JP7012364B2 - T細胞受容体の認識機構を用いたがん又は感染症の治療及び診断 - Google Patents
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Description
[1] がん特異的抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、がん細胞のMHC分子複合体と結合して、MHCクラス1分子複合体の発現を低下させ、NK細胞に認識されるようにすることにより前記がん細胞を殺傷させるための、NK細胞機能増強剤。
[2] がん特異的抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、NK細胞に、MHCクラス1分子を発現しているがん細胞の認識機能を賦与しTDCC(T細胞受容体キメラタンパク質依存性細胞傷害)活性により前記がん細胞を殺傷させるための、NK細胞機能増強剤。
[3] T細胞受容体キメラタンパク質がT細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、[1]又は[2]のNK細胞機能増強剤。
[4] T細胞受容体の可変領域が、T細胞受容体のα鎖及び/又はβ鎖である、[1]~[3]のいずれかのNK細胞機能増強剤。
[5] T細胞受容体の可変領域が、T細胞受容体のα鎖である、[4]のNK細胞機能増強剤。
[6] 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、[1]~[5]のいずれかのNK細胞機能増強剤。
[7] 2つのT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる2量体であり、前記2つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、[1]~[6]のいずれかのNK細胞機能増強剤。
[8] T細胞受容体がMHCクラス1と結合する、[1]~[7]のいずれかのNK細胞機能増強剤。
[9] がん特異的抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたT細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記T細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在すると判定する、がん細胞検出方法。
[10] がん特異的抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたT細胞受容体キメラタンパク質を含むがん検出用試薬。
[12] がん患者から採取したT細胞を用いてがん患者の有するT細胞受容体のレパートリーを解析し、がん患者において出現頻度が高いT細胞受容体をそのがんに対する特異性が高い特異的T細胞受容体としてクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、[11]のT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法。
[13] がん特異的抗原を認識するT細胞受容体キメラタンパク質とNK細胞の受容体の複合体。
[14] in vitroでがん特異的抗原を認識するT細胞受容体キメラタンパク質とNK細胞を接触させることによりT細胞受容体キメラタンパク質とNK細胞の複合体を作製する方法。
[15] 感染症の原因となる病原体に特異的な抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、感染症の原因となる病原体が感染した感染細胞のMHCクラス1分子複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、NK細胞に認識されるようにすることにより前記感染細胞を殺傷させるための、NK細胞機能増強剤。
[16] 感染症の原因となる病原体に特異的な抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、NK細胞に、MHCクラス1分子を発現している、感染症の原因となる病原体が感染した感染細胞の認識機能を賦与しTDCC(T細胞受容体キメラタンパク質依存性細胞傷害)活性により前記感染細胞を殺傷させるための、NK細胞機能増強剤。
[17] T細胞受容体キメラタンパク質がT細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、[15]又は[16]のNK細胞機能増強剤。
[18] T細胞受容体の可変領域が、T細胞受容体のα鎖及び/又はβ鎖である、[15]~[17]のいずれかのNK細胞機能増強剤。
[19] T細胞受容体の可変領域が、T細胞受容体のα鎖である、[18]のNK細胞機能増強剤。
[20] 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、[15]~[19]のいずれかのNK細胞機能増強剤。
[22] T細胞受容体がMHCクラス1分子と結合する、[15]~[21]のいずれかのNK細胞機能増強剤。
[23] 感染症の原因となる病原体に特異的な抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたT細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記T細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在すると判定する、感染症の原因となる病原体が感染した感染細胞検出方法。
[24] 感染症の原因となる病原体に特異的な抗原を認識するT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたT細胞受容体キメラタンパク質を含む感染細胞検出用試薬。
[25] 感染症患者から採取したT細胞から感染症の原因となる病原体に特異的な抗原を認識する病原体抗原特異的T細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、T細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法。
[26] 感染症患者から採取したT細胞を用いて感染症患者の有するT細胞受容体のレパートリーを解析し、感染症患者において出現頻度が高いT細胞受容体をその感染症に対する特異性が高い特異的T細胞受容体としてクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、[25]のT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法。
[27] 感染症の原因となる病原体に特異的な抗原を認識するT細胞受容体キメラタンパク質とNK細胞の受容体の複合体。
[28] in vitroで感染症の原因となる病原体に特異的な抗原を認識するT細胞受容体キメラタンパク質とNK細胞を接触させることによりT細胞受容体キメラタンパク質とNK細胞の複合体を作製する方法。
[29] T細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、標的細胞のMHC分子複合体と結合して、MHCクラス1分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
[30] T細胞受容体キメラタンパク質がT細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、[29]のMHC分子複合体発現低下剤。
[32] T細胞受容体の可変領域が、T細胞受容体のα鎖である、[31]のMHC分子複合体発現低下剤。
[33] 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、[29]~[32]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[34] 2つのT細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる2量体であり、前記2つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、[29]~[33]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[35] T細胞受容体がMHCクラス1分子と結合する、[29]~[34]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[36] 標的細胞が、がん細胞または感染症の原因となる病原体が感染した感染細胞である、[29]~[35]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[37] がん患者のがん組織中のリンパ球のT細胞受容体α鎖可変領域のレパートリー及び前記がん患者の末梢血中のリンパ球のT細胞受容体α鎖のレパートリーを同定し、がん組織中のリンパ球における存在量が末梢血中のリンパ球における存在量の2倍以上であるT細胞受容体α鎖可変領域をがん特異的T細胞受容体α鎖可変領域と決定する、がん特異的T細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法。
[38] 複数のがん患者において、がん特異的T細胞受容体α鎖可変領域を特定し、複数のがん患者において、がん組織中のリンパ球における存在量が末梢血中のリンパ球における存在量の2倍以上であるT細胞受容体α鎖可変領域をがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域と決定する、[37]のがん特異的T細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法。
[39] がん患者のがん組織中のリンパ球のT細胞受容体α鎖可変領域のレパートリー及び健常人の末梢血中のリンパ球のT細胞受容体α鎖のレパートリーを同定し、がん組織中のリンパ球における存在量が健常人の末梢血中のリンパ球における存在量の2倍以上であるT細胞受容体α鎖可変領域をがん特異的T細胞受容体α鎖可変領域とする、がん特異的T細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法。
[40] 複数のがん患者のがん組織中のリンパ球の混合物と複数の健常人の末梢血中のリンパ球の混合物を用いて、がん組織中のリンパ球における存在量が健常人の末梢血中のリンパ球における存在量の2倍以上であるT細胞受容体α鎖可変領域をがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域と決定する、[39]のがん特異的T細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法。
[42] がんが扁平上皮がんである、[37]~[41]のいずれかのがん特異的T細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法。
[43] がんが子宮頸部がん又は肺がんである、[37]~[41]のいずれかのがん特異的T細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法。
[44] TRAV1-1-01、TRAV1-1-02、TRAV21-02、TRAV22-01、TRAV1-2-01、TRAV12-2-03、TRAV39-01、TRAV2-01、TRAV21-01、TRAV12-1-01、TRAV1-2-01及びTRAV38-2/DV8-01からなる群から選択されるT細胞受容体α鎖可変領域遺伝子のいずれかによりコードされるT細胞受容体α鎖可変領域である、子宮頸部がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域。
[45] AVR---(x=1~6)--G-(x=1~3)--KL(I)/(T)で表されるコンセンサスフレームを有するCDR3領域を有するT細胞受容体α鎖可変領域である子宮頸部がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域。
[46] TRAV12-1-01、TRAV16-01、TRAV19-01、TRAV22-01、TRAV35-02、TRAV17-01、TRAV9-2-02及びTRAV13-1-01からなる群から選択されるT細胞受容体α鎖可変領域遺伝子のいずれかによりコードされるT細胞受容体α鎖可変領域である、肺がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域。
[47] T細胞受容体可変領域が、[37]~[42]のいずれかの方法で特定されたT細胞受容体可変領域である、[1]~[8]及び[15]~[22]のいずれかの、NK細胞機能増強剤。
[48] T細胞受容体可変領域が、TRAV1-1-01、TRAV1-1-02、TRAV21-02、TRAV22-01、TRAV1-2-01、TRAV12-2-03、TRAV39-01、TRAV2-01、TRAV21-01、TRAV12-1-01、TRAV1-2-01及びTRAV38-2/DV8-01からなる群から選択されるT細胞受容体α鎖可変領域遺伝子のいずれかによりコードされる子宮頸部がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域である、[47]のNK細胞機能増強剤。
[49] T細胞受容体可変領域が、AVR---(x=1~6)--G-(x=1~3)--KL(I)/(T)で表されるコンセンサスフレームを有するCDR3領域を有する子宮頸部がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域である、[47]又は[48]のNK細胞機能増強剤。
[50] T細胞受容体可変領域が、TRAV12-1-01、TRAV16-01、TRAV19-01、TRAV22-01、TRAV35-02、TRAV17-01、TRAV9-2-02及びTRAV13-1-01からなる群から選択されるT細胞受容体α鎖可変領域遺伝子のいずれかによりコードされる肺がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域である、[47]のNK細胞機能増強剤。
[52] T細胞受容体可変領域が、TRAV1-1-01、TRAV1-1-02、TRAV21-02、TRAV22-01、TRAV1-2-01、TRAV12-2-03、TRAV39-01、TRAV2-01、TRAV21-01、TRAV12-1-01、TRAV1-2-01及びTRAV38-2/DV8-01からなる群から選択されるT細胞受容体α鎖可変領域遺伝子のいずれかによりコードされる子宮頸部がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域である、[51]のMHC分子複合体発現低下剤。
[53] T細胞受容体可変領域が、AVR---(x=1~6)--G-(x=1~3)--KL(I)/(T)で表されるコンセンサスフレームを有するCDR3領域を有する子宮頸部がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域である、[51]又は[52]のMHC分子複合体発現低下剤。
[54] T細胞受容体可変領域が、TRAV12-1-01、TRAV16-01、TRAV19-01、TRAV22-01、TRAV35-02、TRAV17-01、TRAV9-2-02及びTRAV13-1-01からなる群から選択されるT細胞受容体α鎖可変領域遺伝子のいずれかによりコードされる肺がんのがん特異的ヒト共通T細胞受容体α鎖可変領域である、[51]のMHC分子複合体発現低下剤。
[55] T細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、標的細胞のMHC複合体と結合して、MHC複合体のダウンモジュレーションを誘導して発現を低下させる方法。
[56] T細胞受容体キメラタンパク質を、標的細胞上のMHC複合体と結合させ、標的細胞内に取り込ませる方法。
[57] T細胞受容体キメラタンパク質、あるいは、T細胞受容体キメラタンパク質を認識するタンパク質などに磁性体や薬剤を付与することで、標的細胞選択的に薬剤の細胞質内への取り込みを促し、これを利用して細胞を破壊する方法。
1.T細胞受容体キメラタンパク質
(1)T細胞受容体キメラタンパク質の構造
本発明の方法においては、T細胞受容体(TCR:T cell receptor)の可変領域と免疫グロブリンのFc領域とを融合させたT細胞受容体キメラタンパク質を用いる。該T細胞受容体キメラタンパク質をT細胞受容体-イムノグロブリンキメラタンパク質やTCR-IgFc fusion proteinとも呼ぶ。
がん細胞を標的細胞とし、がん細胞におけるTCRを特定する場合、T細胞受容体の可変領域としては、特定のがん細胞に発現する、がん特異的抗原を認識するT細胞受容体の可変領域を用いればよい。このようなT細胞受容体の可変領域としては、例えば、特定のがん患者由来のT細胞受容体の可変領域を用いることができる。がん種は限定されず、本発明で治療対象となるがんとして、発生する部位別では、肺扁平上皮がんや子宮頸部扁平上皮がんなどの扁平上皮がん、肺腺がんや子宮頸部腺がんなどの腺がん、未分化がんが挙げられる。組織、器官別には、胃がん、肺がん、肝がん、結腸がん、膵がん、膀胱がん、前立腺がん、肛門・直腸がん、食道がん、子宮頸がん、子宮体がん、乳がん、皮膚がん、腎がん、副腎がん、尿道がん、陰茎がん、精巣がん、腎盂尿管がん、脳・神経腫瘍、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。この際、大腸がんや消化器がんに特異的ながん胎児性抗原(CEA);悪性黒色腫(メラノーマ)に特異的なMAGE(Melanoma antigen);乳がんに特異的なHER2/neu;前立腺がんに特異的なヒト前立腺がん特異抗原(PSA)、ヒト前立腺酸性フォスファーターゼ(PAP)及びPSMA(prostate specific membrane antigen);白血病や各種がんに特異的なWT1ペプチド;肝細胞がんに特異的なグリピカン3(GPC3)等のがん特異的抗原を認識するT細胞受容体の可変領域を用いることにより、多数のがん患者の治療に汎用的に用いることができるT細胞受容体キメラタンパク質を得ることができる。ただし、がん患者ごとに適切ながん治療を行うためには、がん患者からリンパ球を採取し、リンパ球のT細胞受容体のレパートリーを同定し、そのがん患者に高頻度で認められるT細胞受容体の可変領域を用いればよい。この場合、T細胞受容体はそのがん患者のがん特異的抗原の特定のエピトープを認識する。このような、がん細胞の特定のエピトープに特異的なT細胞受容体をコードするDNAは、がん患者のT細胞受容体を網羅的に解析することにより得ることができる。T細胞受容体には、1018ものレパートリーがあるが、現在では網羅的解析が可能である。例えば、がん患者のリンパ節より、T細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、T細胞受容体のレパートリーを解析することができる。がん患者において出現頻度が高いT細胞受容体をそのがんに対する特異性が高い特異的T細胞受容体であると判断することができる。
一度に複数の患者について、T細胞受容体の網羅的解析を行えば、多数のT細胞受容体のレパートリーを取得することができ、T細胞受容体の可変領域をコードする多数のDNAのライブラリーを作製しておくことができる。その後に治療を必要とするがん患者又は感染症患者に対して、T細胞受容体の解析を行い、その患者が有するT細胞受容体あるいは配列が近似しているT細胞受容体が前記のライブラリーに存在する場合は、そのDNAを用いてT細胞受容体キメラタンパク質を製造すればよい。
(1) T細胞受容体キメラタンパク質の細胞への取り込み、及び細胞表面のMHC複合体の発現の低下
T細胞受容体キメラタンパク質により、MHC複合体の細胞表面上の発現を低下させることができる。また、MHC複合体へ結合したT細胞受容体キメラタンパク質を細胞内へ導入させることができる。
また、本発明はT細胞受容体キメラタンパク質を用いてNK細胞の機能増強を図る方法である。本発明は、さらに、そのために用いるT細胞受容体キメラタンパク質である。
(a)NK細胞は、MHC分子を発現していない細胞を標的細胞として認識する。T細胞受容体キメラタンパク質は、特異的抗原を発現しているMHC複合体と結合して、数時間後、例えば6時間後には細胞内に取り込まれるため、標的細胞上のMHC複合体分子の発現が低下する。このため、NK細胞は標的細胞を認識することができ、攻撃できる。
さらに、本発明のT細胞受容体キメラタンパク質は、がん細胞のMHCクラス1分子とがん特異的抗原の複合体あるいは感染細胞のMHCクラス1分子と病原体特異的抗原に結合するため、がん細胞や感染細胞の検出に利用することができ、がん細胞を検出することによりがんの検出を行うことができる。また、感染症の原因となる細菌やウイルス等の病原体が感染した感染細胞を検出することにより感染症の検出を行うことができる。
1)E.G7細胞上のPD-L1の発現解析
マウスリンフォーマ細胞であるE.G7細胞上のPD-L1の発現を確認した。E.G7細胞に、抗PD-L1蛍光標識抗体(クローン名10F.9G2)を0.25μgを加え、4℃、30分間染色し、その後、PBSにて細胞を2回洗った。このサンプルを用いて、フローサイトメトリーにて解析した。フローサイトメトリー解析はFACSCanto II (Becton Dickinson社製)にて行った。図8に結果を示す。図の数値は、Mean Fluorescence Intensity 値(MFI)を示す。E.G7細胞上にPD-L1が発現していることが確認できた。
C57BL/6マウスに、E.G7細胞を5×106個、足蹠に移植した。0、10日後、15日後の脾臓中のリンパ球を採取した(p18)。蛍光標識抗体を用いて、PD-1の発現を検討した。1×106個のリンパ球に対し、市販の蛍光標識抗体を0.25μgを加え、4℃、30分間染色し、その後、PBSにて細胞を2回洗った。また、死細胞を標識するため、PI(Propidium Iodide)を用いて染色し、解析サンプルとした。このサンプルを用いて、フローサイトメトリーにて解析した。フローサイトメトリー解析はFACSCanto II (Becton Dickinson社製)にて行った。
抗PD-1抗体(クローン名RMP1-14)
抗CD8抗体(クローン名53-6.7)
C57BL/6マウスから、脾臓中のリンパ球を採取した。これをナイーブマウスサンプルとした。C57BL/6マウスに、E.G7細胞を5x106個、足蹠に移植した。10日後、15日後の脾臓中のリンパ球を採取した。マウスは2匹ずつ用いた。
(i) 2本鎖cDNAの両端に以下の[1]~[3]のいずれかの2本鎖アダプターDNAをライゲーションする工程;
(ii) 2本鎖アダプターDNAをライゲーションした遺伝子をウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)で処理し、さらに加熱処理することによりアダプターDNAのアンチセンス鎖を分解する工程;
(iii) 2本鎖アダプターDNAのアンチセンス鎖の一部又は全部の配列からなるフォワードプライマー及び標的遺伝子に特異的にアニーリングするリバースプライマーを用いてPCR増幅を行う工程。
(a) センス鎖とアンチセンス鎖がアニーリングしており、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基長は同じであるか、又はセンス鎖が長い;
(b) センス鎖の塩基長は15~40bpである;
(c) アンチセンス鎖に複数のウラシルを含み、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)でアダプターを処理することにより、ウラシルが除去され、その後加熱処理することによりアンチセンス鎖が分解される;
(d) アダプターDNAの少なくとも1端は平滑末端の形態を有する;
(e) 一方の末端で増幅しようとする標的遺伝子に結合する;及び
(f) センス鎖の一部又は全部が遺伝子増幅に用いるフォワードプライマーの配列である。
V領域:TRAV8-1-01 J領域:TRAJ42-01 CDR3(アミノ酸配列):ATLYSGGSNAKLT(配列番号1)となった。
1)T細胞受容体の遺伝子クローニングと発現プラスミド構築
V領域:TRAV8-1-01 J領域:TRAJ42-01 CDR3(アミノ酸配列):ATLYSGGSNAKLTのT細胞受容体を、E.G7移植15日後の脾臓サンプルcDNA libraryから、以下のPCRプライマーを用いてTCRα鎖のL領域からC領域の一部まで含む領域をクローニングした(del Cと命名)。
Primer配列:
TO1002(V領域sense鎖、EcoRI siteを付与):CGG AAT TCA TGC ACA GCC TCC TGG GGT TG(配列番号32)
TO1005(C領域を一部含むAntisense鎖、Bgl II siteを付与):GAA GAT CTA GGT TCT GGG TTC TGG ATG TTT G(配列番号33)
TP58プラスミドをHEK293細胞に遺伝子導入した後、ultralow IgG-FCS(その後の精製過程でウシIgGが混入することを避けるため)存在培地中で、4日培養した。培養上清を回収し、Hi Trap protein Gカラム(GEヘルスケア・ジャパン社)を用いてメーカーのプロトコールに従って、精製を行った。
T細胞受容体キメラタンパク質は、先行研究により作成されているが、従来型のT細胞受容体キメラタンパク質は、TCR V領域をIgFc部分と結合させたキメラタンパク質である。そこで、上記、V領域:TRAV8-1-01をpFUSE-mIgG2A-Fcプラスミドに結合して従来型のT細胞受容体キメラタンパク質(mTRAV8-IgFc)を構築した。
E.G7に反応するT細胞受容体をもとにした新規T細胞受容体キメラタンパク質(mTRAV8-CDR3-IgFc fusion protein)を作製したので、そのタンパク質を市販のビオチン化キット(Dojindo biotin labeling kit; 和光純薬株式会社)を用いてビオチン化した。
E.G7細胞にビオチン化T細胞受容体キメラタンパク質(従来型又は新規)0.5μgをそれぞれ加え、4℃、60分間結合させた後、PBSにて細胞を2回洗った。その後、Streptavidin-PE (ebioscience社)を加え4℃、30分間染色し、PBSにて細胞を2回洗った。また、死細胞を標識するため、PI(Propidium Iodide)を用いて染色し、解析サンプルとした。このサンプルを用いて、フローサイトメトリーにて解析した。フローサイトメトリー解析はFACSCanto II (Becton Dickinson社製)にて行った。比較対照群として、E.G7細胞に、Streptavidin-PE (ebioscience社)を加え4℃、30分間染色し、PBSにて細胞を2回洗ったサンプルをおいた。結果を図20に示す。図の数値は、MFIを示している。図20Aは新型T細胞受容体キメラタンパク質(mTRAV8-CDR3-IgFc)の結果を示し、図20Bは従来型T細胞受容体キメラタンパク質(mTRAV8-IgFc)の結果を示す。新規T細胞受容体キメラタンパク質は、CDR3領域を持つことで抗原ペプチドを特異的に認識し、従来型と比較して約1.5倍の効率でがん細胞へ結合した。
E.G7細胞に、抗MHCクラス1抗体(H-2KbDb; Biolegend社)を0.25μg加える群、加えない群を用意して4℃、30分間結合させた後、PBSにて細胞を2回洗った。新規ビオチン化T細胞受容体キメラタンパク質0.5μgをそれぞれ加え、4℃、60分間結合させた後、PBSにて細胞を2回洗った。その後、Streptavidin-PE (ebioscience社)を加え4℃、30分間染色し、PBSにて細胞を2回洗った。また、死細胞を標識するため、PI(Propidium Iodide)を用いて染色し、解析サンプルとした。このサンプルを用いて、フローサイトメトリーにて解析した。フローサイトメトリー解析はFACSCanto II (Becton Dickinson社製)にて行った。結果を図21に示す。図の数値は、MFIを示している。図21Aは、抗MHCクラス1抗体を加えなかった群の結果を、図21Bは加えた群の結果を示す。T細胞受容体キメラタンパク質は、抗MHCクラス1抗体により結合を阻害されたことから、T細胞受容体キメラタンパク質はMHC複合体と結合していることが明らかとなった。グラフの上に結合様式を示す。
E.G7 2x105個に対してビオチン化mTRAV8-CDR3-IgFc (0.5μg)を、4℃1時間培養した。細胞をPBSで2回洗浄して、MHC複合体に結合していないmTRAV8-CDR3-IgFcを除去した。次に、ストレプトアビジン-FITCを添加し4℃、30分間染色を行った。細胞をPBSで2回洗浄した後、経時的に蛍光顕微鏡によりmTRAV8-CDR3-IgFcの局在を観察した(図22)。洗浄直後(0hr)では、細胞膜のみが染色されているのが認められたが、6時間後には細胞内部が染色されている(図 矢印)ことが認められた。MHC複合体と結合したT細胞受容体キメラタンパク質(mTRAV8-CDR3-IgFc)は、6時間後には、細胞内に取り込まれることが明らかとなった。
E.G7 1x105個に対して、mTRAV8-CDR3-IgFcを(0, 1, 5μg)存在下で6時間培養した。その後、抗H-2KbDb抗体(Biolegend社)で染色し、フローサイトメトリーで測定した。グラフはmTRAV8-CDR3-IgFc 0μgに対するMean Fluorescence intensity 値(MFI)の差dMFIで示している(図23)。T細胞受容体キメラタンパク質と結合して6時間後には、MHC 複合体の発現低下がみられることが判明した。
子宮頸がんヒト培養細胞株であるHela細胞2x105個に対してビオチン化hTRAV21-CDR3-IgFc (0.5μg)を、4℃、1時間培養した。細胞をPBSで2回洗浄して、MHC複合体に結合していないhTRAV21-CDR3-IgFcを除去した。次に、ストレプトアビジン-FITCを添加し4℃、30分間染色を行った。細胞をPBSで2回洗浄した後、経時的に蛍光顕微鏡によりhTRAV21-CDR3-IgFcの局在を観察した(図24A)。洗浄直後(0hr)では、細胞膜部分が染色されているのが認められたが(矢印)、6時間後には細胞内部が染色されていることが認められた(矢印)。MHC複合体と結合したT細胞受容体キメラタンパク質(hTRAV21-CDR3-IgFc)は、6時間後には、細胞内に取り込まれることが明らかとなった。ここで用いたhTRAV21-CDR3は、実施例17、18により特定した、子宮頸がんに共通するTCRであるhTRAV21-CDR3を用いて実施した。
E.G7 1x105個をCFSEにより蛍光標識し、マウスT細胞1x105個と混合する。これらの細胞にmTRAV8-CDR3-IgFc (0.5μg)を、4℃1時間培養した後2回PBSで洗浄した。抗マウスIgG磁性体抗体(BioMag(登録商標) anti-mouse IgG; Qiagen社)を添加し4℃、30分間培養し、2回PBSで洗浄した。37℃で0時間、あるいは16時間培養した後、MRI(Bruker社 7T-MRI)にて磁場を加えた(3テスラ、30分)。比較対照として、mTRAV8-CDR3-IgFc を加えない群をおいて、24時間後、これらサンプルをフローサイトメトリーにて解析した(図25)。mTRAV8-CDR3-IgFc を加えない群、mTRAV8-CDR3-IgFcを加え37℃で0時間培養した群においては、CFSEの蛍光が減少した分画(CSFE low)が観察され、E.G7の分裂増殖が認められた。それに対し、mTRAV8-CDR3-IgFcを加え37℃で16時間培養した群は、E.G7の増殖は認められなかった(図25A、B)。また、マウスT細胞については、全ての群において検出できたことから、磁場による正常細胞に対する悪影響は認められなかった(図25C)。E.G7とマウスT細胞の存在比を検討したところ、mTRAV8-CDR3-IgFcを加え37℃で16時間培養した群は、他群と比較してE.G7の比率が低下しており(図25D)、がん特異的に細胞が傷害をうけたものと考えられた。これらの結果は、磁場によるハイパーサーミア効果と考えられ、これは細胞内に磁性体が取り込まれることが効果的であること、T細胞受容体キメラタンパク質は、正常細胞に影響を与えずに標的細胞特異的に傷害できる薬剤として有効であることが明らかとなった。
E.G7 1x 104個にmTRAV8-J42-IgFcを1, 10μg/ml添加し、37℃で16時間培養した(MHC クラスI分子の細胞内取り込みによる消失効果)。この細胞を標的細胞として、予めC57BL/6マウス脾臓から単離・IL-2 (500 U/ml)存在下で培養したNK細胞を添加し、共培養した(NK細胞: EG7の割合 = 1 : 1, 10: 1)。4時間後に死細胞をPropidium Iodideで染色し、フローサイトメトリー解析により細胞死が誘導されたE.G7を計数した(図26)。T細胞受容体キメラタンパク質による標的細胞のMHC発現低下、及び下記TCR-Ig fusion protein dependent cellular cytotoxicity; TDCC効果による細胞傷害活性が認められた。
マウス脾臓リンパ球よりNK細胞を単離した。IL-2 (500 U/ml)存在下で7日間培養し、NK細胞を増殖させ、この細胞をeffector細胞として用いた。
マウス脾臓リンパ球よりNK細胞を単離した。IL-2 (500 U/ml)存在下で7日間培養し、NK細胞を増殖させ、この細胞をeffector細胞として用いた。E.G7細胞 5×104個に1μg/mlのmTRAV8-CDR3-IgFc、又はmTRAV8-IgFcを添加し、37℃、30分培養後、PBSにて細胞を2回洗った。対象群には、E.G7細胞 5×104個に1μg/mlのマウスIgGを添加し、37℃、30分培養後、PBSにて細胞を2回洗ったものをおいた。これらTarget細胞に、effector細胞を、20:1(Effector:Target)の割合で加え、37℃、4時間、共培養した。共培養後、PI(Propidium Iodide)を用いて染色し、E.G7細胞分画におけるPI陽性細胞を、フローサイトメトリーにて解析した。PI陽性細胞を死細胞としてその%を評価した(図28)。従来型のT細胞受容体キメラタンパク質を用いたTDCC効果の比較においても、CDR3領域部分が有効であり、新規T細胞受容体キメラタンパク質の効率が良いことが判明した。
Hela細胞 1x 104個にhTRAV21-CDR3-IgFcを0, 2.5μg/ml添加し、37℃で2時間培養して(MHC クラスI分子の細胞内取り込みによる消失効果)、この細胞を標的細胞とした。ヒトNK細胞培養株NK92を添加し、3時間共培養した(NK細胞:がん細胞の割合 = 1 : 1, 5:1,10: 1)。細胞傷害活性をCytotoxicity assay kit (Promega社)を用いて評価した(図29)。T細胞受容体キメラタンパク質による標的細胞のMHC発現低下、及びTCR-Ig fusion protein dependent cellular cytotoxicity; TDCC効果による細胞傷害活性がヒトの実験系においても認められた。
がん細胞E.G7をCFSEで蛍光標識して、mTRAV8-CDR3-IgFc 10μg/mlを添加し同時投与した群、及び未処理群を用意した。これらがん細胞1x106をC57BL/6マウス尾静脈から接種し、24時間後に脾臓に転移したE.G7細胞数を計測した。脾臓細胞3x105個中のE.G7細胞数を示す(図30)。図30に示すように、T細胞受容体キメラタンパク質により、がん転移抑制効果が認められた。
疾患における共通TCRの特定法を開発して。方法は、解析1(腫瘍組織と末梢血の比較(同一検体))による方法と解析2による方法(健常人末梢血との比較)がある。図31に、解析1と解析2のプロトコールを示す。
子宮頸がんの患者15名より、疾患部位周囲組織5mm角の組織をサンプルとして採取した。また、同一患者の末梢血10mlを採取し、比重遠心法により単核球を単離してサンプルとして用いた。
疾患に対する共通TCRの特定方法にて抽出したV領域について各がん患者組織のCDR3出現頻度上位5つを抽出した。各V領域について全てのがん患者組織のCDR3出現頻度順に並べた。図33-1に示すように、32パターンに集約された。図に示すように、高いコンセンサス配列(high consensus sequence)と部分的なコンセンサス配列(partial consensus sequence)が存在した。この中から、上位10個のCDR3パターンを抽出した。抽出したCDR3にはアミノ酸配列AVRを含む配列が有意に多かった。そのためAVRを含む配列32パターンにおいてアラインメントを行い、さらなる共通配列を導き出し(AVR---(x=1~6)--G-(x=1~3)--KL(I)/(T))で表されるコンセンサスフレームを子宮頸がん特異的CDR3として特定した。17.で特定したがん患者で出現頻度の特に高いV領域では、調査した15検体中12検体がこの特異的CDR3を示していた(図33-2)。
子宮頸がんの検体A、B、および未知の検体Cについて、HPV感染の有無を確認した。検体からDNAを抽出し、HPV typing kit (Takara)により、HPVの検出を行った。図34に示すように、検体A、B、Cとも、HPV遺伝子が検出され、悪性型であるHPV16の感染であることが明らかとなった。さらに、検体A、BはHPV感染が認められ、かつTCRの頻度はTRAV21が高かったことから、17.18.で決定したTRAV21-02かつ共通CDR3を含むT細胞受容体キメラタンパク質(TRAV21-CDR3-IgFc)を用いて、HPV感染患者サンプル(検体C)の感染細胞の検出を試みた。凍結包埋したHPV感染子宮頸部組織をクリオスタットにより10μm厚に薄切し、通法によりアセトン固定した。正常ヤギ血清でブロッキングを行った後に、hTRAV21-CDR3-IgFc (1μg)を添加し、4℃で16時間培養した。洗浄後、ビオチン化抗マウスIgG抗体に続いてストレプトアビジン-APC及び核染色のためにDAPIを添加し、蛍光顕微鏡により観察した。結果を、図35に示す。図35A、BはDAPI染色像を、図35Cは、対照となるIg染色像(control Ig: cIg)を、図35Dは、hTRAV21-CDR3-IgFcによる蛍光染色像を示す。T細胞受容体キメラタンパク質(TRAV21-CDR3-IgFc)により、HPV感染細胞を検出することができた(図35D)。T細胞受容体キメラタンパク質は、感染細胞の検出にも利用可能であることが示された。
肺がんの患者13名より、疾患部位周囲組織5mm角の組織をサンプルとして採取した。また、同一患者の末梢血10mlを採取し、比重遠心法により単核球を単離してサンプルとして用いた。
20.で特定したTCRの中でTRAV19-CDR3, TRAV35-CDR3を用いて、T細胞受容体キメラタンパク質を作成した(TRAV19-CDR3-IgFc、TRAV35-CDR3-IgFc)。肺がんの検体Aについて、T細胞受容体キメラタンパク質を用いて、肺がん患者サンプルのがん細胞の検出を試みた。
配列番号32及び33 プライマー
Claims (11)
- T細胞受容体の可変領域のV領域、CDR3の全て及びJ領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるT細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、標的細胞のMHC分子複合体と結合して、MHCクラス1分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
- T細胞受容体の可変領域のV領域が、T細胞受容体のα鎖及び/又はβ鎖である、請求項1記載のMHC分子複合体発現低下剤。
- T細胞受容体の可変領域のV領域が、T細胞受容体のα鎖である、請求項2記載のMHC分子複合体発現低下剤。
- 免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、請求項1~3のいずれか1項記載のMHC分子複合体発現低下剤。
- 2つのT細胞受容体の可変領域のV領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる2量体であり、前記2つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、請求項1~4のいずれか1項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
- T細胞受容体がMHCクラス1分子と結合する、請求項1~5のいずれか1項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のMHC分子複合体発現低下剤を有効成分として含む、NK細胞機能増強剤。
- 請求項7記載のNK細胞機能増強剤を含む、がん細胞を殺傷させるための、がん治療薬。
- がんが肺がんである、請求項8記載のがん治療薬。
- 請求項7記載のNK細胞機能増強剤を含む、感染細胞を殺傷させるための、感染症治療薬。
- 感染症が子宮頚部がんである、請求項10記載の感染症治療剤。
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