JP2008529499A - 抗体変異体とその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、B細胞悪性腫瘍及び自己免疫性疾患の治療のための改善されたヒト化CD20結合抗体を提供する。
Description
本出願は、全体の開示を出典明示によりここに援用する2005年2月7日出願の米国仮出願第60/651,111号、2005年6月10日出願の米国仮出願第60/689,404号、及び2005年7月25日出願の米国仮出願第60/702,571号の優先権を主張する。
(発明の分野)
本発明は、抗CD20抗体とB細胞関連疾患の治療におけるその使用に関する。
本発明は、抗CD20抗体とB細胞関連疾患の治療におけるその使用に関する。
(発明の背景)
リンパ球は幾つかの白血球細胞集団の一つである;リンパ球は外来の抗原を特異的に認識してそれに反応する。リンパ球の3つの主な分類は、Bリンパ球(B細胞)、Tリンパ球(T細胞)及びナチュラルキラー(NK)細胞である。Bリンパ球は抗体産生を担う細胞で、体液性免疫をもたらす。B細胞は骨髄内で成熟して、髄をしてその細胞表面上に抗原結合抗体を発現させる。未処置のB細胞がその膜結合抗体が特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分裂を開始し、その子孫はメモリーB細胞と「形質細胞(プラズマ細胞)」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーB細胞はより長い寿命を持ち、元の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現しないがその代わりに抗体の分泌型を産生する。分泌型抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
リンパ球は幾つかの白血球細胞集団の一つである;リンパ球は外来の抗原を特異的に認識してそれに反応する。リンパ球の3つの主な分類は、Bリンパ球(B細胞)、Tリンパ球(T細胞)及びナチュラルキラー(NK)細胞である。Bリンパ球は抗体産生を担う細胞で、体液性免疫をもたらす。B細胞は骨髄内で成熟して、髄をしてその細胞表面上に抗原結合抗体を発現させる。未処置のB細胞がその膜結合抗体が特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分裂を開始し、その子孫はメモリーB細胞と「形質細胞(プラズマ細胞)」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーB細胞はより長い寿命を持ち、元の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現しないがその代わりに抗体の分泌型を産生する。分泌型抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
CD20抗原(ヒトBリンパ球制限分化抗原Bp35とも呼ばれる)はプレB及び成熟Bリンパ球上に位置するおよそ35kDの分子量を持つ疎水性膜貫通型タンパク質である(Valentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989);及びEinfeld等, EMBO J. 7(3):711-717 (1988))。その抗原はまたB細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)の90%以上に発現されるが(Anderson等, Blood 63(6):1424-1433 (1984))、造血幹細胞、プロB細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない(Tedder等, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985))。CD20は分化及び細胞分裂周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し(上掲のTedder等)、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能すると思われる(Tedder等, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990))。
B細胞リンパ腫ではCD20が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫を治療するための有用な治療標的であった。合衆国ではB細胞NHLの人々は300000人以上であり、毎年56000人以上の人々が新たに診断されている。例えば、ヒトCD20抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス/ヒトモノクローナル抗体であるリツキシマブ(rituximab)(リツキサン(RITUXAN)(登録商標))(ジェネンテック社, サウスサンフランシスコ, カリフォルニア, 合衆国から商業的に入手可能)は、再発性もしくは低抵抗性の(refractory low-grade)又は濾胞性の(follicular)、CD20陽性、B細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療に使用されている。リツキシマブは1998年4月7日に発行された米国特許第5,736,137号(Anderson等)及び米国特許第5,776,456号において「C2B8」と呼ばれている抗体である。インビトロの作用機構研究により、リツキサン(登録商標)がヒト補体を結合して、補体依存性細胞障害作用(CDC)によりリンパ球B細胞系を溶解することが示されている(Reff 等 Blood 83(2): 435-445 (1994))。加えて、それは、抗体依存性細胞傷害(ADCC)のアッセイにおいて有意な活性を有する。インビボ前臨床研究では、おそらく補体及び細胞媒介過程により、リツキサン(登録商標)がカニクイザルの末梢血液、リンパ節及び骨髄からB細胞を減少させることを示している(Reff 等 Blood 83(2): 435-445 (1994))。NHLの治療のための他の抗CD20抗体には、放射性同位体であるイットリウム-90(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)に結合したマウスの抗体ZevalinTMである、I-131にコンジュゲートされた他の完全マウス抗体であるBexxarTM(Corixa, WA)が含まれる。
CD20は、また、自己免疫性疾患を治療するための有用な標的抗原である。リツキシマブは、B細胞と自己抗体が疾患の病態生理に所定の役割を担っていると思われる様々な非悪性自己免疫疾患についてもまた研究されてきた。Edwards等, Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)。リツキシマブは、例えば関節リウマチ(RA)(Leandro等, Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002);Edwards等, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002);Stahl等, Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003);Emery等, Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003))、ループス(Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003);Leandro等 Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002);Gorman等, Lupus, 13: 312-316 (2004))、免疫性血小板減少性紫斑病(D'Arena等, Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003);Stasi等, Blood, 98: 952-957 (2001);Saleh等, Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000);Zaia等, Haematolgica, 87: 189-195 (2002);Ratanatharathorn等, Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000))、赤芽球癆(Auner等, Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002));自己免疫貧血症(Zaja等, Haematologica 87:189-195 (2002)(erratumはHaematologica 87:336 (2002)に記載)、寒冷凝集素症(Layios等, Leukemia, 15: 187-8 (2001);Berentsen等, Blood, 103: 2925-2928 (2004);Berentsen等, Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001);Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001);Damiani等, Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001))、重篤のインスリン抵抗性B型症候群(Coll等, N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004)、混合性クリオグロブリン血症(DeVita等, Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002))、重症筋無力症(Zaja等, Neurology, 55: 1062-63 (2000);Wylam等, J. Pediatr., 143: 674-677 (2003))、ヴェゲナー肉芽腫症(Specks等, Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001))、治療抵抗性尋常性天疱瘡(Dupuy等, Arch Dermatol., 140:91-96 (2004))、皮膚筋炎(Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002))、シェーグレン症候群(Somer等, Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003))、II活性型混合性クリオグロブリン血症 (Zaja等, Blood, 101: 3827-3834 (2003))、尋常性天疱瘡(Dupay等, Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004))、自己免疫神経障害(Pestronk等, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003))、傍腫瘍性眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群(Pranzatelli等 Neurology 60(Suppl. 1) PO5.128:A395 (2003))、及び再発寛解型多発性硬化症((RRMS)、Cross等 (abstract) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003))の徴候と症状を潜在的に軽減することが報告されている。
第II相臨床試験が関節リウマチ(RA)の患者について実施され、リツキシマブの安全性と効果に関する48週のフォローアップデータが得られている。Emery等 Arthritis Rheum 48(9):S439 (2003);Szczepanski等 Arthritis Rheum 48(9):S121 (2003)。患者は4種の治療アーム:メトトレキセート、リツキシマブ単独、リツキシマブ+メトトレキセート、及びリツキシマブ+シクロホスファミド(CTX)に均等に無作為化された。リツキシマブの治療法は1日目と15日目に1グラムを静脈内投与するものであった。
リツキシマブでの治療に関する刊行物には次のものが含まれる:Perotta及びAbuel, “Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab” Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998);Perotta等, "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94: 49 (abstract) (1999);Matthews, R., “Medical Heretics” New Scientist (7 April, 2001);Leandro等, “Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion” Ann Rheum Dis, 上掲;Leandro等, “Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001);Leandro等, “An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”, Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002)、ここでは2週間の間、各患者は500mgのリツキシマブ注入を2回、750mgのシクロホスファミド注入を2回、及び高用量の経口コルチコステロイドを投与され、治療された患者の二人がそれぞれ7ヶ月及び8ヶ月目に再発し、異なるプロトコルでではあるが、再治療された;"Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Weide等, Lupus, 12: 779-782 (2003)、ここでは、患者はリツキシマブ(375mg/m2×4、毎週間隔で繰り返し)で治療され、更にリツキシマブ投与が5−6ヶ月毎になされ、ついで3ヶ月毎に375mg/m2のリツキシマブで維持治療を受け、治療抵抗性SLEの第二の患者はリツキシマブでの治療に成功し、3ヶ月毎に維持療法を受けたが、患者は双方ともリツキシマブでの治療法に良好に応答した;Edwards及びCambridge, “Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes” Rheumatology 40:205-211 (2001);Cambridge等, "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002);Edwards等, “B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders”上掲;Edwards等, “Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002);Levine及びPestronk, “IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab” Neurology 52: 1701-1704 (1999);DeVita等, “Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002);Hidashida等 “Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab.” Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology Oct 24-29; New Orleans, LA 2002での発表;Tuscano, J. “Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab” Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002での発表;"Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin and Chan, Immunity 20:517-527 (2004);Silverman及びWeisman, "Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy", Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003);Kazkaz及びIsenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases", Current opinion in pharmacology, 4: 398-402 (2004);Virgolini及びVanda, "Rituximab in autoimmune diseases", Biomedicine & pharmacotherapy, 58: 299-309(2004);Klemmer等, "Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab", Arthritis And Rheumatism, 48: (9) 9,S (SEP), S624-S624頁(2003);Kneitz等, "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases", Immunobiology, 206: 519-527 (2002);Arzoo等, "Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab)" Annals of the Rheumatic Diseases, 61 (10), p922-4 (2002) Comment in Ann Rheum Dis. 61: 863-866 (2002);"Future Strategies in Immunotherapy" Lake及びDionne, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (2003 by John Wiley & Sons, Inc.) Article Online Posting Date: January 15, 2003 (Chapter 2 "Antibody-Directed Immunotherapy");Liang及びTedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, Section: CD20 as an Immunotherapy Target, article online posting date: 15 January, 2002 entitled "CD20";Appendix 4A entitled "Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens", Stockinger等, Coligan等編, Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley & Sons, Inc) Online Posting Date: May, 2003;Print Publication Date: February, 2003;Penichet及びMorrison, "CD Antibodies/molecules: Definition; Antibody Engineering" Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Section: Chimeric, Humanized and Human Antibodies; posted online 15 January, 2002;Specks等 “Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy” Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001);online abstract submission and invitation Koegh等, "Rituximab for Remission Induction in Severe ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients", American College of Rheumatology, Session Number: 28-100, Session Title: Vasculitis, Session Type: ACR Concurrent Session, Primary Category: 28 Vasculitis, Session 10/18/2004 (http://www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp); Eriksson, "Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated with rituximab", Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003);Jayne等, "B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003);Jayne, poster 88 (11th International Vasculitis and ANCA workshop), 2003 American Society of Nephrology;Stone及びSpecks, "Rituximab Therapy for the Induction of Remission and Tolerance in ANCA-associated Vasculitis", the Clinical Trial Research Summary of the 2002-2003 Immune Tolerance Network, http://www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html。またLeandro等, "B cell repopulation occurs mainly from naive B cells in patient with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Suppl 9): S1160 (2003)を参照のこと。
ヒトの治療におけるマウス抗体の使用の主な制限は、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答である(例としてMiller, R.A. 等 "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62:988-995, 1983;及び、Schroff, R.W., 等 "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res. , 45:879-885, 1985を参照)。齧歯目の抗体の可変(V)ドメインがヒトの定常(C)領域に融合しているキメラ分子でさえ、有意に免疫応答を誘発しうる(HACAヒト抗キメラ抗体) (Neuberger 等 Nature (Lond.), 314:268-270, 1985)。モノクローナル抗体の臨床使用におけるこれらの制限を克服するための強力な方法は、マウス抗体又は非ヒト種由来の抗体の「人間化」である(Jones 等 Nature (Lond), 321:522-525, 1986;Riechman 等, Nature (Lond), 332:323-327, 1988)。特に慢性治療のために患者に投与される場合、このような抗体は抗原性を最小限に又は全く持たないように作製されることが期待される。ヒト化抗CD20抗体は、国際公開公報03/068821A2 (Hansen 等)、国際公開公報2004103404 (Watkins)及び国際公開公報04/056312 (Adams)において記述されている。ヒト抗CD20抗体は、国際公開公報2004/035607 (Teeling 等)において記述されている。
ごく僅かな抗原性を有するだけでなく、生物学的性質及び臨床有効性を向上させた治療用CD20結合抗体を提供することは、有益である。本発明はこれと他の必要性を満たすものである。本発明は、現在の治療組成物の制限を克服する抗CD20抗体、並びに下記の詳細な説明から明らかとなる更なる利点を提供するものである。
ごく僅かな抗原性を有するだけでなく、生物学的性質及び臨床有効性を向上させた治療用CD20結合抗体を提供することは、有益である。本発明はこれと他の必要性を満たすものである。本発明は、現在の治療組成物の制限を克服する抗CD20抗体、並びに下記の詳細な説明から明らかとなる更なる利点を提供するものである。
CD20抗体に関する特許及び特許文献には、米国特許第5776456号、同第5736137号、同第5843439号、同第6399061号、及び同第6682734号、並びに米国特許出願公開第2002/0197255号、同第2003/0021781号、同第2003/0082172号、同第2003/0095963号、同第2003/0147885号(Anderson等);米国特許第6455043号及び国際公開第00/09160号(Grillo-Lopez, A.);国際公開第00/27428号(Grillo-Lopez及びWhite);国際公開第00/27433号(Grillo-Lopez及びLeonard);国際公開第00/44788号(Braslawsky等.);国際公開第01/10462号(Rastetter, W.);国際公開第01/10461号(Rastetter及びWhite);国際公開第01/10460号(White及びGrillo-Lopez);米国特許出願公開第2001/0018041号、同第2003/0180292号、国際公開第01/34194号(Hanna及びHariharan);米国出願公開第2002/0006404号及び国際公開第02/04021号(Hanna及びHariharan);米国出願公開第2002/0012665号及び国際公開第01/74388号(Hanna, N.);米国出願公開第2002/0058029号(Hanna, N.);米国出願公開第2003/0103971号(Hariharan and Hanna);米国出願公開第2002/0009444号、及び国際公開第01/80884号(Grillo-Lopez, A.);国際公開第01/97858号(White, C.);米国出願公開第2002/0128488号及び国際公開第02/34790号(Reff, M.);国際公開第02/060955号(Braslawsky等.);国際公開第2/096948号(Braslawsky等);国際公開第02/079255号(Reff及びDavies);米国特許第6171586号及び国際公開第98/56418号(Lam等.);国際公開第98/58964号(Raju, S.);国際公開第99/22764号(Raju, S.);国際公開第99/51642号、米国特許第6194551号、同第6242195号、同第6528624号及び同第6538124号(Idusogie等.);国際公開第00/42072号(Presta, L.);国際公開第00/67796号(Curd等.);国際公開第01/03734号(Grillo-Lopez等.);米国出願公開第2002/0004587号及び国際公開第01/77342号(Miller及びPresta);米国出願公開第2002/0197256号(Grewal, I.);米国出願公開第2003/0157108号(Presta, L.);米国特許第6565827号、同第6090365号、同第6287537号、同第6015542号、同第5843398号及び同第5595721号(Kaminski等);米国特許第5500362、同第5677180号、同第5721108号、同第6120767号、同第6652852号(Robinson等);米国特許第6410391号(Raubitschek等);米国特許第6224866号及び国際公開第00/20864号(Barbera-Guillem, E.);国際公開第01/13945号(Barbera-Guillem, E.);国際公開第00/67795号(Goldenberg);米国出願公開第2003/0133930号及び国際公開第00/74718号(Goldenberg及びHansen);国際公開第00/76542号(Golay等.);国際公開第01/72333号(Wolin及びRosenblatt);米国特許第6368596号(Ghetie等);米国特許第6306393号及び米国出願公開第2002/0041847号(Goldenberg, D.);米国出願公開第2003/0026801号(Weiner及びHartmann);国際公開第02/102312号(Engleman, E.);米国特許出願公開第2003/0068664号(Albitar等);国際公開第03/002607号(Leung, S.);国際公開第 03/049694号、米国出願公開第2002/0009427号、及び同第2003/0185796号(Wolin等);国際公開第03/061694号(Sing 及びSiegall);米国出願公開第2003/0219818号(Bohen等);米国出願公開第2003/0219433号及び国際公開第03/068821号(Hansen等);米国出願公開第2002/0136719号(Shenoy等);国際公開第2004/032828号(Wahl等);国際公開第2004/035607号(Teeling等);米国出願公開第2004/0093621号(Shitara等)がある。また米国特許第5849898号及び欧州特許出願第330191号(Seed等);米国特許第4861579号及び欧州特許出願公開第332865号(Meyer及びWeiss);国際公開第95/03770号(Bhat等)、米国出願公開第2001/0056066号(Bugelski等);国際公開第2004/035607号(Teeling等);国際公開第2004/056312号(Lowman等);米国出願公開第2004/0093621号(Shitara等);及び国際公開第2004/103404号(Watkins等)を参照のこと。CD20抗体に関する刊行物には、Teeling, J.等 “Characterisation of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin's lymphomas” Blood, Jun 2004; 10.1182が含まれる。
(発明の概要)
本発明は、ヒトCD20を結合して、インビボで霊長類B細胞を減少させる表13及び14に記載のヒト化2H7変異体抗体を提供する。具体的な実施態様では、hu2H7抗体は、バージョン472、473、511、523及び516である。本発明の組成物、方法、製造品、製剤の好ましい実施態様では、ヒト化2H7抗体は、hu2H7.v511又はhu2H7.v114である。
本発明は、ヒトCD20を結合するヒト化2H7抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体がインビボで霊長類B細胞を減少させるために有効であり、配列番号25のL鎖可変領域(VL)と配列番号8のH鎖可変領域(VH)を含んでなるが、VH-CDR2のD56Aのアミノ酸置換を有しており、VH-CDR3のN100がY又はWに置換されるものである抗体を提供する。一実施態様では、この抗体は、さらにVH-CDR3に置換S100aRを含有する。前述の抗体の更なる実施態様では、抗体は、さらにADCC及び/又はCDC活性を改善するFc領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する。ADCC及び/又はCDCエフェクター機能を向上させるために、一実施態様では、前述の抗体は、さらにアミノ酸置換S298A、E333A、K334A及びK326A又はK326Wの何れかを含有してなるIgG1 Fcを含んでなる。一実施態様では、前述の実施態様の抗体は、2H7.v16の少なくとも20倍の抗体依存生細胞障害性(ADCC)を示し、2H7.v16の少なくとも25倍の補体細胞障害性を示す。
本発明は、ヒトCD20を結合して、インビボで霊長類B細胞を減少させる表13及び14に記載のヒト化2H7変異体抗体を提供する。具体的な実施態様では、hu2H7抗体は、バージョン472、473、511、523及び516である。本発明の組成物、方法、製造品、製剤の好ましい実施態様では、ヒト化2H7抗体は、hu2H7.v511又はhu2H7.v114である。
本発明は、ヒトCD20を結合するヒト化2H7抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体がインビボで霊長類B細胞を減少させるために有効であり、配列番号25のL鎖可変領域(VL)と配列番号8のH鎖可変領域(VH)を含んでなるが、VH-CDR2のD56Aのアミノ酸置換を有しており、VH-CDR3のN100がY又はWに置換されるものである抗体を提供する。一実施態様では、この抗体は、さらにVH-CDR3に置換S100aRを含有する。前述の抗体の更なる実施態様では、抗体は、さらにADCC及び/又はCDC活性を改善するFc領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する。ADCC及び/又はCDCエフェクター機能を向上させるために、一実施態様では、前述の抗体は、さらにアミノ酸置換S298A、E333A、K334A及びK326A又はK326Wの何れかを含有してなるIgG1 Fcを含んでなる。一実施態様では、前述の実施態様の抗体は、2H7.v16の少なくとも20倍の抗体依存生細胞障害性(ADCC)を示し、2H7.v16の少なくとも25倍の補体細胞障害性を示す。
これに対して、置換S100aRを含有する抗体は、ADCCを向上させるが、CDC活性を減少させるFcの少なくとも一のアミノ酸変更又は置換を有しうる。この点で、抗体は、Fc内にアミノ酸置換K322Aを少なくとも含有し、さらにアミノ酸置換S298A、E333A、K334Aを含有しうる。
好ましい実施態様では、ADCC及びCDC活性を向上させた抗体はまた、配列番号13及び14のL鎖及びH鎖それぞれの配列を含んでなる抗体2H7.v16と比較して少なくとも3倍、好ましくは少なくとも6倍に増加した親和性でヒトCD20を結合する。
本発明は、ヒトCD20を結合し、配列番号26の軽鎖配列と配列番号34の重鎖配列からなるヒト化2H7抗体を提供する。
また、細胞障害性剤にコンジュゲートされた、前述の実施態様の何れかの抗体が本発明により提供される。一実施態様では、細胞障害性剤、放射性同位体又は毒素である。
一実施態様では、本発明の抗体はCHO細胞内で産生される。
本発明は、さらに、発現ベクターを含む、前記実施態様の抗体をコードする単離された核酸を提供する。抗体を産生する、核酸を含んでなる宿主細胞も同様に提供される。一実施態様では、宿主細胞は、抗体2H7.v511を産生するものである。
好ましい実施態様では、ADCC及びCDC活性を向上させた抗体はまた、配列番号13及び14のL鎖及びH鎖それぞれの配列を含んでなる抗体2H7.v16と比較して少なくとも3倍、好ましくは少なくとも6倍に増加した親和性でヒトCD20を結合する。
本発明は、ヒトCD20を結合し、配列番号26の軽鎖配列と配列番号34の重鎖配列からなるヒト化2H7抗体を提供する。
また、細胞障害性剤にコンジュゲートされた、前述の実施態様の何れかの抗体が本発明により提供される。一実施態様では、細胞障害性剤、放射性同位体又は毒素である。
一実施態様では、本発明の抗体はCHO細胞内で産生される。
本発明は、さらに、発現ベクターを含む、前記実施態様の抗体をコードする単離された核酸を提供する。抗体を産生する、核酸を含んでなる宿主細胞も同様に提供される。一実施態様では、宿主細胞は、抗体2H7.v511を産生するものである。
前述の宿主細胞を培養して、該細胞培養物をから抗体を回収することを含む、上記の何れかの抗体を産生するための方法を提供する。
また、本発明の2H7抗体と担体を含有してなる組成物が提供される。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能な担体である。
他の実施態様は、hu2H7.v511を含有してなる組成物であって、該組成物中の抗体のおよそ80〜100%がフコースを欠いているものである。
さらに他の態様は、容器と該容器に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が前述実施態様の何れかの抗体を含有してなるものである。組成物が所望される特定の治療に応じて、製造品は、前記組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられる、又は前記組成物が関節リウマチを治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物をさらに具備しうる。
本発明の更に別の態様は、前述の実施態様のヒト化2H7抗体を用いた、インビボでB細胞を減少させる方法である。
また、本発明の2H7抗体と担体を含有してなる組成物が提供される。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能な担体である。
他の実施態様は、hu2H7.v511を含有してなる組成物であって、該組成物中の抗体のおよそ80〜100%がフコースを欠いているものである。
さらに他の態様は、容器と該容器に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が前述実施態様の何れかの抗体を含有してなるものである。組成物が所望される特定の治療に応じて、製造品は、前記組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられる、又は前記組成物が関節リウマチを治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物をさらに具備しうる。
本発明の更に別の態様は、前述の実施態様のヒト化2H7抗体を用いた、インビボでB細胞を減少させる方法である。
また、本発明は、CD20陽性癌を有する患者に、治療的有効量の前述の実施態様に記載のヒト化2H7抗体が投与されることを含む、CD20陽性癌の治療方法を提供する。前記CD20陽性癌がB細胞リンパ腫又は白血病であることが好ましい。具体的な実施態様では、hCD20を結合するヒト化2H7抗体及びれの機能的な断片は、非ホジキンリンパ腫(NHL)、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)を治療するために用いられる。その具体的な実施態様では、ヒト化CD20結合抗体又はその機能的な断片、特にv511及びv114は、再発した低悪性度NHL及びリツキシマブ抵抗性低悪性度NHLを含む低悪性度NHLを治療するために用いられる。
これらの癌を治療するために、一実施態様では、抗体は静脈内注入により投与される。注入により投与される投薬は、一般的に週1回、1用量当たりおよそ12.5mg/m2から800mg/m2の範囲で、計1、2、3又は4回である。
これらの癌を治療するために、一実施態様では、抗体は静脈内注入により投与される。注入により投与される投薬は、一般的に週1回、1用量当たりおよそ12.5mg/m2から800mg/m2の範囲で、計1、2、3又は4回である。
また、本発明は、治療的有効量の前述の実施態様の何れか一のヒト化2H7抗体が、自己免疫性疾患に罹患している患者に投与されることを含む、自己免疫性疾患を軽減する方法を提供する。好ましい実施態様では、抗体は静脈内投与又は皮下投与される。抗体は1用量当たり10mg〜500mgの範囲の投薬で静脈内に投与され、具体的な実施態様では、該用量は100mg/用量である。
具体的な実施態様では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、例えばループス腎炎、ベゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgAネフロパシ、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、ANCA関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(NMO)及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである。
hu2H7.v511及びhu2H7.v114抗体は、同時、連続して、又は投薬計画を変更して第二の治療剤と組み合わせて、自己免疫性疾患又はB細胞腫瘍を治療又は軽減するための方法に有用である。一実施態様では、第二治療薬はBAFFアンタゴニストである。ある実施態様では、BAFFアンタゴニストは、ヒトBR3を結合する抗体又はBR3-Fc融合タンパク質である。
具体的な実施態様では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、例えばループス腎炎、ベゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgAネフロパシ、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、ANCA関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(NMO)及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである。
hu2H7.v511及びhu2H7.v114抗体は、同時、連続して、又は投薬計画を変更して第二の治療剤と組み合わせて、自己免疫性疾患又はB細胞腫瘍を治療又は軽減するための方法に有用である。一実施態様では、第二治療薬はBAFFアンタゴニストである。ある実施態様では、BAFFアンタゴニストは、ヒトBR3を結合する抗体又はBR3-Fc融合タンパク質である。
上述した疾患の治療方法の好ましい実施態様では、該疾患を患っている被検体又は患者は、霊長類、好ましくはヒトである。
また、20mM 酢酸ナトリウム、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20、pH5.5内におよそ20mg/mlのヒト化2H7.v511抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤が提供される。また、20mM 酢酸ナトリウム、240mM(8%) トレハロース二水和物、pH5.3、0.02% ポリソルベート20内におよそ20mg/mlのヒト化2H7.v114抗体を含有してなる液体製剤が提供される。2H7.v16に用いられうる他の液体製剤は、20mM 酢酸ナトリウム、pH5.3、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20(Tween20TM)内におよそ30mg/mlの抗体を含有するものである。
また、20mM 酢酸ナトリウム、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20、pH5.5内におよそ20mg/mlのヒト化2H7.v511抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤が提供される。また、20mM 酢酸ナトリウム、240mM(8%) トレハロース二水和物、pH5.3、0.02% ポリソルベート20内におよそ20mg/mlのヒト化2H7.v114抗体を含有してなる液体製剤が提供される。2H7.v16に用いられうる他の液体製剤は、20mM 酢酸ナトリウム、pH5.3、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20(Tween20TM)内におよそ30mg/mlの抗体を含有するものである。
(好ましい実施態様の詳細な説明)
「CD20」抗原は、末梢血又はリンパ系器官のB細胞の90%以上の表面に見出される分子量がおよそ35kDの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。CD20は初期のプレB細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る;ヒトの幹細胞、リンパ球祖先細胞(プロジェニタ)又は正常プラズマ細胞には見出されない。CD20は正常なB細胞並びに悪性B細胞の双方に存在する。文献中でのCD20の他の名称には「Bリンパ球限局性分化抗原」及び「Bp35」がある。CD20抗原は、例えば、Clark及びLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)及びValentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
「抗体」なる用語は、最も広義に用いられ、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、多重特異的抗体(例えば二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物学的活性又は機能を示す限り、抗体断片を包含する。
「CD20」抗原は、末梢血又はリンパ系器官のB細胞の90%以上の表面に見出される分子量がおよそ35kDの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。CD20は初期のプレB細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る;ヒトの幹細胞、リンパ球祖先細胞(プロジェニタ)又は正常プラズマ細胞には見出されない。CD20は正常なB細胞並びに悪性B細胞の双方に存在する。文献中でのCD20の他の名称には「Bリンパ球限局性分化抗原」及び「Bp35」がある。CD20抗原は、例えば、Clark及びLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)及びValentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
「抗体」なる用語は、最も広義に用いられ、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、多重特異的抗体(例えば二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物学的活性又は機能を示す限り、抗体断片を包含する。
本発明のヒト化CD20結合抗体の生物活性には、少なくともヒトCD20への抗体結合、より好ましくはヒト及び他の霊長類CD20(カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーを含む)への結合が含まれるであろう。抗体は、1×10−8より低いKd値、好ましくは1×10−9より低いKd値でCD20に結合し、このような抗体で処置していない適当なネガティブコントロールと比較した場合、好ましくは少なくとも20%のB細胞をインビボで死滅又は枯渇させうるであろう。B細胞の枯渇は、ADCC、CDC、アポトーシス、又は他のメカニズムの一又は複数の結果でありうる。ここでの疾患治療のある実施態様では、特定のエフェクター機能又はメカニズムが他のものよりも望まれ、ヒト化2H7のある変異体がADCCなどの生物学的機能を達成するのに好ましい。
「抗体断片」には、完全長抗体の一部、一般にはその抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片;ダイアボディー(diabodies);直鎖状抗体;単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体からなる。この2つのドメインのフォールディングから6つの高頻度可変ループ(それぞれH鎖及びL鎖から3ループ)が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与させて抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一可変ドメイン(又は抗原に特異的なCDRを3つしか含まないFvの半分)でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体からなる。この2つのドメインのフォールディングから6つの高頻度可変ループ(それぞれH鎖及びL鎖から3ループ)が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与させて抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一可変ドメイン(又は抗原に特異的なCDRを3つしか含まないFvの半分)でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得、一般に少量で存在しうる可能な変異を除いて、同一であり、及び/又は同じエピトープに結合する。そのようなモノクローナル抗体は典型的には標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法によって得られている。例えば、選択方法は、ハイブリドーマクローンのプール、ファージクローン又は組換えDNAクローンのような複数のクローンから独特のクローンを選択することでありうる。選択された標的結合配列は、例えば標的への親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養においてその生産を改善し、インビボでのその免疫原性を減少させ、多重特異的抗体を作り出す等のために、更に改変することができ、改変された標的結合配列を含む抗体はまた本発明のモノクローナル抗体であることが理解されなければならない。異なった決定基(エピトープ)に対する異なった抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と異なり、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要とするものであると考えてはならない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法(例えばKohler等, Nature, 256:495 (1975);Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版 1988);Hammerling等, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えDNA法(例えば米国特許第4816567号を参照)、ファージディスプレイ法(例えばClackson等, Nature, 352:624-628 (1991);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991);Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004);Lee等, J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004);Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004);及びLee等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)を参照)、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術(例えば国際公開第1998/24893号;同第1996/34096号;同第1996/33735号;同第1991/10741号;Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993);Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5545806号;同第5569825号;同第5591669号(全てGenPharm);同第5545807号;国際公開第1997/17852号;米国特許第5545807号;同第5545806号;同第5569825号;同第5625126号;同第5633425号;及び同第5661016号; Marks等, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992);Lonberg等, Nature, 368: 856-859 (1994);Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994);Fishwild等, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996);及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)を参照)を含む様々な技術によって作製することができる。
本発明のCD20結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来する無傷の全長分子と実質的に同じ親和性でのCD20への結合を維持する断片であり、ここで開示するようなインビトロ又はインビボアッセイにより測定されるB細胞の枯渇を含む生物学的活性を示す。
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Vドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変ドメインの110アミノ酸スパンにわたって均一には分布していない。代わりに、V領域は、それぞれ9−12アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性のより短い領域により分離される15−30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる相対的にインバリアントな伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々4つのFR領域を含み、これは主にβシート配置をとり、3つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、βシート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、FR領域の直ぐ近傍に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害(ADCC)への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Vドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変ドメインの110アミノ酸スパンにわたって均一には分布していない。代わりに、V領域は、それぞれ9−12アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性のより短い領域により分離される15−30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる相対的にインバリアントな伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々4つのFR領域を含み、これは主にβシート配置をとり、3つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、βシート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、FR領域の直ぐ近傍に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害(ADCC)への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基(例えば、VLのおおよそ残基24−34(L1)、50−56(L2)及び89−97(L3)及びVHのおおよそ31−35B(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3)(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び/又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、VLの残基26−32(L1)、50−52(L2)及び91−96(L3)及びVHの残基26−32(H1)、52A−55(H2)及び96−101(H3)(Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。
ここで示すように、「コンセンサス配列」又はコンセンサスVドメイン配列は、既知のヒト免疫グロブリン可変領域配列のアミノ酸配列の比較から得た人工の配列である。これらの比較に基づいて、ヒトκ及びヒトH鎖サブグループIIIVドメイン由来の配列のコンセンサスであるVドメインアミノ酸をコードする組換え核酸配列を調製した。コンセンサスV配列は如何なる抗体結合特異性も親和性も持たない。
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同である重鎖及び/又は軽鎖の一部を有するものであり、残りの鎖は他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同であり、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる(米国特許第4816567号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同である重鎖及び/又は軽鎖の一部を有するものであり、残りの鎖は他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同であり、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる(米国特許第4816567号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種からの高頻度可変領域の残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント又はアクセプター抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は結合親和性のような抗体特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、たとえFR領域が結合特性を改善するような一又は複数のアミノ酸置換を含んでも、全てあるいは実質的に全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。FR中のこれらアミノ酸置換の数は、典型的にはH鎖では6個以下、L鎖では3個以下である。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域(天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、C1q結合及び補体依存性細胞障害;Fcレセプター結合性;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);貪食作用;細胞表面レセプター(例えば、B細胞レセプター)のダウンレギュレーション;及びB細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」又は「ADCC」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)上にあるFcレセプター(FcR)に結合した分泌Igによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒でその標的細胞を死滅させるという細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害性細胞を「武装させ(arm)」、そのような死滅に絶対に必要とされる。ADCCを媒介する一次細胞であるNK細胞は、FCγRIIIのみを発現する一方、単球はFCγRI、FCγRII及びFCγRIIIを発現する。造血性細胞でのFcRの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の464頁の表3に要約されている。対象分子のADCC活性を評価するためには、米国特許第5500362号又は同第5821337号又はPrestaの米国特許第6737056号に記載されているようなインビトロADCCアッセイが実施されうる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー細胞(NK)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象分子のADCC活性は、例えばClynes等 PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。抗体がCD20結合抗体である場合、ADCC活性は、以下に記載のようにヒトCD20と16を発現するトランスジェニックマウス(hCD20+/hCD16+ Tgマウス)において試験することができる。
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」又は「ADCC」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)上にあるFcレセプター(FcR)に結合した分泌Igによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒でその標的細胞を死滅させるという細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害性細胞を「武装させ(arm)」、そのような死滅に絶対に必要とされる。ADCCを媒介する一次細胞であるNK細胞は、FCγRIIIのみを発現する一方、単球はFCγRI、FCγRII及びFCγRIIIを発現する。造血性細胞でのFcRの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の464頁の表3に要約されている。対象分子のADCC活性を評価するためには、米国特許第5500362号又は同第5821337号又はPrestaの米国特許第6737056号に記載されているようなインビトロADCCアッセイが実施されうる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー細胞(NK)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象分子のADCC活性は、例えばClynes等 PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。抗体がCD20結合抗体である場合、ADCC活性は、以下に記載のようにヒトCD20と16を発現するトランスジェニックマウス(hCD20+/hCD16+ Tgマウス)において試験することができる。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のFcRsを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行することが望ましい。ADCCを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞障害性T細胞及び好中球が含まれるが、PBMCとNK細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「Fcレセプター」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なFcRは天然配列ヒトFcRである。さらに好適なFcRは、IgG抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。FcγRIIレセプターには、FcγRIIA(「活性型レセプター」)及びFcγRIIB(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターFcγRIIAは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ITAM)を含んでいる。阻害型レセプターFcγRIIBは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ITIM)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。FcRsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のFcRsはここでの「FcR」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性IgGの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターFcRnも含まれる。
「Fcレセプター」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なFcRは天然配列ヒトFcRである。さらに好適なFcRは、IgG抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。FcγRIIレセプターには、FcγRIIA(「活性型レセプター」)及びFcγRIIB(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターFcγRIIAは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ITAM)を含んでいる。阻害型レセプターFcγRIIBは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ITIM)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。FcRsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のFcRsはここでの「FcR」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性IgGの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターFcRnも含まれる。
国際公開公報00/42072 (Presta) にFcRへの結合を向上または減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields ら J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
FcRnへの結合親和性について、一実施態様では、抗体のEC50又は見かけのKd(pH6.0での)は100nM以下、より好ましくは10nM以下である。FcγRIII(F158;すなわち低親和性アイソタイプ)への増加した結合親和性について、一実施態様では、EC50又は見かけのKdは10nM以下であり、FcgRIII(V158;高親和性)について、EC50又は見かけのKdは3nM以下であった。FcRnへの結合の測定方法は公知であり(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)、以下に記載される。インビボでのヒトFcRnへの結合とヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はFc変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。ある実施態様では、本発明のヒト化2H7抗体は、IgG Fc内にアミノ酸変異をさらに含有しており、野生型IgG Fcを有する抗体よりも少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、より好ましくは少なくとも100倍、好ましくは少なくとも125倍、さらにより好ましくは少なくとも150倍からおよそ170倍に亢進したヒトFcRnへの結合親和性を示す。
FcRnへの結合親和性について、一実施態様では、抗体のEC50又は見かけのKd(pH6.0での)は100nM以下、より好ましくは10nM以下である。FcγRIII(F158;すなわち低親和性アイソタイプ)への増加した結合親和性について、一実施態様では、EC50又は見かけのKdは10nM以下であり、FcgRIII(V158;高親和性)について、EC50又は見かけのKdは3nM以下であった。FcRnへの結合の測定方法は公知であり(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)、以下に記載される。インビボでのヒトFcRnへの結合とヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はFc変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。ある実施態様では、本発明のヒト化2H7抗体は、IgG Fc内にアミノ酸変異をさらに含有しており、野生型IgG Fcを有する抗体よりも少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、より好ましくは少なくとも100倍、好ましくは少なくとも125倍、さらにより好ましくは少なくとも150倍からおよそ170倍に亢進したヒトFcRnへの結合親和性を示す。
「補体依存性細胞障害」もしくは「CDC」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Clq)の第1補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Fc領域アミノ酸配列を変更してC1q結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第6,194,551号B1及び国際公開公報99/51642に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
Fc領域アミノ酸配列を変更してC1q結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第6,194,551号B1及び国際公開公報99/51642に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
本明細書と特許請求の範囲を通して、特に明記しない限りは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して取り込まれるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のEUインデックスのものである。「KabatのEUインデックス」とはヒトIgG1EU抗体の残基番号付けを意味する。配列又は他の番号付けシステムを特に示さない限りは、V領域内の残基はKabat番号付けに従って番号付けをした。
CD20抗体には、今は「リツキシマブ」(「リツキサン(登録商標)」)(米国特許第5736137号)と呼ばれている「C2B8」;IDEC Pharmaceuticals社から市販されている「Y2B8」又は「イブリツモマブ・チウキセタン」(ゼバリン(登録商標))と命名されているイットリウム-[90]標識2B8マウス抗体(米国特許第5736137号;1993年6月22日に受託番号HB11388でATCCに寄託された2B8);Corixaから市販されている「131I−B1」又は「ヨウ素I131トシツモマブ」抗体を産生するために131Iで標識されていてもよい「トシツモマブ」とも呼ばれるマウスIgG2a「B1」(BEXXARTM、GlaxoSmithKline、米国特許第5595721号も参照);マウスモノクローナル抗体「1F5」(Press等 Blood 69(2):584-591 (1987)及び「パッチフレームワーク」を含むその変異体又はヒト化1F5(国際公開第2003/002607, Leung, S.;ATCC寄託HB−96450);マウス2H7及びキメラ2H7抗体(米国特許第5677180号);ヒト化2H7(国際公開第2004/056312号 Lowman等)及び以下に記載のもの);HUMAX−CD20TM完全ヒト抗体(Genmab, Denmark;例えばGlennie及びvan de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)及びCragg等, Blood 101: 1045-1052 (2003)を参照);国際公開第2004/035607号(Teeling等)に記載されたヒトモノクローナル抗体;米国特許出願公開第2004/0093621号(Shitara等)に記載されたFc領域に複合N-グリコシド結合糖鎖が結合した抗体;国際公開第2004/103404号(Watkins等, Applied Molecular Evolution)に記載されたAME-133TM抗体のようなAME抗体シリーズのようなCD20結合分子;キメラ又はヒト化A20抗体(それぞれcA20、IMMU-106 a.k.a.hA20)(米国特許出願公開第2003/0219433号、米国特許出願公開2005/0025764;Immunomedics)のようなA20抗体又はその変異体;及びInternational Leukocyte Typing Workshop(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael編, p.440, Oxford University Press (1987))から入手可能なモノクローナル抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1又はNU-B2が含まれる。ここでの好ましいCD20抗体はヒト化、キメラ、又はヒトCD20抗体、より詳細にはヒト化2H7抗体、リツキシマブ、キメラ又はヒト化A20抗体(Immunomedics)、及びHUMAX-CD20TMヒトCD20抗体(Genmab)である。
ここで用いる場合、「B細胞枯渇」は、治療前のレベルと比較して、薬剤又は抗体治療後に動物又はヒトにおいてB細胞レベルが減少することを意味する。B細胞レベルは、全血球数を得て、既知のB細胞マーカーに対して染色するFACS分析により、また実験的実施例に記載したような方法などのよく知られたアッセイを用いて測定可能である。B細胞枯渇は部分的か又は完全なものでありうる。一実施態様では、CD20発現B細胞の枯渇は少なくとも25%である。B細胞枯渇剤を投与されている患者では、B細胞は、一般に、薬剤が患者体内を循環している間とB細胞が回復する時に枯渇される。
「腫瘍壊死因子α(TNFα)」とは、Pennica 等, Nature, 312:721 (1984)又はAggarwal 等, JBC, 260:2345 (1985)に記載のアミノ酸配列を含有するヒトTNFα分子を意味する。本明細書中の「TNFαインヒビター」は、一般的にはTNFαへの結合とその活性を中和することを介してTNFαの生物学的活性をある程度阻害する薬剤である。本明細書中で考慮されるTNFインヒビターの具体例は、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))及びアダリムマブ(HUMIRATM)である。
「腫瘍壊死因子α(TNFα)」とは、Pennica 等, Nature, 312:721 (1984)又はAggarwal 等, JBC, 260:2345 (1985)に記載のアミノ酸配列を含有するヒトTNFα分子を意味する。本明細書中の「TNFαインヒビター」は、一般的にはTNFαへの結合とその活性を中和することを介してTNFαの生物学的活性をある程度阻害する薬剤である。本明細書中で考慮されるTNFインヒビターの具体例は、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))及びアダリムマブ(HUMIRATM)である。
「TNFα-インヒビターに対する不十分な応答」なる用語は、毒性及び/又は不十分な有効性のためにTNFα-インヒビターによる以前又は現在の治療への不十分な応答を指す。不十分な応答は、問題の疾患を治療することに熟練した臨床医によって評価されうる。「不十分な有効性」を経験する哺乳動物は、TNFα-インヒビターによる以前又は現在の治療後に活性な疾患が続いている。例えば、患者は、TNFα-インヒビターによる3か月の治療の後に活性な疾患活動性を有しうる。
ここで用いられる「BAFF」、「BAFFポリペプチド」、「TALL-1」又は「TALL-1ポリペプチド」、「BLyS」、「THANK」なる用語は、「天然配列BAFFポリペプチド」及び「BAFF変異体」を包含する。「BAFF」は、以下に示すアミノ酸配列:
ヒトBAFF配列(配列番号46)
(米国特許公開2005/0095243A1の図3の配列も参照)
の何れか一によってコードされるポリペプチドと、それらのホモログ及び断片及び変異体であり、天然配列のBAFFの生物学的活性を有するものに対する名称である。BAFFの生物学的活性は、B細胞生存を促進する、B細胞成熟を促進する、およびBR3に結合することからなる群から選択されうる。「BAFF」なる用語は、Shu 等., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999);GenBank寄託番号 AF136293;1998年5月7日公開のW098/18921;1998年10月7日公開のEP 869,180;1998年6月25日公開のW098/27114;1999年3月18日公開のW099/12964;1999年7月8日公開のW099/33980;Moore 等., Science, 285:260-263 (1999);Schneider 等., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999);Mukhopadhyay 等., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
ヒトBAFF配列(配列番号46)
(米国特許公開2005/0095243A1の図3の配列も参照)
の何れか一によってコードされるポリペプチドと、それらのホモログ及び断片及び変異体であり、天然配列のBAFFの生物学的活性を有するものに対する名称である。BAFFの生物学的活性は、B細胞生存を促進する、B細胞成熟を促進する、およびBR3に結合することからなる群から選択されうる。「BAFF」なる用語は、Shu 等., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999);GenBank寄託番号 AF136293;1998年5月7日公開のW098/18921;1998年10月7日公開のEP 869,180;1998年6月25日公開のW098/27114;1999年3月18日公開のW099/12964;1999年7月8日公開のW099/33980;Moore 等., Science, 285:260-263 (1999);Schneider 等., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999);Mukhopadhyay 等., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
ここで用いられる「BAFFアンタゴニスト」なる用語は、広義の意味で用いられ、(1)天然配列BAFFポリペプチドないし天然配列BR3ポリペプチドに結合してBAFFポリペプチドと相互作用するBR3を部分的又は完全にブロック(阻止)する、および(2)天然配列BAFFシグナル伝達を部分的又は完全にブロック、阻害ないし中和(無効化)する任意の分子を含む。とりわけ、天然配列BAFFポリペプチドシグナル伝達はB細胞生存およびB細胞成熟を促進する。BAFFシグナル伝達の阻害、ブロックまたは中和により、とりわけB細胞数が減少する。本発明によるBAFFアンタゴニストはインビトロ又はインビボのBAFFポリペプチドの一以上の生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害ないし中和するであろう。一実施態様では、生物学的活性なBAFFはインビトロ又はインビボで以下の事象の何れか一またはそれらのいくつかを増強する:B細胞の生存促進、IgG及び/又はIgMレベルの増加、形質細胞の数の増加、及び脾臓B細胞のp52 NF-κbへのNF-κb2/100のプロセシング(例として、Batten, M 等, (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465;Moore, 等, (1999) Science 285:260-263;Kayagaki, 等, (2002) 10:515-524)。
ここで用いられる「BR3」、「BR3ポリペプチド」または「BR3レセプター」なる用語は、「天然配列BR3ポリペプチド」および「BR3変異体」を包含する(ここでさらに定義する)。「BR3」は以下のポリヌクレオチド配列及びそのホモログの何れか一を有するポリペプチドに対する名称である。
(a) ヒトBR3配列(配列番号47)
(b) オルタナティブヒトBR3配列(配列番号48)
(a) ヒトBR3配列(配列番号47)
(b) オルタナティブヒトBR3配列(配列番号48)
いくつかの実施態様では、本発明に記載のBAFFアンタゴニストは、抗BAFF抗体、BAFF-結合ポリペプチド(イムノアドヘシン及びペプチドを含む)、及びBAFF-結合小分子が含まれる。BAFFアンタゴニストは、国際公開公報02/02641において記述されるBAFF結合抗体(例えば、表1の1−46、321−329、834−872、1563−1595、1881−1905の何れかのアミノ酸配列を含んでなる抗体)を含む。さらなる実施態様では、イムノアドヘシンは、BAFFレセプターのBAFF結合領域(例えばBR3、BCMA又はTACIの細胞外ドメイン)を含んでなる。なお更なる実施態様では、イムノアドヘシンはBR3-Fcである。BAFF結合Fcタンパク質の他の例は、国際公開公報02/66516、国際公開公報00/40716、国際公開公報01/87979、国際公開公報03/024991、国際公開公報02/16412、国際公開公報02/38766、国際公開公報02/092620、国際公開公報01/12812に見られる。BAFFアンタゴニストの作製方法は、上掲の米国特許公開2005/0095243A1、及び米国特許公開2005/0163775において記述される。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(1)ローリー法で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を超えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「コントロール配列」なる表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのDNAに作用可能に結合されている;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのDNAに作用可能に結合されている;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「ベクター」はシャトルおよび発現ベクターを含む。一般的に、プラスミドコンストラクトも複製起源(例として、ColE1複製起源)および選択マーカー(例として、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性)をそれぞれ細菌内のプラスミドの複製および選択を目的として含むであろう。「発現ベクター」は必要なコントロール配列または本発明の抗体断片を含む抗体の発現の調節因子を細菌または真核細胞内で含むベクターを表す。好適なベクターは以下に示す。
本発明のヒト化2H7抗体などのヒト化CD20結合抗体を産生する細胞には、抗体をコードする核酸が導入されている細菌細胞及び真核細胞が含まれるであろう。好適な宿主細胞を以下に開示する。
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識または蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
本発明のヒト化2H7抗体などのヒト化CD20結合抗体を産生する細胞には、抗体をコードする核酸が導入されている細菌細胞及び真核細胞が含まれるであろう。好適な宿主細胞を以下に開示する。
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識または蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
本発明の組成物及び方法
本発明は、2H7.v16の変異体であるヒト化2H7抗体を提供する。具体的な実施態様では、変異体はhu2H7.v511である。
完全長抗体では、本発明のヒト化CD20結合抗体は、ヒト免疫グロブリンのCドメインに結合したヒト化Vドメインを含んでなるであろう。好ましい実施態様では、H鎖C領域は、ヒトIgG、好ましくはIgG1又はIgG3に由来する。L鎖Cドメインはヒトκ鎖由来であることが好ましい。
ここでの目的では、「ヒト化2H7」は、可変軽鎖(VL)配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (配列番号2);と
可変重鎖(VH)配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号 8)
を含んでなる完全抗体ないし抗体断片を指す。
本発明は、2H7.v16の変異体であるヒト化2H7抗体を提供する。具体的な実施態様では、変異体はhu2H7.v511である。
完全長抗体では、本発明のヒト化CD20結合抗体は、ヒト免疫グロブリンのCドメインに結合したヒト化Vドメインを含んでなるであろう。好ましい実施態様では、H鎖C領域は、ヒトIgG、好ましくはIgG1又はIgG3に由来する。L鎖Cドメインはヒトκ鎖由来であることが好ましい。
ここでの目的では、「ヒト化2H7」は、可変軽鎖(VL)配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (配列番号2);と
可変重鎖(VH)配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号 8)
を含んでなる完全抗体ないし抗体断片を指す。
ヒト化2H7抗体が完全な抗体である場合、v16軽鎖アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号 13);と
重鎖アミノ酸配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号 14)
を含んでなることが好ましい。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号 13);と
重鎖アミノ酸配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号 14)
を含んでなることが好ましい。
前述の2H7 mAbの変異体が、上記の配列番号13と同じL鎖配列と、H鎖アミノ酸配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY
YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号 15)
を有する2H7.v31である。
他の変異体は、配列番号26のH鎖アミノ酸配列を有する2H7.v138である。
前述のヒト化2H7抗体の他の変異体は、配列番号25のVLと2H7.v511の配列番号33のVHを含んでなるものである(表2参照)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY
YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号 15)
を有する2H7.v31である。
他の変異体は、配列番号26のH鎖アミノ酸配列を有する2H7.v138である。
前述のヒト化2H7抗体の他の変異体は、配列番号25のVLと2H7.v511の配列番号33のVHを含んでなるものである(表2参照)。
hu2H7.v511は完全長IgG1である。ある実施態様では、抗体は、2H7.v511軽鎖(配列番号26)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
と、2H7.v511重鎖(配列番号34)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY
NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
を含んでなる。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
と、2H7.v511重鎖(配列番号34)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY
NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
を含んでなる。
バージョン16に基づく全ての他の変異体のV領域は、以下の表1に示すアミノ酸置換の位置を除いてv16のアミノ酸配列を有する。特段示さない限り、2H7変異体はv16のものと同じL鎖を有する。ヒト化抗体2H7v.16はまたrhuMAb2H7、PRO70769又はオクレリツマブ(Ocrelizumab)とも呼ばれる。
残基番号付けは、Kabat等, Sequences of Immunological Interest. 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従っており、配列図において挿入はa、b、c、d、及びeで示し、間隙はダッシュで示す。Fc領域を含むCD20結合抗体において、Fc領域のC末端リジン(EU番号付け系によると残基447)は、例えばAbの精製の間、又は抗体ポリペプチドをコードする核酸を組換え操作することによって、除去することができる。従って、本発明のヒト化2H7抗体組成物は、K447を持つ抗体、全てのK447が除去された抗体、又はK447残基を持つ抗体と持たない抗体の混合物を含みうる。
IgG中のNグリコシル化部位はCH2ドメインのAsn297にある。本発明のヒト化2H7抗体組成物は、Fc領域を有する前述のヒト化2H7抗体の任意のものの組成物を含み、ここで組成物中の抗体の約80−100%(好ましくは約90−99%)は糖タンパク質のFc領域に結合したフコースを欠く成熟コア糖鎖構造を含む。そのような組成物は、FcγRIIIA(F158)への結合に驚くべき改善を示すことがここで実証されており、これは、ヒトIgGとの相互作用においてFcγRIIIA(V158)ほど効果的ではない。FcγRIIIA(F158)は、正常で健常なアフリカ系アメリカ人及び白人においてはFcγRIIIA(V158)より一般的である。Lehrnbecher等 Blood 94:4220 (1999)を参照のこと。歴史的に、最も一般的に用いられる産業用宿主の一つであるチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)で産生される抗体は、フコシル化されていない集団におよそ2〜6%を含有する。しかしながら、YB2/0及びLec13は、78〜98%のフコシル化されていない種を有する抗体を産生しうる。Shinkawa 等 J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)は、YB2/0及びLec13細胞で産生される抗体であってFUT8活性をほとんど持たない抗体がインビトロで有意に増加したADCC活性を示すことを報告した。また、フコース含量が低い抗体の作製は、例えばLi 等 (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006;Niwa R. 等 Cancer Res. 64(6): 2127-2133 (2004);米国特許公開2003/0157108 (Presta);米国特許第6,602,684号及び米国特許公開2003/0175884 (Glycart Biotechnology);米国特許公開2004/0093621、米国特許公開2004/0110704、米国特許公開2004/0132140 (すべてKyowa Hakko Kogyo)に記載される。
二重特異性ヒト化2H7抗体は、抗体の1本のアームが本発明のヒト化2H7抗体のH及び/又はL鎖の抗原結合領域を少なくとも有し、他のアームは第二抗原に対してV領域結合特異性を有する抗体を包含する。具体的な実施態様では、第二抗原は、CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D又は他のNK活性化リガンドからなる群から選択される。
一実施態様では、本発明のヒト化2H7抗体は、IgG Fc内にアミノ酸変異をさらに含有し、野生型IgG Fcを有する抗体よりも少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、より好ましくは少なくとも100倍、好ましくは少なくとも125倍、さらにより好ましくは少なくとも150倍からおよそ170倍に亢進したヒトFcRnへの結合親和性を示す。
一実施態様では、本発明のヒト化2H7抗体は、IgG Fc内にアミノ酸変異をさらに含有し、野生型IgG Fcを有する抗体よりも少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、より好ましくは少なくとも100倍、好ましくは少なくとも125倍、さらにより好ましくは少なくとも150倍からおよそ170倍に亢進したヒトFcRnへの結合親和性を示す。
抗体の製造
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離して、次いでポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離して、次いでポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞(融合パートナーとも称する)の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択培地は、典型的には、HGPRT欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
好ましい融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、融合していない親の細胞に対して選択する選択培地に感受性である細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系、例えば、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手し得るMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, Rockville, Maryland USAから入手し得るSP-2及びその誘導体、例えばX63-Ag8-653細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
好ましい融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、融合していない親の細胞に対して選択する選択培地に感受性である細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系、例えば、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手し得るMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, Rockville, Maryland USAから入手し得るSP-2及びその誘導体、例えばX63-Ag8-653細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、例えばマウスに細胞を腹腔内注入することによって、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィ(例えばプロテインA又はプロテインG-セファロース)又はイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、例えばマウスに細胞を腹腔内注入することによって、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィ(例えばプロテインA又はプロテインG-セファロース)又はイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているDNAは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、DNAを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするDNAは、例えば、相同的マウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(CH及びCL)配列に置換することにより(米国特許第4,816,567号;及びMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド(異種性ポリペプチド)のコード配列の全部又は一部を融合させることによって、キメラ又は融合抗体ポリペプチドを生産するように修飾されうる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対して特異性を有する1つの抗原結合部位と異なる抗原に対して特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性及び、抗体がヒトの治療用途に意図される場合にはHAMA応答(ヒト抗マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトVドメイン配列を同定して、その中のヒトフレームワーク領域(FR)をヒト化抗体とする(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性及び、抗体がヒトの治療用途に意図される場合にはHAMA応答(ヒト抗マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトVドメイン配列を同定して、その中のヒトフレームワーク領域(FR)をヒト化抗体とする(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体は、抗体断片、例えばFab、場合によっては免疫コンジュゲートを作製するために1又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、完全長抗体、例えば完全長IgG1抗体であってもよい。
ヒト化抗体は、抗体断片、例えばFab、場合によっては免疫コンジュゲートを作製するために1又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、完全長抗体、例えば完全長IgG1抗体であってもよい。
ヒト抗体及びファージディスプレイ法
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993);Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,591,669号(すべてGenPharm)、同第5,545,807号;及び国際公開公報97/17852を参照されたい。
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993);Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,591,669号(すべてGenPharm)、同第5,545,807号;及び国際公開公報97/17852を参照されたい。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348:552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばM13の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のDNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはB細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる;例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)を参照のこと。V-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352:624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたV遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのV遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12:725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905号を参照のこと。
前記したように、またヒト抗体は、活性化B細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同第5,229,275号を参照)。
前記したように、またヒト抗体は、活性化B細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同第5,229,275号を参照)。
抗体断片
特定の状況では、全抗体よりもむしろ抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片は迅速にクリアランスされ、固形腫瘍へのアクセスが向上しうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Fab、Fv及びScFv抗体断片はすべて大腸菌で発現されて分泌されるため、これら断片の大量の生産が容易である。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有するインビボ半減期が増加したFab及びF(ab')2断片は、米国特許第5,869,046号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開93/16185;米国特許第5,571,894号;及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。Fv及びsFvは、定常領域が欠けている完全な結合部位を有する唯一の種類である;したがって、それらは、インビボ使用の間の非特異的結合を減らすために適する。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端又はカルボキシ末端で、エフェクタータンパク質の融合を得るために設定されうる。上記のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
特定の状況では、全抗体よりもむしろ抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片は迅速にクリアランスされ、固形腫瘍へのアクセスが向上しうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Fab、Fv及びScFv抗体断片はすべて大腸菌で発現されて分泌されるため、これら断片の大量の生産が容易である。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有するインビボ半減期が増加したFab及びF(ab')2断片は、米国特許第5,869,046号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開93/16185;米国特許第5,571,894号;及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。Fv及びsFvは、定常領域が欠けている完全な結合部位を有する唯一の種類である;したがって、それらは、インビボ使用の間の非特異的結合を減らすために適する。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端又はカルボキシ末端で、エフェクタータンパク質の融合を得るために設定されうる。上記のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、CD20タンパク質の2つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位と、CD20結合部位とが結合しうる。あるいは、抗CD20アームは、CD20発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させて局所化させるために、IgG(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)、又はNKG2Dないし他のNK細胞活性化リガンドに対するFcレセプター、又はT細胞レセプター分子(例えばCD3)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はCD20を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はCD20結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公報96/16673には、二重特異性の抗ErbB2/FcγRIII抗体が記載され、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗ErbB2/FcγRI抗体IDM1(Osidem)が開示されている。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体は国際公報98/02463に示されている。米国特許第5,821,337号は二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体を教示する。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、CD20タンパク質の2つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位と、CD20結合部位とが結合しうる。あるいは、抗CD20アームは、CD20発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させて局所化させるために、IgG(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)、又はNKG2Dないし他のNK細胞活性化リガンドに対するFcレセプター、又はT細胞レセプター分子(例えばCD3)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はCD20を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はCD20結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公報96/16673には、二重特異性の抗ErbB2/FcγRIII抗体が記載され、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗ErbB2/FcγRI抗体IDM1(Osidem)が開示されている。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体は国際公報98/02463に示されている。米国特許第5,821,337号は二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体を教示する。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Milstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公報93/8829及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、該融合は、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含むIg重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節により大きな融通性(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖組合せの収率に有意に影響しないときは、2または3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、該融合は、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含むIg重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節により大きな融通性(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖組合せの収率に有意に影響しないときは、2または3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合(ヘテロコンジュゲート)」抗体を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の治療(国際公報91/00360、国際公報92/200373及び欧州特許第03089号)等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第4,676,980号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からFab'-SH断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab')2分子の製造を記述している。各Fab'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ErbB2レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーによりVLにVHを結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーによりVLにVHを結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインを更に有する。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインを更に有する。
他のアミノ酸配列の修飾
ここで記載のCD20結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗CD20抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗CD20抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの抗CD20抗体の翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にある抗CD20抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸とCD20抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗CD20抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
ここで記載のCD20結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗CD20抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗CD20抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの抗CD20抗体の翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にある抗CD20抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸とCD20抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗CD20抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び/又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、N-末端メチオニル残基を持つ抗CD20抗体又は細胞障害ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗CD20抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばADEPT)又はポリペプチドの抗CD20抗体のN-又はC-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗CD20抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、FR変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表に「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗CD20抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、FR変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表に「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro; 及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro; 及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
抗CD20抗体の適切な高次構造を維持するために関与しない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善して、異常な交差を防いでもよい。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特にこの場合、抗体はFv断片などの抗体断片である)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異がある。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば6−7部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたM13の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトCD20の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異がある。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば6−7部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたM13の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトCD20の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び/又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。O結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(N結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(O-結合グリコシル化部位の場合)。
抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。O結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(N結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(O-結合グリコシル化部位の場合)。
抗CD20抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗CD20抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞障害性(CDC)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のFc領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Fc領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および/または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害(ADCC)を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のFc領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびADCC能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第5739277号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、IgG分子のインビボ血清半減期延長に関与するIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)のFc領域のエピトープを表す。
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞障害性(CDC)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のFc領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Fc領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および/または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害(ADCC)を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のFc領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびADCC能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第5739277号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、IgG分子のインビボ血清半減期延長に関与するIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)のFc領域のエピトープを表す。
他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考えられる。例えば、抗体は様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合されてもよい。抗体はまた例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に)、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中に、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Oslo, A編(1980)に開示されている。
抗体の他の修飾がここで考えられる。例えば、抗体は様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合されてもよい。抗体はまた例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に)、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中に、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Oslo, A編(1980)に開示されている。
所望の性質を有する抗体のスクリーニング
実験的実施例に示すようにある生物学的特徴を有する抗体を選択する。
本発明の抗CD20抗体の成長阻害効果は、当業者に知られた方法、例として、CD20遺伝子を内因性または形質移入してCD20を発現する細胞を用いるなどの方法によって評価しうる。例えば、腫瘍細胞株およびCD20形質移入細胞を、様々な濃度の本発明の抗CD20モノクローナル抗体で2、3(例として2−7)日間処理し、クリスタル・バイオレットまたはMTTで染色、または他の比色アッセイ法によって分析した。増殖を測定する他の方法には、本発明の抗CD20抗体存在または非存在下にて処理した細胞による3H-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理後、細胞を回収して、DNA内に取り込まれた放射線量をシンチレーションカウンターで定量した。細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で選択した細胞株を処理して適当な陽性コントロールとする。
実験的実施例に示すようにある生物学的特徴を有する抗体を選択する。
本発明の抗CD20抗体の成長阻害効果は、当業者に知られた方法、例として、CD20遺伝子を内因性または形質移入してCD20を発現する細胞を用いるなどの方法によって評価しうる。例えば、腫瘍細胞株およびCD20形質移入細胞を、様々な濃度の本発明の抗CD20モノクローナル抗体で2、3(例として2−7)日間処理し、クリスタル・バイオレットまたはMTTで染色、または他の比色アッセイ法によって分析した。増殖を測定する他の方法には、本発明の抗CD20抗体存在または非存在下にて処理した細胞による3H-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理後、細胞を回収して、DNA内に取り込まれた放射線量をシンチレーションカウンターで定量した。細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で選択した細胞株を処理して適当な陽性コントロールとする。
細胞死を誘導する抗体を選択するために、プロピジウムヨウ素化物(PI)、トリファンブルーまたは7AAD取り込みなどにより表される膜の完全性の欠損を対照と相対的に評価した。補体および免疫エフェクター細胞非存在下でPI取り込みアッセイを行う。CD20発現腫瘍細胞を単独培地または例として約10μg/mlの適当なモノクローナル抗体を含む培地で培養する。それぞれの処理後、細胞を洗浄して、細胞塊を除去するために35mm濾過器をかぶせた12×75チューブ(1チューブ当たり1ml、各処理群につき3チューブ)に分注する。その後、PI(10μg/ml)をチューブに加える。試料をFACSCANTMフローサイトメーターおよびFACSCONVERTTM CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)により分析しうる。PI取り込みにより決定されるような統計学上有意なレベルの細胞死を引き起こす抗体を細胞死誘導抗体として選択しうる。
対象の抗体により結合されるCD20上のエピトープに結合する抗体を検索するために、例としてAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に示されているように平凡なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗CD20抗体として同じ部位に結合するかエピトープに結合するかを決定するのに用いられる。代わりにまたは加えて、エピトープマッピングはこの分野でよく知られた方法によって行うことができる。例えば、接触する残基を同定するためにアラニンスキャニングによるように抗体の配列に突然変異が誘発される。変異した抗体は確実にフォールディングされるように初めにポリクローナル抗体との結合を試験する。異なる方法では、CD20の異なる領域に一致するペプチドを用いて、試験抗体の競合アッセイ、または試験抗体と特徴のあるまたは既知のエピトープを持つ抗体の競合アッセイを行うことができる。
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明はまた、ヒト化2H7変異体抗体をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするDNAは直ぐに単離され、通常の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
本発明はまた、ヒト化2H7変異体抗体をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするDNAは直ぐに単離され、通常の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
(i) シグナル配列成分
この発明のヒト化2H7抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然CD20結合抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第90/13646号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、ヒト化2H7抗体をコードするDNAにリーディングフレーム内でライゲーションさせる。
この発明のヒト化2H7抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然CD20結合抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第90/13646号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、ヒト化2H7抗体をコードするDNAにリーディングフレーム内でライゲーションさせる。
(ii) 複製開始点
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、細胞成分を同定してヒト化2H7抗体をコードする核酸を取り出すことができるもの、例えばDHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネインI及びII、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、細胞成分を同定してヒト化2H7抗体をコードする核酸を取り出すことができるもの、例えばDHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネインI及びII、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、ヒト化2H7抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979))。trp1遺伝子は、例えば、ATCC第44076号あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Leu2欠陥酵母株(ATCC20622あるいは38626)は、Leu2遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、1.6μmの円形プラスミドpKD1由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がK.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979))。trp1遺伝子は、例えば、ATCC第44076号あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Leu2欠陥酵母株(ATCC20622あるいは38626)は、Leu2遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、1.6μmの円形プラスミドpKD1由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がK.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識されヒト化2H7抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、phoAプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまたCD20結合抗体をコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識されヒト化2H7抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、phoAプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまたCD20結合抗体をコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許73657に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許73657に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのヒト化2H7抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス、及び最も好ましくはサルウィルス40(SV40)などのウィルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンcDNAの発現について、Reyes等, Nature, 297:598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンcDNAの発現について、Reyes等, Nature, 297:598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明のヒト化2H7抗体をコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、CD20結合抗体コード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
より高等の真核生物によるこの発明のヒト化2H7抗体をコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、CD20結合抗体コード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
(vi) 転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、CD20抗体をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、CD20抗体をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開された DD266710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌294(ATCC31446)であるが、他の大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31537)及び大腸菌W3110(ATCC27325)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開された DD266710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌294(ATCC31446)であるが、他の大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31537)及び大腸菌W3110(ATCC27325)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は細菌内で生成することができ、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能は必要でない、例として、治療的抗体が細胞障害性剤(例として、毒素)にコンジュゲートして、その免疫コンジュゲートが腫瘍細胞破壊に効果的である場合など。全長抗体は循環中で半減期が長い。大腸菌での生成がより早くよりコスト効率がよい。大腸菌における抗体断片およびポリペプチドの発現方法について、発現および分泌を最適化する転写開始領域(TIR)およびシグナル配列を記載している米国特許第5,648,237号 (Carterら.)、同第5,789,199号(Jolyら)、および同第5,840,523号 (Simmonsら)を参照のこと。これらの特許文献はここ文献として組み込まれる。発現後、可溶性分画の大腸菌ペーストから抗体を単離し、例としてアイソタイプによるプロテインAまたはGカラムにより精製しうる。例としてCHO細胞での発現抗体精製工程と同様にして最終的精製を行う。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、CD20結合抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ;クルイベロマイセス宿主、例えばK.ラクティス、K.フラギリス(ATCC12424)、K.ブルガリカス(ATCC16045)、K.ウィッケラミイ(ATCC24178)、K.ワルチイ(ATCC56500)、K.ドロソフィラルム(ATCC36906)、K.サーモトレランス、及びK.マルキシアナス;ヤローウィア(EP402226);ピチアパストリス(EP183070);カンジダ;トリコデルマ・リーシア(EP244234);アカパンカビ;シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス;及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
グリコシル化ヒト化2H7抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカNPVのL-1変異体とボンビクス・モリ NPVのBm-5株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))又はCHO-DP-一二株;マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2);イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442);ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75);ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065);マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、CD20結合抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
宿主細胞は、CD20結合抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
(viii) 宿主細胞の培養
本発明のCD20結合抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
本発明のCD20結合抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、とりわけアフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンFc領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、γ2、又はγ4重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ3に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのSEPHAROSETMクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5、好ましくは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5、好ましくは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。
抗体コンジュゲート
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンEおよびその類似体または誘導体が好ましい。
好ましい薬剤/毒素には、DNA阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、DNA干渉物質、DNA切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。好ましい薬剤/毒素には、DNA阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、DNA干渉物質、DNA切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、5フルオロウラシルの、そして、6メルカプトプリンのシトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、N(5、5-ジアセトキシペンチル)ドキソルビシン、モルフォリノ-ドキソルビシン、1(2-クロエチル)-1、2-ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、N8-アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてDM-1、メイタンシン、メイタンシノール、 N-デスメチル-4,5-デセポキシメイタンシノイド、C-19-デクロロメイタンシノイド、C-20-ヒドロキシメイタンシノール、 C-20-デメトキシメイタンシノール、C-9-SH メイタンシノール、C-14-アルコキシメチルメイタンシノール、C-14-ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、C-15-ヒドロキシ/アセチルオキシメイタンシノール、C-15-メトキシメイタンシノール、 C-18-N-デメチルメイタンシノールおよび4,5-デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンE、M、PHEおよびPE;ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチン A、ドロスタチン B、 ドロスタチン C、 ドロスタチン D、 ドロスタチン E (20-epi and 11-epi)、 ドロスタチン G、 ドロスタチン H、 ドロスタチン I、 ドロスタチン 1、 ドロスタチン 2、 ドロスタチン 3、 ドロスタチン 4、 ドロスタチン 5、 ドロスタチン 6、 ドロスタチン 7、 ドロスタチン 8、 ドロスタチン 9、 ドロスタチン 10、 deo-ドロスタチン 10、 ドロスタチン 11、 ドロスタチン 12、 ドロスタチン 13、 ドロスタチン 14、 ドロスタチン 15、 ドロスタチン 16、 ドロスタチン 17、 and ドロスタチン 18;セファロスタチン(cephalostatin)、例として セファロスタチン 1、 セファロスタチン 2、 セファロスタチン 3、 セファロスタチン 4、 セファロスタチン 5、 セファロスタチン 6、 セファロスタチン 7、 25'-epi-セファロスタチン 7、 20-epi-セファロスタチン 7、 セファロスタチン 8、 セファロスタチン 9、 セファロスタチン 10、 セファロスタチン 11、セファロスタチン 12、セファロスタチン 13、セファロスタチン 14、 セファロスタチン 15、セファロスタチン 16、セファロスタチン 17、 セファロスタチン 18、およびセファロスタチン 19を含む。
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンEおよびその類似体または誘導体が好ましい。
好ましい薬剤/毒素には、DNA阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、DNA干渉物質、DNA切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。好ましい薬剤/毒素には、DNA阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、DNA干渉物質、DNA切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、5フルオロウラシルの、そして、6メルカプトプリンのシトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、N(5、5-ジアセトキシペンチル)ドキソルビシン、モルフォリノ-ドキソルビシン、1(2-クロエチル)-1、2-ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、N8-アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてDM-1、メイタンシン、メイタンシノール、 N-デスメチル-4,5-デセポキシメイタンシノイド、C-19-デクロロメイタンシノイド、C-20-ヒドロキシメイタンシノール、 C-20-デメトキシメイタンシノール、C-9-SH メイタンシノール、C-14-アルコキシメチルメイタンシノール、C-14-ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、C-15-ヒドロキシ/アセチルオキシメイタンシノール、C-15-メトキシメイタンシノール、 C-18-N-デメチルメイタンシノールおよび4,5-デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンE、M、PHEおよびPE;ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチン A、ドロスタチン B、 ドロスタチン C、 ドロスタチン D、 ドロスタチン E (20-epi and 11-epi)、 ドロスタチン G、 ドロスタチン H、 ドロスタチン I、 ドロスタチン 1、 ドロスタチン 2、 ドロスタチン 3、 ドロスタチン 4、 ドロスタチン 5、 ドロスタチン 6、 ドロスタチン 7、 ドロスタチン 8、 ドロスタチン 9、 ドロスタチン 10、 deo-ドロスタチン 10、 ドロスタチン 11、 ドロスタチン 12、 ドロスタチン 13、 ドロスタチン 14、 ドロスタチン 15、 ドロスタチン 16、 ドロスタチン 17、 and ドロスタチン 18;セファロスタチン(cephalostatin)、例として セファロスタチン 1、 セファロスタチン 2、 セファロスタチン 3、 セファロスタチン 4、 セファロスタチン 5、 セファロスタチン 6、 セファロスタチン 7、 25'-epi-セファロスタチン 7、 20-epi-セファロスタチン 7、 セファロスタチン 8、 セファロスタチン 9、 セファロスタチン 10、 セファロスタチン 11、セファロスタチン 12、セファロスタチン 13、セファロスタチン 14、 セファロスタチン 15、セファロスタチン 16、セファロスタチン 17、 セファロスタチン 18、およびセファロスタチン 19を含む。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3,896,111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号;同4,248,870号;同4,256,746号;同4,260,608号;同4,265,814号;同4,294,757号;同4,307,016号;同4,308,268号;同4,308,269号;同4,309,428号;同4,313,946号;同4,315,929号;同4,317,821号;同4,322,348号;同4,331,598号;同4,361,650号;同4,364,866号;同4,424,219号;同4,450,254号;同4,362,663号;及び同4,371,533号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体C242に結合するDM1と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chariら, Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体A7、又はHER-2/neuオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235号B1、及びChari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、上記特許文献に開示されているように、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能価性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能価性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)(Carlsson等, Biochem. J. 173:723-737[1978])およびジスルフィド結合により提供されるN-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノアート(SPP)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
対象の他の免疫コンジュゲートには、1つ又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートしたCD20結合抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
放射性同位元素
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗CD20抗体を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗CD20抗体を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(MX-DTPA)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992);米国特許第5208020号)。
治療的用途
本発明のヒト化2H7 CD20結合抗体は、多くの悪性腫瘍および非悪性疾患、例えばB細胞リンパ腫及び白血病などのCD20陽性癌及び自己免疫性疾患の治療に有用である。骨髄の幹細胞(B細胞プロジェニター)はCD20抗原を欠損しており、治療後には健康なB細胞の再産生が可能となり、数か月以内には正常レベルにまで回復する。hu2H7.v511は本明細書に記載の治療方法に用いられるべき好適な抗体である。
CD20陽性癌は、細胞表面上にCD20を発現する細胞の異常な増殖を含むものである。CD20陽性B細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)を含むCD20陽性ホジキン病;非ホジキンリンパ腫(NHL);濾胞性中心細胞(FCC)リンパ腫;急性リンパ球性白血病(ALL);慢性リンパ球性白血病(CLL);線毛細胞白血病が含まれる。
本発明のヒト化2H7 CD20結合抗体は、多くの悪性腫瘍および非悪性疾患、例えばB細胞リンパ腫及び白血病などのCD20陽性癌及び自己免疫性疾患の治療に有用である。骨髄の幹細胞(B細胞プロジェニター)はCD20抗原を欠損しており、治療後には健康なB細胞の再産生が可能となり、数か月以内には正常レベルにまで回復する。hu2H7.v511は本明細書に記載の治療方法に用いられるべき好適な抗体である。
CD20陽性癌は、細胞表面上にCD20を発現する細胞の異常な増殖を含むものである。CD20陽性B細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)を含むCD20陽性ホジキン病;非ホジキンリンパ腫(NHL);濾胞性中心細胞(FCC)リンパ腫;急性リンパ球性白血病(ALL);慢性リンパ球性白血病(CLL);線毛細胞白血病が含まれる。
本明細書で使用する「非ホジキンリンパ腫」又は「NHL」という用語は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系の癌を意味する。通常、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とは、ホジキンリンパ腫にはリードシュテルンベルク細胞が存在し、非ホジキンリンパ腫には前記細胞が不在であることにより区別することができる。本明細書で使用する用語に含まれる非ホジキンリンパ腫の例は、従来技術に既知の分類方式、例えばColor Atlas of Clinical Hematology第3版; A. Victor Hoffbrand及びJohn E. Pettit(編)(Harcourt Publishers Limited 2000)。特に図11.57、11.58及び11.59参照)に記載の改訂版European-American Lymphoma (REAL)方式に従って当業者(腫瘍学者または病理学者)によって認識されるあらゆるものを含む。より具体的な例としては、限定するものではないが、再発性又は抵抗性NHL、前線低悪性度NHL、第III/IV期NHL、化学療法に抵抗性のNHL、前駆体Bリンパ芽球性白血病及び/又はリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、B細胞慢性リンパ性白血病及び/又は前リンパ球性白血病及び/又は小リンパ球リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫(immunocytoma)及び/又はリンパ形質細胞性リンパ腫、周辺帯B細胞リンパ腫、脾周辺帯リンパ腫、結節外周辺帯−MALTリンパ腫、結節周辺帯リンパ腫、有毛細胞白血病、プラズマ細胞腫及び/又は形質細胞骨髄腫、低悪性度/濾胞性リンパ腫、中悪性度/濾胞性NHL、マントル細胞リンパ腫、濾胞性中心リンパ腫(濾胞性)、中悪性度拡散性NHL、広汎性大B細胞リンパ腫、高悪性度NHL(高悪性度前線NHL及び高悪性度再発性NHLを含む)、自己幹細胞移植後の又は自己肝細胞移植に抵抗性のNHL再発、原発性縦隔大B細胞リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、高悪性度免疫芽細胞性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度非切断小細胞性NHL、巨大病変NHL、バーキットリンパ腫、前駆体(末梢性)大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び/又はセザリー症候群、皮膚(皮膚性)リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管動原体リンパ腫が挙げられる。
具体的な実施態様では、ヒト化CD20結合抗体及びその機能的な断片を用いて、非ホジキンリンパ腫(NHL)、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)及び慢性リンパ球性白血病(CLL)、またこれらの症状の再発を含む疾患を治療する。
低悪性度リンパ腫は成長が遅い難病であり、平均的な患者は緩解と再発を繰返し6から10年生存するものである。一実施態様では、ヒト化CD20結合抗体またはその機能的断片は低悪性度NHL、例えば再発した低悪性度NHL及びリツキシマブ抵抗性低悪性度NHLの治療に用いられる。再発した低悪性度NHL患者は、予め1クールのリツキシマブを投与し、6か月より長い期間応答したリツキシマブ応答者でありうる。
このヒト化2H7抗体又はその機能的断片は、例えば、再発性ないし抵抗性の低グレードないし濾胞性のCD20陽性のB細胞NHLのための単一薬剤治療(単一療法)として有用であるか、多剤投与計画において他の薬剤と組み合わせて患者に投与されうる。
低悪性度リンパ腫は成長が遅い難病であり、平均的な患者は緩解と再発を繰返し6から10年生存するものである。一実施態様では、ヒト化CD20結合抗体またはその機能的断片は低悪性度NHL、例えば再発した低悪性度NHL及びリツキシマブ抵抗性低悪性度NHLの治療に用いられる。再発した低悪性度NHL患者は、予め1クールのリツキシマブを投与し、6か月より長い期間応答したリツキシマブ応答者でありうる。
このヒト化2H7抗体又はその機能的断片は、例えば、再発性ないし抵抗性の低グレードないし濾胞性のCD20陽性のB細胞NHLのための単一薬剤治療(単一療法)として有用であるか、多剤投与計画において他の薬剤と組み合わせて患者に投与されうる。
本発明のヒト化2H7抗体又は機能的な断片は最前線の治療として使用することができる。また、本発明は、リツキシマブ(Genentech);オクレリズマブ(ocrelizumab)(Genentech, Inc.);イブリツモマブチウキセタン(ZevalinTM, Biogen Idec);トシツモマブ(BexxarTM, GlaxoSmithKline);HuMAX-CD20TM(GenMab);IMMU-106 (ヒト化抗CD20 a.k.a. hA20又は90Y-hLL2である, Immunomedics);AME-133(Applied Molecular Evolution/Eli Lilly);ゲムツズマブオゾガマイシン(MylotargTM, ヒト化抗CD33抗体, Wyeth/PDL);アレムツズマブ(CampathTM, 抗CD52抗体, Schering Plough/Genzyme);エピラツズマブ(IMMU-103TM, ヒト化抗CD22抗体, Immunomedics)、の何れか一の薬剤による治療に非応答性であるか又は応答が不十分であるCD20陽性B細胞腫瘍患者、又はこれらの薬剤による治療後に再発した患者の治療のための、これらの抗体の使用を意図する。
本発明は、さらに、本発明のヒト化2H7抗体、具体的な実施態様では2H7.v511及び2H7.v114によるフルダラビン治療に失敗した患者を含むCLL患者を治療する方法を提供する。
本発明は、さらに、本発明のヒト化2H7抗体、具体的な実施態様では2H7.v511及び2H7.v114によるフルダラビン治療に失敗した患者を含むCLL患者を治療する方法を提供する。
本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、アトピー、例としてアトピー性疾患、例えば花粉症及びジョブ症候群、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、X連鎖性過剰IgM症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎/皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(MS)、例えば脊椎-眼(spino-optical) MS)、一次進行性MS(PPMS)及び再発性寛解MS(RRMS)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(IBD)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ARDS)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、IgE媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び/又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(GN)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性GN、免疫性GN、膜性GN(膜性ネフロパシ)、特発性膜性GN又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性GN(MPGN)(タイプI及びタイプIIを含む)、急速進行性GN、アレルギー性症状及び応答、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、T細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、外因性の抗原、例えば妊娠中の胎児のABO血液型に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(SLE)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚SLE、亜急性の皮膚SLE、新生児期ループス症候群(NLE)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(I型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(IDDM)、成人発症型真正糖尿病(II型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びTリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎/結節性動脈周囲炎を含む)、微小多発動脈炎、CNS脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びANCA関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(CSS))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(AIHA)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(PRCA)、第VIII因子欠損症、血友病A、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、CNS炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばIgM多発性神経炎又はIgM媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、輸血後紫斑病(PTP)、ヘパリン誘導性血小板減少症、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のITPを含む特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(OMS)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(LIP)、閉塞性細気管支炎(非移植)対NSIP、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(IgAネフロパシ)、特発性IgAネフロパシ、線状IgA皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ALS;筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(AIED)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(OMS)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルB細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、MGUS)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びCNSのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(FSGS)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として、自己免疫脱髄性病及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、CREST症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、間質性肺線維症、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性又は慢性)、又はFuchの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Quervain甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、SCID及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、T細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びTリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群I型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(EBA)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ
症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、リンパ節炎、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、リンパ節炎、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
具体的な実施態様では、ヒト化2H7抗体及びその機能的な断片を用いて、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、例えばループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、例えば再発性寛解MS、乾癬、IgAネフロパシ、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、ANCA関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(NMO)及び糸球体腎炎を治療する。
「治療すること」または「処置」または「寛解」は、治療的処置を表し、この目的は標的とした病態または疾患を治癒しない場合に衰退(減少)させる、又は症状の再発を予防することである。本発明の方法に従って本発明のヒト化CD20結合抗体の治療的有効量を投与した後、患者のCD20陽性B細胞悪性腫瘍または自己免疫性疾患がうまく「治療」されれば、患者は特定の疾患の一またはそれ以上の兆候および症状が明らかにおよび/または測定可能な程度に減少または消失する。例えば、癌では、癌細胞数の有意な減少または癌細胞の消失;腫瘍の大きさの減少;腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止);ある程度の腫瘍成長の阻害;緩解期の延長、および/または特定の癌が関与する一またはそれ以上の症状のある程度の除去;罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善がある。疾患の兆候または症状の減弱は患者が感じ得るものである。癌のすべての兆候の消失を定義するならば、腫瘍の大きさが好ましくは50%以上、より好ましくは75%以上減少すると、処置が完全な反応または部分的な反応を達成し得たことになる。患者が疾患の安定を体験するならば、患者も治療されたと考える。ある基準では、本発明のh2H7抗体により末梢血のB細胞が95%より多く枯渇され、B細胞は基準の25%に戻る。好ましい実施態様では、本発明の抗体による治療は、治療後4か月、好ましくは6か月、より好ましくは1年、さらにより好ましくは2年又は2年以上に癌患者に癌の進行がないほどに有効である。疾患の改善および治療の成功を評価するこれらのパラメーターは医師などの適切な当業者に知られた常法によって容易に測定可能である。
「治療的有効量」という用語は、対象物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体または薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ;腫瘍の大きさを小さくし;癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し;腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し;腫瘍の成長をある程度阻害し;及び/又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。「治療する」の定義を参照。自己免疫性疾患の場合、治療的有効量の抗体又は他の薬剤は、疾患の徴候及び症状が軽減する低度に有効である。
腫瘍治療の効果又は成功を評価するパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の軽減を求めるであろう。パラメータには、疾患増悪の中央値、寛解期間及び安定期間が含まれうる。
次の文献は、リンパ腫及びCLL、それらの診断、治療、及び治療効果を測定するための標準的な医学的手法について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998;van Besien K及びCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, 70章, pp 1293-1338, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000;及びRai, K及びPatel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, 72章, pp1350-1362, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫又は自己免疫関連疾患の治療の効果又は成功を評価するためのパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の減退を求めるであろう。以下は例として挙げる。
次の文献は、リンパ腫及びCLL、それらの診断、治療、及び治療効果を測定するための標準的な医学的手法について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998;van Besien K及びCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, 70章, pp 1293-1338, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000;及びRai, K及びPatel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, 72章, pp1350-1362, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫又は自己免疫関連疾患の治療の効果又は成功を評価するためのパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の減退を求めるであろう。以下は例として挙げる。
一実施態様では、ヒト化2H7抗体及び具体的なhu2H7.v511及びその機能的断片を用いて関節リウマチを治療する。
RAは、二百万を超える米国人が罹っており患者の日常の活動を妨げる消耗性自己免疫疾患である。RAは身体自体の免疫系が不適切に関節組織を攻撃し健康な組織を破壊する慢性的な炎症を引き起こし関節内に損傷を生じる。症状には関節の炎症、腫れ、凝り、及び疼痛が含まれる。また、RAは全身性の疾患であるので、肺、眼及び骨髄のような他の組織に影響を持ちうる。知られている治療法はない。治療には、様々なステロイド系及び非ステロイド系薬剤、免疫抑制剤、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)、及び生物製剤が含まれる。しかしながら、多くの患者は治療に対して不十分な応答性のままである。
RAは、二百万を超える米国人が罹っており患者の日常の活動を妨げる消耗性自己免疫疾患である。RAは身体自体の免疫系が不適切に関節組織を攻撃し健康な組織を破壊する慢性的な炎症を引き起こし関節内に損傷を生じる。症状には関節の炎症、腫れ、凝り、及び疼痛が含まれる。また、RAは全身性の疾患であるので、肺、眼及び骨髄のような他の組織に影響を持ちうる。知られている治療法はない。治療には、様々なステロイド系及び非ステロイド系薬剤、免疫抑制剤、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)、及び生物製剤が含まれる。しかしながら、多くの患者は治療に対して不十分な応答性のままである。
抗体は初期RA(つまり、メトトレキセート(MTX)を受けたことがない)の患者において第一選択治療薬として、また単剤療法として、あるいは例えばMTX又はシクロホスファミドとの併用で又はその後に、使用することができる。あるいは、抗体は、DMARD及び/又はMTXに不応性の患者に対する二次療法として、また単剤療法あるいは例えばMTXとの併用で、使用することができる。ヒト化CD20結合抗体は、関節損傷の予防及び管理、構造損傷の遅延化、RAの炎症に伴う疼痛の軽減、及び中程度から重篤なRAの症状及び徴候の低減一般に有用である。RA患者は、RAの治療に使用される他の薬剤(以下の併用療法を参照)での治療に先立って、その治療後に、又はその治療と併せて、ヒト化CD20結合抗体で治療することができる。一実施態様では、疾患修飾性抗リウマチ薬での治療が過去に失敗したか、及び/又はメトトレキセート単独に対しては不十分な応答であった患者が、本発明のヒト化CD20結合抗体で治療される。この治療の一実施態様では、患者は、ヒト化CD20結合抗体を単独で投与(1日目と15日目に1gの静脈内注入);CD20結合抗体+シクロホスファミド投与(3日目と17日目に750mgの静脈内注入);又はCD20結合抗体+メトトレキセート投与を受ける17日の治療計画で治療される。
RAの間、身体が腫瘍壊死因子α(TNFα)を生産するので、TNFαインヒビターがその疾患の治療のために使われている。しかしながら、TNFαインヒビター、例としてエタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、そして、アダリムマブ(HUMIRATM)は、ネガティブな副作用、例えば感染、心不全及び髄鞘脱落を生じうる。したがって、一実施態様では、ヒト化CD20結合抗体又はその生物学上機能的な断片は、TNFαインヒビター薬剤によって経験されるこれらのネガティブな副作用のリスクを減らすべきRA患者の治療に、又は毒性(例えば心臓毒性)を経験する傾向があると考慮される患者を治療するために、例えば第一線の治療として有用である。また、ヒト化CD20結合抗体又はその生物学上機能的な断片は、TNFα-インヒビターで治療されたが、応答しない、TNFα-インヒビターに不十分な応答を有する(TNF-IR患者)か、又は数回の応答の後で疾患の再発を有するRA罹患被検体、又はTNFα-インヒビターによる治療に応答しそうにない被検体であることが決定された被検体の治療方法に有用である。一実施態様では、TNF-IRは、TNFαインヒビターによる治療の前に、100mg以下などの低用量で治療される。
RAの治療効果を評価する一方法は、American College of Rheumatology (ACR)基準に基づくものであり、これはとりわけ圧痛及び腫大した関節の改善の割合を測定するものである。RA患者は、無抗体治療(例えば、治療前のベースライン)又はプラセボ治療と比較して例えばACR20(20パーセントの改善)でスコア付けをすることができる。抗体治療の効果を評価する他の方法は、X線画像、例えば骨の侵食及び関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられるSharpX線スコアを含む。また、患者は、治療期間中又は治療後の時間期間においてHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防又は改善について評価をすることができる。ACR20基準は、圧痛(痛み)関節数と腫大関節数の両方に20%の改善があり、かつ5つの追加測定のうち少なくとも3つに20%の改善があることを含みうる。
1.視覚的アナログ尺度(VAS)による患者の疼痛評価
2.疾患活動性の患者の全体評価(VAS)
3.疾患活動性の医師の全体評価(VAS)
4.Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、及び
5.急性反応物質、CRP又はESR
ACR50及び70も同様に定義される。好ましくは少なくともACR20のスコア、好ましくは少なくともACR30、より好ましくは少なくともACR50、更により好ましくは少なくともACR70、最も好ましくは少なくともACR75より高いスコアに達する用量の本発明のCD20結合抗体を患者に投与する。
1.視覚的アナログ尺度(VAS)による患者の疼痛評価
2.疾患活動性の患者の全体評価(VAS)
3.疾患活動性の医師の全体評価(VAS)
4.Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、及び
5.急性反応物質、CRP又はESR
ACR50及び70も同様に定義される。好ましくは少なくともACR20のスコア、好ましくは少なくともACR30、より好ましくは少なくともACR50、更により好ましくは少なくともACR70、最も好ましくは少なくともACR75より高いスコアに達する用量の本発明のCD20結合抗体を患者に投与する。
乾癬性関節炎は独特で明瞭なX線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の場合、関節侵食及び関節腔狭小化も同様にシャープ(Sharp)スコアにより評価しうる。本発明のヒト化CD20結合抗体は関節損傷の予防並びに疾患の徴候及び疾病の症状の減弱に用いることができる。
本発明の更に他の態様は、本発明の治療的有効量のヒト化CD20結合抗体が、SLE又はループス腎炎に罹患している患者に投与されることによるSLE又はループス腎炎の治療方法である。SLEDAIスコアは疾患活動性の数値的定量化を付与する。SLEDAIは疾患活動性に相関することが知られている24の臨床及び治験パラメータの荷重指数であり、0−103の数的範囲である。Bryan Gescuk及びJohn Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照のこと。他のスコア法にはBILAGスコア法がある。二本鎖DNAに対する抗体は腎性発赤及び他のループスの症状を引き起こすと考えられている。抗体治療を受けている患者を、血清クレアチニン、尿タンパク、又は尿中の血液の有意で再現可能な増加として定義される腎性発赤までの時間についてモニターすることができる。あるいは又は加えて、抗核抗体及び二本鎖DNAに対する抗体のレベルについて患者をモニターできる。SLEの治療は高用量のコルチコステロイド及び/又はシクロホスファミド(HDCC)を含む。本明細書では、成功したループス治療は、紅斑が減少する、すなわち次の紅斑までの時間及び/又は重症度が軽減するであろう。
本発明の更に他の態様は、本発明の治療的有効量のヒト化CD20結合抗体が、SLE又はループス腎炎に罹患している患者に投与されることによるSLE又はループス腎炎の治療方法である。SLEDAIスコアは疾患活動性の数値的定量化を付与する。SLEDAIは疾患活動性に相関することが知られている24の臨床及び治験パラメータの荷重指数であり、0−103の数的範囲である。Bryan Gescuk及びJohn Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照のこと。他のスコア法にはBILAGスコア法がある。二本鎖DNAに対する抗体は腎性発赤及び他のループスの症状を引き起こすと考えられている。抗体治療を受けている患者を、血清クレアチニン、尿タンパク、又は尿中の血液の有意で再現可能な増加として定義される腎性発赤までの時間についてモニターすることができる。あるいは又は加えて、抗核抗体及び二本鎖DNAに対する抗体のレベルについて患者をモニターできる。SLEの治療は高用量のコルチコステロイド及び/又はシクロホスファミド(HDCC)を含む。本明細書では、成功したループス治療は、紅斑が減少する、すなわち次の紅斑までの時間及び/又は重症度が軽減するであろう。
脊椎関節症は一群の関節疾患であり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者及び医師の全体的評価測定ツールによって決定しうる。
脈管炎に関しては、全身性血管炎の患者のおよそ75%が抗好中球細胞質抗体を持ち、小/中サイズ血管を冒す3種の症状の一つにクラスター化される:ヴェーゲナー肉芽腫症(WG)、顕微鏡的多発性血管炎(MPA)及びチャーグ・ストラウス症候群(CSS)で、集合的にANCA関連脈管炎(AAV)として知られているもの。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(PGA)変化、及び乾癬領域及び重症度指数(PASI)スコア、乾癬症状評価(PSA)を含む臨床兆候及び疾患の症状の変化をモニターし、ベースライン症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的アナログ尺度で処置を通して定期的に、hu2H7.511などの本発明のヒト化CD20結合抗体で治療された乾癬患者を測定することができる。
患者はその治療抗体の最初の注入で注入反応又は注入関連症状を経験する場合がある。これらの症状の重症度はまちまちで、一般に医学的介入で改善することが可能である。これらの症状には、限定されるものではないが、インフルエンザに似た発熱、悪寒/寒気、吐き気、掻痒、頭痛、気管支痙攣、血管性浮腫が含まれる。本発明の疾患治療法が注入反応を最小にすることが望ましい。そのような副作用を軽減又は最小にするために、患者には、抗体の初期順化又は寛容化用量の後に治療的に有効な用量が投与されうる。順化用量は治療的に有効な用量よりも少なく、患者をより多い用量に耐えるように順化させる。
脈管炎に関しては、全身性血管炎の患者のおよそ75%が抗好中球細胞質抗体を持ち、小/中サイズ血管を冒す3種の症状の一つにクラスター化される:ヴェーゲナー肉芽腫症(WG)、顕微鏡的多発性血管炎(MPA)及びチャーグ・ストラウス症候群(CSS)で、集合的にANCA関連脈管炎(AAV)として知られているもの。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(PGA)変化、及び乾癬領域及び重症度指数(PASI)スコア、乾癬症状評価(PSA)を含む臨床兆候及び疾患の症状の変化をモニターし、ベースライン症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的アナログ尺度で処置を通して定期的に、hu2H7.511などの本発明のヒト化CD20結合抗体で治療された乾癬患者を測定することができる。
患者はその治療抗体の最初の注入で注入反応又は注入関連症状を経験する場合がある。これらの症状の重症度はまちまちで、一般に医学的介入で改善することが可能である。これらの症状には、限定されるものではないが、インフルエンザに似た発熱、悪寒/寒気、吐き気、掻痒、頭痛、気管支痙攣、血管性浮腫が含まれる。本発明の疾患治療法が注入反応を最小にすることが望ましい。そのような副作用を軽減又は最小にするために、患者には、抗体の初期順化又は寛容化用量の後に治療的に有効な用量が投与されうる。順化用量は治療的に有効な用量よりも少なく、患者をより多い用量に耐えるように順化させる。
用量
治療される徴候及び当分野の技量のある医師が理解する投薬に関連する因子に応じて、本発明の抗体は、毒素及び副作用を最小化する一方で、その徴候の治療に効果のある用量で投与される。所望の用量は、疾患及び疾患の重症度、疾患の段階、望ましいB細胞調節のレベル、及び当分野の技量のある医師に知られる他の因子に依存しうる。
自己免疫疾患の治療の場合、個々の患者の疾患及び/又は症状の重症度に応じて、ヒト化2H7抗体の用量を調節することによってB細胞の枯渇の程度を調節することが望ましい。B細胞の枯渇は完全でなければならないものではない。あるいは、全B細胞の枯渇は初期治療で望まれるかもしれないが、続く治療では部分的な枯渇のみを達成するように用量を調節してもよい。一実施態様では、B細胞枯渇は少なくとも20%であり、すなわち治療前のベースライン値と比較して80%以下のCD20陽性B細胞が残っている。他の実施態様では、B細胞枯渇は25%、30%、40%、50%、60%、70%又はそれ以上である。好ましくは、B細胞枯渇は、疾患の進行を停止させるのに、より好ましくは治療の元で特定の疾患の兆候や症状を緩解するのに、更により好ましくは疾患を治癒するのに、十分である。
治療される徴候及び当分野の技量のある医師が理解する投薬に関連する因子に応じて、本発明の抗体は、毒素及び副作用を最小化する一方で、その徴候の治療に効果のある用量で投与される。所望の用量は、疾患及び疾患の重症度、疾患の段階、望ましいB細胞調節のレベル、及び当分野の技量のある医師に知られる他の因子に依存しうる。
自己免疫疾患の治療の場合、個々の患者の疾患及び/又は症状の重症度に応じて、ヒト化2H7抗体の用量を調節することによってB細胞の枯渇の程度を調節することが望ましい。B細胞の枯渇は完全でなければならないものではない。あるいは、全B細胞の枯渇は初期治療で望まれるかもしれないが、続く治療では部分的な枯渇のみを達成するように用量を調節してもよい。一実施態様では、B細胞枯渇は少なくとも20%であり、すなわち治療前のベースライン値と比較して80%以下のCD20陽性B細胞が残っている。他の実施態様では、B細胞枯渇は25%、30%、40%、50%、60%、70%又はそれ以上である。好ましくは、B細胞枯渇は、疾患の進行を停止させるのに、より好ましくは治療の元で特定の疾患の兆候や症状を緩解するのに、更により好ましくは疾患を治癒するのに、十分である。
ジェネンテック及びバイオジェン・アイデックの臨床試験では、10mgの少なさから1gの用量までの範囲の抗CD20(hu2H7.v16及びリツキシマブ)の用量を使用して自己免疫疾患の治療効果が評価された(リツキシマブ研究に関する発明の背景の項目;及び国際公開公報04/056312の実施例16を参照)。一般に、約2週間の間隔をあけて2用量の抗体をこれらの臨床試験において投与した。臨床試験で治験した治療計画の例は、関節リウマチではヒト化CD20抗体2H7.v16に対して、2×10mg(つまり1用量当たり10mgで2用量;70kg、身長67インチの患者に対して〜10.1mg/m2の全用量)、2×50mg(70kg、身長67インチの患者に対して55mg/m2の全用量)、2×200mg(70kg、身長67インチの患者に対して220mg/m2の全用量)、2×500mg(70kg、身長67インチの患者に対して〜550mg/m2の全用量)及び2×1000mg(70kg、身長67インチの患者に対して1100mg/m2の全用量)であり;リツキサンに対して、2×500mg(70kg、身長67インチの患者に対して〜550mg/m2の全用量)、2×1000mg(70kg、身長67インチの患者に対して〜1100mg/m2の全用量)である。これらの用量のそれぞれにおいて、抗体の最初の用量の投与後に循環Bリンパ球の実質的な枯渇が観察された。現在、単一か二回の静脈内注入として10mgから2000mgの用量範囲も探求されている。
自己免疫疾患を治療し、自己免疫疾患に罹っている患者のB細胞を枯渇させる方法では、一実施態様では、0.1mgから1000mgの範囲の一定(フラット)な用量でヒト化2H7.511抗体が患者に投与される。我々は、300mg未満の一定用量、また10mgの用量でさえ、大幅なB細胞枯渇が達成されることを見出した。よって、異なる実施態様の本B細胞枯渇及び治療方法では、hu2H7.511抗体は、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、又は250mgの投薬量で投与される。例えば20mg、10mg又はそれ以下の低い用量は部分的な又は短期間のB細胞枯渇が目的である場合に使用することができる。一実施態様では、本用量及び投薬計画は関節リウマチ(RA)を治療する際に用いられる。
CD20陽性癌の治療の場合、本発明の抗CD20抗体の標的であるB細胞の枯渇を最大限にすることが望まれうる。よって、CD20陽性B細胞悪性腫瘍の治療の場合、B細胞を十分枯渇して、例えば腫瘍の成長(大きさ)、癌性細胞タイプの増殖、転移、特定の癌の他の徴候や症状をモニターすることによって技量のある医師によって評価され得る疾患の進行を少なくとも防ぐことが望まれる。好ましくは、B細胞の枯渇は、少なくとも2か月、より好ましくは3か月、更により好ましくは4か月、より好ましくは5か月、更により好ましくは6か月以上の間、疾患の進行を防ぐのに十分な程度である。更により好ましい実施態様では、B細胞の枯渇は、少なくとも6か月、より好ましくは9か月、より好ましくは1年、より好ましくは2年、より好ましくは3年、更により好ましくは5年以上緩解の時間を増やすのに十分な程度である。最も好ましい実施態様では、B細胞枯渇は十分に疾患を治癒する。好ましい実施態様では、癌患者のB細胞の枯渇は、治療の前の基本の値の少なくとも約75%、及びより好ましくは80%、85%、90%、95%、99%及び更に100%である。
NHLの治療の治験におけるv16及びv511を含むhu2H7抗体の用量及び投薬計画の例は、下記の実験的実施例18−20に記載する。
また、50、75、100、125、150、200、250、300、350mg/用量のmg/用量の用量が、NHLなどのB細胞悪性腫瘍の維持療法に用いられうる。
投薬の頻度はいくつかの因子に従って変化しうる。通常、患者は、ヒト化2H7 CD20結合抗体を少なくとも2用量で投与される。異なる実施態様では、2−4、2−8用量、2−10用量が投与されうる。一般的に、2用量は、1か月以内、一般に1、2又は3週空けて投与される。腫瘍学の一治療投薬計画では、200mg/m2から750mg/m2の間の用量で8回の静注が考慮される。RAのための一投薬計画では、患者は、v16、v114又はv511などのヒト化抗体を、6か月ごとに500mg、2回投与される。RAのための他の投薬計画は、9か月ごとに1000mg、2回である。v16、v114又はv511によるRAの第三の投薬計画は、6か月ごとに10mg、2回である。疾患又は再発の改善のレベルに応じて、更なる用量が、疾患過程を通じて、又は疾患維持療法として投与されうる。
また、50、75、100、125、150、200、250、300、350mg/用量のmg/用量の用量が、NHLなどのB細胞悪性腫瘍の維持療法に用いられうる。
投薬の頻度はいくつかの因子に従って変化しうる。通常、患者は、ヒト化2H7 CD20結合抗体を少なくとも2用量で投与される。異なる実施態様では、2−4、2−8用量、2−10用量が投与されうる。一般的に、2用量は、1か月以内、一般に1、2又は3週空けて投与される。腫瘍学の一治療投薬計画では、200mg/m2から750mg/m2の間の用量で8回の静注が考慮される。RAのための一投薬計画では、患者は、v16、v114又はv511などのヒト化抗体を、6か月ごとに500mg、2回投与される。RAのための他の投薬計画は、9か月ごとに1000mg、2回である。v16、v114又はv511によるRAの第三の投薬計画は、6か月ごとに10mg、2回である。疾患又は再発の改善のレベルに応じて、更なる用量が、疾患過程を通じて、又は疾患維持療法として投与されうる。
一又は複数の現行の治療法について十分に効果を示さない、耐性に乏しい又は禁忌を示す、自己免疫性疾患又はB細胞悪性腫瘍を有する患者は、本発明の何れかの投薬計画を用いて治療されうる。例えば、本発明は、腫瘍壊死因子(TNF)インヒビター治療に、または、疾患を修飾している抗リウマチ剤(DMARD)治療に不十分な応答を有したRA患者のための本治療方法を意図する。
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
投与経路
ヒト化2H7抗体は既知の方法で、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間の連続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、又は吸入経路で、一般的には静脈内又は皮下投与で、ヒト患者に投与される。
一般的に亜、腫瘍学的な徴候のために、ヒト化2H7製剤は注入などの静脈内経由により投与される。一実施態様では、ヒト化2H7抗体が注入ビヒクルとして0.9%塩化ナトリウム溶液を用いる静脈内注入によって投与される。関節リウマチの第I/II相臨床試験では静脈内注入により抗体製剤が投与される(実施例20を参照のこと)。
他の実施態様では、ヒト化2H7抗体は特に皮下注入により投与される。
ヒト化2H7抗体は既知の方法で、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間の連続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、又は吸入経路で、一般的には静脈内又は皮下投与で、ヒト患者に投与される。
一般的に亜、腫瘍学的な徴候のために、ヒト化2H7製剤は注入などの静脈内経由により投与される。一実施態様では、ヒト化2H7抗体が注入ビヒクルとして0.9%塩化ナトリウム溶液を用いる静脈内注入によって投与される。関節リウマチの第I/II相臨床試験では静脈内注入により抗体製剤が投与される(実施例20を参照のこと)。
他の実施態様では、ヒト化2H7抗体は特に皮下注入により投与される。
併用療法
上述のB細胞腫瘍の治療では、患者を、一又は複数の治療剤、例えば多剤併用療法の化学療法剤での治療と併せて本発明のヒト化2H7抗体で治療することができる。ヒト化2H7抗体は、化学療法剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性後に、投与することができる。リンパ腫の治療に対する標準的な化学療法には、シクロホスファミド、シタラビン、メルファラン及びミトキサントロン+メルファランが含まれうる。CHOPは非ホジキンリンパ腫の治療に対する最も一般的な化学療法の一つである。次のものはCHOP療法で用いられる薬剤である:シクロホスファミド(商品名シトキサン、ネオザール(neosar));アドリアマイシン(ドキソルビシン/ヒドロキシドキソルビシン);ビンクリスチン(オンコビン);及びプレドニゾロン(しばしばデルタゾン又はオラゾン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、CD20結合抗体は、次の化学療法剤:ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの一又は複数と併用して、それを必要とする患者に投与される。特定の実施態様では、リンパ腫(例えば非ホジキンリンパ腫)の患者はCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化2H7抗体で治療される。他の実施態様では、癌患者がCVP(シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化2H7 CD20結合抗体で治療されうる。具体的な実施態様では、CD20陽性NHLの患者はCVPと組み合わせてヒト化2H7.v511又はv114が、例えば3週ごとに8サイクル投与される。CLLの治療の具体的な実施態様では、2H7.v511抗体が、フルダラビン及びシトキサンの一又は双方での化学療法と併用して投与される。
上述のB細胞腫瘍の治療では、患者を、一又は複数の治療剤、例えば多剤併用療法の化学療法剤での治療と併せて本発明のヒト化2H7抗体で治療することができる。ヒト化2H7抗体は、化学療法剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性後に、投与することができる。リンパ腫の治療に対する標準的な化学療法には、シクロホスファミド、シタラビン、メルファラン及びミトキサントロン+メルファランが含まれうる。CHOPは非ホジキンリンパ腫の治療に対する最も一般的な化学療法の一つである。次のものはCHOP療法で用いられる薬剤である:シクロホスファミド(商品名シトキサン、ネオザール(neosar));アドリアマイシン(ドキソルビシン/ヒドロキシドキソルビシン);ビンクリスチン(オンコビン);及びプレドニゾロン(しばしばデルタゾン又はオラゾン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、CD20結合抗体は、次の化学療法剤:ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの一又は複数と併用して、それを必要とする患者に投与される。特定の実施態様では、リンパ腫(例えば非ホジキンリンパ腫)の患者はCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化2H7抗体で治療される。他の実施態様では、癌患者がCVP(シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化2H7 CD20結合抗体で治療されうる。具体的な実施態様では、CD20陽性NHLの患者はCVPと組み合わせてヒト化2H7.v511又はv114が、例えば3週ごとに8サイクル投与される。CLLの治療の具体的な実施態様では、2H7.v511抗体が、フルダラビン及びシトキサンの一又は双方での化学療法と併用して投与される。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシトキサン(CYTOXAN)(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類;ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類;アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類;TLK286(TELCYTATM);アセトゲニン類(特にブラタシン及びブラタシノン(bullatacinone));δ-9-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、マリノール(登録商標));β-ラパコン;ラパコール;コルヒチン類;ベツリン酸;カンプトセシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標))、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン(scopolectin)、及び9-アミノカンプトセシン);ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む);ポドフィロトキシン;ポドフィリン(podophyllinic)酸;テニポシド;クリプトフィシン類(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成アナログKW-2189及びCB1-TM1;エレウテロビン(eleutherobin);パンクラチスタチン;サルコジクチン(sarcodictyin);スポンジスタチン;クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア類(nitrosureas);クロドロネートなどのビスホスホネート類;抗生物質、例えばエンジイン系抗生物質(例えばカリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγII及びカリケアマイシンωII(例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)及びアントラサイクリン類、例えばアナマイシン(annamycin)、AD32、アルカルビシン、ダウノルビシン、デキストラゾキサン(dextrazoxane)、DX-52-1、エピルビシン、GPX-100、イダルビシン、KRN5500、メノガリル、ダイネミシンAを含むダイネミシン、エスペラマイシン、ネオカルチノスタチン発色団及び関連色素蛋白エンジイン抗生物質発光団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン類(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、アドリアマイシン(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エソルビシン(esorubicin)、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンCのようなマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、及びゾルビシン(zorubicin);デノプテリン(denopterin)、プテロプテリン(pteropterin)、及びトリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸アナログ;フルダラビン(fludarabine)、6-メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンのようなプリンアナログ;アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、6-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジンアナログ;カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類;アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタンのような抗副腎剤;ホリニン酸(ロイコボリン)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher);アセグラトン;抗葉酸抗腫瘍剤、例えばALIMTA(登録商標)、LY231514ペメトレキセド、ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート、代謝拮抗物質、例えば5-フルオロウラシル(5-FU)及びそのプロドラッグ、例えばUFT、S-1及びカペシタビン、及びチミジル酸シンターゼインヒビター及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼインヒビター、例えばラルチトレキセド(raltitrexed)(TOMUDEXRM、TDX);ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのインヒビター、例えばエニルウラシル(eniluracil);アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン(amsacrine);ベストラブシル(bestrabucil);ビサントレン(bisantrene);エダトラキセート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルシン(demecolcine);ジアジコン(diaziquone);エルフォルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate);エポチロン(epothilone);エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン(lonidainine);メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids);ミトグアゾン(mitoguazone);ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラクリン(nitracrine);ペントスタチン;フェナメット(phenamet);ピラルビシン;ロソキサントロン(losoxantron);2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR);ラゾキサン(razoxane);リゾキシン(rhizoxin);シゾフィラン;スピロゲルマニウム(spirogermanium);テニュアゾン酸(tenuazonic acid);トリアジコン(triaziquone);2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(trichothecenes)(特に、T-2トキシン、ベラキュリンA(verracurin A)、ロリジンA(roridin A)及びアングイジン(anguidine));ウレタン;ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標));ダカルバジン;マンノムスチン(mannomustine);ミトブロニトール;ミトラクトール(mitolactol);ピポブロマン(pipobroman);ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド類及びタキサン類、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETMパクリタキセルの無クレモホア(Cremophor)アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びタキソテール(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);クロランブシル;ゲンシタビン(gemcitabine)(GEMZAR(登録商標));6-チオグアニン;メルカプトプリン;プラチナ;シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナアナログ又はプラチナ系アナログ;ビンブラスチン(VELBAN(登録商標));エトポシド(VP-16);イフォスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標));ビンカアルカロイド;ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標));ノバントロン(novantrone);エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;キセローダ(xeloda);イバンドロネート(ibandronate);トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチロールニチン(DMFO);レチノイン酸のようなレチノイド類;上述したものの何れかの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体;並びに上記のものの二以上の組合せ、例えばCHOPで、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の省略形、及びFOLFOXで、5-FU及びロイコボリンと併用したオキサリプラチン(ELOXATINTM)での治療方法の省略形が含まれる。
この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標))、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON(登録商標)トレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節因子(SERM);例えば、4(5)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストール酢酸、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン(exemestane)、フォルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾールなどの、副腎のエストロゲン産物を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター;及び抗アンドロゲン類、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン;並びにトロキサシタビン(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ);アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばPKC-α、Raf、H-Ras、及び上皮増殖因子レセプター(EGF-R);ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン;PROLEUKIN(登録商標)rIL-2;LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ1インヒビター;ABARELIX(登録商標)rmRH;及び上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
加えて、hu2H7抗体及びその機能的な断片は、抗腫瘍血管新生剤、例えば血管内皮性増殖因子(VEGF)アンタゴニストと組み合わせてCD20発現B細胞腫瘍(例えば、NHL)を治療するために用いることができる。「抗血管形成剤」又は「血管形成インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそのコンジュゲートないしその融合タンパク質であって、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を直接又は間接的に阻害するものを指す。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義した血管形成剤に対する抗体ないし他のアンタゴニスト、例えばVEGFに対する抗体、VEGFレセプターに対する抗体、VEGFレセプターシグナル伝達をブロックする小分子(例えばPTK787/ZK2284、SU6668)である。「VEGFアンタゴニスト」は、一又は複数のVEGFレセプターへのVEGFの結合を含む、VEGF活性の中和、ブロック、阻害、抑制、低減又は妨げることができる分子を指す。一実施態様では、このようなB細胞腫瘍に罹患している患者はアバスチン(登録商標)(ベバシズマブ;Genentech)と組み合わせた2H7.v511又は2H7.v114で治療される。抗VEGF抗体である「ベバシズマブ(BV)」(「rhuMAb VEGF」又は「アバスチン(登録商標)」としても知られる)は、Presta 等 Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)に従って産生された組み換えヒト化抗VEGFモノクローナル抗体である。
hu2H7抗体及びその機能的な断片、具体的な実施態様では、2H7.v511及び2H7.v114はまた、TRAILとも称されるApo-2リガンド(Apo2L)などの、サイトカインのTNFファミリーのメンバーと組み合わせたCD20発現B細胞腫瘍の治療方法に有用である。完全長天然配列のヒトApo-2のリガンドは、281アミノ酸長の、サイトカインの腫瘍壊死因子ファミリーのタイプII膜貫通型タンパク質である。Apo-2リガンドの可溶性型、例えば細胞外ドメイン(ECD)ないしはその一部を含んでなるものは、哺乳類の癌細胞のアポトーシスの活性を含む様々な活性を有することが明らかにされている。Apo2L/TRAIL(国際公開公報97/01633及び国際公開公報97/25428において開示される)は、ECDの断片である可溶性ヒトタンパク質であり、完全長Apo-2Lタンパク質のアミノ酸114−281を含んでなる。
上述の自己免疫疾患又は自己免疫関連症状の治療では、患者を、例えば多剤治療法においては、免疫抑制剤のような第二の治療剤と併用して一又は複数のhu2H7.v511などのhu2H7抗体で治療することができる。hu2H7抗体は、免疫抑制剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性時に、投与することができる。免疫抑制剤は、当該分野で決められたものと同じか又は少ない用量で投与することができる。好適な補助免疫抑制剤は、治療される疾患のタイプ並びに患者の病歴を含む多くの因子に依存する。
上述の自己免疫疾患又は自己免疫関連症状の治療では、患者を、例えば多剤治療法においては、免疫抑制剤のような第二の治療剤と併用して一又は複数のhu2H7.v511などのhu2H7抗体で治療することができる。hu2H7抗体は、免疫抑制剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性時に、投与することができる。免疫抑制剤は、当該分野で決められたものと同じか又は少ない用量で投与することができる。好適な補助免疫抑制剤は、治療される疾患のタイプ並びに患者の病歴を含む多くの因子に依存する。
添加剤療法についてここで用いられる「免疫抑制剤」という用語は、患者の免疫系を抑制し又はマスクするように作用する物質を意味する。そのような薬剤には、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現をダウンレギュレート又は抑制する、あるいはMHC抗原をマスクする物質が含まれる。そのような薬剤の例には、糖質コルチコステロイド類、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾン及びデキサメタゾン;2-アミノ-6-アリール-5-置換ピリミジン類(米国特許第4665077号参照);アザチオプリン(又はアザチオプリンに対して副作用があるならばシクロホスファミド);ブロモクリプチン;グルタルアルデヒド(米国特許第4120649号に記載されているように、MHC抗原をマスクする);MHC抗原及びMHC断片に対する抗イディオタイプ抗体;シクロスポリンA;抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト;抗腫瘍壊死因子-α抗体;抗腫瘍壊死因子-β抗体;抗インターロイキン-2抗体及び抗IL-2レセプター抗体;抗L3T4抗体;異種抗リンパ球グロブリン;Pan-T抗体、好ましくは抗CD3又は抗CD4/CD4a抗体;LFA-3結合ドメインを持つ可溶型ペプチド(1990年7月26日に公開の国際公開第90/08187号);ストレプトキナーゼ;TGF-β;ストレプトドルナーゼ;宿主からのRNA又はDNA;FK506;RS-61443;デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin);ラパマイシイン(rapamycin);T細胞レセプター(米国特許第5114721号);T細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251:430-432 (1991);国際公開第90/11294号;及び国際公開第91/01133号);及びT10B9等のT細胞レセプター抗体(欧州特許出願公開第340109号)を含む。
関節リウマチの治療では、患者を、次の薬剤の任意の一又は複数と併用してCD20結合抗体(例えばリツキシマブ又はオクレリツマブ又はその変異体)で治療することができる:DMARDS(疾患修飾性抗リウマチ薬(例えばメトトレキセート))、NSAI又はNSAID(非ステロイド系抗炎症薬)、免疫抑制剤(例えばアザチオプリン;ミコフェノール酸モフェチル(CellCept(登録商標); Roche))、鎮痛薬、糖質コルチコステロイド、シクロホスファミド、HUMRIATM(アダリムマブ;Abbott Laboratories)、ARAVA(登録商標)(レフルノミド)、REMICADE(登録商標)(インフリキシマブ;Centocor Inc., Malvern, Pa)、ENBREL(エタネルセプト;Immunex, WA)、ACTEMRA(トシリツマブ;Roche, Switzerland)、COX-2インヒビター。RAに一般的に使用されるDMARDは、ヒドロキシクロロキン、サルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、D-ペニシルアミン、ゴールド(経口)、ゴールド(筋肉内)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌性プロテインA免疫吸着である。
アダリムマブは、TNFαと結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、TNFαと結合するキメラマウス-ヒトのモノクローナル抗体である。これは、RA及びクローン病を治療するために処方される免疫抑制剤である。インフリキシマブは、結核並びにMSとなる髄鞘脱落を含む感染及び心不全などの致命的な副作用と関係している。アクテムラ(トシリズマブ)は、ヒト化抗ヒトインターロイキン-6(IL-6)レセプターである。
エタネルセプトは、ヒトIgG1のFc部分に結合されるヒトの75kD(p75)腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。エタネルセプト(ENBREL(登録商標))は、活動中のRAの治療のために米国で承認された注射剤である。エタネルセプトはTNFαと結合して、関節及び血液からほとんどのTNFαを取り除くように働くことによって、TNFαが関節リウマチの炎症及び他の症状を促進するのを防止する。この薬剤は、深刻な感染及び敗血症を含むネガティブな副作用である、多発性硬化症(MS)などの神経系疾患と関係している。例として、www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.htmlを参照のこと。
エタネルセプトは、ヒトIgG1のFc部分に結合されるヒトの75kD(p75)腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。エタネルセプト(ENBREL(登録商標))は、活動中のRAの治療のために米国で承認された注射剤である。エタネルセプトはTNFαと結合して、関節及び血液からほとんどのTNFαを取り除くように働くことによって、TNFαが関節リウマチの炎症及び他の症状を促進するのを防止する。この薬剤は、深刻な感染及び敗血症を含むネガティブな副作用である、多発性硬化症(MS)などの神経系疾患と関係している。例として、www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.htmlを参照のこと。
RAの一般的な治療については、例えば“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、RAの患者はメトトレキセート(MTX)と併用して本発明のhu2H7 CD20抗体で治療される。MTXの投薬量の例は、約7.5−25mg/kg/週である。MTXは経口及び皮下的に投与することができる。
一例では、CD20抗体の注入の30分前に、メチルプレドニゾロン100mg静注と、第2〜7日目にプレドニゾン60mg経口、第8〜14日目に30mg経口、第16日までに基礎用量に戻すことからなる副腎皮質ステロイド投薬計画と共に、併用MTX(一経口投与(p.o.)又は一非経口投与につき10〜25mg/週)も患者に投与される。患者はまた、単回用量又は分割した一日量の何れかで、葉酸塩(5mg/週)が投与されうる。患者は、場合によって、治療期間の全体にわたって任意のバックグラウンド量の副腎皮質ステロイド(10mg/日 プレドニゾン又は等量)が投与され続ける。
一例では、CD20抗体の注入の30分前に、メチルプレドニゾロン100mg静注と、第2〜7日目にプレドニゾン60mg経口、第8〜14日目に30mg経口、第16日までに基礎用量に戻すことからなる副腎皮質ステロイド投薬計画と共に、併用MTX(一経口投与(p.o.)又は一非経口投与につき10〜25mg/週)も患者に投与される。患者はまた、単回用量又は分割した一日量の何れかで、葉酸塩(5mg/週)が投与されうる。患者は、場合によって、治療期間の全体にわたって任意のバックグラウンド量の副腎皮質ステロイド(10mg/日 プレドニゾン又は等量)が投与され続ける。
強直性脊椎炎、乾癬性関節炎及びクローン病の治療では、患者を、例えばレミケード(Remicade)(登録商標)(インフリキシマブ;Centocor Inc., Malvern, Pa.)、エンブレル(ENBREL)(エタネルセプト;Immunex, WA)と併用して本発明のCD20結合抗体で治療される。
SLEの治療は、高用量コルチコステロイド及び/又はシクロホスファミド(HDCC)とのCD20抗体の併用を含む。SLE、AAV及びNMOの患者は、次のコルチコステロイドの任意のものと併用して本発明のhu2H7抗体で治療することができる:コルチコステロイド、NSAID、鎮痛薬、COX-2インヒビター、糖質コルチコステロイド、一般的なDMARD(例えばメトトレキセート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド)、生物学的DMARD、例えば抗Blys(例えばベリムマブ)、抗IL6R、例えばトシリツマブ;CTLA4-Ig(アバタセプト)、(抗CD22、例えばエプラツズマブ)、免疫抑制剤(例えばアザチオプリン;ミコフェノール酸モフェチル(CellCept(登録商標); Roche))、及び細胞毒性剤(シクロホスファミド)。
SLEの治療は、高用量コルチコステロイド及び/又はシクロホスファミド(HDCC)とのCD20抗体の併用を含む。SLE、AAV及びNMOの患者は、次のコルチコステロイドの任意のものと併用して本発明のhu2H7抗体で治療することができる:コルチコステロイド、NSAID、鎮痛薬、COX-2インヒビター、糖質コルチコステロイド、一般的なDMARD(例えばメトトレキセート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド)、生物学的DMARD、例えば抗Blys(例えばベリムマブ)、抗IL6R、例えばトシリツマブ;CTLA4-Ig(アバタセプト)、(抗CD22、例えばエプラツズマブ)、免疫抑制剤(例えばアザチオプリン;ミコフェノール酸モフェチル(CellCept(登録商標); Roche))、及び細胞毒性剤(シクロホスファミド)。
乾癬の治療では、患者には、局所治療剤、例えば局所ステロイド類、アントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾール、及びタザロテンと併用して、あるいはメトトレキセート、レチノイド類、シクロスポリン、PUVA及びUVB療法と共に、ヒト化2H7抗体を投与することができる。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに連続して又はそれと同時にヒト化2H7抗体で治療される。
本発明のhu2H7抗体、特にhu2H7.v511及びhu2H7.v114は、同時、連続又は選択的な投与計画のBAFFアンタゴニストと組み合わせて自己免疫性疾患又はB細胞腫瘍を治療するために有用である。BAFF及びBAFFアンタゴニストは前述に定義される。一実施態様では、BAFFアンタゴニストは、ヒトBR3を結合する抗体であり、この抗体は好ましくはヒト化抗体、ヒト抗体又はキメラ抗体である。他の実施態様では、BAFFアンタゴニストはBR3-Fc融合タンパク質である。B細胞を減少させる際のBAFFアンタゴニストと抗CD20抗体の相乗効果は報告されている(例として、上掲の国際公開公報05/000351;Gong 等, (2005), J. Immunol. 174: 817-826を参照)。
毒性を最小にするために、伝統的な全身療法剤は、本投薬量のCD20結合抗体組成物と共により低用量の併用計画で、又は循環、連続、組合せ、又は間欠的な治療計画で投与することができる。
本発明のhu2H7抗体、特にhu2H7.v511及びhu2H7.v114は、同時、連続又は選択的な投与計画のBAFFアンタゴニストと組み合わせて自己免疫性疾患又はB細胞腫瘍を治療するために有用である。BAFF及びBAFFアンタゴニストは前述に定義される。一実施態様では、BAFFアンタゴニストは、ヒトBR3を結合する抗体であり、この抗体は好ましくはヒト化抗体、ヒト抗体又はキメラ抗体である。他の実施態様では、BAFFアンタゴニストはBR3-Fc融合タンパク質である。B細胞を減少させる際のBAFFアンタゴニストと抗CD20抗体の相乗効果は報告されている(例として、上掲の国際公開公報05/000351;Gong 等, (2005), J. Immunol. 174: 817-826を参照)。
毒性を最小にするために、伝統的な全身療法剤は、本投薬量のCD20結合抗体組成物と共により低用量の併用計画で、又は循環、連続、組合せ、又は間欠的な治療計画で投与することができる。
医薬製剤
本発明に従って使用されるhu2H7 CD20結合抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意の薬剤的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合して、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵するために調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリン類を含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はトゥイーン(TWEEN)TM、プルロニクス(PLURONICS)TM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
本発明に従って使用されるhu2H7 CD20結合抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意の薬剤的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合して、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵するために調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリン類を含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はトゥイーン(TWEEN)TM、プルロニクス(PLURONICS)TM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
例示的なhu2H7抗体製剤は、出典明示によりここに援用される国際公開第98/56418号に記載されている。他の製剤は、2−8℃で2年間の最小限の貯蔵期間を持つhu2H7抗体40mg/mL、25mM酢酸塩、150mMトレハロース、0.9%ベンジルアルコール、0.02%ポリソルベート20をpH5.0で含む液体複数回用量製剤である。興味ある他の抗CD20抗体製剤は、抗体10mg/mL、9.0mg/mL塩化ナトリウム、7.35mg/mLクエン酸ナトリウム二水和物、0.7mg/mLポリソルベート80、及び注入用の滅菌水を含み、pH6.5のものである。更に、他の水性医薬製剤は、pH約4.8からpH約5.5、好ましくはpH5.5の10−30mM酢酸ナトリウム、界面活性剤として約0.01−0.1%v/v量のポリソルベート、約2−10%w/v量のトレハロース、及び保存剤としてベンジルアルコールを含む(米国特許第6171586号)。皮下投与に適合化させた凍結乾燥製剤は国際公開第97/04801号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は適当な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成され得、また再構成製剤はここで治療される哺乳動物に皮下投与されうる。
具体的な実施態様では、ヒト化2H7 v16の一静注用製剤は、30mg/mlの抗体を含む20mM 酢酸ナトリウム、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20(Tween20TM)、pH5.3である。この静注用製剤は、NHLなどの腫瘍学的な適応症、並びに関節リウマチのために投与されうる。ヒト化2H7.v511変異体の一製剤は、15〜30mg/mlの抗体、好ましくは20mg/mlの抗体を含む、10mM 硫酸ヒスチジン、60mg/ml スクロース(6%)、0.2mg/ml ポリソルベート20(0.02%)及び静注用滅菌水、pH5.8である。さらに他の実施態様では、静脈内投与のための、2H7変異体、特に2H7.v511の製剤は、20mg/mlの2H7、20mM 酢酸ナトリウム、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20、pH5.5である。この製剤が、単回の静注のために使われうる。2H7.v114の一製剤は、15〜25mg/mlの抗体、好ましくは20mg/mlの抗体を含む、20mM 酢酸ナトリウム、240mM(8%) トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20、pH5.3である。
ここでの製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものをまた含みうる。例えば、細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカイン又は免疫抑制剤(例えば、シクロスポリン又はT細胞に結合する抗体、例えばLFA-1に結合するもの等のT細胞に作用するもの)を更に提供することが望ましい場合がある。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は疾病又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量でここに記載された投与経路又はこれまで用いられている用量の約1〜99%量で用いられる。
また活性成分は、例えばコアセルべーション技術又は界面重合化により調製したマイクロカプセル、例えば、コロイド状のドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョン中に、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に封入されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
また活性成分は、例えばコアセルべーション技術又は界面重合化により調製したマイクロカプセル、例えば、コロイド状のドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョン中に、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に封入されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
徐放製剤を調製することができる。徐放製剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの半透過性基質を含むものであり、該基質は、成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号), L-グルタミン酸及びL-グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性のエチレンビニル酢酸塩、分解性の乳酸・グリコール酸共重合体、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸・グリコール酸共重合体及びロイプロリド酢酸塩からなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリD-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって直ぐに達成できる。
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって直ぐに達成できる。
製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患及び関連症状及び非ホジキンリンパ腫などのCD20陽性癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のhu2H7、例えばhu2H7.v511である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。
パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び/又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示す。
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患及び関連症状及び非ホジキンリンパ腫などのCD20陽性癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のhu2H7、例えばhu2H7.v511である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。
パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び/又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示す。
製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第2の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
種々の目的、例えばB細胞殺傷アッセイ、アポトーシスアッセイのポジティブコントロールとして、細胞からのCD20の精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。CD20の単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合したhu2H7.v511抗体を含むことが可能である。インビトロにおけるCD20の検出及び定量化、例えばELISA又はウエスタンブロットのための抗体を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも1つの本発明の抗CD20抗体を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物(能書)は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
種々の目的、例えばB細胞殺傷アッセイ、アポトーシスアッセイのポジティブコントロールとして、細胞からのCD20の精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。CD20の単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合したhu2H7.v511抗体を含むことが可能である。インビトロにおけるCD20の検出及び定量化、例えばELISA又はウエスタンブロットのための抗体を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも1つの本発明の抗CD20抗体を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物(能書)は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
材料
マウス:ヒトCD20(hCD20)+マウスの作製は、hCD20遺伝子座を組み込んでいる細菌性人工染色体(BAC)の使用によって行った。陽性BACクローンを、hCD20を発現したトランスジェニック(Tg)樹立系統を作製するためにFVBマウス由来の胚細胞にインジェクションした。Gong 等 (2005) J. Immunol. 174:817-826のhCD20 Tg+マウスの作製及び特徴づけの詳細な説明を参照のこと。その後、HCD20 Tg+マウスを、hCD16Tg+mCD16−/−と交配させて、hCD20Tg+mCD16−/−hCD16Tg+マウスを作製し、このマウスを後述の研究に用いた。
抗体:FACS分析法で使用するすべての抗体は、BD PharMingenから購入した。
器材/ソフトウェア:FACS分析は、FACScan又はFACSCalibur機と、Becton Dickinsonから購入したCellQuestソフトウェアを使用して行った。
マウス:ヒトCD20(hCD20)+マウスの作製は、hCD20遺伝子座を組み込んでいる細菌性人工染色体(BAC)の使用によって行った。陽性BACクローンを、hCD20を発現したトランスジェニック(Tg)樹立系統を作製するためにFVBマウス由来の胚細胞にインジェクションした。Gong 等 (2005) J. Immunol. 174:817-826のhCD20 Tg+マウスの作製及び特徴づけの詳細な説明を参照のこと。その後、HCD20 Tg+マウスを、hCD16Tg+mCD16−/−と交配させて、hCD20Tg+mCD16−/−hCD16Tg+マウスを作製し、このマウスを後述の研究に用いた。
抗体:FACS分析法で使用するすべての抗体は、BD PharMingenから購入した。
器材/ソフトウェア:FACS分析は、FACScan又はFACSCalibur機と、Becton Dickinsonから購入したCellQuestソフトウェアを使用して行った。
一般的な方法
単一細胞懸濁液の調製:50μgのマウス血液をEDTA含有チューブを用いて眼窩から採取した後、ACK溶解バッファ(Biosourceから購入)を用いて赤血球溶血を行った。それらを除去した後、マウスの脾臓を、凍結したガラススライドを用いて単一細胞懸濁液に細粒化した。次いで、細胞ペレットを洗浄し、再懸濁して、濾過した。5mlの冷たいPBSを用いて、各マウスの腹腔を洗浄した。洗浄体液を5mlのシリンジに回収して遠心した。次いで、マウスの血液、脾臓及び腹膜からの白血球を洗浄して、計数した後にFACS分析のために染色した。
FACS染色:1%のアルブミン(Sigma)を含む100μlのリン酸緩衝食塩水中で様々な細胞表面マーカー(FACS分析の定義を参照)についておよそ1×106の細胞を染色した。氷上で30分間インキュベーションした後、染色した細胞を洗浄して、再懸濁した後にFACS分析を行った。
FACS分析:FACS分析は、CellQuestソフトウェアとFACSCalibur又はFACScanを用いて行った。血液中のB細胞をCD21+CD23+と定義し、腹膜のB細胞をCD19+と定義し、脾臓のB細胞をB220+と定義した。MZ(周辺帯)B細胞はCD21highCD23lowと定義し、FO(濾胞性)B細胞はCD21+CD23highと定義した。
統計学:データは、平均±標準誤差(n=5)として表した。統計学的分析は、両側の独立t検定(two-tail unpaired T test)を用いて行った。
単一細胞懸濁液の調製:50μgのマウス血液をEDTA含有チューブを用いて眼窩から採取した後、ACK溶解バッファ(Biosourceから購入)を用いて赤血球溶血を行った。それらを除去した後、マウスの脾臓を、凍結したガラススライドを用いて単一細胞懸濁液に細粒化した。次いで、細胞ペレットを洗浄し、再懸濁して、濾過した。5mlの冷たいPBSを用いて、各マウスの腹腔を洗浄した。洗浄体液を5mlのシリンジに回収して遠心した。次いで、マウスの血液、脾臓及び腹膜からの白血球を洗浄して、計数した後にFACS分析のために染色した。
FACS染色:1%のアルブミン(Sigma)を含む100μlのリン酸緩衝食塩水中で様々な細胞表面マーカー(FACS分析の定義を参照)についておよそ1×106の細胞を染色した。氷上で30分間インキュベーションした後、染色した細胞を洗浄して、再懸濁した後にFACS分析を行った。
FACS分析:FACS分析は、CellQuestソフトウェアとFACSCalibur又はFACScanを用いて行った。血液中のB細胞をCD21+CD23+と定義し、腹膜のB細胞をCD19+と定義し、脾臓のB細胞をB220+と定義した。MZ(周辺帯)B細胞はCD21highCD23lowと定義し、FO(濾胞性)B細胞はCD21+CD23highと定義した。
統計学:データは、平均±標準誤差(n=5)として表した。統計学的分析は、両側の独立t検定(two-tail unpaired T test)を用いて行った。
実施例1
2H7抗CD20マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトCD20抗体の2H7(ここではマウスをmとしてm2H7とも呼ぶ)のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス2H7抗体可変領域配列とマウスVとヒトCのキメラ2H7は開示されており、例えば米国特許第5,846,818号及び同第6,204,023号を参照のこと。2H7のCDR残基は、マウス2H7可変ドメインのアミノ酸配列(米国特許第5,846,818号に開示)を既知の抗体の配列と比較することにより同定された(Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。軽鎖と重鎖のCDR領域は配列高頻度可変性(上掲のKabat等)に基づいて定まり、図1A及び図1Bにそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド(表1)を用いて、部位特異的突然変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985))を使用して、プラスミドpVX4に含まれるコンセンサス配列VkI,VHIII(VLカッパサブグループI,VHサブグループIII)に対応する完全ヒトFabフレームワーク中に6つ全てのマウス2H7CDR領域を導入した(出典明記により本明細書中に組み込まれるPCT出願である、国際公開公報04/056342の図2を参照)。
2H7抗CD20マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトCD20抗体の2H7(ここではマウスをmとしてm2H7とも呼ぶ)のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス2H7抗体可変領域配列とマウスVとヒトCのキメラ2H7は開示されており、例えば米国特許第5,846,818号及び同第6,204,023号を参照のこと。2H7のCDR残基は、マウス2H7可変ドメインのアミノ酸配列(米国特許第5,846,818号に開示)を既知の抗体の配列と比較することにより同定された(Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。軽鎖と重鎖のCDR領域は配列高頻度可変性(上掲のKabat等)に基づいて定まり、図1A及び図1Bにそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド(表1)を用いて、部位特異的突然変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985))を使用して、プラスミドpVX4に含まれるコンセンサス配列VkI,VHIII(VLカッパサブグループI,VHサブグループIII)に対応する完全ヒトFabフレームワーク中に6つ全てのマウス2H7CDR領域を導入した(出典明記により本明細書中に組み込まれるPCT出願である、国際公開公報04/056342の図2を参照)。
ファージミドpVX4を突然変異誘発並びに大腸菌中でのF(ab)の発現に使用した。pB0475の誘導体(Cunningham等, Science 243: 1330-1336 (1989))であるファージミドpb0720に基づいて、pVX4は、ヒト化コンセンサスκ-サブグループI軽鎖(VLκI-CL)とヒト化コンセンサスIII重鎖(VHIII-CH1)抗IFN-α(インターフェロンα)抗体をコードするDNA断片を含む。pVX4はまた共に別の過去に開示されたpUC119ベースのプラスミドpAK2(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992))から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャイン-ダルガーノ配列を有している。独特のSpel制限部位をF(ab)軽鎖及び重鎖をコードするDNA間に導入した。抗IFN-α重鎖及び軽鎖双方の最初の23のアミノ酸はStII分泌シグナル配列である(Chang等, Gene 55: 189-196 (1987))。
2H7のCDRスワップバージョン(2H7.v2)を構築するために、部位特異的突然変異誘発をpVX4のデオキシウリジン含有鋳型で実施した;抗IFN-αの6つ全てのCDRがマウス2H7CDRに変化した。得られた分子をヒト化2H7バージョン(2H7.v2)又は2H7の「CDRスワップバージョン」と呼ぶ;これは図1A及び1Bに示されるコンセンサスヒトFR残基を有するm2H7CDR残基を有する。ヒト化2H7.v2は更なるヒト化に用いた。
2H7のCDRスワップバージョン(2H7.v2)を構築するために、部位特異的突然変異誘発をpVX4のデオキシウリジン含有鋳型で実施した;抗IFN-αの6つ全てのCDRがマウス2H7CDRに変化した。得られた分子をヒト化2H7バージョン(2H7.v2)又は2H7の「CDRスワップバージョン」と呼ぶ;これは図1A及び1Bに示されるコンセンサスヒトFR残基を有するm2H7CDR残基を有する。ヒト化2H7.v2は更なるヒト化に用いた。
表3はH及びL鎖においてマウス2H7(m2H7)CDRのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、CDR-H1オリゴヌクレオチドを使用してm2H7のH鎖を再作製した。CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3はH鎖CDR1、CDR2及びCDR3をそれぞれ意味する;同様に、CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3はL鎖CDRのそれぞれを意味する。CDR-H2における置換はCDR-H2AとCDR-H2Bの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表3.pVX4のヒトフレームワーク中へのマウス2H7CDRのCDRスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
表3.pVX4のヒトフレームワーク中へのマウス2H7CDRのCDRスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
ヒト化コンストラクトとの比較のために、キメラ2H7Fab(マウスVL及びVHドメイン、及びヒトCL及びCH1ドメインを含む)を発現するプラスミドを、2H7.v2中にマウスフレームワーク残基を導入するために合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然変異誘発(上掲のKunkel)によって構築した。2H7.v6.8として知られているキメラFabを発現させるための得られたプラスミドコンストラクトの配列を国際公開公報04/056342の図3に示す。Fabの各コード鎖は上にpVX4について記載された23のアミノ酸のStII分泌シグナル配列を有している。
ヒトVkI,VHIIIコンセンサスフレームワーク(図1A及び1B)及び過去のヒト化抗体(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992))とのマウス2H7フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって2H7.v2Fabコンストラクト中に導入した。これらの変異により、CDRコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス2H7フレームワークに見出されたものに変化した。バージョン3はVH(R71V,N73K)を、バージョン4はVH(R71V)を、バージョン5はVH(R71V,N73K)及びVL(L46P)を、バージョン6はVH(R71V,N73K)及びVL(L46P,L47W)を含んでいた。
ヒトVkI,VHIIIコンセンサスフレームワーク(図1A及び1B)及び過去のヒト化抗体(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992))とのマウス2H7フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって2H7.v2Fabコンストラクト中に導入した。これらの変異により、CDRコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス2H7フレームワークに見出されたものに変化した。バージョン3はVH(R71V,N73K)を、バージョン4はVH(R71V)を、バージョン5はVH(R71V,N73K)及びVL(L46P)を、バージョン6はVH(R71V,N73K)及びVL(L46P,L47W)を含んでいた。
m2H7抗体のヒト化及びキメラFab型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖DNAの調製のためにプラスミドを大腸菌株XL-1ブルー(Stratagene, San Diego, CA)中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法(SEQUENASE(登録商標)標識プライマーサイクル配列決定法、Sequenase, U.S. Biochemical Corp.)を使用して完全に配列決定した。プラスミドを、MM294の誘導体である大腸菌株16C9に形質転換し、5μg/mlのカルベニシリンを含むLBプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを37℃で5−8時間、5mlのLB-100μg/mlカルベニシリン中で成長させた。5mlの培養物を500mlのAP5-100μg/mlカルベニシリンに添加して、37℃で4Lの邪魔板振盪フラスコ中で16時間成長させた。AP5培地は1.5gのグルコース、11.0のHycase SF、0.6gの酵母エキス(保証付き)、0.19gの無水MgSO4、1.07gのNH4Cl、3.73gのKCl、1.2gのNaCl、120mlの1Mトリエタノールアミン、pH7.4からなり、1Lの水に加えた後、0.1μmのSealkeenフィルターを通して滅菌濾過した。
細胞を、3000×gにて1Lの遠心分離瓶(Nalgene)で遠心分離によって収集し、上清を除去した。1時間の凍結後、ペレットを25mlの非放射性10mM MES-10mM EDTA、pH5.0(バッファーA)中に再懸濁させた。250μlの0.1M フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)(Sigma)を添加してタンパク質分解を阻止し、3.5mlの原液10mg/mlのニワトリの卵の白色リゾチーム(Sigma)を添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で1時間、穏やかに振盪した後、試料を40000×gで15分、遠心分離した。上清をバッファーAを用いて50mlにし、バッファーAで平衡にした2mlのDEAEカラムに充填した。ついで、バッファーAで平衡にしたプロテインGセファロースCL-4B(Pharmacia)カラム(0.5ml床容積)に流通させた。カラムを10mlのバッファーAで洗浄し、1.25mlの1Mトリス、pH8.0に入れた3mlの0.3Mグリシン、pH3.0で溶出させた。ついで、F(ab)をセントリコン-30(Amicon)を使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中にバッファー交換し、0.5mlの最終容積まで濃縮した。全てのF(ab)のSDS-PAGEゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。
細胞ベースのELISA結合アッセイ(以下に記載)においては、キメラ2H7Fabを含むFabのCD20への結合は検出が難しかった。従って、2H7Fabバージョンをアッセイと更なる突然変異誘発のために完全長IgG1抗体として再形態化した。
完全長IgGの発現のためのプラスミドは、キメラ2H7(v6.8)FabのVL及びVHドメイン並びにヒト化Fabバージョンないし6を、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたpRKベクター(Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990))中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各FabコンストラクトをEcoRV及びBlpIを用いて消化させてVL断片を切除し、これを、完全な軽鎖(VL-CLドメイン)の発現のためにプラスミドpDR1(国際公開公報04/056312の図4)のEcoRV/BlpI部位にクローニングした。また、各FabコンストラクトをPvuII及びApaIで消化させてVH断片を切除し、これを、完全な重鎖(VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン)の発現のためにプラスミドpDR2(国際公開公報04/056312の図5)のPvuII/ApaI部位中にクローニングした。各IgG変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株293(Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977))中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、293細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖DNAと、続いてpAdVAntageTMDNA(Promega, Madison, WI)を添加し、細胞を37℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し4日後に収集した。抗体を、プロテインA-セファロースCL-4Bを使用して培養上清から精製した後、バッファーを10mMコハク酸ナトリウム、140mM NaCl、pH6.0に交換し、Centricon-10(Amicon)を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
完全長IgGの発現のためのプラスミドは、キメラ2H7(v6.8)FabのVL及びVHドメイン並びにヒト化Fabバージョンないし6を、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたpRKベクター(Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990))中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各FabコンストラクトをEcoRV及びBlpIを用いて消化させてVL断片を切除し、これを、完全な軽鎖(VL-CLドメイン)の発現のためにプラスミドpDR1(国際公開公報04/056312の図4)のEcoRV/BlpI部位にクローニングした。また、各FabコンストラクトをPvuII及びApaIで消化させてVH断片を切除し、これを、完全な重鎖(VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン)の発現のためにプラスミドpDR2(国際公開公報04/056312の図5)のPvuII/ApaI部位中にクローニングした。各IgG変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株293(Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977))中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、293細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖DNAと、続いてpAdVAntageTMDNA(Promega, Madison, WI)を添加し、細胞を37℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し4日後に収集した。抗体を、プロテインA-セファロースCL-4Bを使用して培養上清から精製した後、バッファーを10mMコハク酸ナトリウム、140mM NaCl、pH6.0に交換し、Centricon-10(Amicon)を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
CD20抗原に対する相対的結合親和性を測定するために、細胞ベースのELISAアッセイ法を開発した。ヒトBリンパ芽球腫WIL2-S細胞(ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD)を、加湿した5%CO2インキュベーターにおいて、2mMのL-グルタミン、20mMのHEPES、pH7.2及び10%の熱不活化仔ウシ血清を補填したRPMI1640中で成長させた。細胞を、1%胎仔ウシ血清(FBS)含有FBS(アッセイバッファー)で洗浄し、96ウェルの丸底プレート(Nunc, Roskilde, Denmark)中で250−300000細胞/ウェルにて播種した。アッセイバッファー中、2倍の連続希釈標準(15.6−1000ng/mlの2H7v6.8キメラIgG)と3倍の連続希釈試料(2.7−2000ng/ml)をプレートに添加した。プレートを氷中に埋設し、45分間、インキュベートした。未結合抗体を除くために、ウェルに0.1mLのアッセイバッファーを添加した。プレートを遠心分離し、上清を除去した。細胞を0.2mLのアッセイバッファーでもう2回洗浄した。プレートに結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトFc抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)をプレートに添加することによって検出した。45分のインキュベーション後、細胞を前に記載したようにして洗浄した。TMB基質(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン;Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)をプレートに添加した。1Mのリン酸を加えて反応を停止させた。滴定曲線を4変数非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いてフィッティングさせた。滴定曲線の中点の吸光度(中央-OD)とその対応する標準濃度を決定した。ついで、この中央-ODでの各変異体の濃度を決定し、標準の濃度を各変異体の濃度で割った。よって、値は、標準に対する各変異体の結合比である。相対親和性の標準偏差(等価濃度)は一般に実験値の+/−10%であった。
表4に示されるように、CDR-スワップ変異体(v.2)のCD20結合はキメラ2H7(v.6.8)と比較すると極めて低減していた。しかしながら、バージョン3ないし6は改善された結合性を示した。キメラ2H7のものに対する結合親和性を回復させるのに必要とされるかも知れない変異の最小数を決定するために、更なる変異及び変異の組み合わせを部位特異的突然変異誘発によって構築して、表5に示される変異体7から17を産生した。特に、これらはVH変異A49G、F67A、I69L、N73K、及びL78A;及びVL変異M4L、M33I、及びF71Yを含んでいた。バージョン16及び17は、キメラバージョンの2倍内の、最良の相対的結合親和性を示し、2者間に有意差はなかった(標準偏差=+/−10%)。よって、変異の数を最小にするために、マウスフレームワーク残基に対してヒトフレームワーク残基の4の変異のみを有するバージョン16(表5)を、更なる特徴付けのためのヒト化型として選択した。
表4.細胞ベースELISAを使用してキメラ2H7と比較したCD20に対するヒト化2H7IgG変異体の相対的結合親和性。相対的結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対するキメラ2H7の濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat(上掲のKabat等)の番号付けに従ったCDR-スワップバージョンに対するものである。
表5.ヒト化2H7バージョン16(2H7.v16)における変異VH(A49G、R71V、N73K)及びVL(L46P)の構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。下線のコドンは示されたアミノ酸置換をコードする。VH(R71V、N73K)及びVL(L46P)に対して、オリゴは、Fab鋳型での突然変異誘発に使用されたので、センス鎖として示される一方、VH(A49G)に対して、オリゴは、pRK(IgG重鎖)鋳型と共に使用されたので、アンチセンス鎖として示される。バージョン16のタンパク質配列を上記の組成物の項目に示す。
実施例2
2H7CDR領域内の更なる変異
Alaスキャニングによって重要であると同定されたCDR位置での更なる残基の置換及び置換の組み合わせをまた試験した。幾つかの組み合わせた変異体、特にv.96はv.16よりもより強固に結合したようであった。
2H7CDR領域内の更なる変異
Alaスキャニングによって重要であると同定されたCDR位置での更なる残基の置換及び置換の組み合わせをまた試験した。幾つかの組み合わせた変異体、特にv.96はv.16よりもより強固に結合したようであった。
表6.細胞ベースELISA(WIL-2S細胞)を使用して測定したヒト化2H7.v16のCDR領域における変異と非アラニン置換の組み合わせの効果。CD20に対する相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v16親の濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す;比>1は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat(上掲のKabat等)の番号付けに従った2H7.v16に対するものである。
実施例3
亢進したエフェクター機能を持つヒト化2H7変異体
2H7は補体依存性細胞障害性(CDC)と抗体依存性細胞障害性(ADCC)の双方を介してB細胞の溶解を媒介しうるので、改善されたCDC及びADCC活性を持つヒト化2H7.v16の変異体の作製を試みた。補体成分C1qへの向上した結合性を介してCDCを改善するために、他の抗体のFc領域内でのある種の残基の変異は記載されている(Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001))。活性化FcγレセプターへのIgG結合性の向上と阻害性FcγレセプターへのIgG結合性の向上によってADCCを改善するための変異もまた記載されている(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta等, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002))。特に、記載されているようにして(上掲のIdusogie等 (2001);上掲のShields等)3の変異がCDC及びADCC活性の改善のために同定されている:S298A/E333A/K334A(ここでは、三重Ala変異又は変異体とも呼ぶ;Fc領域の番号付けはEU番号付け法による;上掲のKabat等)。
亢進したエフェクター機能を持つヒト化2H7変異体
2H7は補体依存性細胞障害性(CDC)と抗体依存性細胞障害性(ADCC)の双方を介してB細胞の溶解を媒介しうるので、改善されたCDC及びADCC活性を持つヒト化2H7.v16の変異体の作製を試みた。補体成分C1qへの向上した結合性を介してCDCを改善するために、他の抗体のFc領域内でのある種の残基の変異は記載されている(Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001))。活性化FcγレセプターへのIgG結合性の向上と阻害性FcγレセプターへのIgG結合性の向上によってADCCを改善するための変異もまた記載されている(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta等, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002))。特に、記載されているようにして(上掲のIdusogie等 (2001);上掲のShields等)3の変異がCDC及びADCC活性の改善のために同定されている:S298A/E333A/K334A(ここでは、三重Ala変異又は変異体とも呼ぶ;Fc領域の番号付けはEU番号付け法による;上掲のKabat等)。
2H7のCDC及びADCC活性を向上させるために、2H7Fcの三重Ala変異体を構築した。抗HER2抗体4D5のヒト化変異体は、変異S298A/E333A/K334Aで産生されており、4D5Fc110として知られている(つまり、抗p185HER2IgG1(S298A/E333A/K334A);上掲のShields等)。プラスミドである抗体4D5Fc110をコードするp4D5Fc110(上掲のShields等)をApaIとHindIIIで消化させ、Fc断片(変異S298A/E333A/K334Aを含む)を2H7重鎖ベクターpDR2-v16のApaI/HindIII部位に結合させ、pDR2-v31を産生した。バージョン31の完全H鎖のアミノ酸配列は上記の組成物の項目に示す。L鎖はv16のものと同じである。
IgG1抗体のFc領域の定常ドメインは与えられた種内にかなり保存されているが、対立遺伝子変異が存在している(Lefranc及びLefranc, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib編, Pergammon Press, Oxford (1990)に概説)。
IgG1抗体のFc領域の定常ドメインは与えられた種内にかなり保存されているが、対立遺伝子変異が存在している(Lefranc及びLefranc, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib編, Pergammon Press, Oxford (1990)に概説)。
表7.CD20結合性に対するFc領域中の置換の効果。CD20への相対結合性は、フレームワーク置換の細胞ベース(WIL2-S)アッセイで測定した。Fc変異(*)はEU番号付け法(上掲のKabat)により、2H7.v16親に対するものである。v.31のFc領域の3つのAla変化の組み合わせは「Fc110」と記載される。IgG変異体は2H7.v16バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v6.8キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。
実施例4
向上した安定性を持つヒト化2H7変異体
治療用タンパク質としての開発のためには、好適な製剤バッファー中で、酸化、脱アミド化、又は生成物の品質に影響を及ぼしうる他のプロセスに対して安定なままである変異体を選択することが望ましい。2H7.v16では、幾つかの残基が不安定性の原因として同定された:VL(M32)及びVH(M34、N100)。従って、v16との比較でこれらの部位に変異を導入した。
向上した安定性を持つヒト化2H7変異体
治療用タンパク質としての開発のためには、好適な製剤バッファー中で、酸化、脱アミド化、又は生成物の品質に影響を及ぼしうる他のプロセスに対して安定なままである変異体を選択することが望ましい。2H7.v16では、幾つかの残基が不安定性の原因として同定された:VL(M32)及びVH(M34、N100)。従って、v16との比較でこれらの部位に変異を導入した。
表8.細胞ベース(WIL2-S)アッセイにおけるCD20に対する、安定性及び/又はエフェクター機能の向上のために設計された2H7変異体の相対結合性。IgG変異体は2H7.v16バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v6.8キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して+/−10%であった。可変ドメインにおけるフレームワーク置換はKabatの番号付けに従った2H7.v16に対するものであり、Fc変異(*)はEU番号付けによって示される(上掲のKabat等)。(**)標準コンパレーターとして2H7.v16で測定された変異体;相対的な結合値はキメラの値に対して正規化してある。
更なるFc変異が過去に報告された変異(Idusogie等 (2000);Idusogie等 (2001);Shields等 (2001))に基づいてエフェクター機能を改変又は亢進するために安定性又は親和性亢進変異と組み合わせた。前述のようにこれらの変異にはS298、E333A、K334Aが含まれ;CDC活性の低減のためのK322A;ADCC活性の低減のためのD265A;CDC活性の亢進のためのK326A又はK326W;及びFc領域内のアロタイプ変異の効果の試験のためのE356D/M358Lが含まれる。これらの変異の何れもCD20結合親和性に有意な差異を生じなかった。
更なるFc変異が過去に報告された変異(Idusogie等 (2000);Idusogie等 (2001);Shields等 (2001))に基づいてエフェクター機能を改変又は亢進するために安定性又は親和性亢進変異と組み合わせた。前述のようにこれらの変異にはS298、E333A、K334Aが含まれ;CDC活性の低減のためのK322A;ADCC活性の低減のためのD265A;CDC活性の亢進のためのK326A又はK326W;及びFc領域内のアロタイプ変異の効果の試験のためのE356D/M358Lが含まれる。これらの変異の何れもCD20結合親和性に有意な差異を生じなかった。
タンパク質の分解速度に対する安定性変異の効果を試験するために、2H7.v16と2H7.v73を10mMのヒスチジン、6%のスクロース、0.02%のポリソルベート20、pH5.8中12−14mg/mLで処方し、40℃で16日間インキュベートした。ついで、インキュベートした試料につき、イオン交換クロマトグラフィーによって荷電変異体における変化を、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集と断片化を、細胞ベース(WIL2-S)アッセイでの試験によって相対結合性をアッセイした。
結果は、加速された安定性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによる主ピークのフラクションの喪失について、2H7.v73が2H7.v16と比較して大なる安定性を有していることを示した。凝集、断片化又は結合親和性については有意差は見られなかった。
結果は、加速された安定性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによる主ピークのフラクションの喪失について、2H7.v73が2H7.v16と比較して大なる安定性を有していることを示した。凝集、断片化又は結合親和性については有意差は見られなかった。
実施例5
補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイ
2H7IgG変異体について、本質的に開示されている(Idusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000);Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001))CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2-S細胞の補体依存性溶解を媒介するその能力をアッセイした。抗体を0.1mg/mL原液から1:3で連続希釈した。各希釈物の0.05mLのアリコートを、0.05mLの正常なヒト補体溶液(Quidel, San Diego, CA)を含んだ96ウェル組織培養プレートに加えた。この混合物に、0.05mL容積で50000WIL2-S細胞を加えた。37℃で2時間のインキュベーション後、0.05mLのアラマーブルー(Accumed International, Westlake, OH)の溶液を加え、37℃で更に18時間、インキュベーションを継続した。ついで、カバーをプレートから除去し、それを軌道振盪器で室温にて15分振盪した。相対蛍光単位(RFU)を530nm励起フィルター及び590nm発光フィルターを使用して読み取った。KaLeidaGraphソフトウェアを使用して各抗体に対して濃度の関数としてRFUをフィッティングさせることによってEC50を計算した。
結果(表9)は、ヒト化2H7抗体によるCDCの驚くべき改善を示しており、v.73に対してはリツキサン(登録商標)と同様の相対作用強度で、v.75に対してはリツキサン(登録商標)より3倍強く、v.16に対してはリツキサン(登録商標)より3倍弱い。
補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイ
2H7IgG変異体について、本質的に開示されている(Idusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000);Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001))CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2-S細胞の補体依存性溶解を媒介するその能力をアッセイした。抗体を0.1mg/mL原液から1:3で連続希釈した。各希釈物の0.05mLのアリコートを、0.05mLの正常なヒト補体溶液(Quidel, San Diego, CA)を含んだ96ウェル組織培養プレートに加えた。この混合物に、0.05mL容積で50000WIL2-S細胞を加えた。37℃で2時間のインキュベーション後、0.05mLのアラマーブルー(Accumed International, Westlake, OH)の溶液を加え、37℃で更に18時間、インキュベーションを継続した。ついで、カバーをプレートから除去し、それを軌道振盪器で室温にて15分振盪した。相対蛍光単位(RFU)を530nm励起フィルター及び590nm発光フィルターを使用して読み取った。KaLeidaGraphソフトウェアを使用して各抗体に対して濃度の関数としてRFUをフィッティングさせることによってEC50を計算した。
結果(表9)は、ヒト化2H7抗体によるCDCの驚くべき改善を示しており、v.73に対してはリツキサン(登録商標)と同様の相対作用強度で、v.75に対してはリツキサン(登録商標)より3倍強く、v.16に対してはリツキサン(登録商標)より3倍弱い。
表9.リツキサンと比較した2H7抗体のCDC活性。>1の数はリツキサン(登録商標)より弱いCDC活性を示しており、<1の数はリツキサン(登録商標)より強い活性を示している。抗体は、(*)によって示したものが一過性に産生された以外は、安定なCHO株から産生された。
実施例6
抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)アッセイ
2H7IgG変異体について、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)読み取りを使用して、本質的に開示されている(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2-S細胞のナチュラルキラー細胞(NK細胞)溶解を媒介するその能力をアッセイした。NK細胞を、CD16としても知られている(Koene等, Blood 90:1109-1114 (1997))FcγRIIIに対してアイソタイプであった正常なヒトドナーから得られた100mLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で希釈した100mLのヘパリン処理血液から調製した。この実験では、NK細胞はCD16(F158/V158)に対してヘテロ接合性のヒトドナーからのものであった。希釈した血液を15mLのリンパ球分離培地(ICN Biochemical, Aurora, Ohio)上に層状にし2000RPMで20分間、遠心分離した。層間界面の白血球を4本の清浄な50mLチューブに分配し、それに15%の胎仔ウシ血清を含むRPMI培地を満たした。チューブを1400RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをMACSバッファー(0.5%BSA、2mM EDTA)中に再懸濁させ、ビーズ(NK細胞単離キット,130-046-502)を製造者のプロトコール(Miltenyi Biotech)に従って使用してNK細胞を精製した。NK細胞をMACSバッファーで2×106細胞/mLまで希釈した。
アッセイ培地(グリシンなしのF12/DMEM50:50、1mMのHEPESバッファー、pH7.2、ペニシリン/ストレプトマイシン(100単位/mL;Gibco)、グルタミン、及び1%熱不活化仔ウシ血清)中の抗体の連続希釈物(0.05mL)を、96ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。WIL2-S細胞をアッセイバッファーで4x105/mLの濃度まで希釈した。WIL2-S細胞(ウェル当たり0.05mL)を96ウェルプレート中で希釈抗体と混合し、室温で30分間、インキュベートしてCD20への抗体の結合を可能にした(オプソニン作用)。
抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)アッセイ
2H7IgG変異体について、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)読み取りを使用して、本質的に開示されている(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2-S細胞のナチュラルキラー細胞(NK細胞)溶解を媒介するその能力をアッセイした。NK細胞を、CD16としても知られている(Koene等, Blood 90:1109-1114 (1997))FcγRIIIに対してアイソタイプであった正常なヒトドナーから得られた100mLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で希釈した100mLのヘパリン処理血液から調製した。この実験では、NK細胞はCD16(F158/V158)に対してヘテロ接合性のヒトドナーからのものであった。希釈した血液を15mLのリンパ球分離培地(ICN Biochemical, Aurora, Ohio)上に層状にし2000RPMで20分間、遠心分離した。層間界面の白血球を4本の清浄な50mLチューブに分配し、それに15%の胎仔ウシ血清を含むRPMI培地を満たした。チューブを1400RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをMACSバッファー(0.5%BSA、2mM EDTA)中に再懸濁させ、ビーズ(NK細胞単離キット,130-046-502)を製造者のプロトコール(Miltenyi Biotech)に従って使用してNK細胞を精製した。NK細胞をMACSバッファーで2×106細胞/mLまで希釈した。
アッセイ培地(グリシンなしのF12/DMEM50:50、1mMのHEPESバッファー、pH7.2、ペニシリン/ストレプトマイシン(100単位/mL;Gibco)、グルタミン、及び1%熱不活化仔ウシ血清)中の抗体の連続希釈物(0.05mL)を、96ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。WIL2-S細胞をアッセイバッファーで4x105/mLの濃度まで希釈した。WIL2-S細胞(ウェル当たり0.05mL)を96ウェルプレート中で希釈抗体と混合し、室温で30分間、インキュベートしてCD20への抗体の結合を可能にした(オプソニン作用)。
各ウェルに0.1mLのNK細胞を添加してADCC反応を開始させた。コントロールウェルでは、2%のTRITONX-100アルキルアリルポリエーテルアルコールを添加した。ついで、プレートを37℃で4時間インキュベートした。放出されたLDHのレベルを、細胞傷害性(LDH)検出キット(キット番号1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana)を製造者のプロトコールに従って使用して測定した。0.1mLのLDH展開液を各ウェルに加えた後、10秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で15分暗室でインキュベートした。ついで、490nmでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全LDHで割ることによって溶解%を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、4変数曲線フィッティング(KaLeidaGraph)を用いてEC50濃度を決定した。
結果は、ヒト化2H7抗体がADCCに活性があり、v.31に対してはリツキサン(登録商標)の20倍強い相対作用強度で、v.16に対してはリツキサン(登録商標)より5倍強く、v.73に対してはリツキサン(登録商標)よりほぼ4倍強い。
結果は、ヒト化2H7抗体がADCCに活性があり、v.31に対してはリツキサン(登録商標)の20倍強い相対作用強度で、v.16に対してはリツキサン(登録商標)より5倍強く、v.73に対してはリツキサン(登録商標)よりほぼ4倍強い。
表10.n回の実験に基づいて2H7.v16と比較したWIL2-S細胞に対する2H7抗体のADCC活性。(>1の値は2H7.v16より低い作用強度を示し、<1の値はより大なる強度を示す。)
更なるADCCアッセイを実施してリツキサン(登録商標)と2H7の組み合わせ変異体を比較した。これらのアッセイの結果は、2H7.v114及び2H7.v115がリツキサン(登録商標)と比較して>10倍の改善されたADCC作用強度を有することを示している(表11)。
更なるADCCアッセイを実施してリツキサン(登録商標)と2H7の組み合わせ変異体を比較した。これらのアッセイの結果は、2H7.v114及び2H7.v115がリツキサン(登録商標)と比較して>10倍の改善されたADCC作用強度を有することを示している(表11)。
表11.n回の実験に基づいてリツキサン(登録商標)と比較したWIL2-S細胞に対する2H7抗体のADCC活性(>1の値はリツキサン(登録商標)より低い作用強度を示し、<1の値はより大なる強度を示す)。
実施例7
FcRn結合についてのアッセイ
Fc内にアミノ酸変異(例えばN434W、N434Y、N434F、N434A、N434H、N434A+E380A+T307A)を有する可溶性Fc変異体を発現させ、精製して、それらのヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスのFcRnに対する親和性をBIAcore結合アッセイにて分析した。また、Fc変異体をサイズ排除クロマトグラフィによって分析して、それらの凝集傾向を決定した。
変異体Fc断片は、突然変異体pW0437ファジミドにて34B8大腸菌細胞を形質転換して、無リン酸培地中で30℃で24時間生育してFc遺伝子の発現を誘発し、細胞を回収した。細胞ペーストを終夜凍結して、10mM トリス、1mM EDTA中での浸透圧ショックによって、溶解した。溶解物を遠心によって、クリアにし、プロテインAカラムに流した。カラムをPBSにて洗浄して、可溶性FcをプロテインAクエン酸溶出バッファ(0.1M クエン酸塩、pH3.0)にて溶出して、トリスpH7.5にて中和した。可溶性FcをAmicon Centriprepにて濃縮した。
FcRn結合についてのアッセイ
Fc内にアミノ酸変異(例えばN434W、N434Y、N434F、N434A、N434H、N434A+E380A+T307A)を有する可溶性Fc変異体を発現させ、精製して、それらのヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスのFcRnに対する親和性をBIAcore結合アッセイにて分析した。また、Fc変異体をサイズ排除クロマトグラフィによって分析して、それらの凝集傾向を決定した。
変異体Fc断片は、突然変異体pW0437ファジミドにて34B8大腸菌細胞を形質転換して、無リン酸培地中で30℃で24時間生育してFc遺伝子の発現を誘発し、細胞を回収した。細胞ペーストを終夜凍結して、10mM トリス、1mM EDTA中での浸透圧ショックによって、溶解した。溶解物を遠心によって、クリアにし、プロテインAカラムに流した。カラムをPBSにて洗浄して、可溶性FcをプロテインAクエン酸溶出バッファ(0.1M クエン酸塩、pH3.0)にて溶出して、トリスpH7.5にて中和した。可溶性FcをAmicon Centriprepにて濃縮した。
ヒト、カニクイザル、ラット又はマウスのFcRnを、密度を変えて(100−3000のRU)、Biacore CM5チップ上にNHS化学法によって固定した。Fc変異体はpH6.0のPBSにて10μMから1nMまで段階的に希釈し、結合を時間とともにモニターした。親の無ヒンジFc(すなわち野生型)では、huFcRnに対する結合はほぼすぐに平衡状態に達した。これは、とても速い会合係数と解離係数を有することを示し、平衡状態分析によって、測定するとおよそ700nMのKdであった。N434W変異体では、会合係数は有意に遅く、解離係数は非常に遅い。より遅い流量で長時間N434Wを注入することによって、平衡状態の分析が可能であり、Kdはおよそ4nMであった。変異体N434W、N434F、N434Aおよび3突然変異体N434A+E380A+T307Aは、pH6.0において、野生型Fcに対してそれぞれ170倍以下、9倍以下、2.7倍以下および14倍以下の親和性の増加を示した。対照的に、pH7.4においては、huFcRnに対するN434変異体の親和性は、このアッセイで測定されないほど有意に低かった。野生型と比較してN434WはカニクイザルFcRnへの結合を有意に改善せず、ラットFcRnへの結合についてはおよそ10倍改善されるだけで、マウスFcRnへの結合についてはWTと実質的に同じであることが示された。したがって、この突然変異による改善は、ヒトFcRnに特異的なものである。
2H7.v138のヒトIgG1変異体は、ビオチン化FcRnを用いたELISAにおいてヒトFcRnに対するpH依存性の結合について分析した。MaxiSorp96ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)は、2μg/mlのNeutrAvidin (Pierce, Rockford, IL)を含む50mM 炭酸塩緩衝液、pH9.6、100μl/ウェルにて4℃で終夜おいてコートした。プレートを、0.05%ポリソルベートを含有するPBS(洗浄バッファ)、pH7.4にて洗浄し、150μl/ウェルの、0.5%BSAを含有するPBS、pH7.4にてブロックした。室温で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、pH7.4にて洗浄した。ヒトFcRnは、ビオチン-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH)を使用してビオチン化した。ビオチン化FcRnは、0.5%BSA、0.05%ポリソルベート20を含有するPBS(試料バッファ)、pH7.4に2μg/ml、100μl/ウェルの量で、プレートに添加した。プレートを1時間インキュベートして、洗浄バッファpH6.0にて洗浄した。7つのIgG抗体の二倍段階希釈液(3.1−200ng/ml)を含む試料バッファ、pH6.0をプレートに添加した。2時間インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファ、pH6.0にて洗浄した。結合したIgGは、ペルオキシダーゼ標識ヤギF(ab')2抗ヒトIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を試料バッファ、pH6.0中に100μl/ウェルで添加することによって検出した。1時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、pH6.0にて洗浄し、次いで基質3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を100μl/ウェルで添加した。100μl/ウェルの1M リン酸を加えることによって反応を止めた。multiskanAscent読み取り器(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて450nmの吸光度を読み取った。標準曲線の中間点(中間OD)の吸光度を算出した。この中間ODの標準物質及び試料の対応する濃度は、4-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いた滴定曲線から決定した。標準物質の中間OD濃度を試料の中間OD濃度で割って相対的な活性を算出した。
pH6.0又はpH7.4での結合IgGのFcRnからの解離を評価するために、同様にアッセイを行った。ただし、試料のインキュベーション工程の後とプレートを洗浄する場合にはpH6.0又はpH7.4の試料バッファを100μl/ウェルで添加した。プレートを45分間インキュベートして洗浄した。ついで、上記のようにアッセイを続けた。
実施例8
FcRn突然変異を有するヒト化抗CD20 IgG1変異体の特徴づけ
また、ヒトFcのファージディスプレイによって特定される突然変異を、完全な抗体である2H7.v138のバックグラウンドにおけるその変異の効果について試験した。2H7.v138は、Fcが以下の突然変異:S298A、K326A、E333A、K334Aによる亢進したADCCおよびCDC活性のために修飾されているヒト化抗CD20抗体である。位置N434の突然変異をこのバックグラウンドに導入し、IgG(表12)は前述のように293細胞の一過性形質移入によって調製した。いずれの場合においても、精製されたIgG変異体は、上記の通りにサイズ排除クロマトグラフィによって低レベルのタンパク質凝集であることが示された。
表12 ヒト化抗CD20抗体2H7.v138の変異体
FcRn突然変異を有するヒト化抗CD20 IgG1変異体の特徴づけ
また、ヒトFcのファージディスプレイによって特定される突然変異を、完全な抗体である2H7.v138のバックグラウンドにおけるその変異の効果について試験した。2H7.v138は、Fcが以下の突然変異:S298A、K326A、E333A、K334Aによる亢進したADCCおよびCDC活性のために修飾されているヒト化抗CD20抗体である。位置N434の突然変異をこのバックグラウンドに導入し、IgG(表12)は前述のように293細胞の一過性形質移入によって調製した。いずれの場合においても、精製されたIgG変異体は、上記の通りにサイズ排除クロマトグラフィによって低レベルのタンパク質凝集であることが示された。
表12 ヒト化抗CD20抗体2H7.v138の変異体
2H7.v138のヒトIgG1変異体は、ビオチン化FcRnを用いたELISAにおいてヒトFcRnに対するpH依存性の結合について分析した。MaxiSorp96ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)は、2μg/mlのNeutrAvidin (Pierce, Rockford, IL)を含む50mM 炭酸塩緩衝液、pH9.6、100μl/ウェルにて4℃で終夜おいてコートした。プレートを、0.05%ポリソルベートを含有するPBS(洗浄バッファ)、pH7.4にて洗浄し、150μl/ウェルの、0.5%BSAを含有するPBS、pH7.4にてブロックした。室温で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、pH7.4にて洗浄した。ヒトFcRnは、ビオチン-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH)を使用してビオチン化した。ビオチン化FcRnは、0.5%BSA、0.05%ポリソルベート20を含有するPBS(試料バッファ)、pH7.4に2μg/ml、100μl/ウェルの量で、プレートに添加した。プレートを1時間インキュベートして、洗浄バッファpH6.0にて洗浄した。7つのIgG抗体の二倍段階希釈液(3.1−200ng/ml)を含む試料バッファ、pH6.0をプレートに添加した。2時間インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファ、pH6.0にて洗浄した。結合したIgGは、ペルオキシダーゼ標識ヤギF(ab')2抗ヒトIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を試料バッファ、pH6.0中に100μl/ウェルで添加することによって検出した。1時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、pH6.0にて洗浄し、次いで基質3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を100μl/ウェルで添加した。100μl/ウェルの1M リン酸を加えることによって反応を止めた。multiskanAscent読み取り器(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて450nmの吸光度を読み取った。標準曲線の中間点(中間OD)の吸光度を算出した。この中間ODの標準物質及び試料の対応する濃度は、4-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いた滴定曲線から決定した。標準物質の中間OD濃度を試料の中間OD濃度で割って相対的な活性を算出した。
pH6.0又はpH7.4での結合IgGのFcRnからの解離を評価するために、同様にアッセイを行った。ただし、試料のインキュベーション工程の後とプレートを洗浄する場合にはpH6.0又はpH7.4の試料バッファを100μl/ウェルで添加した。プレートを45分間インキュベートして洗浄した。ついで、上記のようにアッセイを続けた。
結果は、Fc変異体で観察されたものと類似の相対的な結合能を示す。pH6.0での相対的な結合親和性はv477>v478=v479>v364>v138である。pH7.4での相対的な結合親和性は、pH6.0での同じ相対的な結合親和性より一貫して弱い:v477>v478=v479>v364>v138。
これらのFc突然変異は、概してヒトIgG抗体に適用できる。
結果は、Fc変異体で観察されたものと類似の相対的な結合能を示す。pH6.0での相対的な結合親和性はv477>v478=v479>v364>v138である。pH7.4での相対的な結合親和性は、pH6.0での同じ相対的な結合親和性より一貫して弱い:v477>v478=v479>v364>v138。
これらのFc突然変異は、概してヒトIgG抗体に適用できる。
実施例9
カニクイザルでのパイロット研究における2H7変異体のインビボ効果
CHO細胞の一過性トランスフェクションによって産生した2H7変異体を、そのインビボ活性を評価するために、正常な雄カニクイザル(Macaca fascicularis)で試験した。C2B8(リツキサン(登録商標))のような他の抗CD20抗体では、正常な霊長類においてB細胞を枯渇させる能力が実証されている(Reff等, Blood 83: 435-445 (1994))。
一研究では、ヒト化2H7変異体を比較した。並行した研究では、リツキサン(登録商標)をまたカニクイザルにおいて試験した。4匹のサルを5種の用量グループのそれぞれにおいて使用した:(1)ビヒクル、(2)0.05mg/kg hu2H7.v16、(3)10mg/kg hu2H7.v16、(4)0.05mg/kg hu2H7.v31、及び(5)10mg/kg hu2H7.v31。抗体は、全体で2用量について0、0.2、又は20mg/mLの濃度で、研究の1日目に一用量、8日目に他の用量、静脈内投与した。投薬の最初の日を1日目とし、その前の日を−1日目と標記する;回復の最初の日(各グループの2匹について)を11日目と標記する。血液サンプルを−19、−12、1(投薬前)日目、及び最初の投薬後6時間目、24時間目、及び72時間目に集めた。更なるサンプルを8日目(投薬前)、10日目(2匹/グループの屠殺前)、及び36日目及び67日目(回復した動物について)に採取した。
カニクイザルでのパイロット研究における2H7変異体のインビボ効果
CHO細胞の一過性トランスフェクションによって産生した2H7変異体を、そのインビボ活性を評価するために、正常な雄カニクイザル(Macaca fascicularis)で試験した。C2B8(リツキサン(登録商標))のような他の抗CD20抗体では、正常な霊長類においてB細胞を枯渇させる能力が実証されている(Reff等, Blood 83: 435-445 (1994))。
一研究では、ヒト化2H7変異体を比較した。並行した研究では、リツキサン(登録商標)をまたカニクイザルにおいて試験した。4匹のサルを5種の用量グループのそれぞれにおいて使用した:(1)ビヒクル、(2)0.05mg/kg hu2H7.v16、(3)10mg/kg hu2H7.v16、(4)0.05mg/kg hu2H7.v31、及び(5)10mg/kg hu2H7.v31。抗体は、全体で2用量について0、0.2、又は20mg/mLの濃度で、研究の1日目に一用量、8日目に他の用量、静脈内投与した。投薬の最初の日を1日目とし、その前の日を−1日目と標記する;回復の最初の日(各グループの2匹について)を11日目と標記する。血液サンプルを−19、−12、1(投薬前)日目、及び最初の投薬後6時間目、24時間目、及び72時間目に集めた。更なるサンプルを8日目(投薬前)、10日目(2匹/グループの屠殺前)、及び36日目及び67日目(回復した動物について)に採取した。
末梢B細胞濃度を、CD3−/CD40+細胞をカウントするFACS法によって決定した。サルサンプル中における全リンパ球のCD3−CD40+B細胞の割合を、次のゲーティング方策によって得た。前方散乱/側方散乱散乱図上にリンパ球集団をマークして領域1(R1)を決めた。R1での事象を使用して、CD40及びCD3マーカーに対して蛍光強度ドットプロットを表示した。蛍光的に標識したアイソタイプコントロールを用いて、CD40及びCD3陽性の各カットオフ点を決定した。
結果は、2H7.v16と2H7.v31の双方が10mg/kg用量で完全な末梢B細胞枯渇を、また0.05mg/kg用量で部分的な末梢B細胞枯渇を生じさせることができたことを示している。投薬の最初の72時間の間に測定されたB細胞枯渇の時間経過と程度は二つの抗体について同様であった。回復動物の続く分析は、2H7.v31で処置した動物が2H7.v16を投薬したものと比較してB細胞の長い枯渇を示したことを示している。特に、10mg/kgの2H7.v16で処置した回復動物は10日目と36日目の採取の間のある時に実質的なB細胞回復を示した。しかしながら、10mg/kgの2H7.v31で処置した回復動物では、36日目と67日目の間のある時にならないとB細胞は回復を示さなかった。これは、2H7.v16と比較して2h7.V31の場合に約1か月完全な枯渇の期間が長くなることを示唆している。
結果は、2H7.v16と2H7.v31の双方が10mg/kg用量で完全な末梢B細胞枯渇を、また0.05mg/kg用量で部分的な末梢B細胞枯渇を生じさせることができたことを示している。投薬の最初の72時間の間に測定されたB細胞枯渇の時間経過と程度は二つの抗体について同様であった。回復動物の続く分析は、2H7.v31で処置した動物が2H7.v16を投薬したものと比較してB細胞の長い枯渇を示したことを示している。特に、10mg/kgの2H7.v16で処置した回復動物は10日目と36日目の採取の間のある時に実質的なB細胞回復を示した。しかしながら、10mg/kgの2H7.v31で処置した回復動物では、36日目と67日目の間のある時にならないとB細胞は回復を示さなかった。これは、2H7.v16と比較して2h7.V31の場合に約1か月完全な枯渇の期間が長くなることを示唆している。
低用量又は高用量でのサルの試験では毒性は観察されず、全体的な症状は正常であった。他の試験では、v16はこれらのサルで2週間あけて2用量を静脈内投与した後(100mg/kg×2=1200mg/m2×2)の最も高い用量まで耐容性が良好であった。
2H7.v16対リツキサン(登録商標)を用いたカニクイザルでのデータは、CDC活性の5倍の減少が作用強度には悪影響を及ぼさないことを示唆している。強力なADCC活性を持つが減少したCDC活性の抗体は、大なるCDC活性を持つものよりも最初の注入反応に対して好ましい安全性プロファイルを有しうる。
2H7.v16対リツキサン(登録商標)を用いたカニクイザルでのデータは、CDC活性の5倍の減少が作用強度には悪影響を及ぼさないことを示唆している。強力なADCC活性を持つが減少したCDC活性の抗体は、大なるCDC活性を持つものよりも最初の注入反応に対して好ましい安全性プロファイルを有しうる。
実施例10
腫瘍成長のインビボでの抑制
RajiヒトB細胞のリンパ腫細胞株(ATCC CCL86)の成長を阻害するrhuMAb2H7.v16の能力をBalb/cヌード(胸腺欠損)マウスで評価した。Raji細胞はCD20を発現し、ヌードマウスに成長し、転移性疾患を生じると報告されている;腫瘍成長はリツキサン(登録商標)によって阻害される(Clynes等, Nature Medicine 6, 443-446 (2000))。56匹の8−10週齢のBalb/cヌードマウスを、各グループが8匹のマウスからなる7グループ(A−G)に分けた。0日目に、各マウスに側部に5×106のRajiBリンパ腫細胞の皮下注射をした。0日目に始まって、各マウスに、100uLのネガティブコントロール液(PBS;リン酸緩衝生理食塩水)、リツキサン(登録商標)又は2H7.v16の何れかを投与した。投薬量は体重に依存し、薬剤送達は尾静脈を経る静脈内であった。グループAのマウスにはPBSを投与した。グループB−Dにはリツキサン(登録商標)を、それぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kg投与した。グループE−Gのマウスには、2H7v.16をそれぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kg投与した。注射は6週間の間、毎週繰り返した。処置の間、毎週の間隔で、各マウスにつき、注射部位での明白な腫瘍の存在を検査し、存在した場合には腫瘍体積を測定し記録した。最終検査は8週目に行った(処置なしの2週の間隔後)。
この研究の結果は、rhuMAb2H7.v16とリツキサン(登録商標)の両方がヌードマウスにおける皮下Raji細胞腫瘍成長の阻害に効果的であったことを示している。腫瘍成長は4週目に始まりPBSコントロールグループで観察された。しかしながら、8週の試験の間、5mg/kg又は0.5mg/kgのリツキサン(登録商標)又は2H7.v16で処置したグループでは、腫瘍は観察されなかった。0.05mg/kgの低用量処置グループでは、2H7グループ中の一匹の動物と、リツキサン(登録商標)グループ中の一匹の動物に、腫瘍が観察された。
腫瘍成長のインビボでの抑制
RajiヒトB細胞のリンパ腫細胞株(ATCC CCL86)の成長を阻害するrhuMAb2H7.v16の能力をBalb/cヌード(胸腺欠損)マウスで評価した。Raji細胞はCD20を発現し、ヌードマウスに成長し、転移性疾患を生じると報告されている;腫瘍成長はリツキサン(登録商標)によって阻害される(Clynes等, Nature Medicine 6, 443-446 (2000))。56匹の8−10週齢のBalb/cヌードマウスを、各グループが8匹のマウスからなる7グループ(A−G)に分けた。0日目に、各マウスに側部に5×106のRajiBリンパ腫細胞の皮下注射をした。0日目に始まって、各マウスに、100uLのネガティブコントロール液(PBS;リン酸緩衝生理食塩水)、リツキサン(登録商標)又は2H7.v16の何れかを投与した。投薬量は体重に依存し、薬剤送達は尾静脈を経る静脈内であった。グループAのマウスにはPBSを投与した。グループB−Dにはリツキサン(登録商標)を、それぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kg投与した。グループE−Gのマウスには、2H7v.16をそれぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kg投与した。注射は6週間の間、毎週繰り返した。処置の間、毎週の間隔で、各マウスにつき、注射部位での明白な腫瘍の存在を検査し、存在した場合には腫瘍体積を測定し記録した。最終検査は8週目に行った(処置なしの2週の間隔後)。
この研究の結果は、rhuMAb2H7.v16とリツキサン(登録商標)の両方がヌードマウスにおける皮下Raji細胞腫瘍成長の阻害に効果的であったことを示している。腫瘍成長は4週目に始まりPBSコントロールグループで観察された。しかしながら、8週の試験の間、5mg/kg又は0.5mg/kgのリツキサン(登録商標)又は2H7.v16で処置したグループでは、腫瘍は観察されなかった。0.05mg/kgの低用量処置グループでは、2H7グループ中の一匹の動物と、リツキサン(登録商標)グループ中の一匹の動物に、腫瘍が観察された。
実施例11
中程度から重篤な関節リウマチにおけるrhuMAb2H7(2H7.v16)の第I/II相治験
目的
この研究の主要な目的は中程度から重篤な関節リウマチの患者におけるrhuMAb2H7の増大静脈内(IV)用量の安全性と耐容性を評価することにある。
中程度から重篤な関節リウマチにおけるrhuMAb2H7(2H7.v16)の第I/II相治験
目的
この研究の主要な目的は中程度から重篤な関節リウマチの患者におけるrhuMAb2H7の増大静脈内(IV)用量の安全性と耐容性を評価することにある。
研究計画
これは、中程度から重篤のRA患者におけるMTXと併用してのrhuMAb2H7(PRO70769)の増大用量の安全性に関する無作為プラセボ対照、多施設、盲式第I/II期の研究者及び患者盲式治験とした。治験は、用量増大相と多数の患者の登録を伴う第二相からなる。治験依頼人は治療割り当てについて非盲検とする。
現在はMTXでの治療には満足できない臨床応答を示す1から5の疾患改変抗リウマチ剤又は生物薬剤で失敗した中程度から重篤のRA患者が登録される。
患者は治験への参加の前に少なくとも12週の間、毎週10−25mgの範囲でMTXを受け、試験薬(PRO70769又はプラセボ)の最初の用量を受ける前に少なくとも4週の間、安定した投薬を受けていることが必要であった。患者はまた安定用量の経口コルチコステロイド(毎日10mgまで又はプレドニゾン等価物)と安定用量の非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を受けていてもよい。患者は次の用量増大計画に従って1日目と15日目に標示用量でPRO70769又はプラセボ等価物の2回の静脈内注入を受けた。
これは、中程度から重篤のRA患者におけるMTXと併用してのrhuMAb2H7(PRO70769)の増大用量の安全性に関する無作為プラセボ対照、多施設、盲式第I/II期の研究者及び患者盲式治験とした。治験は、用量増大相と多数の患者の登録を伴う第二相からなる。治験依頼人は治療割り当てについて非盲検とする。
現在はMTXでの治療には満足できない臨床応答を示す1から5の疾患改変抗リウマチ剤又は生物薬剤で失敗した中程度から重篤のRA患者が登録される。
患者は治験への参加の前に少なくとも12週の間、毎週10−25mgの範囲でMTXを受け、試験薬(PRO70769又はプラセボ)の最初の用量を受ける前に少なくとも4週の間、安定した投薬を受けていることが必要であった。患者はまた安定用量の経口コルチコステロイド(毎日10mgまで又はプレドニゾン等価物)と安定用量の非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を受けていてもよい。患者は次の用量増大計画に従って1日目と15日目に標示用量でPRO70769又はプラセボ等価物の2回の静脈内注入を受けた。
用量増大は、特定の基準に従って、かつ内部の安全性データ審査委員会による安全性データの審査と各コホートで治療された最後の患者への第二の注入の72時間後の急性毒性の評価の後に行った。用量レベルが用量増大相の間、耐容性があると証明された場合には、用量増大相後に、40名の更なる患者(32名は活性及び8名はプラセボ)を、次の用量レベル:2×50mg、2×200mg、2×500mg、及び2×1000mgのそれぞれに無作為化する。およそ205名の患者を研究に登録する。
B細胞数を得て、記録する。6ヶ月の効果評価を越えて48週の追跡試験期間にフローサイトメトリーを使用して、B細胞数を評価する。B細胞枯渇は用量制限毒性(DLC)とは考えられず、むしろPRO70769処置の期待される薬物動態学的結果である。
一サブ治験では、血清及びRNA分析のための血液、並びに尿サンプルを様々な時点で患者から得た。これらのサンプルを用いて、中程度から重篤のRAの患者におけるPRO70769処置への応答の予測となりうる生物マーカーを同定することができる。
B細胞数を得て、記録する。6ヶ月の効果評価を越えて48週の追跡試験期間にフローサイトメトリーを使用して、B細胞数を評価する。B細胞枯渇は用量制限毒性(DLC)とは考えられず、むしろPRO70769処置の期待される薬物動態学的結果である。
一サブ治験では、血清及びRNA分析のための血液、並びに尿サンプルを様々な時点で患者から得た。これらのサンプルを用いて、中程度から重篤のRAの患者におけるPRO70769処置への応答の予測となりうる生物マーカーを同定することができる。
研究治療
患者のコホートは次の増大計画に従って1日目と15日目に標示用量でPRO70769又はプラセボの2回の静脈内注入を受ける。
− 10mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な4患者、1コントロール
− 50mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 200mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 500mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 1000mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
効果
PRO70769の効果はACR応答によって測定される。ACR20、ACR50、及びACR70応答を達成する被験者の割合は治療グループ毎にまとめられ、各グループに95%の信頼区間が生じる。これらの応答の成分とベースラインからのその変化を、治療と往診によってまとめる。
患者のコホートは次の増大計画に従って1日目と15日目に標示用量でPRO70769又はプラセボの2回の静脈内注入を受ける。
− 10mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な4患者、1コントロール
− 50mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 200mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 500mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 1000mgのPRO70769又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
効果
PRO70769の効果はACR応答によって測定される。ACR20、ACR50、及びACR70応答を達成する被験者の割合は治療グループ毎にまとめられ、各グループに95%の信頼区間が生じる。これらの応答の成分とベースラインからのその変化を、治療と往診によってまとめる。
実施例12
2H7.v16の結晶構造の検査とアラニンスキャニングデータから、N100(VH)と隣接する残基を含むCDR-H3の領域が抗原結合に関与しうることが明らかとなった。したがって、我々は、2H7.v16バックグラウンドに多くのアミノ酸置換を作る、N100(VH)に注目した。その結果(表13)から、Tyr又はTrpの何れかの置換がv16と相対的に結合を向上させることが示された。
2H7.v16の結晶構造の検査とアラニンスキャニングデータから、N100(VH)と隣接する残基を含むCDR-H3の領域が抗原結合に関与しうることが明らかとなった。したがって、我々は、2H7.v16バックグラウンドに多くのアミノ酸置換を作る、N100(VH)に注目した。その結果(表13)から、Tyr又はTrpの何れかの置換がv16と相対的に結合を向上させることが示された。
表13 形質移入した293細胞で産生されたIgG変異体による細胞ベースの(WIL2-S)アッセイにおいて測定される、CD20への結合親和性を向上するように設定した2H7変異体の相対的な結合。2H7.v16バックグラウンドに関して突然変異(カバット番号付け)を有するIgG変異体を示す。相対的な結合は、同等の結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v16の濃度として表される;したがって、比率>1は、バージョン16と比較してCD20に対する変異体の向上した結合親和性を示す。
更なる親和性改善がS100a(VH)の置換によって得られうるかどうかを決定するために、2H7.v472(表13)のバックグラウンドの場合に、この位置に多くの突然変異を作製した。細胞ベースの結合比較の結果(表14)から、2H7.v511が細胞上のCD20に対して3倍より大きく結合が向上したことが示された。
2H7.v511重鎖の遺伝子は、鋳型として2H7.v138の重鎖をコードするプラスミドのssDNAとCA1568として設定された5'リン酸化デオキシオリゴヌクレオチド:5'-CCA GAC GTC GAA GTA CCA GTA GCG GTA GCT ATA GTA TAC GAC GCG-3' (配列番号45)を用いた部位特異的突然変異により構築した。下線を付したヌクレオチドは、CDR-H3変異N100Y、S100aRをコードする、アンチセンスDNA鎖のコドンに対応する。2H7.v511の軽鎖は2H7.v138の軽鎖と同一であり、同じプラスミドを軽鎖の発現に用いた。
v138及びv511などのHu2H7変異体は、2H7.v16の発現に用いた図9に示すベクターを用いてCHO細胞において発現することができる。
2H7.v511重鎖の遺伝子は、鋳型として2H7.v138の重鎖をコードするプラスミドのssDNAとCA1568として設定された5'リン酸化デオキシオリゴヌクレオチド:5'-CCA GAC GTC GAA GTA CCA GTA GCG GTA GCT ATA GTA TAC GAC GCG-3' (配列番号45)を用いた部位特異的突然変異により構築した。下線を付したヌクレオチドは、CDR-H3変異N100Y、S100aRをコードする、アンチセンスDNA鎖のコドンに対応する。2H7.v511の軽鎖は2H7.v138の軽鎖と同一であり、同じプラスミドを軽鎖の発現に用いた。
v138及びv511などのHu2H7変異体は、2H7.v16の発現に用いた図9に示すベクターを用いてCHO細胞において発現することができる。
表14 形質移入した293細胞で産生されたIgG変異体による細胞ベースの(WIL2-S)アッセイにおいて測定される、CD20への結合親和性を向上するように設定した2H7変異体の相対的な結合。2H7.v16バックグラウンドと比較してCDR部位に突然変異(カバット番号付け)を有するIgG変異体を示す。加えて、2H7.v16と比較すると、すべての変異体は、Fc変異S298A、K326A、E333A及びK334A(EU番号付け)を含有する。相対的な結合は、同等の結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7.v16の濃度として表される;したがって、比率>1は、バージョン16と比較してCD20に対する変異体の向上した結合親和性を示す。
これらの変異体もFc変異を含んだので、我々はさらに、見かけの平衡解離定数(Kd)を決定するために競合的スキャッチャードアッセイにおいて結合を測定した。
これらの変異体もFc変異を含んだので、我々はさらに、見かけの平衡解離定数(Kd)を決定するために競合的スキャッチャードアッセイにおいて結合を測定した。
平衡解離定数(Kd)は、放射性標識した抗体2H7.v511及び2H7.v138 IgGを用いたWIL2s-S細胞への、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体結合を決定した。抗CD20モノクローナル抗体はCHO細胞において生産された。すべての希釈は、結合アッセイバッファ(0.5%ウシ血清アルブミン、25mM HEPES pH7.2及び0.01%アジ化ナトリウムを含有するDMEM培地)で行った。0.1nMの濃度の125I-2H7.v511及び125I-2H7.v138(ラクトペルオキシダーゼによってヨード化される)の一定量(0.05mL)を、V底96ウェルマイクロアッセイプレートのウェルに分配した。非標識抗体の階段希釈物(0.05mL)を添加し、混合した。0.05mLの容量の30,000個のWIL2-S細胞を各ウェルに加えた。プレートを密封して、室温で24時間インキュベートして、2,500回転数/分で15分間遠心分離した。次いで、上清を吸引して、細胞ペレットを洗浄して、遠心分離した。上清を再度吸引して、ペレットを1N NaOHに溶解して、γ計数のためにチューブに移した。データは、プログラムLigand(McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983))を用いたスキャッチャード分析(Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980))に用いた。下記の表15に示される結果から、抗CD20モノクローナル抗体2H7.v511及び2H7.v138がWIL2-S細胞に発現されるCD20に高い親和性で結合すること、及び2H7.v511が2H7.v16より2.2倍から7.3倍高い親和性で結合することが示された。標識した125I-2H7.v511及び125I-2H7.v138によって得られた値の相違は、2H7.v511のCDR-H3の新規なTyrのヨウ素化から生じる抗原結合の混乱を反映しうる。したがって、125I-2H7.v138の結果はより正確に相対的な結合親和性を反映するようである。
表15 スキャッチャード分析からの抗CD20ヒト化モノクローナル抗体の平衡結合親和性(±フィットの標準誤差)
2H7変異体の結合活性の更なる比較として、可溶化したCD20を用いたELISAを行った。比較のために、他の変異体2H7.v588を、2H7.v16と同一のCDR領域及び2H7.v511と同一のFc領域によって構築した。
2H7変異体の結合活性の更なる比較として、可溶化したCD20を用いたELISAを行った。比較のために、他の変異体2H7.v588を、2H7.v16と同一のCDR領域及び2H7.v511と同一のFc領域によって構築した。
NUNC MaxisorpTMプレートを、2.5μg/mlの可溶性CD20(Genentech;前述したように調製する)を含むPBSにて4℃で終夜コートした後、0.5%のBSAにて室温で1時間置いてブロックした。0.5%のBSAにての試料の階段希釈物を、プレート上で2時間インキュベートした。洗浄後、結合した抗体は、基質として3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を用いてHRPコンジュゲート抗ヒトFab抗体(ヤギ抗ヒトIg、Fab’2-HRPコンジュゲート、NBより)により検出した。吸光度は、450nmで読み取った。滴定曲線は、4-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラムによりフィットした(KaleidaGraph;Synergy Software, Reading, PA)。標準物質の滴定曲線の中間吸光度に対応する抗体変異体の濃度を算出した。その結果(図3)から、2H7.v588及び2H7.v16に対して同様な結合親和性が示された;しかしながら、2H7.v511は、このアッセイにおいて可溶性CD20への結合がおよそ90倍亢進したようであった。
実施例13
ADCC活性
ADCC活性は、図4のアッセイではおよそ4のエフェクター:標的比のWIL2-S細胞と正常ヒトドナーから精製したNK細胞、図11のアッセイでは5:1の比のWIL2-S細胞とNK細胞を用いて、前述したように評価した。図4と図11に示す結果から、2H7.v16及び他の2H7変異体と比較して、2H7.v511に対する最大の活性と増加したADCC効力が示された。2H7.v588は2H7.v511と同様の効力及び最大の活性を示したことから(図4)、更なるCD20の親和性改善がADCC活性を有意に亢進しないことが示唆された。
ADCC活性
ADCC活性は、図4のアッセイではおよそ4のエフェクター:標的比のWIL2-S細胞と正常ヒトドナーから精製したNK細胞、図11のアッセイでは5:1の比のWIL2-S細胞とNK細胞を用いて、前述したように評価した。図4と図11に示す結果から、2H7.v16及び他の2H7変異体と比較して、2H7.v511に対する最大の活性と増加したADCC効力が示された。2H7.v588は2H7.v511と同様の効力及び最大の活性を示したことから(図4)、更なるCD20の親和性改善がADCC活性を有意に亢進しないことが示唆された。
実施例14
CDC活性
また、CDC活性は、WIL2-S細胞及びヒト補体を用いて上記の通りに評価した。図5に示される結果から、2H7.v588と比較して2H7.v511についてCDC効力の増加と、2H7.v16と比較して大いに増加したCDC効力が示された。先に述べた変異体に観察されるように、亢進したCD20親和性によりインビトロのCDC活性が亢進されるようであった。2H7.v511を他の2H7変異体と比較した異なるCDCアッセイにおいて、図10に示すように、v511もまた、v31、v488及びv114よりも増加したCDC活性を表した。以下の修飾と、基本的には上記のように、96マイクロウェルプレート形式にて図10のCDCアッセイを行った。50μlの段階希釈した2H7.v511(300〜1000nMで開始)(及び、実施例15の図12に要約した実験のリツキサン)を、50μlの正常B細胞(1×106/ml、1ウェルにつき50,000細胞)又は50μlのWIL2-S細胞(30,000)と、50μlの1:4に希釈した正常ヒト血清補体(Quidel)とともにインキュベートした。正常B細胞は、ネガティブ選択(Rosettesep, StemCell Technologies)及びフィコール-Paque Plus (Amersham Biosciences)勾配分離を用いて、ヘパリンを加えた全血液から単離した。37℃で2時間インキュベーションした後、50μLのアラマーブルー(Biosource International)を加えて37℃でさらに18時間インキュベートした。プレートを15分間一時的に振とうして、蛍光プレート読み取り機(Ext. 535、Emt 595)にて読取って、相対的な蛍光単位(RFU)を決定した。観察されたRFU値は、KaleidaGraphのmAbの濃度と比較してプロットし、曲線を4パラメータフィットを用いて描いた。
CDC活性
また、CDC活性は、WIL2-S細胞及びヒト補体を用いて上記の通りに評価した。図5に示される結果から、2H7.v588と比較して2H7.v511についてCDC効力の増加と、2H7.v16と比較して大いに増加したCDC効力が示された。先に述べた変異体に観察されるように、亢進したCD20親和性によりインビトロのCDC活性が亢進されるようであった。2H7.v511を他の2H7変異体と比較した異なるCDCアッセイにおいて、図10に示すように、v511もまた、v31、v488及びv114よりも増加したCDC活性を表した。以下の修飾と、基本的には上記のように、96マイクロウェルプレート形式にて図10のCDCアッセイを行った。50μlの段階希釈した2H7.v511(300〜1000nMで開始)(及び、実施例15の図12に要約した実験のリツキサン)を、50μlの正常B細胞(1×106/ml、1ウェルにつき50,000細胞)又は50μlのWIL2-S細胞(30,000)と、50μlの1:4に希釈した正常ヒト血清補体(Quidel)とともにインキュベートした。正常B細胞は、ネガティブ選択(Rosettesep, StemCell Technologies)及びフィコール-Paque Plus (Amersham Biosciences)勾配分離を用いて、ヘパリンを加えた全血液から単離した。37℃で2時間インキュベーションした後、50μLのアラマーブルー(Biosource International)を加えて37℃でさらに18時間インキュベートした。プレートを15分間一時的に振とうして、蛍光プレート読み取り機(Ext. 535、Emt 595)にて読取って、相対的な蛍光単位(RFU)を決定した。観察されたRFU値は、KaleidaGraphのmAbの濃度と比較してプロットし、曲線を4パラメータフィットを用いて描いた。
実施例15
インビボでのB細胞枯渇
2H7.v511のインビボ活性を、B細胞枯渇のトランスジェニックマウスモデルにおいて2H7.v16の活性と比較した。トランスジェニックマウス(hCD20 Tg+/+ mCD16-/- hCD16 Tg+/-)、n=5/グループは、1マウスにつき125μg又は12.5μg(5及び0.5mg/kg等量)の抗体を静脈内投与した。図6、7、13及び14の各々のhIgG1(白線)は、アイソタイプコントロール抗体である。2日目に、血液及び選択された組織区画のB細胞の数を、FACS分析によって計数した。この結果(図6)から、2H7.v511が、低用量及び高用量で、血液及び腹腔のB細胞を2H7.v16より効果的に減少することが示された。脾臓において(図7)、2H7.v511は低用量でわずか〜有意に大きな枯渇を示したが、この相違は高用量では見られなかった。図8は、実験の概略図を示しており、v16及びv511間のCD20結合及びFc機能のレベルを要約する。
また、2H7.v511 B細胞枯渇を、マウスモデルにおけるリツキシマブ(リツキサン(登録商標))と比較した;実験は図12に概説する。図13に示すように、2H7.v511は、低用量及び高用量で、血液及び腹腔のB細胞をリツキシマブより大きく枯渇した。図14は脾臓のB細胞枯渇を示す。0.5mg/kg(図では12.5μg)の低用量では、総量及び濾胞性脾臓のB細胞枯渇は、リツキシマブによるものよりもv511によってより効果があった;しかしながら、v511は、周辺帯B細胞枯渇の媒介の際にはリツキシマブと同じかわずかに低い効果を示した。
また、上の実施例9に基本的には記述されるように、2H7.v511のインビボ効果をカニクイザルにおいて調べる。
インビボでのB細胞枯渇
2H7.v511のインビボ活性を、B細胞枯渇のトランスジェニックマウスモデルにおいて2H7.v16の活性と比較した。トランスジェニックマウス(hCD20 Tg+/+ mCD16-/- hCD16 Tg+/-)、n=5/グループは、1マウスにつき125μg又は12.5μg(5及び0.5mg/kg等量)の抗体を静脈内投与した。図6、7、13及び14の各々のhIgG1(白線)は、アイソタイプコントロール抗体である。2日目に、血液及び選択された組織区画のB細胞の数を、FACS分析によって計数した。この結果(図6)から、2H7.v511が、低用量及び高用量で、血液及び腹腔のB細胞を2H7.v16より効果的に減少することが示された。脾臓において(図7)、2H7.v511は低用量でわずか〜有意に大きな枯渇を示したが、この相違は高用量では見られなかった。図8は、実験の概略図を示しており、v16及びv511間のCD20結合及びFc機能のレベルを要約する。
また、2H7.v511 B細胞枯渇を、マウスモデルにおけるリツキシマブ(リツキサン(登録商標))と比較した;実験は図12に概説する。図13に示すように、2H7.v511は、低用量及び高用量で、血液及び腹腔のB細胞をリツキシマブより大きく枯渇した。図14は脾臓のB細胞枯渇を示す。0.5mg/kg(図では12.5μg)の低用量では、総量及び濾胞性脾臓のB細胞枯渇は、リツキシマブによるものよりもv511によってより効果があった;しかしながら、v511は、周辺帯B細胞枯渇の媒介の際にはリツキシマブと同じかわずかに低い効果を示した。
また、上の実施例9に基本的には記述されるように、2H7.v511のインビボ効果をカニクイザルにおいて調べる。
実施例16
腫瘍増殖のインビボ抑制
RajiヒトB細胞であるリンパ腫細胞株(ATCC CCL86)の増殖を阻害する2H7.v511の能力を、上の実施例10に記載の手順に従って、Balb/cヌード(胸腺欠損)マウスにおいて評価した。
腫瘍増殖のインビボ抑制
RajiヒトB細胞であるリンパ腫細胞株(ATCC CCL86)の増殖を阻害する2H7.v511の能力を、上の実施例10に記載の手順に従って、Balb/cヌード(胸腺欠損)マウスにおいて評価した。
実施例17
薬物動態に影響するFcRn結合のインビボ研究
インビボでのFc変異形抗体の薬物動態に対する亢進したFcRn結合の効果を決定するために、カニクイザル(Macaca fascicularis)又は他の霊長類種に、各々の抗体変異体を静脈注射し、時間の経過につれて血液試料を回収して抗体のクリアランスをモニタした。複数の動物に一又は複数の用量レベルで注射する。一実験では、1−20mg/kgの単回静注用量を0時点とする第1日目に注射した。投与前及び投与後の6時間後、24時間後及び72時間後に各動物から血液(血清)試料を採取した。さらに、第8日目、第10日目、第30日目及び第60日目に試料を採取した。血清試料中の抗体の濃度はELISAを用いて決定した。血清中の抗体濃度の時間依存性の減少は、標準的な薬学技術(ShargelおよびYu, Applied Pharmaceutics and Pharmacokinetics, Fourth edition, pp. 67-98, Appleton and Lange, Stamford, CT (1999))を用いてモデル化した。2-区画モデルを用いて、組織に対する抗体の開始分布(α期)、その後に続く終末期又は除去期(β期)を明らかとした。FcRnが循環中のIgGを維持するように機能するので、このようにして算出された除去半減期(t1/2 β)は亢進したFcRn結合の効果を示す。
薬物動態に影響するFcRn結合のインビボ研究
インビボでのFc変異形抗体の薬物動態に対する亢進したFcRn結合の効果を決定するために、カニクイザル(Macaca fascicularis)又は他の霊長類種に、各々の抗体変異体を静脈注射し、時間の経過につれて血液試料を回収して抗体のクリアランスをモニタした。複数の動物に一又は複数の用量レベルで注射する。一実験では、1−20mg/kgの単回静注用量を0時点とする第1日目に注射した。投与前及び投与後の6時間後、24時間後及び72時間後に各動物から血液(血清)試料を採取した。さらに、第8日目、第10日目、第30日目及び第60日目に試料を採取した。血清試料中の抗体の濃度はELISAを用いて決定した。血清中の抗体濃度の時間依存性の減少は、標準的な薬学技術(ShargelおよびYu, Applied Pharmaceutics and Pharmacokinetics, Fourth edition, pp. 67-98, Appleton and Lange, Stamford, CT (1999))を用いてモデル化した。2-区画モデルを用いて、組織に対する抗体の開始分布(α期)、その後に続く終末期又は除去期(β期)を明らかとした。FcRnが循環中のIgGを維持するように機能するので、このようにして算出された除去半減期(t1/2 β)は亢進したFcRn結合の効果を示す。
実施例18
CLL患者の細胞によるADCC、CDC活性
この研究において、CLL患者のB細胞に対する抗体2H7.v511及びv114の補体活性を試験した。PBMCを、3人のCD20陽性のCLL患者から単離した(CLL患者では、PBMC分画において見られる大部分の細胞はB細胞である)。96ウェルマイクロウェル形式において、各々の患者からの50,000のPBMCを、1000nMから始めて、抗体を1:3倍に階段希釈した、50μlの滴定したmAb(v114、v511又はリツキサンTM)と混合した。各ウェルに、1:4に希釈した50μlの正常ヒト血清補体を加えた。混合物を37℃で2時間インキュベートして、50μlの代謝性色素指標であるアラマーブルー(細胞溶解の指標)を加え、37℃で終夜(16時間以内)インキュベーションを続けた。96ウェルプレートを室温で1分間振とうして、535nm/590nmの蛍光プレートにて読取った。抗体濃度に対する相対的な蛍光単位をプロットして、EC50を得た。CDC活性においてv114とリツキサンを比較した図15と、v511とリツキサンを比較した図16に示される結果から、3人すべての患者についてv511及びv114は効力はおよそ等しいが、リツキサンとv16よりも有意に良好であった。
CLL患者の細胞によるADCC、CDC活性
この研究において、CLL患者のB細胞に対する抗体2H7.v511及びv114の補体活性を試験した。PBMCを、3人のCD20陽性のCLL患者から単離した(CLL患者では、PBMC分画において見られる大部分の細胞はB細胞である)。96ウェルマイクロウェル形式において、各々の患者からの50,000のPBMCを、1000nMから始めて、抗体を1:3倍に階段希釈した、50μlの滴定したmAb(v114、v511又はリツキサンTM)と混合した。各ウェルに、1:4に希釈した50μlの正常ヒト血清補体を加えた。混合物を37℃で2時間インキュベートして、50μlの代謝性色素指標であるアラマーブルー(細胞溶解の指標)を加え、37℃で終夜(16時間以内)インキュベーションを続けた。96ウェルプレートを室温で1分間振とうして、535nm/590nmの蛍光プレートにて読取った。抗体濃度に対する相対的な蛍光単位をプロットして、EC50を得た。CDC活性においてv114とリツキサンを比較した図15と、v511とリツキサンを比較した図16に示される結果から、3人すべての患者についてv511及びv114は効力はおよそ等しいが、リツキサンとv16よりも有意に良好であった。
別の研究では、インビトロのアッセイにおいてMEC1 B-CLL細胞株(Stacchini, A 等 (1999) Leukemia Res. 23, 127-136)とB-CLL(B細胞関連CLL)患者からのB細胞を用いて2H7v.511及びリツキサンのADCC効力を比較した。実験は、以下の通りに行った。NK細胞は、製造者(RosetteSep, StemCell Technologies)の推奨プロトコールに従って、ネガティブ選択を用いて100mLの正常ヒト全血から単離した。全血ドナーは、NK細胞上のCD16の表現形質の発現が異なっていた。対立形質の相違は位置158に生じており、バリン-バリン、バリン-フェニルアラニン、及びフェニルアラニン-フェニルアラニン表現型を含む。一般的に、アッセイは、バリン-フェニルアラニン表現型により行った。アッセイは、以下の通りに丸底96マイクロウェルプレートにおいて行った。50μLの段階希釈した量のmAb(10〜100nmで始める)を、50μLの標的細胞とともにインキュベートした。標的細胞は、B−CLL MEC1細胞株(50μl当たり10,000)と、B-CLL患者からのPBMC(50μL当たり30,000)とを含む。PBMCは、標準的なフィコール-Paque Plus勾配分離を用いてCLLドナーの全血液から単離した。段階希釈した抗体とともに室温で30分間インキュベートした後、50μLのNK細胞(50,000)を加えて、37℃で更に4時間インキュベートした。プレートを1500回転数/分で10分間遠心分離して、100μlの細胞培地を除去した。細胞溶解のレベルは、溶解した細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼ(LDHキット Roche)の量を計量することによって決定した。mAb濃度との相対的なパーセント細胞溶解を決定して、4-パラメータ曲線フィットを用いたKaleidaGraphにプロットした。IC50値は、MEC1細胞株について報告された。点線グラフに対する点を用いてCLL PBMCをプロットし、30、5及び0.8nMのパーセント死滅を記録した。
この結果から、2H7v.511のADCC活性が3人すべての患者試料においてリツキサンより高いことが示された。30nM、5nM及び0.8nMの抗体において、2H7v.511の改善は、リツキサンのそれぞれ2.8倍、6.2倍及び5.4倍であった。NK細胞はVF表現型のものであった。
2H7v.511のADCC活性もまた、リツキサンが媒介するMEC1細胞の細胞溶解より高かった。2H7v.511は、0.95pMの2H7v.511及び0.012MのリツキサンのIC50で13倍以上の活性を有した。NK細胞はVV表現型のものであった。
2H7v.511のADCC活性もまた、リツキサンが媒介するMEC1細胞の細胞溶解より高かった。2H7v.511は、0.95pMの2H7v.511及び0.012MのリツキサンのIC50で13倍以上の活性を有した。NK細胞はVV表現型のものであった。
結論
まとめると、2H7.v511及びv114は、2H7.v16と比較して、CD20結合親和性の増加、CDC活性の増加、ADCC活性の増加、及びインビボB細胞枯渇についてのインビボ効力の増加を示した。
まとめると、2H7.v511及びv114は、2H7.v16と比較して、CD20結合親和性の増加、CDC活性の増加、ADCC活性の増加、及びインビボB細胞枯渇についてのインビボ効力の増加を示した。
実施例19
以下の表に示す実験設定に従って、2H7.v511及びv114を用いてカニクイザルにおいて実験を行って、安全性、霊長類のPK及びインビボ正常B細胞枯渇を評価した。動物は、各服用レベルを4週ごとに投与した。2.5mg/kg、4投薬又は50mg/kg、4投薬の何れかの動物の分析から、v511及びv114の両方により末梢B細胞枯渇が示された。v511によるパイロット試験では、50mg/kgで、末梢B細胞は、急速にかつ十分に減少した。剖検所見に基づいて、組織B細胞もまた、この用量で有意に減少した。
以下の表に示す実験設定に従って、2H7.v511及びv114を用いてカニクイザルにおいて実験を行って、安全性、霊長類のPK及びインビボ正常B細胞枯渇を評価した。動物は、各服用レベルを4週ごとに投与した。2.5mg/kg、4投薬又は50mg/kg、4投薬の何れかの動物の分析から、v511及びv114の両方により末梢B細胞枯渇が示された。v511によるパイロット試験では、50mg/kgで、末梢B細胞は、急速にかつ十分に減少した。剖検所見に基づいて、組織B細胞もまた、この用量で有意に減少した。
実施例20
NHLについての第I相/II臨床試験
下記の表は、一試験の抗体hu2H7.v16と平行試験のhu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するための一第I/II相臨床研究設定を示す。抗体は静脈内注入により投与した。また、この投薬計画は、前記の本発明の他のhu2H7変異体を用いた。
非ホジキンリンパ腫のための2H7第I/II相試験−用量/注入比
NHLについての第I相/II臨床試験
下記の表は、一試験の抗体hu2H7.v16と平行試験のhu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するための一第I/II相臨床研究設定を示す。抗体は静脈内注入により投与した。また、この投薬計画は、前記の本発明の他のhu2H7変異体を用いた。
非ホジキンリンパ腫のための2H7第I/II相試験−用量/注入比
実施例21
NHLについての第I相臨床試験2
下記の表は、一試験の抗体hu2H7.v16と平行試験のhu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するためのもう一つの第I相臨床研究設定を示す。抗体は静脈内注入により投与した。また、この投薬計画は、前記の本発明の他のhu2H7変異体を用いた。各投薬は、3週間間隔で合計8用量とした。
3コホート(10人の患者/コホート) q3wksx8
NHLについての第I相臨床試験2
下記の表は、一試験の抗体hu2H7.v16と平行試験のhu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するためのもう一つの第I相臨床研究設定を示す。抗体は静脈内注入により投与した。また、この投薬計画は、前記の本発明の他のhu2H7変異体を用いた。各投薬は、3週間間隔で合計8用量とした。
3コホート(10人の患者/コホート) q3wksx8
実施例22
NHLについての第I/II相用量増大コホート試験
下記の表は、抗体hu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するための第I/II相臨床研究設定を示す。患者は、毎週、4週間投薬した。有効性を、例えばCTスキャンによる腫瘍収縮により測定した。
(1コホートにつき3〜6人の患者)
NHLについての第I/II相用量増大コホート試験
下記の表は、抗体hu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するための第I/II相臨床研究設定を示す。患者は、毎週、4週間投薬した。有効性を、例えばCTスキャンによる腫瘍収縮により測定した。
(1コホートにつき3〜6人の患者)
実施例23
NHLについての第I/II相用量増大コホート試験
下記の表は、抗体hu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するためのもう一つの第I/II相臨床研究設定を示す。患者は、毎週、4週間投薬した。有効性を、例えばCTスキャンによる腫瘍収縮により測定した。
NHLについての第I/II相用量増大コホート試験
下記の表は、抗体hu2H7.v511を用いた非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療するためのもう一つの第I/II相臨床研究設定を示す。患者は、毎週、4週間投薬した。有効性を、例えばCTスキャンによる腫瘍収縮により測定した。
実施例24
中程度〜重度の関節リウマチにおける2H7.v511の第I/II相試験
研究治療の設定
被験者のコホートは以下の増大計画に従って1日目と15日目に標示用量のhu2H7.v511又はプラセボ等量の2回の静脈内注入を与える:
− 10mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 50mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 100mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 200mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 300mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 500mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
中程度〜重度の関節リウマチにおける2H7.v511の第I/II相試験
研究治療の設定
被験者のコホートは以下の増大計画に従って1日目と15日目に標示用量のhu2H7.v511又はプラセボ等量の2回の静脈内注入を与える:
− 10mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 50mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 100mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 200mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 300mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
− 500mgのhu2H7.v511又はプラセボ等価物:薬剤活性な8患者、2コントロール
効果
2H7.v511の効果はACR応答によって測定される。ACR20、ACR50、及びACR70応答を達成する被験者の割合は治療グループ毎にまとめられ、各グループに95%の信頼区間が生じる。
2H7.v511の効果はACR応答によって測定される。ACR20、ACR50、及びACR70応答を達成する被験者の割合は治療グループ毎にまとめられ、各グループに95%の信頼区間が生じる。
参考文献
特許、出版された出願及び他の出版物を含め、本出願内で引用する文献は、出典明記によりここに組み込まれる。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の技術の範囲内である、分子生物学などの従来の技術を使用する。このような技術は文献において十分に説明される。例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook 等., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989);Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel 等, eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell 等. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu 等. eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson 等., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard 等. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney 等. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed 等. eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan 等. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); and the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology.
特許、出版された出願及び他の出版物を含め、本出願内で引用する文献は、出典明記によりここに組み込まれる。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の技術の範囲内である、分子生物学などの従来の技術を使用する。このような技術は文献において十分に説明される。例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook 等., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989);Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel 等, eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell 等. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu 等. eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson 等., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard 等. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney 等. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed 等. eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan 等. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); and the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology.
Claims (56)
- ヒトCD20を結合するヒト化2H7抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号25のL鎖可変領域(VL)と配列番号8のH鎖可変領域(VH)を含んでなるが、VH-CDR2のD56Aのアミノ酸置換を有しており、VH-CDR3のN100がY又はWに置換されている抗体。
- 前記N100がYに置換されている、請求項1に記載の抗体。
- 前記N100がWに置換されている、請求項1に記載の抗体。
- さらに、VH-CDR3に置換S100aRを含有する、請求項1に記載の抗体。
- さらに、ADCC及び/又はCDC活性を改善するIgG Fc領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する、請求項4に記載の抗体。
- アミノ酸置換S298A、E333A、K334A、K326Aを含有するIgG1 Fcを含んでなる、請求項5に記載の抗体。
- さらに、ADCCを改善するがCDC活性を低減するFc領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する、請求項4に記載の抗体。
- 少なくともアミノ酸置換K322Aを含有する、請求項7に記載の抗体。
- さらに、アミノ酸置換S298A、E333A、K334Aを含有する、請求項8に記載の抗体。
- 配列番号26の軽鎖配列及び配列番号34の重鎖配列を含んでなる、請求項6に記載の抗体。
- 抗体2H7.v16と比較して少なくとも3倍に増加した親和性でヒトCD20を結合する、請求項4に記載の抗体。
- 抗体2H7.v16と比較して少なくとも6倍に増加した親和性でヒトCD20を結合する、請求項4に記載の抗体。
- 2H7.v16の少なくとも20倍の抗体依存生細胞障害性(ADCC)を示す、請求項6に記載の抗体。
- 2H7.v16の少なくとも25倍の補体細胞障害性(CDC)を示す、請求項6に記載の抗体。
- 細胞障害性剤とコンジュゲートされた、請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体。
- 前記細胞障害性剤が放射性同位体又は毒素である、請求項15に記載の抗体。
- 前記抗体がCHO細胞内で産生される、請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項1又は請求項10に記載の抗体をコードする発現ベクター。
- 請求項18に記載の核酸を含有する宿主細胞。
- 請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体を産生する、請求項20に記載の宿主細胞。
- 配列番号26の軽鎖配列と配列番号34の重鎖配列を含んでなる抗体を産生する、請求項20に記載の宿主細胞。
- CHO細胞である請求項22に記載の宿主細胞。
- 請求項21に記載の宿主細胞を培養して、該細胞培養物をから抗体を回収することを含む、請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体の産生方法。
- 請求項1に記載の抗体と担体を含有してなる組成物。
- 請求項10に記載の抗体と薬剤的に受容可能な担体を含有してなる、請求項25に記載の組成物。
- 容器と該容器に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が請求項1ないし17の何れか一に記載の抗体を含有してなる、製造品。
- さらに、該組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物を具備するものであり、前記抗体が配列番号26の軽鎖配列と配列番号34の重鎖配列を含んでなるものである、請求項27に記載の製造品。
- さらに、前記組成物が関節リウマチを治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物を具備する、請求項27に記載の製造品。
- CD20陽性癌を有する患者に、治療的有効量の請求項1ないし17の何れか一に記載のヒト化2H7抗体が投与されることを含む、CD20陽性癌の治療方法。
- 前記CD20陽性癌がB細胞リンパ腫又は白血病である、請求項30に記載の方法。
- 前記CD20陽性癌が非ホジキンリンパ腫(NHL)である、請求項31に記載の方法。
- 前記癌が慢性リンパ球性白血病(CLL)又はSLLである、請求項32に記載の方法。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号26及び34の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる、請求項32又は請求項33に記載の方法。
- 前記抗体が静脈内注入により投与される、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体が1用量当たりおよそ100mg/m2から375mg/m2の範囲の投薬で投与される、請求項35に記載の方法。
- 前記抗体が1用量当たり375mg/m2の投薬で、少なくとも4回投与される、請求項36に記載の方法。
- さらに、少なくとも一の化学療法剤が患者に投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記癌が、非ホジキンリンパ腫(NHL)であり、前記化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンからなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
- 治療的有効量の請求項1ないし14の何れか一に記載のヒト化2H7抗体が、自己免疫性疾患に罹患している患者に投与されることを含む、自己免疫性疾患を軽減する方法。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号26及び34の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる、請求項40に記載の方法。
- 前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、例えばループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgAネフロパシ、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、ANCA関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(NMO)及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである、請求項41に記載の方法。
- 前記自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項42に記載の方法。
- さらに、前記患者に第二の治療剤が投与されることを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記の第二の治療剤が免疫抑制剤である、請求項44に記載の方法。
- 前記免疫抑制剤がメトトレキセートである、請求項45に記載の方法。
- 前記抗体が静脈内投与又は皮下投与される、請求項43に記載の方法。
- 前記抗体が、1用量当たり10mgから500mgの範囲の投薬で静脈内投与される、請求項43に記載の方法。
- 前記抗体が100mg/用量の投薬で投与される、請求項48に記載の方法。
- さらに、前記患者に第二の治療剤が投与される、請求項40に記載の方法。
- 前記の第二の治療剤がBAFFアンタゴニストである、請求項50に記載の方法。
- 前記BAFFアンタゴニストが抗BR3抗体又はBR3-Fc融合タンパク質である、請求項51に記載の方法。
- さらに、前記患者にVEGFアンタゴニストが投与される、請求項30に記載の方法。
- 20mM 酢酸ナトリウム、pH5.5、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20内におよそ20mg/mlのヒト化2H7.v511抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤。
- 20mM 酢酸ナトリウム、pH5.3、240mM(8%) トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20内におよそ20mg/mlのヒト化2H7.v114抗体を含有してなる液体製剤。
- 20mM 酢酸ナトリウム、pH5.3、4% トレハロース二水和物、0.02% ポリソルベート20内におよそ30mg/mlのヒト化2H7.v16抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤。
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