FR2910896A1 - Anticorps monoclonal dirige contre le recepteur humain des ldl - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), dans lequel la région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO: 5, la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO: 7, ou par des séquences d'acide nucléique présentant une homologie suffisante avec les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 7 pour que la nature et l'affinité de la liaison dudit anticorps à son antigène ne soient pas modifiées, et les régions constantes de ses chaînes légères et de ses chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

Description

Le mélanome malin est une tumeur maligne du système pigmentaire

(mélanocytes) survenant soit primitivement en peau saine, soit par dégénérescence d'un naevus préexistant. Le mélanome est le cancer cutané dont la fréquence augmente le plus dans le monde. Elle double tous les 10 ans. La majorité des cas survient sur une peau saine, moins d'un quart apparaissant sur naevus préexistant. Chaque année, aux Etats-Unis, plus de 47 000 personnes sont nouvellement diagnostiquées avec un mélanome et 7 700 d'entre elles mourront de ce cancer agressif de la peau.

En France, 4 000 à 5 000 cas sont découverts tous les ans, et 1 000 personnes en meurent. La prévention et la détection précoce du mélanome sont donc essentielles.

En effet, si des recherches sont effectuées pour traiter le mélanome, le traitement standard du mélanome repose encore sur la chirurgie. Il peut s'agir d'une exérèse initiale qui doit comporter des marges variables en fonction de l'épaisseur de la tumeur, ou d'une reprise chirurgicale pour adapter les marges d'exérèse à l'épaisseur de la tumeur s'il y a besoin. Si le bilan met en évidence une ou plusieurs métastases, il faudra les traiter soit par ablation chirurgicale soit par chimiothérapie.

Les espoirs actuels dans le traitement du mélanome se tournent vers les nouvelles approches par thérapie cellulaire. Le rationnel de leur utilisation repose sur deux constatations : d'une part, des régressions spontanées de mélanomes primitifs ou de métastases cutanées ont été rapportées dans la littérature, laissant supposer que le système immunitaire joue un rôle important dans le développement de cette tumeur ; d'autre part, et ce depuis quelques années, des antigènes spécifiques des cellules tumorales de mélanome ont été isolés.

La thérapie cellulaire appliquée au mélanome fait appel à 2 types de traitement : l'immunothérapie adoptive, processus consistant à administrer à un patient des médicaments dotés d'une activité antitumorale afin de stimuler son système immunitaire et d'aider son corps à combattre plus efficacement le cancer, par TIL ou (Tumeur Infiltrante Lymphocytaire -Tumor Infiltrating Lymphocyte), et l'immunothérapie active représentée par la vaccination. L'immunothérapie adoptive par TIL consiste à injecter au malade une grande quantité (plusieurs milliards) de cellules T cytotoxiques, spécifiques des antigènes de mélanome, qui sont isolées à partir d'une tumeur ou métastase et expandues in vitro dans un laboratoire GMP (Good Manufacturing Practices). On est donc dans un système autologue. Les premières études cliniques réalisées aux USA avec les TIL au stade métastatique du mélanome ont obtenu un taux de réponse de l'ordre de 35 %, mais souvent avec des rechutes rapides, amenant à discuter l'abandon de cette approche par immunothérapie passive. Toutefois, la notion d'efficacité sur une masse tumorale résiduelle , évoquée avec les traitements par cytokines, notamment interféron alpha, a amené à se poser la question de son application aux TIL.

Parallèlement à cette approche par TIL, est développée l'approche par injection de clones dirigés contre des antigènes de mélanome, essentiellement Melan-A et tyrosinase. Des résultats préliminaires au stade métastatique ont été obtenus, mais il a surtout été démontré que les clones injectés chez un patient pouvaient d'une part être retrouvés au site métastatique, et d'autre part qu'ils étaient amplifiés chez les patients après injection. L'immunothérapie active par vaccination vise soit à injecter des lysats de cellules mélaniques irradiées en souscutané (approche multi antigènes), soit à injecter des peptides spécifiques obtenus après identification de certains antigènes du mélanome dans un contexte HLA restreint. L'objectif est ainsi d'induire une réponse immunitaire spécifique antimélanome. Aujourd'hui, on peut schématiquement distinguer 4 générations de vaccins dans le mélanome. La première génération est celle des vaccins multi-antigènes. Ils sont constitués par le broyat de cellules tumorales irradiées. Ils ont ainsi l'avantage d'être constitués de plusieurs antigènes de tumeurs ce qui augmente les chances de pouvoir a priori correspondre à l'une des populations T cytotoxique présentées par le malade. Les antigènes de tumeur du mélanome sont . soit des antigènes de différenciation mélanocytaire : tyrosinase, gp 100, Melan-A /MART-1, gp 75 ; soit des antigènes spécifiques de tumeur (antigènes embryonnaires) : Melanoma Associated Antigen MAA : Mage-1, Mage-2, Mage-3, Bage, Gage-1, Gage-2, Muc-1, Rage-1, NA-17. En revanche, ces antigènes sont généralement présents en petites quantités, ce qui en limite l'action activatrice. Ces broyats tumoraux, injectés au malade en sous-cutané ou intradermique, proviennent soit du malade lui-même (système autologue), soit d'une lignée tumorale allogénique. L'action stimulatrice du broyat tumoral sur les cellules lymphocytaires T peut être intensifiée en ajoutant à ce dernier un adjuvant immunitaire. Ainsi, en tant qu'adjuvants, ont été proposés le BCG, Detox, le QS-21, et le MF-59. La deuxième génération est celle des vaccins antigènes spécifiques, qui reposent sur le principe de l'injection d'un seul antigène de tumeur au malade. Ils induisent de ce fait une importante activation lymphocytaire T cytotoxique. En revanche, leur utilisation est soumise à deux conditions . d'une part, une restriction HLA (HLA-Al pour Mage, HLA-A2 pour NA-17, Melan-A) ; d'autre part, l'expression par la tumeur ou la métastase, de l'antigène correspondant au peptide que l'on veut injecter.

Il faut donc que la lésion soit accessible à une biopsie qui permet d'identifier par PCR la présence ou non de l'antigène. Ceci bien sûr limite les possibilités de faire bénéficier un malade d'un vaccin. Jusqu'à ce jour, les protocoles cliniques ont essentiellement été réalisés avec les peptides Mage-3, Mage-1, Melan-A/Mart-1, NA-17, tyrosinase et NY-SO1.

La troisième génération de vaccin est l'utilisation de cellules dendritiques dans un but de vaccination dans le mélanome, et repose sur le fait que ces cellules sont d'excellentes cellules présentatrices d'antigènes. Elles sont capables d'internaliser des antigènes et de les présenter aux lymphocytes T dans un contexte HLA de classe II pour les lymphocytes CD4+ et HLA de classe I pour les lymphocytes cytotoxiques. Cette activation du lymphocyte T fait par ailleurs intervenir des molécules co-stimulatrices CD40-CD40L et B7-CD28. Le principe de la mise au point du traitement repose sur la culture in vitro de cellules CD34+ ou de monocytes isolés à partir du sang du malade (cytaphérèse) en présence de cytokines comme le GM-CSF (Granulocyte- Macrophage Colony-Stimulating Factor et l'IL-13 (Interleukine-13). Les cellules dendritiques différenciées obtenues sont ensuite chargées in vitro avec un ou plusieurs peptides. Ces cellules dendritiques, dites chargées, deviennent alors d'excellentes cellules activatrices des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du peptide lorsqu'elles sont réinjectées au malade, en intradermique, sous-cutané et intra-ganglionnaire.

La quatrième génération de vaccin est celle des cellules tumorales modifiées. La cellule tumorale mélanique contourne le système immunitaire en produisant des cytokines immunosuppressives, en masquant ses antigènes de tumeur, en n'exprimant pas les molécules de coactivation ou les antigènes de classe I ou II. La réponse cytotoxique T se trouve de ce fait inhibée. Le principe du vaccin par cellule tumorale consiste à injecter au malade en sous-cutané ou intradermique des cellules tumorales autologues irradiées dont le profil phénotypique a été modifié pour la rendre accessible aux lymphocytes T cytotoxiques. C'est ainsi que les cellules tumorales peuvent être transfectées par : soit des cytokines IL-7, IL-2 et IL-12 ; soit le GM- CSF qui active les macrophages ; soit des antigènes de classe I, II, l'antigène BL7 permettant ainsi la reconnaissance des antigènes de tumeur par la cellule cytotoxique.

Les études cliniques (phases I-II) réalisées avec ces différents vaccins de première et deuxième génération, au stade métastatique, portent sur un nombre limité de patients avec actuellement un taux de réponse moyen de l'ordre de 20 %. Ces réponses sont surtout obtenues sur des sites cutanés, ganglionnaires pulmonaires et hépatiques. Fait intéressant et spécifique à la vaccination, des durées de réponse prolongée (supérieures à 2 ans) ont été notées. Un point important est le délai de la réponse clinique. En effet, contrairement aux chimiothérapies, la régression clinique n'apparaît le plus souvent qu'après une phase de stabilisation pouvant durer 3 à 4 mois, voire plus. La tolérance est en général bonne. Les effets secondaires notés étant essentiellement un érythème au site d'injection, des réactions auto-immunes de type vitiligo.

Toutefois, le faible taux de réponse moyen des thérapies actuelles implique un besoin important pour de nouveaux outils permettant d'élargir la gamme de traitement des mélanomes malins.

C'est dans le but de répondre à ce problème technique que la Demanderesse a mis au point un anticorps monoclonal, fragment d'anticorps monoclonal ou dérivé d'anticorps monoclonal, dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, ou par des séquences d'acide nucléique présentant une homologie suffisante avec les séquences SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7 pour que la nature et l'affinité de la liaison dudit anticorps à son antigène ne soient pas modifiées, et dont les régions constantes de ses chaînes légères et de ses chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

Les anticorps sont constitués de chaînes lourdes et de chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région (ou domaine) variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour les chaînes légères et V-D-J pour les chaînes lourdes) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères ou de plusieurs domaines pour les chaînes lourdes. Les deux chaînes lourdes (H, Heavy) et les deux chaînes légères (L, Light) sont identiques entre elles. La chaîne légère est composée de 2 domaines, un domaine variable V et un domaine constant C, repliés indépendamment l'un de l'autre dans l'espace. On les appelle VL et CL. La chaîne lourde comporte également un domaine V noté VH et 3 ou 4 domaines C noté de CH1 à CH4. Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure également. La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, alors que les parties constantes peuvent interagir avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des molécules comme le complément pour médier différentes propriétés fonctionnelles. Aux fins de l'invention, les expressions anticorps monoclonal ou composition d'anticorps monoclonal se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique. En outre, dans l'ensemble de la description, des revendications et des figures de la présente demande, on entend par anticorps monoclonal , un anticorps monoclonal complet, un fragment ou un dérivé d'un tel anticorps. De plus, on entend par séquences d'acide nucléique présentant une homologie suffisante avec les séquences SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7 pour que la nature et l'affinité de la liaison de l'anticorps à son antigène ne soit pas modifiée toute séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide, peptide ou protéine, comprenant au moins un domaine ou fragment d'immunoglobuline, ainsi que tout dérivé d'anticorps présentant une homologie suffisante avec les séquences SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7 pour que la nature et l'affinité de la liaison de l'anticorps à son antigène ne soient pas modifiées. A ce titre, on entend par domaine d'immunoglobuline l'un quelconque des domaines VL, CL, VH, CHI, CH2, CH3, CH4. L'anticorps selon l'invention pouvant avantageusement contenir un ou plusieurs de ces domaines, toutes les combinaisons entre les domaines précédemment cités font partie de l'invention. On entend par fragment d'immunoglobuline un des fragments choisis parmi le fragment Fab, Fab', F(ab')2, Fc, un scFv ou un CDR (Complemantarity Determining Region). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle fragment Fab (Fragment Antigen Binding), et un fragment Fc (fragment cristallisable). Le fragment Fc est le support des fonctions effectrices des immunoglobulines. Par digestion à la pepsine, un fragment F(ab')2 est généré, où les deux fragments Fab restent liés par deux ponts disulfure, et le fragment Fc est scindé en plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de deux fragments Fab', liés par des ponts disulfure intercaténaires pour former un F(ab')2. Quant aux régions variables des chaînes lourdes et légères, on constate que la variabilité de séquence n'est pas distribuée de manière égale. En effet, les régions variables sont constituées d'une part de régions très peu variables nommées charpente ou framework (FR) au nombre de 4 (FR 1 à FR4) et d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité est extrême : il s'agit des régions hypervariables , ou CDR, au nombre de 3 (CDR1 à CDR3). Ainsi, l'anticorps selon l'invention pouvant avantageusement contenir un ou plusieurs de ces fragments, toutes les combinaisons entre les fragments précédemment cités font partie de l'invention. Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon l'invention contient au moins un domaine d'immunoglobuline et au moins un fragment d'immunoglobuline, par exemple un fragment Fc et une ou plusieurs régions variables ou hypervariables. Enfin, on entend par dérivé d'anticorps tout anticorps, cet anticorps pouvant comprendre une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés.

Un tel ajout, substitution ou délétion peut être localisé à n'importe quelle position dans la molécule. Dans le cas où plusieurs acides aminés ont été ajoutés, substitués ou délétés, toute combinaison d'ajout, de substitution ou de délétion peut être considérée, à condition que l'anticorps résultant présente toujours au moins les propriétés avantageuses de l'anticorps de l'invention. L'anticorps selon l'invention, dont les régions variables des chaînes légères et lourdes, ou au moins un domaine ou fragment de ces régions, appartiennent à une espèce différente des régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes, est qualifié d'anticorps chimérique . Les séquences d'acide nucléique murines SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7 codent pour le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes respectivement de l'anticorps produit par l'hybridome murin C7, disponible à l'ATCC (Ame:rican Type Culture Collection) sous le numéro CRL-1691. Cet hybridome produit un anticorps monoclonal murin d'isotype IgG2b dirigé contre le LDL-R. Le récepteur humain des LDL (LDL-R) est une protéine transmembranaire de 839 acides aminés qui comprend trois régions : la région extra-cellulaire (1-768), la région transmembranaire (768-790) et la région cytoplasmique (790-839). La région extracellulaire est divisée en deux sous-régions : celle de liaison des LDL (1-322) et la sous-région en dehors de la zone de liaison des LDL (323-768). Les séquences murines de l'anticorps de l'invention ont été choisies pour coder les régions variables de l'anticorps selon l'invention, ou au moins un domaine ou fragment de ces régions, en raison de la spécificité de l'anticorps murin C7 pour l'antigène LDL-R. L'anticorps C7 a été généré par immunisation avec le domaine extracellulaire du LDL-R bovin. Il se fixe, en dehors du LDL-R bovin, au LDL-R humain mais il ne cross-réagit pas avec les LDL-R du rat, de la souris, du hamster chinois, du lapin et du chien (Beisiegel et al. 1981 J. Biol. Chem. 256, 11923-11931). Cette propriété est avantageuse car les lignées de production d'anticorps monoclonaux sont très souvent des lignées provenant de ces espèces. Ainsi, l'anticorps recombinant peut être avantageusement produit dans une lignée cellulaire provenant des lignées YB2/0, NSO, Sp2/0, CHO, cette liste n'étant pas limitative. L'anticorps de l'invention s'entend aussi des anticorps possédant des régions CDR dont la séquence peptidique est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28. Ces séquences sont les séquences des régions CDR provenant de l'anticorps murin C7, la séquence SEQ ID NO : 6 représentant la séquence du CDR1 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, la séquence SEQ ID NO : 8 représentant la séquence du CDR2 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, la séquence SEQ ID NO : 9 représentant la séquence du CDR3 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, la séquence SEQ ID NO : 15 représentant la séquence du CDR1 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation IMGT, la séquence SEQ ID NO : 16 représentant la séquence du CDR2 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation IMGT, la séquence SEQ ID NO : 17 représentant la séquence du CDR3 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation IMGT, la séquence SEQ ID NO : 22 représentant la séquence du CDR1 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, la séquence SEQ ID NO : 24 représentant la séquence du CDR2 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, la séquence SEQ ID NO : 25 représentant la séquence du CDR3 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, la séquence SEQ ID NO : 26 représentant la séquence du CDR1 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation IMGT, la séquence SEQ ID NO : 27 représentant la séquence du CDR2 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation IMGT, la séquence SEQ ID NO : 28 représentant la séquence du CDR3 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation IMGT. L'invention s'entend aussi des anticorps dont le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes possèdent au moins 70% d'homologie, ou avantageusement au moins 80%, ou encore 90% ou 99% , avec les séquences SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7 respectivement, les modifications de séquence ne modifiant pas la spécificité de l'anticorps. De préférence, ces modifications de séquences ne diminuent pas son affinité pour sa cible. L'anticorps selon l'invention possède en outre des régions constantes de ses chaînes légères et lourdes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. Les anticorps selon l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps chimériques décrites par exemple dans Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, pp. 6851-55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. De tels anticorps et leur mode de préparation ont également été décrits dans la demande de brevet EP 173 494, dans le document Neuberger, M.S. et al., Nature 312(5995):604-8 (1985), ainsi que dans le document EP 125 023 par exemple. Des méthodes pour générer des anticorps chimériques sont largement disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les chaînes lourdes et légères de l'anticorps peuvent être exprimées séparément en utilisant un vecteur pour chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul vecteur.

Un vecteur d'expression est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique, de préférence humaine, codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélome humain Namalwa, PER.C6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHOLecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. Pour la construction de vecteurs d'expression des anticorps chimériques selon l'invention, des séquences signal synthétiques et des sites de restriction appropriés peuvent être fusionnés aux régions variables au cours des réactions d'amplification par PCR. Les régions variables sont ensuite combinées avec les régions constantes d'un anticorps, de manière préférentielle une IgGi humaine. Les gènes ainsi construits sont clonés pour les placer sous le contrôle d'un promoteur, par exemple le promoteur RSV (Rous Sarcoma Virus), CMV (cytomegalovirus), MLP (Major Late Promoter), cette liste n'étant pas limitative, et en amont d'un site de polyadénylation, en utilisant deux vecteurs séparés (un pour chaque chaîne). Les vecteurs sont également munis de gènes de sélection connus de l'homme du métier, tels que par exemple le gène dhfr (dihydrofolate reductase) ou le gène de résistance à la néomycine. Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent être produits par co-transfection dans une cellule hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du vecteur d'expression de la chaîne lourde en utilisant une méthode bien connue de l'homme du métier (par exemple la co-précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la micro-injection, etc.). A l'issue de la transfection, les cellules peuvent être mises en milieu sélectif, par exemple en milieu RPMI (Invitrogen, ref 21875-034) contenant 5% de sérum dialysé (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 g/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131-027) et 25 nM de methotrexate (Sigma, réf. M8407). Les surnageants des puits de transfection résistants sont criblés pour la présence d'immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines ou d'une autre espèce si la partie constante provient d'une autre espèce. Les transfectants produisant le plus d'anticorps sont amplifiés et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules / plaque).

Un mode de réalisation particulier sera illustré plus loin.

Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 10 et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 11. La séquence peptidique SEQ ID NO : 10 est la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 et la séquence peptidique SEQ ID NO : 11 est la séquence déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7.

De manière préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique ou prophylactique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(l), Km(l, 2), Km(l, 2, 3) ou Km(3). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type À.

Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type yl, de type y2, de type y3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type y4. tes anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG), sont des hétérodimères constitués de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CHI, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables VH et VL et des domaines constantes CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcyR, le récepteur Fc néonatal (FcRn) et le Clq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires C1'2 et C-y3, est glycosylée au niveau du domaine C1'2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné, lié à l'Asn 297.

De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type yl, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) chez le plus grand nombre d'individus (humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Glm(3), Glm (1, 2, 17), Glm(l, 17) ou Glm(1,3). Dans un aspect particulier de l'invention, la région constante de chacune

des chaînes lourdes de l'anticorps est de type yl, et elle est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23, la région constante de chacune de ses chaînes légères étant codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21, ou une séquence homologue à la séquence SEQ ID NO : 23 ou SEQ ID NO : 21, ou un fragment desdites séquences. Ainsi, un tel anticorps possède une région variable murine et une région constante humaine, avec des chaînes lourdes de type Id. Cet anticorps appartient donc à la sous-classe des IgGl. Cet anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 21, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 et la région constante est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23.

De manière préférentielle, chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19. La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps. La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps. Dans un tel aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13, et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 13, est la séquence SEQ ID NO : 14 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 19, est la séquence SEQ ID NO : 20. L'invention s'entend aussi des anticorps dont chacune des chaînes légères codées par une séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine possède au moins 70% d'homologie avec la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 et chacune des chaînes lourdes codées par une séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine possède au moins 70% d'homologie, ou avantageusement au moins 80%, ou encore 90% ou 99%, avec la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19, ces modifications n'altérant ni la spécificité de l'anticorps ni ses activités effectrices.

De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention est couplé à une toxine. La toxine est, par exemple, la toxine diphtérique ou la ricine, cette liste n'étant pas limitative. La liaison entre l'anticorps selon l'invention et la toxine est suffisamment forte pour éviter la libération systémique de la toxine et aussi suffisamment labile, afin que la toxine soit libérée dans les cellules cibles. Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps est couplé à un radio-isotope. La présence du radio- isotope accroît considérablement la cytotoxicité. Deux isotopes sont essentiellement utilisés : l'iode 131 (émetteur bêta et gamma), dont la demi-vie est relativement longue (8 jours) et qui exerce un effet tumoricide sur environ 1 mm autour de la cellule tumorale ayant fixé l'anticorps selon l'invention. L'iode 131 présente l'avantage de rendre possible la réalisation d'une imagerie, mais nécessite le respect des mesures de radio-protection. L'yttrium 90 (émetteur bêta), dont la demi-vie est plus brève (2,5 jours), exerce des effets tumoricides sur une distance de 5 mm.

De manière avantageuse, l'anticorps de l'invention est produit dans une lignée cellulaire d'hybridome de rat. La lignée productrice de l'anticorps selon l'invention est une caractéristique importante puisqu'elle confère à l'anticorps certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des anticorps est à l'origine des modifications post-traductionnelles, notamment des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des anticorps ayant pourtant des séquences primaires identiques.

Dans un certain mode de réalisation, l'anticorps est produit dans la lignée de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.Gll.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662).

Un anticorps préféré selon l'invention est l'anticorps EMAB604 produit par l'hybridome R604 (déposé le 14 Novembre 2006 sous le numéro I-3692 à la CNCM - Institut Pasteur, 25 rue du Professeur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France). La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome R604 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome R604 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 7.

Un objet particulier de l'invention concerne un anticorps monoclonal se liant au LDL-R et permettant le recrutement de cellules effectrices. De préférence, cet anticorps est le EMAB604, ou tout anticorps chimérique, humanisé ou humain possédant des caractéristiques fonctionnelles identiques à l'anticorps EMAB604. Avantageusement, cet anticorps est produit par la lignée cellulaire R604.

Un autre objet de l'invention se rapporte au vecteur d'expression de la chaîne légère d'un anticorps selon l'invention, de séquence SEQ ID NO : 12. Ce vecteur est le vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne légère est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 13, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 14. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 21 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. De plus, toute cellule de mammifère peut être utilisée comme cellule hôte, c'est-à-dire comme cellule exprimant l'anticorps selon l'invention, par exemple YB2/0, CHO, CHO dhfr- (par exemple CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lecl3, SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS.

Un autre objet de l'invention se rapporte au vecteur d'expression de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'invention, de séquence SEQ ID NO : 18. Ce vecteur est le vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne lourde est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 19, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 20. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Tout comme indiqué précédemment, le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute cellule de mammifère, par exemple YB2/0, CHO, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lecl3, SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS. Un anticorps produit par co-expression de ces vecteurs dans la cellule YB2/0 est illustré par l'anticorps anti-LDL-R EMAB604, produit par le clone R604 (déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I- 3692 à la CNCM). Cet anticorps possède une forte activité cytotoxique, relevée dans un test ADCC. De plus, l'anticorps EMAB604 induit la sécrétion d'IL-2 par la lignée cellulaire Jurkat-CD16, ce test étant utilisé pour démontrer la capacité d'activation du récepteur CD16 par les anticorps. L'anticorps EMAB604, pouvant être produit par culture du clone R604 dans un milieu de culture et à des conditions permettant l'expression des vecteurs précédemment décrits, est donc un outil des plus intéressants susceptibles de faire progresser la thérapie et le diagnostic des mélanomes.

Un autre objet de l'invention se rapporte à une lignée cellulaire stable produisant un anticorps selon l'invention tel que décrit précédemment.

De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable selon l'invention, qui est caractérisée en ce que la lignée cellulaire dans laquelle l'anticorps est exprimé, est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662), SP2/0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-Lecl0, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.

La lignée cellulaire stable de l'invention a intégré les deux vecteurs d'expression précédemment décrits.

Un autre objet de l'invention se rapporte à l'hybridome R604 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3692 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15).

De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet le recrutement de cellules immunitaires effectrices. Un tel anticorps, de par sa bonne spécificité et sa bonne affinité, est un outil pouvant servir à médier des réactions d'ADCC (Antibody Dependent Cellular-mediated Cytotoxicity). En effet, l'anticorps selon l'invention présente une bonne affinité pour le LDL-R et permet d'autre part le recrutement de cellules immunitaires effectrices. Aux fins de l'invention, on entend par cellule immunitaire effectrice une cellule qui provoque la destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps selon l'invention est lié ( cellules cibles ).

L'anticorps anti-LDL-R EMAB604 a la capacité d'interagir fortement avec le récepteur Fcgamma RIIIa ou CD16 exprimé par les cellules NK. Cette fixation est au moins trois fois supérieure à celle de l'anticorps anti-CD20 Rituxan et comparable à celle l'anticorps anti-CD20 produit par la plateforme EMABLing du LFB. Cette forte fixation au récepteur CD16 permet d'envisager des capacités cytotoxiques optimisées pour l'anticorps anti-LDL-R EMAB604.

Ainsi il a été montré que cet anticorps induisait une lyse cellulaire par ADCC (Antibody-Dependent Cellmediated Cytotoxicity) des cellules HT144 (mélanome) et GUY 17.2 dépendante de l'interaction de sa partie Fc avec le récepteur de faible affinité CD16 exprimé sur les cellules NK (Natural Killer). En effet, cette ADCC est inhibée en présence d'un anticorps anti-CD16 (clone 3G8). Il est à noter que le CD16 est également exprimé par les macrophages et dans une sous population de monocytes ce qui permet d'envisager l'action de l'anticorps anti-LDL-R EMAB604 par induction d'une cytotoxicité cellulaire via des cellules de la lignée monocytaire.

De plus, cette forte fixation de l'anticorps anti-LDL-R EMAB604 au récepteur CD16 lui confère en présence de cellules HT144, la capacité d'induire la sécrétion d'interleukine-2 (IL-2) par la lignée Jurkat transfectée avec le CD16 (Jurkat-CD16). En effet, l'engagement de la partie Fc de l'anticorps fixé sur sa cible (HT144) induit un signal d'activation qui se traduit par la sécrétion d'IL-2 par Jurkat-CD16.

L'anticorps C7 a été obtenu par immunisation de souris avec le LDL-R bovin partiellement purifié. Il a été montré qu'il est un bon compétiteur des LDL, et présente donc une affinité pour le LDL-R comparable à celle du ligand naturel des LDL-R.

Ces anticorps se lient à la cellule-cible par leur fragment variable et se lient aux cellules effectrices par leur fragment constant. Cette relation dépendante des anticorps entre les cellules cibles et les cellules effectrices provoque la lyse des cellules cibles par un mécanisme de type ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity). De manière avantageuse, les cellules cibles selon l'invention sont des cellules tumorales, telles que les sarcomes, les myélomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies, cette liste n'étant pas limitative. En effet, des études ont montré une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. Il s'avère que des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie.

Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux (Henricksson et al., 1989). On peut citer notamment le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies. Par conséquent, les cellules cancéreuses sur- exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention. Ainsi il a été montré 10 que l'anticorps anti-LDL-R EMAB604 se fixait sur les lignées de mélanomes HT:144 et GUY 17.2.

Ainsi, l'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL 15 (Low Density Lipoprotein), capable d'induire une lyse spécifique des mélanomes.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon :L'invention, pour activer in 20 vitro, ex vivo ou in vivo, les récepteurs FcyRIII de cellules immunitaires effectrices ou provoquer la sécrétion de cytokines ou chimiokines par des cellules effectrices. En effet, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour leur capacité à activer par 25 leur région Fc le récepteur FcyRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface de cellules appelées cellules effectrices : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule 30 effectrice provoque l'activation du FcyRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer), des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CD8, les lymphocytes Ty6, les cellules NKT, 35 les éosinophiles, les basophiles ou les mastocytes.

Un autre objet particulier de l'invention est un anticorps tel que décrit précédemment pour son utilisation comme médicament. Dans un aspect particulier de l'invention, 5 l'anticorps utilisé se lie au récepteur humain des LDL, et permet le recrutement de cellules effectrices.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur 10 humain des LDL pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, tel que le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies. En effet, l'anticorps selon l'invention 15 cible le LDL-R de manière spécifique. A cet égard, l'anticorps selon l'invention, en se liant à ce récepteur, va engendrer une réaction de lyse des cellules cibles cancéreuses, notamment par ADCC contre les cellules cibles cancéreuses et permettre la lyse 20 de ces dernières. Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.

25 De manière avantageuse, les cancers traités au moyen de l'anticorps selon l'invention sont les cancers pour lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la surface des cellules cancéreuses, et ce par rapport aux cellules saines correspondantes. 30 De manière particulièrement avantageuse, le cancer traité est le mélanome. Ainsi, l'invention se rapporte également à l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre 35 le récepteur humain des LDL, ou d'un anticorps tel que défini ci-avant, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du mélanome. Les cellules cibles, cancéreuses, pourront être lysées par les cellules effectrices recrutées lors de la réaction d'ADCC, les cellules saines exprimant peu ou pas de LDL-R ou étant, le cas échéant, préalablement traitées pour induire l'internalisation du LDL-R de façon à ne pas être reconnues pair l'anticorps et être ainsi préservées.

Les mélanomes malins traités peuvent être les mélanome superficiels extensifs, qui ont l'aspect d'une tache polychrome dont les contours et la surface sont irréguliers, et qui correspondent à la phase de développement horizontal du mélanome malin, et les mélanomes nodulaires caractérisés cliniquement par une tumeur mélanique saillante et histologiquement par une prolifération bien circonscrite qui envahit d'emblée le derme. Avantageusement, l'anticorps de l'invention est capable d'induire une lyse spécifique de mélanomes issus des lignées HT144 (HTB-63) (HLA Al, Aw24, B13, B15, Cw3, DRw4, DRw7) et GUY-17.2, dépendante du CD16.

Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un anticorps de l'invention en combinaison avec un ou plusieurs autre anticorps dirigés contre un ou plusieurs autres antigènes exprimés sur les cellules de mélanome. De tels antigènes peuvent être exprimés sur les cellules lymphoïdes et sont choisis parmi le HLA-DR, le CD20, le CD22, CD23, CD25, CD30, CD33 et le CD40. Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un anticorps de l'invention en combinaison avec un ou plusieurs autres médicaments couramment utilisés pour le traitement des cancers tels que les médicaments cytotoxiques et cytostatiques (chimiothérapie). Ces médicaments sont bien connus de l'homme du métier, parmi lesquels on peut citer, pour les agents cytotoxiques, les agents alkylants et moutardes azotées, les dérivés du platine, les agents intercalant, les antimétabolites, les inhibiteurs de Topoisomérases, les poisons du fuseau, et, pour les agents cytostatiques, les inhibiteurs de récepteurs à la tyrosine kinase, notamment les récepteurs à EGF (endothelial growth factor), les récepteurs à insuline, les récepteurs à PDGF (Platelet-derived growth factor), les récepteurs à FGF (fibroblast growth factor) et les récepteurs à VEGF (vascular endothelial growth factor), cette liste n'étant pas limitative.

Dans un aspect particulier de l'invention, l'utilisation des anticorps de l'invention s'effectue en association, in vitro, ex vivo ou in vivo, avec des cellules exprimant des FcyR, telles que les cellules NK (Natural Killer), les cellules NKT (Natural Killer T), les lymphocytes Tyô, les macrophages, les monocytes, toute cellule génétiquement modifiée pour exprimer le CD16, ou les cellules dendritiques.

Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un anticorps selon l'invention tel que décrit ci-dessus et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables. Cette composition pharmaceutique a pour vocation de cibler les cellules cancéreuses, notamment celles surexprimant le LDL-R. Ces cellules cancéreuses exprimant à leur surface une quantité de récepteurs au LDL supérieure à la quantité de récepteurs exprimés par les cellules saines, le médicament ainsi préparé sera préférentiellement lié par les cellules cancéreuses.

L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée, etc., ainsi que toute suspension, gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants, conservateurs, etc. Avantageusement, la composition de l'invention comprend en outre au moins un anticorps dirigé contre un autre antigène présent sur les cellules cibles des anticorps.

Avantageusement, la composition de l'invention comprend en outre un anticorps anti-HLA-DR. En effet, les lignées de mélanomes HT144 et GUY 17.2 expriment l'antigène HLA-DR à leur surface. Une composition comprenant un mélange d'anticorps anti-LDL-R et anti-HLA DR dans des proportions pouvant représenter 5, 25, 50, 75 ou 95% de l'un ou de l'autre anticorps par rapport au poids total de la composition est particulièrement avantageuse pour le traitement de patients atteints de mélanomes.

Par ailleurs, les compositions peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. L'administration peut être réalisée par toute voie classique pour ce type d'approche thérapeutique, notamment par voie systémique, en particulier par injection intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous- cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intraartérielle, etc. On peut citer par exemple l'injection intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant la tumeur. L'administration peut également être orale, mucosale ou topique.

Les doses peuvent varier en fonction du nombre d'administrations, de l'association à d'autres principes actifs, du stade d'évolution de la pathologie, etc.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les analyses en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo, ex vivo ou in vitro.

D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas la portée de l'invention.

Figures

Figure 1 : Activité ADCC des anticorps anti-LDL-R (EMAB604) et anti-HLA-DR CHO sur la lignée de mélanome GUY 17.2. Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse (moyenne +/-SEM, n=2) en fonction de la concentration d'anticorps.

Figure 2 : Inhibition de l'activité ADCC induite par 10 pg/ml des anticorps anti-LDL-R (EMAB604) et anti- HLA-DR-CHO sur la lignée de mélanome GUY-17.2 par l'anticorps anti-CD16 murin 3G8 (250 gg/ml).

Figure 3 : Activité ADCC des anticorps anti-LDL-R (EMAB604) et anti-HLA-DR CHO sur la lignée de mélanome HT-144. Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse (moyenne +/-SEM, n=2) en fonction de la concentration d'anticorps.

Figure 4 : Inhibition de l'activité ADCC induite par 10 pg/ml des anticorps anti-LDL-R (EMAB604) et anti-HLA-DR-CHO sur la lignée de mélanome HT-144 par l'anticorps anti-CD16 murin 3G8 (250 g/ml).

Figure 5 : Sécrétion d'IL-2 par la cellule Jurkat-CD16 induite par les anticorps anti-LDL-R (EMAB604) et anti-HLA-DR CHO en présence de la lignée de mélanome GUY 17.2. Figure 6 : Sécrétion d'IL-2 par la cellule Jurkat-CD16 induite par les anticorps anti-LDL-R (EMAB604) et anti-HLA-DR CHO en présence de la lignée de mélanome HT-144. Figure 7 : Pourcentage de fixation des anticorps anti-LDL-R (EMAB604), anti-CD20 produit dans YB2/0 et Rituxan sur le récepteur CD16 exprimé par les cellules NK. Les résultats sont exprimés pour une concentration de 10 et 50 gg/ml d'anticorps.

Figure 8 : Séquences : SEQ ID NO : 5 : séquence d'acide nucléique murine 20 codant pour la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps, SEQ ID NO : 6 : séquence du CDR1 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, SEQ ID NO : 7 : séquence d'acide nucléique murine 25 codant pour la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps, SEQ ID NO : 8 : séquence du CDR2 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, SEQ ID NO : 9 : séquence du CDR3 de la chaîne légère 30 de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, SEQ ID NO : 10 : séquence peptidique de la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps, SEQ ID NO : 11 : séquence peptidique de la région 35 variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps, SEQ ID NO : 12 : séquence d'acide nucléique correspondant au vecteur d'expression de la chaîne légère de l'anticorps, SEQ ID NO : 13 : séquence d'acide nucléique chimère 5 murine-humaine codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps, SEQ ID NO : 14 : séquence peptidique de chacune des chaînes légères de l'anticorps déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 13, 10 SEQ ID NO : 15 : séquence du CDR1 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation IMGT, SEQ ID NO : 16 : séquence du CDR2 de la chaîne légère de l'anticorps selon la numérotation IMGT, SEQ ID NO : 17 : séquence du CDR3 de la chaîne légère 15 de l'anticorps selon la numérotation IMGT, SEQ ID NO : 18 : séquence d'acide nucléique correspondant au vecteur d'expression de la chaîne lourde de l'anticorps selon l'invention, SED ID NO : 19 : séquence d'acide nucléique codant 20 pour la chaîne lourde de l'anticorps selon l'invention, SEQ ID NO : 20 : séquence peptidique de la chaîne lourde de l'anticorps déduite de la séquence SEQ ID NO : 19, 25 SEQ ID NO : 21 : séquence d'acide nucléique codant pour la région constante de chacune des chaîne légères de l'anticorps, SEQ ID NO : 22 : séquence du CDR1 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, 30 SEQ ID NO : 23 : séquence d'acide nucléique humaine codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps de type 'yl, SEQ ID NO : 24 : séquence du CDR2 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, 35 SEQ ID NO : 25 : séquence du CDR3 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation de Kabat, SEQ ID NO : 26 : séquence du CDR1 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation IMGT, SEQ ID NO : 27 : séquence du CDR2 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation IMGT, SEQ ID NO : 28 : du CDR3 de la chaîne lourde de l'anticorps selon la numérotation IMGT. SEQ ID NO : 31 : séquence peptidique de la région constante de chacune des chaîne légères de l'anticorps, déduite de SEQ ID NO : 21, et SEQ ID NO : 34 : séquence peptidique de la région constante de chacune des chaîne lourdes de l'anticorps déduite de SEQ ID NO : 23.

Exemples Exemple 1 : Construction des vecteurs d'expression de l'anticorps chimérique anti-LDL-R C7

A. Détermination de la séquence leader des régions 20 variables de l'anticorps murin C7 L'ARN total de l'hybridome murin C7 produisant uneimmunoglobuline de type IgG2b,K a été extrait (kit Nucleospin RNA Macherey-Nagel ref. 740609.250). Après transcription inverse, les domaines variables des 25 chaînes légères (VK) et lourdes (VH) de l'anticorps C7 ont été amplifiés par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit 5'RACE, Invitrogen ref. 18374.041). Brièvement, une première étape de transcription 30 inverse a été tout d'abord réalisée en utilisant une amorce localisée dans la région 5' des régions constantes CK ou y2b murines. Une séquence poly-dC a été ensuite ajoutée en 3' des ADNc synthétisés avant de réaliser l'amplification des régions VK et VH à 35 l'aide d'une amorce 5' reconnaissant la séquence poly- dC et d'une amorce 3', localisée dans les régions constantes CK ou y2b murines en 5' de l'amorce de15 transcription inverse. Les amorces utilisées pour ces deux étapes sont les suivantes :

1. amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' (SEQ ID NO : 1) b. Amorce antisens spécifique y2b murin 5'- GTGTAGAGTCCAGACTGCAGGAG -3' (SEQ ID NO : 2) 10 2. amorces de PCR 5'RACE a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' (SEQ ID NO : 3) b. Amorce antisens spécifique y2b murin 15 5'- CACTGACTCAGGGAAGTAGCCCTTG -3' (SEQ ID NO : 4)

Les produits de PCR VH et VK ainsi obtenus ont été clonés dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO (Zero blunt 20 TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, réf. K2875-20) puis séquencés. La séquence nucléotidique de la région V de l'anticorps murin C7 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 5 et la séquence peptidique déduite est la 25 séquence SEQ ID NO : 10. Le gène VK appartient au sous-groupe VK1 [Almagro JC et al Immunogenetics (1998), 47 : 355-363]. Les séquences des CDR1, CDR2 et CDR3 de la région VK de l'anticorps murin C7, définies selon la numérotation de Kabat [Kabat et al., 30 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)], sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 9, respectivement. Les séquences des CDR1- IMGT, CDR2-IMGT et CDR3-IMGT de la région V de 35 l'anticorps murin C7, définies selon l'analyse IMGT (international ImMunoGeneTics database) [Lefranc, M.- P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17, respectivement. Cette définition, différente de celle de Kabat fondée sur la seule analyse de variabilité des séquences, prend en compte et combine la caractérisation des boucles hypervariables [Chothia C. and Lesk A.M. J. Mol. Biol. 196 : 901-17 (1987)] et l'analyse structurale des anticorps par cristallographie.

La séquence nucléotidique de la région VH de C7 est la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique qui en est déduite est la séquence SEQ ID NO : 11. Le gène VH appartient au sous-groupe VH1 [Honjo T. and Matsuda F. in Immunoglobulin genes .

Honjo T. and Alt F.W. eds, Academic Press, London (1996), pp145-171]. Les séquences des CDR1, CDR2 et CDR3 de la région VH de l'anticorps murin C7, définies selon la numérotation de Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)], sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24 et SEQ ID NO : 25, respectivement. Les séquences des CDR1-IMGT, CDR2-IMGT et CDR3-IMGT de la région VH de l'anticorps murin C7, définies selon l'analyse IMGT (international ImMunoGeneTics database) [Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27 et SEQ ID NO : 28, respectivement. Cette définition, différente de celle de Kabat fondée sur la seule analyse de variabilité des séquences, prend en compte et combine la caractérisation des boucles hypervariables [Chothia C. and Lesk A.M. J. Mol. Biol. 196 : 901-17 (1987)] et l'analyse structurale des anticorps par cristallographie.35 B. Construction des vecteurs d'expression chaîne lourde et chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB604 1. Vecteur chaîne légère Kappa

La séquence VK clonée dans le vecteur de séquençage pCR4Blunt-TOPO a été amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes . a) amorce sens VK (SEQ ID NO : 29)

5'- ATCGAACTAGTGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCT -3'

15 La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence consensus de Kozak, l'ATG initiateur est en italiques.

20 b) amorce antisens VK (SEQ ID NO : 30) 5'-GATGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCT -3'

Cette amorce réalise la jonction des séquences VK 25 murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III.

Le produit de PCR VK ainsi obtenu contient la 30 séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin C7. Cette PCR VK a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Dra III du vecteur de chimérisation chaîne légère en 5' de la région constante CK humaine, dont la séquence nucléique est 35 la séquence SEQ ID NO : 21 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 31. La séquence CK humaine de ce vecteur de chimérisation a été10 préalablement modifiée par mutagénèse silencieuse afin de créer un site de restriction Dra III pour permettre le clonage de séquences VK murines. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection dhfr (dihydrofolate reductase). La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB604 codée par ce vecteur est présenté en SEQ ID NO : 13 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 14.

2. Vecteur chaîne lourde Une démarche similaire a été appliquée pour la chimérisation de la chaîne lourde de l'anticorps EMAB604. La séquence VH clonée dans le vecteur pCR4Blunt-20 TOPO a été tout d'abord amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes :

a) amorce sens VH (SEQ ID NO : 32) 25 5'-ATCGAGCTAGCGCCGCCACCATGGAATGGCCTTGTATCTT -3'

La séquence soulignée correspond au site de restriction Nhe I, la séquence en gras correspond à une séquence consensus de Kozak, l'ATG initiateur est 30 en italiques.

b) amorce antisens VH (SEQ ID NO : 33) 5'-ACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGT -3' 35 Cette amorce réalise la jonction des séquences VH murine (en italique) et région constante G1 humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Apa I.

Le fragment VH amplifié contient la séquence codant le peptide signal. naturel de l'anticorps murin C7. Ce produit d'amplification PCR VH a été ensuite cloné entre les sites Spe I et Apa I du vecteur de chimérisation contenant la chaîne lourde en 5' de la région constante yl humaine dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 23 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 34. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection neo.

La séquence de la chaîne lourde de l'anticorps chimérique EMAB604 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 19 pour la séquence nucléotidique et en séquence SEQ ID NO : 2C) pour la séquence peptidique déduite.

Exemple 2 : Création d'une lignée cellulaire dérivée de la lignée YB2/0 productrice de l'anticorps chimérique EMAB604 La lignée de rat YB2/0 (ATCC # CRL-1662) a été cultivée en milieu EMS (Invitrogen, réf. 041-95181M) contenant 5% de sérum de veau foetal (JRH Biosciences, réf. 12103-78P). Pour la transfection, 5 millions de cellules ont été éiectroporées (électroporateur Biorad, modèle 1652077) en milieu Electrobuffer (Cell Projects, réf. EB-110) avec 25 pg de vecteur chaîne légère K463-26-C7 linéarisés par Avi II, et 26,7 pg de vecteur chaîne lourde H-463-27-C7 linéarisés par Not 1. Les conditions d'électroporation appliquées étaient de 230 volts et 960 microfarads pour une cuvette de 0, 5 ml et de largeur 0,4cm. Le contenu de la cuvette d'électroporation a été ensuite réparti sur 5 plaques P96 avec une densité de 5000 cellules/puits. La mise en milieu sélectif RPMI (Invitrogen, réf 21875-034) contenant 5% de sérum dialysé (Invitrogen, réf. 10603-017) des cellules, 500 g/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131-027) et 25 nM de méthotrexate (Sigma, réf. M8407), a été réalisée 3 jours après la transfection. Les surnageants des puits de transfection résistants ont été criblés pour la présence d'immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines. Les 16 transfectants produisant le plus d'anticorps ont été amplifiés en plaques P24 et ont été évalués pour leur capacité de production (productivité et production maximale) et pour le taux de fucose des IgG produites. Le cloïde R604 CH10 (productivité : 8,lpcd, production maximale 38,5 g/ml, taux de fucose des IgG de 25,5-26,8%), dénommé ci-après R604 , a été sélectionné pour la production de l'anticorps chimérique EMAB604. La production de l'anticorps chimérique EMAB604 a été réalisée par expansion de la culture en milieu EMS contenant 5% de sérum déplété en Ig bovines (Invitrogen, réf. 16250-078) et 500 g/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131-027), obtenue par dilution à 2x10E5 cellules/ml en flacons de 25 cm2, 75 cm2 et 175 cm2 puis en flacon de type roller. Après avoir atteint le volume maximal (0,9 1), la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la viabilité cellulaire soit inférieure à 50%. Après production, l'anticorps chimérique EMAB604 a été purifié par chromatographie d'affinité sur protéine A et contrôlé par électrophorèse en gel de polyacrylamide.

Exemple 3 : Protocole de mise en oeuvre du test d'ADCC 5 Les cellules cibles (lignées HT-144 ou GUY 17.2) sont incubées avec différentes concentrations d'anticorps (0, 0.1, 1, 10 gg/ml) et les cellules effectrices (cellules NK) purifiées par un kit de 10 déplétion négative (NK Cell Isolation Kit, Myltenyi, Paris, France) à partir de sang périphérique de donneurs sains. Après 4 heures d'incubation, l'activité cytotoxique induite par les anticorps est mesurée par colorimétrie en dosant dans les 15 surnageants, l'activité de l'enzyme lactate déshydrogénase (LDH) libérée par les cellules lysées. Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction de la concentration d'anticorps. Les valeurs d'Emax (pourcentage de lyse 20 maximale), ainsi que les valeurs d'EC50 (quantité d'anticorps induisant 50% de la lyse maximale), sont calculées à l'aide du logiciel PRISM (Graphpad Software).

25 Exemple 4 : Activité ADCC des anticorps EMAB604 et anti-HLA-DR produits par la lignée CHO sur la lignée de mélanome GUY 17.2 (Fig. 1) .

L'anticorps EMAE604 induit une lyse spécifique de 30 la lignée GUY-17.2 supérieure à celle induite par un anticorps anti-HLA-DR produit dans CHO. Les valeurs de lyse maximales (Emax) sont de 19 et 15% pour les anticorps EMAB604 et anti-HLA-DR CHO. Les EC50 correspondantes (quantité d'anticorps requise 35 pour atteindre 50% de la lyse maximale) sont de 0,45 et 5,71 g/ml respectivement, montrant que l'activité de l'anticorps EMAB604 est environ 10 fois plus forte que celle de l'anticorps anti-HLA-DR produit dans CHO. EMAB604 anti-HLA- DR CHO Emax 19 15 EC50 ( g/ml) 0,45 5,71 Calcul des valeurs ADCC Emax (lyse maximale) et EC50 (concentration d'anticorps requise pour obtenir 50% du Emax) obtenus après modélisation (sigmoïde) de la courbe par le logiciel PR.ISM. L'activité ADCC est dépendante du CD16 puisqu'elle est inhibée pour tous les anticorps en presence de l'anticorps murin 3G8 (anti-CD16) (Fig.2).

Exemple 5 : Activité ADCC des anticorps EMAB604 et anti-HLA-DR produits par la lignée CHO sur la lignée 15 de mélanome HT-144 (Fig. 3)

L'anticorps EMAB604 de l'invention induit une lyse spécifique de la lignée de mélanome HT-144 supérieure à celle induite par un anticorps anti-HLA-20 DR produit dans CHO. Les valeurs de lyse maximales (Emax) sont de 18 et 17% pour les anticorps EMAB604 et anti-HLA-DR CHO. Les EC50 correspondantes sont de 0,45 et 1,45 pg/ml respectivement, montrant que l'activité de l'anticorps 25 EMAB604 est environ 8 fois plus forte que celle de l'anticorps anti-HLA-DR produit dans CHO. 30 EMAB604 ant: i -HLA-DR CHO Emax 18 17 EC50 ( g/ml) 0,45 1,45 Calcul des valeurs ADCC Emax (lyse maximale) et EC50 (concentration d'anticorps requise pour obtenir 50% du Emax) obtenus après modélisation (sigmoïde) de la courbe par le logiciel PRISM.

L'activité ADCC est dépendante du CD16 puisqu'elle est inhibée pour tous les anticorps en présence de l'anticorps murin 3G8 (anti-CD16) (Fig. 4).

Exemple 6 : Protocole de mise en oeuvre du test de sécrétion d'IL-2 (Fig. 5 et 6)

Ce test utilise une lignée Jurkat transfectée 15 avec le récepteur CD16 (FcgammaRIIIa) humain comme cellule effectrice (Jurkat-CD16). La technique est basée sur la mesure de la sécrétion d'interleukine 2 (IL-2) par la lignée Jurkat-CD16 induite par l'engagement du CD16 avec les anticorps testés fixés 20 sur les cellules cibles (lignées de mélanome HT-144 ou GUY 17.2). Pour cela, 25 ng/ml des anticorps testés sont ajoutées aux cellules cibles (1.5 x 105 cellules/ml) en présence des cellules Jurkat-CD16 (5 x 106 cellules /ml) et de 10 ng/ml de l'acétate de 25 phorbol myristate (PMA) pendant 18 heures à 37 C en 5% CO2. Les plaques de culture sont ensuite centrifugées et l'IL-2 libérée dans le surnageant de culture quantifiée par ELISA (Quantikine IL-2, R&D, Abingdon, UK). Le résultat final est exprimé en unité 30 d'absorbance (DO). 10 HT 144 R297 EMAB604 HLA-DR CHO 25 ng/ml 0 1,199 0,49 GUY 17.2 R297 EMAB604 HLA- DR CHO 25 ng/ml 0,007 1,353 0,281 Tableau de résultats correspondant aux figures 5 et 6.

Exemple 7 : Capacité des anticorps EMAB604 et anti-HLA-DR produits par la lignée CHO sur la lignée de mélanome GUY 17.2 à induire la sécrétion d'IL-2 par la lignée Jurkat-CD16 (Fig. 5).

L'anticorps EMAB604 induit une sécrétion d'IL-2 en présence de la lignée GUY 17.2 supérieure au même 10 anticorps produit dans CHO. Les valeurs de lyse maximales (Emax) sont de 1.35 et 0,28 unités DO pour les anticorps EMAB604 et anti-HLA-DR CHO. L'anticorps R297, anti-Rhésus D produit dans 15 YB2/0, sert de témoin négatif vis-à-vis des cellules GUY 17.2.

Exemple 8 : Capacité des anticorps EMAB604 et anti-HLA-DR produits par la lignée de mélanome HT-144 à 20 induire la sécrétion d'IL-2 par la lignée Jurkat-CD16 (Fig.6)

L'anticorps EMAB604 induit une sécrétion d'IL-2 en présence de la lignée HT-144 supérieure au même 25 anticorps produit dans CHO. Les valeurs de lyse maximales (Emax) sont de 1.2 et 0,49 unités DO pour les anticorps EMAB604 et anti-HLADR CHO. L'anticorps R297, anti-Rhésus D produit dans 30 YB2/0, sert de témoin négatif vis-à-vis des cellules HT-144.

Exemple 9 : Protocole du test de fixation au récepteur CD16

La fixation au récepteur CD16 est évaluée par un 5 test de compétition de l'anticorps murin anti-CD16 (3G8). Les cellules effectrices (cellules NK) sont purifiées par le kit de déplétion négative (NK Cell Isolation Kit, Myltenyi, Paris, France), à partir de 10 sang périphérique de donneurs sains. Puis, les cellules NK sont incubées avec des concentrations variables (0, 10 et 50 g/ml) d'anticorps à évaluer et l'anticorps anti-CD16 (3G8) couplé à un fluorochrome (3G8-PE) à concentration fixe. 15 Après lavage, la fixation du 3G8-PE sur le récepteur CD16 des cellules NK est évaluée par cytométrie en flux. Les résultats sont exprimés en pourcentage de fixation, 100% de fixation correspondant à l'inhibition totale de la fixation de 20 l'anticorps anti-CD16 (3G8) murin.

L'anticorps EMAB604 se fixe fortement sur le CD16 des cellules NK et cela d'une façon comparable à celle d'un anticorps anti-CD20 produit par la plateforme 25 EMABling (et décrit dans la demande de brevet WO 2006064121). Cette fixation (62%) est environ 3 fois supérieure à celle de Rituxan (18,5%), anticorps produit dans la lignée CHO, à la concentration de 50 g/ml (Fig. 7). 30

Claims (30)

Revendications

1. Anticorps monoclonal, fragment d'anticorps monoclonal ou dérivé d'anticorps monoclonal, dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), caractérisé en ce que la région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, ou par des séquences d'acide nucléique présentant une homologie suffisante avec les séquences SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7 pour que la nature et l'affinité de la liaison dudit anticorps à son antigène ne soient pas modifiées, et les régions constantes de ses chaînes légères et de ses chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.

2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que les régions constantes de chacune de ses chaînes légères et de chacune de ses chaînes lourdes sont des régions constantes humaines.

3. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes légères est de type K.

4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes lourdes est de type T.

5. Anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes lourdes est de type yl.

6. Anticorps selon la revendication 5, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes lourdes est de type yl et est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 23 et en ce que la région constante de chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 21.

7. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique SEQ ID NO : 13 et en ce que chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique SEQ ID NO : 19.

8. Anticorps selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence peptidique déduite de la séquence SEQ ID NO : 13 est la séquence SEQ ID NO : 14 et en ce que la séquence peptidique déduite de la séquence SEQ ID NO : 19 est la séquence SEQ ID NO : 20.

9. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat.

10. Anticorps selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.Gll.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662).

11. Anticorps selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'anticorps EMAB604 produit par le clone R604 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3692 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM).

12. Vecteur d'expression de la chaîne légère d'un anticorps tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 de séquence SEQ ID NO : 12.

13. Vecteur d'expression de la chaîne lourde d'un anticorps tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 de séquence SEQ ID NO : 18.

14. Lignée cellulaire stable exprimant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

15. Lignée cellulaire stable selon la revendication 14, caractérisée en ce que la lignée cellulaire dans laquelle l'anticorps est exprimé, est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.

16. Lignée cellulaire stable selon la revendication 14 ou 15, ayant intégré les deux vecteurs d'expression selon les revendications 12 et 13.

17. Clone R604 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3692 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM).

18. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 19 codant pour la chaîne lourde d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

19. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 13 codant pour la chaîne légère d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 11.

20. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour activer in vitro les récepteurs Fc'yRI II de cellules immunitaires effectrices ou provoquer la sécrétion de cytokines ou de chimiokines par des cellules effectrices.

21. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour son utilisation comme médicament.

22. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.

23. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'un mélanome.

24. Utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'un mélanome.

25. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 23 ou 24, en combinaison avec un ou plusieurs autre(s) anticorps dirigé(s) contre un ou plusieurs autre(s) antigène(s) exprimé(s) sur les cellules de mélanome.

26. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 25, caractérisée en ce que ledit antigène exprimé sur les cellules de mélanome est choisi parmi le HLA-DR, CD20, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33 et le CD40.

27. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, in vitro ou ex vivo, d'un anticorps tel que défini selon l'une quelconque de ces revendications, en association avec des cellules exprimant des FcyR, telles que les cellules NK (Natural Killer), les cellules NKT (Natural Killers T), les lymphocytes Tyy, les macrophages, les monocytes, toute cellule génétiquement modifiée pour exprimer le CD16 ou les cellules dendritiques.

28. Composition pharmaceutique comprenant au moins un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et au moins un excipient et/ou au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptables.

29. Composition selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un anticorps dirigé contre un autre antigène présent sur les cellules cibles desdits anticorps.

30. Composition selon l'une des revendications 28 et 29, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un anticorps anti- HLA-DR.