FR2966043A1 - Utilisation d'un anticorps anti-cd20 pour le traitement du lymphome cerebral primitif - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 1, dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour son utilisation dans le traitement du lymphome cérébral primitif. La présente invention se rapporte également à un anticorps dirigé contre un antigène présent à la surface des cellules de lymphome cérébal primitif pour son utilisation par voie d'administration intrathécale dans le traitement du lymphome cérébral primitif.

Description

UTILISATION D'UN ANTICORPS ANTI-CD20 POUR LE TRAITEMENT DU LYMPHOME CÉRÉBRAL PRIMITIF

DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à l'utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement du lymphome cérébral primitif (également appelé « lymphome cérébral primaire »).

L'invention trouve ses applications industrielles notamment dans le domaine médical.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée après les exemples. 15 Etat de la technique L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire hydrophobe d'un poids moléculaire de 35-37 kDa présente à la surface des lymphocytes B matures (Valentine et al. (1987) Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9 20 [1]; Valentine et al. (1989) J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 [2]). Il est exprimé au cours du développement des lymphocytes B dès le stade pré-B précoce et ce jusqu'à la différenciation en plasmocyte, stade où cette expression disparaît. L'antigène CD20 est présent à la fois sur les lymphocytes B normaux et sur les cellules B malignes. Plus particulièrement, 25 l'antigène CD20 est exprimé sur la plupart des lymphomes de phénotype B (80% des lymphomes) : il est exprimé par exemple sur plus de 900/0 des lymphomes non-Hodgkiniens (NHL) de lymphocytes B. La fonction du CD20 n'est pas encore totalement élucidée, mais il pourrait agir comme un canal calcique et intervenir dans la régulation des 30 premières étapes de la différenciation (Golay et al. (1985) J. Immunol.; 135(6) :3795-801 [31) et de la prolifération des lymphocytes B (Tedder et al. (1986) Sur J. Immunol . 1986 Aug;16(8) :881-7 [4]).

Ainsi, bien qu'il subsiste des incertitudes quant à son rôle dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B, l'antigène CD20 est, de par sa localisation, une cible importante pour le traitement des pathologies impliquant des lymphocytes B tumoraux, comme par exemple les NHL ou la LLC-B (leucémie lymphoïde chronique B) par des anticorps reconnaissant spécifiquement le CD20. De plus, cet antigène est une cible idéale car il s'agit d'une protéine membranaire pour laquelle on ne connaît pas de modulation d'expression ou de polymorphisme. Un seul anticorps monoclonal anti-CD20 non radiomarqué, le rituximab (Genentech), est actuellement disponible sur le marché, pour le traitement des lymphomes de cellules B. Il montre chez les patients atteints de NHL des résultats cliniques encourageants lorsqu'il est associé à une chimiothérapie. Toutefois, son efficacité reste variable et souvent modeste lorsqu'il est utilisé comme agent unique (Teeling et al. (2004) Blood 104(6).-1793-800, [5]).

Les lymphomes cérébraux primitifs (LCP) sont des lymphomes non hodgkiniens se développant dans le cerveau, éventuellement dans la moelle épinière, les méninges et l'ceil, en l'absence de toute autre localisation systémique. Les LCP représentent environ 10/0 des lymphomes non hodgkininens et 50/0 de l'ensemble des tumeurs cérébrales. L'existence d'une immunodépression est un facteur favorisant, qu'elle soit congénitale ou acquise. Les LCP de I'immunocompétent sont, dans plus de 800/0 des cas, des lymphomes non hodgkiniens de type B et de grande malignité (ou à grandes cellules). Les différents sous-types histologiques sont de fréquence très variables dans la littérature en raison du caractère polymorphe de ces tumeurs ; ils sont toutefois classés dans le cadre des lymphomes B diffus à grandes cellules. Les LCP des patients immunocompétents se distinguent dans la majorité des cas de ceux des patients immunodéficients par l'absence de nécrose et un type histologique le plus souvent centroblastique 3o polymorphe. Les LCP peuvent survenir chez l'adulte immunocompétent à tout âge mais avec une prédilection chez le sujet âgé, l'âge médian de survenue se situant entre 50 et 60 ans. Chez l'immunodéprimé, l'âge médian se situe autour de 30 ans. Les manifestations neurologiques ne sont pas spécifiques de la maladie. A la phase diagnostique, les signes de souffrance cérébrale diffuse, ainsi qu'un déficit focal et des crises d'épilepsie, sont observées (J. Philippon, « Tumeurs cérébrales : du diagnostique au traitement », Masson, Paris, 2004, 267-270, [6]). L'administration de corticoïdes, seulement lorsque le diagnostic est certain, entraîne une fonte tumorale dans 50% des cas. 1 o La radiothérapie reste le traitement de référence et amène une excellente réponse, pratiquement dans tous les cas. Cependant, les rechutes sont souvent précoces. Si une chimiothérapie associée (Méthotrexate par exemple) améliore le pronostic, celui-ci reste sombre. 15 Chez le sidéen, le traitement reste la radiothérapie, ce qui n'empêche pas, malheureusement, la survenue d'une maladie opportuniste le plus souvent fatale. Récemment, le rituximab, un anticorps monoclonal chimérique murinhumain se liant aux cellules B expirmant le CD20 humain, a été testé par 20 injection intracérébrale dans une tumeur (Mineo et al. « Using human CD20-transfected murine lymphomatous B cells to evaluate the efficacy of intravitreal an intracerebral rituximab injections in mice », Invest Ophtalmol Vis Sci., 49 (11) :4738-4745, 2008, [71) ou par voie intraventriculaire (Rubenstein et a1. « Phase 1 study of intraventricular administration of 25 rituximab in patients with recurrent CNS and intraocular Iymphoma », J Clin Onco1., 25 (11) : 1350-1356, 2007, [20], Hong et a1., « A successful treatment of relapsed primary CNS Iymphoma patient with intraventricular rituximab followed by high-dose chemotherapy with autologous stem ce11 rescue », Yonsei Med J., 50 (2): 280-283, 2009 [211), et a montré une activité sur du 30 LCP. Au contraire, une injection intraveineuse de rituximab a montré des résultats contradictoires sur l'évolution du LCP (Feugier et a1. « Incidence and risk factors for central nervous system occurrence in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma: influence of rituximab », Ann Oncol, 15:129:133, 2004, [22], Rubenstein et al. [20], Jahnke et al. « Efficacy and MRI of rituximab and methotrexate treatment in a nude rat model of CNS Iymphoma, Neuro Oncol., 11 (5):503-513, 2009, [23]). Il existe donc un réel besoin d'un outil thérapeutique palliant ces inconvénients et obstacles quant au traitement du lymphome cérébral primitif.

10 Description de l'invention Après d'importantes recherches, la Demanderesse est parvenue à fournir des anticorps monoclonaux pouvant être utilisés dans le traitement du lymphome cérébral primitif. Les anticorps selon l'invention sont constitués de deux chaînes lourdes 15 et de deux chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région (ou domaine) variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour les chaînes légères et V-D- J pour les chaînes lourdes) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région 20 constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères ou de plusieurs domaines pour les chaînes lourdes . On entend par « anticorps monoclonal », au sens de la présente invention, toute préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique. 25 Les anticorps de l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps " chimériques " décrites par exemple dans Morrison et al., Proc. Natl . Acad. Sci . U.S.A., 81, pp. 6851-55 (1984), où la technologie de 30 l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes5 d'une immunoglobuline humaine. Un mode de réalisation particulier sera illustré plus loin. Un premier objet de l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1, dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour son utilisation dans le traitement du lymphome cérébral primitif (LCP). Les séquences d'acide nucléique murines SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 codent respectivement pour le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12, disponible à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) sous le numéro ACC 474. Cet hybridome produit un anticorps monoclonal murin de type IgG2a,x dirigé contre le CD20. La séquence SEQ ID NO. 1 comporte néanmoins un résidus d'acide nucléique qui diffère par rapport à la séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12. Ces séquences murines ont été choisies pour dériver les séquences des régions variables des anticorps selon l'invention en raison de la spécificité de l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour l'antigène CD20. Les régions variables des anticorps selon l'invention comportent au moins 700/0 d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2. Avantageusement, cette identité de séquences confère une identité de spécificité des anticorps selon l'invention avec l'anticorps murin CAT-13.6E12. Avantageusement, cette identité de séquences confère une identité d'affinité pour la cible entre l'anticorps selon l'invention et l'anticorps murin CAT-13.6E12.

Les anticorps utilisés dans le premier objet de l'invention possèdent en outre des régions constantes des chaînes légères et lourdes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 800/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 800/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 900/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 900/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 950/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 950/0 d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2.

De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisées dans l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 990/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention peut être codée par une 3o séquence possédant au moins 990/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2.

Avantageusement, tout anticorps possédant des régions variables de leur chaînes lourdes et légères présentant une ou plusieurs substitution(s), insertion(s) ou délétion(s) d'un ou plusieurs acides nucléiques, ces modifications de séquences répondant aux pourcentages d'identités de séquences tels que définis ci-dessus, et n'altérant ni la spécificité de l'anticorps pour sa cible, ni son affinité pour sa cible, peut être utilisé aux fins de l'invention. Les anticorps utilisés dans l'invention s'entendent aussi de tout anticorps possédant les régions CDR (Complementary Determining Région) i o de l'anticorps CAT-13.6E12, associées à des régions FR n'appartenant pas à CAT-13.6E12 (framework, régions très conservées des régions variables, nommées aussi "charpente"). De tels anticorps possèdent une affinité et une spécificité très comparable, de préférence identique, à celle de l'anticorps murin CAT-13.6E12. 15 Dans le premier mode de réalisation de l'invention, l'anticorps est utilisé pour la fabrication d'un médicament, est donc un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la 20 séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine. On entend par « dirigé contre l'antigène CD20 », au sens de la présente invention, la capacité de l'anticorps monoclonal à lier tout ou partie 25 de l'antigène CD20, et notamment I'épitope reconnu par l'anticorps EMAB603, également appelé R603. De manière préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation 30 préféré de l'invention permet de diminuer I'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1), Km(1, 2), Km(1, 2, 3) ou Km(3) mais l'allotype préféré est Km(3) .

Dans un autre mode de réalisation complémentaire, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type X. Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions 1 o humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type y1, de type y2, de type y3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant une 15 région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes 20 réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CHI, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CHI et CL des 25 chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcyR et le Cl q. La région Fc, constituée 3o des 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné de type lactosaminique, lié à l'Asn 297. De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y1, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC chez le plus grand nombre d'individus (humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple G1 m(3), G1 m (1, 2, 17), G1 m(1, 17) ou Glm(1, 3) . De manière préférentielle, l'allotype est G1 m(1, 17) . Dans un aspect particulier de l'invention, la région constante de i o chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y1, et elle est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3, la région constante de chacune de ses chaînes légères étant codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4. Ainsi, un tel anticorps possède une région variable murine et une région constante humaine, avec des 15 chaînes lourdes de type y1. Cet anticorps appartient donc à la sous-classe des IgG1. Selon le mode de réalisation de l'anticorps utilisé dans l'invention, l'anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO 20 : 4, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 et la région constante est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3. De manière préférentielle, chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique 25 murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 codant pour 3o le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps. Dans un aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes i o légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murinehumaine SEQ ID NO : 6, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5, est la 15 séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6, est la séquence SEQ ID NO : 8. L'acide aminé situé en position 106 est une lysine (K) dans la séquence SEQ ID NO : 7. 20 L'anticorps utilisé dans l'invention peut être produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat. La lignée productrice de l'anticorps selon l'invention est une caractéristique importante puisqu'elle confère à l'anticorps certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des anticorps est à l'origine des modifications post-traductionnelles, notamment 25 des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des anticorps ayant pourtant des structures primaires identiques. Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps peut être produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à 30 I'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Avantageusement, cette lignée présente la capacité de produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO. Dans un autre mode de réalisation particulier, un autre anticorps selon l'invention est l'anticorps EMAB603 (également appelé R603) produit par le clone cellulaire R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Chacune des chaînes légères de l'anticorps EMAB603 est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ 1 o ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. Cet anticorps chimérique entre en compétition avec l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 et possède une activité cytotoxique très supérieure à celle du rituximab, qui peut être attribuée pour partie à la glycosylation particulière 15 du N-glycanne de la chaîne lourde de ces anticorps. Avantageusement, le clone R603 produit une composition d'anticorps EMAB603 possédant un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur à 0,6, pour lequel i1 a été démontré dans la demande de brevet FR 03 12229 qu'il est optimal pour conférer une forte activité ADCC aux anticorps. Cet anticorps peut être 20 particulièrement intéressant comme outil thérapeutique pour le traitement du LCP. De tels anticorps, ainsi qu'un procédé permettant leur fabrication, sont décrits dans le document WO 2006/064121. Un exemple de vecteur d'expression d'un anticorps selon l'invention, est 25 le vecteur de séquence SEQ ID NO : 17. Ce vecteur est un vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne légère est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 5, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 7, et dont la chaîne lourde est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 6, 3o dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 8. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6 codant chacune des chaînes lourdes de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps de l'invention peut être i o produit par co-expression dans une cellule de deux vecteurs d'expression, l'un premettant l'expression de la chaîne légère, et l'autre celle de la chaîne lourde de I'anticorps.Tout comme indiqué précédemment, ces vecteurs possèdent des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Tout comme indiqué 15 précédemment, les vecteurs peuvent être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage. De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable exprimant un anticorps utilisé dans l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0, IR983F, un myélome humain comme Namalwa ou toute autre 20 cellule d'origine humaine comme PERCE, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-(CHO DX BII, CHO DG44), ou d'autres lignées choisies parmi WiI-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. 25 De manière préférée, la lignée utilisée est l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.Ag.20, déposée à I'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits 30 par exemple dans CHO. Les milieux de culture adaptés à ces cellules sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer de manière non exhaustives les milieux de culture RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) [141), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952) [151), Dulbecco's modified MEM (Virology, 8, 396 (1959) [161), F12 Medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965) [171), IMDM (J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978) [181), ou encore ceux décrits dans le document EP1229125. Pour ce premier objet de l'invention, le mode d'administration de l'anticorps utilisé dans l'invention peut être intracérébral, par exemple intratumorale, intrastriatal, intraventriculaire, intrathécal, ou par voie intraveineuse, intrapéritonéale, ou sous-cutanée.

Un deuxième objet de l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène présent à la surface des cellules de lymphome cérébal primitif pour son utilisation par voie d'administration intrathécale dans le traitement du lymphome cérébral primitif. On entend par « antigène présent à la surface des cellules de lymphome cérébal primitif », au sens de la présente invention, tout antigène exprimé à la surface extracellulaire des cellules de lymphome cérébal primitif. L'antigène peut être choisi parmi les molécules CD15, CD19, CD20, CD22, CD30, CD45, CD79a, CD138, MIB-1, MUM-1, ou des idiotopes d'immunoglobulines membranaires.

On entend par «voie d'administration intrathécale », au sens de la présente invention, tout mode d'administration permettant à l'anticorps d'être introduit dans la thèque. L'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être produit dans une lignée cellulaire telle que définie ci-avant.

Les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention peuvent être des régions constantes humaines. Avantageusement, ce mode de réalisation permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique 3o chez l'homme.

Avantageusement, pour ce deuxième objet de l'invention, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3, et la région constante de chacune de ses chaînes légères peut être codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4. Avantageusement, cet anticorps appartient à la sous-classe des IgG1. L'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à 1'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662), telle i o que définie ci-avant. L'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être un anticorps spécifiquement à l'antigène CD20, notamment à un anti-CD20 humain. La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps du deuxième objet de l'invention peut être codée par la séquence d'acides 15 nucléiques murine SEQ ID NO : 1, la région variable de chacune de ses chaînes lourdes peut être codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2. Ainsi, les chaînes légères de cet anticorps peuvent être codées par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et 20 les chaînes lourdes être codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6. L'anticorps peut ainsi être constitué des chaînes légères de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et des chaînes lourdes de séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8. 25 L'anticorps peut être produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'anticorps de l'invention peut être utilisé en combinaison 3o avec un ou plusieurs autre(s) anticorps, par exemple monoclonal(ux), dirigé(s) contre un ou plusieurs autre(s) antigène(s) exprimé(s) sur les cellules Iymphoides, comme par exemple, de façon non limitative, les antigènes CD1, CD2, CD3, CD4, CDB, CD11, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69, CD70, CD71, CD79a, CD80, CD81, CD82, CD86, CD95, CD103, CD118, CD119, CD120, CD132, CD138, CD210, CD217. Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'anticorps selon l'invention peut être utilisé en association avec des cellules exprimant des FcyR telles que les cellules NK, les cellules NKT (Natural Killers T) , les lymphocytes Tyô, les macrophages, les monocytes ou les cellules dendritiques, c'est-à-dire en association avec une thérapie cellulaire (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78:1569 ([8]) ; Kimby E et al. 1989 Leukemia 3 (7) :501-504 ([9]); Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) ;159-164 ([10]) ; Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27(3) ;321-327 ([11]) ; Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9) :1667-77 ([12]) ; Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9) :744-50 ([13])) . Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre la formation de lymphocytes T mémoires. Ces lymphocytes T mémoires peuvent posséder la capacité de proliférer, et de se réactiver de manière 2 o rapide lors d'une deuxième exposition aux cellules tumorales. Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre une infiltration de cellules T dans le microenvironnement tumoral, ce qui peut induire un ralentissement de la croissance tumorale, et/ou une meilleure clairance des cellules tumorales. 25 Avantageusement, un tel anticorps monoclonal peut avoir un effet antitumoral significatif. Par exemple, un tel anticorps peut permettre une inhibition de la réplication des cellules tumorales d'au moins 200/0, ou au moins 30 %, ou encore au moins 500/0, et de préférence d'au moins 600/0, ou 700/0 chez le sujet atteint de LCP auquel il est administré. 30 Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, la dose d'anticorps administrée aux patients peut être de préférence inférieure à 375 mg/m2, 187,5 mg/m2, à 75 mg/m2, à 37,5 mg/m2, 15 mg/m2, 7,5 mg/m2 ou de manière particulièrement avantageuse inférieure à 3,75 mg/m2 ou encore à 1 mg/m2 ou à 0,5 mg/m2. La dose administrée est avantageusement comprise entre 187,5 mg/m2 et 75 mg/m2, ou entre 75 mg/m2 et 37,5 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 15 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 7,5 mg/m2 ou encore entre 75 mg/m2 et 3,75 mg/m2. De préférence, la dose administrée est comprise entre 3,75 mg/m2 et 0,5 mg/m2, plus particulièrement comprise entre 2 mg/m2 et 1 mg/m2. Avantageusement, ces doses sont administrées par voie intraveineuse, sous-cutanée, intracérébrale, par exemple intra-tumorale, intrastriatale, intraventriculaire, et/ou intrathécale. Quand l'anticorps est administré par voie intracérébrale, la quantité d'anticorps administrée au patient peut être comprise entre 0,001 pg et 1000 pg d'anticorps, ou encore entre 0,001 pg et 100 pg d'anticorps, ou encore comprise entre 10 pg et 100 pg d'anticorps, avantageusement comprise entre 0,01 pg et 10 pg d'anticorps, ou entre 1 pg et 10 pg, ou entre 0,01 pg et 1 pg, ou entre 0,01 pg et 0,1 pg ou encore entre 0,02 pg et 0,08 pg d'anticorps. Avantageusement, l'administration de l'anticorps peut se faire près de la tumeur, ou dans la tumeur. Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'administration peut se faire soit à dose unique (c'est-à-dire administration unique), soit en injections répétées. Si les injections sont répétées, chaque administration peut être suffisamment espacée de la précédente pour que chaque administration soit considérée comme une administration en dose unique. Par exemple, chaque administration peut être espacée d'au moins une semaine, ou d'au moins 2 semaines, d'au ou moins 3 semaines, ou d'au mois 4 semaines, ou d'au moins 6 semaines, ou d'au moins 10 semaines, ou d'au moins 6 mois de l'administration précédente.

Que ce soit pour le premier objet de l'invention ou pour le deuxième objet de l'invention, l'anticorps peut être administré comme médicament selon les règles standard, bien connues de l'homme du métier, de traitement des lymphomes. Avantageusement, les anticorps utilisés dans l'invention sont cytotoxiques.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du LCP. Un objet particulier de l'invention se rapporte à une méthode de traitement au moyen des anticorps précédemment décrits du LCP. i o Avantageusement, la méthode de traitement comprend l'étape d'administration des anticorps à un patient atteint de LCP, par exemple par voie intrathécale. Avantageusement, l'anticorps utilisé dans l'invention est administré avec un support pharmaceutiquement acceptable, approprié pour l'effet 15 thérapeutique attendu. Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'un médicament destiné au traitement du LCP, consistant à mélanger l'anticorps monoclonal utilisé dans l'invention avec un support pharmaceutiquement acceptable, puis à obtenir le médicament. 20 Un autre objet de l'invention est une méthode de traitement thérapeutique du LCP, comprenant l'administration, à un patient en présentant le besoin, d'un anticorps ou d'un médicament tel que décrit ci-avant. Avantageusement, l'administration peut être effectuée par voie intrathécale. 25 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.

Brève description des figures 30 - La figure 1 est la représentation schématique du vecteur CKHu utilisé pour la chimérisation de la chaîne légère kappa des anticorps EMAB603. - La figure 2 est la représentation schématique du vecteur G1 Hu utilisé pour la chimérisation de la chaîne lourde des anticorps EMAB603. - La figure 3 est la représentation schématique du vecteur d'expression des chaînes lourdes et légères utilisé pour la production de l'anticorps R603. - La figure 4 représente le schéma des injections intracérébrales réalisées dans le cadre de l'étude de l'effet du tampon contenant le R603 sur la croissance tumorale. On réalise à D-7, soit 7 jours avant l'injection intracérébrale des traitements, l'injection de 2 pl de cellules tumorales lymphomateuses B murines (H2d) A20.IIA-GFP-hCD20 en suspension, soit 5.104 cellules, est réalisée. On réalise à D1, soit 7 jours après l'injection intracérébrale des cellules tumorales, l'injection intracérébrale soit de 2 pl de PBS 1X (expérience référencée PCL HO2), soit de 2 pl d'anticorps monoclonal irrelevant anti-P24 (expérience référencée PCL HO6), soit de 2 pl de tampon du R603. - La figure 5 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 4 groupes d'animaux après la mise en oeuvre du protocole d'injection défini ci-dessus (figure 4). La courbe A (représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 ( ), la courbe B représente la survie des souris traitées avec l'anticorps anti-P24 ( ), la courbe C représente les souris traitées avec le PBS 1X (), et la courbe D représente la survie des souris non traitées ( ). Le test statistique est celui de Kaplan-Meier. La valeur P correspond à la valeur Iogrank. - La figure 6 représente le schéma des injections intracérébrales réalisées dans le cadre de l'étude de l'efficacité des anticorps anti-CD20 humain dans le modèle murin de LCP, selon le protocole expérimental n°1. On réalise à D-7, soit 7 jours avant l'injection intracérébrale des traitements, l'injection de 2 pl de cellules tumorales Iymphomateuses B murines (H2d) A20.IIA-GFP-hCD20 en suspension, soit 5.104 cellules, est réalisée. On réalise à D1, soit 7 jours après l'injection intracérébrale des cellules tumorales, l'injection intracérébrale soit de PBS 1X, soit de tampon contenant différentes quantité de R603 (soit 1 pg, soit 5 pg, soit 20 pg), soit de rituximab (20 pg). - La figure 7 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 5 groupes d'animaux après la mise en oeuvre du protocole d'injection défini ci-dessus (figure 6). La courbe A ( --) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 1 pg, la courbe B ( K -) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 5 pg, la courbe C ( --p -) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps R603 20 pg, la courbe D ( )

-) représente les souris traitées avec le PBS 1X, et la courbe E ( représente la survie des souris traitées avec rituximab. Le test statistique est celui de Kaplan-Meier entre le groupe traité et le groupe contrôle PBS 1X. La 10 valeur P correspond à la valeur logrank. - La figure 8 représente le pourcentage de cellules CD19+ GFP+ 15 jours après le traitement selon le protocole expérimental n°2, pour les groupes de souris traitées soit par PBS 1X, soit par tampon contenant différentes quantités de R603 (soit 1 pg, soit 5 pg, soit 20 pg), soit par 15 rituximab (20 pg). Le test statistique est celui de Mann-Whitney. NS= non significatif. - La figure 9 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 4 groupes d'animaux après la mise en oeuvre du protocole expérimental N°3. La courbe A (-°^ représente la survie des souris injectées avec les 20 cellules A20.IIA-GFP, traitées avec le PBS 1X, la courbe B ( ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20, traitées avec le PBS 1X, la courbe C ( ,) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg, la courbe D ( ) représente les souris injectées avec les cellules A20.IIA- 25 GFP-hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg. - La figure 10 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 4 groupes d'animaux après la mise en oeuvre du protocole expérimental N°4. La courbe A ( ) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20, traitées avec le PBS 1X, la courbe B ( ) 30 représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg en intracérébral, la courbe C ( ° °.) représente la survie des souris injectées avec les cellules A20.IIA- GFP-hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg en intrathécale, la courbe D (-~--) représente les souris injectées avec les cellules A20.IIAGFP-hCD20, traitées avec l'anticorps LFB-R603 6,6 mg en intraveineuse. - La figure 11 représente le suivi de la survie, en jours, pour les 2 groupes d'animaux après la mise en oeuvre du protocole expérimental N°5. La courbe A ( ) représente la survie des souris traitées avec le rituximab 20 pg (n=1), la courbe B ( ) représente la survie des souris traitées avec l'anticorps LFB-R603 20 pg (n=4).

EXEMPLES Exemple 1 : Construction des vecteurs d'expression de l'anticorps chimériques anti-CD20 EMAB603

A. Détermination de la séquence des régions variables de l'anticorps murin CAT-13.6E12 L'ARN total de l'hybridome murin CAT-13.6E12 (fournisseur : DSMZ, réf. ACC 474) produisant une immunoglobuline de type IgG2a,x a été isolé (kit RNAeasy, Qiagen réf. 74104). Après transcription inverse, les domaines variables des chaînes légères (VK) et lourdes (VH) de l'anticorps CAT- 13.6E12 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit GeneRacer, Invitrogen réf. L1500-01). Les amorces utilisées pour ces deux étapes sont les suivantes :

1. amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 9) 5' - ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 10) '- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3'

2. amorces de PCR 5'RACE a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 11) 5 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 12) 5'- GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG -3'

Les produits de PCR VH et VK ainsi obtenus ont été clonés dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO (Zéro blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, réf. K2875-20) puis séquencés. La séquence nucléotidique de la région Vx de l'anticorps murin CAT-13.6E12 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 1, hormis le dernier nucléotide qui est remplacé par A (AAA au lieu de AAC) . Le gène Vx appartient à la famille V1(4 (Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [19]). La séquence nucléotidique de la région VH de CAT-13.6E12 est la séquence SEQ ID NO : 2. Le gène VH appartient à la famille VH1 ([19]).

B. Construction des vecteurs d'expression des chaînes lourdes et des 20 chaînes légères des anticorps chimériques EMAB603

1. Vecteur chaîne légère Kappa de l'anticorps EMAB603 La séquence VK clonée dans le vecteur de séquençage pCR4Blunt-TOPO a été amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : 25 a) amorce sens VK (SEQ ID NO : 13) 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACCA TGGATTTTCAAGTGCAGATTTTC AG -3' La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence 3o en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italiques. b) amorce antisens VK: (SEQ ID NO : 14) 5'- TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCG©TTTATTTCCAGCCTGGT - 3' Cette amorce réalise la jonction des séquences Vx murine (en italique) et région constante (Cx) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III. Cette amorce réalise la jonction des séquences Vx murine (en italique) 10 et région constante (Cx) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III.

Le produit de PCR Vx ainsi obtenu contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12, avec la mutation 15 AAC -> AAA (nucléotide encadré dans la séquence de l'amorce antisens SEQ ID NO : 14) qui correspond à la mutation N106K par rapport à la séquence naturelle Vx de CAT-13.6E12.

La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB603 20 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 5 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 7. Cette PCR Vx a été ensuite clonée entre les sites Spe 1 et Dra III du vecteur de chimérisation chaîne légère (Fig. 1) qui correspond à la séquence 25 SEQ ID NO : 1, en 5' de la région constante Cx humaine, dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 4. La séquence Cx humaine de ce vecteur de chimérisation avait été préalablement modifiée par mutagénèse silencieuse afin de créer un site de restriction Dra III pour permettre le clonage de séquences Vx murines. Ce vecteur de chimérisation contient un 30 promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection dhfr (dihydrofolate reductase) . . Vecteur chaîne lourde

Une démarche similaire a été appliquée pour la chimérisation de la 5 chaîne lourde de l'anticorps EMAB603.

La séquence VH clonée dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO a été tout d'abord amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VH (SEQ ID NO :15) 10 5'- CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3

La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italique. b) amorce antisens VH (SEQ ID NO :16) 5'- GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTC C -3' 20 Cette amorce réalise la jonction des séquences VH murine (en italique) et région constante GI humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Apa 1 . Le fragment VH amplifié contient la séquence codant le peptide signal 25 naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Cette PCR VH a été ensuite clonée entre les sites Spe 1 et Apa 1 du vecteur de chimérisation chaîne lourde (Fig. 2) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 2, en 5' de la région constante 71 humaine dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 3. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et 30 une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection néo. 23 15 La séquence de la chaîne lourde de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présenté en SEQ ID NO : 6 pour la séquence nucléotidique et en séquence SEQ ID NO : 8 pour la séquence peptidique déduite. 3. Vecteurs d'expression finaux

Vecteur d'expression de l'anticorps EMAB603 Un vecteur d'expression unique contenant les deux unités de 10 transcription chaîne lourde et chaîne légère de l'anticorps anti-CD20 EMAB-603 a été construit à partir des deux vecteurs de chimérisation de la chaîne légère et de la chaîne Ce vecteur d'expression HK463-25(FDA) présente deux gènes de sélection, néo (neo-phosphotransphérase II) et dhfr (dihydrofolate reductase) ainsi que deux unités de transcription chaîne lourde 15 et chaîne légère sous le contrôle d'un promoteur RSV (Figure 3).

Exemple 2 : Création de lignées cellulaires dérivées de la lignée YB2/0 productrices de l'anticorps chimérique anti-CD20 EMAB603

20 La lignée de rat YB2/0 (ATCC # CRL-1662) a été cultivée en milieu EMS (Invitrogen, réf. 041-95181M) contenant 50/0 de sérum de veau foetal (JRH Biosciences, réf. 12107). Pour la transfection, 5 millions de cellules ont été électroporées (électroporateur Biorad, modèle 1652077) en milieu Optimix (Equibio, réf. EKITE 1) avec 25 µg de vecteur chaîne légère, pRSV- 25 HL-EMAB-603 pour l'expression de l'anticorps EMAB603. Les conditions d'électroporation appliquées étaient de 230 volts et 960 microfarads pour une cuvette de 0,5 ml. Chaque cuvette d'électroporation a été ensuite répartie sur 5 plaques P96 avec une densité de 5000 cellules/puits. La mise en milieu sélectif RPMI (Invitrogen, ref 21875- 034) contenant 50/0 de sérum dialyse 30 (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 gg/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131- 027)5 et 25 nM de methotrexate (Sigma, réf. M8407), a été réalisée 3 jours après la transfection. Les surnageants des puits de transfection résistants ont été criblés pour la présence d'immunoglobulines (Ig) chimériques par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines. Les 10 transfectants produisant le plus d'anticorps ont été amplifiés en plaques P24 et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules/plaque) . 1 o A l'issue du clonage, le clone R603 a été sélectionné pour la production de l'anticorps chimérique EMAB603 et adaptés progressivement au milieu de production CD Hybridoma (Invitrogen, réf. 11279-023). La production des anticorps chimériques EMAB603 a été réalisée par expansion de la culture adaptée en milieu CD Hybridoma, obtenue par dilution à 3x105 cellules/mi en 15 flacons de 75 cm2 et 175 cm2 puis par dilution à 4,5x105 cellules/mi en flacon de type roller. Après avoir atteint le volume maximal, la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la viabilité cellulaire ne soit plus que de 200/0. Après production, les anticorps chimériques EMAB603 ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur protéine A (pureté estimée par HPLC < 95 %) 20 et contrôlés par électrophorèse en gel de polyacrylamide.

Exemple 3 : Etude des anticorps LFB_R603 et Rituximab dans un modèle murin de lymphome cérébral primitif 25 3.1 Matériels Lignée cellulaire On utilise une cellule de lymphome B murin transfectée avec une protéine de fusion du CD20 humain (cloné préalablement à partir de la lignée cellulaire Raji) et la GFP (Green Fluorescent Protein) par un système 30 d'électroporation. Ces cellules transfectées avec le CD20 humain sont appelées A20.IIA-GFP-hCD20, tandis que les cellules non transfectées avec le CD20 humain sont appelées A20.IIA-GFP.

Souris adultes Des souris adultes BALB/c ByJ (H2d) (Charles River Laboratory, L'Arbresle Cedex France), âgées de 6 à 8 semaines, sont acclimatées pendant au moins une semaine après leur date de réception. On réalise une première injection intracérébrale entre la septième et la huitième semaine après leur réception. De la nourriture stérile et de l'eau filtrée leur sont administrées ad libitum. Les littières stériles des cages sont remplacées toutes les semaines.

Anticorps Les trois anticorps (LFB, Les Ulis, France) suivants sont utilisés : - l'anticorps R603, dans une solution batch G097/CD20/F0001 à 10 mg/ml. Une dilution est réalisée dans le tampon 10808108. L'anticorps R603 (également appelé EMAB603) est dirigé contre le CD20 humain (anti-hCD20), - l'anticorps anti-P24 comme contrôle négatif, dans le batch 829 09/020. - L'anticorps rituximab (anti-hCD20), dans le batch M59753 et la solution de stockage N40626 à une concentration de 10 mg/ml.

3.2 Méthodes Injections intracérébrales Les souris sont anesthésiées avec une injection intrapéritonéale de 60 pl de kétamine/xylazine diluée dans du PBS (tampon phosphate salin ou « Phosphate Buffer Saline ») stérile 1X. Les animaux sont ensuite placés dans un cadre stéréotaxique (KopfO), puis une incision de la peau du crâne est réalisée et la surface de l'os est essuyée. Une perforation de l'os crânien est réalisé au-dessus du site choisi pour l'injection des cellules tumorales (2 mm médiane droite/ 0,4 mm front bregma), puis une aiguille gauge 26 est introduite lentement dans le cerveau (2,5 mm de profondeur depuis la surface du cerveau). 5.104 cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 diluées dans 2 pl avec du PBS 1X sont injectées (0,5 pl/min), puis l'aiguille est retirée lentement du cerveau (0,5 mm/30secondes). Enfin, la plaie est suturée avec du fil Ethicon® et la peau est désinfectée.

Première injection 5.104 cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 ou A20.IIA-GFP diluées dans 2 pl avec du PBS 1X sont injectées à une localisation spécifique du cerveau : le striatum droit de chaque souris adulte. Injections du traitement Chaque souris est traitée avec un des trois anticorps sept jours après que l'injection de cellules tumorales ait été réalisée (cf. Figures 4, 6 et 8).

Suivi de la survie Après la chirurgie, les animaux sont pesés deux fois par semaine, et leur comportement général (après isolation du groupe) ainsi que leur aspect (poil hérissé, tumeur visible, cachexie) sont observés.

Prélèvement des cellules Pour les expérimentations destinées à l'étude du microenvironnement immunologique après le traitement des souris par anticorps dirigés contre le CD20 humain (anti-hCD20) dans le modèle LCP, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale et plusieurs organes sont prélevés.

Cerveau Le cerveau est prélevé et placé dans un réceptacle contenant 6 puits avec du milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium). Les cellules 3o cérébrales sont préparées par dissociation avec des ciseaux chirurgicaux. Après la dissociation, la suspension cellulaire est dissociée toutes les 30 minutes dans 2 ml de milieu RPMI à 0,4 pg/pl, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 pg/pl et de la DNase I, et filtrée à travers une membrane 70 pm (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis, afin de séparer les cellules de la myéline, un gradient de Percoll est réalisé et les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS (« Fluorescence activated cell sorter »).

Rate La rate est prélevée et placée dans un réceptacle de 6 puits contenant du PBS 1X. Les cellules de la rate sont préparées par dissociation entre 1 o deux lamelles de microscope gelées. Après la dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane de 70 pm (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées dans une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS.

15 Yeux Les yeux sont prélevés et nettoyés par retrait de la conjonctive et du nerf optique. Chaque oeil collecté est placé dans un réceptacle de 24 puits contenant du PBS 1X. Ils sont disséqués pour enlever le cristallin. Puis les yeux sont placés dans un nouveau puits contenant du PBS 1X. L'ceil entier à 20 l'exception du cristallin est conservé pour être dissocié 30 minutes dans 500 pl de milieu RPMI à 0,4 pg/pl, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 pg/pl et de la DNase I. Après dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane 70 pm (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées sur une plaque 25 de 96 puits pour une analyse par FACS.

Ganglions cervicaux et inguinaux Les ganglions cervicaux et inguinaux sont prélevés et placés dans un réceptacle de 96 puits contenant 500 pl de PBS 1X. Ils sont dissociés 30 pendant 30 minutes dans 500 pl de PBS 1X 0,4 pg/pl, contenant de la Liberase® (Roche Diagnostics) à 0,1 pg/pl et de la DNase I. Après dissociation, la suspension cellulaire est filtrée à travers une membrane 70 pm (BD Falcon) pour éliminer les contaminants les plus gros. Puis les cellules sont placées sur une plaque de 96 puits pour une analyse par FACS.

Analyse par FACS Les données sont acquises au moyen du cytomètre de flux à 11 couleurs (LSRII, BD Biosciences) et les analyses réalisées avec le logiciel associé (Diva, BD Biosciences). Pour les cellules restantes, 106 cellules provenant de la suspension cellulaire préalablement préparée sont introduites dans la plaque de 96 puits. Les récepteurs murins Fcy sont d'abord saturés avec l'anticorps 2.4G2 (anticorps monoclonal anti-CD16/CD32). Puis les cellules sont incubées avec un mélange contenant les anticorps suivants : l'anticorps murin anti-CD19/APC (exprimé par les cellules tumorales et les lymphocytes B endogènes) (6D5; e-Bioscience), l'anticorps murin anti-CD41PETR (exprimé par les lymphocytes CD4+) (GK1.5; BD Biosciences), et l'anticorps murin anti-CD8/AF400 (exprimé par les lymphocytes CD8+) (53-6.7; BD Biosciences). Les cellules vivantes sont définies au moyen du détecteur de granulosité et de réfringence des cellules (Side scatter : SSC) et du détecteur de taille (Forward scatter : FSC) des cellules, après exclusion de l'autofluorescence et des doublets cellulaires. 3.3 Résultats Les groupes de souris sont comparés par : - le test de Kaplan-Meier (expériences PCL HO2, HO3, HO4 et HO6) - le test non paramétrique de Mann Whitney (expérience PCL HO5). 3.3.1 Etude de l'effet de l'anticorps R603 sur la croissance tumorale Pour ces expériences, les groupes testés sont les suivants : - 9 souris n'ayant subi aucun traitement, - 5 souris traitées avec 2 pl de PBS 1X, - 7 souris traitées avec 2 pl de tampon de l'anticorps R603, - 4 souris traiées avec 2 pl d'anticorps anti-P24.

Chaque groupe de souris reçoit une injection tumorale suivie 7 jours plus tard d'une injection de PBS 1X (PCL HO2) ou de tampon contenant l'anticorps R603 ou l'anticorps anti-P24 (PCL HO6) (excepté pour le groupe non traité) (cf. Figure 4).

Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 5, qui représente le suivi de la survie pour les 4 groupes d'animaux après la mise en oeuvre du protocole d'injection défini ci-dessus. Les résultats proviennent d'un pool de six expériences indépedantes : PCL HO2, PCL HO3, PCL HO4, PCL HO6, PCL HO8 et PCL HO9. Quand les 4 groupes sont comparés, aucune i o différence significative n'est observée entre le groupe non traité et le groupe traité avec l'anticorps monoclonal anti-P24, ni entre le groupe non traité avec le groupe traité avec le tampon de l'anticorps LFB-R603.

3.3.2 Etude de l'efficacité dose-réponse des anticorps anti-CD20 15 humain dans le modèle de LCP murin et comparaison avec le rituximab: protocole expérimental n°1 Pour ce protocole expérimental, 5 groupes de souris sont testés et cette expérience est répétée 2 fois : - 10 souris sont traitées avec 2 pl de PBS 1X, 20 - 10 souris sont traitées avec l'anticorps R603 à 1 pg/2p1, - 10 souris sont traitées avec l'anticorps R603 à 5 pg/2p1, - 10 souris sont traitées avec l'anticorps R603 à 20 pg/2p1, - 10 souris sont traitées avec l'anticorps rituximab à 20 pg/2p1. Chaque groupe reçoit une injection tumorale suivie 7 jours plus tard par 25 une injection thérapeutique (cf. figure 6). Les résultats obtenus sont rapportés à la figure 7, qui représente le suivi de la survie des 5 groupes testés suivant le protocole n° 1. Les résultats proviennent d'un pool de 2 expériences indépedantes : PCL HO3 et PCL HO4. 3o Des différences significatives sont observées entre le groupe contrôle PBS 1X et les groupes traités avec un des anticorps anti-CD20 humains suivants : R603 à 20 pg (P<0,001), R603 à 5 pg (P<0,024), rituximab à 20 pg (P<0,0028). Aucune différence significative n'est observée entre le groupe contrôle PBS 1X et le groupe traité avec R603 à 1 pg. De plus, comme des différences significatives sont observées entre les groupes R603 à 20 pg et R603 à 1 pg (P<0,001) et entre les groupes R603 à 20 pg et R603 à 5 pg (P=0,0033), on conclut à un effet dose-réponse du traitement au moyen de l'anticorps R603. Aucune différence significative n'est constatée entre le groupe R603 à 20 pg et le groupe rituximab à 20 pg (P=0,074) en utilisant le test statistique Kaplan-Meyer. Toutefois, en comparaison avec le groupe contrôle PBS 1X, l'anticorps R603 à 20 pg (P<0,001) montre une survie accrue et une mortalité retardée des souris non survivantes au regard de celles obtenues avec le rituximab à 20 pg (P=0,028). De plus, la survie globale de ces 2 groupes traités est clairement différente : 500/0 de survie (5/10) des souris traitées avec le R603 à 20 pg, contre 100/0 de survie (1/10) des souris traitées avec rituximab à 20 pg. 3.3.3 Etude du microenvironnement après le traitement avec les anticorps anti-CD20 humain dans le modèle murin de LCP : protocole expérimental n°2 Pour ce protocole expérimental, 5 groupes de souris sont testés une fois de la manière - 10 souris - 10 souris - 10 souris - 10 souris - 10 sourissuivante : sont traitées avec 2 pl de PBS 1X, sont traitées avec rituximab à 2pg/2p1, sont traitées avec l'anticorps R603 à 20 pg/2p1, sont traitées avec rituximab à 5 pg/2p1, sont traitées avec rituximab à 1 pg/2p1. Chaque groupe reçoit une injection tumorale suivie d'une injection thérapeutique unique 7 jours après. Pour chaque souris 15 jours après le traitement, le cerveau, les 2 yeux, la rate et les ganglions cervicaux et inguinaux sont prélevés et une analyse par FACS est réalisée. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 8, qui représente le pourcentage de cellules tumorales 15 jours après le traitement et selon les doses d'anticorps anti-CD20 humain injectées. Un effet anti-tumoral très significatif du R603 à 20 pg/2pl est obtenu (P=0,009) à un niveau cellulaire en comparaison avec le groupe contrôle PBS 1X. Les doses les plus faibles testées (1 pg et 5 pg) n'ont pas permis d'observer un effet significatif. Un effet significatif, mais moindre (P=0,047) a i o été observé sur le groupe traité avec le rituximab à 20 pg. 3.3.4 Etude de la spécificité anti-hCD20 de l'anticorps monoclonal LFBR603 comparant l'efficacité sur les cellules tumorales A20.IIA-GFP et A20.IIA-GFP-hCD20 dans le modèle PCL : protocole expérimental n° 3 15 Pour ce protocole expérimental, quatre groupes sont testés une fois : - cinq souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et sont traitées avec le PBS 1X 2 pL, - cinq souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP et sont traitées avec le PBS 1X 2 pL, 20 - quatorze souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et sont traitées avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg, - trois souris reçoivent les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et sont traitées avec 20 pg d'anticorps LFB-R603. Chaque groupe reçoit les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 ou 25 A20.IIA-GFP (2 pl de suspension cellulaire à 5.104 cellules) en intracérébral puis une unique injection thérapeutique intracérébrale sept jours plus tard. Résultats Les résultats sont illustrés par la figure 9, qui représente le suivi de la survie des quatre groupes testés. Quand les quatre groupes sont comparés, il est clair que le groupe ayant subi l'injection des cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et le traitement avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg présente une meilleure survie comparé aux autres groupes. Une différence significative est observée entre les souris ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et le traitement avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg et le groupe ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP et le traitement avec l'anticorps LFB- R603 en intracérébral. De plus, une différence significative (P<0,0001) est constatée entre le groupe de souris ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et le traitement avec PBS 1X et le groupe de souris ayant subi une injection avec les cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 et l'anticorps LFB-R603 à 20 pg en intracérébral. Ces résultats montrent bien que l'anticorps monoclonal R603 a un effet spécifique anti-hCD20. 3.3.5 Etude de l'efficacité des anticorps anti-hCD20 par des essais avec différentes voies d'injections dans le modèles murin de LCP : protocole expérimental n° 4 Pour ce protocol, quatre groupes sont testés et cette expérience est répétée deux fois : - cinq souris sont traitées en injection intraveineuse avec 2 pL de PBS 1X, - cinq souris sont traitées en injection intracérébrale avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg, - cinq souris sont traitées en intrathécale avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg, - quatre souris sont traitées en intraveineuse avec l'anticorps LFBR603 à 6,6 mg.

Chaque groupe reçoit une injection tumorale de 2 pL de suspension cellulaire à 5.104 de cellules A20.IIA-GFP-hCD20, suivie sept jours plus tard par une injection unique thérapeutique intracérébrale, intrathécale ou intraveineuse.

Résultats Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 10. Des différences significatives sont observées entre le groupe traité avec le PBS 1X en intraveineuse et le groupe traité avec l'anticorps LFB-R603 à 20 pg en intraveineuse (P=0,0198).

L'administration intracérébrale (intrastriatale) et l'administration intrathécale de 20 pg d'anticorps LFB-R603 montrent un effet thérapeutique similaire jusqu'à 80 jours de traitement. Toutefois, en raison du faible nombre de sourir dans ces groupes (n<5), le test statistique n'a pas été réalisé. Certains animaux traités par injection intrathécale ou intraveineuse sont inclues dans une autre expérience pour augmenter le nombre totale de souris dans chaque groupe. 3.3.6 Etude de la génération d'une réponse mémoire adaptative parmis les souris survivantes : protocole expérimental n° 5 Pour ce protocole expérimental, les cinq souris suivantes sont concernées : - une souris survivante traitée avec 20 pg de rituximab, - quatre souris survivantes traitées avec 20 pg d'anticorps LFB-R603.

Chaque souris survivante reçoit après le centième jour consécutif au traitement une nouvelle injection de 2 pl de suspension cellulaire à 5.104 de cellules tumorales A20.IIA-GFP-hCD20 dans le striatum controlatéral gauche, sans autre nouveau traitement. Résultats Les résultats du suivi de la survie des souris obtenus sont présentés en figure 11. Une survie augmentée est obtenue pour les souris traitées avec 10 l'anticorps LFB-R603 puisque 500/0 de ces souris sont encore en vie 60 jours après la ré-injection de cellules tumorales A20.IIA-hCD20 sans nouveau traitement. En effet, les souris contrôle non traitées à la première injection meurent entre 20 et 40 jours après l'injection des cellules tumorales. Au contraire, la souris traitée avec riruximab et ayant subi une nouvelle injection 15 de cellules tumorale est morte 48 jours après avoir subi une nouvelle injection de cellules tumorales, sans nouveau traitement. Ainsi, une mémoire adaptive (sur aux cellules T et/ou B) est observée et pourrait être impliquée dans la survie plus longue des souris ayant subi une deuxième injection de cellules tumorales, sans que cette hypothèse sur 20 le mécanisme d'action des anticorps ne lie la Demanderesse d'une façon quelconque. Conclusions Dans les différents protocoles expérimentaux testés, il a été démontré 25 que : - une injection intratumorale de tampon de l'anticorps R603 n'influence pas la croissance tumorale, - une injection d'anticorps anti-CD20 humain R603 dans le site de la tumeur induit efficacement un effet anti-tumoral dose-réponse,5 constaté à la fois sur le suivi de la survie et au niveau cellulaire, associé à un taux de survie élevé de 500/0, - une injection d'anticorps anti-CD20 humain rituximab (20pg) dans le site de la tumeur induit un effet anti-tumoral constaté à la fois sur le suivi de la survie et au niveau cellulaire, mais associé à un taux de survie beaucoup plus faible (100/0) qu'avec l'anticorps LFB-R603, - l'effet spécifique anti-hCD20 de l'anticorps LFB-R603 est confirmé avec les cellules A20.IIA-GFP, - une expérience consistant en une ré-injection des souris survivantes 1 o avec des cellules A20.IIA-GFP-hCD20 pourrait permettre de penser qu'une réponse adaptive a été générée par le traitement au moyen de l'anticorps LFB-R603.

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Claims (1)

1. REVENDICATIONS 1 Anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20 présent à la surface des cellules de lymphome cérébral primitif pour son utilisation par voie d'administration intrathécale dans le traitement du lymphome cérébral primitif. 2 Anticorps selon la revendication 1, dont la région constante de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 et dont la région constante de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques humaine SEQ ID NO : 4. 3 Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule Y132/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). 4. Anticorps selon la revendication 3, ledit antigène CD20 étant un antigène humain. 5. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2. 6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dont chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et dont chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6.7. Anticorps selon la revendication 6, dont chacune des chaînes légères est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et dont chacune des chaînes lourdes est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8. 8. Anticorps selon la revendication 7, produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). 10 9 Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lymphome cérébral primitif.5