JP2022541349A - Ｍａｇｅ－ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、黒色腫関連抗原Ａ（ＭＡＧＥ－Ａ）タンパク質由来抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。本発明は、特に、主要組織適合性（ＭＨＣ）タンパク質との複合体中の配列番号１を含んでなるかまたはそれからなる、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。本発明の抗原結合タンパク質は、特に、前記ＭＡＧＥ－Ａペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合する新規操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。本発明の抗原結合タンパク質は、がん性疾患を発現するＭＡＧＥ－Ａの診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の抗原結合タンパク質をコード化する核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原結合タンパク質を発現する組換え細胞、および本発明の抗原結合タンパク質を含んでなる、医薬組成物が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、黒色腫関連抗原Ａ（ＭＡＧＥ－Ａ）タンパク質由来抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。本発明は、特に、主要組織適合性（ＭＨＣ）タンパク質との複合体中の配列番号１を含んでなるかまたはそれからなる、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。本発明の抗原結合タンパク質は、特に、前記ＭＡＧＥ－Ａペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合する新規操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。本発明の抗原結合タンパク質は、がん性疾患を発現するＭＡＧＥ－Ａの診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の抗原結合タンパク質をコード化する核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原結合タンパク質を発現する組換え細胞、および本発明の抗原結合タンパク質を含んでなる、医薬組成物が提供される。
ＭＡＧ－００３ペプチドとしても知られている、アミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」（配列番号１）のＭＡＧＥ－Ａ腫瘍抗原は、ＭＡＧＥ－Ａ４（アミノ酸２８６～２９４）およびＭＡＧＥ－Ａ８（アミノ酸２８８～２９６）のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープである（非特許文献１）。ＭＡＧＥ－Ａ４およびＭＡＧＥ－Ａ８は、どちらもタンパク質であり、ＭＡＧＥ－Ａ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＭＡＧＥ－Ａ８および－Ａ４の機能は不明であるが、胎芽発育および腫瘍形質転換、または腫瘍進行の側面において役割を果たしてもよい。これらのタンパク質について、複数の選択的スプライシング変異型が同定されている。配列番号１に記載のＭＡＧＥ－Ａ抗原は、腫瘍で発現されるが精巣および胎盤を除く正常組織では発現されない、がん／精巣（ＣＴ）抗原に属する。例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質およびｍＲＮＡの発現は、様々ながんの発症および予後に関連付けられている。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される、ＭＡＧＥ－Ａなどのペプチド、特にＭＡＧＥ－Ａ４および／またはＭＡＧＥ－Ａ８由来ペプチド「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」は、ＴＣＲによって結合されてもよく、したがって例えば、Ｔ細胞ベースの免疫療の標的である。したがって、ＭＡＧＥ－Ａ抗原抗原およびそれらのエピトープペプチドは、腫瘍免疫療法の試験で使用されている。
Ｚｈｅｎｇ－Ｃａｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０，５６７５９４
がん治療のための分子標的薬の開発が進歩している一方で、当該技術分野において、がん細胞に高度に特異的であるが、正常細胞にはそうでない分子を特異的に標的化する、新たな抗がん剤を開発する必要性がなおもある。
したがって、本発明は、ＭＨＣタンパク質との複合体中の配列番号１の腫瘍発現抗原ＭＡＧＥ－Ａに特異的な新規抗原結合タンパク質を提供する。
国際公開第２０１７／１５８１０３号は、配列番号１のアミノ酸配列ＫＶＬＥＨＶＶＲＶを有するＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との複合体に結合するＴＣＲ、より具体的には天然ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５などの天然ＴＣＲ、およびがん性疾患の診断、治療法および予防におけるそれらの使用を開示する。しかし、ＭＨＣに提示されたがん抗原に特異的に結合する天然ＴＣＲは、ＭＨＣに提示されたウイルス抗原に特異的に結合するＴＣＲと比較して、親和性が低い（ＫＤ＝１－３００μＭ）ことが多い。この現象の説明の一部は、胸腺で発達するＴ細胞が自己ペプチドＭＨＣリガンド上で負に選択され（耐性誘導）、このような自己ペプチドＭＨＣに対して高すぎる親和性を有するＴ細胞が削除されることであるように見える。この低親和性は、腫瘍免疫逃避の１つの可能な説明であってもよい（Ａｌｅｋ ｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；４２（１２）：３１７４－９）。したがって、養子細胞療法（ＡＣＴ）の抗原認識コンストラクトとして、または可溶性アプローチの認識モジュールとして使用するために、すなわち二重特異性分子を使用するために、がん抗原に対してより高い親和性で結合するＴＣＲ変異型を設計することが望ましいようである（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２０１６ Ｓｅｐ；２１（８）：７６９－８５）。
しかし、ＴＣＲの親和性を高めることは、副作用のリスクもまた高めることがある。上述したように、自然界では、自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する高親和性ＴＣＲは、交差反応性を介した正常組織上に存在する自己ペプチドの認識を回避するために、胸腺選択によって排除される。したがって、その標的配列に対するＴＣＲ親和性を単純に増加させると、類似した非がん特異的ペプチドへの親和性も増加する可能性が高く、したがって、交差反応性および健常組織に対する望ましくない細胞傷害性効果のリスクが増加する。これが単なる理論上のリスクではないことは、ＭＡＧＥ－Ａ３を対象とする操作されたＴＣＲについて、痛切に発見されている。特に、これまでに発表された結果では、前臨床試験で交差反応が予測されていなかったにもかかわらず、筋肉タンパク質であるタイチンのペプチドと交差反応する、ＭＡＧＥ－Ａ３を標的化するＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞を注入された２人の患者において、致死的な毒性が示されている（Ｌｉｎｅｔｔｅ ＧＰ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２：８６３－７１、Ｃａｍｅｒｏｎ ＢＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１３；５：１９７－１０３）。これらの患者は、ＴＣＲで操作されたＴ細胞が重篤で予測不可能なオフターゲットおよび臓器特異的毒性を有し得ることを実証した。
したがって、オフターゲットペプチド（「類似ペプチド」とも称される）との交差反応性の低下または減少による高い安全性プロファイルを維持しながら、より高い親和性でそれらの標的に特異的に結合し、したがって標的抗原ペプチドの発現低下を伴う腫瘍細胞または細胞株でさえも標的化できる、ＴＣＲまたは抗原結合タンパク質を開発および提供するという、満たされていない医学的ニーズがある。換言すれば、本発明者らは、高い腫瘍選択性を維持しながら、それらの標的ペプチドに対して高い結合親和性を示す抗原結合タンパク質を開発することができた。
さらに、本発明者らによって示されたように、ＭＡＧＥ－Ａ特異的ＴＣＲ分子ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５は、一本鎖コンストラクトとして、またはＴ細胞上の表面分子に特異的に結合する部分とＭＨＣ－ペプチド複合体に特異的に結合する部分とを含んでなるＴＣＥＲ（以下、「ＴＣＥＲ（商標）」分子または「ＴＣＥＲ（商標）」）と称される二重特異性形態において、比較的低い溶解性を示す。
したがって、ＴＣＲ技術の進歩にもかかわらず、追加的ながん治療法、特にがん細胞を効率的に標的化して滅殺する治療法に対する必要性が、依然として存在する。特に、ｉ）所望の生物学的活性を有するＭＨＣタンパク質との複合体中で、配列番号１の腫瘍特異的ＭＡＧＥ－Ａペプチドに対して選択的かつ特異的であり、ｉｉ）良好な代謝、薬物動態、溶解性、安定性および／または安全性プロファイルを有し、ｉｉｉ）大規模に製造され得る、新規抗原結合タンパク質を開発する必要がある。
したがって、本発明の文脈において、本発明者らは、前記親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５に由来するＣＤＲ変異型を含んでなる、いくつかの抗原結合タンパク質を操作した。これらの抗原結合タンパク質は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合親和性が増加し、安定性が増加し、および／または溶解性が増加しているため、医療用途に好適である。
さらに、本発明者らによって実証されたように、これらの新規抗原結合タンパク質は、低コピー数の標的がん細胞に効果的に結合して滅殺し、有利には、類似ペプチドに対する交差反応性が低く、高い安全性プロファイルを維持する。
さらに、これらの新規抗原結合タンパク質は、特にＴＣＥＲ（商標）分子の形態で、腫瘍細胞に対する高い細胞傷害性を示す。例えば、ＴＣＥＲ（商標）分子の形態にある新規抗原結合タンパク質では、ＮＣＩ－Ｈ１７５５、Ｈｓ６９５Ｔ細胞、およびＵ２ＯＳに対する最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、細胞に対して１～３００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭの範囲、より具体的には、１ｐＭ～２０ｐＭの間である。さらに、本発明の抗原結合タンパク質のＥＣ５０は、腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔに対して、初代細胞株などの健常組織の細胞株では１００倍、好ましくは１０００倍以上高く、その安全性の高さが実証される。
さらに、本発明者らは、これらの新規抗原結合タンパク質、特にＴＣＥＲ（商標）分子について、生体内において、低用量であっても治療薬マウスモデルにおける有意な腫瘍増殖阻害を実証した。
したがって本発明は、ＭＨＣタンパク質との複合体中のＭＡＧＥ－Ａ由来抗原ペプチドに特異的な抗原結合タンパク質に関連し、前記抗原結合タンパク質は、例えば、天然ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５と比較して、発現および／または精製中の凝集の減少など、安定性が増加している。さらに、前記抗原結合タンパク質は、例えば、細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７５、Ｈｓ６９５Ｔ細胞、およびＵ２ＯＳ細胞に対して、高い細胞傷害性を有する。
要約すると、本発明者らの驚くべき発見は、とりわけ、技術分野に以下の利点を提供する：（ｉ）健常組織上の類似ペプチドとのＴＣＲまたは抗原結合タンパク質の交差反応性の減少、および高い腫瘍選択性の維持；（ｉｉ）ＴＣＲまたは抗原結合タンパク質の安全性プロファイルの向上；（ｉｉｉ）ＴＣＲまたは抗原結合タンパク質が、オフターゲットおよび腫瘍外の細胞傷害性を低減させること；および（ｉｖ）改善された特異的、選択的、および安全なＴＣＲまたは抗原結合タンパク質の提供。
定義
本明細書における「抗原結合タンパク質」という用語は、少なくとも１つの抗原、特に本発明の文脈で定義される抗原に結合できる、ポリペプチドまたは結合タンパク質を指す。好ましい実施形態では、前記抗原結合タンパク質は、例えば、二重特異性抗体から知られているように、２つの異なる抗原に同時に結合できる。本発明の抗原結合タンパク質は、本発明の文脈で定義されるように、元来ＴＣＲに由来する少なくとも６つのＣＤＲを含んでなる。特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、元来ＴＣＲに由来する、本発明の文脈で定義される少なくとも１つの可変αドメインと、少なくとも１つの可変βドメインとを含んでなる。
「ドメイン」は、配列相同性に基づいて定義され、しばしば特定の構造的または機能的実体に関連する、タンパク質の領域である。このようなドメインの例は、抗体軽鎖の可変軽鎖ドメイン、抗体重鎖の可変重鎖ドメイン、抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン（定常ドメイン）、ＴＣＲのα鎖の可変ドメイン、またはＴＣＲのβ鎖の可変ドメインである。
「抗原」または「標的抗原」という用語は、本明細書の用法では、少なくとも１つの抗原結合部位によって結合され得る分子、または分子または複合体の一部を指し、その中では、前記１つの抗原結合部位は、例えば、従来の抗体、従来のＴＣＲ、および／または本発明の抗原結合タンパク質に存在する。
本発明の抗原結合タンパク質によって特異的に結合される抗原は、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドであり、より具体的には、ＭＨＣタンパク質との複合体中にある配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドである。
「エピトープ」という用語は、本明細書の用法では、「構造的エピトープ」および「機能的エピトープ」という用語を含んでなる。「構造的エピトープ」は、抗原に結合したときに抗原結合タンパク質によってカバーされる、例えば、ペプチド－ＭＨＣ複合体などの抗原のアミノ酸である。典型的には、抗原結合タンパク質のアミノ酸の任意の原子から５Å以内にある、抗原の全てのアミノ酸がカバーされていると見なされる。抗原の構造的エピトープは、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ分析をはじめとする、当該技術分野で知られている方法によって判定されてもよい。抗体の構造的エピトープは、典型的には、２０～３０個のアミノ酸を含んでなる。ＴＣＲの構造的エピトープは、典型的には、２０～３０個のアミノ酸を含んでなる。「機能的エピトープ」は、構造的エピトープを形成するアミノ酸のサブセットであり、Ｈ結合、塩橋、芳香族スタッキングまたは疎水性相互作用などの非共有結合を直接形成することによって、または抗原の結合コンフォメーションを間接的に安定化させることによって、本発明の抗原結合タンパク質との界面形成に重要な抗原のアミノ酸を含んでなり、例えば、変異スキャンニングによって判定される。典型的には、抗体が結合する抗原の機能的エピトープは、４～６個のアミノ酸を含んでなる。典型的には、ペプチド－ＭＨＣ複合体の機能的エピトープは、ペプチドの２～６個のアミノ酸と、ＭＨＣ分子の２～７個のアミノ酸とを含んでなる。ＭＨＣＩ提示ペプチドは典型的には、８～１０アミノ酸長を有するので、各所与のペプチドのアミノ酸のサブセットのみが、ペプチド－ＭＨＣ複合体の機能的エピトープの一部である。本発明の文脈において、エピトープ、特に本発明の抗原結合タンパク質によって結合される機能的エピトープは、結合界面の形成に必要とされる抗原のアミノ酸、したがって配列番号１のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つのアミノ酸を含んでなる、機能的エピトープを含んでなるかまたはそれからなる。
「ＭＡＧＥ－Ａ」または「黒色腫関連抗原Ａ」サブファミリータンパク質は、分子レベルで同定された最初の腫瘍関連抗原であった（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１；２５４：１６４３－４７）。ＭＡＧＥ－Ａは、Ｘ染色体のｑ２８領域にある１２個の遺伝子（ＭＡＧＥ－Ａ１～ＭＡＧＥ－Ａ１２）のサブファミリーである。ＭＡＧＥ－Ａサブファミリータンパク質のメンバーは通常、精巣または胎盤でのみ発現され、それらの制限された発現は、それらが胚細胞の発達において機能していてもよいことを示唆する。ＭＡＧＥ－Ａタンパク質は、中枢神経系、脊髄、および脳幹の初期発生でも検出され、ＭＡＧＥ－Ａタンパク質が神経発生にもまた関与していてもよいことが明らかにされた。このファミリーのメンバーは、互いに５０～８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードし、全てのＭＡＧＥタンパク質は、およそ１７０個のアミノ酸からなる高度に保存されたドメインである、共通のＭＡＧＥ相同性ドメイン（ＭＨＤ）を共有する。がんにおけるＭＡＧＥ－Ａタンパク質発現の生物学的機能、および根底にある調節機序は、まだ完全には分かっていない。
「ＭＡＧＥ－Ａ４」または「黒色腫関連抗原４」タンパク質は、ＭＡＧＥ－Ａ遺伝子ファミリーのメンバーであり、配列番号９７のＵｎｉｐｒｏｔ受入れ番号Ｐ４３３５８を有する（２０１９年７月８日時点で利用可能）。ＭＡＧＥ－Ａ４の局在は、細胞質として記載されている。しかし、ＭＡＧＥ－Ａ４染色はまた核内でも検出されており、高分化型がんと低分化型がんとの対比では、核と細胞質の間で示差的分布があった（Ｓａｒｃｅｖｉｃ Ｂ ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６４，４４３－４４９）。ＭＡＧＥ－Ａ４は、雄生殖細胞マーカーとして使用される。これは、精原細胞では発現されないが、前精原細胞および成熟胚細胞で発現される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２７，１２５５－１２６６）。ＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質およびｍＲＮＡの発現は、様々ながんの発症および予後に関連付けられている。
「ＭＡＧＥ－Ａ８」または「黒色腫関連抗原８」タンパク質は、ＭＡＧＥ－Ａスーパーファミリーのメンバーであり、配列番号９８のＵｎｉｐｒｏｔ受入れ番号Ｐ４３３６１を有する（２０１９年７月８日時点で利用可能）。
「ＭＡＧＥ－Ａ４」と「ＭＡＧＥ－Ａ８」タンパク質は、ＢＬＡＳＴＰ２．９．０アルゴリズムを用いたタンパク質配列アラインメントによる判定で、７２％の配列同一性を有する（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。さらに、「ＭＡＧＥ－Ａ４」と「ＭＡＧＥ－Ａ８」は、どちらもＭＡＧ－００３ペプチド、すなわち、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）を含んでなる。
「主要組織適合性複合体」（ＭＨＣ）は、脊椎動物の獲得免疫系が異物分子を認識するために不可欠な細胞表面タンパク質のセットであり、これによって組織適合性が決定される。ＭＨＣ分子の主な機能は、病原体に由来する抗原に結合し、それらを細胞表面上に提示して適切なＴ細胞に認識させることである。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体（しばしば単にＨＬＡ）とも称される。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を保有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを保有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＣＤ８依存性およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答が、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、腫瘍関連抗原および対応するＴ細胞受容体の同定および特性評価は、ワクチンおよび細胞療法などのがん免疫療法の開発において重要である。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は第６染色体の短腕上に位置し、ＨＬＡ－Ａのより大きなα鎖の構成物をコード化する。ＨＬＡ－Ａα鎖の多様性は、ＨＬＡ機能の鍵である。この多様性は、集団の遺伝的多様性を促進する。各ＨＬＡは、特定の構造のペプチドに対して異なる親和性を有することから、ＨＬＡの種類が多いほど、細胞表面上に「提示」される抗原の種類も多くなる。各個人は、それぞれの親から１タイプずつの最大２タイプのＨＬＡ－Ａを発現し得る。一部の個人は、両親から同一のＨＬＡ－Ａを継承し、個々のＨＬＡの多様性が低下する；しかし、大多数の個人は、ＨＬＡ－Ａの２つの異なるコピーを受け継ぐ。全てのＨＬＡ群が、この同じパターンに従う。換言すれば、各個人は、２４３２個の既知のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの１つまたは２つのみを発現する。
本発明の文脈におけるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃタンパク質、好ましくはＨＬＡ－Ａタンパク質、より好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２であってもよい。
「ＨＬＡ－Ａ＊０２」は特定のＨＬＡ対立遺伝子を表し、その中では、文字Ａは遺伝子を表し、接尾辞「＊０２」はＡ２血清型を示す。
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応においては、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を保有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
ＴＣＲは、シグナル伝達媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質に関連する、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲはαβおよびγδ形態で存在し、それらは構造的に類似しているが、かなり異なる解剖学的位置とおそらくは機能を有する。天然のヘテロ二量体αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの細胞外部分は、それぞれ２つのポリペプチドを含有し、そのそれぞれは膜近位定常ドメインおよび膜遠位可変ドメインを有する。定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した、高度に多型性のループを含有する。ＴＣＲ遺伝子治療の使用は、いくつかの現在のハードルを克服する。それは、典型的には対象（患者）自身のＴ細胞に所望の特異性を与えて、十分な数のＴ細胞を短期間で生成できるようにし、それらの枯渇を回避する。例えば、ＴＣＲは効力のあるＴ細胞（例えば、中央メモリーＴ細胞または幹細胞特性を有するＴ細胞）に形質導入され、それは移入時に良好な持続性、保存、および機能を確実にしてもよい。ＴＣＲ操作Ｔ細胞は、化学療法または照射によってリンパ球減少症になったがん患者に注入され、効率的な生着ができるようにするが、免疫抑制は阻害する。
本明細書における「ＴＣＲ」という用語は、ＴＣＲおよびそれらの断片、ならびに一本鎖ＴＣＲおよびそれらの断片、特に単一ドメインＴＣＲの可変αおよびβドメイン、ならびにキメラ、ヒト化、二重特異性または多重特異性ＴＣＲを示す。
「ＴＣＲの断片」は、無傷または天然のＴＣＲの一部、特に無傷または天然のＴＣＲの抗原結合領域または可変領域を含んでなる。ＴＣＲ断片の例としては、Ｖα－ＣａまたはＶβ－Ｃβなどのα、β、δ、γ鎖の断片またはその一部が挙げられ、このような断片は、対応するヒンジ領域；またはＶα、Ｖβ、Ｖδ、Ｖγなどの単一の可変ドメイン；一本鎖ＶαＶβ断片；ＴＣＲ断片から形成される二重特異性ＴＣＲおよび多重特異性ＴＣＲもさらに含んでなるかもしれない。ＴＣＲ断片は、天然に存在する完全長ＴＣＲと比較して同一の機能を発揮し、すなわち断片は、それらの標的ペプチドに選択的かつ特異的に結合する。
「一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）」は、本明細書ではタンパク質を示し、その中では、ＶαとＶβ、またはＶδとＶγなどのＴＣＲの可変ドメインが、１つのポリペプチド上に位置する。典型的には、可変ドメインはリンカーによって分離され、その中では、前記リンカーは、典型的には、例えば、５～１５個など、５～２０個のアミノ酸を含む。
例えば、「天然ＴＣＲ」という文言で使用される「天然」は、野生型ＴＣＲを指す。
養子細胞移入（ＡＣＴ）アプローチでは、生成された導入遺伝子Ｔ細胞が、野生型α鎖およびβ鎖を有する野生型ＴＣＲと、それぞれの標的抗原－ＭＨＣ複合体に特異的なα鎖およびβ鎖を有する遺伝子組換えＴＣＲとを発現してもよい。野生型α鎖およびβ鎖と、遺伝子組換えα鎖およびβ鎖はどちらも、通常、なおも相互に交差対合できる。この望まれない対合の可能性は「ＴＣＲ誤対合」と称され、ＴＣＲ（遺伝子）治療の分野で認識されている問題である。遺伝子組換えＴＣＲαまたはβ鎖と、内在性ＴＣＲβまたはα鎖との間で、それぞれ誤対合および不正確な対合が起こると、遺伝子組換えＴＣＲαβヘテロ二量体の表面発現の減少が帰結することがあり、これによって、修飾Ｔ細胞の機能的結合活性が低下する。さらに、誤対合ＴＣＲを発現して高ＩＬ－２条件下で増殖されたＴ細胞は、前臨床モデルで移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘発することが実証された。
遺伝子組換えＴＣＲαおよびβの対合を最適化して誤対合を回避するためのいくつかのストラテジーとしては、以下が挙げられてもよい：１．マウス化ＴＣＲ：このアプローチでは、ヒトＴＣＲαおよびβ定常鎖が対応するマウスドメインで置き換えられる。ヒトとマウスのＴＣＲ－Ｃドメインは高度な相同性を示すが、小さな違いがＴＣＲ／ＣＤ３相互作用の安定性に影響を与え、したがってＴＣＲ表面発現レベルに影響を与える。２．システイン修飾ＴＣＲ：このアプローチは、構造的に好ましい位置にシステインアミノ酸を導入し、したがって、少なくとも１つの追加的なジスルフィド架橋の形成を可能にし、２つのＴＣＲ鎖間の正しい対合を促進する。例えば、ＴＣＲα定常鎖中のＴ４８ＣおよびＴＣＲβ定常鎖中のＳ５７Ｃなどの部位特異的変異は、２つの鎖間結合（すなわち、導入されたジスルフィド架橋＋内在性膜貫通ジスルフィド架橋（α定常ドメインの９５位とβ定常ドメインの１３１位）によって連結されるＴＣＲヘテロ二量体をもたらす。３．ドメイン交換：腫瘍特異的Ｔ細胞受容体のαおよびβ鎖の間で定常ドメインを入れ替え、ドメイン交換（ｄｓ）ＴＣＲを生成する。これらのｄｓＴＣＲ鎖は、正しく対合すると、ＣＤ３タンパク質を動員するのに必要な全てのドメインを保持し、Ｔ細胞の表面上で発現し、標的抗原との結合時の機能性Ｔ細胞応答を媒介する。対照的に、１つのｄｓＴＣＲ鎖と１つの野生型ＴＣＲ鎖を含有する誤対合ＴＣＲは、ＣＤ３の動員、搬出、およびシグナル伝達に必要な重要なドメインを欠いており、したがって有害な自己免疫を媒介できない。４．排他的ＴＣＲヘテロ二量体：このアプローチでは、立体力と静電力を利用して、ＴＣＲαおよびβ導入遺伝子間の正しい対合を促進し、同時に外因性と内因性のＴＣＲα鎖およびβ鎖間の対合を抑制する。一例では、静電荷の必要な変化を得るために、部位特異的変異を使用して、Ｓ８５Ｒがα定常ドメインに、Ｒ８８Ｇがβ定常ドメインに導入され、したがって二次構造および三次構造を最小限に歪ませるとされる、「ノブ・インツー・ホール」の構成を相互に生成する。５．各ＴＣＲ鎖がＣＤ３ζ分子に融合している、キメラＴＣＲ－ＣＤ３ζ鎖の使用。６．定義されたＴＣＲのＶα鎖が、柔軟なペプチドリンカーを使用してβ鎖に融合されている、一本鎖ＴＣＲの使用。７．内在性ＴＣＲの発現をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ配列またはジンクフィンガーヌクレアーゼの使用。「ベルクロ」と称される別のアプローチは、ヘテロ二量体状態での好ましい静電相互作用により、２つのＴＣＲ鎖を互いに対合できる。すなわち、２つのペプチドは、主に単離形態で展開されるが、混合されると優先的に会合し、安定した平行コイルドコイルヘテロ二量体を形成する。このアプローチは、可溶性ＴＣＲを生成するために適用されてもよく、その中では、ペプチドを短縮型α鎖およびβ鎖にそれぞれ融合させることによって、ヘテロ二量体複合体が優先される。
天然α－βヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖とβ鎖を有する。各α鎖は可変領域、連結領域、および定常領域を含んでなり、β鎖は通常、可変領域と連結領域の間の短い多様性領域もまた含有するが、この多様性領域は連結領域の一部と見なされることが多い。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の定常領域またはＣ領域は、それぞれＴＲＡＣおよびＴＲＢＣと称される（Ｌｅｆｒａｎｃ，（２００１），Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １：Ａｐｐｅｎｄｉｘ １０）。本明細書においてα可変ドメインおよびβ可変ドメインと称される各可変領域は、フレームワーク配列に埋め込まれた３つの「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を含んでなり、１つはＣＤＲ３と命名された超可変領域である。α可変ドメインＣＤＲは、本明細書においてＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３と称され、β可変ドメインＣＤＲは、本明細書においてＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、ＣＤＲｂ３と称される。それらのフレームワークによって、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって区別される、数タイプのα鎖可変（Ｖα）領域および数タイプのβ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖαタイプは、ＩＭＧＴ命名法で一意のＴＲＡＶ番号によって参照され、Ｖβタイプは、ＩＭＧＴ命名法で一意のＴＲＢＶ番号によって参照される（Ｆｏｌｃｈ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，（２０００），Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ １７（１）：４２－５４；Ｓｃａｖｉｎｅｒ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，（２０００），Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ １７（２）：８３－９６；ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ，（２００１），”Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。免疫グロブリン遺伝子についてより詳しくは、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐｂｅｔ ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；４３（データベース出版）：Ｄ４１３－２２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を参照されたい。したがって、従来のＴＣＲ抗原結合部位には、αおよびβ鎖可変領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含んでなる、通常、６つのＣＤＲが含まれ、その中では、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列は、ＨＬＡタンパク質に結合するペプチド抗原の認識および結合に関連し、ＣＤＲ２配列は、ＨＬＡタンパク質の認識および結合に関連する。
抗体と同様に、「ＴＣＲフレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、単一生物種中の異なるＴＣＲ間である程度保存されているＴＣＲαおよびβ鎖可変領域の部分を指す。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、それぞれ４つのＦＲを有し、本明細書において、それぞれＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、ＦＲ４－ａ、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、ＦＲ４－ｂと称される。したがって、α鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－ａ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－ａ）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－ａ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－ａ）と称されてもよく、β鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－ｂ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－ｂ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－ｂ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－ｂ）と称されてもよい。
本発明の文脈において、αまたはβ鎖またはγまたはδ鎖におけるＣＤＲ／ＦＲ定義は、ＩＭＧＴ定義に基づいて判定されることになっている（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７（１）：５５－７７；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。したがって、ＴＣＲまたはＴＣＲ由来ドメインに関連する場合のＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置は、前記のＩＭＧＴ定義に従って示される。好ましくは、第１の可変ドメインのＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置のＩＭＧＴ位置は、ＴＲＡＶ５のＩＭＧＴ番号付けとの類似性で与えられ、および／または第２の可変ドメインのＣＤＲ／ＦＲアミノ酸位置のＩＭＧＴ位置は、ＴＲＢＶ１２－４のＩＭＧＴ番号付けとの類似性で与えられる。γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変ドメイン」という用語は、本明細書の用法ではリーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＧＣ配列を指す。同様に、「ＴＣＲδ可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し、「ＴＣＲδ定常ドメイン」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＤＣ配列を指す。
「免疫グロブリン」とも称される「抗体」では、２つの重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖には、ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）の２タイプがある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ。それぞれの鎖は、異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）との２つのドメインまたは領域を含む。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）と、３つの定常ドメイン（集合的にＣＨと称される、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）との４つのドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）の双方の可変領域は、抗原への結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）と重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の結合、分泌、胎盤通過性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１つの軽鎖可変部分と１つの重鎖可変部分とからなる。抗体の特異性は、抗体組み合わせ部位（抗体結合部位の同義語）と抗原決定基の間の構造的相補性にある。抗体組み合わせ部位は、主に超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成されている。時折、非超可変またはＦＲからの残基は、全体的なドメイン構造に影響を与え、したがって結合組み合わせ部位に影響を与える。ＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、ＣＤＲ３－Ｌ、およびＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈと称される、３つのＣＤＲをそれぞれ有する。したがって、従来の抗体抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含んでなる６つのＣＤＲを含む。
本発明の文脈において、抗体または免疫グロブリンは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥである。
「抗体フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、単一生物種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存されている、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ、およびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと称される、４つのＦＲをそれぞれ有する。したがって、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と称されてもよく、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と称されてもい。
本発明の文脈において、ＦＣドメイン以外の免疫グロブリン軽鎖または重鎖中のＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴ定義に基づいて決定されることになっている（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７（１）：５５－７７；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。したがって、所与の可変鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列と、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびＦＲ５のアミノ酸配列は、前記のＩＭＧＴ定義に従って示される。
当業者であれば理解できるように、抗体の構造、特に抗体の可変重鎖および軽鎖の構造は、ＴＣＲαおよびβ可変ドメイン構造に類似している。したがって、本発明のＴＣＲのＣＤＲは、従来の抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体中にグラフト化され得る。
本発明の抗体、ＴＣＲまたは抗原結合タンパク質のＣＤＲのアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、ＴＣＲフレームワーク領域または抗体フレームワーク領域などのフレームワーク領域を容易に判定し得る。しかし、ＣＤＲが示されていない場合、当業者は、最初に、ＴＣＲのＩＭＧＴ定義または抗体のＩＭＧＴ定義に基づいてＣＤＲアミノ酸配列を決定し、次に、フレームワーク領域のアミノ酸配列を決定し得る。
本明細書の用法では、「ヒトフレームワーク領域」は、天然由来ヒト抗体またはヒトＴＣＲなどの天然由来抗原結合タンパク質のフレームワーク領域と実質的に（約８５％以上、特に９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）同一のフレームワーク領域である。
「抗体」という用語は、抗体およびそれらの断片、ならびに単一ドメイン抗体およびそれらの断片、特に単一ドメイン抗体の可変重鎖、およびキメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性または多重特異性抗体を意味する。
本明細書で言及される「従来の抗体」は、自然から単離された抗体と同じドメインを有し、抗体由来のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含んでなる抗体である。同様に、本明細書で言及される「従来のＴＣＲ」は、天然ＴＣＲおよびＴＣＲ由来のＣＤＲおよびフレームワーク領域と同じドメインを含んでなる、ＴＣＲである。
「ヒト化抗体」という用語は、完全にまたは部分的に非ヒト起源であり、ヒトの免疫反応を回避しまたは最小化するために、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域において特定のアミノ酸を置換するように修飾された抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、主にヒトＣＨおよびＣＬドメインである。
抗体配列をヒト化するための多くの方法が当該技術分野で公知であり；例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ＆ Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３によるレビューを参照されたい。一般的に使用される方法の１つは、ＣＤＲグラフト化、または抗体再形成であり、これは、通常はマウス抗体であるドナー抗体のＣＤＲ配列を異なる特異性のヒト抗体のフレームワークスキャフォールドにグラフト化することを伴う。ＣＤＲグラフト化は、ＣＤＲグラフト化非ヒト抗体の結合特異性および親和性、ひいては生物学的活性を低下させることもあるので、親抗体の結合特異性および親和性を保持するために、ＣＤＲグラフト化抗体の選択された位置に復帰変異が導入されてもよい。可能な復帰変異の位置の同定は、文献および抗体データベースで利用可能な情報を使用して実施され得る。ＣＤＲグラフト化および復帰変異の代替のヒト化技術は、表面再構成であり、その中では、非ヒト起源の非表面露出残基が保持される一方、表面残基はヒト残基に改変される。別の代替技術は「ガイド付き選択」（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９）として知られ、例えばマウスまたはラット抗体から、親抗体のエピトープおよび結合特性を維持する完全ヒト抗体を誘導するために使用され得る。ヒト化のさらなる方法は、いわゆる４Ｄヒト化である。４Ｄヒト化プロトコルは、米国特許出願第２０１１００２７２６６Ａ１号明細書（国際公開第２００９０３２６６１Ａ１号パンフレット）に記載され、ラット抗体の可変軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）ドメインのヒト化のために４Ｄヒト化を適用した例が、以下に例示される。
キメラ抗体では、ヒト化は典型的には、可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を伴う。
ＣＤＲの一部であるアミノ酸残基は、典型的にはヒト化に関連して改変されないが、特定例では、例えば、グリコシル化部位、脱アミド化部位、異性化部位または望ましくないシステイン残基を除去するために、個々のＣＤＲアミノ酸残基を改変することが望ましい場合がある。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ中のアスパラギン残基にオリゴ糖鎖が結合することによって起こり、式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であってもよい。Ｎグリコシル化部位の除去は、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に変異させることによって、特に保存的置換を介して達成されてもよい。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの要因に応じて生じ得る。アスパラギン残基は、主にＡｓｎ－Ｇｌｙの配列で存在する場合に特に脱アミドの影響を受けやすく、Ａｓｎ－Ａｌａなどのその他のジペプチド配列ではその影響より少ない。したがって、このような脱アミド化部位、特にＡｓｎ－ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在する場合、典型的には保存的置換によって、関与する残基の１つを除去することによって、その部位を除去することが望ましくあってもよい。関与する残基の１つを除去するためのＣＤＲ配列中の置換もまた、本発明に包含されることが意図される。
「抗体の断片」は、無傷抗体の一部、特に無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含んでなる。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二特異性抗体、および抗体断片から形成される二重抗体および多重特異性抗体が挙げられる。抗体の断片はまた、重鎖抗体またはＶＨＨなどの単一ドメイン抗体であってもよい。
「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００ダルトンの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を意味し、その中では、ＩｇＧを例えば、パパインなどのプロテアーゼで処理して得られた断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体が、ジスルフィド結合を介して共に結合する。
本発明の抗原結合タンパク質に関する「二重特異性」という用語は、少なくとも２つの原子価と、２つの異なる抗原に対する結合特異性とを有し、したがって２つの抗原結合部位を含んでなる抗原結合タンパク質を指す。「原子価」という用語は、抗原結合タンパク質の結合部位の数を指し、例えば、二価の抗原結合タンパク質は、２つの結合部位を有する抗原結合タンパク質に関連する。原子価という用語は、結合部位の数を指すことに留意すべきであり、その中では、それらの結合部位は、同じかまたは異なる標的に結合してもよく、すなわち、二価の抗原結合タンパク質は、単一特異性、すなわち１つの標的に結合するか、または二重特異性、すなわち２つの異なる標的に結合してもよい。標的は、抗原、標的ペプチド、オフターゲット、すなわち類似ペプチドなどでであってもよい。
本発明の文脈において、少なくとも１つの抗原結合部位がＴＣＲに由来することが好ましく、より具体的には、少なくとも１つの抗原結合部位が、本発明の文脈で定義されるＴＣＲ由来のＣＤＲを含んでなることが好ましい。
「二重特異性」という用語の本発明の文脈において、抗原結合部位の少なくとも１つの特異性がＴＣＲに由来することが好ましく、より特には、少なくとも１つの抗原結合部位が、本発明の文脈において定義されるＴＣＲ由来のＣＤＲを含んでなることが好ましい。したがって、本発明の文脈における「二重特異性」は、本発明の文脈において定義されるＣＤＲを含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位、すなわちＴＣＲ由来のＣＤＲと、少なくとも１つのさらなる抗原結合部位とを組み合わせた抗原結合タンパク質を指し、その中では、前記少なくとも１つのさらなる抗原結合部位は、抗体に由来して、したがって抗体ＣＤＲを含んでなってもよく、またはさらなるＴＣＲに由来し、したがってさらなるＴＣＲのＣＤＲを含んでなってもよい。しかし、好ましい実施形態では、前記のさらなる抗原結合部位は、抗体に由来し、したがって抗体ＣＤＲを含んでなる。
本明細書における「形態」という用語は、前記抗原結合タンパク質中およびその空間的構成中に存在する、特定の数およびタイプのドメインを含んでなる抗原結合タンパク質を指す。
二重特異性形態などの多くの異なる形態は、典型的には、抗体の文脈で当該技術分野で記載され、このような形態としては、典型的には、二特異性抗体、クロスオーバー二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）および／または二重可変ドメイン（ＤＶＤ）タンパク質が挙げられる。これらの異なる二重特異性抗体の概要およびそれらを生成する方法は、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｅ．Ｅ．ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２－２１２で開示される。特に、ＤＶＤ形態は、例えば、以下の科学論文で開示される（Ｗｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７；２５：１２９０－７；ＰＭＩＤ：１７９３４４５２；Ｗｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２００９；１：３３９－４７；Ｌａｃｙ ＳＥ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１５；７：６０５－１９；ＰＭＩＤ：２５７６４２０８；Ｃｒａｉｇ ＲＢ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２；７：ｅ４６７７８；ＰＭＩＤ：２３０５６４４８；Ｐｉｃｃｉｏｎｅ ＥＣ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２０１５）。ＣＯＤＶは、例えばＯｎｕｏｈａ ＳＣ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ；６７（１０）：２６６１－７２または例えば、国際公開第２０１２／１３５３４５号パンフレット、国際公開第２０１６／１１６６２６号パンフレットで開示される。二重特異性二特異性抗体は、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９６；９：２９９－３０５；ＰＭＩＤ：８７３６４９７；Ａｔｗｅｌｌ ＪＬ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９６；３３：１３０１－１２；ＰＭＩＤ：９１７１８９０；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７；１５：６２９－３１；ＰＭＩＤ：９２１９２６３；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９７；３：１３７－４４；ＰＭＩＤ：９２３７０９８；Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０：４３３６－４１；ＰＭＩＤ：１０９６９７７２；およびＤｅＮａｒｄｏ ＤＧ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２００１；１６：５２５－３５；ＰＭＩＤ：１１７８９０２９で説明される。
抗体の文脈で使用される「二特異性抗体」は、典型的には、同じまたは異なる抗体からの、それぞれがＶＨおよびＶＬドメインを含んでなる２つの鎖から構成される二価の分子を指す。２つの鎖は典型的には、ＶＨＡ－ＶＬＢとＶＨＢ－ＶＬＡ（ＡとＢは２つの異なる特異性を表す）、またはＶＬＡ－ＶＨＢとＶＬＢ－ＶＨＡの構成を有する。
本発明の文脈において、「二特異性抗体（Ｄｂ）」または「二重特異性抗体形態」は、本明細書でそれぞれ、リンカー（ＬＤｂ１およびＬＤｂ２）によって連結された２つの可変ドメインを含んでなる２つのポリペプチド鎖から構成された二価の分子を指し、その中では、ドメインの２つは、本発明の文脈で定義される第１および第２のドメイン（Ｖ１およびＶ２）であり、その他の２つのドメインは、ＴＣＲに由来するまたは抗体に由来する可変ドメイン（ＶＡ、ＶＢ）であってもよい。Ｖ１Ｖ２ドメインは、２つの異なるポリペプチド上に位置し、ＶＡＶＢドメインは、２つの異なるポリペプチド上に位置し、ドメインは頭ー尾方向で二量体化する。したがって、配向は、Ｖ１－ＬＤｂ１－ＶＡとＶＢ－ＬＤｂ２－Ｖ２、Ｖ２－ＬＤｂ１－ＶＡとＶＢ－ＬＤｂ２－Ｖ１、Ｖ１－ＬＤｂ１－ＶＢとＶＡ－ＬＤｂ２－Ｖ２、またはＶ２－ＬＤｂ１－ＶＢとＶＡ－ＬＤｂ２－Ｖ１であってもよい。ドメインが頭－尾方向で二量体化できるようにするために、リンカー、すなわちＬＤｂ１およびＬＤｂ１は同一であるかまたは異なり得て、短いリンカーである。短いリンカーは、典型的には例えば、４、５など、例えば３、４、５、６、７、８、９アミノ酸長の２～１２、３～１３アミノ酸長の間のリンカーであり（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｅ．Ｅ．（ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２－２１２）、または配列番号１００の「ＧＧＧＳ」、配列番号１０１の「ＧＧＧＧＳ」、または配列番号９６の「ＧＧＧＳＧＧＧＧ」などの８アミノ酸長である。
「二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））」形態は、２００７年に最初にＷｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｎｏｖ；２５（１１）：１２９０－７）によって記載された。この形態では、典型的には、第２のモノクローナル抗体（Ｂ）の標的結合可変ドメインは、典型的には従来の抗体（Ａ）（ドメインＶＬＡおよびＶＨＡを含んでなる）に融合し、その中では、従来の抗体（Ａ）の軽鎖は、したがって追加的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬＢ）を含んでなり、従来の抗体（Ａ）の重鎖は、追加的な重鎖可変ドメイン（ＶＨＢ）を含んでなる。当該技術分野で記載されるようなＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、したがって典型的には、ＶＨＢ－Ｌ－ＶＨＡ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含んでなる１つの重鎖と、ＶＬＢ－Ｌ－ＶＬＡ－ＣＬを含んでなる１つの軽鎖との２つのポリペプチド鎖から構成される。ドメイン対ＶＬＡ／ＶＨＡおよびＶＬＡ／ＶＬＡは、したがって平行して対合する。
本発明の文脈において、「二重可変ドメインＩｇ形態」は、それぞれ、リンカー（Ｌ１、Ｌ３）によって連結された、２つの可変ドメインを含んでなる２つのポリペプチド鎖を含んでなるタンパク質を指し、その中では、ドメインの２つは、本発明の文脈で定義される第１および第２のドメイン（Ｖ１およびＶ２）であり、その他の２つのドメインは、重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨＡおよびＶＨＢ）に由来する抗体である。本発明の文脈におけるＤＶＤ－Ｉｇ形態では、ポリペプチド鎖は、例えば、Ｖ１－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ２－Ｌ３－ＶＬＡ－Ｌ４－ＣＬ、またはＶ２－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ１－Ｌ３－ＶＬＡ－Ｌ４－ＣＬの構成を有する。接続リンカーＬ１およびＬ３は、好ましくは５～１５アミノ酸残基などの５～２０アミノ酸残基長の間であり、および／または接続リンカーＬ２およびＬ４は、存在してもまたは存在しなくてもよい。
抗体の文脈で当該技術分野で記載されるような「クロスオーバー二重可変ドメインＩｇ様タンパク質」は、２つのＶＨおよび２つのＶＬドメインが、可変ＶＨ－ＶＬドメインのクロスオーバー対合を可能にする様式で連結され、それらは、ＶＨＡ－ＶＨＢおよびＶＬＢ－ＶＬＡの順序、またはＶＨＢ－ＶＨＡおよびＶＬＡ－ＶＬＢの順序のいずれかで（ＮからＣ末端方向に）配列される形態を表す。
本発明の文脈において、「クロスオーバー二重可変ドメインＩｇ様タンパク質」は、それぞれがリンカー（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４）によって連結された２つの可変ドメインを含んでなる、２つのポリペプチド鎖を含んでなるタンパク質を指し、その中では、２つのドメインは、本発明の文脈で定義される第１および第２のドメイン（Ｖ１およびＶ２）であり、その他の２つのドメインは、抗体重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨＡ、ＶＨＢ）に由来する。本発明の文脈におけるＣＤＶＤ－Ｉｇ形態では、ポリペプチド鎖は、例えば、Ｖ１－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶＬＡ－Ｌ３－Ｖ２－Ｌ４－ＣＬ、Ｖ２－Ｌ１－ＶＨＡ－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶＬＡ－Ｌ３－Ｖ１－Ｌ４－ＣＬ、ＶＨＡ－Ｌ１－Ｖ１－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ２－Ｌ３－ＶＬＡ－ＬＤＶＤ３－ＣＬ、またはＶＨＡ－Ｌ１－Ｖ２－Ｌ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３とＶ１－Ｌ３－ＶＬＡ－Ｌ４－ＣＬの構成を有する。このＣＤＶＤ形態では、リンカー（Ｌ１～Ｌ４）は、典型的には、全グリシンリンカーおよび本明細書のリンカーの項で下に記載されるリンカーを含めて、異なる長さである。例えば、Ｌ１は３～１２アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は３～１４アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１～８アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は１～３アミノ酸残基の長さであるか、またはＬ１は５～１０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５～８アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１～５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は１～２アミノ酸残基の長さであるか、またはＬ１は７アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。
本明細書における「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、５または６つ以上の特定の物体などの１つ以上の特定の物体を指す。例えば、本明細書における少なくとも１つの結合部位は、１、２、３、４、５または６つ以上の結合部位を指す。
「参照配列と少なくとも８５％の同一性を有する」配列とは、その全長において、参照配列の全長と８５％以上、特に９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列である。
本出願の文脈では、「同一性の百分率」は、グローバルなペアワイズアラインメントを用いて計算される（すなわち、２つの配列が、それらの全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ大域アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて、それらの全長を考慮した場合の２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つける「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムが、用いられてもよい。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂサイトで利用でき、以下の出版物でさらに説明されている（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ．２７６－２７７）。本発明による２つのポリペプチド間の同一性の百分率は、１０．０に等しい「Ｇａｐ Ｏｐｅｎ」パラメーター、０．５に等しい「Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ」パラメーター、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスで、ＥＭＢＯＳＳ：ｎｅｅｄｌｅ（大域）プログラムを用いて計算される。
参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一」のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入および／または置換などのアミノ酸変異を含んでなってもよい。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは別の種に由来する相同配列に対応してもよい。
「アミノ酸置換」は、保存的または非保存的であってもよい。好ましくは、置換は保存的置換であり、その中ではあるアミノ酸が類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸によって置換される。
一実施形態では、保存的置換としては、その内容全体が参照により援用される、Ｄａｙｈｏｆｆによって”Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．５”，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載されるものが挙げられてもよい。例えば、一態様では、以下のグループの１つに属するアミノ酸は、互いに交換され得て、したがって、保守的な交換を構成する：グループ１：アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；グループ２：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）；グループ３：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）；グループ４：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；グループ５：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）；およびグループ６：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。一態様では、保存的アミノ酸置換は、Ｔ→Ａ、Ｇ→Ａ、Ａ→Ｉ、Ｔ→Ｖ、Ａ→Ｍ、Ｔ→Ｉ、Ａ→Ｖ、Ｔ→Ｇ、および／またはＴ→Ｓから選択されてもよい。
さらなる実施形態では、保存的アミノ酸置換としては、例えば、（１）非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；および（４）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど、同一クラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換が挙げられてもよい。その他の保存的アミノ酸置換はまた、以下のように行われ得る：（１）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ；（２）プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ；および（３）プロトン受容体：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ（例えば、その内容全体が参照により援用される、米国特許第１０，１０６，８０５号明細書を参照されたい）。
別の実施形態では、表１に従って保存的置換が行なわれてもよい。タンパク質修飾に対する耐性を予測する方法は、例えば、その内容全体が参照により援用される、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５－９２１０（２００４）にある。
表1：保存的アミノ酸置換
Figure 2022541349000001
別の実施形態では、保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下で表２に示されるものであってもよい。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表２で「例示的な置換」と命名される、より実質的な変化が導入され、必要に応じて生成物がスクリーニングされてもよい。
表2：アミノ酸置換
Figure 2022541349000002
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は変異型抗原結合タンパク質を含んでもよく、その中では、前記変異型抗原結合タンパク質は、変異型がそれに由来する抗原結合タンパク質と比較して、好ましくは第１の可変ドメイン（Ｖαドメインなど）および第２の可変ドメイン（Ｖβドメインなど）のＣＤＲ領域にある、最大８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなる、第１のポリペプチド鎖（α鎖など）および第２のポリペプチド鎖（β鎖など）を含む。この点において、抗原結合タンパク質のＣＤＲ領域のそれぞれの中に、または第１および／または第２の可変ドメインのＣＤＲ領域の全ての中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のアミノ酸置換があってもよい。置換は、第１および／または第２の可変ドメインのどちらかのＣＤＲ中にあってもよい。
一実施形態では、変異型は機能的変異型である。
「機能的変異型」という用語は、本明細書の用法では、保存的アミノ酸置換を含有する抗原結合タンパク質などの親抗原結合タンパク質と、実質的または有意な配列同一性または類似性を有する抗原結合タンパク質を指し、その中では、前記機能的変異型は、親抗原結合タンパク質の生物学的活性を保持する。一態様では、機能的変異型は、例えば、親抗原結合タンパク質とほぼ同程度、同程度、またはより高い程度で標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の変異型（本明細書に記載の抗原結合タンパク質それ自体は、親抗原結合タンパク質と称される）を包含する。親抗原結合タンパク質に関して、機能的変異型は、例えば、親抗原結合タンパク質へのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列であるアミノ酸配列を有し得る。
機能的変異型は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む親抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含んでなり得る。代案としては、またはそれに加えて、機能的変異型は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する、親抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を含んでなり得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が機能的変異型の生物学的活性を妨害または阻害しないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異型の生物学的活性を増強し、その結果、機能的変異型の生物学的活性は、親抗原結合タンパク質と比較して増加する。
本開示の修飾されたＴＣＲ、ポリペプチド、および抗原結合タンパク質（機能的部分および機能的変異型を含む）は、修飾されたＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質（またはその機能的部分または機能的変異型）が、例えば、抗原に特異的に結合する能力、宿主における罹患細胞を検出する能力、または宿主における疾患を治療または予防する能力などのそれらの生物学的活性を保持するという条件で、任意の長さであり得て、すなわち、任意の数のアミノ酸を含んでなり得る。
本発明の抗原結合タンパク質（機能的部分および機能的変異型を含む）は、１つまたは複数の天然アミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでなり得きる。このような合成アミノ酸は、当該技術分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸酸モノアミド、Ｎ′－ベンジル－Ｎ′－メチル－リジン、Ｎ′，Ｎ′－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられてもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質（機能的部分および機能的変異型をはじめとする）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎアシル化され得て、例えば、ジスルフィド架橋を介して環化され得て、または酸付加塩に変換され得て、および／または任意選択的に、二量体化または重合、または抱合され得る。
本開示の抗原結合タンパク質は、合成、組換え、単離、および／または精製され得る。
本明細書における「共有結合」は、例えば、ポリペプチドリンカーなどのリンカーまたはリンカー配列を介した、ジスルフィド架橋またはペプチド結合、または共有結合を指す。
「リンカー」という用語は、本明細書の用法では、例えば、一本鎖コンストラクト中、本発明の抗原結合タンパク質の第１の可変ドメインと第２の可変ドメインの間、および任意選択的に、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間などの２つのドメインの間に挿入されて、ドメインに十分な可動性を提供し、正しく折りたたまれて抗原結合部位を形成し、または二重特異性抗原結合タンパク質の場合は、本発明の抗原結合タンパク質のクロスオーバー対合（ＣＯＤＶ形態の、または二重特異性抗体形態のいくつかの）または平行対合構成（例えば、ＤＶＤ形態）のいずれかで、抗原結合部位と、少なくとも１つのさらなる抗原結合部位を形成する、１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。
いくつかの実施形態では、リンカーは０個のアミノ酸からなり、すなわちリンカーは存在しない。リンカーは、アミノ酸配列レベルで、可変ドメイン間、または可変ドメインと定数ドメイン間の移行部にそれぞれ挿入される。免疫グロブリンドメインならびにＴＣＲドメインのおよそのサイズが良く理解されているため、ドメイン間の移行部が同定され得る。実験データによって実証されるように、またはモデル化または二次構造予測測の技術を使用して同定または想定され得るように、βシートまたはαらせんなどの二次構造要素を形成しないペプチドストレッチの位置を特定することによって、ドメイン移行部の正確な位置が判定され得ることは、当業者によって知られている。本発明の文脈で使用されるリンカーという用語は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６と称されるリンカーを指すが、これらに限定されるものではない。
それぞれの文脈で特に指定されていない限り、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６、などのリンカーは、長さが少なくとも１～３０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、２～２５、２～２０、または３～１８アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸長以下のさペプチドであり得る。その他の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、５～２５、５～１５、４～１１、１０～２０、または２０～３０アミノ酸長であり得る。その他の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、約、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長であり得る。特定の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６などのリンカーは、例えば、長さが、５～２４、１０～２４または５～１０などの２４未満、２０未満、１６未満、１２未満、１０未満のアミノ酸残基であってもよい。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、長さが、１を超え、２を超え、５を超え、１０を超え、２０を超えるアミノ酸残基、長さが２２を超えるアミノ酸残基などの長さが１以上のアミノ酸残基である。
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５Ｌ６、などの例示的なリンカーは、ＴＶＡＡＰ（配列番号９９）、ＧＧＧＳ（配列番号１００）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１４０）、ＴＶＬＲＴ（配列番号１０２）、ＴＶＳＳＡＳ（配列番号１０３）、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号ＮＯ：９６）、ＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１４８）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０４）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４３）、ＧＧＧＧＳＡＡＡ（配列番号１０５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１５５）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１６１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１６３）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴ（配列番号１６５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ（配列番号１０７）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１４５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０８）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号１４６）、ＧＧＱＧＳＧＧＴＧＳＧＧＱＧＳＧＧＴＧＳＧＧＱＧＳ（配列番号１４７）、ＴＶＬＳＳＡＳ（配列番号１０９）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、特にＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号ＮＯ：９６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１０）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０８）のアミノ酸配列からなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
本発明の文脈で使用される「Ｆｃドメイン」という用語は、以下でさらに定義される天然ＦｃドメインおよびＦｃドメインの変異型および配列を包含する。Ｆｃ変異型および天然Ｆｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語には、抗体全体から分解されたか、またはその他の手段で生成されたかにかかわらず、単量体または多量体の形態の分子が含まれる。
「天然Ｆｃ」という用語は、本明細書の用法では、抗体の消化から得られるか、または単量体または多量体の形態であるかどうかにかかわらず、その他の手段によって生成された非抗原結合断片の配列を含んでなり、ヒンジ領域を含有してもよい分子を指す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、特にヒト由来であり、免疫グロブリンのいずれかであり、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２、最も好ましくはＩｇＧ１であり得る。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合によって二量体または多量体形態に結合し得る単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥなど）またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２など）に応じて、１～４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合二量体である。「天然Ｆｃ」という用語は、本明細書の用法では単量体、二量体、および多量体の形態に一般的である。天然Ｆｃアミノ酸配列の一例は、ＩＧＨＧ１＊０１の配天然Ｆｃアミノ酸配列である、列番号１１１のアミノ酸配列である。
「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、典型的には、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に位置する重鎖の柔軟な部分を指す。それは約２５アミノ酸長であり、「上部ヒンジ」、「中部ヒンジ」または「コアヒンジ」、および「下部ヒンジ」に分割される。「ヒンジサブドメイン」は、上部ヒンジ、中部（またはコア）ヒンジ、または下部ヒンジを指す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４分子のヒンジのアミノ酸配列を以下に示す：
ＩｇＧ１：Ｅ２１６ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１１４）
ＩｇＧ２：Ｅ２１６ＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰ（配列番号１１５）
ＩｇＧ３：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥ２１６ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１１６）
ＩｇＧ４：Ｅ２１６ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号１１７）。
本発明の文脈において、これはＦｃドメイン中のアミノ酸位置に言及し、これらのアミノ酸位置または残基は、例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５（１９６９）に記載されるようなＥＵ番号付けシステムに従って示される。
「Ｆｃ変異型」という用語は、本明細書の用法では、天然Ｆｃから修飾されているが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位をなおも含んでなる、分子または配列を指す。例示的なＦｃ変異型、およびそれらとサルベージ受容体との相互作用は、当該技術分野で公知である。したがって、「Ｆｃ変異型」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含んでなり得る。さらに、天然Ｆｃは、本発明の抗原結合タンパク質に必要でない構造的特徴または生物学的活性を提供するので、除去され得る領域を含んでなる。したがって、「Ｆｃ変異型」という用語は、１つまたは複数の天然Ｆｃ部位または残基を欠く分子または配列を含んでなり、またはその中では、１つまたは複数のＦｃ部位または残基が修飾されて、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との非適合性、（３）選択された宿主細胞での発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を与えまたは関与している。
したがって、一実施形態では、Ｆｃ１および／またはＦｃ２などのＦｃ－ドメインは、ヒンジドメインを含んでなる。一実施形態では、Ｆｃ－ドメインは、ヒトＩｇＧＦｃドメインであり、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２、より好ましくはＩｇＧ１に由来する。
いくつかの実施形態では、特に、抗原結合タンパク質が、２つのＦｃドメイン、すなわち本明細書で以下に記載されるＴＣＥＲ（商標）形態（Ｆｃ１およびＦｃ２など）を含んでなる場合に、２つのＦｃドメインは、同じ免疫グロブリンイソタイプまたはイソタイプサブクラスであっても、または異なる免疫グロブリンイソタイプまたはイソタイプサブクラスであってもよく、好ましくは同じものである。したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃ１およびＦｃ２は、ＩｇＧ１サブクラス、またはＩｇＧ２サブクラス、またはＩｇＧ３サブクラス、またはＩｇＧ４サブクラスであり、好ましくはＩｇＧ１サブクラス、またはＩｇＧ２サブクラス、より好ましくはＩｇＧ１サブクラスである。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、変異型Ｆｃドメインであり、したがって本明細書で以下に記載されるアミノ酸置換の１つまたは複数を含んでなる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、「ＲＦ」および／または「ノブ・インツー・ホール」変異、好ましくは「ノブ・インツー・ホール」を含んでなるかまたはさらに含んでなる。
「ＲＦ変異」は、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ．，２０１：２５－３４）によって記載されたようなＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆなどの、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸ＨＹのＲＦへのアミノ酸置換を一般に指し、プロテインＡへの結合を無効にすることから、精製目的に有利であると記載されている。抗原結合タンパク質が２つのＦｃドメインを含んでなる場合、ＲＦ変異は片方または双方、好ましくは１つのＦｃドメインにあってもよい。
「ノブ・インツー・ホール」技術とも称される「ノブ・インツー・ホール」は、どちらもＣＨ３－ＣＨ３界面でヘテロ多量体形成を促進する、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）と、Ｔ３６６Ｗ（ノブ）とを指す。これらの「ノブ・インツー・ホール」変異は、追加的なシステインアミノ酸置換であるＹ３４９ＣおよびＳ３５４Ｃの導入によってさらに安定化され得る。「ノブ・インツー・ホール」技術は、安定化システインアミノ酸置換と一緒に、米国特許第５７３１１６８号明細書および米国特許第８２１６８０５号明細書に記載される。
本発明の文脈において、「ノブ」変異は、システインのアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃと一緒に、例えば、配列番号１１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、Ｆｃドメインに存在し、「ホール」変異は、システインアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃと一緒に、配列番号１１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、Ｆｃドメインに存在する。
いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（ノブ）を含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）を含んでなり、逆もまた同様である。
いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含んでなるかまたはさらに含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ含んでなるかまたはさらに含んでなり、逆もまた同様である。
したがって、いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ノブ）を含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（ホール）を含んでなり、逆もまた同様である。
この一連のアミノ酸置換は、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７）によって記載されたように、一方のポリペプチドにアミノ酸置換Ｋ４０９Ａを含め、もう一方のポリペプチドにＦ４０５Ｋを含めることによって、さらに拡張され得る。したがって、いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｋ４０９Ａを含んでなるかまたはさらに含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、そのＣＨ３ドメイン中にアミノ酸置換Ｆ４０５Ｋを含んでなるかまたはさらに含んでなり、逆もまた同様である。
場合によっては、人為的に導入されたシステイン架橋は、最適には抗原結合タンパク質の結合特性を妨げることなく、抗原結合タンパク質の安定性を改善してもよい。このようなシステイン架橋は、ヘテロ二量体化をさらに改善し得る。
得られたタンパク質のヘテロ二量体化を改善するための、荷電対置換などのさらなるアミノ酸置換が、例えば、欧州特許第２９７０４８４号明細書など、当該技術分野で記載される。
したがって一実施形態では、例えば、Ｆｃ１などのポリペプチドの１つのＦｃドメインは、電荷対置換Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｒ、またはＤ３５６ＫおよびＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒのを含んでなるかまたはさらに含んでなり、例えば、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメインは、電荷対置換Ｒ４０９Ｄ、Ｒ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、またはＫ４０９ＤおよびＮ３９２Ｄ、Ｎ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、またはＫ３９２Ｄを含んでなるかまたはさらに含んでなり、逆もまた同様である。
さらなる実施形態では、ポリペプチド鎖の片方または双方、好ましくは双方の上のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体（ＦｃｙＲ）結合を阻害する、１つまたは複数の改変を含んでなり得る。このような改変としては、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａが挙げられ得る。
ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなるＦｃ部分、またはそれらの部分を抗原結合タンパク質、より具体的には二重特異性抗原結合タンパク質に含めることにより、Ｆｃ：Ｆｃ－γ受容体（ＦｃｇＲ）によって誘発されるこれらの分子の非特異的固定化の問題が生じた。ＦｃｇＲは、異なる細胞表面分子（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩ）結合から構成され、ＩｇＧ－分子のＦｃ部分によって提示されるエピトープに対する異なる親和性を有する。このような非特異的（すなわち、二重特異性分子の２つの結合ドメインのいずれによっても誘導されない）固定化は、ｉ）分子の薬物動態への影響、およびｉｉ）免疫エフェクター細胞の様々なＦｃ－変異型のオフターゲット活性化の理由から好ましくなく、ＦｃｇＲ結合を除去する変異が同定されている。これに関連して、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｔｈｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ＣＨ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ Ｃ１ｑ，ＦｃｙＲＩ ａｎｄ ＦｃｙＲＩＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ）は、ヒトＩｇＧ１の残基２３３～２３６と、ヒトＩｇＧ２に由来する対応する配列、すなわち、残基２３３Ｐ、２３４Ｖ、および２３５Ａとの交換を開示しており、その中では、２３６位にアミノ酸が存在せず、ＦｃｇＲＩ結合が消滅し、Ｃ１ｑ結合が消滅し、ＦｃｇＲＩＩＩ結合が減少している。欧州特許第１０７５４９６号明細書は、Ｆｃ領域の（２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａの１つまたは複数、２３６位に残基またはＧがなく、３２７Ｇ、３３０Ｓおよび３３１Ｓなどの）多様性を有する抗体およびその他のＦｃ含有分子を開示しており、その中では、組換え抗体は、有意な補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子に結合できる。
したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）またはＧと；３２７Ｇ、３３０Ｓ、３３１Ｓからなる群から選択されるアミノ酸の１つまたは複数または欠失とを含んでなるかまたはさらに含んでなり、好ましくは、Ｆｃ領域は、アミノ酸２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）またはＧと；３２７Ｇ、３３０Ｓ、３３１Ｓからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸とを含んでなるかまたはさらに含んでなり、最も好ましくは、Ｆｃ領域は、アミノ酸２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６（残基なし）および３３１Ｓを含んでなるかまたはさらに含んでなる。
さらなる一実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７ＧまたはＮ２９７Ａ、好ましくはＮ２９７Ｑを含んでなるかまたはさらに含んでなる。
アミノ酸置換「Ｎ２９７Ｑ」、「Ｎ２９７Ｇ」、または「Ｎ２９７Ａ」は、Ｆｃドメイン内の天然Ｎグリコシル化部位を抑制する２９７位でのアミノ酸置換を指す。このアミノ酸置換は、Ｆｃγ受容体相互作用をさらに妨げ、最終的なタンパク質産物、すなわち例えば、Ｔａｏ，ＭＨ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＬ（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ Ｏｃｔ １５；１４３（８）：２５９５－６０１．）に記載されたような糖残基に起因する、本発明の抗原結合タンパク質のばらつきを減少させる。
さらなる一実施形態は、特に軽鎖なしの場合、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２２０Ｃを含んでなるかまたはさらに含んでなる。アミノ酸置換「Ｓ２２０Ｃ」は、ＣＨ１ＣＬジスルフィド架橋を形成するシステインを欠失させる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば、Ｓ３５４ＣとＹ３４９ＣまたはＬ２４２ＣとＫ３３４Ｃなどの少なくとも２つの追加的なシステイン残基を含んでなるかまたはさらに含んでなり、その中ではＳ３５４Ｃは、Ｆｃ１などの１つのポリペプチドのＦｃドメイン中にあり、Ｙ３４９Ｃは、Ｆｃ２などのその他のポリペプチドのＦｃドメイン中にあって、ヘテロ二量体を形成し、および／またはその中ではＬ２４２ＣおよびＫ３３４Ｃは、ポリペプチドの片方または双方のＦｃ１またはＦｃ２のいずれかの同じＦｃドメインに位置して、ドメイン内Ｃ－Ｃ橋を形成する。
「精製された」および「単離された」とは、ポリペプチド（すなわち、本発明の抗原結合タンパク質）またはヌクレオチド配列を指す場合、示された分子が、同じタイプのその他の生物学的巨大分子の実質的な不在下で、存在することを意味する。「精製された」という用語は、本明細書の用法では、特に、同じタイプの生物学的巨大分子の少なくとも７５重量％、８５重量％、９５重量％、または９８重量％が存在することを意味する。
特定のポリペプチドをコード化する「単離された」核酸分子は、対象ポリペプチドをコード化しないその他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す；しかし、分子は、組成物の基本的特性に悪影響を及ぼさないいくつかの追加的な塩基または部分を含んでもよい。
「ドメイン」は、タンパク質の任意の領域であってもよく、一般に配列相同性に基づいて定義され、しばしば特定の構造的または機能的実体に関連している。
「組換え」分子は、組換え手段によって調製、発現、生成、または単離された分子である。
「遺伝子」という用語は、１つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部を含んでなるアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば、遺伝子が発現される条件を判定するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配列を含んでも含まなくてもよい。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写されてもよいが、アミノ酸配列には翻訳されまない。その他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子またはＤＮＡ転写の調節因子として機能してもよい。特に、遺伝子という用語は、タンパク質をコード化するゲノム配列、すなわち、調節因子、プロモーター、イントロン、およびエクソン配列を含んでなる配列を意図してもよい。
「親和性」は、理論的には、抗原結合タンパク質と抗原との間の平衡結合によって、本発明の文脈では、抗原結合タンパク質とその抗原、すなわちＭＨＣタンパク質との複合体中の配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドとの間の平衡結合によって、定義される。親和性は、例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）または平衡解離定数（ＫＤ）で表わされてもよい。
「ＫＤ」は、抗原結合タンパク質とその抗原の間の平衡解離定数、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率である。ＫＤおよび親和性は、反比例の関係にある。ＫＤ値は、抗原結合タンパク質の濃度に関係し、ＫＤ値が低いほど、抗原結合タンパク質の親和性がより高くなる。親和性、すなわちＫＤ値は、本明細書の「抗原結合タンパク質」の項で下に詳細に説明されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて会合や解離の速度を測定するなど、様々な既知の方法によって実験的に評価され得る。
「ＥＣ５０」とも称される「最大半量有効濃度」は、通常、指定された曝露時間後に、ベースラインと最大値の中間の応答を誘発する分子の濃度を指す。ＥＣ５０と親和性は反比例の関係にあり、ＥＣ５０値が低いほど、分子の親和性がより高くなる。一例として、「ＥＣ５０」は、指定された露光時間後に、ベースラインと最大値の中間の反応を誘発する本発明の抗原結合タンパク質の濃度を指し、より具体的には、指定された露光時間後に、ベースラインと最大値の中間の反応を誘発する本発明の抗原結合タンパク質の濃度を指す。ＥＣ５０値は、本明細書の「抗原結合タンパク質」の項で下に詳細に記載されるように、例えば、ＩＦＮ－γ放出アッセイまたはＬＤＨ放出アッセイなどを使用して、様々な既知の方法によって実験的に評価され得る。
「ＣＤ３」はタンパク質複合体であり、４つの異なる鎖から構成される。哺乳類では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含有するこれらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖として知られている分子に結合し、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生じる。
「ＣＤ２８」はまた、Ｔ細胞上でも発現され、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供し得る。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の増殖と生存、サイトカイン産生、およびＴヘルパー２型発生に重要な役割を果たす。
「ＣＤ１３４」はまた、ＯＸ４０とも称される。ＣＤ１３４／ＯＸ４０は、活性化に続いて２４～７２時間後に発現しており、二次共刺激分子を定義していると考えられる。
「４－１ＢＢ」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の４－１ＢＢリガンドに結合でき、それによってＴ細胞の共刺激シグナルが生じる。
「ＣＤ５」は主にＴ細胞上に見られる受容体の別の例であり、ＣＤ５はＢ細胞上にも低レベルで見られる。
「ＣＤ９５」は、Ｔ細胞機能を修飾する受容体のさらなる例であり、その他の細胞の表面上で発現されるＦａｓリガンドによるアポトーシスシグナル伝達を媒介するＦａｓ受容体としても知られている。ＣＤ９５は、休止状態のＴリンパ球におけるＴＣＲ／ＣＤ３駆動型シグナル伝達経路を調節することが報告されている。
「ＮＫ細胞特異的受容体分子」は、例えば、ＣＤ１６、低親和性Ｆｃ受容体、およびＮＫＧ２Ｄである。
Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の双方の表面上に存在する受容体分子の一例は、ＣＤ２、およびＣＤ２スーパーファミリーのさらなるメンバーである。ＣＤ２は、ＴおよびＮＫ細胞上で共刺激分子として機能できる。
本発明の文脈において、本明細書で上に（ｉｉ）で言及される「膜貫通領域」は、例えば、ＴＣＲαまたはβ膜貫通ドメインであってもよい。
「細胞質シグナル伝達領域」は、例えば、ＴＣＲαまたはβ細胞内ドメインであってもよい。
本明細書における「診断薬」は、（直接的または間接的に）シグナルを提供する、蛍光分子、放射性分子、または当該技術分野で公知の任意のその他の標識などの検出可能な分子または物質を指す。
当該技術分野で公知の「蛍光分子」としては、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、青色レーザーで使用するためのフルオロフォア（例えば、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＰＥ－Ｃｙ５、ＦＬ３およびＡＰＣまたはＣｙ５、ＦＬ４）、赤色、紫色、またはＵＶレーザーで使用するためのフルオロフォア（例えば、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ）が挙げられる。
「放射性分子」としては、Ｉ１２３，Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｔｃ９９などのシンチグラフィー研究用の放射性原子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗原結合タンパク質はまた、ヨウ素１２３、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識を含んでなってもよい。
このような診断薬は、抗原結合タンパク質に直接結合（すなわち、物理的に結合）されるか、または間接的に結合されてもよい。
本明細書における「治療薬」は、治療効果を有する薬剤を指す。一実施形態では、このような治療薬は、細胞傷害剤または放射性同位体などの増殖阻害剤であってもよい。
無差別に使用され得る「増殖阻害剤」または「抗増殖剤」は、生体外または生体内のどちらかで、細胞、特に腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物または組成物を指す。
「細胞傷害剤」という用語は、本明細書の用法では、細胞の機能を阻害しまたは妨げる、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。「細胞傷害剤」という用語は、化学療法剤、酵素、抗生物質、および細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素（それらの断片および／または変異型を含む）、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、細胞傷害剤は、タキソイド、ビンカ、タキサン、メイタンシノイドまたはＤＭ１もしくはＤＭ４などのメイタンシノイド類似体、小型薬剤、トマイマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン誘導体、クリプトフィシン誘導体、レプトマイシン誘導体、オーリスタチンまたはドラスタチン類似体、プロドラッグ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、抗チューブリン剤、ＣＣ－１０６５またはＣＣ－１０６５類似体である。
「放射性同位体」という用語は、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、およびＬｕの射性同位体などのがん治療に適する放射性同位体を含むことが意図される。このような放射性同位元素は、一般的に主にβ線を放出する。一実施形態では、放射性同位体は、α放射性同位体、より正確には、α線を放出するトリウム２２７である。
本明細書における「ＰＫ修飾部分」は、本発明の抗原結合タンパク質の薬物動態（ＰＫ）を修飾する部分を指す。したがって、この部分は、特に、本発明の抗原結合タンパク質の生体内半減期および分布を改変する。好ましい実施形態では、ＰＫ修飾部分は、抗原結合タンパク質の半減期を延長する。ＰＫ修飾部分の例としては、ＰＥＧ（Ｄｏｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．Ｏｃｔ ２８；１６（１０）：２５８３１－６４；およびＪｅｖｓｅｖａｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．Ｊａｎ；５（１）：１１３－２８）、Ｐａｓ化（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．Ａｕｇ；２６（８）：４８９－５０１）、アルブミン（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｅｐ ２０；２７７（３８）：３５０３５－４３）、抗体および／または非構造化ポリペプチドのＦｃ部分（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；２７（１２）：１１８６－９０）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「半減期（Ｔ１／２）」とは、一般に、生体内に沈着した薬物またはその他の物質の半分の量が、通常の生物学的プロセスによって代謝または排除されるのに必要な時間を指す。したがって、本発明の文脈における半減期は、本発明の抗原結合タンパク質の半分の量が、例えば、マウスにおいて排除されるのに必要な時間を指す。半減期は、当該技術分野で周知の方法によって判定され得る。一例では、半減期は、実施例１０で詳細に説明されるように判定される。したがって、一例では、半減期は、例えば、本発明の抗原結合タンパク質を高度免疫不全ＮＯＧマウスなどのマウスに投与することによって、例えば、静脈内投与した後、０時間、０．１時間、２時間、８時間、２４時間、４８時間、１２０時間、２４０時間、３６０時間などの異なる時点で、後頭葉神経叢から血漿サンプルを採取することによって、判定される。抗原結合タンパク質の血漿レベルは、次に、ＥＬＩＳＡなどの当該技術分野で公知の技術を使用して、Ｆｃ－ＶＬアッセイおよびＣＤ３－ｐＭＨＣアッセイなどの異なる設定を用いて判定される。サンプルの血漿濃度は、典型的には、それぞれの標準曲線からの補間によって取得され、半減期は、典型的には、異なる時点で採取された血漿レベルの線形回帰によって判定される。
抗原結合タンパク質
国際公開第２０１７／１５８１０３号パンフレットで開示されるようなＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５を出発点として使用し、本発明者らは、一本鎖（ｓｃＴＣＲ）形態で、本明細書の実施例１および２に記載されるような酵母スクリーニングアッセイを使用して、または一本鎖二重特異性ＴＣＲコンストラクトで、ＴＣＲ可変α（Ｖα）および任意選択的に可変β（Ｖβ）ドメイン変異型を設計、生成、および試験し、本明細書の実施例４に記載されるような可溶性の二重特異性ｓｃＴＣＲコンストラクトの結合親和性、ならびに収量および安定性をさらに最適化した。このようにして、本発明者らは、可変αおよび任意選択的にβドメインの異なる変異型、より具体的には可変αドメインのＣＤＲａ３（５つの変異型がある）の異なる変異型を同定したが、これらは、親ＴＣＲのＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、および／またはＣＤＲｂ３と、または本発明の抗原結合タンパク質が標的に、すなわち、ＭＨＣタンパク質との複合体中の、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに、高い親和性だけでなく高い特異性で結合するのに有利な変異型である、ＣＤＲａ１（１つの変異型）、ＣＤＲａ２（３つの変異型）、ＣＤＲｂ１（１つの変異型）、ＣＤＲｂ２（５つの変異型）および／またはＣＤＲｂ３（１つの変異型）について発見されたＣＤＲ変異型のいずれかと、有利に組み合わせることができるかもしれない。
本発明者らは、ＣＤＲが、ＡＣＴのＴＣＲ、一本鎖ＴＣＲコンストラクト、ならびにその他の二重特異性形態で使用されてもよいことを実施例で実証し、したがって、同定されたＣＤＲ変異型を使用して、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに対して高い親和性だけでなく高い特異性を有する、ＭＨＣタンパク質との複合体中の、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の異なる抗原結合タンパク質が生成されてもよいことを原理実証で実証した。
さらに、本発明者らは、ＴＣＲ可変α（Ｖα）および可変β（Ｖβ）ドメインのフレームワークを変異させることで、本明細書で実施例４に記載されるように、可溶性の二重特異性ｓｃＴＣＲコンストラクトの結合特異性、ならびに収量および安定性が改善されることを発見した。
実施例５～８では、本発明者らは、ヒトＴＣＲ－ＣＤ３複合体に、および例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１などのＭＨＣクラスＩ分子に結合した、配列番号１のＭＡＧＥ－Ａペプチドを含んでなるペプチド：ＭＨＣ複合体に、特異的に結合する、ＴＣＥＲ（商標）形態にある抗原結合タンパク質などの腫瘍細胞株に対する生体外および生体内効力を設計し、発現させ、そして成功裏に試験した。ＢＭＡ０３１を標的化するために、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１５５，１９０３－１９１０）によって記載されたＣＤ３特異的ヒト化抗体ｈＵＣＨＴ１に由来するＴＣＲ－ＣＤ３複合体であるＶＨおよびＶＬドメイン、またはＳｈｅａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１，１４７，４３６６－７３）によって記載されたα／βＴＣＲ特異的抗体が修飾され、これらの実施例で使用された。ＭＡＧＥ－Ａ：ＭＨＣ複合体を標的化するために、本明細書で開示されるＣＤＲを含んでなるＶαおよびＶβドメインを用いて、抗原結合タンパク質の安定性および親和性成熟がもたらされてもよい。同じＶＬおよびＶＨ、ＶαおよびＶβドメインを実施例４に記載されるように、Ｆａｂドメイン（ＣＨ１ヒンジおよびＣＬを含んでなる）をさらに含んでなる、ヒト一本鎖Ｔ細胞受容体形態で使用した。
したがって、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質に言及し、その中では前記抗原ペプチドは、ＭＨＣタンパク質との複合体中にあり、抗原結合タンパク質は、
（ａ）３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、および
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる第２のポリペプチド鎖
を含んでなり、
－ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列「Ｘ１ＳＳＳＴＹ」配列番号７２を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥ、より好ましくはＥであり、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号７２と異なるアミノ酸配列であり、
－ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列「ＩＸ１ＳＸ２Ｘ３ＤＸ４」配列番号７３を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ４は、任意のアミノ酸であり、式中、好ましくはＸ１はＦまたはＹ、より好ましくはＹであり、Ｘ２はＮまたはＳ、好ましくはＳであり、Ｘ３はＱまたはＭ、好ましくはＱであり、Ｘ４はＭ、Ｖ、ＳまたはＱ、好ましくはＳまたはＱ、より好ましくはＱであり、
－ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列「ＣＡＥＸ１Ｘ２ＳＸ３ＳＫＩＩＦ」配列番号７７を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ３は任意のアミノ酸であり、式中、ＣＤＲａ１がアミノ酸配列番号５を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ２がアミノ酸配列番号６を含んでなるかまたはそれからなる場合は、ＣＤＲａ３はアミノ酸配列「ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ」（配列番号７）を含まずまたはそれからならないという条件で、好ましくは、ＣＤＲａ３がアミノ酸配列「ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ」（配列番号７）を含まずまたはそれからならないという条件で、好ましくはＸ１は、Ａ、ＦまたはＭ、より好ましくはＭであり、好ましくはＸ２は、Ｓ、Ｔ、またはＮ、より好ましくはＴであり、好ましくはＸ３はＥまたはＡ、好ましくはＥであり、または
－ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列「ＣＡＥＸ１Ｘ２ＳＸ３ＳＫＩＩＦ」配列番号７７を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ１は、Ｆ、ＭまたはＡ、好ましくはＭであり、好ましくはＸ２は、Ｓ、Ｔ、またはＮ、より好ましくはＴであり、好ましくはＸ３は、ＥまたはＡ、好ましくはＥであり、
－ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列「Ｘ１ＧＨＤ」配列番号７８を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＳまたはＰ、より好ましくはＰであり、または少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で配列番号７８とは異なるアミノ酸配列であり、
－ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列「ＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｐ」配列番号７９を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ１はＣまたはＮ、より好ましくはＣであり、好ましくはＸ２はＹまたはＮ、より好ましくはＹであり、好ましくはＸ３はＧまたはＮ、より好ましくはＧであり、好ましくはＸ４はＨ、Ｖ、Ｔ、ＡまたはＭ、好ましくはＨまたはＴ、最も好ましくはＴであり、式中、好ましくは、Ｘ１がＣである場合、ＦＲ３－ｂアミノ酸配列はアミノ酸６６位にアミノ酸６６Ｃを含んでなり、
－ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列「ＣＡＳＲＡＸ１ＴＧＥＬＦＦ」配列番号８２を含んでなるかまたはそれからなる、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＮ、好ましくはＤであり、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号８２とは異なるアミノ酸配列である。
特定の一実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質に言及し、その中では、前記抗原ペプチドはＭＨＣタンパク質との複合体中にあり、抗原結合タンパク質は、
（ａ）３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる第２のポリペプチド鎖
を含んでなり、
－ＣＤＲａ１は、配列番号５のアミノ酸配列、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号５とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲａ２は、配列番号６のアミノ酸配列、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号６とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列「ＣＡＥＸ１Ｘ２ＳＸ３ＳＫＩＩＦ」配列番号７７を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、式中、ＣＤＲａ１がアミノ酸配列番号５を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ２がアミノ酸配列番号６を含んでなるかまたはそれからなる場合は、ＣＤＲａ３はアミノ酸配列「ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ」（配列番号７）を含まずまたはそれからならないという条件で、好ましくは、ＣＤＲａ３がアミノ酸配列「ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ」（配列番号７）を含まずまたはそれからならないという条件で、好ましくはＸ１は、Ａ、ＦまたはＭ、より好ましくはＭであり、好ましくはＸ２は、Ｓ、Ｔ、またはＮ、より好ましくはＴであり、好ましくはＸ３は、ＥまたはＡ、好ましくはＥであり、
－ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列「ＣＡＥＸ１Ｘ２ＳＸ３ＳＫＩＩＦ」配列番号７７を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ１は、Ｆ、ＭまたはＡ、好ましくはＭであり、好ましくはＸ２は、Ｓ，ＴまたはＮ、より好ましくはＴであり、好ましくはＸ３はＥまたはＡ、好ましくはＥであり、
－ＣＤＲｂ１は、配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号１２とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ２は、配列番号１３のアミノ酸配列、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号１３とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列番号１４、または少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号１４とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
特定の一実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合する、可溶性抗原結合タンパク質などの抗原結合タンパク質に言及し、その中では、前記抗原ペプチドはＭＨＣタンパク質との複合体中にあり、抗原結合タンパク質は
（ａ）３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、および
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる第２のポリペプチド鎖
を含んでなり、
－ＣＤＲａ１は、アミノ酸配列「Ｘ１ＳＳＳＴＹ」配列番号７２を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥ、より好ましくはＥであり、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号７２と異なるアミノ酸配列であり、
－ＣＤＲａ２は、アミノ酸配列「ＩＹＳＳＱＤＸ１」配列番号７４を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＱ、ＶまたはＳ、好ましくはＱであり、
－ＣＤＲａ３は、アミノ酸配列配列「ＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦ」配列番号３５、または少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号３５とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ１は、アミノ酸配列「Ｘ１ＧＨＤＹ」配列番号７８を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸、好ましくはＳまたはＰ、より好ましくはＰであり、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号７８と異なるアミノ酸配列であり、
－ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列「ＦＣＹＧＸ１Ｐ」配列番号８１を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＨ、Ｖ、ＡまたはＴ、好ましくはＴであり、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換で、より好ましくは１つのアミノ酸置換で、配列番号８１とは異なるアミノ酸配列であり、式中、好ましくはＣＤＲｂ２がアミノ酸配列「ＦＣＹＧＸ１Ｐ」配列番号８１を含んでなるかまたはそれからなる場合、ＦＲ３－ｂアミノ酸配列はアミノ酸６６位にアミノ酸６６Ｃを含んでなり、
－ＣＤＲｂ３は、アミノ酸配列「ＣＡＳＲＡＸ１ＴＧＥＬＦＦ」配列番号８２を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＮ、好ましくはＤであり、または少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、配列番号８２とは異なるアミノ酸配列である。
本明細書で上に示されるように、いくつかの実施形態では、ＣＤＲｂ２アミノ酸配列は、５７位にアミノ酸５７Ｃを含んでなり、このアミノ酸は、好ましくはＦＲ３ｂアミノ酸配列の６６位に存在するシステインと、ジスルフィド架橋を好ましくは形成する。したがって、好ましい実施形態では、ＣＤＲｂ２アミノ酸配列が５７位にアミノ酸５７Ｃを含んでなる場合、次にＦＲ３－ｂアミノ酸配列は、好ましくは、アミノ酸６６位にアミノ酸６６Ｃを含み、逆もまた同様である。したがっていくつかの実施形態では、ＦＲ３ｂアミノ酸配列は、好ましくは、この６６位でのアミノ酸置換を含んでなり、したがって、いくつかの関連実施形態では、ＦＲ３ｂアミノ酸配列は、アミノ酸置換Ｉ６６Ｃを含んでなる。
いくつかの実施形態では、本発明の文脈におけるＣＤＲａ１は、配列番号５または配列番号５５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明の文脈におけるＣＤＲａ２は、アミノ酸配列：「ＩＹＳＳＱＤＸ１」配列番号７４を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＱ、ＶまたはＳ、より好ましくはＱ、または配列番号６であり、または１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換などの少なくとも１つのアミノ酸置換で、より好ましくは１つのアミノ酸置換で、配列番号７４または配列番号６とは異なるアミノ酸配列であり、好ましくはＣＤＲａ２は、アミノ酸配列「ＩＹＳＳＱＤＸ１」配列番号７４を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸、好ましくはＱ、ＶまたはＳ、より好ましくはＱであり、または１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換などの少なくとも１つのアミノ酸置換で、より好ましくは１つのアミノ酸置換で、配列番号７４とは異なるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、本発明の文脈におけるＣＤＲａ２は、配列番号６および配列番号５６、５７、および５９、好ましくは配列番号６および配列番号５６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
いくつかの実施形態では、ＣＤＲａ３は、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、好ましくは配列番号３５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲｂ１は、配列番号１２または配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列：
－「ＦＮＮＮＶＰ」配列番号１３、または
－「ＦＣＹＧＸ１」配列番号８１
を含んでなるかまたはそれからなり、
式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＨ、Ｖ、ＡまたはＴ、より好ましくは、Ｔであり（式中、好ましくは、ＣＤＲｂ２がアミノ酸配列「ＦＣＹＧＸ１Ｐ」配列番号８１を含んでなるかまたはそれからなる場合、ＦＲ３－ｂアミノ酸配列は、アミノ酸６６位にアミノ酸６６Ｃを含んでなる）、または
１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換などの少なくとも１つのアミノ酸置換で、より好ましくは１つのアミノ酸置換で、配列番号１３または８１とは異なるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、本発明の文脈におけるＣＤＲｂ２は、アミノ酸配列配列番号１３および配列番号６３、６４、６５、６６、および７０、好ましくは配列番号１３および配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは、ＣＤＲｂ２が、アミノ酸配列番号６３、６４、６５、６６または７０を含んでなるかまたはそれからなる場合は、ＦＲ３－ｂアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６６位にアミノ酸６６Ｃを含んでなる。
一実施形態では、本発明の文脈におけるＣＤＲｂ３は、配列番号１４または配列番号７１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、
（ａ）３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる第２のポリペプチド鎖
を含んでなり、
－ＣＤＲａ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲａ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲａ３は、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、好ましくは配列番号３５、３６、３７、３８、より好ましくは配列番号３５などの配列番号３５および３８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ３は、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
特定の一実施形態では、抗原結合タンパク質は、
（ａ）３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、
（ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる第２のポリペプチド鎖
を含んでなり、
－ＣＤＲａ１は、配列番号５または配列番号５５、好ましくは配列番号５５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲａ２は、配列番号５６、５７および５９、好ましくは配列番号５６および５９、より好ましくは配列番号５６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲａ３は、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＣＤＲｂ２は、配列番号６３、６４、６５、６６、および７０、好ましくは配列番号６５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、式中、好ましくは、ＣＤＲｂ２が、配列番号６３、６４、６５、６６または７０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる場合に、ＦＲ３－ｂアミノ酸配列は、好ましくはアミノ酸６６位にアミノ酸６６Ｃを含んでなり、
－ＣＤＲｂ３は、配列番号１４または配列番号７１、好ましくは配列番号７１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
本発明は、本発明の文脈で開示されるＣＤＲアミノ酸配列の変異型、典型的にはＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３、ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２および／またはＣＤＲｂ３の変異型を含んでなる抗原結合タンパク質にさらに言及し、このような変異型は、４つ、３つ、２つ、または１つなどの少なくとも１つ、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含んでもよく、その中では、アミノ酸置換の好ましい数は、好ましくは、それぞれのＣＤＲの長さに依存する。
したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤＲａ１は、少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つのまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、または１つのみのアミノ酸置換で、本明細書で開示されるＣＤＲａ１アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくはアミノ酸２８、２９、３６、３７および３８位のいずれか、より好ましくは２８位にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲａ２は、少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、または１つのみのアミノ酸置換で、本明細書で開示されるＣＤＲａ２アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくは５６または６５位、より好ましくは６５位にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲａ３は、本明細書で開示されるＣＤＲａ３アミノ酸配列とは、少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換で、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換で、または１つのみのアミノ酸置換で、異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくはアミノ酸１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１３、１１４、１１５、１１６、および１１７位のいずれかである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲｂ１は、少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つのアミノ酸置換などの１つまたは２つのアミノ酸置換で、本明細書で開示されるＣＤＲｂ１アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくはアミノ酸２７、２８、２９、３７および３８位のいずれか、より好ましくは２７および３８位にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲｂ２は、少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換で、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、または１つのみのアミノ酸置換で、本明細書で開示されるＣＤＲｂ２アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は好ましくは５６位にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲｂ３は、少なくとも１つのアミノ酸置換で、好ましくは１つ、２つ、３つのまたは４つのアミノ酸置換で、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換で、または１つのみのアミノ酸置換で、本明細書で開示されるＣＤＲｂ３アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、前記アミノ酸置換は、好ましくはアミノ酸１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７位のいずれかにある。
本明細書で上に言及されるアミノ酸置換は、本明細書で上に「定義」の項で定義され、好ましくは、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。当業者であれば理解できるように、本明細書で定義されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる第１の可変ドメインと、明細書で定義されるＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる第２の可変ドメインは、一緒に抗原結合部位を形成し、その中では、前記抗原結合部位は、ＭＨＣタンパク質との複合体中の配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに結合する。３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３は、ＴＣＲの可変αドメインに由来する。したがって、当業者であれば理解できるように、いくつかの実施形態では、第１の可変ドメインはまた、可変αドメインと称されることもある。同様に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３は、前記ＴＣＲの可変βドメインに由来し、したがって、当業者によって理解されるように、第２の可変ドメインもまた、可変βドメインと称されることもある。より具体的には、配列（ＦＲ１－ａ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－ａ）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－ａ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－ａ）などの本発明の文脈で定義されるα可変フレームワークアミノ酸配列およびα可変ＣＤＲを含んでなる第１の可変ドメインは、可変αドメインおよび／またはと称されるかもしれず、および／または配列（ＦＲ１－ｂ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－ｂ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－ｂ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－ｂ）などの本発明の文脈で定義されるβ可変フレームワークアミノ酸配列およびβ可変ＣＤＲを含んでなる第２の可変ドメインは、可変βドメインと称されるかもしれない。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、抗体フレームワーク配列に移植されてもよい。したがって、一例では、第１の可変ドメインの文脈で定義されるＣＤＲは、軽鎖可変ドメインに移植され得て、したがって、第１の可変ドメインは、配列（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲａ１）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲａ２）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲａ３）－（ＦＲ４－Ｌ）を含んでなるかまたはそれからなり、軽鎖可変ドメインと称されるかもしれない。同じ例では、第２の可変ドメインの文脈で定義されるＣＤＲが、重鎖可変ドメインに移植されているかもしれず、したがって、第２の可変ドメインは、配列（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲｂ１）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲｂ２）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲｂ３）－（ＦＲ４－Ｈ）を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインンと称されるかもしれない。しかし、第１の可変ドメインの文脈で定義されるＣＤＲが、重鎖可変ドメインに移植されるかもしれず、第２の可変ドメインの文脈で定義されるＣＤＲが、軽鎖可変ドメインに移植されるかもしれず、上記の考慮事項が、必要な変更を加えて適用できることもまた、当業者であれば理解できるであろう。
本発明の文脈において、本発明の抗原結合タンパク質のＣＤＲは、国際公開第２０１７／１５８１０３号パンフレットに開示されるように、少なくとも前記親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列において、天然および親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＣＤＲと異なる。当業者であれば理解できるように、本明細書で上に定義されるＣＤＲａ３は、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＣＤＲａ３であるアミノ酸配列「ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ」（配列番号７）を含まずまたはそれからならない。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質の文脈で本明細書に定義される第１の可変ドメインおよび第２の可変ドメインは、ＩＭＧＴ番号付けによる４４位のアミノ酸置換を含んでなってもよい。好ましい実施形態では、対合を改善するために、４４位の前記アミノ酸が別の適切なアミノ酸で置換される。特定の実施形態では、好ましくは、前記抗原結合タンパク質がＴＣＲである場合、前記アミノ酸置換は、例えば、鎖の対合（すなわち、好ましい実施形態における、αおよびβ鎖の対合またはγおよびδの対合）を改善し、第１の可変ドメイン（ｖ１４４）の４４位に存在するアミノ酸、第２の可変ドメインｎ（ｖ２４４）の４４位に存在するアミノ酸の一方または両方は、ｖ１４４Ｄ／ｖ２４４Ｒ、ｖ１４４Ｒ／ｖ２４４Ｄ、ｖ１４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ、ｖ１４４Ｋ／ｖ２４４Ｅ、ｖ１４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ、ｖ１４４Ｋ／ｖ２４４Ｄ、ｖ１４４Ｒ／ｖ２４４Ｅ；ｖ１４４Ｅ／ｖ２４４Ｒ、ｖ１４４Ｌ／ｖ２４４Ｗ、ｖ１４４Ｗ／ｖ２４４Ｌ、ｖ１４４Ｖ／ｖ２４４Ｗ、ｖ１４４Ｗ／ｖ２４４Ｖからなるアミノ酸対の群から選択されるアミノ酸対ｖ１４４／ｖ２４４中に置換される。
したがって、さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｑ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｗ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｈ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｋ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｑ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｑ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｑ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｌ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；ｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｌ；ｖ１Ｅ４４Ｖ／ｖ２Ｑ４４Ｗ；およびｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｑ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｗ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｈ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｋ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｒ４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｒ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｒ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｌ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；ｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｌ；ｖ１Ｅ４４Ｖ／ｖ２Ｒ４４Ｗ；およびｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｒ４４Ｖ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｑ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｑ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｑ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｑ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｑ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｗ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｗ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｗ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｗ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｗ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｗ４４／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｈ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｈ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｈ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｈ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｈ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｈ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｋ４４／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｋ４４Ｅ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｋ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｋ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｋ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｋ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｖ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｄ／ｖ２４４Ｋ；ｖ１Ｅ４４Ｋ／ｖ２Ｋ４４Ｄ；ｖ１Ｅ４４／ｖ２Ｋ４４Ｒ；ｖ１Ｅ４４Ｒ／ｖ２Ｋ４４Ｅ；ｖ１Ｅ４４Ｌ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；ｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｋ４４Ｌ；ｖ１Ｅ４４Ｖ／ｖ２Ｋ４４Ｗ；およびｖ１Ｅ４４Ｗ／ｖ２Ｑ４４Ｖからなる群から選択される、好ましい置換対（ｖ１４４／ｖ２４４）の１つをさらに含んでもよい。
上記において、例えば、「ｖ１Ｑ４４Ｒ／ｖ２Ｑ４４Ｄ」とは、第１の可変ドメインではＱ４４がＲで置換され、第２の可変ドメインではＱ４４がＤで置換されていることを意味するものとする。追加的な置換および説明は、米国特許出願第２０１８－０１６２９２２号明細書に記載される。
本発明の発明者らは、ＴＣＲαおよびβ可変ドメインから最初に得られたＣＤＲが、天然のＴＣＲとは異なる形態を有する抗原結合タンパク質で使用されてもよいことを実証した。例えば、実験の項では、本発明者らは、本明細書で以下に詳細に記載され、実施例（すなわち、実施例６）で示されるように、ＴＣＲＥ（商標）形態のＴＣＲαおよびβ可変ドメインのＣＤＲを使用した。
さらに、本発明者らは、ｓｃＴＣＲを含んでなる二重特異性ＴＣＲにおいて、またはＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｖα－Ｌｚ－Ｖβを含んでなる第１のポリペプチドと、ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬを含んでなる第２のポリペプチドとを含んでなるＦａｂ安定化ｓｃＴＣＲなどの一本鎖ＴＣＲコンストラクトにおいて、本発明の文脈で定義されるＣＤＲを使用した。その中では、ＶＨ（ＣＤ３）、ＶＬ（ＣＤ３）、Ｖα、およびＶβは上記で定義され、Ｌｚは、配列番号１０８のアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなるリンカーであり、ＣＨ１は、重鎖の定常ドメインであり、ＣＬは、軽鎖の定常領域である（実施例４）。
したがって、当業者はこれらの実験から、本発明の文脈で本明細書に定義されるＣＤＲが、本発明の異なる抗原結合タンパク質で使用されてもよく、したがって、本明細書に開示される異なる形態で使用されてもよいことを原理的な証明として理解している。当業者であれば、１つの抗原結合形態の文脈で実証された、本発明の抗原結合タンパク質の結合特性が、抗原結合タンパク質の形態が変化したときに少なくとも保存されることが好ましいことをさらに理解するであろう（すなわち、少なくとも第１および第２の可変ドメインのＣＤＲアミノ酸配列、好ましくは第１および第２の可変ドメインのアミノ酸は同一である）。
既に上述したように、本発明の文脈におけるＣＤＲの結合機能性は、抗体のフレームワークにおいて提供されてもよい。例えば、おそらく３、２または１つの追加的なＮおよび／またはＣ末端フレームワーク残基を含む、本発明の文脈で定義されるＣＤＲアミノ酸配列が、抗体可変重鎖／軽鎖配列に直接グラフトされてもよい。より具体的には、本発明の文脈で定義されるＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３ドメインは、可変重鎖アミノ酸配列にグラフトされてもよく、本発明の文脈で定義されるＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３は、可変軽鎖アミノ酸配列にグラフトされてもよく、逆もまた同様である。
これもまた理解されるように、いくつかの実施形態では、抗体内において、抗体の可変軽鎖ドメインが本発明の文脈で定義される第１の可変ドメインによって置き換えられてもよく、可変重鎖ドメインが本発明の文脈で定義される第２の可変ドメインによって置き換えられてもよく、逆もまた同様である。
しかし、好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質は、αフレームワーク領域およびβフレームワーク領域をさらに含んでなる。
一実施形態では、前記第１の可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－ａは、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴ」配列番号８３のアミノ酸配列、または配列番号８３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ２－ａは、「ＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹ」配列番号８４のアミノ酸配列、または配列番号８４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ３－ａは、「ＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦ」配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ４－ａは、「ＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
前記第２の可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂをさらに含んでなり、式中、
－ＦＲ１－ｂは、「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩ」配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ２－ｂは、「ＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＩＹ」配列番号８８のアミノ酸配列、または配列番号８８と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ３－ｂは、「ＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦ」配列番号８９のアミノ酸配列、または配列番号８９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または
－ＦＲ４－ｂは、「ＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９０と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
一実施形態では、前記第１の可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－ａは、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴ」配列番号８３のアミノ酸配列、または配列番号８３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
－ＦＲ２－ａは、「ＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹ」配列番号８４のアミノ酸配列、または配列番号８４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ３－ａは、「ＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦ」配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ４－ａは、「ＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
前記第２の可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－ｂは、「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩ」配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ２－ｂは、「ＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＩＹ」配列番号８８のアミノ酸配列、または配列番号８８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ３－ｂは、「ＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦ」配列番号８９のアミノ酸配列、または配列番号８９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり；または
－ＦＲ４－ｂは、「ＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
一実施形態では、前記第１の可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－ａは、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴ」配列番号８３のアミノ酸配列、または配列番号８３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ２－ａは、「ＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹ」配列番号８４のアミノ酸配列、または配列番号８４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ３－ａは、「ＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦ」配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ４－ａは、「ＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
前記第２の可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂをさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－ｂは、「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩ」配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ２－ｂは、「ＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＩＹ」配列番号８８のアミノ酸配列、または配列番号８８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ３－ｂは、「ＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦ」配列番号８９のアミノ酸配列、または配列番号８９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり；または
－ＦＲ４－ｂは、「ＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、例えば、本明細書で上に記載されるα定常ドメインおよび／またはβ定常ドメイン、またはγおよび／またはδ定常ドメインなどの定常ドメインをさらに含んでなる。好ましくは、αおよびβ定常ドメインおよび／またはγおよびδ定常ドメインは、天然ＴＣＲには存在しないさらなる変異を含んでなり、２つの遺伝子組換え鎖、すなわちαおよびβ鎖の対合を増強する。例えば、ＴＲＡＣの４８位およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２の５７位が、システイン残基によって置換されてもよい。このような修飾のさらなる例は、上に記載されている。本発明の抗原結合タンパク質に含まれるα定常ドメインおよびβ定常ドメインの例は、配列番号８（ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のα定常ドメイン）および配列番号１５（ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のβ定常ドメイン）である。
一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、例えば、少なくとも１つのα可変ドメインおよび１つのβ可変ドメインを含んでなる分子（α／βＴＣＲ）、または少なくとも１つのγ可変ドメインまたはδ可変ドメインを含んでなる分子などの本明細書で上に定義されるＴＣＲ分子を含んでなる。換言すれば、このようなＴＣＲは、ヘテロ二量体分子、すなわちα／βおよびγ／δヘテロ二量体である。
養子細胞療法（ＡＣＴ）で使用するために、α／βまたはγ／δヘテロ二量体ＴＣＲは、細胞質ドメインと膜貫通ドメインの双方を有する完全長鎖として、患者のＴ細胞に形質移入されてもよい。定常ドメインは、適切な変異、すなわちジスルフィド結合を含んでなって、所望の遺伝子組換えα／βまたはγ／δ鎖の対合を改善し、内在性α／βまたはγ／δとそれぞれの遺伝子組換え鎖との対合を低減してもよい。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、例えば、本明細書で上に記載されるα定常ドメインおよび／またはβ定常ドメインなどの定常ドメインをさらに含んでなる。好ましくは、αおよびβ定常ドメインは、天然ＴＣＲには存在しないさらなる変異を含んでなって、２つの鎖、すなわち、それぞれαおよびβ鎖、またはγおよびδ鎖の対合を増強する。例えば、ＴＲＡＣの４８位およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２の５７位が、システイン残基によって置換される。本発明の抗原結合タンパク質に含まれるα定常ドメインおよびβ定常ドメインの例は、配列番号８（ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のα定常ドメイン）および配列番号１５（ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のβ定常ドメイン）である。
好ましい実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、およびＣＤＲ３αを含んでなる、α可変ドメインを含んでなり、定常ドメインをさらに含んでなるα鎖と；ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、ＣＤＲ３βを含んでなる、β可変ドメインを含んでなり、β定常ドメインをさらに含んでなるβ鎖とを含んでなる。さらなる好ましい実施形態では、α可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなり、その中では、ＣＤＲａ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ３は、配列番号３５、３６、３７、３８、３９のアミノ酸配列、好ましくは配列番号３５、３６、３７、３８のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号３５などの配列番号３５および３８アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり；β可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含んでなり、その中では、ＣＤＲｂ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲｂ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲｂ３は、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
好ましい実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、およびＣＤＲ３αを含んでなる、α可変ドメインを含んでなり、定常ドメインをさらに含んでなるα鎖と；ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、ＣＤＲ３βを含んでなる、β可変ドメインを含んでなり、β定常ドメインをさらに含んでなるβ鎖とを含んでなる。さらなる好ましい実施形態では、α可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなり、その中では、ＣＤＲａ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ３は、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、β可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含んでなり、その中では、ＣＤＲｂ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲｂ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲｂ３は、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
別の好ましい実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、およびＣＤＲ３αを含んでなる、α可変ドメインを含んでなり、定常ドメインをさらに含んでなるα鎖と；ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、ＣＤＲ３βを含んでなる、β可変ドメインを含んでなり、β定常ドメインをさらに含んでなるβ鎖とを含んでなる。さらなる好ましい実施形態では、α可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなり、その中では、ＣＤＲａ１は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、β可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３を含んでなり、その中では、ＣＤＲｂ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲｂ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲｂ３は、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
別の好ましい実施形態では、ＴＣＲの可変αおよびβドメインは、それぞれ、αフレームワーク領域およびβフレームワーク領域をさらに含んでなる。
一実施形態では、前記第１のα可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａをさらに含んでなり、その中では、ＦＲ１－ａは、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴ」配列番号８３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＦＲ２－ａは、「ＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹ」配列番号８４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＦＲ３－ａは、「ＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦ」配列番号８５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＦＲ４－ａは、「ＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号８６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
前記第２のβ可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂをさらに含んでなり、その中では、ＦＲ１－ｂは、「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩ」配列番号８７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＦＲ２－ｂは、「ＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＩＹ」配列番号８８のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＦＲ３－ｂは、「ＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦ」配列番号８９のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、またはＦＲ４－ｂは、「ＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号９０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
別の好ましい実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも８５％、９０％または９５％と同一である配列を含んでなるかまたはそれからなる定常ドメインをさらに含んでなる、上記で定義された可変ドメインのいずれかを含んでなり；β定常ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５と少なくとも８５％、９０％または９５％同一である配列を含んでなるかまたはそれからなる。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質の変異型が想定され、本明細書で上に「定義」の項で定義される「参照配列と少なくとも８５％同一である」という表現を用いて、明示的に言及される。例えば、配列ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａ、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂは、適切な場合は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、特に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換によって、および／またはカノニカル残基との置換によって、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、および配列番号９０の参照配列と異なってもよい。特に、第１および第２の可変ドメインの配列ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａ、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂは、保存的アミノ酸置換のみによって、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６，配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、および配列番号９０の参照配列と異なってもよい。
本発明の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列、および対応するＤＮＡ配列にそれぞれ修飾および変更が加えられてもよく、それでもなお、望ましい特性を有する機能的抗原結合タンパク質またはポリペプチドが帰結する。修飾は、第１または第２の可変ドメイン、特にフレームワーク領域、または各ＣＤＲ、または第１および／または第２の可変ドメインに含まれる全てのＣＤＲに加えられてもよい。
本発明の発明者らはさらに、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のフレームワーク領域を使用することによって、抗原結合タンパク質のフレームワーク領域における特定のアミノ酸置換が有利な効果を有することを発見した。特に、アミノ酸置換Ｓ１９ＡまたはＳ１９Ｖ、好ましくはＳ１９Ｖは、可溶性一本鎖ＴＣＲコンストラクトの発現に決定的に重要であり、それに加えて、その第の２アミノ酸位置のＹ（すなわち、ＩＭＧＴによるアミノ酸５７）を含んでなるＣＤＲａ２アミノ酸配列は、ＣＤＲａ２中のＹ（５７Ｙ）である。さらに、本発明者らは、ＦＲ２－ａ中のアミノ酸置換Ａ４８Ｋ、Ｌ５０Ｐ、ＦＲ２－ｂ中のアミノ酸置換Ｍ４６Ｐ、Ｍ４７Ｇを単独または組み合わせて使用することで、本発明の可溶性抗原結合タンパク質の発現収量が増加することを発見した。本発明者らはまた、ＦＲ２－ｂ中のＩ５４Ｆが、可溶性抗原結合タンパク質の発現収量を増加させ、特にＩＭＧＴによる１０９位にＤを含んでなるＣＤＲｂ３アミノ酸配列に加えて、可溶性抗原結合タンパク質の安定性を増加させることを示した。さらに、本発明者らは、ＦＲ２－ｂ中のＩ５４Ｆ置換が、可溶性抗原結合タンパク質の特異性を有意に改善することを見いだした。
したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、
－ＦＲ１－ａの１９位でのアミノ酸置換（前記アミノ酸置換は、好ましくはＳ１９Ａ、Ｓ１９Ｖ、より好ましくはＳ１９Ｖである）、
－ＦＲ２－ａの４８および／または５０位でのアミノ酸置換（前記４８位でのアミノ酸置換は、好ましくはＡ４８Ｋであり、前記５０位でのアミノ酸置換は、好ましくはＬ５０Ｐである）、
－ＦＲ２－ｂの４６、４７および／または５４位でのアミノ酸置換（前記４６、４７および／または５４位でのアミノ酸置換は、好ましくはそれぞれＭ４６Ｐ、Ｍ４７Ｇ、およびＩ５４Ｆであり、上記で定義されるＣＤＲｂ３アミノ酸配列が１０９位のアミノ酸１０９Ｄを含んでなる場合には、前記５４位のアミノ酸は、好ましくはＩ５４Ｆである）、
－ＦＲ３－ｂの６６位でのアミノ酸置換（前記６６位でのアミノ酸置換は、好ましくはＩ６６Ｃであり、上記で定義されるＣＤＲｂ２アミノ酸配列が５７位のアミノ酸５７Ｃを含んでなる場合には、前記６６位のアミノ酸は、好ましくは６６Ｃである）
を含んでなるアミノ酸置換の群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０など、より好ましくは３または４などの１～５、２～５個のアミノ酸置換を含んでなり、
その中では、置換の位置は、ＩＭＧＴ命名法に従って付与され、その中では、任意選択的に、前記アミノ酸置換は、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５の対応するフレームワークアミノ酸配列のアミノ酸配列と比較して与えられる。
好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、アミノ酸置換Ｓ１９Ｖ、Ａ４８Ｋ、およびＩ５４ＦまたはＳ１９Ｖ、Ａ４８Ｋ、好ましくはＳ１９Ｖ、Ａ４８Ｋ、およびＩ５４Ｆを含んでなリ、その中では、置換の位置は、ＩＭＧＴの命名法に従って付与される。一実施形態では、前記アミノ酸置換の組み合わせは、有利には、アミノ酸配列「ＣＡＳＲＡＸ１ＴＧＥＬＦＦ」配列番号８２を含んでなるかまたはそれからなるＣＤＲｂ３と、さらに組み合わされ、その中では、Ｘ１はＤであり、またはＩＭＧＴ番号付けによれば、その中では、ＣＤＲｂ３アミノ酸は、１０９位にアミノ酸１０９Ｄを含んでなる。さらなる好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、アミノ酸置換Ｉ６６Ｃをさらに含んでなり、その中では、好ましくは、ＦＲ３－ｂは、上記で定義されるＣＤＲｂ２アミノ酸配列が位置５７にアミノ酸５７Ｃを含んでなる場合、アミノ酸置換Ｉ６６Ｃを含んでなる。
したがって、一実施形態では、前記第１の可変ドメインは、１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくはＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される全てのフレームワーク領域をさらに含んでなり、その中では、
－ＦＲ１－ａが、「ＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹ」配列番号９１のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも８５％と同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは配列番号８５と少なくとも９１％同一である前記アミノ酸配列が、アミノ酸１９Ｖ（配列番号９１中で下線が引かれている）を含んでなり、
－ＦＲ２－ａが、「ＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹ」配列番号９２のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは配列番号８５と少なくとも９２％同一である前記アミノ酸配列が、アミノ酸４８Ｋ（配列番号９２中で下線が引かれている）と、任意選択的に５０位でのアミノ酸置換、好ましくはＬ５０Ｐとを含んでなり、
－ＦＲ３－ａが、「ＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦ」配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ４－ａは、「ＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
前記第２の可変ドメインが、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、
－ＦＲ１－ｂは、「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩ」配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
－ＦＲ２－ｂは、「ＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹ」配列番号９３のアミノ酸配列、または配列番号９３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは前記アミノ酸配列は、アミノ酸５４Ｆと、任意選択的に４６および／または４７位でのアミノ酸置換とを含んでなる配列番号９３と少なくとも８５％と同一であり、その中では、前記４６および／または４７位でのアミノ酸置換は、好ましくはそれぞれ、Ｍ４６Ｐおよび／またはＭ４７Ｇであり、
－ＦＲ３－ｂは、「ＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦ」配列番号８９のアミノ酸配列、または配列番号８９と少なくとも８５％と同一であるアミノ酸配列、または「ＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦ」配列番号９４のアミノ酸配列または配列番号９４と少なくとも８５％と同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、その中では、好ましくは前記アミノ酸配列は、アミノ酸６６Ｃを含んでなる配列番号９４と少なくとも８５％同一であり、上記で定義されるＣＤＲｂ２アミノ酸配列が５７位のアミノ酸５７Ｃを含んでなる場合には、好ましくは配列番号９４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＦＲ３－ｂが、アミノ酸６６Ｃを含んでなり、
－ＦＲ４－ｂは、「ＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９０と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質の変異型が想定され、本明細書で上に「定義」の項で定義される「参照配列と少なくとも８５％同一である」という表現を用いて、明示的に言及される。例えば、配列ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａ、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂは、適切な場合は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、特に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換によって、および／またはカノニカル残基との置換によって、配列番号９１、配列番号９２、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９３および配列番号８９または配列番号９４、配列番号９０の参照配列と異なってもよい。特に、第１および第２の可変ドメインの配列ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａ、およびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂは、保存的アミノ酸置換のみによって、配列番号９１、配列番号９２、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９３および配列番号８９または配列番号９４、配列番号９０の参照配列と異なってもよい。
本発明の抗原結合タンパク質のアミノ酸配列、および対応するそれらをコード化するＤＮＡ配列に、修飾および変更が加えられてもよく、それでもなお、望ましい特性を有する機能的抗原結合タンパク質またはポリペプチドが帰結する。
したがって、一実施形態では、本発明は、以下を含んでなる抗原結合タンパク質に言及する：
（ｉ）「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹＩＦＳＮＭＤＭＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号１１８、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹＩＦＳＮＭＤＭＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＦＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号１１９、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹＩＦＳＮＭＤＭＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＦＮＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号１２０、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹＩＦＳＮＭＤＭＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＦＳＳＡＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号１２１、「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＳＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＡＧＬＱＬＬＴＹＩＦＳＮＭＤＭＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＡＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号１２２、好ましくは配列番号１１８および配列番号１２１、より好ましくは配列番号１１８、または配列番号１１８～１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列（式中、配列番号１１８～１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列が、配列番号１１８～１２２の場合には、好ましくは、配列番号５のＣＤＲａ１、配列番号６のＣＤＲａ２、および配列番号３５、３６、３７、３８、３９のＣＤＲａ３のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなる）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも８５％と同一であるアミノ酸配列を含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる、第２のポリペプチド鎖（式中、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％と同一である前記アミノ酸配列は、好ましくは配列番号１２、１３、および１４のＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなる）、または
（ｉｉｉ）好ましくは、アミノ酸配列「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号１５１または「ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＥＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰ」配列番号１５２を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、または配列番号１５１または１５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列（式中、好ましくは、配列番号１５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは配列番号５のＣＤＲａ１、配列番号５６のＣＤＲａ２、および配列番号３５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、式中、好ましくは、配列番号１５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号５５のＣＤＲａ１、配列番号５６のＣＤＲａ２、および配列番号３５のＣＤＲａ３のアミノ酸配列を含んでなり、好ましくはアミノ酸１９Ｖおよび／または４８Ｋをさらに含んでなる）、
（ｉｖ）アミノ酸配列「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＮＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号１４９または「ＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬ」配列番号１５０を含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる第２のポリペプチド鎖（式中、好ましくは、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、好ましくは配列番号６２のＣＤＲｂ１、配列番号６５のＣＤＲｂ２、および配列番号１４のＣＤＲｂ３のアミノ酸配列を含んでなり、式中、好ましくは、配列番号１５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列は、配列番号６２のＣＤＲｂ１、配列番号６５のＣＤＲｂ２、および配列番号７１のＣＤＲｂ３のアミノ酸配列を含んでなり、好ましくはアミノ酸５４Ｆおよび／または６６Ｃをさらに含んでなる）。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体またはその断片、または二重特異性抗体またはその断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片、または二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片である。抗体、ＴＣＲ、およびそれぞれの断片は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト起源であり、これは、ヒト抗原遺伝子座から生成され、したがって、ヒト配列、特にヒトＴＣＲまたは抗体配列を含んでなるものと理解される。
一実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、特に共有結合を介して共に連結される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、可溶性タンパク質である。
「共有結合」、「リンカー配列」または「ポリペプチドリンカー」は、本明細書で上に「定義」の項で定義される（「リンカー」を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、以下の１つまたは複数をさらに含んでなる：
（ｉ）１つまたは複数のさらなる抗原結合部位；
（ｉｉ）任意選択的に細胞質シグナル伝達領域を含む膜貫通領域、
（ｉｉｉ）診断薬；
（ｉｖ）治療薬；または
（ｖ）ＰＫ修飾部分。
当業者に知られているように、例えば、抗体の文脈における抗原結合部位は、典型的には、抗原に結合する６つのＣＤＲによって形成される。
本発明の文脈において、本明細書で上に（ｉ）で言及される１つまたは複数のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、抗原ＣＤ０（ＣＤ１γ、ＣＤ２δ、およびＣＤ２ε鎖など）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ７Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／βおよびＴＣＲγ／δ、ＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される抗原に、またはエフェクター細胞の抗原、好ましくはＣＤ３、ＴＣＲα／βまたはＣＤ２８、より好ましくはＣＤ３およびＴＣＲα／βに、結合する結合部位から選択される。
「ＣＤ３」および「ＣＤ２８」は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）で言及される１つまたは複数のさらなる抗原結合部位の１つは、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に結合できる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３Ｔ細胞共受容体との複合体中にある。
好ましい実施形態では、（ｉ）で言及される１つまたは複数のさらなる抗原結合部位の１つは、ＴＣＲα／βに結合できる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体は、ＣＤ３Ｔ細胞共受容体である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、ＣＤ５またはＣＤ９５である。
「ＣＤ１３４」、「４－１ＢＢ」、「ＣＤ５」、「ＣＤ９５」、および「ＮＫ細胞特異的受容体分子」は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。「膜貫通領域」、「細胞質シグナル伝達領域」、「診断薬」、「治療薬」、および「ＰＫ修飾部分」は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、直接、または切断可能または切断不能なリンカーを介して、少なくとも１つの増殖阻害剤に共有結合する。このような少なくとも１つの増殖阻害剤が付着する抗原結合タンパク質はまた、コンジュゲートと称されることもある。
例えば、免疫コンジュゲートなどのこのようなコンジュゲートの調製は、国際公開第２００４／０９１６６８号パンフレット、またはＨｕｄｅｃｚ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：２０９－２２３（２００５）、およびＫｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．４４（１５）：５４０５－５４１５（２００５）に記載され、当業者によって、このような少なくとも１つの増殖阻害剤が付着した本発明の抗原結合タンパク質の調製に移行されてもよい。
少なくとも１つの増殖阻害剤の付着の文脈における「リンカー」は、ポリペプチドを薬物部分に共有結合的に付着させる、共有結合または原子の鎖を含んでなる化学部分を意味する。
コンジュゲートは、インビトロ法によって調製されてもよい。結合基を使用して、薬物またはプロドラッグが抗体に結合される。適切な連結基は当該技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基、およびエステラーゼ不安定基が挙げられる。本発明の抗原結合タンパク質と細胞傷害剤または増殖阻害剤との結合は、Ｎ－スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）、ブタン酸４－［（５－ニトロ－２－ピリジニル）ジチオ］－２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルエステル（ニトロ－ＳＰＤＢ）、４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）－２－スルホ－酪酸（スルホ－ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）－ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）をはじめとするが、これらに限定されるものではない、様々な二機能性タンパク質結合剤を使用して行われてもよい。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ（１９８７）に記載されたように調製され得る。炭素標識された１－イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合させるための例示的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号パンフレット）。
リンカーは、細胞内の細胞傷害剤または増殖阻害剤の放出を促進する「切断可なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、エステラーゼ不安定リンカー、光不安定リンカー、またはジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照されたい）が使用されてもよい。リンカーはまた、場合によっては、より良好な耐性をもたらすかもしれないる「切断不能リンカー」（例えば、ＳＭＣＣリンカー）であってもよい。
代案としては、本発明の抗体および細胞傷害性または増殖阻害ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質は、組換え技術またはペプチド合成によって生成されてもよい。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコード化する領域によって分離されている、コンジュゲートの２つの部分をコードする、それぞれの領域を含んでなってもよい。
本発明の抗原結合タンパク質はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号パンフレットを参照されたい）を活性抗がん剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に、ポリペプチドをコンジュゲートすることによって、依存性酵素媒介プロドラッグ療法で使用されてもよい（例えば、国際公開第８８／０７３７８号パンフレットおよび米国特許第４，９７５，２７８号明細書を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、酵素、サイトカイン（ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５などの）、ナノキャリア、または核酸の１つまたは複数をさらに含んでなる。
好ましい一実施形態では、抗原結合タンパク質は二重特異性である。二重特異性抗原結合タンパク質はまた、本明細書で「二重特異性分子」と称される。
多くの異なる二重特異性形態が当該技術分野で記載され、本明細書で上に「形態」の下の「定義」の項に記載される。異なる形態のタンパク質を生成するための技術もまた、対応する項で引用される当該技術分野で開示されており、したがって当業者は、本発明の文脈で定義されるＣＤＲまたは可変ドメインを本明細書で開示された形態で容易に使用できる。ｓｃＴＣＲなどの抗原結合タンパク質またはＴＣＥＲ（商標）などの可溶性二重特異性結合タンパク質の生成は、本明細書の実施例の項でも開示される。ＤＶＤ形態の場合のように、軽鎖および重鎖可変ドメインが平行配向であってもよく、αおよびβ可変ドメインが平行配向であってもよく、またはＣＯＤＶ形態の場合のように、軽鎖および重鎖の可変ドメインが交差配向であってもよく、αおよびβ可変ドメインが交差配向であってもよいことは、当業者であれば理解できるであろう。
したがって、本発明は、２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなる抗原結合タンパク質にさらに言及し、
その中では、第１のポリペプチド鎖は、式、
Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を有し、
式中、Ｖ３は第３の可変ドメインであり；Ｖ４は第４の可変ドメインであり；Ｌ１およびＬ２はリンカーであり；Ｌ２は存在してもまたは存在しなくてもよく；ＣＬは軽鎖定常ドメインまたはその一部であって存在しまたは存在せず；
その中では、第２のポリペプチド鎖は、式、
Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
によって表わされる構造を有し、
式中、Ｖ５は第５の可変ドメインであり；Ｖ６は第６の可変ドメインであり；
Ｌ３およびＬ４はリンカーであり；Ｌ４は存在してもまたは存在しなくてもよく；ＣＨ１は重鎖定常ドメイン１またはその一部であって存在しまたは存在せず；式中、
Ｖ３またはＶ４は、本明細書で上に定義される第１の可変ドメインであってＶ５またはＶ６は、本明細書で上に定義される第２の可変ドメインであり、または
Ｖ５またはＶ６は本発明の文脈で定義される第１の可変ドメインであってＶ３またはＶ４は本明細書で上に定義される第２の可変ドメインであり、式中、
Ｖ３は本明細書で上に定義される第１の可変ドメインであってＶ５は第２の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
Ｖ３は本明細書で上に定義される第２の可変ドメインであってＶ５は第１の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
Ｖ３は本明細書で上に定義される第１の可変ドメインであってＶ６は第２の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、または
Ｖ３は本明細書で上に定義される第２の可変ドメインであってＶ６は第１の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、
Ｖ４は本明細書で上に定義される第１の可変ドメインであってＶ５は第２の可変ドメインであり、Ｖ３は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ３は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
Ｖ４は本明細書で上に定義される第２の可変ドメインであってＶ５は第１の可変ドメインであり、Ｖ３は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、または
Ｖ３は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、
その中では、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインは一緒に１つの抗原結合部位Ｂを形成し、その中では、本明細書で上に定義される第１および第２の可変ドメインは、１つの抗原結合部位Ａを形成する。リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。しかしいくつかの実施形態では、いくつかのリンカーの長さは、特定の形態にとって好ましいかもしれない。しかし、リンカーの長さおよびそれらのアミノ酸配列に関する知識は、当該技術分野の一般知識に属し、異なる形態のリンカー、ならびにリンカーおよびアミノ酸の配列は、最新技術の一部であり、本明細書で上記に引用した開示に開示される。
本明細書で上に定義される第１および第２の可変ドメインを形成する抗原結合部位Ａが、本発明の文脈で本明細書に記載されるようなＭＡＧＥ－Ａペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合することは、当業者であれば理解できるであろう。
好ましい実施形態では、Ｖ３は本発明の文脈で定義される第１の可変ドメインであってＶ６は第２の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、または
Ｖ３は本発明の文脈で定義される第１の可変ドメインであってＶ６は第２の可変ドメインであり、Ｖ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインである。
一実施形態では、式［Ｉ］のポリペプチドは、Ｃ末端に式［Ｉ］のポリペプチド、リンカー（Ｌ５）、およびＦｃドメインまたはその一部をさらに含んでなり、および／またはその中では、式［ＩＩ］のポリペプチドは、Ｃ末端に式［ＩＩ］のポリペプチド、リンカー（Ｌ６）、およびＦｃドメインまたはその一部をさらに含んでなる。
Ｆｃドメインは、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合部位（ＡおよびＢ）を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなり、
その中では、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］、
Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］
によって表わされる構造を有し、
その中では、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］、
Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－ＦＣ２［ＩＶ］
によって表わされる構造を有し、
式中、Ｖ３、Ｌ１、Ｖ４、Ｌ２、ＣＬ、Ｖ５、Ｌ３、Ｖ６、Ｌ４、ＣＨ１は、本明細書で上に定義されるようであり、式中、Ｌ５およびＬ６は存在するかまたは存在しないリンカーであり、式中、ＦＣ１およびＦＣ２は、Ｆｃドメインであり、式中、ＦＣ１およびＦＣ２は、同じかまたは異なり、好ましくは異なる。Ｆｃドメインは、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
一実施形態では、ＦＣ１は、配列番号１１３（ホール）のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＦＣ２は、配列番号１１２（ノブ）のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、逆もまた同様であり、
より好ましくはＶ４またはＶ３が重鎖可変ドメインである場合、ＦＣ１は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じてＶ５またはＶ６が軽鎖可変ドメインである場合、ＦＣ２は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または
Ｖ４またはＶ３が軽鎖可変ドメインである場合、ＦＣ１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じて、Ｖ５またはＶ６が重鎖可変ドメインである場合、ＦＣ２は配列番号１１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
一実施形態では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ＣＤ３（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖など）、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／βおよびＴＣＲγ／δ、ＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される抗原に結合する１つの結合部位Ｂを一緒に形成し、および／またはエフェクター細胞に結合する。
さらなる実施形態では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に結合する１つの結合部位を一緒に形成し、その中では、Ｔ細胞特異的受容体分子およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
一実施形態では、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１５４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１５６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１５８のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５９のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１６０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１６２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１６４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
好ましくは、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１５４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１５６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５９のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１６０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１６２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または、軽鎖可変ドメインは配列番号１５３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１６４のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、より好ましくは、軽鎖可変ドメインは配列番号１５９のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、重鎖可変ドメインは配列番号１６０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる。
実施例からから分かるように、本発明の発明者は、本発明の文脈で定義されるＣＤＲ、より具体的には本明細書で上に定義される可変ドメインをＴＣＥＲ（商標）形態で使用することを原理の証明として実証した（実施例）。
したがって、好ましい一実施形態では、抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなり、
その中では、１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＩＩ］、
Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］
によって表わされる構造を有し、
１つのポリペプチド鎖は、式［ＩＶ］、
Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－ＦＣ２［ＩＶ］
によって表わされる構造を有し、
式中、Ｌ２、ＣＬ、Ｌ５およびＬ４、ＣＨ１、Ｌ６は存在せず
式中、Ｖ３、Ｌ１、Ｖ４、Ｖ５、Ｌ３、Ｖ６は本明細書で上に定義されるようであり、
好ましくは、Ｖ３は本発明の文脈で定義される第１の可変ドメインであってＶ６は第２の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、または好ましくは、Ｖ３は本発明の文脈で定義される第１の可変ドメインであってＶ６は第２の可変ドメインであり、Ｖ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、
好ましくは、Ｌ１およびＬ３は、（配列番号９６）のアミノ酸配列「ＧＧＧＳＧＧＧＧ」を含んでなるかまたはそれからなり、
好ましくはＦＣ１は配列番号１１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、ＦＣ２は配列番号１１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、逆もまた同様であり、
より好ましくは、Ｖ４が重鎖可変ドメインである場合、ＦＣ１は配列番号１１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じて、Ｖ５が軽鎖可変ドメインである場合、ＦＣ２は配列番号１１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、または
より好ましくは、Ｖ４が軽鎖可変ドメインである場合、ＦＣ１は配列番号１１２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、それに応じて、Ｖ５が重鎖可変ドメインである場合、ＦＣ２は配列番号１１３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインは、好ましくは、ＣＤ３、ＴＣＲα／βまたはＣＤ２８、より好ましくはＣＤ３またはＴＣＲα／βである、本明細書で上に定義される抗原に結合する１つの抗原結合部位を一緒に形成し、
その中では、第１および第２の可変ドメインは、本発明の文脈で定義されるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合する、１つの抗原結合部位を形成する。
この実施形態の抗原結合タンパク質は、二重特異性ＴＣＲ、またはＦｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二重特異性抗体と称されることもある。この実施形態の抗原結合タンパク質はまた、ＴＣＥＲ（商標）と称されることもある。
「ＴＣＥＲ（商標）」は、本発明の文脈で定義される第１および第２の可変ドメインの２つの抗原結合ドメインと、リクルーターとも称される抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインによって形成されるさらなる抗原結合ドメインとを含んでなる、可溶性抗原結合タンパク質である、二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、ＣＤ３に対する、およびＴＣＲα／βに対する、可変軽鎖および重鎖可変ドメインなどがある。
好ましい一実施形態では、ＴＣＥＲ（商標）などの抗原結合タンパク質は、以下を含んでなる：
－アミノ酸配列（配列番号１３５）：ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＳＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＡＥＫＦＱＧＲＶＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＥＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］の１つの第１のポリペプチド
（式中、Ｌ２、ＣＬ、Ｌ５は存在せず、配列番号１３８のＶ３（α可変ドメインに由来する成熟ＴＣＲ）（配列番号５、配列番号５９、および配列番号３５のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３を太字で示す）、配列番号９６のＬ１（下線付き）、配列番号１６０のＶ４（抗ＴＣＲαβＶＨ）、および配列番号１１３のＦＣ１（斜体および下線付き）を含んでなる）；
－アミノ酸配列（配列番号１３６）：
ＱＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＳＧＧＧＧＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の１つの第２のポリペプチド
（式中、Ｌ４、ＣＨ１、Ｌ６は存在せず、配列番号１５９のＶ５（抗ＴＣＲαβＶＬ）、配列番号９６のＬ３（下線付き）、配列番号１５０（配列番号６２、配列番号６５、配列番号７１のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３を太字で示す）のＶ６（β可変ドメインに由来するＴＣＲ）、および配列番号１１２のＦＣ２（斜体および下線付き）を含んでなり、式中、ＦＣ１およびＦＣ２配列は、システインを介して軽鎖を連結する必要がないため、システインからセリンへのアミノ酸置換（太字で示されるＳ）、Ｆｃγ受容体相互作用を無効化するＩｇＧ２ヒンジに類似したＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸置換（ＰＶＡは２３３～２３５および３３１Ｓの位置に太字で示される）、Ｆｃ部分のＮ－グリコシル化部位を除去してＦｃγ受容体間の相互作用を無効化するＮ２９７Ｑアミノ酸置換（太字のＱ）、さらにＦＣ１の場合はホール変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）、およびＦＣ２の場合はノブ変異（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を含んでなる）。したがって、好ましい一実施形態では、ＦＣ１は配列番号１１３であり、ＦＣ２は配列番号１１２である。
別の好ましい実施形態では、ＴＣＥＲ（商標）などの抗原結合タンパク質は、以下を含んでなる：
アミノ酸配列（配列番号１３６）：
ＱＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＳＧＧＧＧＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］の１つの第１のポリペプチド
（式中、Ｌ２、ＣＬ、Ｌ５は存在せず、配列番号１５９のＶ３（抗ＴＣＲαβＶＬ）、配列番号９６のＬ１（下線付き）、配列番号１５０のＶ４（β可変ドメインに由来するＴＣＲ）（配列番号６２、配列番号６５、配列番号７１のＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、ＣＤＲｂ３を太字で示す）、および配列番号１１２のＦＣ１（斜体および下線付き）を含んでなる）；
アミノ酸配列（配列番号１３７）：
ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰＧＧＧＳＧＧＧＧＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＡＥＫＦＱＧＲＶＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＥＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－ＦＣ２［ＩＶ］の１つの第２のポリペプチド
（式中、Ｌ４、ＣＨ１、Ｌ６は存在せず、配列番号１５１のＶ５（α可変ドメインに由来する成熟ＴＣＲ）（配列番号５、配列番号５６、および配列番号３５のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３を太字で示す）、配列番号９６のＬ３（下線付き）、配列番号１６０のＶ６（抗ＴＣＲαβＶＨ）、および配列番号１１３のＦＣ２（斜体および下線付き）を含んでなり、
式中、ＦＣ１およびＦＣ２配列は、システインを介して軽鎖を連結する必要がないため、システインからセリンへのアミノ酸置換（太字で示されるＳ）、Ｆｃγ受容体相互作用を無効化するＩｇＧ２ヒンジに類似したＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸置換（ＰＶＡは２３３～２３５および３３１Ｓの位置に太字で示される）、Ｆｃ部分のＮ－グリコシル化部位を除去してＦｃγ受容体間の相互作用を無効化するＮ２９７Ｑアミノ酸置換（太字のＱ）、さらにＦＣ２の場合はホール変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）、およびＦＣ１の場合はノブ変異（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を含んでなる）。したがって、好ましい一実施形態では、ＦＣ１は配列番号１１２であり、ＦＣ２は配列番号１１３である。
別の好ましい実施形態では、ＴＣＥＲ（商標）などの抗原結合タンパク質は、以下を含んでなる：
アミノ酸配列（配列番号１３１）：
ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＤＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰＧＧＧＳＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＱＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］の１つの第１のポリペプチド
（式中、Ｌ２、ＣＬ、Ｌ５は存在せず、配列番号１５１のＶ３（α可変ドメインに由来する成熟ＴＣＲ）（配列番号５、配列番号５６、および配列番号３５のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３を太字で示す）、配列番号９６のＬ１（下線付き）、配列番号１５３のＶ４（抗ＴＣＲαβＶＬ）、および配列番号１１２のＦＣ１（斜体および下線付き）；
アミノ酸配列（配列番号１３０）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＡＱＫＦＱＤＲＶＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－ＦＣ２［ＩＶ］の１つの第２のポリペプチド
（式中、Ｌ４、ＣＨ１、Ｌ６は存在せず、配列番号１５４のＶ５（抗ＴＣＲαβＶＬ）、配列番号９６のＬ３（下線付き）、配列番号１５１のＶ６（β可変ドメインに由来するＴＣＲ）（配列番号６２、配列番号６５、配列番号７１のＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、ＣＤＲｂ３を太字で示す）、および配列番号１１３のＦＣ２（斜体および下線付き）を含んでなり、
式中、ＦＣ１およびＦＣ２配列は、システインを介して軽鎖を連結する必要がないため、システインからセリンへのアミノ酸置換（太字で示されるＳ）、Ｆｃγ受容体相互作用を無効化するＩｇＧ２ヒンジに類似したＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸置換（ＰＶＡは２３３～２３５および３３１Ｓの位置に太字で示される）、Ｆｃ部分のＮ－グリコシル化部位を除去してＦｃγ受容体間の相互作用を無効化するＮ２９７Ｑアミノ酸置換（太字のＱ）、さらにＦＣ２の場合はホール変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）、およびＦＣ１の場合はノブ変異（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を含んでなる）。したがって、好ましい一実施形態では、ＦＣ１は配列番号１１２であり、ＦＣ２は配列番号１１３である。
別の好ましい実施形態では、ＴＣＥＲ（商標）などの抗原結合タンパク質は、以下を含んでなる：
アミノ酸配列（配列番号１３３）：ＥＤＶＥＱＳＬＦＬＳＶＲＥＧＤＳＶＶＩＮＣＴＹＴＥＳＳＳＴＹＬＹＷＹＫＱＥＰＧＫＧＬＱＬＬＴＹＩＹＳＳＱＤＱＫＱＤＱＲＬＴＶＬＬＮＫＫＤＫＨＬＳＬＲＩＡＤＴＱＴＧＤＳＡＩＹＦＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦＧＳＧＴＲＬＳＩＲＰＧＧＧＳＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＱＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド
（式中、Ｌ２、ＣＬ、Ｌ５は存在せず、配列番号１５２のＶ３（α可変ドメインに由来する成熟ＴＣＲ）（配列番号５５、配列番号５６、および配列番号３５のＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３を太字で示す）、配列番号９６のＬ１（下線付き）、配列番号１５４のＶ４（抗ＴＣＲαβＶＬ）、および配列番号１１２のＦＣ１（斜体および下線付き）を含んでなる）；
アミノ酸配列（配列番号１３０）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＡＱＫＦＱＤＲＶＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＰＧＨＤＹＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＦＹＦＣＹＧＴＰＣＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＲＡＤＴＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
の式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－ＦＣ２［ＩＶ］の１つの第２のポリペプチド
（式中、Ｌ４、ＣＨ１、Ｌ６は存在せず、配列番号１５４のＶ５（抗ＴＣＲαβＶＬ）、配列番号９６のＬ３（下線付き）、配列番号１５１のＶ６（β可変ドメインに由来するＴＣＲ）（配列番号６２、配列番号６５、配列番号７１のＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、ＣＤＲｂ３を太字で示す）、および配列番号１１３のＦＣ２（斜体および下線付き）を含んでなり、
式中、ＦＣ１およびＦＣ２配列は、システインを介して軽鎖を連結する必要がないため、システインからセリンへのアミノ酸置換（太字で示されるＳ）、Ｆｃγ受容体相互作用を無効化するＩｇＧ２ヒンジに類似したＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸置換（ＰＶＡは２３３～２３５および３３１Ｓの位置に太字で示される）、Ｆｃ部分のＮ－グリコシル化部位を除去してＦｃγ受容体間の相互作用を無効化するＮ２９７Ｑアミノ酸置換（太字のＱ）、さらにＦＣ２の場合はホール変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）、およびＦＣ１の場合はノブ変異（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を含んでなる）。したがって、好ましい一実施形態では、ＦＣ１は配列番号１１２であり、ＦＣ２は配列番号１１３である。
一実施形態では、本発明は、以下を含んでなる、抗原結合タンパク質に言及する：
ｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１２８のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｉｉｉ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｉｖ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３０のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｖ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｖｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｖｉｉ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｖｉｉｉ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１４２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｉｘ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１４２のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｘ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｘｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ１－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
ｘｉｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチド、
好ましくはｉｉｉ）～ｘｉ）、より好ましくはｉｉｉ）およびｉｖ）である。
本発明のなおもより好ましい実施形態では、配列番号１３１のアミノ酸配列からなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３０のアミノ酸配列からなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチドを含んでなる抗原結合タンパク質に言及し；または本発明は、配列番号１３３のアミノ酸配列からなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３０のアミノ酸配列からなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチドを含んでなる抗原結合タンパク質に言及し；または本発明は、配列番号１３５のアミノ酸配列からなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列からなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチドを含んでなる抗原結合タンパク質に言及し；または本発明は、配列番号１３７のアミノ酸配列からなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列からなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチドを含んでなる抗原結合タンパク質に言及し；または本発明は、配列番号１３９のアミノ酸配列からなる、式Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－Ｆｃ１［ＩＩＩ］の第１のポリペプチド、および配列番号１３６のアミノ酸配列からなる、式Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－Ｆｃ２［ＩＶ］の第２のポリペプチドを含んでなる抗原結合タンパク質に言及する。
また、エフェクター機能に関して、例えば、抗原結合タンパク質の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強または低減するように、本発明の抗原結合タンパク質を修飾することが望ましくあってもよい。これは、本発明の抗原結合タンパク質との関連で、本明細書ではＦｃ変異型とも称される、抗原結合タンパク質のＦｃ領域に、１つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって達成されてもよい。代案としては、またはそれに加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基が導入されて、この領域での鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になってもよい。このように生成されたヘテロ二量体抗原結合タンパク質は、内部移行能力の改善または減少、および／または補体媒介性細胞滅殺および／または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加を有してもよい（Ｃａｒｏｎ ＰＣ．ｅｔ ａｌ．１９９２；およびＳｈｏｐｅｓ Ｂ．１９９２）。
本発明の抗原結合タンパク質の別のタイプのアミノ酸修飾、すなわち抗原結合タンパク質に見られる１つまたは複数の炭水化物部分を削除すること、および／または抗原結合タンパク質中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することによって、抗原結合タンパク質の元来のグリコシル化パターンを変化させるのに有用であってもよい。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリン、およびアスパラギン－Ｘ－スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のどちらかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加または欠失は、好都合には、アミノ酸配列を改変して（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）、それが上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含有するようにすることによって達成される。
別のタイプの修飾は、潜在的に分解産物または抗原結合タンパク質調製物の不均一性をもたらすものとして、インシリコまたは実験的に同定された配列の除去を伴う。例として、アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの要因に応じて生じ得る。アスパラギン残基は、主にＡｓｎ－Ｇｌｙの配列で存在する場合に特に脱アミドの影響を受けやすく、Ａｓｎ－Ａｌａなどのその他のジペプチド配列ではその影響より少ない。したがって、このような脱アミド化部位、特にＡｓｎ－Ｇｌｙが、本発明の抗原結合タンパク質中に存在する場合、典型的には保存的置換によってその部位が除去され、関与する残基の１つを除去することが望ましくあってもよい。１つまたは複数の関与する残基を除去するための、配列中のこのような置換もまた、本発明に包含されることが意図される。
別のタイプの共有結合修飾は、グリコシドを抗原結合タンパク質に化学的または酵素的に共役させることを伴うこれらの手順は、Ｎ－またはＯ－結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における、抗原結合タンパク質の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリングモード次第で、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル群、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着してもよい。例えば、このような方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレットに記載される。
抗原結合タンパク質上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成されてもよい。化学的脱グリコシル化には、抗原結合タンパク質を化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物に曝露させることが必要である。この処理は、結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断をもたらすが、抗原結合タンパク質は無傷のままにする。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）およびＥｄｇｅ，ＡＳ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）によって記載される。抗体の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，ＮＲ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）によって記載されたように、様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
抗原結合タンパク質の別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，３０１，１４４号明細書、米国特許第４，６７０，４１７号明細書、米国特許第４，７９１，１９２号明細書、または米国特許第４，１７９，３３７号明細書に記載されている様式で、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの様々な非タンパク質性ポリマーの１つに抗原結合タンパク質を結合させることを含んでなる。
特定の一実施形態では、抗原結合タンパク質はＴＣＲである。特定の一実施形態では、ＴＣＲはヒトＴＣＲである。したがって、一実施形態では、前記第１の可変ドメインはＴＣＲαまたはγ鎖に含まれ；および／または式中、前記第２の可変ドメインはＴＣＲβまたはδ鎖に含まれる。一実施形態では、前記ＴＣＲはα－βヘテロ二量体であり、α鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列と、β鎖ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とを含んでなる。
以下のα鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびβ鎖ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメインは、ＴＣＲ定常ドメイン配列とも称される。一実施形態では、ＴＣＲ定常ドメイン配列は、例えば、ヒト、ラット、サル、ウサギ、ロバ、またはマウス、好ましくはヒトなどの任意の哺乳類などの任意の好適な生物種に由来してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、ＴＣＲ定常ドメイン配列は、例えば、異種配列、好ましくはマウス配列の導入によって、わずかに修飾されてもよく、それはＴＣＲの発現と安定性を高めてもよい。また、可変領域の好ましくないアミノ酸の置換および／またはＴＣＲ Ｃドメイン間のジスルフィド架橋の導入、および不対システインの除去など、現状技術（例えば、国際公開第２０１８／１０４４０７号パンフレット、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６９１５１号明細書、国際公開第２０１１／０４４１８６号パンフレット、国際公開第２０１４／０１８８６３号パンフレット）から知られている、さらなる安定化変異が導入されてもよい。
特に、ＴＣＲ定常ドメイン配列をトランケーションまたは置換によって修飾し、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然ジスルフィド結合が削除されてもよい。また、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７とをシステイン残基で置換することによって、αおよび／またはβ鎖の定常ドメイン配列が修飾されてもよく、前記システインは、ＴＣＲαおよびβ定常ドメイン間にジスルフィド結合を形成する。ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２は、定常ドメインの７５位でのシステインからアラニンへの変異、８９位でのアスパラギンからアスパラギン酸への変異をさらに含んでもよい。定常ドメインは、それに加えてまたは代案として、天然ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ１／２配列に対する、さらなる変異、置換または欠失を含有してもよい。ＴＲＢＣ１／２という用語は、例えば、ＴＲＡＣの４位でのＮからＫなどの天然多型変異型を包含する（Ｂｒａｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４ Ｆｅｂ；６（２）：２２３－３０）。
一実施形態では、ＴＣＲはキメラである。
本明細書における「キメラＴＣＲ」はＴＣＲを指し、その中では、ＴＣＲ鎖は複数の生物種からの配列を含んでなる。好ましくは、本発明の文脈におけるＴＣＲは、例えば、α鎖のヒト可変領域と、マウスＴＣＲα鎖のマウス定常領域とを含んでなる、α鎖を含んでなってもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または一本鎖二重特異性抗体である。この実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが共に共有結合し、共有結合は本明細書で上に「定義」の項で定義される。
ｓｃＴＣＲは、第１のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖）の可変領域のポリペプチドと、全（完全長）第２のＴＣＲ鎖（例えば、β鎖）のポリペプチドとを含んでなり得て、または逆もまた然りである。さらに、ｓｃＴＣＲは、任意選択的に、２つ以上のポリペプチドを主に連結する、１つまたは複数のリンカーを含んでなり得る。リンカーは、例えば、本明細書に記載されるように、２つの一本鎖を共に結合するペプチドであり得る。また、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５などのヒトサイトカインに融合された本発明のｓｃＴＣＲも提供される。
一実施形態では、前記一本鎖ＴＣＲは、Ｖα－Ｌｔ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌｔ－Ｖα、Ｖα－Ｃａ－Ｌｔ－Ｖβ、Ｖα－Ｃｂ－Ｌｔ－Ｖβ、Ｖα－Ｌｔ－Ｖβ－Ｃｂ、Ｖα－Ｌｔ－Ｖβ－Ｃａ、Ｖα－Ｃａ－Ｌｔ－Ｖβ－Ｃｂ、Ｖα－Ｃｂ－Ｌｔ－Ｖβ－Ｃａ、好ましくはＶα－Ｌｔ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌｔ－Ｖαからなる群から選択される一本鎖形態の１つである。その中では、Ｖαは本明細書で上に定義される第１の可変ドメインであり、Ｖβは本明細書で上に定義される第２の可変ドメインであり、ＣａおよびＣｂはそれぞれ存在するかまたは存在しないＴＣＲαおよびβ定常領域であり、Ｌｔは存在するかまたは存在しないリンカーであり、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
一実施形態では、このような一本鎖ＴＣＲは、Ｃ末端またはＮ末端のどちらかで連結された、少なくとも１つのさらなる可変ドメイン、好ましくは１つまたは２つのさらなる可変ドメインをさらに含んでもよい。
一実施形態ではこのようなさらなる可変ドメインは、さらなるリンカーＬｋを介して連結されてもよい。好ましい一実施形態では、リンカーＬｋは、本明細書で上に定義されるリンカーまたは配列番号１１４のアミノ酸配列のＣＨ１ヒンジ配列である。
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質、特にＴＣＲを提示する粒子、および前記粒子を粒子のライブラリ内に含めることを含む。このような粒子としては、ファージ、酵母、リボソーム、または哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような粒子およびライブラリーを生成する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、国際公開第２００４／０４４００４号パンフレット；国際公開第０１／４８１４５号パンフレット；Ｃｈｅｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３９．２：１７５－１８４を参照されたい）。
さらに、本発明の発明者らは、実施例、特に実施例３において、本発明の抗原結合タンパク質が標的抗原に結合することを実証し、すなわち、ＭＨＣタンパク質との複合体中の、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の、高い特異性を有するＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド、すなわち、抗原結合タンパク質は、同定されたエピトープに特異的に結合する。
したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合し、その中では、前記抗原ペプチドは、ＭＨＣタンパク質との複合体中にあり、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある。より詳細には、一実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの少なくとも３つまたは少なくとも４つのアミノ酸位置、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の１、５、７、および８つまたは１、３、５、７、および８つ、特に１、５、および７つからなる群から選択される、少なくとも３または４つ、好ましくは３または４つ、好ましくは３のアミノ酸位置を含んでなるかまたはそれからなる、エピトープに特異的に結合する。正確なエピトープの判定は、使用される方法と選択されたカットオフ値によってわずかに異なるかもしれない。主にアミノ酸位置１、５、および７に結合する特性のために、本発明の抗原結合タンパク質は、類似ペプチドＮＯＭＡＰ－１－０３２０、ＮＯＭＡＰ－１－１２２３、およびＯＤＣ－００１に有意に結合しない。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド変異型に有意に結合せず、その中では、位置１、５、および７の少なくとも１つ、位置１、５、７、および８の少なくとも１つ、または位置１、３、５、７、および８の少なくとも１つが置換され、好ましくはアラニンで置換される。
Ｔ細胞発現抗原結合タンパク質などの本発明の抗原結合タンパク質、特にＴＣＲまたはそれらの断片または二重特異性ＴＣＲおよびそれらの断片の文脈における、「有意に結合しない」とは、典型的には、機能アッセイ、例えば、上記のＩＦＮ－γ放出などのＴＣＲ活性化アッセイにおける、好ましくは同じ実験条件において、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」からなるＭＡＧＥ－Ａペプチドから得られた、応答、すなわちシグナルの３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、好ましくは３０％未満である、例えば、抗原ペプチド変異型について検出されたシグナルなどの応答を意味する。抗原ペプチド変異型の文脈における、および本発明の抗原結合タンパク質、特に本発明の可溶性抗原結合タンパク質の文脈における、「有意に結合しない」とは、典型的には、好ましくは同じ実験条件において、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」からなるＭＡＧＥ－Ａペプチドについて判定されたＫＤの３～１０倍など、３倍を超え、３．５倍を超え、４倍を超え、４．５倍を超え、５倍を超え、好ましくは３を超えて増加している、例えば、バイオレイヤー干渉法などの結合アッセイにおける、抗原ペプチド変異型について判定されたＫＤを意味し、その中では、抗原ペプチド変異型について得られるシグナルは、好ましくはバックグラウンドシグナルであり、抗原ペプチド変異型またはＭＡＧＥ－Ａペプチドは、ＭＨＣ分子との複合体中にある。
上記によれば、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質、特に可溶性抗原結合タンパク質は、特異的抗原に対する親和性と比較して低下した親和性で、ＭＨＣタンパク質との複合体中の、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の、本明細書で上に記載されるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチ変異型に結合する、すなわち、ＭＨＣタンパク質との複合体、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の本発明の文脈で記載されるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに結合し、ＭＡＧＥ－Ａ抗原性ペプチド変異型複合体のそれぞれのＫＤは、３～１０倍など、３倍を超え、３．５倍を超え、４倍を超え、４．５倍を超え、５倍を超え、好ましくは３倍を超えて増加する。「親和性」および「ＫＤ」という用語は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
ＭＨＣタンパク質、特にＭＨＣクラスＩおよびＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的かつ任意選択的に結合できる、親和性成熟抗原結合タンパク質として特徴付けられる。
本発明の抗原結合タンパク質は、本明細書で上に特定されるようなＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド複合体に、より具体的には本明細書で上に定義される配列番号１のエピトープに、特異的に結合し、そのそれぞれの標的、すなわちＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドと、それが有意に結合しないその他の類似ペプチドとが区別され得る。
「特異性」または「特異的に結合する」という用語は、その結合する標的ペプチド配列（「エピトープ」）を類似したエピトープ、ペプチドまたはタンパク質から区別する、すなわち抗原結合タンパク質は、第２の抗原に有意に交差反応性でない場合、第１の抗原に「特異的に結合」する、抗原結合タンパク質の能力を示す。
本発明の文脈における「類似ペプチド」は、「オフターゲット」ともまたと称されることもあり、典型的には８～１６アミノ酸長を含んでなるペプチドに関する。本発明の文脈における類似のペプチドは、典型的にはＭＨＣ提示である。さらに、本発明の文脈における類似ペプチドは、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドのアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、より具体的には、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドのエピトープと比較して、対応するＭＡＧＥ－Ａペプチドのエピトープを構成するアミノ酸と比較して、アミノ酸の生化学的／生物物理学的特性が同一および／または類似しているエピトープを含んでなる。この配列類似性のために、類似ペプチドは抗原結合タンパク質によって結合されるかもしれず、このシナリオでは、例えば、類似ペプチドがＭＨＣタンパク質によって提示され、したがって、例えば、ＴＣＲなどの抗原結合タンパク質によって結合される場合、ＴＣＲなどの所与の抗原結合タンパク質が類似ペプチドに結合する能力は、望ましいＴ細胞応答をもたらさず、有害反応をもたらすこともある。このような有害反応は、２０１８年１２月４日に出版されたされ、Ｌｏｗｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙの７ページで報告されたように、健常組織でペプチドと交差反応する、特異的ＴＣＲの交差反応性などの「腫瘍外」の副作用であってもよい。本発明の文脈における類似ペプチドは、例えば、ＭＡＧ－００３に対する高い配列類似性（類似性ＢＬＡＳＴ検索）に基づいて、例えば、正常組織提示ＨＬＡ－Ａ＊０２結合ペプチドのデータベース（ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴデータベース）から選択された。したがって、これらの有害反応のために、本発明の抗原結合タンパク質は、類似ペプチド、特に本明細書で下に列挙される類似ペプチドへの結合を回避するように操作される。
したがって、本発明の文脈における類似ペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列からなるＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＡＸＩＮ１－００１、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＡＮＯ５－００１、配列番号２６のアミノ酸配列からなるＴＰＸ２－００１、配列番号２７のアミノ酸配列からなるＳＹＮＥ３－００１、配列番号２８のアミノ酸配列からなるＭＩＡ３－００１、配列番号２９のアミノ酸配列からなるＨＥＲＣ４－００１、配列番号３０のアミノ酸配列からなるＰＳＭＥ２－００１、配列番号３１のアミノ酸配列からなるＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、配列番号３２のアミノ酸配列からなるＣＮＯＴ１－００３、配列番号３３のアミノ酸配列からなるＴＥＰ１－００３、配列番号３４のアミノ酸配列からなるＰＩＴＰＮＭ３－００１、配列番号１２９のアミノ酸配列からなるＺＦＣ－００１、配列番号１７１のアミノ酸配列からなるＩＮＴＳ４－００２、配列番号１７２のアミノ酸配列からなるＳＡＭＨ－００１、配列番号１７３のアミノ酸配列からなるＰＰＰ１ＣＡ－００６、配列番号１７４のアミノ酸配列からなるＲＰＬ－００７、配列番号１７５のアミノ酸配列からなるＳＥＴＤ１Ａ－００１、配列番号１７６のアミノ酸配列からなるＮＯＭＡＰ－１－０３２０、配列番号１７７のアミノ酸配列からなるＮＯＭＡＰ－１－１２２３、および配列番号１７８のアミノ酸配列からなるＯＤＣ－００１、配列番号１７９のアミノ酸配列からなるＣＯＬ６Ａ３－０１０、配列番号１８０のアミノ酸配列からなるＦＡＭ１１５Ａ－００１、配列番号１８１のアミノ酸配列からなるＰＨＴＦ２－００１、および配列番号１８１のアミノ酸配列からなるＲＰＰ１－００１のペプチドからなるリストから選択される。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質、特にＴ細胞発現抗原結合タンパク質などのＴＣＲまたはそれらの断片、または二重特異性ＴＣＲおよびそれらの断片は、前記類似ペプチドがＭＨＣタンパク質との複合体中にある場合、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある場合、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、ＡＸＩＮ１－００１、ＡＮＯ５－００１、ＴＰＸ２－００１、ＳＹＮＥ３－００１、ＭＩＡ３－００１、ＨＥＲＣ４－００１、ＰＳＭＥ２－００１、ＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＣＮＯＴ１－００３、ＴＥＰ１－００３、ＰＩＴＰＮＭ３－００１、好ましくはＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＨＥＲＣ４－００１、およびＣＮＯＴ１－００３からなるリストから選択される、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５など、１、２、３、４、５など、好ましくは少なくとも３または全ての類似ペプチドに結合せずまたはに有意に結合しない。類似ペプチド、すなわちオフターゲットへの結合は副作用のリスクを増加させるかもしれないので、これは本発明の文脈における重要な利点であり、したがって、本発明の抗原結合タンパク質が、本明細書で列挙される類似ペプチドと交差反応しないという事実は、本発明を有望な抗がん剤にする。
「有意に結合しない」は、類似ペプチドの文脈において、および本発明の抗原結合タンパク質、特にＴ細胞発現抗原結合タンパク質などのＴＣＲまたはそれらの断片、または二重特異性ＴＣＲおよびそれらの断片の文脈において、「交差反応しない」と称されることもあり、本明細書で、例えば、ＭＡＧＥ－ＡＭＡＧＥ－Ａと比較した類似ペプチド／ＭＨＣへの抗原結合タンパク質について機能アッセイで測定される機能応答を指し、その中では、類似ペプチド／ＭＨＣに対する抗原結合タンパク質の応答は、同じ実験設定において、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する同じ抗原結合タンパク質の応答の８％、６％、５％など、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、好ましくは５％である。一例では、応答は、前記抗原結合タンパク質を発現するＴ細胞の機能的応答であり、本明細書で上に記載され、類似ペプチドの文脈で実施例３および図５に記載されるように、ＩＦＮ－γ放出アッセイを用いて決定される。
さらに、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質、特に本発明の可溶性抗原結合タンパク質は、前記類似ペプチドがＭＨＣタンパク質との複合体中にある場合、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある場合、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、ＡＸＩＮ１－００１、ＡＮＯ５－００１、ＴＰＸ２－００１、ＳＹＮＥ３－００１、ＭＩＡ３－００１、ＨＥＲＣ４－００１、ＰＳＭＥ２－００１、ＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＣＮＯＴ１－００３、ＴＥＰ１－００３、ＰＩＴＰＮＭ３－００１、ＩＮＴＳ４－００２、ＳＡＭＨ－００１、ＰＰＰ１ＣＡ－００６、ＲＰＬ－００７、ＳＥＴＤ１Ａ－００１、ＮＯＭＡＰ－１－０３２０、ＮＯＭＡＰ－１－１２２３、ＯＤＣ－００１、ＣＯＬ６Ａ３－０１０、ＦＡＭ１１５Ａ－００１、ＰＨＴＦ２－００１およびＲＰＰ１－００１好ましくはＣＮＯＴ１－００３、ＳＹＮＥ３－００１、ＴＰＸ２－００１、ＰＳＭＥ２－００１、より好ましくはＳＹＮＥ３－００１、ＴＰＸ２－００１、ＰＳＭＥ２－００１からなるペプチド群から選択される、少なくとも１つの類似ペプチド、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５など、１、２、３、４、５など、好ましくは少なくとも３または全ての類似ペプチドに結合せずまたは有意に結合しない。
一例では、本発明の抗原結合タンパク質、特に本発明の可溶性抗原結合タンパク質は、前記類似ペプチドがＭＨＣタンパク質との複合体中にある場合、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある場合、ＩＮＴＳ４－００２、ＳＡＭＨ－００１、ＰＰＰ１ＣＡ－００６、ＲＰＬ－００７、ＳＥＴＤ１Ａ－００１、ＮＯＭＡＰ－１－０３２０、ＮＯＭＡＰ－１－１２２３およびＯＤＣ－００１、ＩＮＴＳ４－００２、ＳＡＭＨ－００１、ＰＰＰ１ＣＡ－００６、ＲＰＬ－００７、ＳＥＴＤ１Ａ－００１またはＮＯＭＡＰ－１－０３２０、ＮＯＭＡＰ－１－１２２３、ＯＤＣ－００１、ＣＯＬ６Ａ３－０１０、ＦＡＭ１１５Ａ－００１、ＰＨＴＦ２－００１およびＲＰＰ１－００１など、ＰＰＰ１ＣＡ－００６、ＲＰＬ－００７およびＳＥＴＤ１Ａ－００１などに結合せずまたは有意に結合しない。
類似ペプチドの文脈において、また、本発明の可溶性抗原結合タンパク質などの抗原結合タンパク質の文脈において、「有意に結合しない」は、本明細書で、親和性の低下、より速い解離速度および／または低い結合シグナル、特により速い解離速度および／または低い結合シグナルによって特徴付けられる。例えば、本発明の文脈において、抗原結合タンパク質は、同一実験環境および同一抗原結合タンパク質濃度で、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する同じ抗原結合タンパク質結合の応答の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満または３％未満の少なくとも１つの類似ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合応答を有し、および／または、例えば、本発明の文脈において、抗原結合タンパク質は、特異的抗原、すなわち本明細書に記載されるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する親和性と比較して低下した親和性で、少なくとも１つの類似ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、その中では、それぞれの類似に対するペプチドそれぞれのＫＤは、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍、好ましくは５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００倍、好ましくは２０～１００倍、より好ましくは３０～１００倍、４０～１００倍など、典型的には４０～５０倍増加する。例えば、抗原結合タンパク質がＭＡＧ－００３／ＭＨＣの複合体に１ｎＭのＫＤで結合し、抗原結合タンパク質が例えば、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１／ＭＨＣの複合体に１００ｎＭのＫＤで結合する場合、抗原結合タンパク質は１００倍に増加したＫＤで、したがって１００分の１に減少した親和性で、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１／ＭＨＣに結合する。これらの例において、結合応答、解離定数、および結合親和性は、好ましくは、例えば、実施例４および５に記載されるように、バイオレイヤー干渉法を用いて測定される。いくつかのさらなる例では、抗原結合タンパク質は、特異的抗原、すなわち本明細書に記載のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する親和性と比較して減少した親和性で、少なくとも１つの類似ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、その中では、例えば、ＫＤ値が典型的には、実施例５に記載されるようにバイオレイヤー干渉法によって測定された場合、特異的抗原、すなわちＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する親和性と比較して、ＣＮＯＴ１－００３、ＩＮＴＳ４－００２、およびＳＡＭＨ－００１に対するそれぞれのＫＤは１０００倍を超えて増加し、ＣＯＬ６Ａ３－０１０、ＰＨＴＦ２－００１、ＲＰＰ１－００１、およびＦＡＭ１１５Ａ－００１では５００倍を超えて増加する。
さらなる例では、ＭＨＣ複合体中では、１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）または１１４－ｉｓｏ２－ＵＣＨＴ１（１７）などの抗原結合タンパク質は、ＯＤＣ－００１、ＮＯＭＡＰ－１－０３２０、およびＮＯＭＡＰ－１－１２２３に対して、実施例５に記載されるようにバイオレイヤー干渉法によって測定された場合、例えば、１．５％未満など、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満の結合応答を有する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と、ＨＬＡ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２とを含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに、１００μＭ未満、５０μＭ未満、３０μＭ未満、２５μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、好ましくは５０ｐＭ～１００μＭ、５０ｐＭ～１０μＭ、５０ｐＭ～１μＭ、より好ましくは、５０ｐＭ～５００ｎＭ、５０ｐＭ～１００ｎＭ、５０ｐＭ～５０ｎＭ、および５０ｐＭ～１０ｎＭのＫＤで特異的に結合する。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、ＨＬＡ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに対する、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１２０ｎＭ未満、１１０ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ未満、特に５０ｐＭ～１００ｎＭ、１００ｐＭ～１００ｎＭ、１ｎＭ～１００ｎＭの親和性（ＫＤ）を有する。「ＫＤ」および「親和性」は、本明細書で上に「定義」の項で定義される。
ＫＤなどの親和性を測定する方法は当業者に知られており、例えば、表面プラズモン共鳴およびバイオレイヤー干渉法が挙げられる。当業者に知られているように、使用される緩衝液、タンパク質の濃度など、それらの実験に使用される実験条件は、結果に影響を与えてもよい。
関連する実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質、特にＴ細胞発現抗原結合タンパク質などのＴＣＲまたはそれらの断片または二重特異性ＴＣＲまたはそれらの断片は、配列番号１のアミノ酸配列と、ＨＬＡ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２とを含んでなるかまたはそれからなる、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの複合体に対する、１００μＭ未満、５０μＭ未満、３０μＭ未満、２５μＭ未満、１μＭ未満、好ましくは２５μＭ未満、例えば、５００ｎＭ～１００μＭ、５００ｎＭ～５０μＭ、５００ｎＭ～２５μＭの親和性（ＫＤ）を有する。
特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は可溶性である。可溶性抗原結合タンパク質としては、例えば、制限なしに、抗体またはまたはその断片、または二重特異性抗体またはその断片、ＴＣＲ断片または二重特異性ＴＣＲまたはｓｃＴＣＲが挙げられてもよい。関連する実施形態では、好ましくは可溶性である抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と、ＨＬＡ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２とを含んでなるかまたはそれからなる、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの複合体に、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１ｎＭ未満、例えば、１０ｐＭ～１００ｎＭ、１０ｐＭ～５０ｎＭ、１０ｐＭ～１０ｎＭ、特に５０ｐＭ～１００ｎＭ、１００ｐＭ～５０ｎＭ、１００ｐＭ～１０ｎＭのＫＤで結合する。
したがって、一例では、本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、本明細書で上に記載される可溶性ＴＣＥＲ（商標）として発現され、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体に対するそれらの結合親和性について分析された。典型的には、測定は、例えば、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで、典型的には、製造業者によって推奨される設定を用いて実施される簡潔に述べると、結合動態は、典型的には、例えば、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡを緩衝剤として使用して、３０℃で、例えば、１０００ｒｐｍの振盪速度で測定された。抗原結合タンパク質は、ＦＡＢ２ＧまたはＡＨＣなどのバイオセンサー上に負荷され、または溶液中で分析された。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、任意選択的に、参照タンパク質と比較して増加した親和性を有する。
本明細書における「参照タンパク質」は、本発明の抗原結合タンパク質がそれと比較されるタンパク質を指す。一実施形態では、参照タンパク質は、本タンパク質と同じ標的、すなわちＭＨＣタンパク質との複合体中のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに対して向けられ、より好ましくは、前記参照タンパク質は、それが比較される抗原結合タンパク質と同じ形態である。特定の一実施形態では、参照タンパク質は、それが比較される抗原結合タンパク質と同じ形態であり、参照タンパク質は、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＣＤＲまたはαおよびβ可変ドメインを含んでなる。
本明細書で開示されるように、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」と、ＨＬＡ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２を含んでなるかまたはそれらからなる、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの複合体を認識しおよび／またはそれに結合する。したがって、ＭＡＧ－００３およびＨＬＡ分子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩに存在し、前記複合体への抗原結合タンパク質の結合は、結合時に免疫応答を惹起してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、参照タンパク質によって誘導される免疫応答と比較して増加した免疫応答を誘導する。
したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、免疫応答を誘導し、好ましくは、免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。したがって、一例では、免疫応答は、好ましくはＩＦＮ－γ放出アッセイで判定されるＥＣ５０値によって特徴付けられるかもしれない。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、参照タンパク質のＥＣ５０よりも低い、好ましくはＩＦＮ－γ放出によって判定されるＥＣ５０［ｎＭ］値を有し、好ましくは、抗原結合タンパク質は、参照タンパク質のＥＣ５０［ｎＭ］値の２分の１、好ましくは２、３、４、５、６、７、８分の１、例えば、２～９分の１のＥＣ５０［ｎＭ］を有し、この中で、ＥＣ５０値は、ＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２発現細胞、好ましくは配列番号１の抗原ペプチドが負荷された細胞上で判定された最大半量ＩＦＮ－γ放出濃度［ｎＭ］である。一例では、言及されるＥＣ５０は、例えば、電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド、好ましくは配列番号１のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの連続希釈液が負荷されたＴ２細胞とを共培養した後に、典型的には、ＥＬＩＳＡによって判定される。好ましくは、参照タンパク質は、それが比較される抗原結合タンパク質と同じ形態であり、参照タンパク質は、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＣＤＲまたはαおよびβ可変ドメインを含んでなり、ＥＣ５０は、好ましくは同じ実験設定で判定されている。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対する、好ましくはＩＦＮ－γ放出アッセイまたはＬＤＨ放出アッセイによって判定される、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ、１０ｎＭ未満、９００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、０．１ｎＭ～２０ｎＭの間などの、０．５ｎＭ～１５ｎＭ、０．８ｎＭ～１２ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭなどの、または１ｐＭ～１５０ｐＭ、１～１００ｐＭ、１～５０ｐＭ、１～２０ｐＭ、１～２０ｐＭなどのＥＣ５０値を有する。
一実施形態では、抗原結合タンパク質はＴＣＲであり、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対する、好ましくはＩＦＮ－γ放出によって判定される、１２未満ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、６ｎＭ未満、４ｎＭ未満、０．１ｎＭ～２０ｎＭの間など、０．５ｎＭ～１５ｎＭ、０．８ｎＭ～１２ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭなどのＥＣ５０を有する。
この実施形態では、ＥＣ５０は、本発明の異なる抗原結合タンパク質を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（２０，０００個の細胞／ウェル）を使用して、ＭＡＧ－００３（配列番号１）の希釈系列が負荷されたＴ２細胞（２０，０００個の細胞／ウェル）との共培養時に放出される、ＩＦＮ－γのレベルを判定することによって判定される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＥＲ（商標）などの可溶性分子であり、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対する、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭ～１５０ｐＭ、１～１００ｐＭ、１～５０ｐＭ、１～２０ｐＭ、１～２０ｐＭのＥＣ５０を有する。この実施形態では、ＥＣ５０は、本発明の異なる抗原結合タンパク質を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（２０，０００細胞／ウェル）を使用して、ＭＡＧ－００３を内在性レベルで提示する腫瘍細胞株との共培養時に放出されるＬＤＨのレベルを判定することにより判定され、好ましくは、細胞株は、ＭＨＣタンパク質との複合体中の約１０７１個のＭＡＧ－００３ペプチドをその表面上に提示するＨｓ６９５Ｔであり、好ましくは、細胞株は、ＭＨＣタンパク質との複合体中の約３９１８個のＭＡＧ－００３ペプチドをその表面上に提示するＮＣＩ－Ｈ１７５５であり、または好ましくは、細胞株は、ＭＨＣタンパク質との複合体中の約１２５個のＭＡＧ－００３ペプチドをその表面上に提示するＵ２ＯＳである。
本発明の抗原結合タンパク質は、高い安全性プロファイルを有する。
本明細書における「安全性プロファイル」は、腫瘍細胞を健常組織細胞から区別する能力を指し、これは、しばしば安全域を判定することによって判定される。
本明細書における「安全域」または「治療域」は、腫瘍細胞株に１００％の細胞傷害性を誘導するのに必要な化合物の最大半量濃度と、健常組織細胞に１００％の細胞傷害性を誘導するのに必要な化合物の最大半量濃度とを比較した場合の係数を指す。目的の抗原結合タンパク質について、腫瘍細胞株について判定されたＥＣ５０が１ｐＭであり、例えば、初代細胞について判定されたＥＣ５０値が１０００ｐＭである場合、腫瘍細胞株に対するＥＣ５０は初代細胞に対するのＥＣ５０の１０００分の１であるので、安全域は１０００である。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、健常細胞に対するＥＣ５０値よりも５００～１２０００、好ましくは１０００～１００００高い、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０など、健常細胞に対するＥＣ５０値よりも１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、８０００以上、１００００以上高い、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有する。
「ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞」は、本明細書では、ＭＡＧＥ－Ａペプチド／ＭＨＣ複合体をその表面上に提示する細胞を指し、その中では、前記ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体のコピー数は、典型的には当業者に知られた方法で判定され得る。一実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体は、がん細胞などの標的細胞であり、その中では、がんは、本明細書の下で「治療法および使用」の項で定義される。本発明の文脈において、ＭＡＧＥ－Ａペプチド／ＭＨＣ複合体は、正常（健常）組織の細胞表面上の前記複合体のレベルと比較して、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞、特にがん細胞の細胞表面上に過剰に提示される。「過剰に提示される」とは、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体が、健常組織における提示レベルの少なくとも１．２倍のレベル、好ましくは健常組織または細胞における提示レベルの少なくとも２倍、およびより好ましくは５倍～１０倍で、提示されることを意味する。
一実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞は、５０を超え、８０を超え、１００を超え、１２０を超え、１５０を超え、３００を超え、４００を超え、６００を超え、８００を超え、１０００を超え、１５００を超え、２０００を超える、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体コピー数、好ましくは５０～２０００、８０～２０００など、１００～２０００など、例えば１２０～２０００のＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣコピー数を有する。
本明細書における「コピー数」は、例えば、がん細胞、または健常細胞のようなＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ提示細胞などの細胞の細胞表面上に存在する、本発明の文脈で定義されるＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体の数を指す。タンパク質のコピー数は、蛍光標識された抗原結合タンパク質を用いた罹患細胞のＦＡＣＳ分析をはじめとする、様々な当該技術分野で知られている方法によって判定され得る。
本明細書の「健常細胞」は、がん細胞ではない細胞を指し、好ましくは、本明細書の健常細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ提示細胞周囲の組織の細胞、がん細胞を提示するＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体周囲の組織の細胞を指す。しかし、場合によっては、健常細胞もまたＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体を発現してその表面に提示するかもしれない。典型的には、本発明の文脈における健常細胞中では、当業者であれば理解できるように、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体が、がん細胞よりも少ない量（コピー数）で存在する。
健常細胞は、好ましくは、星状細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、間葉系幹細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞、好ましくはＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、健常細胞、好ましくは、星状細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠状動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、間葉系幹細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺線維芽細胞、気管平滑筋細胞、表皮ケラチノサイト、腎皮質内皮細胞、および肺動脈平滑筋細胞、好ましくは、星状細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、間葉系幹細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、および肺動脈平滑筋細胞、より好ましくはＧＡＢＡ神経細胞、心筋細胞、心臓微小血管内皮細胞、軟骨細胞、冠動脈内皮細胞、鼻上皮細胞、末梢血単核細胞、肺動脈平滑筋細胞からなる群から選択される健常細胞に対するＥＣ５０値よりも１０００倍以上、１５０００倍以上、９０００倍以上高い、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有する。
好ましい一実施形態では、抗原結合タンパク質は、健常細胞に対するＥＣ５０値よりも９０００倍以上または１００００倍以上高いＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対する、ＥＣ５０を有し、その中では、好ましくは、前記健常細胞は、ｉＰＳＣ由来星状細胞、ｉＧＡＢＡ神経細胞、ｉ心筋細胞、骨芽細胞、肺線維芽細胞、気管平滑筋細胞および表皮ケラチノサイトおよび腎皮質上皮細胞からなる群から選択される。
したがって、一実施形態では、健常細胞は、５０未満、２０未満、１０未満、好ましくは１０未満のＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体コピー数、好ましくは０～１０のＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体コピー数の、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体コピー数を有する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞に対するＥＣ５０値よりも５００～１２０００、好ましくは１０００～１２０００高い、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０など、類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞に対するＥＣ５０値よりも１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上高い、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対するＥＣ５０を有する。
「類似ペプチド」は、本明細書で上記に定義される。
したがって類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞は、その細胞表面上に類似ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞である。一実施形態では、類似ペプチド／ＭＨＣ提示細胞は、１０を超え、２０を超え、４０を超え、５０を超え、８０を超え、１００を超え、１２０を超え、１５０を超え、３００を超え、４００を超え、５００を超え、８００を超えて、好ましくは、５０～１０００、５０～８０００など、５０～５００など、１００～５００などの類似のペプチド／ＭＨＣコピー数である、類似ペプチド／ＭＨＣのコピー数を有する。
本発明は、生体内で腫瘍退縮、より具体的には試験条件下での完全な退縮を誘導できる抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質が調製され、ヒトＰＢＭＣが移植された雌のＮＯＧマウスに移植された測定可能ＨＳ６９５Ｔ腫瘍異種移植片に対して、異なる用量で評価された（実施例７を参照されたい）。ＭＡＧ－００３を標的化するＴＣＥＲ（商標）（配列番号１２７および１３０、グループ３；配列番号１３５および１３６、グループ４）は、全てのマウスにおいて、無作為化した日の８６ｍｍ３（グループ３）および８０ｍｍ３（グループ４）の基底レベルと比較して、１８日目から試験終了の２５日目までにＨｓ６９５Ｔ腫瘍の完全な寛解を誘導した。
したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、腫瘍増殖を阻害または低減し、より具体的には、本発明の抗原結合タンパク質は、腫瘍の平均腫瘍体積を８０％を超え、８５％を超え、９０％を超え、９２％を超え、９４％を超え、９６％を超え、９８％を超え、９９％を超えて、９５％～１００％、９６％～１００％、９８％～１００％など、９８％、９９％または１００％など、好ましくは１００％低減し、その中では、前記腫瘍は、本明細書の「治療法および使用」の項で以下に定義されるがんである。一例では、抗原結合タンパク質は、がん腫瘍において完全寛解を誘導し、その中では、がんは、例えば、ヒト腫瘍細胞株ＨＳ６９５Ｔにおいて、本明細書で以下に定義される。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質の半減期（Ｔ１／２）は、６または７日などの６～７日である。
実施例、特に実施例１および図１からさらに分かるように、天然ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５などの天然ＴＣＲは、酵母またはＣＨＯ細胞のどちらでも可溶性形態で発現され得なかった。これとは逆に、本発明の抗原結合タンパク質、特にＴＣＥＲ（商標）分子、好ましくは本明細書で記述される好ましいＴＣＥＲ（商標）分子は、可溶性であるだけでなく、ＣＨＯ細胞で一過性に発現させることができ、その量は１０ｍｇ／Ｌを超え（細胞培養）、２０ｍｇ／Ｌを超え、さらには４０ｍｇ／Ｌである。したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、宿主細胞において高収率で発現され得て、ここで、好ましくは宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、その中では、好ましくは収率は、５～５０、５，～４５、５～４０、５～３５、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）など、１０を超え、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）を超える。一例では、抗原結合タンパク質は一過性に形質移入されたＣＨＯ－Ｓ細胞で発現され、その中では、細胞は、Ｔ＝０において、４×１０６／ｍＬの密度で、３７℃で、総容量３２０ｍＬのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）の培地中で培養された。１日後、供給液（ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ ７ａおよびｂ）が添加され、温度が３２℃に低下された。細胞、したがって抗原結合タンパク質は、合計１２日間の培養時間と合計３回の栄養供給後に収穫された。
実施例からさらに分かるように、本発明者らは、例えば実施例４および５において、本発明の抗原結合タンパク質が、参照タンパク質と比較して、例えば、天然ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＣＤＲと、好ましくは前記天然ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５のフレームワーク領域とを含んでなる抗原結合タンパク質と比較して、改善された安定性を有することを実証した。
したがって一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、任意選択的に、参照タンパク質と比較して改善された安定性を有する。本発明の文脈において、改善された安定性は、例えば、温度ストレスに曝された場合の物理的安定性の増加を指す。したがって、本発明の新たに開発された抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質よりもストレス条件、特に温度ストレスにより良く耐え得る。
本発明の文脈における「安定性」という用語は、物理的安定性を指し、当該技術分野で記載される様々な分析技術を使用して定性的および／または定量的に評価され得て、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）；およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）で概説される。本発明の文脈において、これらの方法は、特に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの使用、濁度の測定、および／または目視検査による）凝集体形成の評価を指す。安定性を測定するために、本発明の抗原結合タンパク質を含んでなるサンプルは、安定性試験で試験されてもよく、その中では、サンプルは選択された期間ストレス条件に曝され、適切な分析技術を使用した化学的および物理的安定性の定量的および任意選択的に定性的な分析がそれに続いた。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、４０℃の温度に例えば、１４日間曝された場合など、特定の期間にわたりストレス条件に曝された場合に、物理的に安定している。
「物理的安定性」は、本発明の文脈において、実質的に、凝集、沈殿および／または変性の兆候を有さない抗原結合タンパク質を指す。
物理的安定性にアクセスする方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、光掩蔽（ＬＯ）、および色と透明度であり、例えば、目視検査によって判定される。
「凝集の兆候がない」とは、例えば、ＰＢＳなどの緩衝液中で１４日にわたる４０°Ｃの温度などのストレス条件に曝された後に、抗原結合タンパク質を含んでなるサンプルが、ＰＢＳなどの緩衝液中でＳＥＣ－ＨＰＬＣなどのＳＥＣによって測定された場合、単量体含有量の９４％～９９％、９５％～９９％、９６％～９９％、９７％～９９％の単量体含有量などの、８０％を超え、８６％を超え、８８％を超え、９０％を超え、９２％を超え、９４％を超え、９６％，を超える９７％を超え、９８％を超え、９９％を超える単量体含有量を有することを意味する。
したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、ストレス条件に曝された場合の参照タンパク質と比較して、凝集が減少している。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）では、使用されるカラム、操作圧力、および緩衝液の速度に応じて、試験された条件下で、単量体含量の１％、２％、３％、４％、好ましくは２％などの１または２％の差が、本発明の文脈では有意差があると見なされる。
これは、参照抗原結合タンパク質が９６％の単量体含有量を有し、本発明の抗原結合タンパク質が９７％の単量体含有量を有する場合、本発明の抗原結合タンパク質の単量体含有量は、同じ条件で測定した場合、参照抗原結合タンパク質と比較して有意に異なり、したがって有意に増加していることを意味する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ストレス条件に曝された場合、凝集の減少を有し、より具体的には、ストレスによって誘発された凝集体が、前記ストレス条件への曝露の前後に測定された場合、本発明の抗原結合タンパク質は、１０％未満、４％未満、３％未満、２％未満の凝集を有する。
核酸、ベクター、および組換え宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本明細書で上に定義される本発明の抗原結合タンパク質をコードする配列を含んでなるかまたはそれからなる単離核酸配列に関する。
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含まれてもよいＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、それによってＤＮＡやＲＮＡの配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写または翻訳）を促進するためのビヒクルを意味する。
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含んでなるベクターに関する。
このようなベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含んでなり、対象への投与時に前記ポリペプチドの発現を引き起こし、または指示してもよい。動物細胞のための発現ベクターで使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖などのプロモーター（Ｍａｓｏｎ ＪＯ ｅｔ ａｌ．１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．１９８３）が挙げられる。
ヒト抗体Ｃ領域をコード化する遺伝子を挿入して発現させることができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．１９８１）、ｐＳＧ１ β ｄ２－４－（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）などが挙げられる。プラスミドのその他の例としては、複製起点を含んでなる自己複製プラスミドド、または例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの統合プラスミドが挙げられる。
ウイルスベクターのその他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、パッケージング細胞への形質移入によって、またはヘルパープラスミドまたはウイルスを用いた一過性形質移入によって、当該技術分野で公知の技術によって生成されてもよい。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコルは、例えば、国際公開第９５／１４７８５号パンフレット、国際公開第９６／２２３７８号パンフレット、米国特許第５，８８２，８７７号明細書、米国特許第６，０１３，５１６号明細書、米国特許第４，８６１，７１９号明細書、米国特許第５，２７８，０５６号明細書、および国際公開第９４／１９４７８号パンフレットにある。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージ化される能力を有し、少なくとも外因性核酸をコード化する、核酸ベクターコンストラクトを指す。ベクターおよび／または粒子は、生体外または生体内のどちらかで、任意の核酸を細胞に移し入れる目的で用いられ得る。多数の形態のウイルスベクターが、当該技術分野で公知である。
「ビリオン」という用語は、単一の感染性ウイルス粒子を指すために使用される。「ウイルスベクター」、「ウイルスベクター粒子」、および「ウイルス粒子」はまた、細胞外に存在する、ＤＮＡまたはＲＮＡコアとタンパク質コートを有する完全なウイルス粒子を指す。例えば、ウイルスベクターは、アデノウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、またはピコルナウイルスから選択されてもよい。
ウイルスは、天然に存在するウイルスならびに人工ウイルスを指してもよい。本発明のいくつかの実施形態によるウイルスは、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのどちらであってもよい。パルボウイルス（ＡＡＶなど）は、非エンベロープウイルスの例である。好ましい実施形態では、ウイルスは、エンベロープウイルスであってもよい。好ましい実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスであってもよい。真核細胞のウイルス感染を促進し得るウイルス外被タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、改変ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）、および修飾テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）からのエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）で偽型化されたＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）を含んでもよい。これらのエンベロープタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をはじめとするパルボウイルスなどのその他のウイルスの侵入を効率的に促進し得て、それによってそれらの広範な効率を実証する。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）４０７０ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５に記載されるような）ＲＤ１１４ ｅｎｖ、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏまたはＲＤｐｒｏ（その内容が参照により本明細書に援用されるＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０；２３５：１２６９－１２７６に記載されるような、ＲＤ１１４のＲペプチド切断配列をＨＩＶ－１マトリックス／カプシド（ＭＡ／ＣＡ）切断配列で置換することによって構築されたＲＤ１１４－ＨＩＶキメラ）、バキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用されるＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１０８６９－１０８７８，２００７に記載されるような）、またはＧＡＬＶ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５に記載されるような）またはそれらの誘導体をはじめとする、その他のウイルスエンベロープタンパク質が使用されてもよい。
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターで形質転換、形質導入、または形質移入された宿主細胞に関する。
「形質転換」という用語は、元来、宿主細胞への遺伝子移入の自然発生プロセスを指し、これは、細胞による細胞膜を介した、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸などの遺伝物質の吸収を伴い、その結果、宿主細胞は、導入された遺伝子または配列を発現し、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子または配列によってコード化されるタンパク質または酵素を産生する。自然形質転換および人工または誘導形質転換と称される、２つのタイプがある。人工または誘導形質転換法は実験室条件下で行われ、典型的には形質移入と称される。
形質転換の過程において、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの外来核酸を受け取って発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
「形質移入」という用語は、宿主細胞が外来遺伝物質を受け取ることを可能にする、宿主細胞の細胞膜上の細孔の生成を伴う遺伝子移入の様式を指す。典型的には形質移入は、昆虫または哺乳類の細胞などの真核細胞の形質転換を指す。化学薬品媒介形質移入は、例えば、リン酸カルシウムまたはカチオン性ポリマーまたはリポソームの使用を伴う。非化学薬品媒介形質移入法は、典型的には、電気穿孔、ソノポレーション、インペールフェクション、光形質移入、または流体力学的送達である。粒子ベースの形質移入には、ナノ粒子を使用して核酸を宿主細胞に移入する遺伝子銃技術、またはマグネトフェクションと称される別の方法が使用される。ヌクレオフェクションおよび熱ショックの使用は、形質移入を成功させるためのその他の進化した方法である。形質移入法を介して外来核酸を受け取る宿主細胞は、「形質移入」されている。
「形質導入」という用語は、一般に、ウイルスまたはウイルスベクターによる細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡなどの外来核酸の移入に関連すると理解される。ウイルスまたはウイルスベクターによって、ＤＮＡやＲＮＡなどの外来核酸を受け取って発現する宿主細胞は、「形質導入」されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、その内容全体が本明細書に参照により援用される、米国特許第２０１９０２１６８５２号明細書に記載された方法を使用して形質導入されてもよい。
本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の組換え抗原結合タンパク質が生成されてもよい。
「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコード化されるタンパク質の発現のための適切な条件下にある、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
一般的な発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、および哺乳類宿主細胞とベクターが挙げられる。その他の宿主細胞の例としては、限定されることなく、原核生物細胞（細菌など）および真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる特定の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母、哺乳類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、初代または確立された哺乳類細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚性細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成される）が挙げられる。例としてはまた、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ ｅｔ ａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と称する）なども挙げられる。いくつかの実施形態では、キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性は、ＹＢ２／０細胞で発現させると増強されることから、この細胞が好ましくあってもよい。
本発明はまた、本発明による抗原認識コンストラクトを含んでなる宿主細胞にも関する。具体的には、本発明の宿主細胞は、本明細書で上に記載される核酸またはベクターを含んでなる。宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌、または藻類などの真核細胞であり得て、または例えば、細菌または原虫など原核細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、例えばヒトなどの生物から直接単離された細胞であり得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁状態で増殖する細胞であり得る。組換えＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質などの抗原結合タンパク質を生成する目的のために、宿主細胞は好ましくは哺乳類細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞タイプであり得て、任意の組織型に由来し得て、任意の発達段階であり得て、宿主細胞は好ましくは、末梢血白血球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば、初代Ｔ細胞などの培養Ｔ細胞などの任意のＴ細胞；または例えば、ジャーカット、ＳｕｐＴ１などの培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞；または哺乳類から得られたＴ細胞、好ましくは、ヒト患者由来のＴ細胞またはＴ細胞前駆体であり得る。哺乳類から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、またはその他の組織または体液をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の起源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、記憶Ｔ細胞、未感作Ｔ細胞などをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のＴ細胞型であり得て、任意の発達段階のものであり得る。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞である。宿主細胞は、好ましくは、ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８を発現する腫瘍細胞に特異的な腫瘍反応性Ｔ細胞である。
上記によれば、一実施形態では、本発明は、本明細書で上に定義される本発明の抗原結合タンパク質、または核酸、または本発明のベクターを含んでなる宿主細に言及する。その中では、前記宿主細胞は、好ましくは、ａ）リンパ球、例えばＴリンパ球またはＴリンパ球前駆細胞、例えばＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞、またはｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの組換え発現のための細胞である。
特に、本発明のいくつかの抗原結合タンパク質の発現では、発現ベクターは、どちらのタイプであってもよく、その中では、抗体重鎖およびα鎖などの第１のポリペプチドをコードする遺伝子と、抗体軽鎖やβ鎖などの第２のポリペプチドをコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプと、双方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデム型）がある。抗原結合タンパク質発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、および動物細胞における抗体ＨとＬ鎖の発現レベル間のバランスに関して、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい（Ｓｈｉｔａｒａ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９４ Ｊａｎ．３；１６７（１－２）：２７１－８）。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターとの例しては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号パンフレット）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。
一実施形態では、このような組換え宿主細胞は、本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質の生成に使用され得る。
本発明の抗原結合タンパク質を生成する方法
本発明はまた、
ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．本発明の抗原結合タンパク質をコード化するコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと、任意選択的に
ｅ．前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択するステップと
を含んでなる本明細書で上に定義される抗原結合タンパク質を生成する方法にも関する。
本発明の抗原結合タンパク質は、本明細書で上に対応する項で定義される。
本明細書の「遺伝子コンストラクト」は、宿主におけるコード領域の発現を可能にする核酸を示し、したがって、上記のベクターまたはＲＮＡなどの核酸を指す。
一実施形態では、方法はさらに、前記適切な宿主細胞上で、前記抗原認識コンストラクトを細胞表面提示させるステップをさらに含んでなってもよい。
その他の好ましい実施形態では、ｂ）の遺伝子コンストラクトは、本発明の抗原結合タンパク質をコード化する核酸を含んでなる。このような核酸は、本明細書で上に「核酸、ベクター、および組換え宿主細胞」の項で定義される。
関連する実施形態では、遺伝子コンストラクトは、前記コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでなる、発現コンストラクトである。
関連する実施形態では、遺伝子コンストラクトは、形質転換、形質導入または形質移入を用いて、適切な宿主中に導入される。形質転換、形質導入または形質移入は、本明細書で上の項に定義される。
望ましくは、遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するための形質移入システムは、本明細書で上に、核酸、ベクター、および組換え宿主細胞の項に記載されるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターシステムである。このようなシステムは、当業者に周知である。
一実施形態では、方法は、宿主細胞からの抗原結合タンパク質の単離と精製、および任意選択的に、Ｔ細胞における抗原結合タンパク質の再構成をさらに含んでなる。
本発明の抗原結合タンパク質は、限定されることなく、化学的、生物学的、遺伝が的または酵素的技術のいずれか単独または組み合わせなど、当該技術分野で公知の任意の技術によって生成されてもよい。
いくつかの特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、抗体または免疫グロブリン様フレームワークを有する。
抗体またはそれらの断片およびＴＣＲまたはそれらの断片などのポリペプチドを生成するための標準技術は当該技術分野で公知であり、これらの技術は、当業者によって本発明の抗原結合タンパク質に移行され得る。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、特に市販のペプチド合成装置（カリフォルニア州フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されたものなど）を使用して、製造業者の指示に従って合成され得る。代案としては、抗体またはそれらの断片およびＴＣＲまたはそれらの断片などの本発明の抗原結合タンパク質は、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、所望の（ポリ）ペプチドをコード化するＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを所望のポリペプチドを発現する適当な真核生物または原核生物の宿主に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として断片を得ることができ、その後、周知の技術を用いてそれから断片が分離され得る。
一例では、すなわち、ＴＣＥＲ（商標）二重特異性分子の場合、ＶＨとＶＬ、および可変α（Ｖα）と可変β（Ｖβ）の様々な組み合わせをコードするＤＮＡ配列、ならびにリンカーをコードする配列が、例えば、遺伝子合成によって得られてもよい。得られたＤＮＡ配列は、例えば、ヒトＩｇＧ４［受入番号：Ｋ０１３１６］およびＩｇＧ１［受入番号：Ｐ０１８５７］に由来するヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインをそれぞれコードする発現ベクターに、フレーム内でクローン化され、さらに操作されてもよい。追加的な鎖間ジスルフィド結合の安定化ありまたはなしで、ＣＨ３ドメインに「ノブ・インツー・ホール」の変異を組み込むため；ＣＨ２のＮ－グリコシル化部位を除去する（例えば、Ｎ２９７Ｑ変異）ため；Ｆｃ－サイレンシング変異を導入するため；またはＲｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｂｙ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，５４５１－５４５９）によって記述された方法に従って、ＶＬとＶＨにそれぞれ追加的なジスルフィド結合安定化を導入するため；安定性または製造可能性を高める変異を含めるための操作が実施されてもよい。
本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、プロテインＡ－セファロース、プロテインＬ－セファロース、プロテインＧ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの免疫グロブリン精製手順によって培地から適切に分離される。
一実施形態では、本明細書において、発現した抗原結合タンパク質またはポリペプチドを回収することは、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、κ選択クロマトグラフィー、および／またはサイズ排除クロマトグラフィー、好ましくはプロテインＬクロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィー、より好ましくはプロテインＬ－クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを実施することを指す。
組換えＤＮＡを伴う本発明の抗原結合タンパク質を生成するための方法、および遺伝子形質移入技術は、当該技術分野で周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）および特許文献米国特許第５，２０２，２３８号明細書；および米国特許第５，２０４、２４４号明細書を参照されたい）。
さらに、従来の組換えＤＮＡに基づいてヒト化抗体を生成するための方法、および遺伝子形質移入技術は、当該技術分野で周知であり（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳ．ｅｔ ａｌ．１９８５を参照されたい）、本発明の抗原結合タンパク質の生成に容易に適用され得る。
一例では、本発明の組換え抗原結合タンパク質の発現のためのベクターは、例えば、ＨＣＭＶ由来のプロモーター要素であるｐＵＣ１９誘導体によって制御される、単シストロン性として設計された。プラスミドＤＮＡは、例えば、標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅され、引き続いて、市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製された。精製されたプラスミドＤＮＡは、例えば、製造業者の指示に従って（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）システム；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または電気穿孔システム（ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性形質移入に使用された。形質移入されたＣＨＯ－細胞は、例えば、３２℃～３７℃で６～１４日間培養され、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）ＦｅｅｄまたはＣｅｌｌｂｏｏｓｔ ７ａおよび７ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標））溶液が１～２回供給された。
調整された細胞上清は、例えば、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を使用した濾過（０．２２μｍ）によって清澄化された。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実行するように装備された、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製された。アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡまたはＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、標準的なアフィニティークロマトグラフィープロトコルに従って実施された。例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、アフィニティカラムからの溶出（ｐＨ２．８）直後に、サイズ排除クロマトグラフィーが実施され、標準的なプロトコルに従って高純度の単量体タンパク質が得られた。タンパク質濃度は、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、予測されたタンパク質配列に従って計算された吸光係数を用いて判定された。必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、濃度が調節された。最後に、精製された分子は、例えば、２～８℃の温度で約１ｍｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水中に保存された。
精製された二重特異性抗原結合タンパク質の品質は、例えば、Ｖａｎｑｕｉｓｈｕ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍ内で、３００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で実行される、ＭａｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラム（５μｍ、４ｘ３００ｍｍ）上で、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによって判定された。
特定の一実施形態では、上記で定義されるＴ細胞がステップａ）において提供され、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲまたはその断片である。したがって、抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞の細胞表面上で発現される。したがって、方法は、本発明の文脈で定義されるように、がん細胞に特異的なＴＣＲなどの抗原結合タンパク質をその表面上に発現するＴ細胞を生成する。
医薬組成物
本発明は、本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物にさらに言及する。
本発明はまた、薬剤として使用するための本発明による抗原結合タンパク質にも関する。本発明はまた、薬剤として使用するための本発明の医薬組成物にも関する。
本発明はまた、薬剤の製造における、本発明による抗原結合タンパク質または／および本発明の医薬組成物の使用にも関する。
「医薬組成物「または「治療用組成物」という用語は、本明細書の用法では、対象に適切に投与され場合に、望ましい治療的効果誘導できる化合物または組成物を指す。
いくつかの実施形態では、対象はまた、患者と称されることもある。
このような医薬組成物は、投与様式との適合性のために選択された薬学的または生理学的に許容される調合剤と混合された、本発明の抗原結合タンパク質、または治療薬をさらに含んでなる抗原結合タンパク質の治療的有効量を含んでなってもよい。
本発明の抗原結合タンパク質は、通常、無菌の医薬組成物の一部として供給され、これは、通常、薬学的に許容可能な担体を含む。
「薬学的に」または「薬学的に許容可能な」とは、哺乳類、特にヒトに投与したときに、適宜、有害反応、アレルギー反応、その他の不都合な反応を生じない分子体および組成物を指す。薬学的に許容可能な担体または賦形剤とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの製剤助剤を指す。
「薬理的に許容可能な担体」はまた、「薬学的に許容可能な希釈剤」または「薬学的に許容可能なビヒクル」と称されることもあり、生理学的適合性である、溶剤、増量剤、安定剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれてもよい。したがって、一実施形態では担体は、水性担体である。
別の態様では、水性担体は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質と組み合わされた場合、例えば、改善された溶解性、効力、および／または改善された免疫療法などの、改善された特性を付与できる。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量、およびレジメンは、必然的に、治療される病状、疾患の重症度、患者の年齢、体重、および性別、所望の治療期間などに依存する。この医薬組成物は、（それを患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適切な形態であってもよい。それは、単位用量剤形で提供されてもよく、一般に密封容器内に提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットには、通常、（必ずしも必要ではないが）使用説明書が含まれる。それは、複数の前記単位用量剤形を含んでもよい。
生物学的半減期などの経験的考察事項は、一般的に投与量の決定に寄与する。投与の頻度は、治療の過程で判定および調整されてもよく、がん細胞の数を低減すること、がん細胞の減少を維持すること、がん細胞の増殖を低減すること、またはがん細胞を滅殺することに基づいている。代案としては、抗原結合タンパク質の持続的な徐放性製剤が適切であってもよい。徐放を達成するための様々な製剤および装置が当該技術分野で公知である。
一実施形態では、抗原結合タンパク質の投与量は、１回または複数回の投与を受けた個人において経験的に決定され得る。個人には、抗原結合タンパク質の漸増投与量が与えられる。抗原結合タンパク質の有効性を評価するために、がん細胞の状態のマーカーが追跡され得る。これらとしては、ＦＡＣＳ、その他の画像技術によるがん細胞増殖および細胞死の直接測定；およびこのような測定によって評価される健康の改善、または認められた試験または生存期間の延長によって測定される生活の質の向上が挙げられる。投与量は、個人、疾患の病期、および使用されている過去および並行治療に応じて変動することが当業者には明らかであろう。
特に、医薬組成物は、注射できる製剤に薬学的に許容可能なビヒクルを含有する。これらは、特に等張性、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）、または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってもよく、これは滅菌水または生理食塩水の添加時に、注射液の構成が可能になる。
医薬組成物を調製するために、本発明の有効量の抗原結合タンパク質は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散されてもよい。
注入用途に適した医薬品形態としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌の注射液または分散液の即時調合のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定している必要があり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されている必要がある。
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で、調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、およびに油中で調製され得る。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐ保存料を含有する。
本発明の抗原結合タンパク質は、薬学的に許容可能な塩を使用して、中性または塩の形態の組成物に調合され得る。
滅菌注射液は、必要に応じて、上に列挙されるその他の様々な成分と共に、適切な溶媒に必要な量の活性化合物を組み込んだ後、濾過滅菌によって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎的分散媒および上に列挙されたものからの必要なその他の成分を含有する、滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法としては、活性成分と、あらかじめ滅菌濾過された溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥技術が挙げられる。
直接注射のためのより濃縮された、または高度に濃縮された溶液の調製もまた想定され、その中では、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、非常に迅速な浸透をもたらし、小さな腫瘍領域に高濃度の活性剤を送達することが想定される。
製剤化されると、溶液は、投与剤形と適合性のある様式で、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記の注射液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた使用され得る。
治療法および使用
本発明者らは、本発明のいくつかの抗原結合タンパク質、特に可溶性ＴＣＥＲ（商標）分子＃１１４－ｉｓｏ０－ＵＣＨＴ１（１７）、＃１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）、＃１１４－ｉｓｏ２－ＵＣＨＴ１（１７）、＃１１４－ｉｓｏ０－ＢＭＡ０３１（３６）、＃１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ０３１（３６）、および＃１１４－ｉｓｏ２－ＢＭＡ０３１（３６）などの本発明のＴＣＥＲ（商標）分子について、Ｈｓ６９５Ｔ、Ａ３７５、およびＵ２ＯＳなどのＭＡＧ－００３陽性がん細胞株に対するこれらの分子の細胞傷害性活性を生体外実験の項の実施例６で示した。本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するがペプチドＭＡＧ－００３を提示しない細胞株において、二重特異性抗原結合タンパク質によってわずかな溶解のみが誘導されたことから、前記細胞傷害活性が非常に特異的であり、ＭＡＧ－００３陽性細胞に限定されることをさらに実証した。
さらに、本発明者らは、実施例７に詳細に記載され、図１１に示されるように、ＮＯＧマウスのＨＳ６９５Ｔ腫瘍を完全寛解に導く、ＭＡＧ－００３（配列番号１２７および１３０、グループ３；配列番号１３５および１３６、グループ４）を標的化するＴＣＥＲ（商標）などの本発明の抗原結合タンパク質の生体内効力を実証した。
本発明者らによって実証されるように、本発明の抗原結合タンパク質は、対象、好ましくは患者において免疫応答を生じさせるのに有用であり、その中では、腫瘍細胞はこの免疫応答によって破壊され得る。ペプチドＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）は、同等のコピー数で正常組織上に提示または過剰提示されないことから、このような治療的ワクチン接種に由来する免疫応答は、腫瘍細胞に対して非常に特異的であると予想され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防ぐ。さらに、本明細書の導入部で示したように、本発明の抗原結合タンパク質は、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ、特に本明細書で定義された前記ペプチドＭＡＧ－００３中のエピトープに特異的に結合し、したがって、正常組織上に存在するその他の関連ペプチド抗原（類似ペプチド）を認識したり、または交差反応したりすることはない。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、免疫療法に有用である。
したがって、本発明の抗原結合タンパク質、特にＴＣＥＲ（商標）分子などの二重特異性抗原結合タンパク質を使用して、がんが治療されてもよい。
本発明の抗原結合タンパク質は、ヒトおよび／または非ヒト哺乳類の動物、特にヒトにおける治療目的で使用されてもよい。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞に結合し、それらの細胞表面上にペプチドＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）／ＭＨＣ複合体提示する、腫瘍細胞の増殖を低減しおよび／または殺滅し得る。抗原結合タンパク質は、生理学的（例えば、生体内）条件での結合を促進する濃度で投与されることが理解される。
したがって、一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、結腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、膵臓、腎臓などの異なる組織の腫瘍細胞に対する免疫療法に使用され得る。別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞に結合し、その増殖を低減しおよび／または殺滅し得る。
したがって、本発明は、それを必要とする対象に、本発明に従って、本明細書で上に「抗原結合タンパク質」、「核酸」または「医薬組成物」の項で定義される、治療有効量の抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物を投与することを含んでなる、増殖性疾患または障害を治療または予防する方法に関する。
特定の実施形態では、本発明は、細胞表面上に本発明の抗原結合タンパク質を発現するＴ細胞を前記対象に投与することを含んでなる、増殖性疾患を有する対象を治療する方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞表面上に本発明の抗原認識コンストラクトを発現するＴ細胞を含んでなる組成物を前記対象に投与することを含んでなる、増殖性疾患を有する対象において免疫応答を惹起する方法に言及する。
一実施形態では、前記方法で言及される免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞応答である。
本発明はさらに、増殖性疾患の診断、予防、および／または治療で使用するための、本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物に言及する。
本発明はさらに、増殖性疾患の診断、予防、および／または治療のための薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の医薬組成物の使用にさらに言及する。
一実施形態では、本発明は、対象における増殖性疾患または障害を治療または予防するための、本発明による抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の使用に言及する。
好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、対象に対して自系であるか、または対象に対して同種異系であり、好ましくは自系である。好ましくは、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球または末梢血単核細胞から得られ得る。好ましくは、Ｔ細胞は、組成物の形態で投与される。好ましい関連する一実施形態において、前記組成物は、アジュバントをさらに含んでなり、その中では、アジュバントは、本明細書で上に医薬組成物の項で定義される。
「対象」または「個体」という用語は同義的に使用され、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類、好ましくはヒトであってもよい。
本発明の文脈において、「治療する」または「治療」という用語は、治療的使用（すなわち、所与の疾患を有する対象における）を指し、このような障害または病状の１つまたは複数の症状の進行を逆転させ、緩和し、阻害することを意味する。したがって、治療は、疾患の完全な治癒をもたらす治療だけでなく、疾患の進行を遅らせ、および／または対象の生存を延長する治療も指す。
「予防する」とは、予防的使用（すなわち、所与の疾患に罹り易い対象における）を意味する。
一実施形態では、「疾患」または「障害」は、本発明の抗原結合タンパク質による治療から利益を得るであろう任意の病状である。一実施形態では、これは、対象を問題の障害に罹り易くする病的状態も含めた、慢性および急性の障害または疾患を含む。
「治療を必要とする」という用語は、既に障害を有する対象、ならびに障害が予防されるべき対象を指す。したがって、一実施形態では、対象は患者である。
がんなどの「増殖性疾患」は、細胞の無制御および／または不適切な増殖を伴う。
一実施形態では、増殖性障害または疾患は、例えば、前記腫瘍疾患のがんまたは腫瘍細胞における、ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８の発現によって特徴付けられる腫瘍疾患である。
したがって、特に好ましいがんは、ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８陽性がんである。
本発明の文脈において、例えば、ＭＡＧ－００３ペプチドなどの関連ペプチドが、ＮＣＩによるガイドラインに従って全てのがんの９８％以上で提示される場合、がんは「ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８「陽性」」であると見なされる。ここで挙げられているあらゆるその他の適応症では、これらのがんの治療における標準であることから生検が実施され得て、ペプチドはＸＰｒｅｓｉｄｅｎｔ（登録商標）および関連方法に従って同定され得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第０３／１００４３２号パンフレット；国際公開第２００５／０７６００９号パンフレット；国際公開第２０１１／１２８４４８号パンフレット；国際公開第２０１６／１０７７４０号パンフレット；米国特許第７，８１１，８２８号明細書、米国特許第９，７９１，４４４号明細書、および米国特許第２０１６／０１８７３５１号明細書による）。一実施形態では、がんは、例えば、本発明の抗原結合タンパク質を使用することによって、容易にアッセイされる（すなわち、診断される）。抗原結合タンパク質を使用してがんを発現する抗原を同定する方法は、当業者に知られている。がん腫は、皮膚、または体器官を覆う組織に発生する特定タイプのがんであるため、「がん」および「がん腫」という用語は、本明細書では互換的に使用されないことが理解されるべきである。しかし、実施例１１で使用される組織サンプルは腫瘍患者に由来し、サンプルは患者の疾患に割り当てられる。
一実施形態では、ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８「陽性」がん、すなわち標的ペプチドを提示するものは、非小細胞肺がんや小細胞肺がんなどの肺がん、肝臓がん、頭頸部がん、皮膚がん、腎細胞がん、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん腫、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、骨肉腫、および食道がんからなる群から選択される。
一実施形態では、ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８「陽性」がん、すなわち標的ペプチドを提示するものは、非小細胞肺がんや小細胞肺がんなどの肺がん、肝臓がん、頭頸部がん、皮膚がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんからなる群から選択される。
別の実施形態では、肺がんが非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、好ましくは非小細胞肺がん腺がんまたは扁平上皮細胞非小細胞肺がん（ＳＮＳＣＬＣ）；または小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、がんは、皮膚がん、好ましくは黒色腫である。別の実施形態では、がんは、頭頸部がん、好ましくは頭頸部扁上皮がん腫（ＨＮＳＣＣ）である。別の実施形態では、がんは肝臓がん、好ましくは肝細胞がん（ＨＣＣ）である。別の実施形態では、がんは食道がん、好ましくは胃食道接合部がんである。
がん治療の指針を提供するテキストとしては、Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）がある。適切な治療アプローチは、特定のタイプのがん、および関連分野で認識されているように、患者の全身状態などのその他の要因に応じて選択される。本発明の抗原結合タンパク質は、それ自体で使用され得て、またはがん患者の治療に典型的に使用されるその他の抗がん剤を使用する治療レジメンに加え得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、化学療法剤、非化学療法剤、抗腫瘍剤、および／または放射線、好ましくは化学療法剤など、がん治療に広く使用されている様々な薬剤および治療法と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。
本明細書における「診断」は、医学的診断を指し、いずれの疾患または病状が人の症状および徴候を説明するかを判定することを指す。
抗原結合タンパク質またはその医薬組成物の「治療有効量」とは、任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で、前記増殖性疾患を治療するのに十分な量の抗原結合タンパク質を意味する。しかし、本発明の抗原結合タンパク質、核酸またはベクター、宿主細胞または医薬組成物の毎日または毎月の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特定の治療有効量レベルは、治療される障害または疾患、および障害の重症度；使用される特定の抗原結合タンパク質の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食生活；投与時間、投与経路、および用いられる特定のポリペプチドの排泄速度；治療持続期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野で周知の同様の要因をはじめとする様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当業者の技術の範囲内で周知である。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質による治療の有効性は、例えば、がんのマウスモデルにおいて、生体内で、例えば、治療群と対照群との間の腫瘍体積の変化を測定することによってアッセイされる。
例えば、本発明の医薬組成物、ベクター、核酸、および細胞は、例えば、実質的に純粋な形態で提供されてもよく、その中では、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００重量％の同じタイプの抗原結合タンパク質が存在する。
本発明の抗原結合タンパク質、本発明の核酸または本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の医薬組成物は、任意の実行可能な方法によって投与され得る。
本明細書で開示されるように、いくつかの実施形態では、宿主細胞、好ましくはＴリンパ球またはＴリンパ球前駆細胞などのリンパ球、例えばＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞、最も好ましくはＴ細胞が、本明細書に記載の医学的使用または治療方法で使用される。
したがって、本発明の宿主細胞、好ましくはＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明はまた、患者において標的細胞を滅殺する方法を提供し、方法は、上記で定義される有効数の宿主細胞、好ましくはＴ細胞を患者に投与することを含んでなる。この方法の文脈において、宿主細胞は、ひとたび対象に投与されると、好ましくは免疫応答を惹起する。
宿主細胞または細胞の集団が対象に投与される本発明の方法の目的のために、宿主細胞は、（別の対象からの）同種異系であるか、または対象に対して自系である細胞であり得る。好ましくは、細胞は対象にとって自系である。
宿主細胞が同種異系であり、したがって別の対象からのものである場合、前記別の対象は健康である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２０１９０１７５６５０号明細書、米国特許出願第１６／２７１，３９３号明細書、および米国特許出願第１６／３６１，０４３号明細書に記載される方法に従って製造されてもよい。
「健康」とは、対象が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得るいかなる疾患にも罹患していないことを意味する。
特定の例では、宿主細胞はＴ細胞である。したがって、本発明の文脈において、本明細書で上に定義されるＴ細胞が薬剤として使用される場合、通常、Ｔ細胞は、アフェレーシスによって対象から採取される。次に、Ｔ細胞は、それらの細胞表面上に本発明の抗原結合タンパク質を発現するように遺伝子操作され、次に、遺伝子操作されたＴ細胞は増殖され、次に、対象に再注入される。この例では、抗原結合タンパク質は好ましくはＴＣＲである。
別のアプローチでは、宿主細胞は、間葉系幹細胞などの幹細胞であってもよく、本発明の抗原結合タンパク質を発現するように操作される。この例では、抗原結合タンパク質は、抗体、ｓｃＴＣＲなどの可溶性タンパク質、または本明細書で定義される可溶性抗原結合タンパク質、より好ましくは、本明細書に記載のＴＣＥＲ（商標）などの二重特異性可溶性抗原結合タンパク質である。
したがって、宿主細胞は、本明細書で上に「核酸、ベクター、および組換え宿主細胞」の項に記載されるように、本発明による核酸および／またはベクターで形質転換、形質導入、または形質移入されている。
本発明の抗原結合タンパク質を発現するために宿主細胞が形質転換、形質導入または形質移入される場合、好ましくは、細胞は、抗原結合タンパク質を発現できる発現ベクターを含んでなる。宿主細胞が本発明の抗原結合タンパク質を発現すると、宿主細胞は、活性化宿主細胞と称されてもよい。
Ｔ細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。概説は、Ｇａｔｔｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（２００６）：３８３－３９３；Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４（２００６）：１２６－１２９）にある。
生体外でＴ細胞を生成するために、いくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５（１９９５）：１７８３－１７８７）は、Ｔ細胞の調製において自系末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用した。Ｂ細胞もまた、自己由来Ｔ細胞の生成において使用され得る。
Ｔ細胞の調製では、同種異系細胞もまた使用されてもよく、方法は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第６８０５８６１号明細書で詳細に記載されている。
一態様では、ＴＣＲ惹起免疫応答またはＴ細胞応答は、生体外または生体内で、ＭＡＧ－００３／ＭＨＣ複合体への結合によって誘導されるエフェクター機能の増殖および活性化を指してもよい。例えば、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、または天然にペプチドを提示する、標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、またはＩＬ－２であるサイトカインの分泌；例えば、ペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
本明細書で上に記載されるように、ＭＡＧ－００３／ＭＨＣ複合体に特異的に結合する本発明の抗原結合タンパク質を発現するＴ細胞などの宿主細胞は、治療において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化宿主細胞を提供する。
上記方法によって生成される活性化宿主細胞は、標的細胞を選択的に認識してもよい。
本明細書の「標的細胞」は、上記の提示細胞本明細書で上に「抗原結合タンパク質」の項で定義されるＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ提示細胞を指す。
一実施形態では、標的細胞好ましくはがん細胞であり、その中では、がんは本明細書で上に定義される。
生体内で、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、（時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）腫瘍細胞であり得て、および／または腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る（時にＭＨＣクラスＩＩもまた発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２（２００６）：４１６３－４１７０）。
キット
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質を含んでなるキットを提供する。
一実施形態では、キットは、
ａ）本明細書で上に「抗原結合タンパク質」の項 で定義される 少なくとも１つの本発明の抗原結合タンパク質；
ｂ）任意選択的に包装材料、および
ｃ）任意選択的に、がんを治療するのに、またはがんの治療で使用するのに、前記抗原結合タンパク質が有効であることを示す、前記包装材料内に含まれるラベルまたは包装挿入物
を含んでなる。
関連する実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質は、単一および／または複数チャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよび溶解シリンジ）に含有されている。
一実施形態では、本発明は、単回投与投与ユニットを製造するためのキットを包含する。
したがって、一実施形態では、本発明のキットのａ）で言及される本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質は、第１の容器に含有される本発明の乾燥抗原結合タンパク質である。次に、キットは、水性製剤を有する第２の容器をさらに含む。
したがって、キットは、
ａ）本明細書で上に「抗原結合タンパク質」の項で定義される本発明の少なくとも１つの乾燥抗原結合タンパク質を含んでなる第１の容器、
ｂ）水性製剤を含んでなる第２の容器；
ｃ）任意選択的に包装材料、および
ｄ）任意選択的に、がんを治療するのに、またはがんの治療で使用するのに、前記抗原結合タンパク質が有効であることを示す、前記包装材料内に含まれるラベルまたは包装挿入物
を含んでなる。
水性製剤は、典型的には、本明細書で上に「医薬組成物」の項で定義される、薬理的に許容可能な担体を含んでなる水溶液である。
関連する実施形態では、「第１の容器」および「第２の」容器は、複数チャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、溶解シリンジ）のチャンバーを指す。
がんは、本発明の文脈において本明細書で上に定義される。
本出願を通して、「および／または」という用語は、それが接続する１つまたは複数の状況が発生してもよいことを包含すると解釈されるべき文法的接続詞である。例えば、「このような天然配列タンパク質は、標準的な組換えおよび／または合成方法を使用して調製され得る」という表現は、天然配列タンパク質が、標準的な組換え法と合成法とを使用して調製され得ること、天然配列タンパク質が、標準組換え法を使用して調製され得ること、または天然配列タンパクが、質合成法を使用してが調製され得ることを示す。
さらに、本出願を通して、「含んでなる」という用語は、具体的に言及された全ての機能、ならびに任意選択的で、追加的な、特定されていない機能を包含すると解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「含んでなる」という用語の使用はまた、具体的に言及された特徴以外の特徴が存在しない（すなわち、「からなる」）実施形態も開示する。
さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を除外しない。特定の措置が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの措置の組み合わせを有利に使用できないことを示すものではない。
次に、以下の図および実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。本明細書で引用される全ての資料および特許文献は、それらの内容全体が本明細書に参照により援用される。本発明を図示し、前述の説明で詳細に説明してきたが、実施例は例示的または模範的なものであり、制限的なものではないと見なされるべきである。
配列の説明
Figure 2022541349000003
Figure 2022541349000004
Figure 2022541349000005
Figure 2022541349000006
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Figure 2022541349000011
Figure 2022541349000012
Figure 2022541349000013
Figure 2022541349000014
図１～１８は、本明細書に記載される実施形態を示す。
酵母表面提示を介して、ＴＣＲを安定化されたｓｃＴＣＲに変換した結果を示す。形質転換されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００の表面上に提示されたＳｃＴＣＲ分子は、ＦＩＴＣ標識抗Ｖβ８抗体およびＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体で染色された。非修飾のｓｃＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５（左側パネル、配列番号１９）と、ランダム変異ｓｃＴＣＲライブラリの選択に由来する、２つの安定化単一点変異を保有するｓｃＴＣＲ変異型（右側パネル、配列番号２２）とが比較される。２つの安定化単一点変異を保有するｓｃＴＣＲ変異型は、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体染色の増加を示すことが分かる。 図２Ａ：ＣＤＲ３αのｓｃＴＣＲ親和性成熟に関する、酵母表面提示の結果を示す。非修飾および成熟ＣＤＲ３αを含んでなる安定化されたｓｃＴＣＲは、１５ｎＭの濃度のＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体で染色された。ＭＡＧ－００３（配列番号１）との高い配列類似性を有するペプチド（配列番号２３～３２）を含有する、それぞれ１０ｎＭの濃度で適用された１０個のＨＬＡ－Ａ＊０２四量体の混合物による対比染色。非修飾α鎖ＣＤＲ３配列ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ（配列番号７）を含む安定化されたｓｃＴＣＲ（配列番号２２）は、親和性成熟α鎖ＣＤＲ３配列ＣＡＥＦＳＳＡＳＫＩＩＦ（配列番号３８）、ＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３５）、ＣＡＥＦＴＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３６）、ＣＡＥＦＮＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３７）、およびＣＡＥＡＴＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３９）を含んでなるｓｃＴＣＲ変異型と、それぞれ比較された。ＣＤＲのα２（配列番号５６、５７、５９）、β１（配列番号６２）、β２（配列番号６３、６４、６５、６６、７０）が変異している酵母クローンもまた、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３に対する特異性が主に維持される一方で、結合性が強く向上していることが分かる。 図２Ｂ：それぞれ、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、およびＣＤＲ２βのｓｃＴＣＲ親和性成熟の酵母表面提示の結果を示す。非修飾および成熟ＣＤＲを含んでなる安定化ｓｃＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体（標的化ｐＨＬＡ単量体）で染色され、ＭＡＧ－００３（配列番号１）と高い配列類似性を有するペプチド（配列番号２３～３２）を含有する、それぞれ１０ｎＭの濃度で適用された１０個のＨＬＡ－Ａ＊０２テトラマーの混合物で対比染色された。（ａ）それぞれ４０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体で染色された、非修飾（配列番号６）、および成熟α鎖ＣＤＲ２配列ＩＹＳＳＱＤＱ（配列番号５６）、ＩＹＳＳＱＤＶ（配列番号５７）、およびＩＹＳＳＱＤＳ（配列番号５９）を含む、ｓｃＴＣＲ変異型の比較。（ｂ）それぞれ１５ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体で染色された、非修飾（配列番号７）、および成熟α鎖ＣＤＲ３配列ＣＡＥＦＳＳＡＳＫＩＩＦ（配列番号３８）、ＣＡＥＭＴＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３５）、ＣＡＥＦＴＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３６）、ＣＡＥＦＮＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３７）およびＣＡＥＡＴＳＥＳＫＩＩＦ（配列番号３９）を含むｓｃＴＣＲ変異型の比較。（ｃ）それぞれ４０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体で染色された、非修飾（配列番号１２）、および成熟β鎖ＣＤＲ１配列ＰＧＨＤＹ（配列番号６２）を含む、ｓｃＴＣＲ変異型の比較。（ｄ）それぞれ５ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体で染色された、非修飾（配列番号１３）、および成熟β鎖ＣＤＲ２配列ＦＣＹＧＨＰ（配列番号６３）、ＦＣＹＧＶＰ（配列番号６４）、ＦＣＹＧＴＰ（配列番号６５）、ＦＣＹＧＡＰ（配列番号６６）、ＦＣＹＧＭＰ（配列番号７０）を含む、ｓｃＴＣＲ変異型の比較。ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体による染色は、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５と比較した場合、全てのＲ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体で有意に増加し、変異体変種のペプチド－ＨＬＡ結合が改善されたことを示す。 ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体およびＦＩＴＣ標識抗Ｖβ８抗体による、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型の染色を示す。対照の目的で、ＴＣＲ（ＭＯＣＫ）またはＮＹＥＳＯ１－００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲを発現させず、ＰＥで標識したＨＬＡ－Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１－００１４量体を用いて染色した。 ＭＡＧ－００３に応答してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する、成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型のＩＦＮ－γ放出を示す。対照の目的で、ＴＣＲ（ＭＯＣＫ）またはＮＹＥＳＯ１－００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲを発現させなかった。ＩＦＮ－γ放出は、電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＡＧ－００３の連続希釈液が負荷されたＴ２細胞との共培養後に、ＥＬＩＳＡによって判定された。（それぞれ負荷されたＴ２細胞との共培養時に、模擬電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって放出された）ＩＦＮ－γのベースラインレベルが差し引かれた。親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５と比較して、成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体１～５は、ＭＡＧ－００３に応答してＩＦＮ－γ放出の増加を示した。 ＭＡＧ－００３および異なる類似ペプチドに応答してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する、成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型のＩＦＮ－γ放出を示す。対照の目的で、ＴＣＲ（ＭＯＣＫ）またはＮＹＥＳＯ１－００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲを発現させなかった。ＩＦＮ－γ放出は、電気穿孔されＣＤ８＋Ｔ細胞と、１０μＭのペプチドが負荷されたＴ２細胞との共培養後に、ＥＬＩＳＡによって判定された。（それぞれ負荷されたＴ２細胞との共培養時に、模擬電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって放出された）ＩＦＮ－γのベースラインレベルが差し引かれた。親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５と比較して、成熟したＲ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体１～５は、ＭＡＧ－００３に応答してＩＦＮ－γ放出の増加を示し、試験された類似ペプチドではＩＦＮ－γ放出を示さなかった。 ＭＡＧ－００３およびそれぞれのアラニン置換ペプチドに応答してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する、成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型のＩＦＮ－γ放出を示す。対照の目的で、ＴＣＲ（ＭＯＣＫ）またはＮＹＥＳＯ１－００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲを発現させなかった。ＩＦＮ－γ放出は、電気穿孔されＣＤ８＋Ｔ細胞と、１０μＭのペプチドが負荷されたＴ２細胞との共培養後に、ＥＬＩＳＡによって判定された。（それぞれ負荷されたＴ２細胞との共培養時に、模擬電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって放出された）ＩＦＮ－γのベースラインレベルが差し引かれた。 図７Ａ：異なる親和性成熟ＣＤＲおよび／またはフレームワーク変異を有するＴＣＲ可変ドメインを含んでなる、可溶性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ抗原結合タンパク質の生産収率および熱ストレス安定性データを示す。 図７Ｂ：バイオレイヤー干渉法によって測定された、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中のＭＡＧ－００３に対する可溶性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ抗原結合タンパク質Ｓ、＃１、＃２、およびＩの結合曲線を示す。溶液中のＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体の濃度を上げながら各相互作用測定に使用し、単位はｎＭで示される。 図７Ｃ：それぞれＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある、ＭＡＧ－００３、および正常組織由来のオフターゲットペプチドＳＹＮＥ３－００１、ＴＰＸ２－００１、ＰＳＭＥ２－００１に対する、可溶性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ抗原結合タンパク質Ｉ（灰色の曲線）および＃１９（黒色の曲線）の結合曲線を示す。測定にはバイオレイヤー干渉法が用いられ、溶液中のｓｃＴＣＲ－Ｆａｂの濃度は１μＭとした。 図８Ａ：ヒト化Ｔ細胞動員抗型ＢＭＡ０３１（３６）の異なるＶＨ／ＶＬ配列、ならびにヒト化Ｔ細胞動員抗体ＵＣＨＴ１の異なる変異型１７、１７ｏｐｔ、２１、２３と組み合わされた、選択された親和性成熟ＣＤＲを有するＴＣＲ可変ドメインを含んでなる、可溶性ＴＣＥＲ（商標）抗原結合タンパク質の生産収率および熱ストレス安定性データを示す。 図８Ｂ：ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中のＭＡＧ－００３のＵＣＨＴ１（１７）およびＢＭＡ０３１（３６）と組み合わされた、ＴＣＲ可変ドメイン変異型１１４－ｉｓｏ０、１１４－ｉｓｏ１、および１１４－ｉｓｏ２を含んでなるＴＣＥＲ（商標）抗原結合タンパク質の結合曲線を示す。測定にはバイオレイヤー干渉法が用いられ、溶液中のＴＣＥＲ（商標）分子の濃度を上げながら適用し、単位はｎＭで示される。 図８Ｃ：それぞれジスルフィド安定化ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある、ＭＡＧ－００３および正常組織由来のオフターゲットペプチドＮＯＭＡＰ－１－０３２０、ＮＯＭＡＰ－１－１２２３、ＯＤＣ－００１に対する、１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）および１１４－ｉｓｏ２－ＵＣＨＴ１（１７）ＴＣＥＲ（商標）分子の結合曲線を示す。測定にはバイオレイヤー干渉法が用いられ、溶液中のＴＣＥＲ（商標）の濃度は１μＭとした。 検出可能なＭＡＧ－００３発現があった（Ｈｓ６９５ＴおよびＡ３７５）および検出可能なＭＡＧ－００３発現がなかった（ＢＶ１７３）、ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株のＴＣＥＲ（商標）媒介殺滅の生体外効率データを示す。ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ０（配列番号１２７および１３０）、＃１１４－ｉｓｏ１（配列番号１３１および１３０）、および＃１１４－ｉｓｏ２（配列番号１３３および１３０）の可変ドメインを有する、ＵＣＨＴ１（１７）抗体可変ドメインを含んでなる、ＴＣＥＲ（商標）分子が試験された（上部パネル）。さらに、ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ０（配列番号１３５および１３６）および＃１１４－ｉｓｏ２（配列番号１３９および１３６）の可変ドメインを有する、ＢＭＡ０３１（３６）抗体可変ドメインを含んでなる、ＴＣＥＲ（商標）分子が試験された（下部パネル）。腫瘍細胞と、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー（ＨＢＣ－７２０）のヒトＰＢＭＣとを１：１０の比率で同時インキュベートし、ＴＣＥＲ（商標）分子の濃度を上げながら細胞傷害活性をＬＤＨ－放出アッセイで分析した。４８時間後、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して、標的細胞株の溶解を測定した。ＵＣＨＴ１（１７）およびＢＭＡ０３１（３６）抗体を含んでなるＴＣＥＲ（商標）分子の効率的な細胞溶解が示される。 検出可能なＭＡＧ－００３発現を伴うＨＬＡ－Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株（Ｈｓ６９５Ｔ、Ａ３７５、およびＵ２ＯＳ）のＴＣＥＲ（商標）を介した生体外での滅殺を示す。ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ１（配列番号１３１および１３０）および＃１１４－ｉｓｏ２（配列番号１３３および１３０）の可変ドメインを有する、ＵＣＨＴ１（１７）抗体可変ドメインを含んでなる、ＴＣＥＲ（商標）分子、ならびにＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ１（配列番号１３７および１３６）の可変ドメインを有するＢＭＡ０３１（３６）抗体の可変ドメインを含んでなるＴＣＥＲ（商標）分子が試験された。腫瘍細胞と、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー（ＨＢＣ－９８２）のヒトＰＢＭＣとを１：１０の比率で同時インキュベートし、ＴＣＥＲ（商標）分子の濃度を上げながら細胞傷害活性をＬＤＨ－放出アッセイで分析した。４８時間後、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して、腫瘍細胞株の溶解を測定した。ＵＣＨＴ１（１７）およびＢＭＡ０３１（３６）抗体を含んでなるＴＣＥＲ（商標）分子の効率的な腫瘍細胞溶解が示される。 ＭＡＧ－００３（配列番号１）およびＰＲＡＭＥ－００４（配列番号１６８）の検出可能な提示を有する、ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株であるＨｓ６９５Ｔ細胞の腫瘍異種移植片に対する、ヒトＰＢＭＣを移植した免疫不全ＮＯＧマウスにおける。ＴＣＥＲ（商標）媒介生体内の有効性を示す。ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ０（配列番号１２７および１３０、グループ３）の可変ドメインを有する、ＵＣＨＴ１（１７）抗体可変ドメインを含んでなるＴＣＥＲ（商標）が、ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ０（配列番号１３５および１３６、グループ４）の可変ドメインを有する、ＢＭＡ０３１（３６）抗体可変ドメインを含んでなるＴＣＥＲ（商標）と比較された。対照として、ＰＲＡＭＥ－００４を標的化するＴＣＥＲ（配列番号１６９および１７０、グループ２）が使用された。グループ１はビヒクル処置対照群に相当し、その中では１１日目に腫瘍潰瘍のために１匹の動物が殺処分された。線で結ばれた各記号は個々の動物をに相当し、治療日は矢印で示される。Ｔ細胞動員のためのＵＣＨＴ１（１７）抗体とＢＭＡ０３１（３６）抗体とを含んでなるＴＣＥＲ（商標）について、完全寛解が示される。 ＴＣＥＲ（商標）分子１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６））（配列番号１３７および１３６）の生体外安全性データが、異なる臓器からの１１のヒトＨＬＡ－Ａ＊０２陽性正常組織初代細胞を用いたＬＤＨ殺滅実験で評価される。異なる細胞は、ＴＣＥＲ（商標）濃度を上げながら、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナーからのＰＢＭＣエフェクター細胞と１：１０の比率で共培養された。細胞は、初代組織細胞特異的培地とＴ細胞培地との５０％混合物中で同時インキュベートされた。安全域を判定するために、ＴＣＥＲ（商標）分子が、ＭＡＧ－００３陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔと同じ設定で同時インキュベートされた。安全域は、カットオフ値を超える応答を示す最初のＴＣＥＲ（商標）濃度として判定された、最小影響量（ＬＯＥＬ）に基づいて定義された。カットオフは（［全ての三連からの標準偏差ｘ３］＋ＴＣＥＲなしの対照正常組織サンプル）として定義され、各細胞傷害性プロットに点線で示される。各正常組織細胞タイプについて、ＬＯＥＬに基づいて判定された安全枠は１，０００倍または１０，０００倍より大きく、１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）ＴＣＥＲ（商標）分子の良好な安全性プロファイルが示唆された。 ＭＡＧ－００３（配列番号１）の検出可能な提示を有する、ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株であるＨｓ６９５Ｔ細胞の腫瘍異種移植片に対する、ヒトＰＢＭＣを移植した免疫不全ＮＯＧマウスにおける、ＴＣＥＲ（商標）媒介生体内の有効性を示す。ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ１（配列番号１３１および１６７、グループ３）の可変ドメインを有する、ＵＣＨＴ１（１７）抗体可変ドメインを含んでなるＴＣＥＲ（商標）が、ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ１（配列番号１３７および１３６、グループ２）の可変ドメインを有する、ＢＭＡ０３１（３６）抗体可変ドメインを含んでなるＴＣＥＲ（商標）と比較された。グループ１は、ビヒクル処置された対照群に相当する。グラフは、グループあたり６匹（グループ２および３）から１０匹（ビヒクル）のマウスに由来する平均腫瘍体積を示す。ＵＣＨＴ１（１７ｏｐｔ）抗体とＴ細胞を動員するＢＭＡ０３１（３６）抗体とを含んでなるＴＣＥＲ（商標）分子を週１回０．０１ｍｇ／ｋｇ体重でｉ．ｖ．投与したところ、完全寛解が示された。 ＮＯＧマウスにおける１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）ＴＣＥＲ（商標）分子の薬物動態プロファイルを示す。マウスは、２ｍｇ／ｋｇ体重の単回静脈内注射を受けた。異なる時点で採取されたサンプルのＴＣＥＲ（商標）の血漿中濃度は、特定のタンパク質ドメインの存在（Ｆｃ－ＶＬアッセイ）または二重特異的結合活性（ＣＤ３－ｐＭＨＣアッセイ）のどちらかを検出するＥＬＩＳＡによって判定された。 ＴＣＥＲ（商標）分子の設計が示される。二重特異性Ｔ細胞結合受容体（ＴＣＥＲ（商標））は、親和性成熟ＴＣＲの可変ドメイン（Ｖα、Ｖβ）と、ヒト化Ｔ細胞動員抗体の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）とを含有する、融合タンパク質である。分子は、エフェクター機能が抑制されたＦｃ部分を使用し、これは、半減期の延長および安定性／製造可能性特性改善もまたもたらす。 ＴＣＥＲ（商標）分子１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６））（配列番号１３７および１３６）の生体外安全性データが、異なる臓器からの１２のヒトＨＬＡ－Ａ＊０２陽性正常組織初代細胞を用いたＬＤＨ殺滅実験で評価される。異なる細胞は、ＴＣＥＲ（商標）濃度を上げながら、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナーからのＰＢＭＣエフェクター細胞と１：１０の比率で共培養された。細胞は、初代組織細胞特異的培地とＴ細胞培地との５０％混合物中で同時インキュベートされた。安全域を判定するために、ＴＣＥＲ（商標）分子が、ＭＡＧ－００３陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔと同じ設定で同時インキュベートされた。安全域は、カットオフ値を超える応答を示す最初のＴＣＥＲ（商標）濃度として判定された、最小影響量（ＬＯＥＬ）に基づいて定義された。カットオフは（［全ての三連からの標準偏差ｘ３］＋ＴＣＥＲなしの対照正常組織サンプル）として定義され、各細胞傷害性プロットに点線で示される。各正常組織細胞タイプについて、ＬＯＥＬに基づいて判定された安全枠は１，０００倍または１０，０００倍より大きく、１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）ＴＣＥＲ（商標）分子の良好な安全性プロファイルが示唆された。 ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３の異なるコピー数を示す腫瘍細胞株に応答した、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型の細胞傷害性およびＩＦＮ－γ放出を示す。対照の目的で、ＴＣＲ（ＭＯＣＫ）またはＮＹＥＳＯ１－００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲを発現させなかった。電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍細胞株と共培養した後、上清中のＬＤＨおよびＩＦＮ－γレベルが判定された。 ペプチド提示について分析された正常組織および腫瘍サンプルは、それらの起源の臓器に従ってグループ化される。上部：技術的反復測定およびアリコート測定からのＭＳシグナル強度の中央値は、ペプチドが検出された単一のＨＬＡ－Ａ＊０２陽性正常（図の左側）および腫瘍サンプル（図の右側）の点としてプロットされる。箱ひげ図は、複数のサンプルにわたる正規化されたシグナル強度を表し、対数空間で定義されている。箱は、中央値、２５パーセンタイル値、および７５パーセンタイル値を示す。ひげは、下位四分位数の１．５四分位間範囲（ＩＱＲ）内にある最低データポイントまで伸び、上位四分位数の１．５ ＩＱＲ内にある最高データポイントまで伸びる。下部：各臓器中の相対ペプチド検出頻度が、棒グラフとして示される。パネルの下の数字は、各臓器のこの分析について評価されたサンプルの総数のうち、ペプチドが検出されたサンプルの数を示す（Ｎ＝５８１の正常サンプル、Ｎ＝７７１の腫瘍サンプル）。ペプチドがサンプル上で検出されたが、技術的理由で定量化され得なかった場合、サンプルは、この検出頻度表示に含まれるが、図の上部に点は示されない。
使用された略語：ａｄｉｐｏｓｅ：脂肪組織；ａｄｒｅｎａｌ ｇｌ：副腎；ｂｌａｄｄｅｒ：膀胱；ｂｌｏｏｄｖｅｓｓ：血管；ｅｓｏｐｈ：食道；ｇａｌｌ ｂｌ：胆嚢；ｉｎｔｅｓｔ．ｌａ：大腸；ｉｎｔｅｓｔ．ｓｍ：小腸；ｎｅｒｖｅ ｃｅｎｔ：中枢神経；ｎｅｒｖｅ ｐｅｒｉｐｈ：末梢神経；ｐａｒａｔｈｙｒ：副甲状腺；ｐｅｒｉｔ：腹膜；ｐｉｔｕｉｔ：下垂体；ｓｋｅｌ．ｍｕｓ：骨格筋；ＡＭＬ：急性骨髄性白血病；ＢＲＣＡ：乳がん；ＣＣＣ：胆管細胞がん腫；ＣＬＬ：慢性リンパ球性白血病；ＣＲＣ：結腸直腸がん；ＧＢＣ：胆嚢がん；ＧＢＭ：神経膠芽腫；ＧＣ：胃がん；ＧＥＪＣ：胃食道接合部がん；ＨＣＣ：肝細胞がん腫；ＨＮＳＣＣ：頭頸部扁上皮がん腫；ＭＥＬ：黒色腫；ＮＨＬ：非ホジキンリンパ腫；ＮＳＣＬＣａｄｅｎｏ：非小細胞肺がん腺がん；ＮＳＣＬＣｏｔｈｅｒ：ＮＳＣＬＣａｄｅｎｏまたはＮＳＣＬＣｓｑｕａｍに明確に割り当てることができなかったＮＳＣＬＣサンプル；ＮＳＣＬＣｓｑｕａｍ：扁平上皮細胞非小細胞肺がん；ＯＣ：卵巣がん；ＯＳＣＡＲ：食道がん；ＰＡＣＡ：膵臓がん；ＰＲＣＡ：前立腺がん；ＲＣＣ：腎細胞がん腫；ＳＣＬＣ：小細胞肺がん；ＵＢＣ：膀胱がん腫；ＵＥＣ：子宮および子宮内膜がん。
がん抗原に対する細胞受容体（ＴＣＲ）は、ウイルス抗原を標的化するＴＣＲと比較した場合に、親和性がより低いことが多く、これは腫瘍の免疫逃避の１つの可能な説明であってもよい（Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；４２（１２）：３１７４－９）。したがって、養子細胞療法におけるがん抗原標的化コンストラクトとして、または可溶性治療薬、すなわち二重特異性分子の認識モジュールとしての使用のために、より高い親和性を有するＴＣＲ変異型を生成することが望ましい（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２０１６ Ｓｅｐ；２１（８）：７６９－８５）。したがって、本発明は、腫瘍関連ペプチドＭＡＧ－００３（配列番号１）に対する高い結合力および選択性に基づいて、ヒト天然ＴＣＲレパートリーから同定されたＴ細胞受容体Ｒ７Ｐ１Ｄ５の修飾および最適化に関する。ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５は、国際公開第２０１７／１５８１０３号パンフレットで開示されている、配列番号４のアミノ酸配列を有するα可変ドメインと、配列番号１１のアミノ酸配列を有するβ可変ドメインとを含んでなる。
実施例１：安定したｓｃＴＣＲの生成
本発明では、ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５（配列番号２および９、全長）を、可変α（配列番号４）およびβ（配列番号１１）ドメインと、適切なグリシン－セリンリンカー配列を使用して、一本鎖ＴＣＲコンストラクト（ｓｃＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５、配列番号１９）に変換した。酵母表面提示を介したＴＣＲ成熟のために、対応する配列のＤＮＡを合成し、リーダー配列とＡｇａ２ｐ酵母交配タンパク質（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）とを含有する、ｐＣＴ３０２ベースの酵母提示ベクター（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００；３２８：４３０－４４）と一緒に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００に形質転換した（ＭＡＴａＡＧＡ１：：ＧＡＬ１￢ＡＧＡ１：：ＵＲＡ３ｕｒａ３￢５２ｔｒｐ１ｌｅｕ２￢δ２００ｈｉｓ３￢δ２００ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ｐｒｂｄ１．６Ｒｃａｎ１ＧＡＬ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＭＹＡ￢４９４１（商標））。酵母中での相同組換え後に得られた融合タンパク質（配列番号１６）は、目的のタンパク質の提示に関与するＡｇａ２ｐタンパク質のＮ末端にあるリーダーペプチド（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ Ｊｕｎ；１５（６）：５５３－７）、発現制御のためのリンカー配列（配列番号１８および２０）を含む短鎖ペプチド、および目的のタンパク質、すなわち、ｓｃＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５（配列番号１９）またはその変異型を含有する。ｓｃＴＣＲ変異型のライブラリは、ｓｃＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５の全遺伝子配列にわたるランダム変異ＰＣＲアプローチを介して生成した。国際公開第２０１８／０９１３９６号パンフレットに記載されるように、酵母細胞の形質転換を実施し、ライブラリーあたり最大１０９の酵母クローンを得た。ＨＬＡ－Ａ＊０２の文脈でＭＡＧ－００３への結合が改善された変異体ｓｃＴＣＲ変種を保有する酵母クローンの選択プロセスは、基本的にＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１９：９５－１４１）に記載されるように実施した。酵母表面に提示されたＲ７Ｐ１Ｄ５ ｓｃＴＣＲ変異型の高発現と正しいコンフォメーションを確認するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体染色と共に、抗Ｖβ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、クローン１Ｃ１）抗体による染色を使用した（図１）。酵母表面提示によるｓｃＴＣＲ変換は、細胞表面上のｓｃＴＣＲの適切な提示のための２つの決定的に重要な安定化変異を明らかにし、１つはｓｃＴＣＲα鎖のフレームワーク領域ＦＲ１－ａ（配列番号８３）にあり、もう１つはα鎖のＣＤＲ２（配列番号６）にあり、これにより、安定化バージョンｓｃＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５Ｓ（配列番号２２）が得られ、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体結合の改善がもたらされた。
実施例２：安定化ｓｃＴＣＲの親和性成熟
ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３に対するより高い結合親和性を有するｓｃＴＣＲ分子を生成するために、以前に同定された安定化ｓｃＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５Ｓ（配列番号２２）を使用して、全てのＣＤＲを個別に成熟させた。ＣＤＲ残基は、本質的に以前記載されたように、縮重ＤＮＡオリゴプライマーを使用して無作為化した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１９：９５－１４１）。得られたＤＮＡライブラリーを実施例１で説明したように形質転換した。結合特異性を維持するために、ＭＡＧ－００３ペプチド（配列番号１）と、高度な配列類似性を示す正常組織由来ペプチド（配列番号２３～３２）とを含んでなる、ＨＬＡーＡ＊０２四量体の混合物に対する、負の選択を採用した。
親和性が強化された選択的なＲ７Ｐ１Ｄ５Ｓｓｃ ＴＣＲ変異型を選択するために、各選択ラウンドで、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体または単量体を濃度を下げながら使用した。３回の選択ラウンドの後、単一のｓｃＴＣＲクローンが分離および配列決定され、その結果、異なる親和性成熟ＣＤＲ配列が得られた。成熟ＣＤＲａ３配列（配列番号３５～３９）を有するｓｃＴＣＲについて例示的に示されるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３単量体結合の強力な改善を実証できた。ＭＡＧ－００３ペプチド（配列番号１）との高度な配列類似性を有する正常組織由来ペプチドを含有する、１０個のＨＬＡ－Ａ＊０２四量体の混合物への低い結合によって確認されたように、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３結合の選択性は保持された。ＣＤＲａ３変異体５（配列番号３９）は、四量体ＨＬＡ－Ａ＊０２／類似ペプチドのわずかに増加した交差結合を示した（図２Ａ）。さらに、変異したＣＤＲα（配列番号５６、５７、５９）、β１（配列番号６２）またはβ２（配列番号６３、６４、６５、６６、７０）を有する酵母クローンからは、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３の特異性が主に保持されながら、結合が大幅に改善されたことが明らかになった（図２Ｂ）。
実施例３：細胞発現のための成熟ＴＣＲの使用
腫瘍特異的ペプチドＭＨＣを認識するＴＣＲを発現するためのＴ細胞の修飾は、Ｔ細胞をがん細胞にリダイレクトする有望なストラテジーである。成熟したＣＤＲ３配列を使用することで、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３に対する細胞結合ＴＣＲの反応性を向上させることができ、同定されたＣＤＲａ３変異体配列（配列番号３５～３９）を親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５α鎖（配列番号２）上にグラフトし、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５β鎖（配列番号９）と組み合わせた。得られた変異体ＴＣＲ変種（それぞれ、α鎖変異型配列配列番号４０～４４を含んでなる、Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体１～５）は、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡコンストラクトの生体外転写によって生成された、それぞれのｍＲＮＡの電気穿孔後に、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞で発現させた。対照の目的で、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中のＮＹＥＳＯ１－００１ペプチド（配列番号４５）に対して向けられた、１Ｇ４ ＴＣＲ（配列番号１３２および１３４）を発現させた。ＲＮＡが電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞を一晩インキュベートした後、ＰＥ標識ペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２四量体およびＦＩＴＣ標識抗Ｖβ８抗体で染色することによって、導入されたＴＣＲ変異型の発現を分析した。親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５およびそれに由来する全ての変異型は模擬電気穿孔サンプルおよびＶβ８陰性ＮＹＥＳＯ１ ＴＣＲ対照からのバックグラウンドレベルと比較して、同様の抗Ｖβ８染色を示したことから、発現効率が類似していることが示唆された。対照的にＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３四量体による染色は、親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５（図３）と比較した場合、全てのＲ１Ｐ５Ｄ３ ＣＤＲａ３変異体で有意に増加し、変異体変種のペプチド－ＨＬＡ結合が改善されたことが示された。ＭＡＧ－００３の希釈系列（図４）またはＭＡＧ－００３と潜在的なオフターゲットペプチドの１０μＭのいずれかを負荷したＴ２標的細胞（２０，０００細胞／ウェル）に対するＴ細胞媒介ＩＦＮ－γ放出を測定することによって、異なるＲ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（２０，０００細胞／ウェル）の機能的活性化を調べた（図５）。潜在的なオフターゲットペプチドは、ＭＡＧ－００３との高い配列類似性（類似性ＢＬＡＳＴ検索）に基づいて、正常組織に提示されたＨＬＡ－Ａ＊０２結合ペプチドのデータベース（ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴデータベース）から選択した。親ＴＣＲ Ｒ７Ｐ１Ｄ５と比較して、成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体１～５は増加した反応性を示し（図４）、最大半量ＩＦＮ－γ放出を誘発するのに必要な濃度（ＥＣ５０値、表４）が３～９分の１であることが示された。予測されたように、追加的なＴＣＲ（ＭＯＣＫ）またはＮＹＥＳＯ１－００１に特異的な１Ｇ４対照ＴＣＲを発現しないＴ細胞では、バックグラウンドＩＦＮ－γ放出のみが観察された。成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型のＭＡＧ－００３認識の選択性を分析するために、異なる類似ペプチド（配列番号２３～３４）が負荷されたＴ２細胞に応答したＩＦＮ－γ放出を分析した。データは、それぞれ負荷されたＴ２細胞との共培養時に、模擬電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮ－γレベルを差し引くことによって、バックグラウンドＩＦＮ－γ放出について補正した。Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体５がいくつかの類似ペプチドに対してわずかにシグナルが増加したことと、Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体２がＭＩＡ３－００１に対して低いシグナルを示したことを除いて、全てのその他の成熟Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＴＣＲ変異型は、試験された類似ペプチドに対して交差反応性を示さず、高度に選択的であった（図５）。全てのＴＣＲ変異体変種は、親ＴＣＲと比較して大幅に高いＭＡＧ－００３特異的ＩＦＮ－γ放出を誘導したことから、Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体４、１、および３（および潜在的に２）は、細胞ＴＣＲベースの腫瘍標的化の最も有望な候補である。Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体１～５は、変異解析によって、結合エピトープに関してさらに特性決定した。１、５、７、および８位におけるアラニン置換が応答を抑止することから、Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体１～４は、これらの位置におけるストリンジェントな認識を有する広範な結合エピトープを示した。変異体１などの一部のＲ７Ｐ１Ｄ５変異型では、３位のアラニン置換についてもわずかな影響が観察された。類似ペプチドで示されるより低い特異性に一致して、Ｒ７Ｐ１Ｄ５ ＣＤＲａ３変異体５ ＴＣＲは、変異体変種１～４と比較した場合に、ストリンジェンシーが低下した位置７および８を認識した（図６）。ＣＤＲａ３変異体ＴＣＲ変種の機能的活性は、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３の異なるコピー数を提示する腫瘍細胞株上でさらに評価した。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞は、３：１のエフェクター対ターゲット比で（ＮＣＩ－Ｈ１７５５、ＭＣＦ－７：２５，０００細胞／ウェル、Ｈｓ６９５Ｔ、Ａ３７５、Ｕ２Ｏ：１２，５００細胞／ウェル）、腫瘍細胞株と共培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞に導入されたＴＣＲ変異型の発現は、上記のように検証した。エフェクター細胞と標的細胞を２４時間共培養した後、上清中に放出されたＬＤＨとＩＦＮ－γのレベルを定量化した。ＬＤＨレベルは、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して測定し、細胞傷害性は、エフェクター細胞とターゲット細胞の自発的なＬＤＨ放出を差し引いた後、完全溶解対照に対する百分率として計算した。全てのＣＤＲａ３変異体ＴＣＲ変種は、親ＴＣＲと比較して、全ての分析された腫瘍細胞株のより強力な殺滅を誘発した一方で、標的陰性ＭＣＦ－７細胞では殺滅は観察されなかった。より少ない標的コピー数を提示する腫瘍細胞株（Ａ３７５、Ｕ２ＯＳ）では、野生型ＴＣＲに対して最小限の細胞傷害性のみが認められた一方で、特に、成熟変異型１～４は実質的な滅殺を誘導でき、これはこれらの変異型が低い標的コピー数の患者集団の治療を可能にすることを示す。細胞傷害性データと一致して、野生型との比較で、成熟ＴＣＲ変異型を発現するＴ細胞でもＩＦＮ－γ放出の増強が観察された。
表4：親R7P1D5およびCDRa3変異型変異1～5の最大半量IFN-γ放出の濃度[nM]。親TCR R7P1D5は配列番号2および11に基づき、変異型変種TCR 1～5はそれぞれ配列番号40～44、および配列番号11に基づく。
Figure 2022541349000015
実施例４：ｓｃＴＣＲ変異型の生成、精製、および特性評価
ＶαおよびＶβドメインからなるＴＣＲを設計し、一本鎖（ｓｃＴＣＲ）形態で生成し、ヒト化ＣＤ３特異的Ｔ細胞誘導抗体ＵＣＨＴ１由来のＦａｂ断片と組み合わせて試験した。したがって、ＨＣＭＶ由来のプロモーター要素によって制御される、ヒト化ＵＣＨＴ１抗体（変異型Ｓでは配列番号１２３、Ｓ以外のその他の変異型では配列番号８０）の軽鎖か、またはヒト化ＵＣＨＴ１抗体のＶＨ－ＣＨ１のＣ末端に結合したそれぞれのｓｃＴＣＲ配列のどちらかを含有するプラスミドを生成した。
表5：Fab断片との組み合わせで発現されるscTCR変異型を生成するための配列の組み合わせ。形質移入のために、軽鎖配列を含有するプラスミドはそれぞれのFab重鎖配列を含有するプラスミドと混合された。
Figure 2022541349000016
プラスミドＤＮＡを標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅し、引き続いて、市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。精製されたプラスミドＤＮＡは、製造業者（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）システム；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従って、ＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性形質移入に使用した。形質移入されたＣＨＯ細胞を３２℃～３７℃で１０～１２日間培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄを１回供給した。
調整された細胞上清は、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を利用した濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。二重特異性抗原結合タンパク質は、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実行するように装備された、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。アフィニティークロマトグラフィーは、標準的なアフィニティクロマトグラフィープロトコルに従って、プロテインＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、アフィニティカラムからの酸性溶出（ｐＨ２．８）直後に、サイズ排除クロマトグラフィーを実施して、標準的なプロトコルに従って高純度の単量体タンパク質を得た。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、予測されたタンパク質配列に従って計算された吸光係数を用いて判定した。必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、濃度を調節した。最後に、精製された分子を２～８℃の温度で約７．２ｍｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に保存した。各分子の生産性は、［ミリグラムタンパク質精製／リットル細胞上清］として、収率を計算することによって評価した。
精製されたｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ抗原結合タンパク質の品質は、Ｖａｎｑｕｉｓｈｕ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍ内で、３００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で実行される、ＭａｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラム（５μｍ、７．８ｘ３００ｍｍ）上で、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによって判定した。検出器波長は、２１４ｎｍに設定した。同じ方法を用いて、それぞれの分子の熱ストレスを受けたサンプル（１ｍｇ／ｍＬのＤＰＢＳ中、４０℃で７日間または１４日間保存した後）を分析した。誘導された凝集体は、［凝集体％（ストレス後）］－［凝集体％（開始時）］として計算した。単量体回収率は、［単量体ピーク面積（ストレス後）］／［単量体ピーク面積（開始）］×１００％として計算した。図７Ａに示されるように、異なるｓｃＴＣＲ変異型間で、生産収率（左側パネル）と熱ストレス安定性に顕著な違いが観察された。２つのフレームワーク変異（ａＳ１９Ａ、ａＦ５７Ｙ）と組み合わされた野生型ＣＤＲ配列を含有する安定化されたｓｃＴＣＲ変異型Ｓ（配列番号１２４）は、低レベルでのみ発現された。隣接するフレームワーク変異ｂＩ６６Ｃ（変異型Ｉ）と組み合わされた親和性成熟ＣＤＲｂ２配列と一緒に、親和性成熟ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３、およびＣＤＲｂ１配列（変異型＃１）および親和性成熟ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３、およびＣＤＲｂ１配列を組み込んだ後に、発現レベルの増加および熱ストレス安定性の増加を達成できた。ＣＤＲ－成熟ｓｃＴＣＲ変異型Ｉおよび＃１の双方を使用して、フレームワーク領域のさらなる修飾を試験し、発現収量とヒートストレス安定性を改善した。変異型体＃１への３つのフレームワーク変異（ａＬ５０Ｐ、ｂＭ４６Ｐ、およびｂＭ４７Ｇ）の組み込みによって、生産収率が向上した変異型＃３０が生成し、それは、フレームワーク変異ａＳ１９ＡをａＳ１９Ｖに置き換えることでさらに改善され得た（変異型＃３２）。ａＳ１９ＡまたはＳ１９Ｖ変異の影響は、ａＳ１９復帰変異を有する変異型３２に相当する変異型２９によって強調され、その結果、生産性が大幅に低下し、凝集レベルが上昇する。特に、生産収率に対するａＳ１９の復帰変異の後者の悪影響は、フレームワーク変異ａＡ４８Ｋの導入によって逆転され得た（変異型＃３１）。ＣＤＲ成熟ｓｃＴＣＲ変異型Ｉの文脈で、追加的なフレームワーク変異ｂＩ５４Ｆ（変異型１９）およびβ鎖ＣＤＲ３（変異型２０）のｂＮ１０９Ｄ変異を単独で、または組み合わせて（変異型２１）試験した。ＣＤＲｂ３の変異ｂＮ１０９Ｄは、Ａｓｎ残基の脱アミド化を起こし易いＮＴモチーフをＤＴモチーフに変換し、これは、ＣＤＲ配列内の配列の不利益を除去する設計アプローチの観点から、有利であり得た。変異型Ｉ（変異型＃１９）にｂＩ５４Ｆフレームワーク変異を導入したところ、収量が向上し、ｓｃＴＣＲの熱ストレス安定性が向上した。ＣＤＲｂ３変異ｂＮ１０９Ｄの変異型＃１９への追加的な導入は、さらに大幅に改善された熱ストレス安定性を有するｓｃＴＣＲ変異型＃２１を生成したが、ｂＮ１０９Ｄの変異のみの場合（変異型＃２０）は、変異型Ｉと比較して生産性がわずかに向上し、安定性も同程度であった。
ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ抗原結合タンパク質は、バイオレイヤー干渉法を介して、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の配列番号１のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに対する、それらの結合親和性について分析した。製造業者によって推奨される設定を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで測定を実施した。簡潔に述べると、緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ツイーン－２０、０．１％ＢＳＡを使用し、３０℃、１０００ｒｐｍの振盪速度で結合動態を測定した。ペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２複合体の連続希釈液を分析する前に、二重特異性分子をバイオセンサー（ＦＡＢ２Ｇ）上に負荷した。安定化されたｓｃＴＣＲ変異型Ｓ（配列番号１２３および１２４）を含んでなる二重特異性抗原結合タンパク質は、５００ｎＭの濃度まで非常に弱い結合シグナルのみを示した（図７Ｂ、表６）。親和性成熟ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３ およびＣＤＲｂ１配列（変異型＃１および変異型＃２）を導入することで、標的ペプチド－ＭＨＣに対する結合が大幅に改善された。変異型＃１（配列番号８０、５８）および＃２（配列番号８０、７６）のＫＤ値は２から３ｎＭであること判定された。成熟ＣＤＲｂ２配列をフレームワーク変異ｂＩ６６Ｃと一緒にｓｃＴＣＲ変異型＃２にさらに加えることで、結合親和性のさらなる改善がもたらされ、変異型ＩのＫＤの測定値は１５０ｐＭとなった（配列番号８０、１２６）。
表6：変異体S（配列番号123、124）、#1、#2、およびI（それぞれ配列番号58、76または126と組み合わされた配列番号80）のフレームワーク変異、CDRの組み合わせ、およびKD値。KD値は、バイオレイヤー干渉法によって測定された。
Figure 2022541349000017
 *500 nMに至るまでの関連する結合シグナルなし
ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂ抗原結合タンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の潜在的なオフターゲットペプチドへの結合を分析することにより、その特異性に関してさらに特性決定した。類似性ＢＬＡＳＴ検索によって判定された配列類似性に基づいて、正常組織に提示されたＨＬＡ－Ａ＊０２結合ペプチドのデータベース（ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴデータベース）から、潜在的なオフターゲットペプチドを選択した。結合は、本質的に上記のように、バイオレイヤー干渉法を介して分析した。全ての相互作用の結合シグナルは、プチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２複合体を負荷するためのＨＩＳ１Ｋバイオセンサー使用して、１μＭの二重特異性ｓｃＴＣＲ－Ｆａｂの濃度で判定した。潜在的なオフターゲットペプチドは、結合期終了時の結合応答に関して分析した。ｓｃＴＣＲ変異型Ｉ（配列番号８０、１２６）と比較して、追加的なフレームワーク変異ｂＩ５４Ｆを含んでなる変異型＃１９（配列番号８０、１２５）は、上に示す改善された生産収率と安定性に加えて、改善された結合特異性を示した（図７Ｃ、表７）。ＭＡＧ－００３（配列番号１）に対する結合曲線はどちらの変異型も類似していた（図７Ｃ）一方で、変異型＃１９は、結合シグナルの欠如によって示されるように、オフターゲットペプチドＳＹＮＥ３－００１（配列番号２７）、ＴＰＸ２－００１（配列番号２６）、およびＰＳＭＥ２－００１（配列番号３０）に対する結合の抑止を示した（表７）。
表7：scTCR変異型I（配列番号80、126）および変異型19（配列番号80、125）を有するscTCR-Fab抗原結合タンパク質の特異性。1 µM二重特異性の結合動態は、バイオレイヤー干渉法を介して測定された。結合期の終了時の応答（MAG-003信号のnmまたは％として）が示される。
Figure 2022541349000018
実施例５：二重特異性ＴＣＥＲ（商標）分子の生成、精製、および特性評価
図１５は、本開示の一実施形態による二重特異性ＴＣＥＲ（商標）分子を示す。二重特異性Ｔ細胞結合受容体（ＴＣＥＲ（商標））は、親和性成熟ＴＣＲの可変ドメイン（Ｖα、Ｖβ）と、ヒト化Ｔ細胞動員抗体の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）とを含有する、融合タンパク質である。分子は、エフェクター機能が抑制されたＦｃ部分を使用し、これにより、延長された半減期、改善された安定性／製造可能性の特性がもたらされる。
二重特異性ＴＣＥＲ（商標）分子は、実施例４に記載されるように、好ましいＣＤＲおよびフレームワーク変異を有する、選択されたＴＣＲαおよびβ鎖可変ドメインに基づいて設計した。ｓｃＴＣＲ変異型＃２１のそれぞれのＴＣＲ可変ドメインは、有益なフレームワーク変異ａＳ１９ＶおよびａＡ４８Ｋと組み合わされ、ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ０（配列番号１３８および配列番号１５０）がもたらされた。ＣＲ＃１１４－ｉｓｏ０の可変ドメイン配列をさらに最適化するために、ＣＤＲａ１（ａＤ２７Ｅ）とＣＤＲａ２（ａＳ６５Ｑ）にある２つの潜在的な異性化部位（ＤＳ－モチーフ）をそれぞれ置換し、ＣＤＲ内に１つまたは皆無の翻訳後修飾コンセンサス配列を有する、ＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ１（配列番号１５１および配列番号１５０）および１１４－ｉｓｏ２（配列番号１５２および配列番号１５０）をもたらした。上述のＴＣＲ変異型＃１１４－ｉｓｏ０、＃１１４－ｉｓｏ１、および＃１１４－ｉｓｏ２の可変ドメインは、２つの新たにヒト化されたＴ細胞動員抗体ＢＭＡ０３１（３６）（配列番号１５９および１６０）、ＵＣＨＴ１（１７）（配列番号１５３および１５４）、および異なるＵＣＨＴ１（１７）変異型ＵＣＨＴ１（１７）（１７ｏｐｔ）（配列番号１５３および１６２）、ＵＣＨＴ１（２１）（配列番号１５３および１６４）およびＵＣＨＴ１（２３）（配列番号１５３および１５６）に由来する変異型に由来するＶＬ－およびＶＨ－ドメインとそれぞれ組み合わせた。
ＴＣＲ／抗体二重特異性抗体－Ｆｃ形態を使用して、本発明者らは、ＴＣＥＲ（商標）分子（表８に示される例示的な完全長配列）と、ＨＣＭＶ由来のプロモーター要素ｐＵＣ１９誘導体によって制御される単シストロン性のそれぞれのベクターとを設計した。プラスミドＤＮＡを標準的な培養方法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅し、引き続いて、市販のキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。電気穿孔システム（ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ）を使用するＣＨＯ－Ｓ細胞の一過性形質移入のために、精製したプラスミドＤＮＡを使用した。形質移入されたＣＨＯ細胞を３２℃～３７℃で１０～１２日間培養し、Ｃｅｌｌｂｏｏｓｔ ７ａおよび７ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標））溶液を１～３回供給した。
表8：TCER（商標）分子のそれぞれの変異型を生成するためのTCR可変ドメイン配列とT細胞動員抗体可変ドメイン配列との組み合わせ。形質移入のために、鎖Aを含有するプラスミドは鎖Bを含有するプラスミドと混合された。
Figure 2022541349000019
調整された細胞上清は、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）Ｌａｂ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を利用した濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。二重特異性抗原結合タンパク質は、親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーをインラインで実行するように装備された、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ ２５ Ｌ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。アフィニティークロマトグラフィーは、標準的なアフィニティクロマトグラフィープロトコルに従って、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥまたはプロテインＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ ２６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、アフィニティカラムからの溶出（ｐＨ２．８）直後に、サイズ排除クロマトグラフィーが実施され、標準的なプロトコルに従って高純度の単量体タンパク質を得た。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、予測されたタンパク質配列に従って計算された吸光係数を用いて判定した。必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、濃度を調節した。最後に、精製された分子を２～８℃の温度で約１ｍｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水中に保存した。
精製された二重特異性抗原結合タンパク質の品質は、Ｖａｎｑｕｉｓｈｕ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍ内で、３００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で実行される、ＭａｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラム（５μｍ、４ｘ３００ｍｍ）上で、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによって判定した。検出器波長は、２１４ｎｍに設定した。誘導された凝集体は、［凝集体％（ストレス後）］－［凝集体％（開始時）］として計算した。単量体回収率は、［単量体ピーク面積（ストレス後）］／［単量体ピーク面積（開始）］×１００％として計算した。
異なるＴＣＥＲ（商標）分子の生産性およびストレス安定性データデータは、図８Ａに示される。変異型１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）（１７ｏｐｔ）以外の全ての変異型は、１０ｍｇ／ｌを超える生産収率を示した（図８、左側パネル）。４０°Ｃでの分子の熱ストレス試験からは、１４日間の熱ストレスで１０％未満の凝集体形成を示す、全ての生成されたＴＣＥＲ（商標）分子に対して非常に良好～許容可能な安定性が明らかになった（図８Ａ、右側パネル）。
バイオレイヤー干渉法を用いて、それぞれ（表８に示されるように）、ＵＣＨＴ１（１７）およびＢＭＡ０３１（３６）と組み合わされた、ＴＣＲ変異型１１４－ｉｓｏ０、１１４－ｉｓｏ１、および１１４－ｉｓｏ２を含んでなる、二重特異性ＴＣＥＲ（商標）抗原結合タンパク質を、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチド（配列番号１）に対するそれらの結合親和性について特性決定した（図８Ａ、表９）。製造業者によって推奨される設定を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで測定を実施した。簡潔に述べると、緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％ツイーン－２０、０．１％ＢＳＡを使用し、３０℃、１０００ｒｐｍの振盪速度で結合動態を測定した。二重特異性ＴＣＥＲ（商標）分子の連続希釈液を分析する前に、ペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２複合体をバイオセンサー（ＨＩＳ１Ｋ）上に負荷した。ＴＣＥＲ（商標）変異型１１４－ｉｓｏ０、１１４－ｉｓｏ１、および１１４－ｉｓｏ２は、それぞれ、１．８ｎＭ、２．０ｎＭ、および２．３ｎＭの同等のＫＤ値で、ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中のＭＡＧ－００３と強く結合し、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３結合が、ＴＣＲ可変αドメインのＣＤＲａ１（ａＤ２７Ｅ）およびＣＤＲａ２（ａＳ６５Ｑ）中の２つの異性化部位の除去によって影響を受けないことが示唆された。
表9：表8に示されるCHT1(17)およびBMA031(36)と組み合わされたTCER（商標）変異型114-iso0、114-iso1、および114-iso2の親和性分析。KD値は、バイオレイヤー干渉法によって測定された。
Figure 2022541349000020
ＴＣＲ変異型１１４－ｉｓｏ０、１１４－ｉｓｏ１、および１１４－ｉｓｏ２は、バイオレイヤー干渉法を用いて正常組織由来のオフターゲットペプチドへの結合を分析することによって、それらの特異性に関してさらに特性決定した。測定は、上述したように実施した。ＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の、ＭＡＧ－００３（配列番号１）に対する、およびオフターゲットペプチドＣＮＯＴ１－００３（配列番号３２）、ＣＯＬ６Ａ３－０１０（配列番号１７９）、ＦＡＭ１１５Ａ－００１（配列番号１８０）、ＨＥＡＴＲ５Ａ－００１（配列番号３１）、ＨＥＲＣ４－００１（配列番号２９）、ＩＮＴＳ４－００２（配列番号１７１）、ＰＨＴＦ２－００１（配列番号１８１）、ＰＰＰ１ＣＡ－００６（配列番号１７３）、ＲＰＬ－００７（配列番号１７４）、ＲＰＰ１－００１（配列番号１８２）、ＳＡＭＨ－００１（配列番号１７２）、ＳＥＴＤ１Ａ－００１（配列番号１７５）に対する、１１４－ｉｓｏ０－ＵＣＨＴ１（１７）の結合親和性を判定し、親和性ウィンドウを計算した。親和性ウィンドウは、オフターゲット結合が２００倍を超える～皆無の範囲であった（表１０）。１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）および１１４－ｉｓｏ２－ＵＣＨＴ１（１７）の特異性は、１μＭのＴＣＥＲ（商標）の濃度のＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中の、ＭＡＧ－００３（配列番号１）およびオフターゲットペプチドＯＤＣ－００１（配列番号１７８）、ＮＯＭＡＰ－１－０３２０（配列番号１７６）、およびＮＯＭＡＰ－１－１２２３（配列番号１７７）に対する結合シグナルを測定することによって分析した（図８Ｃ、表１１）。ＭＡＧ－００３シグナルの１％以下の結合応答が検出され、ＭＡＧ－００３に対するＴＣＲ変異型の高い特異性が実証された。
表10：TCER（商標）;分子114-iso0-UCHT1(17)の特異性KNS値は、114-iso0-UCHT1(17)(500nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM)の連続希釈液を分析するバイオレイヤー干渉法によって測定された。親和性ウィンドウは、KD(類似ペプチド)/KD(MAG-003)として計算された。
Figure 2022541349000021
表11：TCER（商標）分子114-iso1-BMA(36)および114-iso2-UCHT1(17)の特異性。1 μM TCER（商標）の結合動態は、バイオレイヤー干渉法を介して測定された。結合期の終了時の応答（MAG-003信号のnmまたは％として）が示される。
Figure 2022541349000022
実施例６：ＭＡＧ－００３陽性および腫瘍細胞株のＴＣＥＲ（商標）媒介性殺滅
成熟ＴＣＲ変異型は、ＴＣＲ／ａｎｔｉＣＤ３二重特異性抗体－Ｆｃ形態を使用して、可溶性ＴＣＥＲ（商標）分子＃１１４－ｉｓｏ０－ＵＣＨＴ１（１７）、＃１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）、＃１１４－ｉｓｏ２－ＵＣＨＴ１（１７）、＃１１４－ｉｓｏ０－ＢＭＡ０３１（３６）、＃１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ０３１（３６）および＃１１４－ｉｓｏ２－ＢＭＡ０３１（３６）として発現させた（表８もまた参照されたい）。ＭＡＧ－００３陽性腫瘍細胞株とＭＡＧ－００３陰性腫瘍細胞株に対する、二重特異性ＴＣＥＲ（商標）分子の細胞傷害活性をそれぞれＬＤＨ放出アッセイで分析した。したがって、細胞表面上に異なる量のＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３分子を提示する腫瘍細胞株と、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナーからのＰＢＭＣとをＴＣＥＲ（商標）分子の濃度を増加させながら同時インキュベートした。４８時間後、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して、標的細胞株の溶解を測定した。図９および図１０に示されるように、ＴＣＥＲ（商標）分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３複合体の質量分析による定量化によって判定されるように、それぞれ、腫瘍細胞あたり１１００コピー、２３０コピー、および１２０コピーを提示するＭＡＧ－００３陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ、Ａ３７５、およびＵ２ＯＳを効率的に溶解した。殺滅アッセイでは、２人の健常なドナー（図９のＨＢＣ－７２０および図１０のＨＢＣ－９８２）からのＰＢＭＣを使用した。同じ実験内で、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するが、ＭＡＧ－００３を検出可能なレベルで提示しない細胞株ＢＶ－１７３では、二重特異性ＴＣＥＲ（商標）分子によって細胞の溶解が誘導されないか、わずかしか誘導されなかったことから、ＴＣＲドメインの特異性が示された。
実施例７：腫瘍異種移植片を保有するＯＧマウスにおける生体内効力
薬力学的研究を高免疫欠損ＮＯＧマウス系統で実施し、Ｔ細胞抗原に特異的に結合することによって、およびヒトがん細胞上のヒト腫瘍特異的ＨＬＡ－ペプチド複合体に特異的に結合することによって、ヒト免疫Ｔ細胞の活性を動員する、ＴＣＥＲ（商標）分子の能力を試験した。皮下注射されたヒト腫瘍細胞株ＨＳ６９５Ｔを保有するＮＯＧマウス系統に、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の異種移植片を静脈内注射した。ヒトＰＢＭＣ（１×１０７細胞／マウス）は、キャリパー測定後に、個々のＨｓ６９５Ｔ腫瘍の体積が５０ｍｍ３に達した時点で、２４時間以内に移植した。ヒト血液細胞の移植後１時間以内に、処置を開始した。グループあたり８～１０匹の雌マウス（腫瘍サイズに応じて無作為化）に、尾静脈への静脈内ボーラス注射（５ｍＬ／ｋｇ体重、週２回投与、６回投与）を与えた。ＴＣＥＲ（商標）分子の注射用量は、０．５（グループ２）および０．０５（グループ３および４）ｍｇ／ｋｇ体重×注射であり、ビヒクル対照グループ（グループ１）ではＰＢＳを使用した。個々のマウスについて図１１に示されるように、ＴＣＥＲ（商標）分子による治療は、顕著な抗腫瘍反応を誘発した。２５日目の基底レベルの７４ｍｍ３～１０８１ｍｍ３へのビヒクル対照群１で観察された増加と比較して、９０ｍｍ３の基底レベル（無作為化の開始）から２５日目の２０９ｍｍ３への平均腫瘍体積の増加の減少によって示されるように、ＰＲＡＭＥ－００４（配列番号１６８、グループ２）を標的化するＴＣＥＲ（商標）（配列番号１６９および１７０）による治療は、腫瘍増殖を強く抑制した。ＭＡＧ－００３を標的化するＴＣＥＲ（商標）（配列番号１２７および１３０、グループ３；配列番号１３５および１３６、グループ４）による処置は、全てのマウスにおいて、無作為化した日の８６ｍｍ３（グループ３）および８０ｍｍ３（グループ４）の基底レベルと比較して、１８日目から試験終了の２５日目までにＨｓ６９５Ｔ腫瘍の完全な寛解を誘導した。
実施例８：初代健常細胞の生体外安全性
ＴＣＥＲ（商標）分子１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）の安全性プロファイルは、異なる臓器のヒト正常組織初代細胞を用いたＬＤＨ殺滅実験で評価した。図１２は、増加するＴＣＥＲ（商標）濃度の存在下で、１１の異なる初代健常組織細胞（ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）と、健康なＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナーからのＰＢＭＣエフェクター細胞とを１：１０の比率で共培養した結果を示す。細胞は、正常組織初代細胞特異的培地と、Ｔ細胞培地との１：１混合物中で同時インキュベートした。安全域を判決定するために、正常組織初代細胞のそれぞれの培地の組み合わせで、ＭＡＧ－００３陽性腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔと同じ設定で、ＴＣＥＲ（商標）分子を同時インキュベートした。共培養の４８時間後、上清を採取し、ＬＤＨ－Ｇｌｏ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＬＤＨ放出を測定することによって、腫瘍細胞溶解を分析した。
図１２では、各細胞傷害性プロットによって、ＰＢＭＣとＴＣＥＲ分子の濃度を増加させながら同時インキュベーション養した後の、同じ培地の組み合わせにおける正常組織初代細胞タイプ（白塗り円）のＬＤＨ放出を、対照腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ（黒塗り円）と比較して示す。全ての場合において、正常組織の初代細胞に対する応答は、ＥＣ５０を計算するには低すぎた。それに代えて、本発明者らは、カットオフ値を超える応答を伴う最初のＴＣＥＲ（商標）濃度として判定された最小影響量（ＬＯＥＬ）に基づいて、安全域を定義した。カットオフは（［全ての三連からの標準偏差×３］＋ＴＣＥＲ（商標）なしの対照正常組織サンプル）として定義され、各細胞傷害性プロットに点線で示される。正常な組織細胞タイプ毎に、ＬＯＥＬベースの安全域は１，０００倍よりも大きいと判断された。
ＴＣＥＲ（商標）分子１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）の安全性プロファイルは、１２の異なる初代健常組織細胞（ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）を使用した２回目のＬＤＨ殺滅実験で評価し、そのいくつかは１回目の実験と重複した。上記のような実験条件を使用した。
図１６では、各細胞傷害性プロットによって、ＰＢＭＣとＴＣＥＲ分子の濃度を増加させながら同時インキュベーションした後の、同じ培地の組み合わせにおける正常組織初代細胞タイプ（白塗り円）のＬＤＨ放出を、対照腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ（黒塗り円）と比較して示す。全ての場合において、正常組織の初代細胞に対する応答は、ＥＣ５０を計算するには低すぎた。それに代えて、本発明者らは、カットオフ値を超える応答を伴う最初のＴＣＥＲ（商標）濃度として判定された最小影響量（ＬＯＥＬ）に基づいて、安全域を定義した。カットオフは（［全ての三連からの標準偏差ｘ３］＋ＴＣＥＲ（商標）なしの対照正常組織サンプル）として定義され、各細胞傷害性プロットに点線で示される。正常な組織細胞タイプ毎に、ＬＯＥＬベースの安全域は１，０００倍よりも大きいと判断された。
実施例９：腫瘍異種移植片を保有するＮＯＧマウスにおける週１回の治療による生体内効力
薬力学的研究を高免疫欠損ＮＯＧマウス系統で実施し、Ｔ細胞抗原に特異的に結合することによって、およびヒトがん細胞上のヒト腫瘍特異的ＨＬＡ－ペプチド複合体に特異的に結合することによって、ヒト免疫Ｔ細胞の活性を動員する、ＴＣＥＲ（商標）分子の能力を試験した。皮下注射されたヒト腫瘍細胞株Ｈｓ６９５Ｔ保有するＮＯＧマウス系統に、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の異種移植片を静脈内注射した。ヒトＰＢＭＣ（１×１０７細胞／マウス）は、キャリパー測定後に、個々のＨｓ６９５Ｔ腫瘍の体積が５０ｍｍ３に達した時点で、２４時間以内に移植した。ヒト血液細胞の移植後１時間以内に、処置を開始した。グループあたり６～１０匹の雌マウス（腫瘍サイズに応じて無作為化された）に、尾静脈への静脈内ボーラス注射（５ｍＬ／ｋｇ体重、週１回投与、３回投与）を与えた。ＴＣＥＲ（商標）分子の注射用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重ｘ注射（グループ２および３）であり、ビヒクル対照グループ（グループ１）ではＰＢＳを使用した。図１３に示されるように、ＴＣＥＲ（商標）分子による治療は、顕著な抗腫瘍反応を誘発した。ＭＡＧ－００３ＴＣＥＲ（商標）分子１１４－ｉｓｏ１－ＢＭＡ（３６）（配列番号１３７および１３６、グループ２）および１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（Ｖ１７ｏｐｔ）（配列番号１３１および１６７、グループ３）による治療は、２１日目に全てのマウスでＨｓ６９５Ｔ腫瘍の寛解を誘導した。８５ｍｍ３の基底レベルから２１日目の１０２４ｍｍ３へのビヒクル対照（グループ１）内で観察された増加と比較して、８４ｍｍ３から８ｍｍ３へ（グループ２）、および８３ｍｍ３から１４ｍｍ３へ（グループ３）の基底レベル（無作為化の開始）から２１日目への平均腫瘍体積の増加の減少によって示されるように、腫瘍増殖は強く抑制された。完全寛解は、グループ２の２匹のマウスとグループ３の２匹のマウスで観察された。
実施例１０：ＮＯＧマウスの生体内薬物動態
ＴＣＥＲ（商標）１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）（配列番号１３０および１３１）の薬物動態特性は、２ｍｇ／ｋｇ体重の単回静脈内注射を投与された高度免疫不全ＮＯＧマウスにおいて分析した。血漿サンプルは、０時間、０．１時間、２時間、８時間、２４時間、４８時間、１２０時間、２４０時間、および３６０時間の時点で後頭葉神経叢から採取した。１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）の血漿レベルは、２つの異なるアッセイ設定（Ｆｃ－ＶＬアッセイおよびＣＤ３－ｐＭＨＣアッセイ）を用いたＥＬＩＳＡによって判定した。Ｆｃ－ＶＬアッセイの設定を用いて、それぞれのタンパク質サブユニットを検出することによって、ＴＣＥＲ（商標）血漿レベルを定量化した。簡潔に述べると、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃをＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩コーティングした。残りの結合部位は、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを使用してブロックした。ブロック緩衝液で希釈されたサンプルは、プロテインＬ－ＨＲＰおよびＴＭＢ基質溶液で検出する前に、室温で１時間インキュベートした。ＣＤ３－ｐＭＨＣアッセイを使用して、ＴＣＥＲ（商標）１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）の血漿レベルを、双方の標的分子に同時に結合できる分子のみを測定する、二重特異性結合活性を介して判定した。ＣＤ３δε－Ｆｃは、ヒトＣＤ３δおよびＣＤ３εの細胞外ドメインと、（「ノブ・インツー・ホール」変異および追加的なＣ末端のＨｉｓ－Ｔａｇを含有する）ＴＣＥＲ（商標）コンストラクトで用いられるＦｃドメインのＮ末端とを融合させることによって生成した。ＣＤ３δε－Ｆｃ分子をＥｘｐｉＣＨＯ細胞で発現させ、上記のようにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ＣＤ３δε－ＦｃをＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよびサンプルインキュベーションを上述したように実施し、ＨＬＡ－Ａ＊０２／ＭＡＧ－００３および抗ｂ２ｍ－ＨＲＰを使用した二段階検出がそれに続いた。サンプルの血漿中濃度は、それぞれの標準曲線からの内挿よって得た。どちらのアッセイの設定でも、同様のＴＣＥＲ（商標）血漿濃度が測定され、タンパク質の完全性、ならびに分子の結合活性が血漿中で保持されていることが示される（図１４）。２４時間、４８時間、１２０時間、２４０時間、および３６０時間の時点の線形回帰により、１５０時間の最終血漿半減期が明らかになった。結果は、１１４－ｉｓｏ１－ＵＣＨＴ１（１７）の半減期（Ｔ１／２）が約６～７日であることを示しす。
実施例１１：質量分析法による初代組織上のＭＡＧ－００３ペプチドの検出
衝撃凍結組織サンプルからのＨＬＡ分子を精製し、ＨＬＡ関連ペプチドを単離した。単離ペプチドを分離して、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）実験によって配列を同定した。複数の組織サンプルで同定されたＭＡＧ－００３は、ラベルフリーＬＣ－ＭＳデータのイオンカウントを使用して定量化した。方法は、ペプチドのＬＣ－ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量と相関すると仮定する。様々なＬＣ－ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルを中心傾向に基づいて正規化し、サンプル当たりで平均化して、提示プロファイルと称されるプロットにマージさせた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメントのような、異なる解析法を統合する。自動的に導出された全ての定量的および定性的データは、手動で検査した（図１８を参照されたい）。

Claims (27)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」を含んでなるかまたはそれからなる、ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、前記抗原ペプチドが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質との複合体中にあり、前記抗原結合タンパク質が、
    （ａ）３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、およびＣＤＲａ３を含んでなる、第１の可変ドメインを含んでなる第１のポリペプチド鎖、
    （ｂ）ＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、およびＣＤＲｂ３の３つのＣＤＲを含んでなる、第２の可変ドメインを含んでなる第２のポリペプチド鎖
    を含んでなり、
    －前記ＣＤＲａ１が、アミノ酸配列「Ｘ１ＳＳＳＴＹ」配列番号７２を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、または少なくとも１つのアミノ酸置換で配列番号７２とは異なるアミノ酸配列であり、
    －前記ＣＤＲａ２が、アミノ酸配列「ＩＸ１ＳＸ２Ｘ３ＤＸ４」配列番号７３を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ４は、任意のアミノ酸であり、
    －前記ＣＤＲａ３が、アミノ酸配列「ＣＡＥＸ１Ｘ２ＳＸ３ＳＫＩＩＦ」配列番号７７を含んでなるかまたはそれからなり、式中、ＣＤＲａ１がアミノ酸配列番号５を含んでなるかまたはそれからなり、ＣＤＲａ２がアミノ酸配列番号６を含んでなるかまたはそれからなる場合は、前記ＣＤＲａ３はアミノ酸配列「ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ」（配列番号７）を含まずまたはそれからならないという条件で、好ましくは、前記ＣＤＲａ３がアミノ酸配列「ＣＡＥＹＳＳＡＳＫＩＩＦ」（配列番号７）を含まずまたはそれからならないという条件でＸ１～Ｘ３は、任意のアミノ酸であり、
    －前記ＣＤＲｂ１が、アミノ酸配列「Ｘ１ＧＨＤＹ」配列番号７８を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、または少なくとも１つのアミノ酸置換で配列番号７８とは異なるアミノ酸配列であり、
    －前記ＣＤＲｂ２が、アミノ酸配列「ＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｐ」配列番号７９を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１～Ｘ４は、任意のアミノ酸であり、
    －前記ＣＤＲｂ３が、アミノ酸配列「ＣＡＳＲＡＸ１ＴＧＥＬＦＦ」配列番号８２を含んでなるかまたはそれからなり、式中、Ｘ１は、任意のアミノ酸、または少なくとも１つのアミノ酸置換で配列番号８２とは異なるアミノ酸配列である、抗原結合タンパク質。
  2. 前記抗原結合タンパク質が、前記抗原ペプチドの配列番号１のアミノ酸配列「ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ」に特異的に結合し、前記抗原ペプチドがＭＨＣタンパク質との複合体中にあり、好ましくは、前記ＭＨＣタンパク質が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  3. 前記抗原結合タンパク質が、配列番号１のＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの少なくとも３つのアミノ酸位置、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸位置１、５、７、および８、または１、３、５、および７からなるアミノ酸位置の群から選択される、少なくとも３つのアミノ酸位置を含んでなるかまたはそれからなる、エピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗原結合タンパク質。
  4. 前記抗原結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列とＨＬＡ－Ａ＊０２とを含んでなるかまたはそれからなる、前記ＭＡＧＥ－Ａ抗原ペプチドの複合体に、１００μＭ未満、５０μＭ未満、３０μＭ未満、２５μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、好ましくは５０ｐＭ～１００μＭ、５０ｐＭ～１０μＭ、５０ｐＭ～１μＭ、より好ましくは、５０ｐＭ～５００ｎＭ、５０ｐＭ～１００ｎＭ、５０ｐＭ～５０ｎＭ、および５０ｐＭ～１０ｎＭのＫＤで結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  5. 前記抗原結合タンパク質が、ＭＡＧＥ－Ａ／ＭＨＣ複合体提示細胞に対する、０．１ｎＭ～２０ｎＭなど、０．５ｎＭ～１５ｎＭ、０．８ｎＭ～１２ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭ、０．８ｎＭ～１０ｎＭなど、または１ｐＭ～１５０ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、１ｐＭ～５０ｐＭ、１ｐＭ～２０ｐＭ、１ｐＭ～２０ｐＭなど、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満のＥＣ５０値を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  6. 前記抗原結合タンパク質が、前記ペプチドがＭＨＣタンパク質との複合体中にある場合、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体中にある場合、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ－００１、ＡＸＩＮ１－００１、ＡＮＯ５－００１、ＴＰＸ２－００１、ＳＹＮＥ３－００１、ＭＩＡ３－００１、ＨＥＲＣ４－００１、ＰＳＭＥ２－００１、ＨＥＡＴＲ５Ａ－００１、ＣＮＯＴ１－００３、ＴＥＰ１－００３、ＰＩＴＰＮＭ３－００１、ＩＮＴＳ４－００２、ＳＡＭＨ－００１、ＰＰＰ１ＣＡ－００６、ＲＰＬ－００７、ＳＥＴＤ１Ａ－００１、ＮＯＭＡＰ－１－０３２０、ＮＯＭＡＰ－１－１２２３、およびＯＤＣ－００１、好ましくはＨＥＡＴＲ５Ａ－００１およびＣＮＯＴ１－００３からなるリストから選択されるペプチドに有意に結合しない、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  7. 前記抗原結合タンパク質が、抗体またはその断片、または二重特異性抗体またはその断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片、または二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその断片である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  8. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、互いに共有結合または非共有結合している、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  9. 前記抗原結合タンパクが、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または一本鎖二重特異性抗体である、請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
  10. 前記第１の可変ドメインが、ＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、
    －ＦＲ１－ａが、配列番号８３のアミノ酸配列、または配列番号８３と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ２－ａが、配列番号８４のアミノ酸配列、または配列番号８４と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ３－ａが、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ４－ａが、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８６と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    前記第２の可変ドメインが、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、
    －ＦＲ１－ｂが、配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ２－ｂが、配列番号８８のアミノ酸配列、または配列番号８８と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ３－ｂが、配列番号８９のアミノ酸配列、または配列番号８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ４－ｂが、配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９０と少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  11. 前記フレームワーク領域が、
    －ＦＲ１－ａの１９位でのアミノ酸置換（式中、前記アミノ酸置換は、好ましくはＳ１９Ａ、Ｓ１９Ｖ、より好ましくはＳ１９Ｖである）、
    －ＦＲ２－ａの４８および／または５０位でのアミノ酸置換（式中、前記４８位でのアミノ酸置換は、好ましくはＡ４８Ｋであり、前記５０位でのアミノ酸置換は、好ましくはＬ５０Ｐである）、
    －ＦＲ２－ｂの４６、４７および／または５４位でのアミノ酸置換（式中、前記４６、４７および／または５４位でのアミノ酸置換は、好ましくはそれぞれＭ４６Ｐ、Ｍ４７Ｇ、およびＩ５４Ｆであり、式中、上記で定義されるＣＤＲｂ３アミノ酸配列が１０９位のアミノ酸１０９Ｄを含んでなる場合には、前記５４位のアミノ酸は好ましくはＩ５４Ｆである）、
    －ＦＲ３－ｂの６６位でのアミノ酸置換（式中、前記６６位でのアミノ酸置換は、好ましくはＩ６６Ｃであり、式中、上記で定義されるＣＤＲｂ２アミノ酸配列が５７位のアミノ酸５７Ｃを含んでなる場合には、前記６６位のアミノ酸は、好ましくは６６Ｃである）
    を含んでなるアミノ酸置換群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなり、置換の位置がＩＭＧＴ命名法に従って付与される、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。
  12. 前記第１の可変ドメインが、ＦＲ２－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、およびＦＲ４－ａからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、
    －ＦＲ１－ａが、配列番号９１のアミノ酸配列、または配列番号９１と少なくとも８５％と同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは配列番号９１と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列が、アミノ酸１９Ｖを含んでなり、
    －ＦＲ２－ａが、配列番号９２のアミノ酸配列、または配列番号９２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは配列番号９２と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列が、アミノ酸４８Ｋと、任意選択的に５０位でのアミノ酸置換、好ましくはＬ５０Ｐとを含んでなり、
    －ＦＲ３－ａが、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ４－ａが、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８６と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    前記第２の可変ドメインが、ＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、およびＦＲ４－ｂからなる群から選択される１つまたは複数のフレームワーク領域、好ましくは複数のフレームワーク領域をさらに含んでなり、
    －ＦＲ１－ｂが、配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、
    －ＦＲ２－ｂが、配列番号９３のアミノ酸配列、または配列番号９３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは配列番号９３と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列が、好ましくはアミノ酸５４Ｆと、任意選択的に４６および／または４７位でのアミノ酸置換とを含んでなり、４６および／または４７位での前記アミノ酸置換が、好ましくはそれぞれＭ４６Ｐおよび／またはＭ４７Ｇであり、
    －ＦＲ３－ｂが、配列番号８９のアミノ酸配列、または配列番号８９と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、または配列番号９４のアミノ酸配列、または配列番号９４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなり、好ましくは配列番号９４と少なくとも８５％同一である前記アミノ酸配列が、アミノ酸６６Ｃを含んでなり、上記で定義されるＣＤＲｂ２アミノ酸配列が５７位のアミノ酸５７Ｃを含んでなる場合には、好ましくは配列番号９４と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなるＦＲ３－ｂが、アミノ酸６６Ｃを含んでなり、
    －ＦＲ４－ｂが、配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９０と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるかまたはそれからなる、
    請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
  13. 前記第１の可変ドメインがＴＣＲαまたはγ鎖の一部であり、および／または前記第２の可変ドメインがＴＣＲβまたはδ鎖の一部である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  14. （ｉ）１つまたは複数のさらなる抗原結合部位；
    （ｉｉ）任意選択的に細胞質シグナル伝達領域を含む膜貫通領域；
    （ｉｉｉ）診断薬；
    （ｉｖ）治療薬；または
    （ｖ）ＰＫ修飾部分
    の１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  15. ２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなる、請求項１～７および１０～１３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質であって、
    第１のポリペプチド鎖が、式、
    Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
    （式中、Ｖ３は第３の可変ドメインであり；Ｖ４は第４の可変ドメインであり；Ｌ１およびＬ２はリンカーであり；Ｌ２は存在してもまたは存在しなくてもよく；ＣＬは軽鎖定常ドメインまたはその一部であって存在するかまたは存在しない）によって表わされる構造を有し、
    第２のポリペプチド鎖が、式、Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
    （式中、Ｖ５は第５の可変ドメインであり；Ｖ６は第６の可変ドメインであり；Ｌ３およびＬ４はリンカーであり；Ｌ４は存在してもまたは存在しなくてもよく；ＣＨ１は重鎖定常ドメイン１またはその一部であって存在するかまたは存在せず；式中、
    Ｖ３またはＶ４は請求項１で定義される第１の可変ドメインであり、Ｖ５またはＶ６は請求項１で定義される第２の可変ドメインであり、または
    Ｖ５またはＶ６は請求項１で定義される第１の可変ドメインであり、Ｖ３またはＶ４は請求項１で定義される第２の可変ドメインであり、式中、
    Ｖ３は請求項１に記載の第１の可変ドメインであってＶ５は請求項１に記載の第２の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
    Ｖ３は請求項１に記載の第２の可変ドメインであってＶ５は請求項１に記載の第１の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
    Ｖ３は請求項１に記載の第１の可変ドメインであってＶ６は請求項１に記載の第２の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、または
    Ｖ３は請求項１に記載の第２の可変ドメインであってＶ６は請求項１に記載の第１の可変ドメインであり、Ｖ４は軽鎖可変ドメインであってＶ５は重鎖可変ドメインであり、またはＶ４は重鎖可変ドメインであってＶ５は軽鎖可変ドメインであり、
    Ｖ４は請求項１に記載の第１の可変ドメインであってＶ５は請求項１に記載の第２の可変ドメインであり、Ｖ３は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ３は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインであり、または
    Ｖ４は請求項１に記載の第２の可変ドメインであってＶ５は請求項１に記載の第１の可変ドメインであり、Ｖ３は軽鎖可変ドメインであってＶ６は重鎖可変ドメインであり、またはＶ３は重鎖可変ドメインであってＶ６は軽鎖可変ドメインである）によって表わされる構造を有し、
    前記軽鎖可変ドメインと前記重鎖可変ドメインが一緒に１つの抗原結合部位を形成し、前記第１と第２の可変ドメインが一緒に１つの抗原結合部位を形成する、抗原結合タンパク質。
  16. 前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、ＣＤ３（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖など）、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／βおよびＴＣＲγ／δ、ＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される抗原に結合し、および／またはエフェクター細胞に結合する、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
  17. １つのポリペプチド鎖が、式［ＩＩＩ］、
    Ｖ３－Ｌ１－Ｖ４－Ｌ２－ＣＬ－Ｌ５－ＦＣ１［ＩＩＩ］
    によって表わされる構造を有し、
    １つのポリペプチド鎖が、式［ＩＶ］、
    Ｖ５－Ｌ３－Ｖ６－Ｌ４－ＣＨ１－Ｌ６－ＦＣ２［ＩＶ］
    によって表わされる構造を有する
    （式中、Ｖ３、Ｌ１、Ｖ４、Ｌ２、ＣＬ、Ｖ５、Ｌ３、Ｖ６，Ｌ４、およびＣＨ１は、請求項１～１６のいずれか一項で定義されるようであり、Ｌ５およびＬ６はリンカーであり存在しまたは存在せず、ＦＣ１およびＦＣ２はＦｃ－ドメインであり、ＦＣ１およびＦＣ２は同じかまたは異なる）、２つの抗原結合部位を形成する２つのポリペプチド鎖を含んでなる、請求項１５または１６に記載の抗原結合タンパク質。
  18. Ｖ３が請求項１～１７のいずれか一項で定義される第１の可変ドメインであってＶ６が第２の可変ドメインであり、Ｖ４が軽鎖可変ドメインであってＶ５が重鎖可変ドメインであり、または
    Ｖ３が請求項１～１７のいずれか一項で定義される第１の可変ドメインであり、Ｖ６が第２の可変ドメインであり、Ｖ４が重鎖可変ドメインであってＶ５が軽鎖可変ドメインであり、Ｌ１およびＬ２が、配列番号９６のアミノ酸配列「ＧＧＧＳＧＧＧＧ」を含んでなるかまたはそれからなり、Ｌ２、Ｌ５，Ｌ４、およびＬ６が存在せず、Ｖ４が重鎖可変ドメインである場合は、ＦＣ１がアミノ酸配列番号１１３を含んでなるかまたはそれからなり、Ｖ５が軽鎖可変ドメインである場合は、ＦＣ２がアミノ酸配列番号１１２を含んでなるかまたはそれからなり、または
    Ｖ４が軽鎖可変ドメインである場合は、ＦＣ１がアミノ酸配列番号１１２を含んでなるかそれからなり、Ｖ５が重鎖可変ドメインである場合は、ＦＣ２がアミノ酸配列番号１１３を含んでなるかまたはそれからなる、請求項１７に記載の抗原結合タンパク質。
  19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコード化する配列を含んでなる単離核酸、または前記核酸を含んでなる核酸ベクター。
  20. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、または請求項１９に記載の核酸またはベクターを含んでなり、好ましくは、ａ）Ｔリンパ球などのリンパ球、または例えば、ＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞などのＴリンパ球始原細胞、またはｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの組換え発現のための細胞である、組換え宿主細胞。
  21. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、または請求項１９に記載の核酸またはベクター、または請求項２０に記載の宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、安定剤および／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
  22. ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ．請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするコード配列を含んでなる、遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
    ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
    ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
    を含んでなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を生成する方法。
  23. 前記適切な宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を単離および精製するステップと、任意選択的に、Ｔ細胞内で前記抗原結合タンパク質を再構成するステップとをさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
  24. 医療で使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸またはベクター、請求項２０に記載の宿主細胞、または請求項２１に記載の医薬品組成物。
  25. ＭＡＧＥＡ４および／またはＭＡＧＥＡ８陽性がんなどの、がんなどの増殖性疾患の診断、予防、および／または治療で使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸またはベクター、請求項２０に記載の宿主細胞、または請求項２１に記載の医薬品組成物。
  26. 前記がんが、肺がん、肝臓がん、頭頸部がん、皮膚がん、腎細胞がん、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢がん、胆管がん、骨肉腫がん、および食道がんからなる群から選択される、請求項２５に記載の抗原結合タンパク質。
  27. （ｉ）肺がんが非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、好ましくは非小細胞肺がん腺がんまたは扁平上皮細胞非小細胞肺がん（ＳＮＳＣＬＣ）；または小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）であり；
    （ｉｉ）皮膚がんが黒色腫であり；
    （ｉｉｉ）頭頸部がんが頭頸部扁上皮がん腫（ＨＮＳＣＣ）であり；
    （ｉｖ）肝臓がんが肝細胞がん（ＨＣＣ）であり；
    （ｖ）食道がんが胃食道接合部がんである、
    請求項２６に記載の抗原結合タンパク質。
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