TW202120548A - 特異性結合mage-a的抗原結合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及特異性結合黑色素瘤相關抗原 A (MAGE-A) 蛋白來源抗原的抗原結合蛋白。本發明特別提出了與 MAGE-A抗原肽特異性結合的抗原結合蛋白，所述 MAGE-A抗原肽包含 SEQ ID NO: 1 或由 SEQ ID NO: 1 組成且與主要組織相容性 (MHC) 蛋白形成複合體。特別地，本發明的抗原結合蛋白含有與所述 MAGE-A 肽/MHC 複合體特異性結合的新型改造 T細胞受體 (TCR) 的互補決定區 (CDR)。本發明的抗原結合蛋白可用於診斷、治療和預防表達 MAGE-A 的癌性疾病。還提出了編碼本發明抗原結合蛋白的核酸、包含這些核酸的載體、表達抗原結合蛋白的重組細胞以及包含本發明抗原結合蛋白的藥物組合物。

Description

特異性結合MAGE-A的抗原結合蛋白
本發明涉及特異性結合黑色素瘤相關抗原 A (MAGE-A) 蛋白來源抗原的抗原結合蛋白。本發明特別提出了與 MAGE-A抗原肽特異性結合的抗原結合蛋白，所述 MAGE-A抗原肽包含 SEQ ID NO: 1 或由 SEQ ID NO: 1 組成且與主要組織相容性 (MHC) 蛋白形成複合體。特別地，本發明的抗原結合蛋白含有與所述 MAGE-A 肽/MHC 複合體特異性結合的新型改造 T細胞受體 (TCR) 的互補決定區 (CDR)。本發明的抗原結合蛋白可用於診斷、治療和預防表達 MAGE-A 的癌性疾病。還提出了編碼本發明抗原結合蛋白的核酸、包含這些核酸的載體、表達抗原結合蛋白的重組細胞以及包含本發明抗原結合蛋白的藥物組合物。
氨基酸序列「KVLEHVVRV」(SEQ ID NO: 1)的MAGE-A腫瘤抗原（也稱為MAG-003 肽）是MAGE-A4（氨基酸 286-294）和MAGE-A8（氨基酸288-296）的一個 HLA-A*02:01限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位(Zheng-Cai J. et al. Clin Dev. Immunol. 2010, 567594)。MAGE-A4和MAGE-A8 都是蛋白，並且是MAGE-A基因家族成員。儘管MAGE-A8和-A4可能在胚胎發育、腫瘤轉化或腫瘤進展方面發揮作用，但它們的功能目前尚不清楚。這些蛋白已確定了多種選擇性剪接變體。根據SEQ ID NO: 1的MAGE-A抗原屬於在腫瘤中表達但在睾丸和胎盤之外的正常組織中不表達的癌症/睾丸(CT)抗原。MAGE-A4蛋白和 mRNA 表達等與各種癌症的發生和預後有關。主要組織相容性複合體(MHC)分子提呈的肽例如MAGE-A（特別是MAGE-A4和/或MAGE-A8）衍生的肽「KVLEHVVRV」可能與TCR結合，因此是基於T細胞免疫療法的靶標。因此，MAGE-A抗原及其表位肽已用於腫瘤免疫療法試驗。
雖然在開發用於癌症治療的分子靶向藥物方面取得了進展，但是，本領域仍然需要開發抗癌新藥，其特異性靶向作用於對癌細胞具有高度特異性但對正常細胞不具特異性的分子。
因此，本發明提出了新型抗原結合蛋白，其對與MHC蛋白形成複合體的SEQ ID NO: 1的腫瘤表達抗原MAGE-A具有特異性。
WO 2017/158103公開了TCR，更特別是天然TCR（例如，天然 TCR R7P1D5），其與具有SEQ ID NO: 1的KVLEHVVRV的氨基酸序列的MAGE-A抗原肽和HLA I類分子的複合體結合，以及這些TCR在診斷、治療和預防癌性疾病中的用途。但是，相較於與MHC提呈病毒抗原特異性結合的TCR，與MHC提呈癌症抗原特異性結合的天然TCR親和力通常較低(KD = 1-300 μM)。此現象的部分解釋似乎為：胸腺中發育的T細胞在自身肽-MHC配體上被負選擇（耐受誘導），從而刪除了對此類肽-MHC親和力過高的T細胞。這種低親和力是腫瘤免疫逃逸的一種可能解釋(Aleksic et al. 2012, Eur J Immunol.2012 Dec; 42(12):3174-9)。因此，似乎需要設計與癌症抗原具有更高結合親和力的TCR變體，用作過繼細胞療法(ACT)中的抗原識別構建體，或者作為可溶性方法的識別模組，即，使用雙特異性分子(Hickman et al.2016, J Biomol Screen.2016 Sep;21(8):769-85)。
但是，增加TCR的親和力也可能增加副作用的風險。如上所述，自然中抗腫瘤相關抗原（自身蛋白）的高親和力TCR透過胸腺選擇被排除，從而避免透過交叉反應識別存在於正常組織上的自身肽。因此，簡單增加TCR對靶序列的親和力也可能增加相似非癌特異性肽的親和力，從而增加交叉反應的風險和對健康組織的有害細胞毒性作用。對於靶向作用於MAGE-A3的改造TCR，已痛苦地發現這不僅僅是理論上的風險。特別是，之前發表的結果顯示：兩名患者發生致命的毒性，這兩名患者輸注了經改造以表達靶向作用於MAGE-A3的TCR的T細胞，該TCR與肌肉蛋白Titin中的肽發生交叉反應，但臨床前研究中未預測到交叉反應性(Linette GP et al.Blood 2013;122:863-71, Cameron BJ, et al.  Sci. Transl. Med. 2013; 5:197-103)。這些患者表明，TCR改造的T細胞可能具有嚴重且不可預測的脫靶和器官特異性毒性。
因此，存在尚未滿足的醫療需求，即開發並提出以更高親和力與其靶標特異性結合的 TCR 或抗原結合蛋白，從而甚至可靶向作用於靶抗原肽表達較低的腫瘤細胞或細胞系，同時由於與脫靶肽（也稱為「相似肽」）的交叉反應較低或降低而保持高安全性特徵。換言之，發明人能夠開發出對其靶肽表現出高結合親和力同時又保持高腫瘤選擇性的抗原結合蛋白。
此外，如發明人所示，MAGE-A 特異性 TCR 分子 TCR R7P1D5 作為單鏈構建體或稱為 TCER 的雙特異性形式（以下稱為「TCER™」分子或「TCER™」）顯示了相對較低的溶解度，TCER™ 包含與 T細胞上表面分子特異性結合且與 MHC-肽複合體特異性結合的部分。
因此，儘管 TCR 技術取得了進步，但是仍然需要額外的癌症療法，特別是有效靶向作用於並殺死癌細胞的癌症療法。特別是，需要開發新的抗原結合蛋白，其 i) 對於與具有所需生物學活性的 MHC蛋白形成複合體的 SEQ ID NO: 1 的腫瘤特異性 MAGE-A 肽具有選擇性和特異性，ii) 具有良好的代謝、藥代動力學、溶解性、穩定性和/或安全性特徵，和 iii) 可大規模生產。
因此，在本發明背景下，發明人改造了幾種抗原結合蛋白，其包含衍生自所述親本TCR R7P1D5的CDR變體。這些抗原結合蛋白對肽-MHC複合體的結合親和力增加且穩定性增加和/或溶解性增加，使其更適合用於醫療用途。
此外，如本發明人所證明的，這些新的抗原結合蛋白有效地結合並殺死甚至低拷貝數的靶癌細胞，並有利地維持高安全性特徵同時與類似肽的交叉反應性低。
此外，這些新的抗原結合蛋白，特別是 TCER™ 分子形式的抗原結合蛋白，對腫瘤細胞顯示出高細胞毒性。例如，對於 TCER™ 分子形式的新抗原結合蛋白，對 NCI-H1755、Hs695T細胞和 U2OS 的半數最大有效濃度 (EC50 ) 為 1 至 300 pM、1 pM 至 100 pM 的範圍，尤其是對細胞為 1 pM 至 20 pM 之間。此外，對於健康組織的細胞系（例如：原代細胞系），與腫瘤細胞系 Hs695T 相比，本發明抗原結合蛋白的 EC50 高 100 倍，優選為高 1000 倍以上，這證明了其高安全性。
此外，對於這些新的抗原結合蛋白，特別是 TCER™ 分子，發明人證明了在治療性小鼠模型中即使在低劑量下也具有顯著的體內腫瘤生長抑制作用。
因此，本發明涉及對與 MHC蛋白形成複合體之 MAGE-A 衍生抗原肽具有特異性的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白與例如天然 TCR R7P1D5 相比，在表達和/或純化期間穩定性增加，例如，聚集減少。此外，所述抗原結合蛋白對例如細胞系 NCI-H175、Hs695T細胞和 U2OS 細胞具有高細胞毒性。
總之，發明人令人驚訝的發現尤其提出了相較於本領域的以下優點：(i) 降低 TCR 或抗原結合蛋白與相似肽在健康組織上的交叉反應性並保持高腫瘤選擇性；(ii) 提高 TCR 或抗原結合蛋白的安全性特徵；(iii) TCR 或抗原結合蛋白發揮降低脫靶和脫腫瘤細胞毒性作用；以及 (iv) 提出特異性、選擇性和安全性改善的 TCR 或抗原結合蛋白。 定義
本文中的術語「抗原結合蛋白」系指能夠與至少一種抗原，特別是本發明背景下定義的抗原結合的多肽或結合蛋白。在一優選實施方案中，所述抗原結合蛋白能夠同時與兩種不同抗原結合，如同例如根據雙特異性抗體所已知者。本發明的抗原結合蛋白包含至少6個根據本發明背景下所定義的CDR，其最初源自TCR。在一特別實施方案中，本發明的抗原結合蛋白包含至少一個根據本發明背景下所定義的可變α結構域和至少一個可變β結構域，其最初源自TCR。
「結構域」為根據序列同源性定義的蛋白質區域，通常與特定的結構性或功能性實體有關。此類結構域的實例為：抗體輕鏈的可變輕鏈結構域、抗體重鏈的可變重鏈結構域、抗體重鏈的CH1 、CH2 和CH3 結構域（恆定結構域）、TCR α 鏈的可變結構域或 TCR β 鏈的可變結構域。
本文使用的術語「抗原」或「靶抗原」系指能夠與至少一個抗原結合位點結合的分子或分子或複合體的一部分，其中，例如，所述一個抗原結合位點存在於常規抗體、常規 TCR 中和/或本發明的抗原結合蛋白中。
與本發明的抗原結合蛋白特異性結合的抗原為 MAGE-A抗原肽，其包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成，更具體地說，為與 MHC蛋白形成複合體的包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成的 MAGE-A抗原肽。
本文所用的術語「表位」包含術語「結構性表位」和「功能性表位」。「結構性表位」為當抗原結合蛋白與抗原（例如，肽-MHC 複合體）結合時，所述抗原被所述抗原結合蛋白覆蓋的該些氨基酸。通常情況下，認為抗原在抗原結合蛋白氨基酸任何原子的 5Å 內的所有氨基酸為被覆蓋。抗原的結構性表位可透過本領域已知的方法（包括 X 射線晶體學或 NMR 分析）確定。抗體的結構性表位通常包含 20 至 30 個氨基酸。TCR 的結構性表位通常包含 20 至 30 個氨基酸。「功能性表位」是形成結構性表位的氨基酸的子集，包含對形成本發明抗原結合蛋白介面至關重要抗原的氨基酸（方式為：透過直接形成非共價相互作用，例如：H 鍵、鹽橋、芳族堆積或疏水相互作用；或透過間接穩定抗原的結合構象），例如透過突變掃描測定。通常情況下，與抗體結合的抗原的功能性表位包含 4 至 6 個氨基酸。通常情況下，肽-MHC 複合體的功能性表位包含肽的 2 至 6 個氨基酸和 MHC 分子的 2 至 7 個氨基酸。由於 MHC I 提呈肽的長度通常為 8 至 10 個氨基酸，因此，每個給定肽僅氨基酸子集為肽-MHC 複合體的功能性表位的一部分。在本發明背景中，表位，特別是與本發明抗原結合蛋白結合的功能性表位包含形成結合介面所需的抗原氨基酸或由其組成，因此，功能性表位包含 SEQ ID NO: 1 的 MAGE-A抗原肽的至少 3 個氨基酸，優選為至少 4 個氨基酸。
「MAGE-A」或「黑色素瘤相關抗原 A」亞家族蛋白是分子水平上確定的首批腫瘤相關抗原 (van der Bruggen P, et al. Science. 1991; 254:1643-47)。MAGE-A 是位於 X 染色體 q28 區域的 12 個基因（MAGE-A1 至 MAGE-A12）亞家族。MAGE-A 亞家族蛋白成員通常僅在睾丸或胎盤中表達，其限制性表達表明它們可能在生殖細胞發育中發揮作用。在中樞神經系統以及脊髓和腦幹早期發育時也檢測到了 MAGE-A 蛋白，顯示 MAGE-A 蛋白也可能參與神經元發育。此家族的成員編碼相互具有 50% 至 80% 序列同一性的蛋白，並且所有 MAGE 蛋白質具有一個共同的 MAGE 同源結構域 (MHD)，該結構域是由大約 170 個氨基酸組成的高度保守結構域。MAGE-A 蛋白在癌症中表達的生物學功能和潛在調節機制目前尚不完全清楚。
「MAGE-A4」（即，「黑色素瘤相關抗原4」）蛋白是MAGE-A基因家族成員，具有SEQ ID NO: 97的Uniprot 登錄號 P43358（2019 年 7 月 8 日可用）。MAGE-A4位置被描述為在細胞質內。但是，在細胞核中也檢測到了MAGE-A4染色，在分化良好與分化較差的癌症中細胞核和細胞質之間具有差異性分佈(Sarcevic B et. al., 2003, Oncology 64, 443-449)。MAGE-A4用作一種雄性生殖細胞標誌物。它在生殖母細胞中不表達，但在前精原細胞和成熟生殖細胞中表達(Mitchell et al., 2014, Mod. Pathol. 27, 1255-1266)。MAGE-A4蛋白和mRNA的表達與各種癌症的發展和預後有關。
「MAGE-A8」或「黑色素瘤相關抗原 8」蛋白是 MAGE-A 超家族成員，具有 SEQ ID NO: 98 的 Uniprot 登錄號 P43361（2019 年 7 月 8 日可用）。
根據使用 BLASTP 2.9.0 演算法透過蛋白序列比對所確定的，「MAGE-A4」和「MAGE-A8」蛋白具有 72% 的序列同一性 (Stephen F. et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。此外，「MAGE-A4」和「MAGE-A8」均包含 MAG-003 肽，即，KVLEHVVRV (SEQ ID NO: 1)。
「主要組織相容性複合體」(MHC)是一組細胞表面蛋白，對於獲得性免疫系統識別脊椎動物中的外來分子至關重要，這反過來又決定了組織相容性。MHC分子的主要功能是與源自病原體的抗原結合，並將它們展示於細胞表面上，以透過適當的T細胞識別。人MHC也稱為HLA（人白細胞抗原）複合體（通常只稱為 HLA）。MHC基因家族分為三個亞組：I類、II類和III類。肽和MHC I類的複合體由負載適當T細胞受體(TCR)的CD8陽性T細胞進行識別，而肽和 MHC II類分子的複合體由負載適當TCR的CD4陽性輔助T細胞進行識別。由於CD8依賴性和CD4依賴性這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵腫瘤相關抗原和相應 T細胞受體在開發癌症免疫治療（如：疫苗和細胞治療）中非常重要。HLA-A基因位於染色體6的短臂上並編碼 HLA-A的較大α-鏈成分。HLA-A α-鏈的變異是HLA功能的關鍵。這種變異促進了人群中的遺傳多樣性。由於每種HLA對某些結構的肽均具有不同的親和力，因此，更多種類的HLA意味著在細胞表面上「提呈」更多種類的抗原。每個人最多可以表達兩種類型的 HLA-A，其中一種來自其父母。有些人將從父母雙方遺傳相同的HLA-A，這降低了其個體HLA多樣性；但是，大多數人都遺傳兩種不同拷貝的HLA-A。所有HLA組都具有相同的模式。換句話說，每個人只能表達2432種已知HLA-A等位基因中的一種或兩種。
在本發明的背景下，MHC I 類 HLA 蛋白可以是 HLA-A、HLA-B或HLA-C 蛋白，優選為 HLA-A 蛋白，更優選為 HLA-A*02。
「HLA-A*02」表示特定的 HLA 等位基因，其中字母 A 表示基因，而字尾「*02」表示 A2 血清型。
在 MHC I 類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些 MHC-I 類分子結合，而且它們之後還必須能被負載特異性 T細胞受體 (TCR) 的T細胞識別。
「TCR」是免疫球蛋白超家族的異二聚體細胞表面蛋白，其與參與介導信號轉導的 CD3 複合體的不變蛋白質相關。TCR 以 αβ和γδ 形式存在，其結構相似，但解剖位置非常不同，也很可能功能也非常不同。天然異二聚體 αβ TCR和γδ TCR 的細胞外部分各自含有兩個多肽，每個多肽都有一個膜近端恒定結構域和一個膜遠端可變結構域。每個恒定和可變結構域都包括一個鏈內二硫鍵。可變結構域包含與抗體互補決定區 (CDR) 類似的高度多態性環。使用 TCR 基因療法可克服目前的一些障礙。它通常可讓受試者（患者）自己的 T細胞在短時間內具有所需的特異性並產生足夠數量的 T細胞，從而避免其耗盡。例如，TCR 將被轉導至能 T細胞（例如中央記憶 T細胞或具有幹細胞特性的 T細胞），這可確保轉移時產生更好的持久性、保留性和功能。TCR 工程化 T細胞將透過化學療法或照射被注入淋巴細胞減少的癌症患者，從而獲得有效的植入，但抑制免疫抑制。
本文中的術語「TCR」表示 TCR 及其片段，以及單鏈 TCR 及其片段，特別是單結構域 TCR 以及嵌合、人源化、雙特異性或多特異性 TCR 的可變 α和β 結構域。
「TCR 片段」包含完整或天然 TCR 的一部分，特別是完整或天然 TCR 的抗原結合區或可變區。TCR 片段的實例包括 α、β、δ、γ 鏈的片段，例如：Vα -Ca 或Vβ -Cβ 或其部分，此類片段還可能進一步包含相應的鉸鏈區或單個可變結構域，例如：Vα 、Vβ 、Vδ 、Vγ 、單鏈 Vα Vβ 片段或由 TCR 片段形成的雙特異性和多特異性 TCR。與天然存在的全長 TCR 相比，TCR 的片段發揮相同的功能，即，片段選擇性地且特異性地與其靶肽結合。
在本文中，「單鏈 TCR (scTCR)」表示一種蛋白，其中 TCR 的可變結構域，例如：Vα 和Vβ 或Vδ 和Vγ 位於一個多肽上。通常，可變結構域被連接子分開，其中所述連接子通常包含 5 至 20 個，例如 5 至 15 個氨基酸。
在例如「天然 TCR」措辭中使用的「天然」指野生型 TCR。
在過繼細胞轉移 (ACT) 方法中，產生的轉基因 T細胞可能表達具有野生型 α和β 鏈的野生型 TCR，也表達具有對各靶抗原-MHC 複合體特異的 α和β 鏈的轉基因 TCR。野生型 α和β 鏈以及轉基因 α和β 鏈通常仍然能夠彼此交叉配對。這種不希望的配對可能性被稱為「TCR 錯配」，並且是 TCR（基因）治療領域公認的問題。轉基因 TCR α或β 鏈與內源性 TCR β或α 鏈之間的錯配和不正確配對可能分別導致轉基因 TCRαβ 異源二聚體的表面表達降低，這進而降低了修飾 T細胞的功能性親合力。此外，在一項臨床前模型中，表達錯配 TCR 和在高 IL-2 條件下擴增的 T細胞被證明可誘導移植物抗宿主病 (GvHD)。
優化轉基因TCR α和β配對以避免錯配的一些策略可能包括以下幾點：1. 鼠源化TCR：在這種方法中，人TCRα和β恒定鏈被相應的鼠結構域取代。儘管人和鼠TCR-C結構域顯示出高度的同源性，但是小差異會影響TCR/CD3相互作用的穩定性，並因此影響TCR表面表達水平。2. 半胱氨酸修飾的TCR：該方法在結構上有利的位置引入半胱氨酸氨基酸，因此可形成至少一個額外的二硫鍵並促進兩個TCR鏈之間的正確配對。例如，TCR α恒定鏈中T48C和TCR β恒定鏈中S57C的定點突變形成由兩個鏈間鍵連接的 TCR 異源二聚體（即，引入的二硫鍵加內源性跨膜二硫鍵（α恒定結構域第95號位置和β恒定結構域第 131 號位置）。3. 結構域交換：恒定域在腫瘤特異性 T細胞受體的 α和β 鏈之間交換，產生結構域交換的 (ds) TCR。當正確配對時，這些 dsTCR 鏈保留募集 CD3 蛋白、在 T細胞表面表達和在銜接靶抗原後介導功能性 T細胞反應所必需的全部結構域。相比之下，含有一個 dsTCR鏈和一個野生型 TCR 鏈的錯配TCR缺乏CD3募集、輸出和信號傳導所必需的關鍵結構域，因此不能介導有害的自身免疫。4. 專有 TCR 異源二聚體：在這種方法中，利用空間和靜電力來促進 TCR α和β轉基因之間的正確配對，同時抑制外源性和內源性 TCR α和β鏈之間的配對。一項實施例使用定點突變將 S85R 引入α恒定結構域，將 R88G 引入 β恒定結構域，以便獲得靜電電荷的所需變化，從而產生相互的「杵臼結構」配置，據稱該配置極少扭曲二級和三級結構。5. 使用具有與 CD3ζ 分子融合的各 TCR 鏈的嵌合 TCR-CD3ζ 鏈。6. 使用單鏈 TCR，其中使用柔性肽連接子將確定的 TCR 的 V α 鏈與 β 鏈融合。7. 使用 shRNA 序列或鋅指核酸酶以敲減內源性 TCR 的表達。在另一種稱為「velcro」的方法中，由於在異源二聚體狀態下有利的靜電相互作用而能夠讓兩個 TCR 鏈相互配對。也就是說，這兩種肽主要以分離形式展開，但在混合時優先締合以形成穩定的平行捲曲螺旋異源二聚體。這種方法可用於產生可溶性 TCR，其中異源二聚體複合體透過將肽分別融合至截短的 α和β 鏈而形成。
天然 α-β 異二聚體 TCR 具有 α 鏈和 β 鏈。每個 α 鏈都包括可變、連接和恒定區域，β 鏈通常還包括可變區和連接區之間的短多樣性區域，但是該多樣性區域常被視為連接區域的一部分。TCR α和β 鏈的恒定區或 C 區分別稱為 TRAC和TRBC（Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol 附錄 1：附錄 10）。每個可變區（本文稱為 α 可變結構域和 β 可變結構域）都包括嵌入在框架序列中的三個互補決定區 (CDR)，其中一個是稱為 CDR3 的高度可變區。α 可變結構域 CDR 在本文中稱為 CDRa1、CDRa2、CDRa3，而 β 可變結構域 CDR 在本文中稱為 CDRb1、CDRb2、CDRb3。存在幾種類型的 α 鏈可變 (Vα) 區和幾種類型的 β鏈可變 (Vβ) 區，由其框架、CDR1和CDR2 序列及部分定義的 CDR3 序列區分。Vα 類型透過唯一的 TRAV 號在 IMGT 命名中提及，Vβ 類型透過唯一的 TRBV 號在 IMGT 命名中提及 (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1):42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2):83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press)。關於免疫球蛋白抗體和 TCR 基因的更多資訊，參見國際免疫基因學資訊系統®，Lefranc MP 等人 (Nucleic Acids Res.2015 Jan; 43 (Database issue):D413-22; and http://www.imgt.org/)。因此，常規的 TCR 抗原結合位點通常包括六個 CDR，包含來自 α和β 鏈可變區的 CDR 組，其中 CDR1和CDR3 序列與 HLA 蛋白結合的肽抗原的識別和結合有關，而 CDR2 序列與 HLA 蛋白的識別和結合有關。
與抗體類似，「TCR 框架區」 (FR) 是指插入 CDR 之間的氨基酸序列，即，指與單個物種中的不同 TCR 之間一定程度保守的 TCR α和β 鏈可變區的那些部分。每個 TCR 的 α和β 鏈各有四個 FR，本文中分別稱為 FR1-a、FR2-a、FR3-a、FR4-a和FR1-b、FR2-b、FR3-b、FR4-b。因此，α 鏈可變結構域可稱為 (FR1-a)-(CDRa1)-(FR2-a)-(CDRa2)-(FR3-a)-(CDRa3)-(FR4-a)，β 鏈可變結構域可稱為 (FR1-b)-(CDRb1)-(FR2-b)-(CDRb2)-(FR3-b)-(CDRb3)-(FR4-b)。
在本發明的背景下，α或β 鏈或 γ或δ 鏈中的 CDR/FR 定義基於 IMGT 定義確定 (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org)。因此，根據所述 IMGT 定義，提示了與 TCR或TCR 衍生結構域相關的 CDR/FR 氨基酸位置。優選情況是，第一可變結構域 CDR/FR 氨基酸位置的 IMGT 位置類似於 TRAV5 的 IMGT 編號和/或第二可變結構域 CDR/FR 氨基酸位置的 IMGT 位置類似於 TRBV12-4 的 IMGT 編號。就 γ/δ TCR 而言，如本文所用的術語「TCRγ可變結構域」系指無前導區 (L) 的TCR γ V (TRGV) 區與 TCR γ J (TRGJ) 區的串連物；術語 TCR γ 恒定結構域系指細胞外 TRGC 區或 C 末端截短 TRGC 序列。同樣地，術語「TCR δ可變結構域」系指無前導區 (L) 的 TCR δ V (TRDV) 區與 TCR δ D/J (TRDD/TRDJ) 區的串連物，術語 TCR δ 恒定結構域系指細胞外 TRDC 區域或 C 末端截短 TRDC 序列。
在「抗體」（也稱為「免疫球蛋白」）中，兩條重鏈透過二硫鍵相互連接，且每條重鏈透過一條二硫鍵與輕鏈連接。輕鏈有兩種類型，即，λ(l)和κ(k)。重鏈有五個主要類型（或同種型），它們決定了抗體分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每條鏈包含不同的序列結構域。輕鏈包括兩個結構域或區，即，可變結構域(VL )和恒定結構域(CL )。重鏈包括四個結構域，即，一個可變結構域(VH )和三個恒定結構域(CH1 、CH2 和CH3 ，統稱CH )。輕鏈可變區(VL )和重鏈可變區(VH )決定了對抗原的結合識別和特異性。輕鏈恒定區結構域(CL )和重鏈恒定區結構域(CH )具有重要的生物學特性，例如：抗體鏈締合、分泌、跨胎盤遷移、補體結合以及與 Fc 受體(Fc R)的結合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-端部分，由一條輕鏈和一條重鏈的可變部分組成。抗體的特異性取決於抗體結合位點（antibody combining site，等同於antibody binding site）和抗原決定因子之間的結構互補性。抗體結合位點由主要來自高可變或互補決定區(CDR)的殘基組成。有時，來自非高可變區或 FR 的殘基會影響整體結構域結構，從而影響結合位元點。CDR 是指一起確定天然免疫球蛋白結合位點天然 Fv 區結合親和力和特異性的氨基酸序列。免疫球蛋白輕鏈和重鏈各有三個CDR，分別稱為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常規抗體抗原結合位點包括六個CDR，其包含來自各重鏈和輕鏈V區的CDR組。
在本發明的背景下，抗體或免疫球蛋白為IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。
「抗體框架區」(FR) 是指插入 CDR 之間的氨基酸序列，即，指與單個物種中的不同免疫球蛋白中相對保守的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區的那些部分。每個免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各有四個 FR，分別稱為 FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。因此，輕鏈可變結構域可稱為 (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)，重鏈可變結構域可稱為 (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。
在本發明的背景下，免疫球蛋白輕鏈或重鏈（Fc 結構域除外）中的 CDR/FR 定義基於 IMGT 定義確定 (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org)。因此，根據所述 IMGT 定義，提示了給定可變鏈的 CDR1、CDR2和CDR3 的氨基酸序列以及 FR1、FR2、FR3、FR4和FR5的氨基酸序列。
如本領域技術人員所瞭解的，抗體的結構（特別是抗體的可變重鏈和輕鏈的結構）與 TCR α和β 可變結構域的結構類似。因此，本發明 TCR 的 CDR 可移植至常規抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體中。
本領域技術人員獲知本發明的抗體、TCR 或抗原結合蛋白的 CDR 的氨基酸序列後，可以較容易確定框架區，例如：TCR 框架區或抗體框架區。但是，在未指出 CDR 的情況下，本領域技術人員可以首先基於 TCR 的 IMGT 定義或抗體的 IMGT 定義來確定 CDR 氨基酸序列，然後確定框架區的氨基酸序列。
本文所使用的「人框架區」是與天然抗原結合蛋白（例如：天然人抗體或人 TCR）框架區基本相同（約85%或更高，特別是90%、95%、97%、99%或100%相同）的框架區。
術語「抗體」表示抗體及其片段，以及單結構域抗體及其片段，特別是單結構域抗體以及嵌合、人源化、雙特異性或多特異性抗體的可變重鏈。
本文所指的「常規抗體」是與從自然界分離的抗體具有相同結構域且包含抗體衍生 CDR 和框架區的抗體。同樣，本文所指的「常規 TCR」是包含與天然 TCR 具有相同結構域並包含 TCR 衍生 CDR 和框架區的 TCR。
術語「人源化抗體」系指完全或部分非人類來源的抗體，該抗體已被修飾以取代某些氨基酸，特別是重鏈和輕鏈框架區中的氨基酸，從而避免或最大程度地減少人體中的免疫反應。人源化抗體的恒定結構域主要是人 CH 和CL 結構域。
本領域中已知有很多抗體序列人源化處理方法；例如，參見綜述 Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633。一種常用的方法是 CDR 移植或抗體重構，其涉及將供體抗體（通常為小鼠抗體）的 CDR 序列移植入具有不同特異性的人抗體骨架中。由於 CDR 移植可降低 CDR 移植非人抗體的結合特異性和親和力，從而降低其生物學活性，因此，可在 CDR 移植抗體的選定位置引入回復突變，以保持親本抗體的結合特異性和親和力。使用文獻和抗體數據庫中的現有資訊可鑒定可能的回復突變位置。CDR 移植和回復突變的另一種人源化技術是表面重塑，其中保留非人來源的非表面暴露殘基，而表面殘基則變為人殘基。另一種替代技術稱為「引導選擇」 (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899)，可用於從例如鼠或大鼠抗體等中衍生出保留表位和親本抗體結合特徵的完全人抗體。人源化處理的另一種方法為所謂的 4D 人源化。專利申請 US20110027266 A1 (WO2009032661A1) 中描述了 4D 人源化方案，其在以下應用 4D 人源化技術進行大鼠抗體可變輕 (VL ) 和重 (VH ) 結構域人源化中舉例說明。
對於嵌合抗體，人源化通常涉及修飾可變區序列框架區。
儘管在某些情況下可能希望改變單個 CDR 氨基酸殘基，例如，去除糖基化位點、脫醯胺位點、異構化位點或不理想的半胱氨酸殘基，但作為 CDR 一部分的氨基酸殘基通常不會作與人源化相關的改變。N-連接糖基化透過將寡糖鏈連接至三肽序列 Asn-X-Ser或Asn-X-Thr 的天冬醯胺殘基而發生，其中 X 可以為除 Pro 之外的任何氨基酸。N-糖基化位點的移除可透過將 Asn或Ser/Thr 殘基突變為不同的殘基來實現，特別是透過保守取代的方式實現。天冬醯胺和穀氨醯胺殘基的脫醯胺可能取決於諸如 pH 和表面暴露等因素。天冬醯胺殘基尤其容易發生脫醯胺（主要是存在於 Asn-Gly 序列中時），而在其他二肽序列（如 Asn-Ala）中時則較少發生。當此類脫醯胺位點（特別是 Asn-Gly）存在於 CDR 序列中時，可能希望移除該位點，通常是透過保守取代法移除其中一個涉及的殘基。CDR 序列中取代以移除其中一個涉及的殘基也是本發明的意圖。
「抗體片段」包含完整抗體的一部分，特別是完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括 Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、雙抗體、由抗體片段形成的雙特異性和多特異性抗體。抗體的片段也可以是單結構域抗體，例如：重鏈抗體或 VHH。
術語「Fab」表示分子量約為 50,000 道爾頓且具有抗原結合活性的抗體片段，其中在使用蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）處理 IgG 而獲得的片段中，H 鏈的 N 端側約一半和整個 L 鏈透過二硫鍵而結合在一起。
與本發明抗原結合蛋白相關的術語「雙特異性」系指對兩種不同抗原具有至少兩個效價和結合特異性的抗原結合蛋白，從而包括兩個抗原結合位點。術語「效價」系指抗原結合蛋白結合位點的數量，例如，二價抗原結合蛋白涉及具有兩個結合位點的抗原結合蛋白。應注意的是，術語效價系指結合位點的數量，其中那些結合位點可以與相同或不同的靶標結合，即，二價抗原結合蛋白可以為單特異性（即，與一個靶標結合），也可以為雙特異性的（即，與兩個不同的靶標結合）。靶標可以為抗原、靶肽、脫靶物（即相似肽）等。
在本發明的背景下，優選為：至少一個抗原結合位點源自 TCR，更特別地，至少一個抗原結合位點包含本發明背景下所定義的 TCR 衍生 CDR。
在本發明的背景下，術語「雙特異性」優選為：抗原結合位點的至少一個特異性源自 TCR，更特別地，至少一個抗原結合位點包含本發明背景下所定義的 TCR 衍生 CDR。因此，本發明背景下的「雙特異性」系指一種組合至少一個抗原結合位點（包含本發明背景下定義的 CDR，即 TCR 衍生 CDR）與至少另一個抗原結合位點的抗原結合蛋白，其中所述至少另一個抗原結合位點可源自抗體從而包含抗體 CDR，也可能源自另一個 TCR 從而包含另一個 TCR 的 CDR。但是，在一優選實施方案中，所述另一個抗原結合位點衍生自抗體從而包含抗體 CDR。
本文所指的術語「形式」是指抗原結合蛋白，其包含存在於所述抗原結合蛋白中的特定數目和類型的結構域及其空間組織。
本領域描述了許多不同的形式，例如：雙特異性形式，通常在抗體的背景下，此類形式通常包括非限制性實例，例如：雙抗體、交叉雙可變域 (CODV) 和/或雙可變域 (DVD) 蛋白。這些不同雙特異性抗體及其製備方法的概述公開於，例如，Brinkmann U. and Kontermann E.E. MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2):182-212。具體地，例如，以下科學文章中公開了 DVD 形式 (Wu C et al.Nat Biotechnol 2007; 25:1290-7; PMID:17934452; Wu C. et al.MAbs 2009; 1:339-47; Lacy SE et al.MAbs 2015; 7:605-19; PMID:25764208; Craig RB et al.PLoS One 2012; 7:e46778; PMID:23056448; Piccione EC et al.MAbs 2015)。例如，CODV 公開於 Onuoha SC et al.Arthritis Rheumatol.2015 Oct; 67(10):2661-72 或例如，公開於 WO2012/135345、WO2016/116626。例如，雙特異性雙抗體的描述參見 Holliger P et al.Protein Eng 1996; 9:299-305; PMID:8736497; Atwell JL et al.Mol Immunol 1996; 33:1301-12; PMID:9171890; Kontermann RE, Nat Biotechnol 1997; 15:629-31; PMID:9219263; Kontermann RE et al.Immunotechnology 1997; 3:137-44; PMID:9237098; Cochlovius B et al.Cancer Res 2000; 60:4336-41; PMID:10969772; and DeNardo DG et al.Cancer Biother Radiopharm 2001; 16:525-35; PMID:11789029。
在抗體背景下所使用的「雙抗體」通常系指由兩條鏈組成的二價分子，每條鏈均包含來自相同或不同抗體的 VH 和VL 結構域。兩條鏈通常具有構型 VHA -VLB 和VHB -VLA （A和B 代表兩種不同的特異性）或 VLA -VHB 和VLB -VHA 。
在本發明的背景下，本文的「雙抗體 (Db)」或「雙抗體形式」系指由兩條多肽鏈組成的二價分子，每條多肽鏈包含透過連接子（LDb1 和LDb2 ）連接的兩個可變結構域，其中兩個結構域在本發明背景下定義為第一結構域和第二結構域（V1 和V2 ），而另外兩個結構域可能為 TCR 衍生或抗體衍生可變結構域（VA 、VB ）。V1 和V2 結構域位於兩個不同多肽上，VA 和VB 結構域位於兩個不同多肽上，並且這些結構域按從頭到尾的方向進行二聚化。因此，方向可能為 V1 -LDb1 -VA 和VB -LDb2 -V2 、V2 -LDb1 -VA 和VB -LDb2 -V1 、V1 -LDb1 -VB 和VA -LDb2 -V2 或V2 -LDb1 -VB 和VA -LDb2 -V1 。為了使結構域進行頭對尾的二聚化，連接子（即 LDb1 和LDb1 ）可相同或不同且為短連接子。短連接子是長度通常為 2 至 12、3 至 13 個氨基酸之間的連接子，諸如 3、4、5、6、7、8、9 個氨基酸長度，例如：4、5 個氨基酸長度 (Brinkmann U. and Kontermann E.E. (MAbs.2017 Feb-Mar; 9(2):182-212)或8 個氨基酸長度，諸如：SEQ ID NO: 100 的「GGGS」、SEQ ID NO: 101 的「GGGGS」或 SEQ ID NO: 96 的「GGGSGGGG」。
「雙可變結構域免疫球蛋白 (DVD-Ig™)」形式的描述初見 Wu C. 等人 2007 年的文章(Nat Biotechnol.2007 Nov; 25(11):1290-7)。以該形式中，通常將第二種單克隆抗體 (B) 的靶結合可變結構域與常規抗體 (A)（包含 VLA 和VHA 結構域）進行融合，其中常規抗體 (A) 的輕鏈因此包含額外的輕鏈可變結構域 (VLB )，而常規抗體 (A) 的重鏈包含額外的重鏈可變結構域 (VHB )。因此，本領域中所述的 DVD-Ig™ 通常由兩條多肽鏈--一條重鏈（包含 VHB -L-VHA -CH1 -CH2 -CH3 ）和一條輕鏈（包含 VLB -L-VLA -CL ）組成。因此，VLA /VHA 和VLA /VLA 結構域對並行配對。
在本發明的背景下，「雙可變結構域 Ig 形式」系指包含兩條多肽鏈的蛋白，每條多肽鏈包含透過連接子 (L1 , L3 ) 連接的兩個可變結構域，其中兩個結構域在本發明背景下定義為第一結構域和第二結構域（V1 和V2 ），而另外兩個結構域為抗體衍生重鏈和輕鏈可變結構域（VHA 和VHB ）。在本發明背景下的 DVD-Ig 形式中，例如，多肽鏈含有組織 V1 -L1 -VHA -L2 -CH1 -CH2 -CH3 和V2 -L3 -VLA -L4 -CL 或V2 -L1 -VHA -L2 -CH1 -CH2 -CH3 和V1 -L3 -VLA -L4 -CL 。連接連接子 L1 和L3 的長度優選為 5 至 20 個氨基酸殘基之間，例如 5 至 15 個氨基酸殘基，和/或連接連接子 L2 和L4 可能存在也可能不存在。
抗體領域中所述的「交叉雙可變結構域-Ig 樣蛋白」代表一種形式，其中兩個 VH 和兩個 VL 結構域以允許可變 VH -VL 結構域交叉配對的方式連接，所述結構域（從 N-端到 C-端）以 VHA -VHB 和VLB -VLA 的順序或以 VHB -VHA 和VLA -VLB 的順序排列。
在本發明的背景下，「交叉雙可變結構域-Ig 樣蛋白」系指包含兩條多肽鏈的蛋白，每條多肽鏈包含透過連接子（L1 、L2 、L3 和L4 ）連接的兩個可變結構域，其中兩個結構域在本發明背景下定義為第一結構域和第二結構域（V1 和V2 ），而另外兩個結構域為抗體衍生重鏈和輕鏈可變結構域（VHA 、VHB ）。在本發明背景下的 CDVD-Ig 形式中，例如，多肽鏈含有組織 V1 -L1 -VHA -L2 -CH1 -CH2 -CH3 和VLA -L3 -V2 -L4 -CL 、V2 -L1 -VHA -L2 -CH1 -CH2 -CH3 和VLA -L3 -V1 -L4 -CL 、VHA -L1 -V1 -L2 -CH1 -CH2 -CH3 和V2 -L3 -VLA -LDVD3 -CL 或VHA -L1 -V2 -L2 -CH1 -CH2 -CH3 和V1 -L3 -VLA -L4 -CL 。在此 CDVD 形式中，連接子（L1 至 L4 ）通常具有不同的長度，包括全甘氨酸連接子以及下文連接子部分中所述的連接子。例如，L1 的長度為3至12個氨基酸殘基、L2 的長度為3至14個氨基酸殘基、L3 的長度為1至8個氨基酸殘基、L4 的長度為1至3個氨基酸殘基，或L1 的長度為5至10個氨基酸殘基、L2 的長度為5至8個氨基酸殘基、L3 的長度為1至5個氨基酸殘基、L4 的長度為1至2個氨基酸殘基，或L1 的長度為7個氨基酸殘基，L2 的長度為5個氨基酸殘基，L3 的長度為1個氨基酸殘基，L4 的長度為2個氨基酸殘基。
本文中「至少一個」系指一個或多個指定物件，例如1、2、3、4、5或6個或更多指定對象。例如，本文中至少一個結合位點系指1、2、3、4、5或6個或更多結合位點。
「與參考序列至少85%相同」的序列系指其全長與參考序列全長具有85%或更高序列同一性，特別是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。
在本申請的背景下，使用整體成對比對法來計算「同一性百分比」（即，比較兩個序列的全長）。比較兩個或更多個序列同一性的方法是本領域所周知的。例如，可使用「針具」程序，其使用 Needleman-Wunsch 整體比對演算法 (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) 以找到兩個序列（考慮其全長）的最佳比對方法（包括間隙）。例如，針具程序可從萬維網上下載，並在以下出版物中進一步描述 (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp.276-277)。根據本發明，兩個多肽之間同一性百分比的計算方法為：EMBOSS:針具（整體）程序，「Gap Open」參數等於 10.0、「Gap Extend」參數等於 0.5、矩陣為 Blosum62。
由與參考序列「至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同」的氨基酸序列組成的蛋白可能包含相對於參考序列的氨基酸突變，例如缺失、插入和/或取代。在發生取代時，由與參考序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列組成的蛋白可能對應於衍生自其他物種的同源序列（不同於參考序列）。
「氨基酸取代」可以是保守的也可以是非保守的。優選情況是，取代為保守取代，其中一個氨基酸被具有相似結構和/或化學性質的另一氨基酸所取代。
在一實施方案中，保守取代可能包括由 Dayhoff 在「The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5」, Natl.Biomedical Research 中所述的取代，其內容透過引用整體併入本文。例如，一方面，屬於以下組之一的氨基酸可彼此交換，因此構成保守交換：第1組：丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、天冬醯胺(N)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；第2組：半胱氨酸(C)、絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)、蘇氨酸(T)；第3組：纈氨酸(V)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)；第4組：賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)；第5組：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、組氨酸(H)；和第6組：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)。一方面，保守氨基酸取代可選自以下取代：T→A、G→A、A→I、T→V、A→M、T→I、A→V、T→G和/或T→S。
在另一實施方案中，保守氨基酸取代可包括用相同類別的另一個氨基酸取代一種氨基酸，例如，(1) 非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；(2) 不帶電的極性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3) 酸性：Asp、Glu；和 (4) 鹼性：Lys、Arg、His。其他保守氨基酸取代也可以按如下進行：(1) 芳香族：Phe、Tyr、His；(2) 質子供體：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；和 (3) 質子受體：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln（參見美國專利號 10,106,805，其內容透過引用整體併入本文）。
在另一實施方案中，保守取代可以根據表1進行。用於預測蛋白質修飾耐受性的方法可參見，如，Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101(25):9205-9210 (2004)，其內容透過引用整體併入。
表 1：保守的氨基酸取代
Figure 02_image001
在另一實施方案中，保守取代可能為表2中「保守取代」標題下所示的取代。如果此類取代導致生物活性改變，則可能引入表2中稱為「代表性取代」的重大改變，並且在需要時篩選產品。
表 2：氨基酸取代
Figure 02_image003
在一些實施方案中，抗原結合蛋白可能包括變體抗原結合蛋白，其中所述變體抗原結合蛋白包括第一多肽鏈（例如 α 鏈）和第二多肽鏈（例如 β 鏈），其與變體所衍生自的抗原結合蛋白相比，包含至多 8、9、10、11、12、13、14、15 個或更多氨基酸取代基，優選為在第一個可變結構域（例如 Vα 結構域）和第二個可變結構域（例如 Vβ 結構域）的 CDR 區中。就這點而言，在抗原結合蛋白的各 CDR 區或第一和/或第二可變結構域的所有 CDR 區中可能有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或更多氨基酸取代基。取代基可在第一和/或第二可變結構域的 CDR 中。
在一實施方案中，變體為功能性變體。
本文所用的術語「功能性變體」系指與親本抗原結合蛋白具有基本或明顯序列同一性或相似性的抗原結合蛋白，例如：含有保守氨基酸取代基的那些抗原結合蛋白，其中所述功能性變體保留了親本抗原結合蛋白的生物學活性。一方面，例如，功能性變體包括本文所述抗原結合蛋白的那些變體（那麼，本文所述的抗原結合蛋白本身稱為親本抗原結合蛋白），其保留與親本抗原結合蛋白相似、相同或更高程度的靶細胞識別能力。相較於親本抗原結合蛋白，例如，功能性變體可以含有一種氨基酸序列，該序列與親本抗原結合蛋白的氨基酸序列至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% 相同。
例如，功能性變體可以包含具有至少一個保守氨基酸取代基的親本抗原結合蛋白的氨基酸序列。可選或另外的情況是，功能性變體可以包含具有至少一個非保守氨基酸取代基的親本抗原結合蛋白的氨基酸序列。在這種情況下，非保守氨基酸取代優選為不干擾或不抑制功能性變體的生物學活性。優選情況是，非保守氨基酸取代可增強功能性變體的生物學活性，從而增加相對於親本抗原結合蛋白的功能性變體生物學活性。
本公開內容的修飾 TCR、多肽和抗原結合蛋白（包括功能性部分和功能性變體）可能具有任何長度，即，可以包含任何數目的氨基酸，但前提是修飾 TCR、多肽或蛋白（或其功能性部分或功能性變體）保留其生物學活性，例如：與抗原特異性結合、檢測宿主中患病細胞或治療或預防宿主中疾病的能力等。
本發明的抗原結合蛋白（包括功能性部分和功能性變體）可以包含替代一種或多種天然氨基酸的合成氨基酸。此類合成氨基酸為本領域所已知的，例如，可以包括氨基環己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高絲氨酸、S-乙醯氨基甲基-半胱氨酸、反式3-和反式4-羥脯氨酸、4-氨基苯基丙氨酸、4-硝基苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-羧基苯基丙氨酸、β-苯基絲氨酸、β-羥基苯丙氨酸、苯甘氨酸、α-萘丙氨酸、環己基丙氨酸、環己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸單醯胺、N'-苄基-N'-甲基賴氨酸、N',N'-二苄基賴氨酸、6-羥基賴氨酸、鳥氨酸、α-氨基環戊烷羧酸、α-氨基環己烷羧酸、α-氨基環庚烷羧酸、α-（2-氨基-2-降冰片烷）-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和 α-叔丁基甘氨酸。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白（包括功能性部分和功能性變體）可以被糖基化、醯胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-醯化、環化（例如，透過二硫鍵）或轉化成酸加成鹽和/或任選地被二聚化或多聚化或共軛。
本公開的抗原結合蛋白可以為合成的、重組的、分離的和/或純化的。
本文的「共價鍵」系指，例如：二硫鍵或透過多肽連接子等連接子或連接子序列連接的肽鍵或共價鍵。
本文所用的術語「連接子」系指一個或多個氨基酸殘基，其插入兩個結構域之間從而為例如單鏈構建體中、本發明抗原結合蛋白的第一可變結構域和第二可變結構域之間和任選地輕鏈和重鏈可變結構域的可變結構域之間的結構域提供充分遷移性，從而正確折疊以形成抗原結合位點，或者在雙特異性抗原結合蛋白的情況下以本發明抗原結合蛋白的交叉配對（以 CODV 形式或某些雙抗體形式）或平行配對形式（例如：以 DVD 形式）形成抗原結合位點和至少一個其他抗原結合位點。
在一些實施方案中，連接子由 0 個氨基酸組成，這表示該連接子不存在。在氨基酸序列水平上，在可變結構域之間或可變結構域與恒定結構域之間的轉換處分別插入連接子。由於已熟知免疫球蛋白結構域以及 TCR 結構域的大致尺寸，因此，可確定結構域之間的轉換。本領域技術人員已知，結構域轉換的精確位置可透過定位不會形成二級結構元件（例如β-折疊或 α-螺旋）的肽延伸段來確定（如透過實驗資料證明），或者可使用建模或二級結構預測技術鑒定或假設。在本發明背景下使用的連接子術語系指但不限於稱為 L1 ,、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 的連接子。
只要不在各自背景下另行指定，連接子（例如 L1 ,、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 ）的長度可以為至少 1 至 30 個氨基酸。在一些實施方案中，連接子（例如 L1 ,、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 ）的長度可以為 2-25、2-20或 3-18 個氨基酸。在一些實施方案中，連接子（例如 L1 ,、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 ）可以為長度不超過 14、13、12、11、10、9、8、7、6或5 個氨基酸的肽。在其他實施方案中，連接子（例如 L1 ,、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 ）的長度可以為 5-25、5-15、4-11、10-20或20-30 個氨基酸。在其他實施方案中，連接子（例如 L1 ,、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 ）的長度可以約為 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30 個氨基酸。在特定實施方案中，連接子（例如 L1 、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 ）長度可能為小於 24、小於 20、小於 16、小於 12、小於 10（例如 5 至 24、10 至 24或5-10）個氨基酸殘基。在一些實施方案中，所述連接子的長度等於 1 個或多個氨基酸殘基，例如：長度大於 1、大於 2、大於 5、大於 10、大於 20 個氨基酸殘基、大於 22 個氨基酸殘基。
示例性連接子（例如 L1 、L2 、L3 、L4 、L5 和L6 ）包含選自氨基酸組的氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸組由 TVAAP (SEQ ID NO: 99)、GGGS (SEQ ID NO:100)、GGGGS (SEQ ID NO:101)、GGSGG (SEQ ID NO:140)、TVLRT (SEQ ID NO:102)、TVSSAS (SEQ ID NO:103)、GGGSGGGG (SEQ ID NO:96)、GGGGSGT (SEQ ID NO:148)、GGSGGGGSGG (SEQ ID NO:141)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104)、GGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO:143)、GGGGSAAA (SEQ ID NO:105)、GGGGSGGGGSGT (SEQ ID NO:155) GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:106)、GGGGSGGGGSGGGGSGT (SEQ ID NO:161)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGT (SEQ ID NO:163)、GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO:144)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGT (SEQ ID NO:165)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGS (SEQ ID NO:107)、GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO:145)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:108)、GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO:146)、GGQGSGGTGSGGQGSGGTGSGGQGS (SEQ ID NO:147)、TVLSSAS (SEQ ID NO:109)和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:110)，特別是 GGGSGGGG (SEQ ID NO:96)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:110)和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:108) 組成。
在本發明背景下使用的術語「Fc 結構域」包含下文進一步定義的天然 Fc 結構域以及 Fc 結構域變體和序列。與 Fc 變體和天然 Fc 分子一樣，術語「Fc 結構域」包括單體或多聚體形式的分子，無論其是從完整抗體中酶切還是透過其他方式產生。
本文所用的術語「天然 Fc 」是指包含由抗體酶切或透過其他方式產生的非抗體結合片段的序列的分子，不論其為單體形式還是多聚體形式，並且可能包含鉸鏈區。天然 Fc 的原始免疫球蛋白來源特別是來源於人，可以為任何免疫球蛋白，優選為 IgG1或IgG2，最優選為 IgG1。天然 Fc 分子由單體多肽組成，而所述單體多肽可透過共價鍵（即，二硫鍵）和非共價鍵締合為二聚體或多聚體形式。天然 Fc 分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵數量為 1-4 個，具體取決於類別（例如：IgG、IgA和IgE）或亞類別（例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2）。天然 Fc 的一個實例為由木瓜蛋白酶酶切 IgG 產生的二硫鍵結合二聚體。本文所用的術語「天然 Fc 」是單體、二聚體和多聚體形式的通稱。天然 Fc 氨基酸序列的一個實例為 SEQ ID NO: 111 的氨基酸序列，其是 IGHG1*01 的天然 Fc 氨基酸序列。
「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「鉸鏈結構域」通常是指位於 CH1 結構域和 CH2 結構域之間重鏈的柔性部分。它長約 25 個氨基酸，分為「上鉸鏈」、「中間鉸鏈」或「核心鉸鏈」和「下鉸鏈」。 「鉸鏈子結構域」是指上鉸鏈、中（或核心）鉸鏈或下鉸鏈。本文中 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 分子鉸鏈的氨基酸序列如下所示： IgG1: E216 PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 114) IgG2: E216 RKCCVECPPCPAPPVAGP (SEQ ID NO: 115) IgG3:ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE216 PKSCDTPPPCPRCPAPELLG (SEQ ID NO: 116) IgG4: E216 SKYGPPCPSCPAPEFLG (SEQ ID NO: 117)。
在本發明背景下，它是指 Fc 結構域中的氨基酸位置，這些氨基酸位置或殘基根據例如 Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969) 中所述的 EU 編號系統來顯示。
本文所用的術語「Fc 變體」是指根據天然 Fc 修飾但仍包含挽救受體 Fc Rn（新生 Fc 受體）結合位點的分子或序列。示例性 Fc 變體及其與挽救受體的相互作用是本領域已知的。因此，術語「Fc 變體」可包含根據非人天然 Fc 人源化的分子或序列。此外，天然 Fc 包含可被移除的區域，因為這些區域提供了本發明抗原結合蛋白不需要的結構特徵或生物學活性。因此，術語「Fc 變體」包含缺少一個或多個天然 Fc 位點或殘基或其中一個或多個 Fc 位點或殘基已被修飾的分子或序列，其影響或涉及：(1) 二硫鍵形成，(2) 與選定宿主細胞不相容，(3) 在選定宿主細胞中表達後具有 N-端異質性，(4) 糖基化，(5) 與補體相互作用，(6) 與挽救受體之外的 Fc 受體結合，或 (7) 抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。
因此，在一實施方案中，Fc 結構域（例如 Fc1 和/或 Fc2 ）包含鉸鏈結構域。在一實施方案中，Fc 結構域為人 IgG Fc 結構域，優選為衍生自人 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，優選為 IgG1或IgG2，更優選為 IgG1。
在一些實施方案中，特別地，當抗原結合蛋白包含兩個 Fc 結構域（即，在下文所述的TCER™ 形式中，例如：Fc1 和Fc2 ）時，所述兩個 Fc 結構域可能具有相同的免疫球蛋白同種型或同種型亞類或不同的免疫球蛋白同種型或同種型亞類，優選為相同。因此，在一些實施方案中，Fc1 和Fc2 為 IgG1 亞類或 IgG2 亞類或 IgG3 亞類或 IgG4 亞類，優選為 IgG1 亞類或 IgG2 亞類，更優選為 IgG1 亞類。
在一些實施方案中，Fc 結構域為變體 Fc 結構域，因而包含下文所述的一個或多個氨基酸取代基。
在一些實施方案中，Fc 結構域包含或進一步包含「RF」和/或「杵臼結構」突變，優選為「杵臼結構」。
「RF突變」通常是指 Fc 結構域的 CH3 結構域中將氨基酸 HY 取代為 RF 的氨基酸取代基，如 CH3 結構域中的氨基酸取代基 H435R和Y436F，如 Jendeberg, L. 等人(1997, J. Immunological Meth., 201:25-34) 一文所述，由於其消除了與蛋白 A 的結合而被描述為有利於純化之目的。在抗原結合蛋白包含兩個 Fc 結構域的情況下，RF 突變可能發生於一個或兩個 Fc 結構域，優選為發生於一個 Fc 結構域。
「杵臼結構」（也稱為「杵臼結構」技術）是指均在 CH3 -CH3 介面中能促進異源多聚體形成的氨基酸取代基 T366S、L368A和Y407V（臼）和 T366W（杵）。透過引入額外半胱氨酸氨基酸取代基 Y349C和S354C，可進一步穩定那些杵臼結構突變。US5731168和US8216805 專利中描述了「杵臼結構」技術以及起穩定作用的半胱氨酸氨基酸取代基。
在本發明背景下，「杵」突變與半胱氨酸氨基酸取代基 S354C 存在於例如包含 SEQ ID NO: 112 氨基酸序列或由其組成的 Fc 結構域中，「臼」突變與半胱氨酸氨基酸取代基 Y349C1 存在於包含 SEQ ID NO: 113 氨基酸序列或由其組成的 Fc 結構域中。
在一些實施方案中，其中一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc1 ）在其 CH3 結構域中包含氨基酸取代基 T366W（杵），而另一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc2 ）在其 CH3 結構域中包含氨基酸取代基 T366S、L368A和Y407V（臼），反之亦然。
在一些實施方案中，其中一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc1 ）在其 CH3 結構域中包含或進一步包含氨基酸取代基 S354C，而另一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc2 ）在其 CH3 結構域中包含或進一步包含氨基酸取代基 Y349C，反之亦然。
因此，在一些實施方案中，其中一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc1 ）在其 CH3 結構域中包含氨基酸取代基 S354C和T366W（杵），而另一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc2 ）在其 CH3 結構域中包含氨基酸取代基 Y349C、T366S、L368A和Y407V（臼），反之亦然。
如 Wei 等人所述，透過納入一個多肽上的氨基酸取代基 K409A 和另一多肽上的 F405K 可以進一步擴展該組氨基酸取代基(Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, Oncotarget.2017)。因此，在一些實施方案中，其中一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc1 ）在其 CH3 結構域中包含或進一步包含氨基酸取代基 K409A，而另一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc2 ）在其 CH3 結構域中包含或進一步包含氨基酸取代基 F405K，反之亦然。
在某些情況下，人工引入的半胱氨酸橋可改善抗原結合蛋白的穩定性，最理想狀況是不干擾抗原結合蛋白的結合特性。此類半胱氨酸橋可進一步改善異二聚化。
在本領域中，例如在 EP 2 970 484 中已描述了進一步的氨基酸取代（例如：帶電對取代），從而改善所得蛋白的異二聚化。
因此，在一些實施方案中，其中一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc1 ）包含或進一步包含帶電對取代基 E356K、E356R、D356R或D356K和D399K或D399R，而另一個多肽的 Fc 結構域（例如 Fc2 ）包含或進一步包含帶電對取代基 R409D、R409E、K409E或K409D和N392D、N392E、K392E或K392D，反之亦然。
在另一實施方案中，一條或兩條（優選為兩條多肽鏈）上的 Fc 結構域可包含一個或多個抑制 Fc γ 受體 (Fc γR) 結合的改變。此類改變可以包括 L234A、L235A。
透過將由鉸鏈、CH2 和CH3 結構域或其部分組成的 Fc 部分納入抗原結合蛋白中，更具體地納入雙特異性抗原結合蛋白中，出現了由 Fc :Fc -γ受體 (Fc gR) 相互作用誘導的這些分子的非特異性固定的問題。FcgR 由不同的細胞表面分子（Fc gRI、Fc gRIIa、Fc gRIIb、Fc gRIII）組成，其與 IgG 分子的 Fc 部分顯示的表位元元具有不同的親和力。由於 i) 對分子的藥代動力學的影響和 ii) 對免疫效應細胞的脫靶激活，這種非特異性（即，不是由雙特異性分子的兩個結合結構域中的任一個誘導）固定是不利的，因此，已確定消融 Fc gR 結合性的各種 Fc 變體和突變。在此背景下，Morgan et al.1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding) 公開了人 IgG1 的殘基233-236與來自人 IgG2 的相應序列交換（即，殘基 233P、234V和235A，其中在第 236 位置不存在氨基酸），導致消除 Fc gRI 結合、消除 C1q 結合並減少 Fc gRIII 結合。EP1075496 公開了具有 Fc 區變異的抗體和其他含 Fc 的分子（例如，233P、234V、235A 中的一個或多個，且在第 236 位置無殘基或 G 以及 327G、330S和331S），其中重組抗體能夠與靶分子結合而不引發顯著的補體依賴性裂解或細胞介導的靶標破壞。
因此，在一些實施方案中，Fc 區包含或進一步包含一種或多種選自 233P、234V、235A、236（無殘基）或 G、327G、330S、331S 組成組中的氨基酸或缺失，優選為 Fc 區包含或進一步包含氨基酸 233P、234V、235A、236（無殘基）或 G 以及選自 327G、330S、331S 組成組中的一個或多個氨基酸，最優選為 Fc 區包含或進一步包含氨基酸 233P、234V、235A、236（無殘基）和 331S。
在另一實施方案中，Fc 結構域包含或進一步包含氨基酸取代基 N297Q、N297G或N297A，優選為 N297Q。
氨基酸取代基「N297Q」、「N297G」或「N297A」是指消除 Fc 結構域內天然 N-糖基化位點的第 297 位置的氨基酸取代基。此氨基酸取代基可進一步阻止 Fc -γ-受體相互作用，並可降低終蛋白產物（即本發明的抗原結合蛋白）的變異性，這是由糖殘基所致，描述參見，例如，Tao, MH and Morrison, SL (J Immunol.1989 Oct 15;143(8):2595-601.) 一文。
在一進一步實施方案中，特別是無輕鏈時，Fc 結構域包含或進一步包含氨基酸取代基 S220C。氨基酸取代「S220C」可刪除形成 CH1 -CL 二硫鍵的半胱氨酸。
在一些實施方案中，Fc 結構域包含或進一步包含至少兩個額外的半胱氨酸殘基，例如：S354C和Y349C或L242C和K334C，其中 S354C 位於一個多肽的 Fc 結構域中（例如：Fc1 ），而 Y349C 位於另一個多肽的 Fc 結構域（例如：Fc2 ），以形成異二聚體和/或其中 L242C和K334C 位於一個或兩個多肽的Fc1 或Fc2 的同一 Fc 結構域中，以形成結構域內 C-C 橋。
當提及多肽（即，本發明的抗原結合蛋白）或核苷酸序列時，「純化的」和「分離的」系指所示的分子在基本上不存在同類型其他生物大分子的情況下存在。本文所用的術語「純化的」特別是指存在至少 75%、85%、95%或98% 重量的相同類型生物大分子。
編碼特定多肽的「分離的」核酸分子系指一種核酸分子，其基本上沒有不編碼目標多肽的其他核酸分子；但是，所述分子可能包括一些額外的鹼基或部分，其不會對組合物的基本特性產生有害影響。
「結構域」可以是任何蛋白質區域，其通常根據序列同源性定義並通常與特定的結構性或功能性實體有關。
「重組」分子是透過重組手段製備、表達、產生或分離的分子。
術語「基因」是指編碼或對應於特定氨基酸序列的 DNA 序列，所述特定氨基酸序列包含一種或多種蛋白質或酶的全部或部分，可能包括也可能不包括調節性 DNA 序列，例如：啟動子序列，其確定例如基因表達的條件。某些不是結構性基因的基因可能由 DNA 轉錄為 RNA，但不會轉譯為氨基酸序列。其他基因可充當結構性基因的調節因子或 DNA 轉錄的調節因子。特別地，術語基因可用於編碼蛋白質的基因組序列，即，包含調節因子、啟動子、內含子和外顯子序列的序列。
「親和力」理論上定義為抗原結合蛋白與抗原之間的平衡結合，在本發明背景下，定義為抗原結合蛋白與其抗原，即，包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列或由其組成且與 MHC蛋白形成複合體的MAGE-A抗原肽之間的平衡結合。例如，親和力可以一半最大有效濃度 (EC50 ) 或平衡解離常數 (KD ) 表示。
「KD 」是抗原結合蛋白與其抗原之間的平衡解離常數，即 koff /kon 之比。KD 和親和力成反比。KD 值與抗原結合蛋白濃度有關，KD 值越低，抗原結合蛋白的親和力越高。親和力（即，KD 值）可透過多種已知方法進行實驗評估，例如：使用表面等離子共振 (SPR) 或生物膜層干涉 (BLI) 技術測量締合和解離速率，下文「抗原結合蛋白」章節做更詳細的描述。
「一半最大有效濃度」，也稱為「EC50 」，通常是指在指定的暴露時間之後誘導介於基線和最大值中間的反應的分子濃度。EC50 和親和力成反比，EC50 值越低，分子的親和力越高。在一實施例中，「EC50 」是指本發明的抗原結合蛋白濃度，其在指定的暴露時間之後誘導介於基線和最大值中間的反應，更具體地，是指在指定的暴露時間之後誘導介於基線和最大值中間的反應的本發明的抗原結合蛋白濃度。EC50 值可透過多種已知方法進行實驗評估，例如：使用 IFN-γ 釋放測定法或 LDH 釋放測定法，如下文「抗原結合蛋白」章節做更詳細的描述。
「CD3」是一種蛋白質複合體，由四條不同的鏈組成。在哺乳動物中，複合體包含一條 CD3γ 鏈、一條 CD3δ 鏈和兩條 CD3ε 鏈。這些鏈與稱為 T細胞受體 (TCR) 的分子和 ζ 鏈締合，以在 T 淋巴細胞中產生激活信號。
「CD28」也在 T細胞上表達，可提供T細胞激活所需的共刺激信號。CD28 在 T細胞增生和存活、細胞因子產生以及 2 型 T 輔助細胞發育中發揮重要作用。
「CD134」也稱為 OX40。CD134/OX40 在激活後 24 至 72 小時後表達，可用於定義次級共刺激分子。
「4-1BB」能夠與抗原提呈細胞 (APC) 上的 4-1BB-配體結合，從而產生 T細胞的共刺激信號。
「CD5」是主要在 T細胞上發現的受體的另一實例，在 B 細胞上也發現低水平 CD5。
「CD95」是修飾 T細胞功能的受體的另一實例，也稱為 Fas 受體，其透過在其他細胞表面上表達的 Fas-配體介導凋亡信號傳導。據報告，CD95 可調節靜息 T 淋巴細胞中 TCR/CD3 驅動信號傳導通路。
「NK 細胞特異性受體分子」為，例如，CD16（一種低親和力 Fc 受體）和 NKG2D。
存在於 T細胞和自然殺傷 (NK) 細胞表面上的受體分子的一個實例為 CD2和CD2 超家族的其他成員。CD2 能夠充當 T細胞和 NK 細胞上的共刺激分子。
本發明背景下上文 (ii) 中提及的「跨膜區」可以為，例如，TCR α或β 跨膜結構域。
「胞質信號傳導區」可以為，例如，TCR α或β 細胞內結構域。
本文中的「診斷劑」系指可檢測的分子或物質，例如：螢光分子、放射性分子或本領域已知的（直接或間接）提供信號的任何其他標記物。
本領域已知的「螢光分子」包括異硫氰酸螢光素 (FITC)，藻紅蛋白 (PE)，用於藍色鐳射的螢光團（例如，PerCP、PE-Cy7、PE-Cy5、FL3和APC或Cy5、FL4），用於紅色、紫色或紫外鐳射的螢光團（例如，太平洋藍、太平洋橙）。
「放射性分子」包括但不限於用於閃爍顯像檢查的放射性原子，例如： I123 、I124 、In111 、Re186 、Re188 、Tc99 。本發明的抗原結合蛋白可能還包含用於核磁共振 (NMR) 成像（也稱為磁共振成像，MRI）的自旋標記物，例如：碘-123、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
此類診斷劑可能與抗原結合蛋白直接偶聯（即，物理連接），也可間接連接。
本文中的「治療劑」系指具有治療作用的藥物。在一實施方案中，此類治療劑可為生長抑制劑，例如：細胞毒性劑或放射性同位素。
可無差別使用的「生長抑制劑」或「抗增生劑」系指在體外或體內抑制細胞（特別是腫瘤細胞）生長的化合物或組合物。
本文所用的術語「細胞毒性劑」系指抑制或妨礙細胞功能和/或導致細胞破壞的物質。術語「細胞毒性劑」意圖包括化學治療劑、酶、抗生素和毒素（例如：細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體）以及下文公開的各種抗腫瘤劑或抗癌藥。在一些實施方案中，細胞毒性劑為紫杉醇、長春蔓、紫杉烷、美登木素或美登木素類似物（例如，DM1或DM4）、小分子藥物、妥美黴素或吡咯苯二氮卓衍生物、隱藻素衍生物、瘦黴素衍生物、奧瑞他汀或海兔毒素類似物、前藥、拓撲異構酶 II 抑制劑、DNA 烷基化劑、抗微管蛋白劑、CC-1065或CC-1065 類似物。
術語「放射性同位素」意圖包括適合於治療癌症的放射性同位素，例如：At211 、Bi212 、Er169 、I131 、I125 、Y90 、In111 、P32 、Re186 、Re188 、Sm153 、Sr89 以及 Lu 的放射性同位素。此類放射性同位素通常主要發射 β 射線。在一實施方案中，放射性同位素為 α 發射體同位素，更確切地說為發射 α 輻射線的釷 227。
本文的「PK 修飾部分」系指修飾本發明抗原結合蛋白藥代動力學 (PK) 的部分。因此，所述部分特別修飾本發明抗原結合蛋白的體內半衰期和分佈。在一優選實施方案中，PK 修飾部分增加抗原結合蛋白的半衰期。PK 修飾部分的實例包括但不限於 PEG (Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci.Oct 28;16(10):25831-64 and Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28)、PAS 化 (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel.Aug;26(8):489-501)、白蛋白 (Dennis et al., (2002) J Biol Chem.Sep 20;277(38):35035-43)、抗體和/或非結構化多肽的 Fc 部分 (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol.Dec; 27(12):1186-90)。
「半衰期 (T1/2 )」通常系指積貯在活生物體中的半數藥物或其他物質透過正常生物過程被代謝或排除所需的時間。因此，在本發明背景中，半衰期系指在例如小鼠中排除半數本發明抗原結合蛋白所需的時間。半衰期可以透過本領域熟知的方法測定。在一實施例中，半衰期如實施例 10 中所詳細描述的測定。因此，在一實施例中，透過以下方法來測定半衰期：給予（例如，透過靜脈內給予）例如小鼠（例如，超免疫缺陷 NOG 小鼠）本發明的抗原結合蛋白，然後在不同時間點（例如，0 h、0.1 h、2 h、8 h、24 h、48 h、120 h、240 h和360 h 的時間點）從例如眼球後叢中收集血漿樣本。然後透過本領域已知的技術（例如 ELISA）、使用不同的設置（例如 Fc - VL 測定法和 CD3 - pMHC 測定法）來測定抗原結合蛋白的血漿水準。通常透過從相應的標準曲線插補來獲得樣本的血漿濃度，然後通常透過不同時間點所獲得的血漿水準的線性回歸來確定半衰期。
抗原結合蛋白
使用 WO 2017/158103 所公開的 TCR R7P1D5 作為起點，本發明人設計、生產和檢測了 TCR 可變 α (Vα) 和可選的可變 β (Vβ) 結構域變體，其為使用酵母篩選測定法的單鏈 (scTCR) 形式（如本文實施例 1和2 中所述）或為進一步優化可溶性雙特異性 scTCR 構建體的結合親和力以及產率和穩定性的單鏈雙特異性 TCR 構建體（如本文實施例 4 中所述）。用這種方法，發明人鑒定出可變 α 結構域以及任選的 β 結構域的不同變體，更特別地，可變 α 結構域的 CDRa3（含 5 個變體）的不同變體，其可有利地與親本 TCR 的 CDRa1、CDRa2、CDRb1、CDRb2 和/或 CDRb3 組合，或與針對 CDRa1（1 個變體）、CDRa2（3 個變體）、CDRb1（1 個變體）、CDRb2（5 個變體）和/或 CDRb3（1 個變體）發現的任何 CDR 變體組合，這些變體具有的優勢是讓本發明的抗原結合蛋白以高親和力且亦以高特異性與靶標（即 MAGE-A抗原肽，其包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列且與 MHC蛋白形成複合體，優選為與 HLA-A*02形成複合體）結合。
發明人在各實施例中證明：CDR 可用於 ACT 的 TCR、單鏈 TCR 構建體以及其他雙特異性形式，因而在原理上證明了所鑒定的 CDR 變體可用於產生不同抗原結合蛋白，這些蛋白對 MAGE-A抗原肽（其包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列且與 MHC蛋白形成複合體，優選為與 HLA-A*02 形成複合體）具有高親和力且亦具有高特異性。
此外，發明人發現：使 TCR 可變 α (Vα) 和可變 β (Vβ) 結構域的框架發生突變可改善可溶性雙特異性scTCR 構建體的結合特異性以及產率和穩定性，如本文實施例 4 中所述。
在實施例 5-8 中，發明人設計、表達並成功檢測了例如，TCER™ 形式的抗原結合蛋白抗腫瘤細胞系的體外和體內療效，所述抗原結合蛋白與人 TCR-CD3 複合體特異性結合以及與包含結合於 MHC I 類分子（例如HLA-A*02:01）的 SEQ ID NO: 1 的 MAGE-A 肽的肽：MHC 複合體特異性結合。為了靶向作用於 TCR-CD3 複合體，修飾了衍生自 CD3 特異性人源化抗體 hUCHT1 的 VH 和VL 結構域，如 Zhu et al. (J Immunol, 1995, 155, 1903-1910) 所述，或衍生自 α/β TCR 特異性抗體 BMA031 的 VH 和VL 結構域，如 Shearman et al.(J Immunol, 1991, 147, 4366-73) 所述，並用於那些實施例中。為了靶向作用於 MAGE-A:MHC 複合體，可利用包含本文所公開 CDR 的 Vα和Vβ 結構域，從而形成穩定性和親和力成熟的抗原結合蛋白。相同的 VL 和VH 、Vα和Vβ 結構域進一步用於人單鏈 T細胞受體形式，其進一步包含 Fab 結構域（包含 CH1 -鉸鏈和 CL ），如實施例 4 中所述。
因此，本發明涉及與 MAGE-A抗原肽特異性結合的抗原結合蛋白，所述 MAGE-A抗原肽包含SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成，其中所述抗原肽與 MHC蛋白形成複合體，所述抗原結合蛋白包含： (a)      包含第一可變結構域的第一條多肽鏈，所述第一可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中： -                   CDRa1 包含氨基酸序列「X1 SSSTY」SEQ ID NO:72 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 D或E，更優選為 E，或與 SEQ ID NO: 72 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基）， -                  CDRa2 包含氨基酸序列「IX1 SX2 X3 DX4 」SEQ ID NO: 73 或由其組成，其中 X1 至 X4 為任何氨基酸，並且其中優選為 X1 為 F或Y，更優選為 Y，X2 為 N或S，優選為 S，X3 為 Q或M，優選為 Q，X4 為 M、V、S或Q，優選為 S或Q，更優選為 Q。 -                  CDRa3 包含氨基酸序列「CAEX1 X2 SX3 SKIIF」SEQ ID NO:77 或由其組成，其中 X1 至 X3 為任何氨基酸，並且其中優選為 X1 為 A、F或M，更優選為 M，優選為 X2 為 S、T或N，更優選為 T，優選為 X3 為 E或A，優選為 E，前提是：如果 CDRa1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 5 或由其組成並且CDRa2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 6 或由其組成，則 CDRa3 不包含「CAEYSSASKIIF」 (SEQ ID NO: 7) 也不是由其組成，優選前提是：CDRa3 不包含「CAEYSSASKIIF」 (SEQ ID NO: 7) 也不是由其組成，或 -                  CDRa3 包含氨基酸序列「CAEX1 X2 SX3 SKIIF」SEQ ID NO: 77 或由其組成，其中 X1 至 X3 為任何氨基酸，優選為 X1 為 F、M或A，優選為 M，優選為 X2 為 S、T或N，更優選為 T，優選為 X3 為 E或A，優選為 E，以及 (b)     包含第二可變結構域的第二條多肽鏈，所述第二可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中： -                  CDRb1 包含氨基酸序列「X1 GHDY」SEQ ID NO:78 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 S或P，更優選為 P，或與 SEQ ID NO: 78 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基）， -                  CDRb2 包含氨基酸序列「FX1 X2 X3 X4 P」SEQ ID NO: 79 或由其組成，其中 X1 至 X4 為任何氨基酸，優選為 X1 為 C或N，更優選為 C，優選為X2 為 Y或N，更優選為 Y，優選為 X3 為 G或N，更優選為 G，優選為X4 為 H、V、T、A或M，優選為 H或T，最優選為 T，其中當優選為 X1 為 C 時，FR3-b 氨基酸序列在氨基酸第 66 位置處包含氨基酸 66C，和 -                  CDRb3 包含氨基酸序列「CASRAX1 TGELFF」SEQ ID NO: 82 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 D或N，更優選為 D，或與 SEQ ID NO: 82 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基）。
在一特別的優選方案中，本發明涉及與 MAGE-A抗原肽特異性結合的抗原結合蛋白，所述 MAGE-A抗原肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成，其中所述抗原肽與 MHC蛋白形成複合體，所述抗原結合蛋白包含： a)       包含第一可變結構域的第一條多肽鏈，所述第一可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中： -                  CDRa1 包含氨基酸序列「X1 SSSTY」SEQ ID NO:72 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 D或E，更優選為 E，或與 SEQ ID NO: 72 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基）， -                  CDRa2 包含氨基酸序列「IYSSQDX1 」SEQ ID NO: 74 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 Q、V或S，優選 Q， -                  CDRa3 包含氨基酸序列「CAEMTSESKIIF」SEQ ID NO:35 或由其組成，或與 SEQ ID NO: 35 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個、三或四個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基），以及 (b)     包含第二可變結構域的第二條多肽鏈，所述第二可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中： -                  CDRb1 包含氨基酸序列「X1 GHDY」SEQ ID NO:78 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 S或P，更優選為 P，或與 SEQ ID NO: 78 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基）， -                  CDRb2 包含氨基酸序列「FCYGX1 P」SEQ ID NO:81 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 H、V、A或T，優選 T，或與 SEQ ID NO: 81 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基，更優選為一個氨基酸取代基，並且其中當優選為 CDRb2 包含氨基酸序列「FCYGX1 P」SEQ ID NO: 81 或由其組成時，FR3-b 氨基酸序列在氨基酸第 66 位置處包含氨基酸 66C， -                  CDRb3 包含氨基酸序列「CASRAX1 TGELFF」SEQ ID NO:82 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，優選為 D或N，更優選為 D，或與 SEQ ID NO: 82 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個、三個或四個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基）。
如上所述，在一些實施方案中，CDRb2 氨基酸序列在第 57 位置處包含氨基酸 57C，此氨基酸優選與優選在 FR3b 氨基酸序列第 66 位置處存在的半胱氨酸一起形成二硫鍵。因此，在優選實施方案中，當 CDRb2 氨基酸序列在第 57 位置處包含氨基酸 57C 時，則 FR3-b 氨基酸序列優選為在氨基酸第 66 位置處包含氨基酸 66C，反之亦然。因此，在一些實施方案中，FR3b 氨基酸序列優選為在此第 66 位置處包含氨基酸取代基，因此，在一些相關實施方案中，FR3b 氨基酸序列包含氨基酸取代基 I66C。
在一些實施方案中，本發明背景下的 CDRa1 包含 SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 55 的氨基酸序列或由其組成。
在一實施方案中，本發明背景下的 CDRa2 包含以下氨基酸序列或由其組成： 「IYSSQDX1 」SEQ ID NO: 74，其中，X1 為任何氨基酸，優選為 Q、V或S，更優選為 Q，或 SEQ ID NO: 6，或與 SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 6 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，例如，一個、兩個或三個氨基酸取代基，更優選為一個氨基酸取代基，優選 CDRa2 包含氨基酸序列「IYSSQDX1 」SEQ ID NO:74 或由其組成，其中，X1 為任何氨基酸，優選為 Q、V或S，更優選為 Q，或與 SEQ ID NO: 74 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，例如，一個、兩個或三個氨基酸取代基，更優選為一個氨基酸取代基。
在一些實施方案中，本發明背景下的 CDRa2 包含氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸序列選自由氨基酸序列 SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 56、57和59，優選為 SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 56 組成的組。
在一些實施方案中，CDRa3 包含氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸序列選自由氨基酸序列 SEQ ID NO: 35、36、37、38、39 優選為 SEQ ID NO: 35 組成的組。
在一些實施方案中， CDRb1 包含 SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 62 的氨基酸序列或由其組成。
在一些實施方案中，CDRb2 包含以下氨基酸序列或由其組成： - 「FNNNVP」SEQ ID NO:13 或 - 「FCYGX1 P」SEQ ID NO: 81，其中，X1 為任何氨基酸，優選為 H、V、A或T，更優選為 T，並且其中優選情況為：當CDRb2 包含氨基酸序列「FCYGX1 P」SEQ ID NO: 81 或由其組成時，FR3-b 氨基酸序列在氨基酸第 66 位置處包含氨基酸 66C，或 與 SEQ ID NO: 13或81 不同的氨基酸序列，不同點為：有至少一個氨基酸取代基，例如：一個、兩個或三個氨基酸取代基，更優選為一個氨基酸取代基。
在一些實施方案中，本發明背景下的 CDRb2 包含氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸序列選自由氨基酸序列 SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 63、64、65、66和70 ，優選為 SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 65 組成的組，並且其中優選情況是：當 CDRb2 包含氨基酸序列SEQ ID NO: 63、64、65、66或70 或由其組成時，FR3-b 氨基酸序列優選為在氨基酸第 66 位置處包含氨基酸 66C。
在一實施方案中，本發明背景下的 CDRb3 包含 SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 71 的氨基酸序列或由其組成。
在一特定實施方案中，本發明的抗原結合蛋白包含 (a)  包含第一可變結構域的第一條多肽鏈，所述第一可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中： - CDRa1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 5 或由其組成， - CDRa2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 6 或由其組成，和 - CDRa3 包含氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸序列選自由氨基酸序列 SEQ ID NO: 35、36、37、38、39，優選為 SEQ ID NO:35、36、37、38，更優選為 SEQ ID NO:35和38（例如 SEQ ID NO: 35）組成的組，並且其中 (b)     包含第二可變結構域的第二條多肽鏈，所述第二可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中： - CDRb1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 或由其組成， - CDRb2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 或由其組成，和 -  CDRb3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 14 或由其組成。
在一特定實施方案中，抗原結合蛋白包含 (a)  包含第一可變結構域的第一條多肽鏈，所述第一可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中： -  CDRa1 包含 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:55，優選為 SEQ ID NO:55 的氨基酸序列或由其組成， - CDRa2 包含氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸序列選自由氨基酸序列 SEQ ID NO:56、57和59，優選為 SEQ ID NO:56和59，更優選為 SEQ ID NO: 56 組成的組， - CDRa3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 35 或由其組成， (b)  包含第二可變結構域的第二條多肽鏈，所述第二可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中： -  CDRb1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 62 或由其組成， -  CDRb2 包含氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸序列選自由氨基酸序列 SEQ ID NO: 63、64、65、66和70，優選為 SEQ ID NO: 65 組成的組，並且其中優選情況是：當 CDRb2 包含氨基酸序列SEQ ID NO: 63、64、65、66或70 或由其組成時，FR3-b 氨基酸序列優選為在氨基酸第 66 位置處包含氨基酸 66C，和 - CDRb3 包含 SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:71，優選為 SEQ ID NO:71 的氨基酸序列或由其組成。
本發明進一步涉及抗原結合蛋白，其包含本發明背景下公開所公開 CDR 氨基酸序列的變體，通常為 CDRa1、CDRa2、CDRa3、CDRb1、CDRb2 和/或 CDRb3 的變體，此類變體可能至少包含一個，例如四個、三個、兩個或一個，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，其中優選的氨基酸取代基數量優選的取決於各 CDR 的長度。
因此，在一些實施方案中，CDRa1 包含與本文所公開 CDRa1 氨基酸序列不同的氨基酸序列或由其組成，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基或僅一個氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基優選為在氨基酸第 28、29、36、37和38 位置中的任何一處，更優選為第 28 位置處。
在一些實施方案中，CDRa2 包含與本文所公開 CDRa2 氨基酸序列不同的氨基酸序列或由其組成，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基或僅一個氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基優選為在氨基酸第 56 或65 位置處，更優選為第 65 位置處。
在一些實施方案中，CDRa3 包含與本文所公開 CDRa3 氨基酸序列不同的氨基酸序列或由其組成，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個、三個或四個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基或僅一個氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基優選為在氨基酸第 105、106、107、108、109、113、114、115、116和117位置中的任何一處。
在一些實施方案中，CDRb1 包含與本文所公開 CDRb1 氨基酸序列不同的氨基酸序列或由其組成，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基（例如一個氨基酸取代基），其中所述氨基酸取代基優選為在氨基酸第27、28、29、37和38 位置中的任何一處，更優選為第 27和38位置處。
在一些實施方案中，CDRb2 包含與本文所公開 CDRb2 氨基酸序列不同的氨基酸序列或由其組成，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個或三個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基或僅一個氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基優選為在氨基酸第 56 位置處。
在一些實施方案中，CDRb3 包含與本文所公開 CDRb3 氨基酸序列不同的氨基酸序列或由其組成，不同點為：至少有一個氨基酸取代基，優選為一個、兩個、三個或四個氨基酸取代基，優選為一個或兩個氨基酸取代基或僅一個氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基優選為在氨基酸第 105、106、107、108、109、113、114、115、116、117位置中的任何一處。
上文所指的氨基酸取代基的定義見上文「定義」章節，優選為氨基酸取代基為保守氨基酸取代基。如本領域技術人員所瞭解的一樣，包含本文定義 CDR 氨基酸序列的第一可變結構域和包含本文定義 CDR 氨基酸序列的第二可變結構域一起形成抗原結合位點，其中所述抗原結合位點與 MAGE-A抗原肽結合，所述抗原肽包含 SEQ ID NO: 1 氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成且與 MHC蛋白形成複合體。
三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3 衍生自 TCR 的可變 α 結構域，因此，如本領域技術人員所瞭解的一樣，在一些實施方案中，第一可變結構域也可指可變 α 結構域。類似地，三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3 衍生自所述 TCR 的可變 β 結構域。因此，如本領域技術人員進一步瞭解的一樣，第二可變結構域也可指可變 β 結構域。更特別地，包含本發明背景下定義的 α 可變框架氨基酸序列和 α 可變 CDR（例如序列 (FR1-a)-(CDRa1)-(FR2-a)- (CDRa2)-(FR3-a)-(CDRa3)-(FR4-a)）的第一可變結構域可稱為可變 α 結構域和/或包含本發明背景下定義的 β 可變框架氨基酸序列和 β 可變 CDR（例如序列 (FR1-b)-(CDRb1)-(FR2-b)-(CDRb2)-(FR3-b)-(CDRb3)-(FR4-b)）的第二可變結構域可稱為可變 β 結構域。
在一些實施方案中，CDR 可在抗體框架序列中進行移植。因此，在一實施例中，在第一可變結構域背景下定義的 CDR 可在輕鏈可變結構域中進行移植，所述第一可變結構域因此包含序列 (FR1-L)-(CDRa1)-(FR2-L)-(CDRa2)-(FR3-L)-(CDRa3)-(FR4-L) 或由其組成，並可稱為輕鏈可變結構域。在同一實施例中，在第二可變結構域背景下定義的 CDR 可在重鏈可變結構域中進行移植，所述第二可變結構域因此包含序列 (FR1-H)-(CDRb1)-(FR2-H)-(CDRb2)-(FR3-H)-(CDRb3)-(FR4-H) 或由其組成，並可稱為重鏈可變結構域。但是，本領域技術人員也會瞭解，在第一可變結構域背景下定義的 CDR 也可在重鏈可變結構域中移植，並且在第二可變結構域背景下定義的 CDR 也可在輕鏈可變結構域中移植，以上考慮經適當修改後適用。
在本發明的背景下，本發明抗原結合蛋白的 CDR 與天然和親本 TCR R7P1D5 的 CDR 不同，如 WO 2017/158103 中公開內容所述，至少在所述親本 TCR R7P1D5 的 CDRa3 的氨基酸序列中不同。如本領域技術人員所瞭解的，上文所定義的 CDRa3 不包含氨基酸序列「CAEYSSASKIIF」(SEQ ID NO: 7) 也不由其組成，其是親本 TCR R7P1D5 的 CDRa3。
在一實施方案中，本文在本發明抗原結合蛋白背景下所定義的第一可變結構域和第二可變結構域根據 IMGT 編號在第 44 位置處可能包含氨基酸取代基。在一優選實施方案中，第 44 位置處的所述氨基酸被另一種合適氨基酸取代，以改善配對。在特定的實施方案中，優選為其中所述抗原結合蛋白為 TCR 的實施方案中，所述氨基酸取代改善例如鏈的配對（即 α和β 鏈的配對或 γ和δ 的配對），在一優選實施方案中，第一可變結構域第 44 位置處 (v1 44) 以及第二可變結構域第 44 位置處 (v2 44) 存在的一個或兩個氨基酸被取代為選自由 v1 44D/v2 44R、v1 44R/v2 44D、v1 44E/v2 44K、v1 44K/v2 44E、v1 44D/v2 44K、v1 44K/v2 44D、v1 44R/v2 44E; v1 44E/v2 44R、v1 44L/v2 44W、v1 44W/v2 44L、v1 44V/v2 44W、v1 44W/v2 44V 組成的氨基酸對組的氨基酸對 v1 44/v2 44。
因此，在另一實施方案中，抗原結合蛋白可進一步包括選自由以下組成組的優選取代對之一 (v1 44/v2 44)：v1 Q44D/v2 Q44R；v1 Q44R/v2 Q44D；v1 Q44E/v2 Q44K；v1 Q44K/v2 Q44E；v1 Q44D/v2 Q44K；v1 Q44K/v2 Q44D；v1 Q44E/v2 Q44R；v1 Q44R/v2 Q44E；v1 Q44L/v2 Q44W；v1 Q44W/v2 Q44L；v1 Q44V/v2 Q44W；和 v1 Q44W/v2 Q44V；v1 W44D/v2 Q44R；v1 W44R/v2 Q44D；v1 W44E/v2 Q44K；v1 W44K/v2 Q44E；v1 W44D/v2 Q44K；v1 W44K/v2 Q44D；v1 W44E/v2 Q44R；v1 W44R/v2 Q44E；v1 W44L/v2 Q44W；v1 W44/v2 Q44L；v1 W44V/v2 Q44W；和 v1 W44/v2 Q44V；v1 H44D/v2 Q44R；v1 H44R/v2 Q44D；v1 H44E/v2 Q44K；v1 H44K/v2 Q44E；v1 H44D/v2 Q44K；v1 H44K/v2 Q44D；v1 H44E/v2 Q44R；v1 H44R/v2 Q44E；v1 H44L/v2 Q44W；v1 H44W/v2 Q44L；v1 H44V/v2 Q44W；和 v1 H44W/v2 Q44V；v1 K44D/v2 Q44R；v1 K44R/v2 Q44D；v1 K44E/v2 Q44K；v1 K44/v2 Q44E；v1 K44D/v2 Q44K；v1 K44/v2 Q44D；v1 K44E/v2 Q44R；v1 K44R/v2 Q44E；v1 K44L/v2 Q44W；v1 K44W/v2 Q44L；v1 K44V/v2 Q44W；和 v1 K44W/v2 Q44V；v1 E44D/v2 Q44R；v1 E44R/v2 Q44D；v1 E44/v2 Q44K；v1 E44K/v2 Q44E；v1 E44D/v2 Q44K；v1 E44K/v2 Q44D；v1 E44/v2 Q44R；v1 E44R/v2 Q44E；v1 E44L/v2 Q44W；v1 E44W/v2 Q44L；v1 E44V/v2 Q44W；和 v1 E44W/v2 Q44V；v1 Q44D/v2 R44；v1 Q44R/v2 R44D；v1 Q44E/v2 R44K；v1 Q44K/v2 R44E；v1 Q44D/v2 R44K；v1 Q44K/v2 R44D；v1 Q44E/v2 R44；v1 Q44R/v2 R44E；v1 Q44L/v2 R44W；v1 Q44W/v2 R44L；v1 Q44V/v2 R44W；和 v1 Q44W/v2 R44V；v1 W44D/v2 R44；v1 W44R/v2 R44D；v1 W44E/v2 R44K；v1 W44K/v2 R44E；v1 W44D/v2 R44K；v1 W44K/v2 R44D；v1 W44E/v2 R44；v1 W44R/v2 R44E；v1 W44L/v2 R44W；v1 W44/v2 R44L；v1 W44V/v2 R44W；和 v1 W44/v2 R44V；v1 H44D/v2 R44；v1 H44R/v2 R44D；v1 H44E/v2 R44K；v1 H44K/v2 R44E；v1 H44D/v2 R44K；v1 H44K/v2 R44D；v1 H44E/v2 R44；v1 H44R/v2 R44E；v1 H44L/v2 R44W；v1 H44W/v2 R44L；v1 H44V/v2 R44W；和 v1 H44W/v2 R44V；v1 K44D/v2 R44；v1 K44R/v2 R44D；v1 K44E/v2 R44K；v1 K44/v2 R44E；v1 K44D/v2 R44K；v1 K44/v2 R44D；v1 K44E/v2 R44；v1 K44R/v2 R44E；v1 K44L/v2 R44W；v1 K44W/v2 R44L；v1 K44V/v2 R44W；和 v1 K44W/v2 R44V；v1 E44D/v2 R44；v1 E44R/v2 R44D；v1 E44/v2 R44K；v1 E44K/v2 R44E；v1 E44D/v2 R44K；v1 E44K/v2 R44D；v1 E44R/v2 R44E；v1 E44L/v2 R44W；v1 E44W/v2 R44L；v1 E44V/v2 R44W；和 v1 E44W/v2 R44V；v1 Q44D/v2 K44R；v1 Q44R/v2 K44D；v1 Q44E/v2 44K；v1 Q44K/v2 K44E；v1 Q44D/v2 44K；v1 Q44K/v2 K44D；v1 Q44E/v2 K44R；v1 Q44R/v2 K44E；v1 Q44L/v2 K44W；v1 Q44W/v2 K44L；v1 Q44V/v2 K44W；和 v1 Q44W/v2 K44V；v1 W44D/v2 K44R；v1 W44R/v2 K44D；v1 W44E/v2 44K；v1 W44K/v2 K44E；v1 W44D/v2 44K；v1 W44K/v2 K44D；v1 W44E/v2 K44R；v1 W44R/v2 K44E；v1 W44L/v2 K44W；v1 W44/v2 K44L；v1 W44V/v2 K44W；和 v1 W44/v2 K44V；v1 H44D/v2 K44R；v1 H44R/v2 K44D；v1 H44E/v2 44K；v1 H44K/v2 K44E；v1 H44D/v2 44K；v1 H44K/v2 K44D；v1 H44E/v2 K44R；v1 H44R/v2 K44E；v1 H44L/v2 K44W；v1 H44W/v2 K44L；v1 H44V/v2 K44W；和 v1 H44W/v2 K44V；v1 K44D/v2 K44R；v1 K44R/v2 K44D；v1 K44E/v2 44K；v1 K44/v2 K44E；v1 K44D/v2 44K；v1 K44/v2 K44D；v1 K44E/v2 K44R；v1 K44R/v2 K44E；v1 K44L/v2 K44W；v1 K44W/v2 K44L；v1 K44V/v2 K44W；和 v1 K44W/v2 K44V；v1 E44D/v2 K44R；v1 E44R/v2 K44D；v1 E44/v2 44K；v1 E44K/v2 K44E；v1 E44D/v2 44K；v1 E44K/v2 K44D；v1 E44/v2 K44R；v1 E44R/v2 K44E；v1 E44L/v2 K44W；v1 E44W/v2 K44L；v1 E44V/v2 K44W；和 v1 E44W/v2 Q44V。
在上面的內容中，例如「v1 Q44R/v2 Q44D」是指：在第一可變結構域中，Q44 被 R 取代，而在第二可變結構域中，Q44 被 D 取代。其他取代和描述可參見美國專利申請號 2018-0162922。
本發明的發明人證明，從 TCR α和β 可變結構域最初獲得的 CDR 可用於與天然 TCR 具有不同形式的抗原結合蛋白中。例如，在實驗章節中，發明人使用了 TCER™ 形式的 TCR α和β 可變結構域的 CDR，詳細描述見下文並如實施例（即，實施例6）所示。
此外，發明人在單鏈 TCR 構建體中使用了本發明背景下所定義的 CDR，例如：包含scTCR 的雙特異性 TCR，或包含具有 VH (CD3)-CH1 -Vα-Lz -Vβ 的第一個多肽和具有 VL (CD3)-CL 的第二個多肽的 Fab 穩定化 scTCR，其中，VH (CD3)、VL (CD3)、Vα和Vβ 如上定義，Lz 為由 SEQ ID NO:108 的氨基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 組成的連接子，CH1 為重鏈的恒定結構域，CL 是輕鏈的恒定區（實施例 4）。
因此，本領域技術人員根據這些實驗可瞭解，作為原理證明，本文在本發明背景下定義的 CDR 可用於本發明的不同抗原結合蛋白，並以本文公開的不同形式使用。本領域技術人員進一步瞭解，當本發明抗原結合蛋白形式改變時，在一種抗原結合形式的背景下證明的抗原結合蛋白的結合特徵優選為至少是保守的（即，至少第一和第二可變結構域的 CDR 氨基酸序列，優選為第一和第二可變結構域的氨基酸相同）。
如上所述，抗體框架中可能提供本發明背景下的 CDR 結合功能。例如，本發明背景下定義的 CDR 氨基酸序列，可能包括額外的 3 個、2 個或 1 個 N 和/或 C 端框架殘基，可以直接移植到抗體可變重/輕鏈序列中。更特別地，本發明背景下定義的 CDRa1、CDRa2和CDRa3 結構域可移植到可變重鏈氨基酸序列中，並且本發明背景下定義的 CDRb1、CDRb2和CDRb3 可移植到可變輕鏈氨基酸序列中，反之亦然。
還瞭解的是，在一些實施方案中，在抗體內，抗體的可變輕鏈結構域可被本發明背景下定義的第一可變結構域替代，而可變重鏈結構域可被本發明背景下定義的第二可變結構域替代，反之亦然。
但是，在一優選實施方案中，抗原結合蛋白進一步包含 α 框架區和 β 框架區。
在一實施方案中，所述第一可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 組成組的框架區，優選為 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a，其中 - FR1-a 包含「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYT」SEQ ID NO:83 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 83 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -  FR2-a 包含「LYWYKQEPGAGLQLLTY」SEQ ID NO:84 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 84 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， - FR3-a 包含「KQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYF」SEQ ID NO:85 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 85 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， - FR4-a 包含「GSGTRLSIRP」SEQ ID NO:86 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 86 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，和 所述第二可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 組成組的框架區，優選為 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b，其中 - FR1-b 包含「DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPI」SEQ ID NO:87 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 87 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， - FR2-b 包含「LFWYRQTMMRGLELLIY」SEQ ID NO:88 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 88 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， - FR3-b 包含「IDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF」SEQ ID NO:89 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 89 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，或 - FR4-b 包含「GEGSRLTVL」SEQ ID NO:90 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 90 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成。
在一實施方案中，所述第一可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 組成組的框架區，優選為 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a，其中 - FR1-a 包含「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYT」SEQ ID NO:83 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 83 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成； -  FR2-a 包含「LYWYKQEPGAGLQLLTY」SEQ ID NO:84 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 84 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成， - FR3-a 包含「KQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYF」SEQ ID NO:85 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 85 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成； - FR4-a 包含「GSGTRLSIRP」SEQ ID NO:86 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 86 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成； 和 所述第二可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 組成組的框架區，優選為 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b，其中 - FR1-b 包含「DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPI」SEQ ID NO:87 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 87 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成； - FR2-b 包含「LFWYRQTMMRGLELLIY」SEQ ID NO:88 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 88 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成； - FR3-b 包含「IDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF」SEQ ID NO:89 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 89 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成；或 - FR4-b 包含「GEGSRLTVL」SEQ ID NO:90 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 90 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列或由其組成。
在一實施方案中，所述第一可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 組成組的框架區，優選為 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a，其中 - FR1-a 包含「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYT」SEQ ID NO:83 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 83 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成； -  FR2-a 包含「LYWYKQEPGAGLQLLTY」SEQ ID NO:84 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 84 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成， - FR3-a 包含「KQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYF」SEQ ID NO:85 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 85 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成； - FR4-a 包含「GSGTRLSIRP」SEQ ID NO:86 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 86 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成； 和 所述第二可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 組成組的框架區，優選為 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b，其中 - FR1-b 包含「DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPI」SEQ ID NO:87 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 87 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成； - FR2-b 包含「LFWYRQTMMRGLELLIY」SEQ ID NO:88 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 88 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成； - FR3-b 包含「IDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF」SEQ ID NO:89 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 89 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成；或 - FR4-b 包含「GEGSRLTVL」SEQ ID NO:90 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 90 具有至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成。
因此，本發明的抗原結合蛋白優選為進一步包含恒定結構域，例如，如上所述的 α恒定結構和/或 β恒定結構域，或 γ 和/或 δ 恒定結構域。優選情況為，α和β恒定結構域和/或 γ和δ 恒定結構域包含不存在於天然 TCR 中的其他突變，以加強兩條轉基因鏈（即 α和β 鏈）的配對。例如，TRAC 的第 48 位置以及 TRBC1或TRBC2 的第 57 位置可以被半胱氨酸殘基取代。此類修飾的進一步實施例如上所述。本發明抗原結合蛋白中包含的 α恒定結構域和 β恒定結構域的實例為 SEQ ID NO: 8（TCR R7P1D5 的 α恒定結構域）和 SEQ ID NO: 15（TCR R7P1D5 的 β恒定結構域）。
在一實施方案中，本發明抗原結合分子包含上文所定義的 TCR 分子，例如，包含至少一個 α 可變結構域和一個 β 可變結構域（α/β TCR）的分子或包含至少一個 γ 可變結構域或 δ 可變結構域的分子。換言之，此類 TCR 為異二聚體分子，即 α/β和γ/δ 異二聚體。
為了用於過繼細胞治療 (ACT)，α/β或γ/δ 異二聚體 TCR 可能被轉染至患者的 T細胞中為具有細胞質結構域和跨膜結構域的全長鏈。恒定結構域可包含合適的突變，即，二硫鍵，以改善所需轉基因 α/β或γ/δ 鏈的配對，並減少內源性 α/β或γ/δ 與各別轉基因鏈的配對。因此，本發明的抗原結合蛋白優選為進一步包含恒定結構域，例如，如上文所述的 α恒定結構域和/或 β恒定結構域。優選情況為，α和β恒定結構域包含不存在於天然 TCR 中的其他突變，以分別加強兩條鏈（即 α和β 鏈或 γ和δ 鏈）的配對。例如，TRAC 的第 48 位置以及 TRBC1或TRBC2 的第 57 位置被半胱氨酸殘基取代。本發明抗原結合蛋白中包含的 α恒定結構域和 β恒定結構域的實例為 SEQ ID NO: 8（TCR R7P1D5 的 α恒定結構域）和 SEQ ID NO: 15（TCR R7P1D5 的 β恒定結構域）。
在一優選實施方案中，TCR 包含 α 鏈和 β 鏈，該 α 鏈包含 α 可變結構域並進一步包含 α恒定結構域，該 α 可變結構域包含 CDR1α、CDR2α和CDR3α；該 β 鏈包含 β 可變結構域並且進一步包含 β恒定結構域，該 β 可變結構域包含 CDR1β、CDR2β和CDR3β。在一個進一步優選的實施方案中，α 可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中 CDRa1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 5 或由其組成，CDRa2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 6 或由其組成，CDRa3 包含選自由氨基酸序列 SEQ ID NO: 35、36、37、38、39（優選為氨基酸序列 SEQ ID NO: 35、36、37、38，更優選為氨基酸序列 SEQ ID NO: 35和38，例如 SEQ ID NO: 35）組成組中的氨基酸序列或由其組成；β 可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中 CDRb1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 或由其組成，CDRb2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 或由其組成，CDRb3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 14 或由其組成。
在一優選實施方案中，TCR 包含 α 鏈和 β 鏈，該 α 鏈包含 α 可變結構域並進一步包含 α恒定結構域，該 α 可變結構域包含 CDR1α、CDR2α和CDR3α；該 β 鏈包含 β 可變結構域並且進一步包含 β恒定結構域，該 β 可變結構域包含 CDR1β、CDR2β和CDR3β。在一個進一步優選的實施方案中，α 可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中 CDRa1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 5 或由其組成，CDRa2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 6 或由其組成，CDRa3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 35 或由其組成；β 可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中 CDRb1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 或由其組成，CDRb2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 或由其組成，CDRb3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 14 或由其組成。
在另一優選實施方案中，TCR 包含 α 鏈和 β 鏈，該 α 鏈包含 α 可變結構域並進一步包含 α恒定結構域，該 α 可變結構域包含 CDR1α、CDR2α和CDR3α；該 β 鏈包含 β 可變結構域並且進一步包含 β恒定結構域，該 β 可變結構域包含 CDR1β、CDR2β和CDR3β。在一個進一步優選的實施方案中，α 可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中 CDRa1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 5 或由其組成，CDRa2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 6 或由其組成，CDRa3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 38 或由其組成；β 可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中 CDRb1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 或由其組成，CDRb2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 或由其組成，CDRb3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 14 或由其組成。
在另一優選實施方案中，TCR 的可變 α和β 結構域進一步分別包含 α 框架區和 β 框架區。
在一實施方案中，所述第一 α 可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 組成組的框架區，優選為FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a，其中，FR1-a 包含氨基酸序列「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYT」SEQ ID NO: 83 或由其組成，FR2-a 包含氨基酸序列「LYWYKQEPGAGLQLLTY」SEQ ID NO: 84 或由其組成，FR3-a 包含氨基酸序列「KQDQRLTVLLNKNKDKHLSLRIADTQTGDSAIYF」SEQ ID NO: 85 或由其組成，FR4-a 包含氨基酸序列「GSGTRLSIRP」SEQ ID NO: 86 或由其組成，以及所述第二 β 可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 組成組的框架區，優選為 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b，並且其中 FR1-b 包含氨基酸序列「DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPI」SEQ ID NO: 87 或由其組成，FR2-b 包含氨基酸序列「LFWYRQTMMRGLELLIY」SEQ ID NO: 88 或由其組成，FR3-b 包含氨基酸序列「IDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF」SEQ ID NO: 89 或由其組成，或FR4-b 包含氨基酸序列「GEGSRLTVL」SEQ ID NO: 90 或由其組成。
在另一優選實施方案中，包含任何上述定義可變結構域的 TCR 進一步包含 α恒定結構域和 β恒定結構域，該 α恒定結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 8 或與 SEQ ID NO: 8具有至少 85%、90%或95% 同一性的序列或由其組成；該 β恒定結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 15 或與 SEQ ID NO: 15具有至少 85%、90%或95% 同一性的序列或由其組成。
本文所述抗原結合蛋白的變體考慮並明確指使用「與參考序列至少85% 相同」的措辭，如上文「定義」章節所定義。例如，序列 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 以及 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 可適當地與參考序列 SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90 不同，不同點在於：至少有一個氨基酸取代基，特別是至少有一個保守氨基酸取代基和/或規範殘基取代基。特別是，第一可變結構域和第二可變結構域的序列 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 以及 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 可與參考序列 SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90 不同，不同點僅為保守氨基酸取代基。
可對本發明抗原結合蛋白的氨基酸序列和相應的 DNA 序列分別進行修飾和改變，並且仍可產生具有所需特性的功能性抗原結合蛋白或多肽。可在第一或第二可變結構域中，特別是在第一和/或第二可變結構域中包含的框架區中或每個 CDR 中或所有 CDR 中進行修飾。
本發明的發明人還發現，透過使用親本 TCR R7P1D5 的框架區，抗原結合蛋白框架區中特定的氨基酸取代基具有有利作用。特別是，氨基酸取代基 S19A或S19V，優選為 S19V，對於表達可溶性單鏈 TCR 構建體至關重要，特別是除了在其第二個氨基酸位置包含 Y 的 CDRa2 氨基酸序列（即，CDRa2 中，根據 IMGT 氨基酸 57 為 Y (57Y)）之外。此外，發明人發現，單獨或組合使用 FR2-a 中的氨基酸取代基 A48K和L50P、FR2-b 中的 M46P和M47G 可增加本發明可溶性抗原結合蛋白的表達產量。發明人還證明，FR2-B 中的 I54F 可增加可溶性抗原結合蛋白的表達產量，特別是根據 IMGT 在第 109 位置包含 D 的 CDRb3 氨基酸序列之外，可增加可溶性抗原結合蛋白的穩定性。另外，發明人發現 FR2-b 中的 I54F 取代顯著提高了可溶性抗原結合蛋白的特異性。
因此，在一實施方案中，本發明抗原結合蛋白的框架區包含至少一個氨基酸取代基，優選為 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 個，更優選為 1 至 5 個、2 至 5 個（例如：3或4 個）選自包含以下的氨基酸取代基組中的氨基酸取代基： - FR1-a 中第 19 位置處的氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基優選為 S19A、S19V，更優選為 S19V -  FR2-a 中第 48 和/或第 50 位置處的氨基酸取代基，其中所述第 48 位置處的氨基酸取代基優選為 A48K，所述第 50 位置處的氨基酸取代基優選為 L50P， - FR2-b 中第 46、47和/或 54 位置處的氨基酸取代基，其中所述第 46、47和54 位置處的氨基酸取代基分別優選為 M46P、M47G和I54F，其中，當上面定義的 CDRb3 氨基酸序列在第 109 位置處包含氨基酸 109D 時，優選第 54 位置處的所述氨基酸為 I54F， - FR3-b 中第 66 位置處的氨基酸取代基，其中所述第 66 位置處的氨基酸取代基分別優選為 I66C，其中，當上面定義的 CDRb2 氨基酸序列在第 57 位置處包含氨基酸 57C 時，優選第 66 位置處的所述氨基酸為 66C， 並且其中取代基的位置根據 IMGT 命名法給出，其中所述氨基酸取代基與親本 TCR R7P1D5 的相應框架氨基酸序列的氨基酸序列相比任選地給出。
在一優選實施方案中，本發明抗原結合蛋白的框架區包含氨基酸取代基 S19V、A48K和I54F或S19V、A48K，優選為 S19V、A48K和I54F，其中取代基的位置根據 IMGT 命名法給出。在一實施方案中，所述氨基酸取代的組合有利於進一步與包含氨基酸序列「CASRAX1 TGELFF」 SEQ ID NO: 82或由其組成的 CDRb3 組合，其中，X1 為 D，或根據 IMGT 編號，其中 CDRb3 氨基酸在第 109 位置處包含氨基酸 109D。在另一個優選實施方案中，當上文定義的 CDRb2 氨基酸序列第 57 位置包含 57C 時，本發明抗原結合蛋白的框架區還包含氨基酸取代基 I66C，其中優選為 FR3-b 包含氨基酸取代基 I66C。
因此，在一實施方案中，所述第一可變結構域還包含一個或多個選自由 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 組成組的框架區，優選為所有框架區，其中 -  FR1-a 包含「EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYT」SEQ ID NO:91 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 91 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 91 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含氨基酸 19V（SEQ ID NO: 91 中下劃線部分）， -  FR2-a 包含「LYWYKQEPGKGLQLLTY」SEQ ID NO:92 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 92 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 92 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含氨基酸 48K（SEQ ID NO: 92 中下劃線部分）和任選為第 50 位置處的氨基酸取代基，優選為 L50P， -  FR3-a 包含「KQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYF」SEQ ID NO:85 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 85 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -  FR4-a 包含「GSGTRLSIRP」SEQ ID NO:86 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 86 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，和 所述第二可變結構域還包含一個或多個框架區，優選為選自由 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 組成組的框架區，其中 - FR1-b 包含「DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPI」SEQ ID NO:87 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 87 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -  FR2-b 包含「LFWYRQTMMRGLELLFY」SEQ ID NO:93 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 93 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 93 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含氨基酸 54F 和任選為第 46 和/或 47 位置處的氨基酸取代基，其中第 46和/或 47 位置處的所述氨基酸取代基分別優選為 M46P 和/或 M47G， - FR3-b 包含「IDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF」SEQ ID NO: 89 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 89 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，或包含「CDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF」SEQ ID NO: 94 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 94 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 94 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含氨基酸 66C，並且其中，當上面定義的 CDRb2 氨基酸序列在第 57 位置處包含氨基酸 57C 時，FR3-b 優選包含與包含氨基酸 66C 的 SEQ ID NO: 94 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -  FR4-b 包含「GEGSRLTVL」SEQ ID NO:90 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 90 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成。
本文所述抗原結合蛋白的變體考慮並明確指使用「與參考序列至少85% 相同」的措辭，如上文「定義」章節所定義。例如，序列 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 以及 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 可適當地與參考序列 SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 93和SEQ ID NO: 89或SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 90不同，不同點在於：至少有一個氨基酸取代基，特別是至少有一個保守氨基酸取代基和/或規範殘基取代基。特別是，第一可變結構域和第二可變結構域的序列 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 以及 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 可與參考序列 SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:94、 SEQ ID NO:90 不同，不同點僅為保守氨基酸取代基。
可對本發明抗原結合蛋白的氨基酸序列和編碼它們的相應 DNA 序列進行修飾和改變，並且仍可產生具有所需特性的功能性抗原結合蛋白或多肽。
因此，在一實施方案中，本發明涉及一種抗原結合蛋白，其包含 (i)  包含第一可變結構域的第一多肽鏈，所述第一可變結構域包含選自由以下組成組的氨基酸序列：「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP」SEQ ID NO:118、「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFTSESKIIFGSGTRLSIRP」SEQ ID NO:119、「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFNSESKIIFGSGTRLSIRP」SEQ ID NO:120、「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFSSASKIIFGSGTRLSIRP」SEQ ID NO:121、「EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEATSESKIIFGSGTRLSIRP」SEQ ID NO:122，優選為 SEQ ID NO: 118和SEQ ID NO: 121，更優選為 SEQ ID NO: 118，或者與選自由 SEQ ID NO 118至122 組成組的氨基酸序列至少具有 85% 同一性的氨基酸序列，並且其中，在 SEQ ID NO 118 至 122 的情況下，與選自由 SEQ ID NO: 118 至 122 組成組的氨基酸序列具有至少 85% 同一性的氨基酸序列優選分別包含SEQ ID NO: 5 的 CDRa1、SEQ ID NO: 6 的CDRa2和SEQ ID NO:35、36、37、38、39 的 CDRa3 的氨基酸序列，和 (ii) 包含第二可變結構域的第二多肽鏈，所述第二可變結構域包含 SEQ ID NO: 11 的氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 11 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列，其中與SEQ ID NO: 11 的氨基酸序列具有至少 85% 同一性的氨基酸序列優選為分別包含 SEQ ID NO: 12、13和14 的 CDRb1、CDRb2和CDRb3 的氨基酸序列，或 (iii) 包含第一可變結構域的第一多肽鏈，所述第一可變結構域包含以下氨基酸序列：「EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP」SEQ ID NO:151 或「EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP」SEQ ID NO:152，優選為與 SEQ ID NO:151或152 氨基酸序列具有至少 85% 同一性的氨基酸序列，並且其中優選與 SEQ ID NO: 151 的氨基酸序列具有少 85% 同一性的氨基酸序列優選包含 SEQ ID NO: 5 的 CDRa1、SEQ ID NO: 56 的 CDRa2和SEQ ID NO: 35 的 CDRa3 的氨基酸序列，其中優選與 SEQ ID NO: 152 的氨基酸序列具有少 85% 同一性的氨基酸序列優選包含 SEQ ID NO: 55 的 CDRa1、SEQ ID NO: 56 的 CDRa2和SEQ ID NO: 35的 CDRa3 的氨基酸序列，並且優選還包含氨基酸 19V 和/或 48K，和 (iv) 包含第二可變結構域的第二多肽鏈，所述第二可變結構域包含以下氨基酸序列：「DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL」SEQ ID NO:149 或「DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVL」SEQ ID NO:150，並且其中優選為與 SEQ ID NO:149 氨基酸序列具有至少 85% 同一性的氨基酸序列優選包含 SEQ ID NO: 62 的 CDRb1、SEQ ID NO: 65 的 CDRb2和SEQ ID NO: 14 的 CDRb3 的氨基酸序列，並且其中優選與 SEQ ID NO:150 的氨基酸序列具有少 85% 同一性的氨基酸序列包含 SEQ ID NO: 62 的 CDRb1、SEQ ID NO: 65 的 CDRb2和SEQ ID NO: 71 的 CDRb3 的氨基酸序列，並且優選還包含氨基酸 54F 和/或 66C。
在一實施方案中，抗原結合蛋白為抗體或其片段，或雙特異性抗體或其片段，或 T細胞受體 (TCR) 或其片段，或雙特異性 T細胞受體 (TCR) 或其片段。抗體和 TCR 及各自的片段的定義見上文「定義」章節。
在一實施方案中，抗原結合蛋白來源於人，其被理解為由人抗原基因座產生，因此包含人序列，特別是人 TCR 或抗體序列。
在一實施方案中，第一多肽和第二多肽特別透過共價鍵連接在一起。
在一實施方案中，抗原結合蛋白為一種可溶性蛋白。
「共價連接」、「連接子序列」或「多肽連接子」如上文「定義」章節所定義（見「連接子」）。
在一實施方案中，本發明抗原結合蛋白還包含以下一種或多種： (i)  一個或多個其他抗原結合位點； (ii) 跨膜區，任選為包括胞質信號傳導區； (iii) 診斷劑； (iv) 治療劑；或 (v)  PK 修飾部分。
如本領域技術人員熟悉的，例如在抗體背景下，抗原結合位點通常由 6 個與抗原結合的 CDR 形成。
在本發明的背景下，上文 (i) 中提及的一個或多個其他抗原結合位點優選為選自與抗原結合的結合位點，其中所述抗原選自由抗原CD3（例如：CD3γ、CD3δ和CD3ε 鏈）、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、Fc εRI、TCRα/β、TCRγ/δ、HLA-DR 或效應細胞的抗原組成的組，優選為 CD3、TCR α/β或CD28，更優選為 CD3和TCR α/β。
「CD3」和「CD28」的定義見上文「定義」章節。
在一些實施方案中，(i) 中提及的一個或多個其他抗原結合位點中的一個能夠與 T細胞特異性受體分子和/或天然殺傷細胞（NK 細胞）特異性受體分子結合。在一特定實施方案中，抗原結合蛋白與 CD3 T細胞共受體形成複合體。
在一優選實施方案中，(i) 中提及的一個或多個其他抗原結合位點之一能夠與 TCRα/β 結合。
在一些實施方案中，T細胞特異性受體為 CD3 T細胞共受體。
在一些實施方案中，T細胞特異性受體為 CD28、CD134、4-1 BB、CD5或CD95。
「CD134」、「4-1 BB」、「CD5」、「CD95」和「NK 細胞特異性受體分子」的定義見上文「定義」章節。「跨膜區」、「胞質信號傳導區」、「診斷劑」、「治療劑」和「PK 修飾部分」的定義見上文「定義」章節。
在一些實施方案中，本發明的抗原結合蛋白直接或經由可裂解或不可裂解連接子共價附著於至少一種生長抑制劑。附著於此類至少一種生長抑制劑的抗原結合蛋白也可稱為綴合物。
製備此類綴合物（例如：免疫綴合物）的描述參見申請 WO2004/091668或Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298:209-223 (2005)和Kirin et al., Inorg Chem.44(15): 5405-5415 (2005)，並且可能被本領域技術人員轉移至製備本發明的抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白附著有此類至少一種生長抑制劑。
在至少一種生長抑制劑附著背景下的「連接子」系指包含共價鍵或原子鏈的化學部分，其將多肽共價附著於藥物部分。
綴合物可透過體外方法製備。為了使藥物或前藥與抗體連接，使用連接基團。合適的連接基團為本領域所熟知的，包括二硫鍵、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團和酯酶不穩定基團。本發明的抗原結合蛋白與細胞毒性劑或生長抑制劑的綴合可使用多種雙功能蛋白偶聯劑進行，包括但不限於 N-琥珀醯亞胺基吡啶二硫代丁酸鹽 (SPDB)、丁酸 4-[（5-硝基-2-吡啶基）二硫]-2,5-二氧-1-吡咯烷基酯（硝基 SPDB）、4-（吡啶-2-基二硫烷基）-2-磺基丁酸（磺基-SPDB）、N-琥珀醯亞胺基（2-吡啶二硫基）丙酸酯 (SPDP)、琥珀醯亞胺基（N-馬來醯亞胺甲基）環己烷-1-羧酸鹽 (SMCC)、亞氨基噻烷 (IT)、亞氨基酯的雙功能衍生物（如：己二亞氨二甲酯 HCL）、活性酯（如：辛二酸二琥珀醯亞胺酯）、醛（如：戊二醛）、雙疊氮化合物（如：雙-（對疊氮苯甲醯基）-己二胺）、雙重氮衍生物（如：雙-（對重氮苯甲醯基）-乙二胺）、二異氰酸酯（如：甲苯2,6-二異氰酸酯）和雙活性氟化合物（如：1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。例如，可按 Vitetta et al (1987) 一文所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳標記 1-異硫氰酸根合苄基甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用於放射性核苷酸與抗體綴合的一種示例性螯合劑 (WO 94/11026)。
連接子可以為「可裂解連接子」，其促進細胞毒性劑或生長抑制劑在細胞中釋放。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、酯酶不穩定連接子、光不穩定連接子或含二硫鍵連接子（參見，例如美國專利號 5,208,020）。連接子也可能為「不可裂解連接子」（例如 SMCC連接子），在某些情況下可能使耐受性更好。
或者，包含本發明抗體以及細胞毒性或生長抑制性多肽的融合蛋白可透過重組技術或肽合成製備。DNA 的長度可能包含編碼綴合物的兩個部分的相應區域，所述兩個部分彼此相鄰或由編碼連接子肽的區域隔開，所述連接子肽不破壞綴合物所需性質。
本發明的抗原結合蛋白還可用於依賴性酶介導前藥療法中，方法為：透過使多肽與前藥活化酶綴合，所述前藥活化酶將前藥（例如：肽基化學治療劑，參見 WO 81/01145）轉化為活性抗癌藥物（參見，例如，WO 88/07378 和美國專利號 4,975,278）。
在一實施方案中，本發明抗原結合蛋白還包含以下一種或多種：酶、細胞因子（例如：人 IL-2、IL-7或IL-15）、納米載體或核酸。
在一優選實施方案中，抗原結合蛋白呈雙特異性。該雙特異性抗原結合蛋白在本文中也稱為「雙特異性分子」。
在本領域中描述了許多不同的雙特異性形式，並在上文「定義」章節中的「形式」下進行了描述。製備不同形式蛋白質的技術在本領域中也進行了公開（在相應章節中引用），因此本領域技術人員可以用本文公開的形式較容易地使用本發明背景下定義的 CDR 或可變結構域。在本文實施例章節中也公開了抗原結合蛋白（例如：scTCR）或可溶性雙特異性結合蛋白（例如：TCER™）的製備。本領域技術人員會瞭解，輕鏈和重鏈可變結構域可以為平行方向，且 α和β 可變結構域可以為平行方向，如以 DVD 形式一樣，或者輕鏈和重鏈可變結構域可以為交叉方向，且 α和β 可變結構域可以為交叉方向，如以 CODV 形式一樣。
因此，本發明進一步涉及包含兩條形成兩個抗原結合位點（A和B）的多肽鏈的抗原結合蛋白，其中第一條多肽鏈具有下式表示的結構： V3 -L1 -V4 -L2 -CL [I] 其中，V3 為第三可變結構域；V4 為第四可變結構域；L1 和L2 為連接子；L2 可能存在也可能不存在；CL 為輕鏈恒定結構域或其一部分且可能存在也可能不存在； 其中第二條多肽鏈具有下式表示的結構： V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 [II] 其中，V5 為第五可變結構域；V6 為第六可變結構域；L3 和L4 為連接子； L4 可能存在也可能不存在；CH1 為重鏈恒定結構域 1 或其一部分且存在或不存在；其中 V3 或V4 為上文定義的第一可變結構域，而 V5 或V6 為上文定義的第二可變結構域，或 V5 或V6 在本發明背景下定義為第一可變結構域，而 V3 或V4 在本發明背景下定義為第二可變結構域，其中 V3 為上文所定義的第一可變結構域而 V5 為第二可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域，或， V3 為上文所定義的第二可變結構域而 V5 為第一可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域，或， V3 為上文所定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V5 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V5 為輕鏈可變結構域，或 V3 為上文所定義的第二可變結構域而 V6 為第一可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V5 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V5 為輕鏈可變結構域， V4 為上文所定義的第一可變結構域而 V5 為第二可變結構域，並且 V3 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V3 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域，或 V4 為上文所定義的第二可變結構域而 V5 為第一可變結構域，並且 V3 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V3 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域， 其中，輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域一起形成一個抗原結合位點 B，並且其中上文定義的第一和第二可變結構域形成一個抗原結合位點 A。連接子 L1 、L2 、L3 、L4 的定義見上文「定義」章節。但是，在一些實施方案中，有些連接子長度對於特定形式可能為優選。但是，關於連接子長度及其氨基酸序列的知識屬於本領域的常識，而連接子以及用於不同形式的連接子和氨基酸序列屬於現有技術的一部分，並在上文引用的公開中披露。
本領域技術人員會瞭解，在上文所定義的第一可變結構域和第二可變結構域中形成的抗原結合位點 A 與本發明背景下所述的 MAGE-A 肽/MHC 複合體特異性結合。
在一優選實施方案中，V3 為本發明背景下所定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V5 為重鏈可變結構域，或 V3 為本發明背景下所定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為重鏈可變結構域而 V5 為輕鏈可變結構域。
在一實施方案中，式 [I] 的多肽在式 [I] 多肽的 C-端還包含連接子 (L5 )和Fc 結構域或其部分，和/或其中，式 [II] 的多肽在式 [II] 多肽的 C-端還包括連接子 (L6 )和Fc 結構域或其部分。
Fc 結構域的定義見上文「定義」章節。
在一實施方案中，抗原結合蛋白包含兩條形成兩個抗原結合位點（A和B）的多肽鏈， 其中一條多肽鏈具有式 [III] 表示的結構： V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 以及一條多肽鏈具有式 [IV] 表示的結構： V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 其中 V3 、L1 、V4 、L2 、CL 、V5 、L3 、V6 、L4 、CH1 的定義見上文，並且其中 L5和L6 為存在或不存在的連接子，且其中 Fc1 和Fc2 為 Fc 結構域，且其中 Fc1 和Fc2 相同或不同，優選為不同。Fc 結構域的定義見上文「定義」章節。
在一實施方案中，Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113（臼）或由其組成，Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112（杵）或由其組成，反之亦然， 更優選地，當 V4 或V3 為重鏈可變結構域時，Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113 或由其組成，因此，當 V5 或V6 為輕鏈可變結構域時，Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112 或由其組成，或 當 V4 或V3 為輕鏈可變結構域時，Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112 或由其組成，因此，當 V5 或V6 為重鏈可變結構域時，Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113 或由其組成。
在一實施方案中，重鏈可變結構域 (VH ) 和輕鏈可變結構域 (VL ) 一起形成一個結合位點 B，其與選自由 CD3（例如：CD3γ、CD3δ和CD3ε 鏈）、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、Fc εRI、TCRα/β、TCRγ/δ、HLA-DR 所組成組中的抗原結合和/或與效應細胞結合。
在另一實施方案中，重鏈可變結構域 (VH ) 和輕鏈可變結構域 (VL ) 一起形成一個結合位點，所述結合位點與 T細胞特異性受體分子和/或天然殺傷細胞（NK 細胞）特異性受體分子結合，其中 T細胞特異性受體分子和天然殺傷細胞（NK 細胞）特異性受體分子的定義見上文「定義」章節。
在一實施方案中，輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 154 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 156 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 157 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 158 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 159 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 160 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 162 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 164 或由其組成。
優選為，輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 154 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 156 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 159 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 160 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 162 或由其組成，或者輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 153 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 164 或由其組成，更優選為，輕鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 159 或由其組成而重鏈可變結構域包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 160 或由其組成。
從實施例中可以看出，本發明的發明人在原理上證明了本發明背景下定義的 CDR 的使用，更具體地如上文定義的 TCER™ 形式的可變結構域（實施例）。
因此，在一優選實施方案中，抗原結合蛋白包含形成兩個抗原結合位點的兩條多肽鏈，其中一條多肽鏈具有由式 [III] 表示的結構： V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 以及一條多肽鏈具有式 [IV] 表示的結構： V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 其中 L2 、CL 、L5 和L4 、CH1 、L6 不存在，並且 其中 V3 、L1 、V4 、V5 、L3 、V6 如上文所定義， 優選為，V3 為本發明背景下所定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V5 為重鏈可變結構域，或者優選為 V3 為本發明背景下所定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為重鏈可變結構域而 V5 為輕鏈可變結構域，和 優選為，L1 和L3 包含 (SEQ ID NO: 96) 的氨基酸序列「GGGSGGGG」或由其組成，和 優選為，Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113 或由其組成，Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112 或由其組成，反之亦然， 更優選為，當 V4 為重鏈可變結構域時，Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113 或由其組成，因此，當 V5 為輕鏈可變結構域時，Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112 或由其組成，或 更優選為，當 V4 為輕鏈可變結構域時，Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112 或由其組成，因此，當 V5 為重鏈可變結構域時，Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113 或由其組成，和 輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域一起形成一個抗原結合位點，其優選與如上文所定義的抗原（優選為 CD3、TCRα/β或CD28，更優選為 CD3或TCRα/β）結合， 並且其中第一和第二可變結構域形成一個抗原結合位點，其與本發明背景下定義的 MAGE-A抗原肽特異性結合。
本實施方案的抗原結合蛋白可稱為雙特異性 TCR 或稱為含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體。本實施方案的抗原結合蛋白也可稱為 TCER™。
「TCER™」為雙特異性 T細胞受體 (TCR)，是可溶性抗原結合蛋白，其包含兩個抗原結合結構域--如本發明背景下定義的第一和第二可變結構域以及由抗體的重鏈和輕鏈可變結構域形成的另外一種抗原結合結構域，也稱為募集子，例如：針對 CD3 或針對 TCRα/β 的可變輕鏈和重鏈可變結構域。
在一優選實施方案中，抗原結合蛋白（例如 TCER™ ）包含 氨基酸序列 (SEQ ID NO: 135) 的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的一個第一多肽： EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L2 、CL 、L5 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 138（SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 59和SEQ ID NO: 35 的 CDRa1、CDRa2、CDRa3 以粗體表示）的 V3 （成熟的 TCR 衍生 α 可變結構域）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L1 （下劃線）、序列 SEQ ID NO: 160 的 V4 （抗 TCRαβ VH ）和序列 SEQ ID NO: 113 的Fc1 （以斜體和下劃線表示）；和 氨基酸序列 (SEQ ID NO: 136) 的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的一個第二多肽： QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L4 、CH1 、L6 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 159 的 V5 （抗TCRαβ VL）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L3 （下劃線）、序列 SEQ ID NO: 150（SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 71 的 CDRa1、CDRa2、CDRa3 以粗體表示）的 V6 （TCR 衍生 β 可變結構域）和序列 SEQ ID NO: 112 的 Fc2 （以斜體和下劃線表示），其中，Fc1 和Fc2 序列包含半胱氨酸至絲氨酸的氨基酸取代基（以粗體字表示的 S）因為無需透過所述半胱氨酸連接輕鏈、IgG1 鉸鏈區的氨基酸取代基類似 IgG2 鉸鏈可消除 Fc -γ 受體的相互作用（在第 233 至 235和331S 位置以粗體字表示的 PVA）、N297Q 氨基酸取代基（以粗體字表示的 Q）可消除 Fc 部分內的 N-糖基化位點從而消除 Fc -γ 受體的相互作用，和另外如果是 Fc1 中的臼突變（Y349C、T366S、L368A和Y407V）和如果是 Fc2 中的杵突變（S354C和T366W）。因此，在一優選實施方案中，Fc1 具有序列 SEQ ID NO: 113 而 Fc2 具有序列 SEQ ID NO: 112。
在另一優選實施方案中，抗原結合蛋白（例如 TCER™）包含一個具有氨基酸序列 (SEQ ID NO: 136) 的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -FC1 [III] 的第一多肽： QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L2 、CL 、L5 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 159 的 V3 （抗 TCRαβ VL）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L1 （下劃線部分）、序列 SEQ ID NO:150（具有 SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 71 序列的 CDRa1、CDRa2、CDRa3 以粗體表示）的 V4 （TCR 衍生 β 可變結構域）和序列 SEQ ID NO: 112 的Fc1 （斜體和下劃線部分）；和 一個具有氨基酸序列 (SEQ ID NO: 137) 的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -FC2 [IV] 的第二多肽： EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L4 、CH1 、L6 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 151（具有 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 35 的 CDRa1、CDRa2、CDRa3 以粗體表示）的 V5 （成熟的 TCR 衍生 α 可變結構域）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L3 （下劃線部分）、序列 SEQ ID NO: 160 的 V6 （抗 TCRαβ VH ）和序列 SEQ ID NO: 113 的Fc2 （斜體和下劃線部分）， 其中，Fc1 和Fc2 序列包含：半胱氨酸至絲氨酸的氨基酸取代（S 以粗體字表示），因為沒有輕鏈需要透過IgG1 鉸鏈區的所述半胱氨酸氨基酸取代連接以類似 IgG2 鉸鏈從而消除 Fc -γ 受體的相互作用（在第 233 至 235 位置以粗體字表示的 PVA和331S）；N297Q 氨基酸取代（Q 以粗體字表示）以移除 Fc 部分內的 N-糖基化位點，從而消除 Fc -γ 受體的相互作用；以及如果是 Fc2 中的臼突變（Y349C、T366S、L368A和Y407V）和如果是 Fc1 中的杵突變（S354C和T366W）。因此，在一優選實施方案中，Fc1 具有序列 SEQ ID NO: 112 而 Fc2 具有序列 SEQ ID NO: 113。
在另一優選實施方案中，抗原結合蛋白（例如 TCER™）包含一個具有氨基酸序列 (SEQ ID NO: 131) 的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -FC1 [III] 的第一多肽： EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L2 、CL 、L5 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 151（具有 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 35 的 CDRa1、CDRa2、CDRa3 以粗體表示）的 V3 （成熟的 TCR 衍生 α 可變結構域）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L1 （下劃線部分）、序列 SEQ ID NO: 153 的 V4 （抗 TCRαβ VL）和序列 SEQ ID NO: 112 的Fc1 （斜體和下劃線部分）；和 一個具有氨基酸序列 (SEQ ID NO: 130) 的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -FC2 [IV] 的第二多肽： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L4 、CH1 、L6 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 154 的 V5 （抗 TCRαβ VL）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L3 （下劃線部分）、序列 SEQ ID NO:151（具有 SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 71 序列的 CDRa1、CDRa2、CDRa3 以粗體表示）的 V6 （TCR 衍生 β 可變結構域）和序列 SEQ ID NO: 113 的Fc2 （斜體和下劃線部分）， 其中，Fc1 和Fc2 序列包含：半胱氨酸至絲氨酸的氨基酸取代（S 以粗體字表示），因為沒有輕鏈需要透過IgG1 鉸鏈區的所述半胱氨酸氨基酸取代連接以類似 IgG2 鉸鏈從而消除 Fc -γ 受體的相互作用（在第 233 至 235 位置以粗體字表示的 PVA和331S）；N297Q 氨基酸取代（Q 以粗體字表示）以移除 Fc 部分內的 N-糖基化位點，從而消除 Fc -γ 受體的相互作用；以及如果是 Fc2 中的臼突變（Y349C、T366S、L368A和Y407V）和如果是 Fc1 中的杵突變（S354C和T366W）。因此，在一優選實施方案中，Fc1 具有序列 SEQ ID NO: 112 而 Fc2 具有序列 SEQ ID NO: 113。
在另一優選實施方案中，抗原結合蛋白（例如 TCER™）包含一個具有氨基酸序列 (SEQ ID NO: 133) 的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -FC1 [III] 的第一多肽： EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L2 、CL 、L5 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 152（具有 SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 35 的 CDRa1、CDRa2、CDRa3 以粗體表示）的 V3 （成熟的 TCR 衍生 α 可變結構域）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L1 （下劃線部分）、序列 SEQ ID NO: 154 的 V4 （抗 TCRαβ VL）和序列 SEQ ID NO: 112 的Fc1 （斜體和下劃線部分）；和 一個具有氨基酸序列 (SEQ ID NO: 130) 的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -FC2 [IV] 的第二多肽： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 其中，L4 、CH1 、L6 不存在，並且包含序列 SEQ ID NO: 154 的 V5 （抗 TCRαβ VL）、序列 SEQ ID NO: 96 的 L3 （下劃線部分）、序列 SEQ ID NO:151（具有 SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 71 序列的 CDRb1、CDRb2、CDRb3 以粗體表示）的 V6 （TCR 衍生 β 可變結構域）和序列 SEQ ID NO: 113 的Fc2 （斜體和下劃線部分）， 其中，Fc1 和Fc2 序列包含：半胱氨酸至絲氨酸的氨基酸取代（S 以粗體字表示），因為沒有輕鏈需要透過IgG1 鉸鏈區的所述半胱氨酸氨基酸取代連接以類似 IgG2 鉸鏈從而消除 Fc -γ 受體的相互作用（在第 233 至 235 位置以粗體字表示的 PVA和331S）；N297Q 氨基酸取代（Q 以粗體字表示）以移除 Fc 部分內的 N-糖基化位點，從而消除 Fc -γ 受體的相互作用；以及如果是 Fc2 中的臼突變（Y349C、T366S、L368A和Y407V）和如果是 Fc1 中的杵突變（S354C和T366W）。因此，在一優選實施方案中，Fc1 具有序列 SEQ ID NO: 112 而 Fc2 具有序列 SEQ ID NO: 113。
在一實施方案中，本發明涉及一種抗原結合蛋白，其包含 i)       式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 127 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 128 的氨基酸序列或由組成， ii)      式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 127 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 130 的氨基酸序列或由組成， iii)     式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 131 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 130 的氨基酸序列或由組成， iv)      式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 133 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 130 的氨基酸序列或由組成， v)       式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 135 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 的氨基酸序列或由組成， vi)      式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 137 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 的氨基酸序列或由組成， vii)     式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 139 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 的氨基酸序列或由組成， viii)    式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 131 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 142 的氨基酸序列或由組成， ix)      式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 133 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 142 的氨基酸序列或由組成， x)       式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 131 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 的氨基酸序列或由組成， xi)      式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 133 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 136 的氨基酸序列或由組成， xii)     式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽，其包含 SEQ ID NO: 133 的氨基酸序列或由其組成，以及式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽，其包含 SEQ ID NO: 166 的氨基酸序列或由組成， 優選為 iii) 至 xi)，更優選為 iii)和iv)。
在一更優選實施方案中，本發明涉及一種抗原結合蛋白，其包含由氨基酸序列 SEQ ID NO: 131 組成的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽以及由氨基酸序列 SEQ ID NO: 130 組成的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽；或本發明涉及一種抗原結合蛋白，其包含由氨基酸序列 SEQ ID NO: 133 組成的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽以及由氨基酸序列 SEQ ID NO: 130 組成的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽；或本發明涉及一種抗原結合蛋白，其包含由氨基酸序列 SEQ ID NO: 135 組成的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽以及由氨基酸序列 SEQ ID NO: 136 組成的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽；或本發明涉及一種抗原結合蛋白，其包含由氨基酸序列 SEQ ID NO: 137 組成的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽以及由氨基酸序列 SEQ ID NO: 136 組成的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽；或本發明涉及一種抗原結合蛋白，其包含由氨基酸序列 SEQ ID NO: 139 組成的式 V3 -L1 -V4 -L2 -CL -L5 -Fc1 [III] 的第一多肽以及由氨基酸序列 SEQ ID NO: 136 組成的式 V5 -L3 -V6 -L4 -CH1 -L6 -Fc2 [IV] 的第二多肽。
針對效應子功能，還可能需要對本發明的抗原結合蛋白進行修飾，從而增強或降低抗原結合蛋白的抗原依賴性細胞介導細胞毒性 (ADCC) 和/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)。這可透過在抗原結合蛋白的 Fc 區中引入一個或多個氨基酸取代基來實現，本文中在本發明抗原結合蛋白的背景下也稱為 Fc -變體。替代地或另外地，可在 Fc 區中引入半胱氨酸殘基，從而在該區形成鏈間二硫鍵。由此產生的異二聚體抗原結合蛋白可改善或降低內在化能力和/或增加補體介導細胞殺傷力和/或抗體依賴性細胞的細胞毒性 (ADCC) (Caron PC. et al.1992; and Shopes B. 1992)。
本發明抗原結合蛋白的另一類型氨基酸修飾可用於改變抗原結合蛋白的原始糖基化模式，即，透過刪除抗原結合蛋白中存在的一個或多個碳水化合物部分，和/或添加抗原結合蛋白中不存在的一個或多個糖基化位點。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸中出現任何一個（其中 X 為脯氨酸以外的任何氨基酸）都會產生潛在的糖基化位點。添加或刪除抗原結合蛋白的糖基化位點可透過改變氨基酸序列以使其包含一個或多個上述三肽序列（用於 N-連接的糖基化位點）而方便地實現。
另一類型的修飾涉及移除透過電腦或實驗方法鑒定的序列，這可能導致抗原結合蛋白製備產生降解產物或異質性。例如，天冬醯胺和穀氨醯胺殘基的脫醯胺可能取決於諸如 pH 和表面暴露等因素。天冬醯胺殘基尤其容易發生脫醯胺（主要是存在於 Asn-Gly 序列中時），而在其他二肽序列（如 Asn-Ala）中時則較少發生。當此類脫醯胺位點（特別是 Asn-Gly）存在於本發明的抗原結合蛋白中時，可能希望移除該位點，通常是透過保守取代法移除其中一個涉及的殘基。序列中此類取代以移除其中一個或多個涉及的殘基也是本發明的意圖。
另一種類型的共價修飾涉及將糖苷在化學或酶學上偶聯至抗原結合蛋白。這些程序的優點在於：它們無需在對 N-或O-連接糖基化具有糖基化能力的宿主細胞中產生抗原結合蛋白。根據所使用的偶聯方式，糖可附著至 (a) 精氨酸和組氨酸，(b) 遊離羧基，(c) 遊離巰基團，例如：半胱氨酸基團，(d) 遊離羥基團，例如：絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸基團，(e) 芳香殘基，例如：苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸殘基，或 (f) 穀氨醯胺的醯胺基團。例如，WO87/05330 中描述了此類方法。
移除抗原結合蛋白上存在的任何碳水化合物部分可在化學上或酶學上實現。化學去糖基化需要將抗原結合蛋白暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理可導致連接糖（N-乙醯氨基葡糖或 N-乙醯半乳糖胺）之外的大多數或所有糖裂解，同時讓抗原結合蛋白保持完整。化學脫糖基化的描述見 Sojahr H. et al.(1987)和Edge, AS. et al.(1981)。抗體上碳水化合物部分的酶切可透過使用多種內切和外切糖苷酶來實現，參見 Thotakura, NR. et al. (1987)。
抗原結合蛋白的另一種類型共價修飾包含將抗原結合蛋白與多種非蛋白質聚合物（例如：聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯）之一連接，方法為美國專利號4,640, 835；4,496, 689；4,301, 144；4,670, 417；4,791, 192或4,179,337 規定的方法。
在一特別實施方案中，抗原結合蛋白為 TCR。
在一特別實施方案中，TCR 為人 TCR。因此，在一實施方案中，所述第一可變結構域包含於 TCR α或γ 鏈；和/或其中所述第二可變結構域包含於 TCR β或δ 鏈。在一實施方案中，所述 TCR 為 α-β 異二聚體，並且包含 α 鏈 TRAC 恒定結構域序列和 β 鏈 TRBC1或TRBC2 恒定結構域序列。
α 鏈 TRAC 恒定結構域序列和 β 鏈 TRBC1或TRBC2 恒定結構域如下，也稱為 TCR 恒定結構域序列。在一實施方案中，TCR 恒定結構域序列可源自任何合適的物種，如任何哺乳動物，例如：人、大鼠、猴、兔、驢或小鼠，優選為人。在一些優選實施方案中，TCR 恒定結構域序列可例如透過引入異源序列、優選為小鼠序列來稍加修飾，這可能增加 TCR 的表達和穩定性。此外，可以引入現有技術中已知的進一步穩定化突變（例如  WO 2018/104407、PCT/EP2018/069151、WO 2011/044186,、WO 2014/018863），例如，替換可變區中的不利氨基酸和/或在 TCR C 結構域之間引入二硫鍵以及去除不配對的半胱氨酸。
特別地，TCR 恒定結構域序列可透過截短或取代修飾，以刪除 TRAC 外顯子 2 的 Cys4 與 TRBC1或TRBC2 外顯子 2 的 Cys2 之間的天然二硫鍵。α 和/或 β 鏈恒定結構域序列也可透過用半胱氨酸殘基代替 TRAC 的 Thr 48和TRBC1或TRBC2 的 Ser 57 來修飾，所述半胱氨酸在 TCR 的 α和β恒定結構域之間形成二硫鍵。TRBC1或TRBC2 還可在恒定結構域的第 75 位置包含半胱氨酸至丙氨酸的突變，在恒定結構域的第 89 位置包含天冬醯胺至天冬氨酸的突變。相對於天然 TRAC和/或 TRBC1/2 序列，恒定結構域可另外或替代地包含其他突變、替代或刪除。術語 TRAC和TRBC1/2 包含天然多態變體，例如：TRAC 第 4 位置的 N 至 K (Bragado et al In!Immunol.1994 Feb;6(2):223-30)。
在一實施方案中，TCR 呈嵌合性。
本文的「嵌合 TCR」系指 TCR，其中 TCR 鏈包含來自多個物種的序列。優選情況為，本發明背景下的 TCR 可包含 α 鏈，其包含 α 鏈的人可變區和例如鼠 TCRα 鏈的鼠恒定區。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白為單鏈 TCR (scTCR) 或單鏈雙特異性抗體。在本實施方案中，第一多肽和第二多肽共價連接在一起，其中共價連接的定義見上文「定義」章節。
scTCR 可包含第一 TCR 鏈（例如，α 鏈）的可變區的多肽和整個（全長）第二 TCR 鏈（例如，β 鏈）的多肽，反之亦然。此外，scTCR 可以任選地包含一個或多個將兩個或多個多肽連接在一起的連接子。例如，連接子可以是肽，其將兩個單鏈連接在一起，如本文所述。還提供了本發明的 scTCR，其與人細胞因子如 IL-2、IL-7或IL-15 融合。
在一實施方案中，所述單鏈 TCR 為選自由 Vα-Lt -Vβ、Vβ-Lt -Vα、Vα-Ca-Lt -Vβ、Vα-Cb-Lt -Vβ、Vα-Lt -Vβ-Cb、Vα-Lt -Vβ-Ca、Vα-Ca-Lt -Vβ-Cb、Vα-Cb-Lt -Vβ-Ca、優選為 Vα-Lt -Vβ、Vβ-Lt -Vα 組成組的一種單鏈形式，其中 Vα 為上文所定義的第一可變結構域，其中 Vβ 為上文所定義的第二可變結構域，Ca和Cb 分別為存在或不存在的 TCR α和β恒定區，Lt 為存在或不存在且如上文「定義」章節中定義的連接子。
在一實施方案中，此類單鏈 TCR 可進一步包含至少一個另外的可變結構域，優選為一個或兩個另外的可變結構域（不論透過 C 還是 N-端連接）。
在一實施方案中，此類另外的可變結構域可透過另一連接子 Lk 連接。在一優選實施方案中，連接子 Lk 為上文所定義的連接子或氨基酸序列 SEQ ID NO: 114 的 CH1 -鉸鏈序列。
本發明還包括展示本發明抗原結合蛋白的顆粒，特別是 TCR，以及包含於顆粒文庫的所述顆粒。此類顆粒包括但不限於噬菌體、酵母、核糖體或哺乳動物細胞。產生此類顆粒和文庫的方法為本領域已知的（例如，參見 WO2004/044004；WO01/48145，Chervin et al.(2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184)。
此外，本發明的發明人在實施例（特別是實施例 3）中證明：本發明的抗原結合蛋白與靶抗原（即，與 MHC蛋白複合，優選與 HLA-A*02 複合的 MAGE-A抗原肽）高特異性結合，即，抗原結合蛋白與鑒定的表位特異性結合。
因此，本發明的抗原結合蛋白與 MAGE-A抗原肽特異性結合，所述 MAGE-A抗原肽包含SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成，其中所述抗原肽優選與 MHC蛋白複合，優選與 HLA-A*02 複合。更特別地，在一實施方案中，抗原結合蛋白與表位特異性結合，所述表位包含 SEQ ID NO: 1 的 MAGE-A抗原肽的至少三個或至少四個氨基酸位置或由其組成，優選為至少 3 個、至少4個氨基酸位置，優選為選自由 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列的氨基酸第 1、5、7和8 位置或 1、3、5、7和8 位置、尤其是第 1、5和7 位置組成的組的至少 3 個（例如，3或4 個）、優選為 3 個氨基酸。根據所使用的方法和所選的臨界值，確切表位的確定方法可能會略有不同。本發明的抗原結合蛋白具有主要與氨基酸第 1、5和7 位置結合這一性質，因此，不顯著與相似肽 NOMAP-1-0320、NOMAP-1-1223和ODC-001 結合。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白不會顯著地與 MAGE-A抗原肽變體結合，所述 MAGE-A抗原肽變體包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列或由其組成，其中第 1、5和7 位置中的至少一個、第 1、5、7和8 位置中的至少一個或第 1、3、5、7和8 位置中的至少一個被取代，優選被取代為丙氨酸。
在本發明的抗原結合蛋白背景下（特別是 TCR 或其片段或雙特異性 TCR 及其片段，例如 T細胞表達的抗原結合蛋白），「不顯著與……結合」通常表示在功能性分析（例如，在 TCR 激活分析中，諸如上述 IFN-γ 釋放）中，優選在相同實驗條件下，反應（例如，針對例如抗原肽變體檢測到的信號）為反應（即，針對由SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」組成的 MAGE-A 肽獲得的信號）的 30% 以下、25% 以下、20% 以下、15% 以下，優選為 30% 以下。在本發明的抗原肽變體和抗原結合蛋白背景下，特別是本發明的可溶性抗原結合蛋白背景下，「不顯著與……結合」通常表示，優選在相同實驗條件下，結合測定法（例如生物膜層干涉術）中針對抗原肽變體測定的 KD 與針對由SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」組成的 MAGE-A 肽測定的 KD 相比，可增加 3 倍以上、3.5 倍以上、4 倍以上、4.5 倍以上、5 倍以上，優選為 3 倍以上，例如 3 至 10 倍，其中針對抗原肽變體獲得的信號優選為背景信號，其中抗原肽變體或 MAGE-A 肽與 MHC 分子複合。
根據上述內容，在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白（特別是可溶性抗原結合蛋白）與上文所述以 MHC蛋白複合體的形式（優選為 HLA-A*02 複合體的形式）的 MAGE-A抗原肽變體結合的親和力比對特定抗原（即，本發明背景下所述的 MAGE-A抗原肽，其與 MHC蛋白複合，優選為與HLA-A*02 複合）的親和力降低，並且其中對 MAGE-A抗原肽變體複合體的相應 KD 增加 3 倍以上、3.5 倍以上、4 倍以上、4.5 倍以上、5 倍以上，優選為 3 倍以上，例如 3 至 10 倍。術語「親和力」和「KD 」的定義見上文「定義」章節。
MHC蛋白（特別是 MHC I 類和HLA-A*02 蛋白）的定義見上文「定義」章節。
在一實施方案中，本發明抗原結合蛋白的特徵在於具有親和力成熟的抗原結合蛋白，其能夠特異性地和任意選擇性地與 MAGE-A抗原肽/MHC 複合體結合。
本發明的抗原結合蛋白與上文指定的 MAGE-A抗原肽複合體特異性結合，更特別地與上文定義的 SEQ ID NO: 1 表位結合，並且可區分其各自的靶標即 MAGE-抗原肽以及其不與之顯著結合的其他類似肽。
術語「特異性」或「特異性結合」表示抗原結合蛋白將其與之結合的靶標肽序列（「表位」）和相似表位、肽或蛋白區分開來的能力，即，抗原結合蛋白與第一抗原「特異性結合」時，其對第二抗原就不發生顯著的交叉反應。
在本發明背景下的「類似肽」也可以稱為「脫靶物」，涉及長度通常包含 8 至 16 個氨基酸的肽。本發明背景下的類似肽通常由 MHC 提呈。此外，本發明背景下的類似肽包含與 MAGE-A抗原肽的氨基酸序列相似的氨基酸序列或由其組成，更特別地，與 MAGE-A抗原肽表位相比，這些肽包含表位，其中與構成相應 MAGE-A 肽表位的氨基酸相比，一些或所有氨基酸的氨基酸的生化/生物物理特性相同和/或相似。由於這種序列相似性，類似肽可能會被抗原結合蛋白結合，在這種情況下，例如，如果類似肽由 MHC蛋白提呈並因此被抗原結合蛋白（如 TCR）結合，則給定的抗原結合蛋白（例如 TCR）與類似肽結合的能力不會導致所需的 T細胞反應，但可能導致不良反應。此類不良反應可能為「腫瘤外」副作用，例如在 Lowdell 等人 2018 年 12 月 4 日發表的《細胞療法》(Cytotherapy) 第 7 頁報告的與健康組織肽交叉反應的特定 TCR 的交叉反應。本發明背景下的類似肽選自例如正常組織提呈的 HLA-A*02 結合肽的數據庫（XPRESIDENT 數據庫），依據是，基於例如對 MAG-003 的高度序列相似性（相似性 BLAST 搜索）。由於這些不良反應，本發明的抗原結合蛋白因此被改造以避免與類似肽（特別是下面列出的類似肽）結合。
因此，本發明背景下的相似肽選自由以下肽組成的列表：由 SEQ ID NO: 23 的氨基酸序列組成的肽 RABGAP1L-001、由 SEQ ID NO: 24 的氨基酸序列組成 AXIN1-001、由 SEQ ID NO: 25 的氨基酸序列組成的 ANO5-001、由 SEQ ID NO: 26 的氨基酸序列組成的 TPX2-001、由 SEQ ID NO: 27 的氨基酸序列組成的 SYNE3-001、由 SEQ ID NO: 28 的氨基酸序列組成的MIA3-001、由 SEQ ID NO: 29 的氨基酸序列組成的 HERC4-001、由 SEQ ID NO: 30 的氨基酸序列組成的 PSME2-001、由 SEQ ID NO: 31 的氨基酸序列組成的 HEATR5A-001、由 SEQ ID NO: 32 的氨基酸序列組成的 CNOT1-003、由 SEQ ID NO: 33 的氨基酸序列組成的 TEP1-003、由 SEQ ID NO: 34 的氨基酸序列組成的 PITPNM3-001、由 SEQ ID NO: 129 的氨基酸序列組成的 ZFC-001、由 SEQ ID NO: 171 的氨基酸序列組成的 INTS4-002、由 SEQ ID NO: 172 的氨基酸序列組成的 SAMH-001、由 SEQ ID NO: 173 的氨基酸序列組成的PPP1CA-006、由 SEQ ID NO: 174 的氨基酸序列組成的 RPL-007、由 SEQ ID NO: 175 的氨基酸序列組成的 SETD1A-001、由 SEQ ID NO: 176 的氨基酸序列組成的 NOMAP-1-0320、由 SEQ ID NO: 177 的氨基酸序列組成的 NOMAP-1-1223、由 SEQ ID NO: 178 的氨基酸序列組成的 ODC-001、由 SEQ ID NO: 179 的氨基酸序列組成的 COL6A3-010、由 SEQ ID NO: 180 的氨基酸序列組成的 FAM115A-001、由 SEQ ID NO: 181 的氨基酸序列組成的 PHTF2-001、以及由 SEQ ID NO: 181 的氨基酸序列組成的 RPP1-001。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白，特別是 TCR 或其片段或雙特異性 TCR 及其片段，例如 T細胞表達的抗原結合蛋白，不結合或不顯著結合於至少 1 個，例如至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個，例如 1、2、3、4、5 個，優選為至少 3 個，或 3 個或所有選自由 RABGAP1L-001、AXIN1-001、ANO5-001、TPX2-001、SYNE3-001、MIA3-001、HERC4-001、PSME2-001、HEATR5A-001、CNOT1-003、TEP1-003、PITPNM3-001，優選為HEATR5A-001、HERC4-001和CNOT1-003 組成的列表中的類似肽，條件是：當所述類似肽與 MHC蛋白形成複合體，優選與 HLA-A*02 複合時。這在本發明背景下是重要的優點，因為與類似肽（即，脫靶）結合可能會增加副作用的風險，因此，本發明的抗原結合蛋白不與本文所列類似肽發生交叉反應這一事實使其成為一種有前景的抗癌治療藥物。
在類似肽的背景下和本發明抗原結合蛋白（特別是 TCR 或其片段或雙特異性 TCR 及其片段，例如，T細胞表達的抗原結合蛋白）的背景下，「不顯著與……結合」也可稱為「不交叉反應」，在本文中系指例如在功能測定中，與 MAGE-A 相比，抗原結合蛋白對類似肽/MHC 測得的功能反應，其中，抗原結合蛋白對類似肽/MHC 的反應是相同抗原結合蛋白在相同實驗環境下對 MAGE-A抗原肽/MHC 複合體的反應的 30% 以下、20% 以下、10% 以下、5% 以下，例如：8%、6%、5%，優選為 5%。在一實施例中，所述反應為表達所述抗原結合蛋白的 T細胞的功能性反應，且在類似肽背景下使用上文以及實施例 3和圖 5 所述的 IFN-γ 釋放測定法測定。
此外，在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白，特別是本發明的可溶性抗原結合蛋白不結合或不顯著結合於至少 1 個類似肽，例如至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個，例如 1、2、3、4、5 個，優選為至少 3 個，或 3 個或所有選自由 RABGAP1L-001、AXIN1-001、ANO5-001、TPX2-001、SYNE3-001、MIA3-001、HERC4-001、PSME2-001、HEATR5A-001、CNOT1-003、TEP1-003、PITPNM3-001、INTS4-002、SAMH-001、PPP1CA-006、RPL-007、SETD1A-001、NOMAP-1-0320、NOMAP-1-1223、ODC-001、COL6A3-010、FAM115A-001、PHTF2-001和RPP1-001，優選為 CNOT1-003、SYNE3-001、TPX2-001、PSME2-001，更優選為 SYNE3-001、TPX2-001、PSME2-001 組成的肽組中的類似肽，條件是：當所述類似肽與 MHC蛋白形成複合體，優選與 HLA-A*02 複合時。
在一實施例中，當 INTS4-002、SAMH-001、PPP1CA-006、RPL-007、SETD1A-001、NOMAP-1-0320、NOMAP-1-1223和ODC-001（例如 INTS4-002、SAMH-001、PPP1CA-006、RPL-007、SETD1A-001或NOMAP-1-0320、NOMAP-1-1223、ODC-001）、COL6A3-010、FAM115A-001、PHTF2-001和RPP1-001（例如 PPP1CA-006、RPL-007和SETD1A-001）與 MHC蛋白形成複合體時（優選為與 HLA-A*02 複合時），本發明的抗原結合蛋白（特別是本發明的可溶性抗原結合蛋白）不與所述相似肽結合或不顯著結合。
在類似肽的背景下以及在抗原結合蛋白（例如，本發明的可溶性抗原結合蛋白）的背景下，本文中「不顯著與……結合」的特徵在於親和力降低、解離速率較快和/或結合信號較低，特別是解離速率較快和/或結合信號較低。例如，在本發明的背景下，抗原結合蛋白對至少一個類似肽/MHC 複合體的結合反應小於 50%、小於 45%、小於 40%、小於 30%、小於 20%、小於 10%、小於 5%、小於 4% 或小於 3% 相同抗原結合蛋白對 MAGE-A抗原肽/MHC 複合體的結合反應，條件為：實驗環境相同、抗原結合蛋白濃度相同，和/或，例如，在本發明的背景下，抗原結合蛋白與至少一種類似肽/MHC 複合體結合，其親和力與其對特定抗原（即，本文所述的 MAGE-A抗原肽/MHC 複合體）的親和力相比下降，其中，對各類似肽的相應 KD 增加 5、7、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 倍，優選為 5、7、10、15、20、30、40、50、100 倍，優選為 20 至 100 倍，更優選為 30 至 100 倍，例如 40 至 100 倍，通常為 40 到 50 倍。例如，當抗原結合蛋白以 1 nM 的 KD 與 MAG-003/MHC 複合體結合，而抗原結合蛋白以 100 nM 的 KD 與例如RABGAP1L-001/MHC 複合體結合時，則抗原結合蛋白與 RABGAP1L-001/MHC 結合的 KD 增加 100 倍，因而親和力降低 100 倍。在這些實施例中，結合反應、解離常數和結合親和力優選使用例如實施例 4和5 中所述的生物膜層干涉技術來測量。在一些進一步的實施例中，抗原結合蛋白以與對特定抗原（即本文所述的 MAGE-A抗原肽/MHC 複合體）親和力相比較低的親和力與至少一種相似肽/MHC 複合體結合，其中，與特定抗原（即 MAGE-A抗原肽/MHC 複合體）的親和力相比，對 CNOT1-003、INTS4-002和SAMH-001 的各自 KD 增加了 1000 倍以上，對 COL6A3-010、PHTF2-001、RPP1-001和FAM115A-001 的 KD 增加了 500 倍以上，此時，KD 值通常例如採用生物層干涉法測量，如實施例 5 中所述。
在另一實施例中，抗原結合蛋白，例如 14-iso1-BMA(36)或114-iso2-UCHT1(17)，對 MHC 複合體中的 ODC-001、NOMAP-1-0320和NOMAP-1-1223 有結合反應，透過實施例 5 中所述的生物層干涉法測量時，反應小於 5%、小於 4%、小於 3%、小於 2%（例如小於 1.5%）。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白與包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列或由其組成的 MAGE-A抗原肽和 HLA 分子（優選為 HLA-A*02）特異性結合，其 KD ≤100 μM、≤50 μM、≤30 μM、≤25 μM、≤1 μM、≤500nM、≤100nM、≤ 50nM、≤10nM，優選為50pM 至 100μM、50pM 至 10μM、50pM 至 1μM，更優選為 50pM 至 500nM、50pM 至 100nM、50pM 至 50nM和50pM 至 10nM。因此，本發明的抗原結合蛋白對包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 1 或由其組成且與 HLA 分子（優選為 HLA-A*02）複合的 MAGE-A抗原肽的親和力 (KD ) 為 ≤ 200 nM、≤ 150 nM、≤ 120 nM、110 nM，優選為 ≤ 100 nM，特別是 50 pM 至 100 nM、100 pM 至 100 nM、1 nM 至 100 nM。「KD 」和「親和力」的定義見上文「定義」章節。
測量親和力（如 KD ）的方法為本領域技術人員已知的，包括：例如表面等離子體共振和生物膜層干涉法。如本領域技術人員所知，用於那些實驗的實驗條件（例如，所使用的緩衝液、蛋白質濃度）可能對結果產生影響。
在一相關實施方案中，本發明的抗原結合蛋白（特別是 TCR 或其片段或雙特異性 TCR 或其片段，例如：T細胞表達的抗原結合蛋白）對包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 1 或由其組成的 MAGE-A抗原肽與 HLA 分子的複合體的親和力  (KD ) 為 ≤100 μM、≤50 μM、≤30 μM、≤25 μM、≤1 μM，優選為 ≤ 25 μM，例如，500nM 至 100μM、500nM 至 50μM、500nM 至 25μM。
在一特定實施方案中，本發明的抗原結合蛋白是可溶的。可溶性抗原結合蛋白可包括但不限於，例如，抗體或其片段，或雙特異性抗體或其片段，TCR 片段或雙特異性 TCR 或scTCR。在一相關實施方案中，抗原結合蛋白（優選為可溶性）與包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 1 或由其組成的 MAGE-A抗原肽與 HLA 分子（優選為 HLA-A*02）的複合體結合，KD 為 ≤ 100 nM、≤ 50 nM、 ≤ 10 nM、≤ 1nM，例如，10pM 至 100 nM、10 pM 至 50 nM、10 pM 至 10 nM，特別是 50pM 至 100 nM、100 pM 至 50 nM、100 pM 至 10 nM。
因此，在一實施例中，本發明的抗原結合蛋白表達為例如上文所述的可溶性 TCER™，並分析其對 HLA-A*02/MAG-003 單體的結合親和力。通常，例如使用製造商推薦的設置在 Octet RED384 系統上進行測量。簡言之，通常在 30°C和例如 1000 rpm 轉速下以例如 PBS、0.05% 吐溫-20、0.1% BSA 用作緩衝液來測量結合動力學。抗原結合蛋白被載入至生物感測器（例如 FAB2G或AHC）上或在溶液中分析。
在一實施方案中，任選地與參考蛋白相比，本發明抗原結合蛋白的親和力增加。
本文的「參考蛋白」系指與本發明抗原結合蛋白進行比較的蛋白。在一實施方案中，參考蛋白直接作用於與本發明蛋白相同的靶標，即與 MHC蛋白複合的 MAGE-A抗原肽，更優選地，所述參考蛋白與對其進行比較的抗原結合蛋白具有相同的形式。在一特定實施方案中，參考蛋白與對其比較的抗原結合蛋白具有相同的形式，並且參考蛋白包含親本 TCR R7P1D5 的 CDR或α和β 可變結構域。
如本文所公開的，本發明的抗原結合蛋白識別和/或結合於包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成的 MAGE-A抗原肽與 HLA 分子（優選為 HLA-A*02）的複合體。因此，MAG-003和HLA 分子存在於 I 類主要組織相容性複合體 (MHC) 中，並且抗原結合蛋白與所述複合體的結合可在結合後引發免疫反應。在一些實施方案中，與參考蛋白誘導的免疫反應相比，本發明抗原結合蛋白誘導的免疫反應增加。
因此，在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白誘導免疫反應，優選為其中免疫反應的特徵在於干擾素 (IFN) γ 水平增加。因此，在一實施例中，免疫反應的特徵可透過優選使用 IFN-γ 釋放測定法測定的 EC50 值來描述。
在一實施方案中，抗原結合蛋白的 EC50 [nM] 值（優選由 IFN-γ 釋放法測定）低於參考蛋白的 EC50 ，優選為抗原結合蛋白的 EC50 [nM] 值比參考蛋白的 EC50 [nM] 值低 2 倍，優選為低 2、3、4、5、6、7、8 倍（例如，低 2 至 9 倍），並且其中 EC50 值為 MHC（優選為 HLA-A*02）表達細胞上測定的最大 IFN-γ釋放量一半的濃度 [nM]，所述 MHC 表達細胞優選為載有 SEQ ID NO: 1 的抗原肽。在一實施例中，所指的 EC50 通常透過 ELISA 法測定，例如，在電穿孔的 CD8+ T細胞與載有連續稀釋的 MAGE-A抗原肽（優選為 SEQ ID NO: 1 的 MAGE-A抗原肽）的 T2 細胞共培養後測定。優選為參考蛋白和與之比較的抗原結合蛋白具有相同的形式，且參考蛋白包含親本 TCR R7P1D5 的 CDR或α和β 可變結構域，其中 EC50 優選在相同的實驗環境中測定。
在一實施方案中，抗原結合蛋白對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 值（優選透過 IFN-γ 釋放測定法或 LDH 釋放測定法測定）小於 100nM、小於 50nM、小於 10nM、小於 900pM、小於 500pM、小於 300pM、小於 200pM、小於 150pM、小於 100pM、小於 50pM、小於 20pM、小於 10pM，例如 0.1nM 至 20nM，例如 0.5nM 至 15nM、0.8nM 至 12nM、0.8nM 至 10nM 或例如 1pM 至 150pM、1 至 100pM、1 至 50pM、1 至 20pM。
在一實施方案中，抗原結合蛋白為 TCR 並且對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 值（優選透過 IFN-γ 釋放測定法測定）小於 12nM、小於 10nM、小於 9nM、小於 8nM、小於 6nM、小於 4nM，例如 0.1nM 至 20nM，例如 0.5nM 至 15nM、0.8nM 至 12nM、0.8nM 至 10nM。
在此實施方案中，EC50 使用表達本發明不同抗原結合蛋白的 CD8+ T細胞（20,000 個細胞/孔）測定，並透過 T2 細胞（20,000 個細胞/孔）共同培養後釋放的 IFN-γ 水平進行測定，所述 T2 細胞載入有稀釋系列的 MAG-003 (SEQ ID NO: 1)。
在一實施方案中，抗原結合蛋白為一種可溶性分子，例如，TCER™，並對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 值小於 200pM、小於 150pM、小於 100pM、小於 50pM、小於 20pM、小於 10pM、1pM 至 150pM、1pM 至 100pM、1pM 至 50pM、1pM 至 20 pM。在此實施方案中，EC50 使用表達本發明不同抗原結合蛋白的CD8+ T細胞（20,000 個細胞/孔）並用在內源性水平下提呈 MAG-003 的腫瘤細胞系共培養後確定釋放 LDH 水平來測定，優選為細胞系為在表面上提呈約 1071 個與 MHC蛋白複合的 MAG-003 肽的 Hs695T，優選為細胞系為在表面上提呈約 3918 個與 MHC蛋白複合的 MAG-003 肽的 NCI-H1755，或優選為細胞系為在表面上提呈約 125 個與 MHC蛋白複合的 MAG-003 肽的 U2OS。
本發明的抗原結合蛋白具有高安全性特徵。
本文中「安全性特徵」系指區分腫瘤細胞與健康組織細胞的能力，這通常透過測定安全窗來確定。
本文中的「安全窗」或「治療窗」系指誘導腫瘤細胞系中 100% 細胞毒性所需化合物的一半最大濃度與誘導健康組織細胞中 100% 細胞毒性所需化合物的一半最大濃度相比的倍數。如果對於相關抗原結合蛋白，針對腫瘤細胞系測定的 EC50 為 1pM 而針對例如原代細胞測定的 EC50 值為 1000pM，則安全窗為 1000，這是因為針對腫瘤細胞系的 EC50 比針對原代細胞的 EC50 小 1000 倍。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 比針對健康組織細胞的 EC50 高 ≥100、≥500、≥1000、≥2000、≥3000、≥4000、≥5000、≥6000、≥ 8000、≥ 10000 倍，例如，針對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 比針對健康組織細胞的 EC50 值高 500 至 12000 倍，優選為高 1000 至 10000 倍。
本文中的「MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞」系指在其表面提呈 MAGE-A 肽/MHC 複合體的細胞，其中所述 MAGE-A/MHC 複合體的拷貝數通常可透過本領域技術人員熟知的方法測定。在一實施方案中，MAGE-A/MHC 複合體為靶細胞，例如：癌細胞，其中所述癌症的定義見下文「治療方法和用途」章節。在本發明的背景下，與正常（健康）組織細胞表面上的所述複合體水平相比，MAGE-A 肽/MHC 複合體在 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞（特別是癌細胞）的細胞表面上過度提呈。「過度提呈」意指 MAGE-A/MHC 複合體提呈水平至少為健康組織提呈水平的 1.2 倍；優選為至少為健康組織或細胞提呈水平的 2 倍，更優選為 5 倍至 10 倍。
在一實施方案中，MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的MAGE-A/MHC 複合體拷貝數大於 50、大於 80、大於 100、大於 120、大於 150、大於 300、大於 400、大於 600、大於 800、大於 1000、大於 1500、大於 2000，優選為 MAGE-A/MHC 拷貝數為 50 至 2000，例如，80 至 2000，例如，100 至 2000，例如，120 至 2000。
本文中的「拷貝數」系指細胞（如 MAGE-A/MHC 提呈細胞，例如：癌細胞或健康細胞）的細胞表面上提呈的本發明背景下定義的 MAGE-A/MHC 複合體數。蛋白質的拷貝數可透過多種本領域已知的方法來測定，包括用螢光標記的抗原結合蛋白對患病細胞進行 FACS 分析。
本文中的「健康細胞」系指無癌細胞的細胞，優選為本文中的健康細胞系指在 MAGE-A/MHC 提呈細胞周圍的組織細胞、在 MAGE-A/MHC 複合體提呈癌細胞周圍的組織細胞。但是，在某些情況下，健康細胞也可能在其表面表達和提呈 MAGE-A/MHC 複合體。通常情況下，如本領域技術人員瞭解的，在本發明背景下的健康細胞中 MAGE-A/MHC 複合體提呈數量（拷貝數）比在癌細胞中少。
健康細胞優選為選自由星形細胞、GABA 神經元、心肌細胞、心臟微血管內皮細胞、軟骨細胞、冠狀動脈內皮細胞、皮膚微血管內皮細胞、間充質幹細胞、鼻上皮細胞、外周血單核細胞、肺動脈平滑肌細胞（優選為 GABA 神經元、心肌細胞、心臟微血管內皮細胞、軟骨細胞、冠狀動脈內皮細胞、鼻上皮細胞、外周血單核細胞、肺動脈平滑肌細胞）組成的組。
在一實施方案中，抗原結合蛋白對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 比對健康細胞的 EC50 值高 ≥ 1000、≥ 15000、≥ 9000 倍，優選為健康細胞選自由星形膠質細胞、GABA 神經元、心肌細胞、心臟微血管內皮細胞、軟骨細胞、冠狀動脈內皮細胞、皮膚微血管內皮細胞、間充質幹細胞、鼻上皮細胞、外周血單核細胞、肺成纖維細胞、氣管平滑肌細胞、表皮角質形成細胞、腎皮質上皮細胞和肺動脈平滑肌細胞，優選為星形膠質細胞、GABA 神經元、心肌細胞、心臟微血管內皮細胞、軟骨細胞、冠狀動脈內皮細胞、皮膚微血管內皮細胞、間充質幹細胞、鼻上皮細胞、外周血單核細胞和肺動脈平滑肌細胞，更優選為 GABA 神經元、心肌細胞、心臟微血管內皮細胞、軟骨細胞、冠狀動脈內皮細胞、鼻上皮細胞、外周血單核細胞、肺動脈平滑肌細胞組成的組。
在一優選實施方案中，抗原結合蛋白對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的EC50 比針對健康細胞的 EC50 值高 ≥9000或 ≥10000 倍，其中優選情況為，所述健康細胞選自由iPSC 衍生星形膠質細胞、GABA 神經元、心肌細胞、成骨細胞、肺成纖維細胞、氣管平滑肌細胞、表皮角質形成細胞和腎皮質上皮細胞組成的組。
因此，在一實施方案中，健康細胞的 MAGE-A/MHC 複合體拷貝數小於 50、小於 20、小於 10，優選為 MAGE-A/MHC 複合體拷貝數小於 10，優選為 MAGE-A/MHC 複合體拷貝數介於 0 至 10 之間。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 比針對類似肽/MHC 提呈細胞的 EC50 高 ≥100、≥500、≥1000、≥2000、≥3000、≥4000、≥5000、≥6000 倍，例如，針對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 比針對類似肽/MHC 提呈細胞的 EC50 值高 500 至 12000 倍，優選為高 1000 至 12000 倍。
「類似肽」的定義見上文。
因此，類似肽/MHC 提呈細胞是在其細胞表面上提呈類似肽/MHC 複合體的細胞。
在一實施方案中，類似肽/MHC 提呈細胞的類似肽/MHC 拷貝數大於 10、大於 20、大於 40、大於 50、大於 80、大於 100、大於 120、大於 150、大於 300、大於 400、大於 500、大於 800，優選為類似肽/MHC 拷貝數為 50 至 1000，例如，50 至 8000，例如，50 至 500，例如，100 至 500。
本發明提出了抗原結合蛋白，其能夠在體內誘導腫瘤消退，更特別地在受測條件下完全消退。抗原結合蛋白的製備和評價採用不同劑量，針對植入移植有人 PBMC的雌性 NOG 小鼠中的可測量 HS695T 腫瘤異種移植物（參見實施例 7）。TCER™ 靶向 MAG-003（SEQ ID NO: 127和130，第 3 組；SEQ ID NO: 135和136，第 4 組）從第 18 天至研究結束（第 25 天）在所有小鼠中誘導了 Hs695T 腫瘤完全緩解，相比之下，隨機分配當天的基礎水平為 86 mm3 （第 3 組）和 80 mm3 （第 4 組）。
因此，在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白抑制或減少了腫瘤生長，更特別地，本發明的抗原結合蛋白減少腫瘤的平均腫瘤體積大於 80%、大於 85%、大於 90%、大於 92%、大於 94%、大於 96%、大於 98%、大於 99%，例如，95% 至 100%、96% 至 100%、98% 至 100%，例如，98%、99%或100%，優選為 100%，其中所述腫瘤為下文「治療方法和用途」章節中定義的癌症。在一實施例中，抗原結合蛋白誘導了癌症腫瘤的完全緩解，其中癌症如下文所定義，例如，人腫瘤細胞系 HS695T。
在一實施方案中，本發明抗原結合蛋白的半衰期 (T1/2 ) 為 6 至 7 天，例如 6或7天。
從實施例，特別是實施例 1 和圖 1 中可進一步看出，天然 TCR（例如天然 TCR R7P1D5）既不能在酵母中也不能在 CHO 細胞中以可溶性形式表達。與此相反，本發明的抗原結合蛋白（特別是 TCER™ 分子，優選為本文所述的優選 TCER™ 分子）不僅可溶，而且還可在 CHO 細胞中以 ＞ 10mg/L（細胞培養物）、＞ 20mg/L 甚或 40mg/L 的量進行暫態表達。因此，在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白可在宿主細胞中以高產量表達，其中優選宿主細胞為 CHO 細胞，並且其中優選產量大於 10、大於 15、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45 mg/L（細胞培養物），例如，5 至 50、5 至 45、5 至 40、5 至 35、10 至 35、10 至 30、10 至 25、10 至 20 mg/L（細胞培養物）。在一實施例中，抗原結合蛋白在暫態轉染的 CHO-S 細胞中表達，其中，細胞在總體積為 320 mL 的 GE HealthcareTM 培養基中培養，培養條件為 T=0、密度 4x106 /mL、37°C。一天後，添加進料溶液（CellBoost 7a和b），溫度降低至 32°C。在培養總共 12 天和進料 3 次後收穫了細胞並因此收穫了抗原結合蛋白。
從實施例中可進一步看出，發明人例如在實施例 4和5 中證明，與參考蛋白（例如與包含天然 TCR R7P1D5 的CDR、優選為包含所述天然 TCR R7P1D5 框架區的抗原結合蛋白）相比，本發明的抗原結合蛋白改善了穩定性。
因此，在一實施方案中，與參考蛋白相比，本發明的抗原結合蛋白改善了穩定性。在本發明的背景下，穩定性改善系指，例如，當暴露於熱應力時物理穩定性增加。因此，本發明的新開發抗原結合蛋白可比參考抗原結合蛋白更好地耐受應力條件，特別是熱應力。
本發明背景下的術語「穩定性」系指物理穩定性，並且可以使用本領域中描述的各種分析技術進行定性和/或定量評估，綜述參見，例如，Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs.(1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993)。在本發明的背景下，這些方法特別涉及評估聚集物形成（例如：使用尺寸排阻色譜法、透過測量濁度和/或透過目視檢查）。為了測量穩定性，可在穩定性研究中測試包含本發明抗原結合蛋白的樣本，其中樣本在選定時間段內被暴露於應力條件，然後使用適當的分析技術對化學和物理穩定性進行定量和任選進行定性分析。
在一實施方案中，例如，當暴露於應力條件下一定時間，例如：暴露於 40℃ 的溫度下 14 天後，本發明的抗原結合蛋白具有物理穩定性。
在本發明的背景下，「物理穩定性」基本上系指抗原結合蛋白無聚集、沉澱和/或變性跡象。
評估物理穩定性的方法的實例如：尺寸排阻色譜法 (SEC)、動態光散射法 (DLS)、光遮蔽法 (LO) 以及顏色和淨度（例如，透過目視檢查法確定）。
「無聚集跡象」意指，例如，包含抗原結合蛋白的樣本在緩衝液（如 PBS）中暴露於應力條件（例如 40°C 的溫度）14 天後，單體含量大於 80%、大於 86%、大於 88%、大於 90%、大於 92%、大於 94%、大於 96%、 大於 97%、大於 98%、大於 99%，例如，當透過 SEC（例如SEC-HPLC）在緩衝液（例如 PBS）中測量時，單體含量為 94% 至 99%、95% 至 99%、96% 至 99%、97% 至 99%。
因此，在一實施方案中，與參考蛋白相比，本發明的抗原結合蛋白例如在暴露於應力條件下時聚集性降低。
使用尺寸排阻色譜法 (SEC) 時，根據所用的色譜柱、操作壓力和緩衝液流速，在受測條件下，1%、2%、3%、4%，優選為 1%或2%（例如 2%）的單體含量差異在本發明背景下被視為具有顯著差異。
這意味著，當參考抗原結合蛋白的單體含量為 96% 而本發明抗原結合蛋白的單體含量為 97% 時，本發明抗原結合蛋白的單體含量具有顯著差異，因此，在相同條件下測量時，與參考抗原結合蛋白相比顯著增加。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白在暴露於應力條件後聚集性降低，更特別地，當在暴露於所述應力條件之前和之後測量應力誘導的聚集體時，本發明的抗原結合蛋白的聚集小於 10%、小於 4%、小於 3%、小於 2%。
核酸、載體和重組宿主細胞
本發明的另一個目的涉及一種分離的核酸序列，其包含編碼上文定義的本發明抗原結合蛋白的序列或由其組成。
通常情況下，所述核酸為 DNA或RNA分子，其可以包含於任何合適的載體（例如：質粒、粘粒、附加體、人工染色體、噬菌體或病毒載體）中。
術語「載體」、「克隆載體」和「表達載體」意指可將 DNA或RNA 序列（例如，外源基因）引入宿主細胞以轉化宿主並促進所引入序列表達（例如，轉錄和翻譯）的載體。
因此，本發明的另一個目的涉及包含本發明核酸的一種載體。
此類載體可包含調節元件，諸如啟動子、增強子、終止子等，以在受試者給藥後引起或對準所述多肽的表達。用於動物細胞表達載體的啟動子和增強子實例包括 SV40 的早期啟動子和增強子 (Mizukami T. et al. 1987)、Moloney 小鼠白血病病毒的 LTR 啟動子和增強子 (Kuwana Y et al. 1987)、免疫球蛋白 H 鏈的啟動子(Mason JO et al. 1985) 和增強子 (Gillies SD et al. 1983) 等。
只要可以插入和表達編碼人抗體 C 區的基因，即可使用任何動物細胞的表達載體。合適的載體實例包括 (Miyaji H et al. 1990)、pAGE103 (Mizukami T et al. 1987)、pHSG274 (Brady G et al. 1984)、pKCR (O'Hare K et al. 1981)、pSG1 ¦Β d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 等。質粒的其他實例包括：包含複製起點的複製質粒或整合質粒，例如 pUC、pcDNA、pBR 等。
病毒載體的其他實例包括腺病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒和 AAV 載體。此類重組病毒可透過本領域已知的技術生產，例如：透過轉染包裝細胞或透過以輔助質粒或病毒暫態轉染。病毒包裝細胞的典型實例包括 PA317 細胞、PsiCRIP 細胞、GPenv+ 細胞、293 細胞等。產生此類複製缺陷的重組病毒的詳細方案可參見，例如：WO95/14785、WO96/22378、US5,882,877、US6,013,516、US4,861,719、US5,278,056和WO94/19478。
術語「病毒載體」系指核酸載體構建體，其包括至少一種病毒來源的元件，有被包裝入病毒載體顆粒的能力，並編碼至少一種外源核酸。載體和/或顆粒可用於在體外或體內將任何核酸轉移至細胞之目的。多種形式的病毒載體為本領域已知。
術語「病毒體」指單個感染性病毒顆粒。「病毒載體」、「病毒載體顆粒」和「病毒顆粒」也指具有其 DNA或RNA 核心和蛋白質外殼的完整病毒顆粒，因為該病毒存在於細胞外部。例如，病毒載體可選自腺病毒、痘病毒、α 病毒、暈病毒、黃病毒、彈狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、皰疹病毒、副粘病毒或微小核糖核酸病毒。
病毒可指天然存在的病毒以及人造病毒。根據本發明一些實施方案的病毒可能是包膜病毒或無包膜病毒。細小病毒（例如 AAV）是無包膜病毒的實例。在一優選實施方案中，病毒可能是包膜病毒。在優選實施方案中，病毒可能是逆轉錄病毒，特別是慢病毒。可以促進真核細胞病毒感染的病毒包膜蛋白可能包括 HIV-1 衍生慢病毒載體 (LV)，這些載體用水皰性口炎病毒 (VSV-G) 的包膜糖蛋白 (GP)、修飾的貓內源性逆轉錄病毒 (RD114TR) 和修飾的長臂猿白血病病毒 (GALVTR) 處理成為假型。這些包膜蛋白可以有效地促進其他病毒的進入，例如細小病毒，包括腺相關病毒 (AAV)，從而證明它們的廣泛效率。例如，可使用其他病毒包膜蛋白，包括莫洛尼鼠白血病病毒 (MLV) 4070 env（如 Merten et al., J. Virol. 79:834-840, 2005 一文中所述；其內容透過引用併入本文）、RD114 env、嵌合包膜蛋白 RD114pro或RDpro（透過用 HIV-1 基質/衣殼 (MA/CA) 切割序列取代 RD114 的 R 肽切割序列構建的 RD114-HIV嵌合體，如 Bell et al. Experimental Biology and Medicine 2010; 235:1269-1276 一文中所述；其內容透過引用併入本文）、桿狀病毒 GP64 env（如 Wang et al. J. Virol. 81:10869-10878, 2007 一文中所述；其內容透過引用併入本文）或 GALV env（如 Merten et al., J. Virol. 79:834-840, 2005 一文中所述；其內容透過引用併入本文）或其衍生物。
本發明的另一目的涉及用根據本發明的核酸和/或載體轉化、轉導或轉染的宿主細胞。
術語「轉化」原先系指基因轉移入宿主細胞中的自然過程，所述過程涉及細胞透過細胞膜吸收基因物質（例如：核酸，如 DNA或RNA），從而使宿主細胞表達引入的基因或序列以產生所需的物質，所述物質通常為引入基因或序列編碼的蛋白質或酶。有兩種類型的轉化，稱為自然轉化以及人工或誘導轉化。人工或誘導轉化方法在實驗室條件下進行，通常稱為轉染。
透過轉化過程接受和表達外源核酸（例如，DNA或RNA）的宿主細胞已被「轉化」。
術語「轉染」系指基因轉移的一種方式，涉及在宿主細胞的細胞膜上創建孔，使宿主細胞能夠接收外來基因物質。通常情況下，轉染系指真核細胞（例如，昆蟲或哺乳動物細胞）的轉化。化學介導的轉染涉及使用例如磷酸鈣或陽離子聚合物或脂質體。非化學介導的轉染方法通常為電穿孔、聲穿孔、穿刺轉染、光學轉染或水動力遞送。基於顆粒的轉染使用基因槍技術，其中納米顆粒用於將核酸轉移至宿主細胞，或透過另一種稱為磁轉染的方法。核轉染和使用熱休克是成功轉染的另外的演變方法。透過轉染方法接收外來核酸的宿主細胞已被「轉染」。
術語「轉導」通常理解為涉及將外來核酸（例如，DNA或RNA）透過病毒或病毒載體轉移至細胞中。透過病毒或病毒載體接受和表達外來核酸（例如，DNA或RNA）的宿主細胞已被「轉導」。
在一些實施方案中，可使用 US20190216852 描述的方法轉導細胞，該專利內容透過引用整體併入本文。
本發明的核酸可用於在合適的表達系統中產生本發明的重組抗原結合蛋白。
本發明的核酸可用於在合適的表達系統中產生本發明的重組抗原結合蛋白。
術語「表達系統」意指合適條件下的宿主細胞和相容性載體，例如，用於表達由載體攜帶並引入宿主細胞的外來 DNA 編碼的蛋白質。
常見的表達系統包括：大腸桿菌宿主細胞和質粒載體、昆蟲宿主細胞和桿狀病毒載體以及哺乳動物宿主細胞和載體。宿主細胞的其他實例包括但不限於：原核細胞（例如，細菌）和真核細胞（例如，酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等）。特定的實例包括：大腸桿菌、克魯維酵母或釀酒酵母、哺乳動物細胞系（例如，Vero 細胞、CHO 細胞、3T3 細胞、COS 細胞等）以及原代或確定的哺乳動物細胞培養物（例如，由淋巴母細胞、成纖維細胞、胚胎細胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞等形成的培養物）。實例還包括：小鼠 SP2/0-Ag14 細胞 (ATCC CRL1581)、小鼠 P3X63-Ag8.653 細胞 (ATCC CRL1580)、CHO 細胞（其中二氫葉酸還原酶基因（下稱「DHFR基因」）有缺陷，Urlaub G et al; 1980）、大鼠 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 細胞（ATCC CRL1662，下稱「YB2/0 細胞」）等。在一些實施方案中，可優選 YB2/0 細胞，這是因為當嵌合或人源化抗體在該細胞中表達時，其 ADCC 活性增強。
本發明還涉及包含根據本發明的抗原識別構建體的宿主細胞。具體地，本發明的宿主細胞包含如上所述的核酸或載體。宿主細胞可以是真核細胞，例如植物、動物、真菌或藻類，也可以是原核細胞，例如細菌或原生動物。宿主細胞可以是培養細胞或原代細胞，即直接從生物體（例如人）分離。宿主細胞可以是貼壁細胞或懸浮細胞（即，在懸浮液中生長的細胞）。為了產生抗原結合蛋白（例如，重組 TCR、多肽或蛋白）之目的，宿主細胞優選為哺乳動物細胞。最優選地，宿主細胞為人細胞。雖然宿主細胞可以是任何細胞類型，可以來自任何類型的組織，可以是任何發育階段的細胞，但是宿主細胞優選為外周血白細胞 (PBL) 或外周血單核細胞 (PBMC)。更優選地，宿主細胞為 T細胞。T細胞可以是任何 T細胞，諸如培養的 T細胞，例如，原代 T細胞或來自培養 T細胞系的 T細胞，例如 Jurkat、SupT1 等，或獲得自哺乳動物的 T細胞，優選為來自人類患者的 T細胞或 T細胞前體。如果獲得自哺乳動物，T細胞可從許多來源獲得，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或液體。T細胞還可以是富集或純化的。優選地，T細胞為人 T細胞。更優選地，T細胞是分離自人的 T細胞。T細胞可以是任何類型的 T細胞並且可以是任何發育階段的，包括但不限於 CD4 陽性和/或 CD8 陽性、CD4 陽性輔助 T細胞，例如，Th1和Th2 細胞、CD8-陽性 T細胞（例如，細胞毒性 T細胞）、腫瘤浸潤細胞 (TIL)、記憶 T細胞、幼稚 T細胞等。優選地，T細胞為 CD8 陽性 T細胞或 CD4 陽性 T細胞。宿主細胞優選為對表達 MAGEA4 和/或 MAGEA8的腫瘤細胞具有特異性的腫瘤反應性 T細胞。
根據以上內容，在一實施方案中，本發明涉及一種包含上文定義的本發明抗原結合蛋白或本發明核酸或載體的宿主細胞，其中所述宿主細胞優選為 a) 淋巴細胞，諸如 T 淋巴細胞或 T 淋巴細胞祖細胞，例如：CD4或CD8 陽性 T細胞，或b) 用於重組表達的細胞，諸如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
特別是，為了表達本發明的一些抗原結合蛋白，表達載體的類型可以是：其中編碼第一多肽（例如，抗體重鏈或 α 鏈）的基因和編碼第二多肽（例如，抗體輕鏈或 β 鏈）的基因存在於分開的載體上；也可以是這樣的類型：其中兩種基因都存在於同一載體上（串聯型）。從構建抗原結合蛋白表達載體的容易程度、引入動物細胞的容易程度以及動物細胞中抗體 H和L 鏈表達水平之間的平衡方面考慮，優選串聯型人源化抗體表達載體 (Shitara K et al.J Immunol Methods.1994 Jan. 3; 167(1-2):271-8)。串聯型人源化抗體表達載體的實例包括：pKANTEX93 (WO 97/10354)、pEE18 等。
在一實施方案中，此類重組宿主細胞可用於產生至少一種本發明的抗原結合蛋白。
產生本發明抗原結合蛋白的方法
本發明還涉及產生上文定義的抗原結合蛋白的方法，其包含 a.       提出合適的宿主細胞， b.       提出一種基因構建體，其包含編碼本發明抗原結合蛋白的編碼序列， c.       將所述基因構建體引入所述合適的宿主細胞，和 d.       由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體，且任選地 e.       選擇表達和/或分泌所述抗體的細胞。
本發明的抗原結合蛋白的定義見相應章節。
本文的「基因構建體」表示可在宿主中表達編碼區的核酸，因此系指核酸（如上文所述的載體）或 RNA。
在一實施方案中，所述方法可能進一步包括在所述合適宿主細胞上進行細胞表面提呈所述抗原識別構建體的步驟。
在其他的優選實施方案中，b) 中的基因構建體包含編碼本發明抗原結合蛋白的核酸。此類核酸的定義見上文「核酸、載體和重組宿主細胞」章節。
在一相關實施方案中，所述基因構建體是包含與所述編碼序列可操作地連接的啟動子序列的表達構建體。
在一相關實施方案中，使用轉化、轉導或轉染方法將基因構建體引入合適的宿主。轉化、轉導或轉染的定義見上文相關章節。
理想情況是，用於將基因構建體引入所述合適宿主細胞的轉染系統為上文核酸、載體和重組宿主細胞章節中所述的逆轉錄病毒或慢病毒載體系統。此類系統是本領域技術人員所熟知的。
在一實施方案中，所述方法進一步包括從宿主細胞中分離和純化抗原結合蛋白，以及任選地在 T細胞中重建抗原結合蛋白。
本發明的抗原結合蛋白可透過本領域已知的任何技術產生，例如但不限於，任何化學、生物學、基因學或酶學技術，可以單獨或組合使用。
在一些特定的實施方案中，本發明的抗原結合蛋白具有抗體或免疫球蛋白樣框架。
產生多肽（如，抗體或其片段和 TCR 或其片段）的標準技術為本領域已知，並且本領域技術人員可將這些技術轉移使用於本發明的抗原結合蛋白。例如，可使用熟知的固相方法進行合成，特別是使用市售的肽合成設備（例如，加利福尼亞州福斯特城 Applied Biosystems 製造的肽合成設備）並按照製造商的說明進行合成。或者，本發明的抗原結合蛋白（例如，抗體或其片段和 TCR 或其片段）可透過本領域熟知的重組 DNA 技術進行合成。例如，在將編碼所需（多）肽的 DNA 序列摻入表達載體中並將此類載體引入表達所需多肽的合適真核或原核宿主之後，可獲得片段作為 DNA 表達產物，之後可使用熟知的技術進行將其分離。
在一實施例中，即在 TCER™ 雙特異性分子的情況下，可透過例如基因合成獲得編碼 VH和VL 以及可變 α (Vα) 和可變 β (Vβ) 各種組合的 DNA 序列，以及編碼連接子的序列。可將得到的 DNA 序列分別框內克隆至編碼衍生自人 IgG4 [登錄號：K01316]和IgG1 [登錄號：P01857] 的鉸鏈區、CH2 和CH3 結構域的表達載體中，並進一步進行改造。可進行改造以將杵臼突變併入到 CH3 結構域中，其具有和不具有額外的鏈間二硫鍵穩定性；去除 CH2 中的 N-糖基化位點（例如：N297Q 突變）；或引入 Fc 沉寂突變；根據 Reiter et al. (Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions.Biochemistry, 1994, 33, 5451 - 5459) 所述的方法，分別將額外的二硫鍵穩定化引入 VL和VH 中；納入提高穩定性或可製造性的突變。
本發明的抗原結合蛋白可透過免疫球蛋白純化方法（例如，蛋白A-瓊脂糖凝膠、蛋白 L-瓊脂糖凝膠、蛋白G-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜）從培養基中適當地分離。
在一實施方案中，本文中回收表達抗原結合蛋白或多肽系指實施蛋白 A 色譜、蛋白 L 色譜、κ選擇色譜和/或尺寸排阻色譜，優選為蛋白 L 色譜和/或尺寸排阻色譜，更優選為蛋白 L 色譜和尺寸排阻色譜法。
產生本發明抗原結合蛋白的方法涉及重組DNA，基因轉染技術為本領域熟知的（參見 Morrison SL. et al. (1984) 和專利文獻 US5,202,238 以及 US5,204,244）。
此外，基於常規重組 DNA 和基因轉染技術產生人源化抗體的方法為本領域熟知的（參見，例如，Riechmann L. et al. 1988；Neuberger MS. et al. 1985），並可容易地應用於生產本發明的抗原結合蛋白。
在一實施例中，用於表達本發明重組抗原結合蛋白的載體設計為單順反子，例如，由 HCMV 衍生的啟動子元件 pUC19-衍生物控制。例如，根據標準培養方法在大腸桿菌中擴增質粒 DNA，隨後使用市售套件 (Macherey& Nagel) 純化。例如，根據製造商的說明書（ExpiCHO™ system；Thermo Fisher Scientific）或利用電穿孔系統 (MaxCyte STX)，將純化的質粒 DNA 用於 CHO-S 細胞的暫態轉染。例如，將轉染的 CHO 細胞在 32℃ 至 37℃ 下培養 6-14 天，並接受一至兩次 ExpiCHO™ Feed或Cellboost 7a和7b (GE Healthcare™) 溶液進料。
例如，利用 Sartoclear Dynamics® Lab Filter Aid (Sartorius) 透過過濾 (0.22 μm) 澄清條件細胞上清液。例如，使用配備的 Äkta Pure 25 L FPLC 系統 (GE Lifesciences) 純化雙特異性抗原結合蛋白，以線上進行親和力和尺寸排阻色譜。例如，按照標準親和色譜方案，在蛋白 A或L 色譜柱 (GE Lifesciences) 上進行親和層析。例如，在從親和柱洗脫 (pH 2.8) 後直接進行尺寸排阻色譜，以使用 Superdex 200 pg 16/600 柱 (GE Lifesciences) 按照標準方案獲得高純度單體蛋白。例如，使用根據預測的蛋白質序列計算的消光係數，在 NanoDrop 系統 (Thermo Scientific) 上測定蛋白質濃度。如有需要，使用 Vivaspin 裝置 (Sartorius) 調整濃度。最後，將純化的分子在 2-8℃ 溫度下以約 1mg/mL 的濃度保存在例如磷酸鹽緩衝鹽水中。
純化的雙特異性抗原結合蛋白的品質，透過例如 HPLC-SEC 在 MabPac SEC-1 色譜柱 (5 μm，4x300 mm) 上測定，所述色譜柱在 Vanquish uHPLC 系統內例如包含 300 mM NaCl 的 50mM 磷酸鈉 pH 6.8 中運行。
在一特定實施方案中，步驟 a) 中提出了如上所定義的 T細胞，並且抗原結合蛋白為 TCR 或其片段。因此，抗原結合蛋白在 T細胞的細胞表面上表達。因此，所述方法可產生在其表面表達抗原結合蛋白（例如 TCR）的 T細胞，所述抗原結合蛋白對本發明背景下定義的癌細胞具有特異性。
藥物組合物
本發明還涉及一種藥物組合物，其包含本發明的抗原結合蛋白、本發明的核酸、本發明的載體或本發明的宿主細胞以及藥用載體。
本發明還涉及根據本發明所述的用作藥劑的抗原結合蛋白。本發明還涉及用作藥劑的本發明藥物組合物。
本發明還涉及根據本發明所述的抗原結合蛋白或/和本發明藥物組合物在製備藥劑中的用途。
本文使用的術語「藥物組合物」或「治療組合物」系指正確給予受試者時能夠誘導所期望治療效果的化合物或組合物。
在一些實施方案中，受試者也可稱為患者。
此類治療或藥物組合物可包含有效治療量的本發明抗原結合蛋白或進一步包含治療劑的抗原結合蛋白，與被選擇為適合於給藥方式的藥學上或生理上可接受的製劑混合。
本發明的抗原結合蛋白通常作為無菌藥物組合物的一部分提供，其通常包括藥用載體。
「藥學的」或「藥用」系指當正確給予哺乳動物，特別是人時，不會產生不良、過敏性或其他不良反應的分子實體和組合物。藥用載體或賦形劑系指任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包囊材料或製劑助劑。
「藥用載體」也可稱為「藥用稀釋劑」或「藥用溶媒」，可包括溶劑、填充劑、穩定劑、分散介質、包衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，它們在生理學上是相容的。因此，在一實施方案中，載體為水性載體。
另一方面，當與本文所述的抗原結合蛋白組合時，水性載體能夠改善性質，例如改善溶解度、療效和/或改進免疫治療。
藥物組合物的劑型、給藥途徑、劑量和給藥方案自然取決於需治療的病症、疾病的嚴重程度、患者的年齡、體重和性別、期望的治療持續時間等。此藥物組合物可為任何合適的劑型（取決於患者用藥的所需方法）。它可以以單位劑型提供，通常以密封容器中提供，並且可以作為套件的一部分提供。此類套件通常（但不一定）包括使用說明書。它可包括多個所述單位劑型。
經驗考慮因素（如，生物半衰期）通常將有助於確定劑量。給藥頻率可在治療過程中確定和調整，並且基於癌細胞減少數量、維持減少癌細胞、減少癌細胞增生或殺滅癌細胞。或者，抗原結合蛋白的持續緩釋製劑可能合適。用於實現緩釋的各種製劑和裝置為本領域已知。
在一實施方案中，抗原結合蛋白的劑量可在已接受一次或多次給藥的個體中憑經驗確定。個體的抗原結合蛋白劑量逐漸增加。為了評估抗原結合蛋白的療效，可追蹤癌細胞狀態的標誌物。這些包括透過 FACS、其他成像技術直接測量癌細胞的增生和細胞死亡；透過此類測量方法評估健康改善狀況，或透過公認的檢測測量生活品質提高情況或生存時間延長情況。對於本領域技術人員顯而易見的是，劑量將根據個體、疾病階段以及所使用的既往和伴隨治療而變化。
特別是，藥物組合物包含溶媒，其對於可注射的製劑是藥學上可接受的。特別是，這些可為等滲無菌鹽水溶液（磷酸一鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或此類鹽的混合物）或乾燥的，尤其是凍乾組合物，其根據情況添加無菌水或生理鹽水後，可配製可注射溶液。
為了製備藥物組合物，可將有效量的本發明抗原結合蛋白溶解或分散於藥用載體或水性介質中。
適用於注射用途的藥物劑型包括無菌水溶液或分散液；製劑包括麻油、花生油或丙二醇水溶液；以及用於臨時製備無菌注射液或分散液的無菌粉劑。所有情況下，劑型必須為無菌的且必須具備易於注射程度的流動性。它在生產和儲存條件下必須穩定，並且保存時必須防止受到微生物（如，細菌和真菌）污染。
作為遊離鹼或藥用鹽的活性化合物溶液可在與表面活性劑（如，羥丙基纖維素）適當混合的水中製備。分散液也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中製備。在常規儲存和使用條件下，這些製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
本發明的抗原結合蛋白可使用藥用鹽配製為中性或鹽形式的組合物。
無菌注射溶液的製備方法為：將所需量的活性化合物摻入根據需要含有上述各種其他成分的適當溶劑中，然後進行過濾滅菌。通常情況下，分散液的製備方法為：將各種滅菌的活性成分摻入無菌溶媒，所述無菌溶媒包含基本分散介質和上述所需的其他成分。對於用於製備無菌注射溶液的無菌粉末，優選的製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥技術，其可從先前的無菌過濾溶液中產生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
也考慮了製備更多或高度濃縮的溶液用於直接注射，其中設想使用 DMSO 作為溶劑以使之以極快的速度滲透，從而將高濃度的活性劑遞送至小腫瘤區域。
配製後，以與劑量製劑相容的方式和以治療有效量來給予溶液。所述製劑易於以多種劑型給予，例如上述可注射溶液類型，但是也可採用藥物釋放膠囊等。
治療方法和用途
發明人在體外實驗章節的實施例 6 中展示了本發明的幾種抗原結合蛋白，特別是本發明的 TCER™ 分子，例如可溶性 TCER™ 分子 #114-iso0-UCHT1(17)、#114-iso1-UCHT1(17)、#114-iso2-UCHT1(17)、#114-iso0-BMA031(36)、#114-iso1-BMA031(36)和#114-iso2-BMA031(36)，以及這些分子對於 MAG-003 陽性癌細胞系（例如，Hs695T、A375和U2OS）的細胞毒性活性。本發明人還證明了所述細胞毒性活性具有高度特異性，並且限於 MAG-003 陽性細胞，這是因為在表達 HLA-A*02 但不提呈肽 MAG-003 的細胞系中，雙特異性抗原結合蛋白僅誘導少量裂解。
此外，發明人證明了本發明的抗原結合蛋白，例如，TCER™ 靶向 MAG-003（SEQ ID NO: 127和130，第 3 組； SEQ ID NO: 135和136，第 4 組）的體內療效，導致在 NOG 小鼠中HS695T 腫瘤完全緩解，詳細描述見實施例 7，如圖 11 所示。
如發明人所證明的，本發明的抗原結合蛋白可用於在受試者（優選為患者）中產生免疫反應，其中該免疫反應可毀滅腫瘤細胞。源自該治療性疫苗的免疫反應預期能夠高度特異性地對抗腫瘤細胞，因為肽 KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1) 不以可相比的拷貝數目在正常組織上提呈或過度提呈，防止患者發生對抗正常細胞的不良自體免疫反應的風險。此外，如本說明書的引言部分所示，本發明的抗原結合蛋白與 KVLEHVVRV 特異性結合，特別是與本文所定義的所述肽 MAG-003 的表位結合，因此，不會透過交叉反應識別存在於正常組織中的其他相關肽抗原（類似肽），也不會與它們發生交叉反應。因此，本發明的抗原結合蛋白可用於免疫療法。
因此，本發明的抗原結合蛋白，特別是雙特異性抗原結合蛋白（例如，TCER™ 分子）可用於治療癌症。
本發明的抗原結合蛋白可用於人和/或非人類哺乳動物（特別是人）之治療目的。
在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白可與腫瘤細胞結合，並降低腫瘤細胞的生長和/或殺滅腫瘤細胞，所述腫瘤細胞在其細胞表面提呈肽 KVLEHVVRV (SEQ ID NO: 1)/MHC 複合體。可理解，抗原結合蛋白的給藥濃度為在生理（例如，體內）條件下可促進結合。
因此，在一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白可用於針對不同組織（例如，結腸、肺、乳腺、攝護腺、卵巢、胰腺、腎臟等）腫瘤細胞的免疫療法。在另一實施方案中，本發明的抗原結合蛋白可與腫瘤細胞結合並減少腫瘤細胞的生長和/或殺滅腫瘤細胞。
因此，本發明涉及一種治療或預防增生性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受試者給予有效治療量的根據本發明所述的抗原結合蛋白、核酸或載體、宿主細胞或藥物組合物，定義參見上文「抗原結合蛋白」、「核酸」或「藥物組合物」章節。
在一特定實施方案中，本發明涉及一種治療增生性疾病受試者的方法，所述方法包括向所述受試者給予細胞表面上表達本發明抗原結合蛋白的 T細胞。
在另一實施方案中，本發明涉及在增生性疾病受試者中引發免疫反應的方法，所述方法包括向所述受試者給予一種組合物，其包含細胞表面上表達本發明抗原識別構建體的 T細胞。
在一實施方案中，所述方法中提及的免疫反應為細胞毒性 T細胞反應。
本發明還涉及用於診斷、預防和/或治療增生性疾病的本發明的抗原結合蛋白、本發明的核酸或本發明的載體、本發明的宿主細胞或本發明的藥物組合物。
本發明還涉及本發明的抗原結合蛋白、本發明的核酸或本發明的載體、本發明的宿主細胞或本發明的藥物組合物在製造用於診斷、預防和/或治療增生性疾病的一種藥劑中的用途。
在一實施方案中，本發明涉及根據本發明所述的抗原結合蛋白、核酸或載體、宿主細胞或藥物組合物在治療或預防受試者增生性疾病或病症中的用途。
在優選實施方案中，T細胞為受試者自體細胞或為受試者同種異體細胞，優選為自體細胞。優選情況是，T細胞獲自腫瘤浸潤淋巴細胞或外周血單核細胞。優選情況是，T細胞以組合物形式給予。在一優選的相關實施方案中，所述組合物還包含佐劑，其中所述佐劑的定義見上文藥物組合物章節。
術語「受試者」或「個體」可互換使用，例如，可以為人或非人哺乳動物，優選為人。
在本發明的背景下，術語「治療」系指治療性用途（即，用於患有特定疾病的受試者），意指逆轉、減輕、抑制此類疾病或病症的一種或多種症狀進展。因此，治療不僅指使疾病完全治癒的治療，而且還指減緩疾病進展和/或延長受試者存生存期的治療。
「預防」意指預防性用途（即，用於易患特定疾病的受試者）。
在一實施方案中，「疾病」或「病症」是從本發明抗原結合蛋白治療中受益的任何狀況。在一實施方案中，這包括慢性和急性病症或疾病，包括讓受試者易患所述病症的那些病理狀況。
術語「需要治療」系指已經患有病症受試者以及需要預防該病症的受試者。因此，在一實施方案中，受試者為患者。
「增生性疾病」（例如，癌症）涉及細胞的失調控和/或不適當增生。
在一實施方案中，增生性病症或疾病為，例如，以所述腫瘤疾病的癌症或腫瘤細胞有 MAGEA4 和/或 MAGEA8 表達為特徵的腫瘤疾病。
因此，特別優選的癌症為 MAGEA4 和/或 MAGEA8 陽性癌症。
在本發明的背景下，如果根據 NCI 指南，＞ 98% 所有癌症中提呈相關肽（例如 MAG-003 肽），則該癌症視為「MAGEA4 和/或 MAGEA8「陽性」」。在本文指出的所有其他適應症中，可進行活檢，因為這是這些癌症治療中的標準手段，並且可根據 XPresident® 和相關方法鑒定肽（根據 WO 03/100432；WO 2005/076009；WO 2011/128448；WO 2016/107740、US 7,811,828、US 9,791,444和US 2016/0187351，各文獻內容透過引用整體併入本文）。在一實施方案中，例如透過使用本發明的抗原結合蛋白可較容易地測定（即，診斷）癌症。使用抗原結合蛋白鑒定抗原表達癌症的方法為本領域技術人員已知。應當理解，本文中術語「癌症」(cancer)和「上皮癌」(carcinoma) 不能互換使用，因為上皮癌 (carcinoma) 是出現在皮膚中或在內襯或覆蓋身體器官的組織中的特定類型癌症。但是，實施例 11 中使用的組織樣本來自腫瘤患者，並且將樣本分配至患者的疾病。
在一實施方案中，MAGEA4 和/或 MAGEA8「陽性」（即提呈靶肽）的癌症選自由肺癌（例如，非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、肝癌、頭頸癌、皮膚癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、默克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊和膽管癌、骨肉瘤和食道癌組成的組。
在一實施方案中，MAGEA4 和/或 MAGEA8「陽性」（即提呈靶肽）的癌症選自由肺癌（例如，非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、肝癌、頭頸癌、皮膚癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊和膽管癌和食道癌組成的組。
在另一實施方案中，肺癌為非小細胞肺癌 (NSCLC)，優選為非小細胞肺癌腺癌或鱗狀細胞非小細胞肺癌 (SNSCLC) 或小細胞肺癌 (SCLC)。在另一實施方案中，癌症為皮膚癌，優選為黑色素瘤。在另一實施方案中，癌症為頭頸癌，優選為頭頸鱗狀細胞癌 (HNSCC)。在另一實施方案中，癌症為肝癌，優選為肝細胞癌 (HCC)。在另一實施方案中，癌症為食道癌，優選為胃食管交界癌。
Cancer, Principles and Practice of Oncology, 4th Edition, DeVita et al, Eds. J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa. (1993) 是為癌症治療提供指導的文章。適當的治療方法根據相關領域公認的癌症具體類型和其他因素（例如，患者一般狀況）選擇。本發明的抗原結合蛋白可單獨使用，也可加入其他抗癌藥物（常用於治療癌症患者）的治療方案中。
因此，在一些實施方案中，本發明的抗原結合蛋白可在廣泛用於癌症治療的多種藥物和治療方法（例如，化學治療劑、非化學治療劑、抗腫瘤劑和/或放射療法，優選為化學治療劑）的同時、之前或之後給予。
本文中的「診斷」系指醫學診斷，並指確定哪種疾病或狀況可解釋患者的症狀和體徵。
「有效治療量」的抗原結合蛋白或其藥物組合物意指足夠量的抗原結合蛋白以適用於任何醫學治療的合理受益/風險比來治療所述增生性疾病。但是，應瞭解，本發明的抗原結合蛋白、核酸或載體、宿主細胞或藥物組合物的每日或每月總使用量將由主治醫師在合理醫療判斷範圍內來決定。對於任何特定患者而言，具體有效治療劑量水平將取決於多種因素，包括：所治療的病症或疾病以及病症的嚴重程度；所使用的特異性抗原結合蛋白的活性；所使用的特定組合物，患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所使用特定多肽的給藥時間、給藥途徑和排泄速率；治療持續時間；與所使用的特定多肽聯合或同時使用的藥物；以及醫學領域熟知的因素。例如，為本領域技術人員熟知的是，以低於達到期望治療作用所需的劑量水平開始使用化合物的劑量，並逐漸增加劑量直至達到期望的效果。
在一實施方案中，本發明抗原結合蛋白的治療療效在體內測定，例如，在癌症小鼠模型中測定，並透過測量例如治療組和對照組之間的腫瘤體積變化來測定。
本發明的藥物組合物、載體、核酸和細胞可以以基本上純的形式提供，例如，其中，存在按重量計至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或100% 的相同類型抗原結合蛋白。
本發明的抗原結合蛋白、本發明的核酸或本發明的載體、本發明的宿主細胞或本發明的藥物組合物可透過任何可行的方法給予。
如本文所公開的，在一些實施方案中，宿主細胞，優選為淋巴細胞（例如 T 淋巴細胞或 T 淋巴細胞祖細胞，例如 CD4或CD8 陽性 T細胞），最優選為 T細胞，用於本文所述的醫療用途或治療方法。
因此，本發明的宿主細胞，優選為 T細胞，可用作治療組合物的活性成分。因此，本發明也提出了一種殺傷患者靶細胞的方法，所述方法包括給予患者以上定義的有效量的宿主細胞，優選 T細胞。在此方法的背景下，宿主細胞在給予受試者後，優選引發免疫反應。
為了本發明方法之目的，其中將宿主細胞或細胞群給予受試者，宿主細胞可以是受試者的同種異體（來自另一名受試者）或自體細胞。優選情況是，細胞為受試者的自體細胞。
如果宿主細胞為同種異體細胞，也就是來自另一名受試者，則所述另一名受試者是健康的。
在一些實施方案中，可根據 US20190175650、美國申請號 16/271,393 和美國申請號 16/361,043 中所述的方法製造 T細胞，這些文獻的內容透過引用整體併入本文。
「健康的」意指受試者一般健康狀況良好，優選為免疫系統合格，更優選為無任何可很容易測試或檢測的疾病。
在特定的實施例中，宿主細胞為 T細胞。因此，在本發明的背景下，當上文所定義的 T細胞用作藥劑時，則 T細胞通常透過血液成分單採法從受試者中採集。然後，對 T細胞進行基因工程改造，以在其細胞表面表達本發明的抗原結合蛋白，之後，對基因工程改造的 T細胞進行擴增，然後重新注入受試者中。在此實施例中，抗原結合蛋白優選為 TCR。
在另一方法中，宿主細胞可以為幹細胞（例如，間充質幹細胞）並改造成表達本發明的抗原結合蛋白。在此實施例中，抗原結合蛋白為如本文定義的可溶性蛋白（例如，抗體、scTCR 或可溶性抗原結合蛋白），更優選為雙特異性可溶性抗原結合蛋白，例如本文所述的 TCER™。
因此，宿主細胞用根據本發明所述的核酸和/或載體轉化、轉導或轉染，定義見上文「核酸、載體和重組宿主細胞」章節。
當宿主細胞被轉化、轉導或轉染以表達本發明的抗原結合蛋白時，優選為所述細胞包含能夠表達抗原結合蛋白的表達載體。當宿主細胞表達了本發明的抗原結合蛋白後，所述宿主細胞可稱為激活的宿主細胞。
T細胞過繼轉移方案為本領域所熟知的方案。綜述可發現於：Gattioni 等人和Morgan 等人的文章(Gattinoni, L. et al., Nat.Rev.Immunol. 6 (2006):383-393; Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129)。
可使用一些方法來體外生成 T細胞。例如，自體腫瘤浸潤性淋巴細胞可用於生成 CTL。Plebanski 等人(Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995):1783-1787) 使用自體外周血淋巴細胞 (PLB) 製得 T細胞。此外，B 細胞可用於製備自體 T細胞。
也可用同種異體細胞製得 T細胞，在 US6805861 中詳細描述了一種方法，以引用方式併入本文。
一方面，TCR 引發的免疫反應或 T細胞反應可指透過在體外或體內與 MAG-003/MHC 複合體結合而誘導效應子功能的增生和激活。對於 MHC I 類限制性細胞毒性 T細胞，例如，效應子功能可能為溶解肽脈衝的、肽前體脈衝的或天然肽提呈的靶細胞、分泌細胞因子，優選為肽誘導的干擾素-γ、TNF-α或IL-2、分泌效應分子，例如，肽誘導的顆粒酶或穿孔素，或脫顆粒。
如上文所述，表達與 MAG-003/MHC 複合體特異性結合的本發明抗原結合蛋白的宿主細胞（例如，T細胞）可用於治療。因此，本發明的另一方面提出了用本發明前述方法製得的激活宿主細胞。
透過上述方法產生的激活宿主細胞可選擇性地識別靶細胞。
本文中的「靶細胞」系指上文「抗原結合蛋白」章節中定義的 MAGE-A/MHC 提呈細胞。
在一實施方案中，靶細胞優選為癌細胞，其中所述癌症如上文所定義。
根據本發明，CD8-陽性 T細胞的體內靶細胞可為腫瘤細胞（有時表達 MHC-II 類抗原）和/或腫瘤（腫瘤細胞）周圍的基質細胞（有時也表達 MHC-II 類抗原(Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170)。
套件
最後，本發明還提出了套件，其包含至少一種本發明的抗原結合蛋白。
在一實施方案中，套件包含 a)       上文「抗原結合蛋白」章節中所定義的至少一種本發明的抗原結合蛋白， b)       任選為包裝材料，以及 c)       任選為所述包裝材料內所含的標籤或藥物仿單，提示所述抗原結合蛋白可有效治療癌症或可用於治療癌症。
在一相關實施方案中，本發明的至少一種抗原結合蛋白包含於單室和/或多室預填充式注射器（例如，液體注射器和凍乾注射器）中。
在一實施方案中，本發明包括用於產生單劑量給藥單位的套件。
因此，在一實施方案中，如本發明套件的 a) 中提及的本發明至少一種抗原結合蛋白為第一容器中包含的本發明的乾燥抗原結合蛋白。套件進一步包含具有水性製劑的第二容器。
因此，在一實施方案中，套件包含 a)       第一容器，其包含至少一種上文「抗原結合蛋白」章節中所定義的本發明的乾燥抗原結合蛋白， b)       第二容器，其包含水性製劑； c)       任選為包裝材料，以及 d)       任選為所述包裝材料內所含的標籤或藥物仿單，提示所述抗原結合蛋白可有效治療癌症或可用於治療癌症。
水性製劑通常指包含上文「藥物組合物」章節中所定義的藥用載體的水溶液。在一相關實施方案中，「第一容器」和「第二容器」系指多室預填充式注射器（例如，凍乾注射器）的腔室。
本發明背景下的癌症定義見上文。
在整個本申請中，術語「和/或」為語法上連詞，應解釋為包含與其連接的一個或多個情況可能發生。例如，措辭「可使用標準重組和/或合成方法製備此類天然序列蛋白」表示可使用標準重組和合成方法來製備天然序列蛋白，或者可使用標準重組方法來製備天然序列蛋白或可使用合成方法製備天然序列蛋白。
此外，在整個本申請中，術語「包含」應解釋為包含所有特別提及的特徵以及可選的、附加的、未指定的特徵。如本文中所用的，術語「包含」的使用還公開了實施方案，其中不存在特別提及特徵之外的特徵（即，「由……組成」）。
此外，不定冠詞「一」或「一個」不排除有多個。在相互不同的從屬權利要求中敍述某些措施這一事實並不表示不能使用這些措施的組合。
現在將參考以下附圖和實施例對本發明進行更詳細的描述。本文引用的所有文獻和專利檔透過引用整體併入本文。雖然本發明已經在前面的描述中進行了詳細的說明和描述，實施例被認為是說明性的或示例性的而非限制性的。
序列說明
SEQ ID NO:   名稱 氨基酸序列
1 MAG-003 KVLEHVVRV
2 R7P1D5 TCR α 鏈 – 全長 MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEYSSASKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
3 R7P1D5 TCR α 前導肽 MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSR
4 R7P1D5 α 可變結構域 GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEYSSASKIIFGSGTRLSIRP
5 R7P1D5 CDRa1 DSSSTY
6 R7P1D5 CDRa2 IFSNMDM
7 R7P1D5 CDRa3 CAEYSSASKIIF
8 R7P1D5 - α恒定結構域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
9 R7P1D5 TCR β 鏈 – 全長 MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
10 R7P1D5 TCR β 前導肽 MGSWTLCCVSLCILVAKHT
11 R7P1D5 β 可變結構域 DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
12 R7P1D5 CDRb1 SGHDY
13 R7P1D5 CDRb2 FNNNVP
14 R7P1D5 CDRb3 CASRANTGELFF
15 R7P1D5 β恒定結構域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
16 Aga2p 融合蛋白與 scTv R7P1D5 和標籤 MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFGGGGSDYKDDDDKGGGASGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEYSSASKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVLAAAGGSGGEQKLISEEDL
17 前導序列和 Aga2p MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVF
18 FLAG 標記加連接子 GGGGSDYKDDDDKGGGAS
19 含有連接子的 R7P1D5 的單鏈可變結構域 GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEYSSASKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
20 連接子和 Myc 標籤 AAAGGSGGEQKLISEEDL
21 CDRa2 突變體 1 (aF57Y) IYSNMDM
22 scTv R7P1D5S（穩定） GEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEYSSASKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
23 RABGAP1L-001 FLLETVVRV
24 AXIN1-001 ILDEHVQRV
25 ANO5-001 IVMEHVVFL
26 TPX2-001 KILEDVVGV
27 SYNE3-001 KLLDLQVRV
28 MIA3-001 KVLDKVFRA
29 HERC4-001 KVLEILHRV
30 PSME2-001 KVLERVNAV
31 HEATR5A-001 KVLETLVTV
32 CNOT1-003 KVLGIVVGV
33 TEP1-003 AVEEHVVSV
34 PITPNM3-001 SVLEKVTRA
35 CDRa3 突變體 1 CAEMTSESKIIF
36 CDRa3 突變體 2 CAEFTSESKIIF
37 CDRa3 突變體 3 CAEFNSESKIIF
38 CDRa3 突變體 4 CAEFSSASKIIF
39 CDRa3 突變體 5 CAEATSESKIIF
40 R7P1D5_aMTSE（R7P1D5 – α 鏈變體 1） MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
41 R7P1D5_aFTSE（R7P1D5 – α 鏈變體 2） MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFTSESKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
42 R7P1D5_aFNSE（R7P1D5 – α 鏈變體 3） MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFNSESKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
43 R7P1D5_aFSSA（R7P1D5 – α 鏈變體 4） MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFSSASKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
44 R7P1D5_aATSE（R7P1D5 – α 鏈變體 5） MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEATSESKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
45 NYESO1-001 SLLMWITQV
46 MAG-003_A1 AVLEHVVRV
47 MAG-003_A2 KALEHVVRV
48 MAG-003_A3 KVAEHVVRV
49 MAG-003_A4 KVLAHVVRV
50 MAG-003_A5 KVLEAVVRV
51 MAG-003_A6 KVLEHAVRV
52 MAG-003_A7 KVLEHVARV
53 MAG-003_A8 KVLEHVVAV
54 MAG-003_A9 KVLEHVVRA
55 CDRa1 突變體 1 ESSSTY
56 CDRa2 突變體 2 IYSSQDQ
57 CDRa2 突變體 3 IYSSQDV
58 75-NU(17)-R7P1D5#1 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
59 CDRa2 突變體 4 IYSSQDS
60 75-NU(17)-R7P1D5#20 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVL
61 75-NU(17)-R7P1D5#21 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVL
62 CDRb1 突變體 1 PGHDY
63 CDRb2 突變體 1 FCYGHP
64 CDRb2 突變體 2 FCYGVP
65 CDRb2 突變體 3 FCYGTP
66 CDRb2 突變體 4 FCYGAP
67 75-NU(17)-R7P1D5#29 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGPQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTPGRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
68 75-NU(17)-R7P1D5#30 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGPQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTPGRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
69 75-NU(17)-R7P1D5#31 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGPQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTPGRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
70 CDRb2 突變體 5 FCYGMP
71 CDRb3 突變體 1 (bN109D) CASRADTGELFF
72 CDRa1 共有 - ACT + TCER X1 SSSTY
73 CDRa2 共有 - ACT + TCER IX1 SX2 X3 DX4
74 CDRa2 共有 p1 - TCER IYSSQDX1
75 75-NU(17)-R7P1D5#32 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGPQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTPGRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
76 75-NU(17)-R7P1D5#2 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
77 CDRa3 共有 ACT + TCER CAEX1 X2 SX3 SKIIF
78 CDRb1 共有 - ACT + TCER X1 GHDY
79 CDRb2 共有 - ACT + TCER FX1 X2 X3 X4 P
80 75-NU(17)-R7P1D5x（共同 LC） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
81 CDRb2 共有 p3 - TCER FCYGX1 P
82 CDRb3 共有 ACT + TCER CASRAX1 TGELFF
83 FR1-a EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYT
84 FR2-a   LYWYKQEPGAGLQLLTY
85 FR3-a   KQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYF
86 FR4-a   GSGTRLSIRP
87 FR1-b DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPI
88 FR2-b LFWYRQTMMRGLELLIY
89 FR3-b IDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF
90 FR4-b GEGSRLTVL
91 FR1-a (19V) EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYT
92 FR2-a (48K) LYWYKQEPGKGLQLLTY
93 FR2-b (54F) LFWYRQTMMRGLELLFY
94 FR3-b (66C) CDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYF
95 MUM-001 KLVEYIVKA
96 優選連接子 GGGSGGGG
97 可透過Uniprot登錄號 P43358 訪問的 MAGEA4 MSSEQKSQHCKPEEGVEAQEEALGLVGAQAPTTEEQEAAVSSSSPLVPGTLEEVPAAESA GPPQSPQGASALPTTISFTCWRQPNEGSSSQEEEGPSTSPDAESLFREALSNKVDELAHF LLRKYRAKELVTKAEMLERVIKNYKRCFPVIFGKASESLKMIFGIDVKEVDPASNTYTLV TCLGLSYDGLLGNNQIFPKTGLLIIVLGTIAMEGDSASEEEIWEELGVMGVYDGREHTVY GEPRKLLTQDWVQENYLEYRQVPGSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRI AYPSLREAALLEEEEGV
98 可透過Uniprot登錄號 P43361 訪問的 MAGEA8 MLLGQKSQRYKAEEGLQAQGEAPGLMDVQIPTAEEQKAASSSSTLIMGTLEEVTDSGSPS PPQSPEGASSSLTVTDSTLWSQSDEGSSSNEEEGPSTSPDPAHLESLFREALDEKVAELV RFLLRKYQIKEPVTKAEMLESVIKNYKNHFPDIFSKASECMQVIFGIDVKEVDPAGHSYI LVTCLGLSYDGLLGDDQSTPKTGLLIIVLGMILMEGSRAPEEAIWEALSVMGLYDGREHS VYWKLRKLLTQEWVQENYLEYRQAPGSDPVRYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARV RISYPSLHEEALGEEKGV
99 連接子 TVAAP
100 連接子 GGGS
101 連接子 GGGGS
102 連接子 TVLRT
103 連接子 TVSSAS
104 連接子 GGGGSGGGGS
105 連接子 GGGGSAAA
106 連接子 GGGGSGGGGSGGGGS
107 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGS
108 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
109 連接子 TVLSSAS
110 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
111 IGHG1*01 的天然 Fc 氨基酸序列 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
112 具有杵突變 [S354C和T366W] 的 Fc EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
113 具有臼突變 [(Y349C、T366S、L368A和Y407V +] 的 Fc EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
114 IgG1- 鉸鏈 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
115 IgG2-鉸鏈 ERKCCVECPPCPAPPVAGP
116 IgG3-鉸鏈 ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPAPE LLG      
117 IgG4-鉸鏈 ESKYGPPCPSCPAPEFLG
118 R7P1D5_aMTSE（R7P1D5 – α 可變結構域變體 1） EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP
119 R7P1D5_aFTSE（R7P1D5 – α 可變結構域變體 2） EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFTSESKIIFGSGTRLSIRP
120 R7P1D5_aFNSE（R7P1D5 – α 可變結構域變體 3） EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFNSESKIIFGSGTRLSIRP
121 R7P1D5_aFSSA（R7P1D5 – α 可變結構域變體 4） EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEFSSASKIIFGSGTRLSIRP
122 R7P1D5_aATSE（R7P1D5 – α 可變結構域變體 5） EDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEATSESKIIFGSGTRLSIRP
123 CR7P1D5S 的75-NU (V9) 輕鏈 – 共同 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
124 75-NU(V9)-CR7P1D5S (HC) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEYSSASKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
125 75-NU(Var17)-CR7P1D5#19 (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
126 75-NU(Var17)-CR7P1D5I (HC) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGEDVEQSLFLSVREGDSAVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
127 100(A)-NU(V17)-R7P1D5#114-iso0-dsFcKO-GK (α-VL) EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
128 100(A)-NU(V17)-R7P1D5#112-dsFcKO-GK (VH-β) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
129 ZFC-001 KLQEQIHRV
130 100(A)-NU(V17)-R7P1D5#114-dsFcKO-GK (VH-β) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
131 100(A)-NU(V17)-R7P1D5#114-iso1-dsFcKO-GK (α-VL) EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
132 1G4 α 鏈 METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
133 100(A)-NU(V17)-R7P1D5#114-iso2-dsFcKO-GK (α-VL) EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
134 1G4 β 鏈 MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
135 100(D)-NB(V36)-R7P1D5#114-iso0-dsFcKO-GK (α-VH) EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
136 100(D)-NB(V36)-R7P1D5#114-dsFcKO-GK (VL-β) QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
137 100(D)-NB(V36)-R7P1D5#114-iso1-dsFcKO-GK (α-VH) EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
138 R7P1D5#114-iso0-Vα EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDSKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP
139 100(D)-NB(V36)-R7P1D5#114-iso2-dsFcKO-GK (α-VH) EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRPGGGSGGGGEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
140 連接子 GGSGG
141 連接子 GGSGGGGSGG
142 100(A)-NU(V23)-R7P1D5#114-dsFcKO-GK (VH-β) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTEYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPQKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
143 連接子 GGSGGGGSGGGGSGG
144 連接子 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
145 連接子 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
146 連接子 GSADDAKKDAAKKDGKS
147 連接子 GGQGSGGTGSGGQGSGGTGSGGQGS
148 連接子 GGGGSGT
149 R7P1D5#112-Vβ DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVL
150 R7P1D5#114-Vβ DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVL
151 R7P1D5#114-iso1-Vα EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP
152 R7P1D5#114-iso2-Vα EDVEQSLFLSVREGDSVVINCTYTESSSTYLYWYKQEPGKGLQLLTYIYSSQDQKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMTSESKIIFGSGTRLSIRP
153 UCHT1(17) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIK
154 UCHT1(17) VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
155 連接子 GGGGSGGGGSGT
156 UCHT1(23) VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTEYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPQKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
157 BMA(10) VL QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK               
158 BMA(10) VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSS
159 BMA(36) VL QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
160 BMA(36) VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDVTKYAEKFQGRVTLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVHYCARGSYYDYEGFVYWGQGTLVTVSS
161 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGT
162 UCHT1(17opt) VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGESDWYFDVWGQGTLVTVSS
163 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGT
164 UCHT1(21) VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPQKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
165 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGT
166 100(A)-NU(V21)-R7P1D5#114-dsFcKO-GK (VH-β) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPQKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
167 100(A)-NU(V17opt)-R7P1D5#114-dsFcKO-GK (VH-β) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGESDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPIPGHDYLFWYRQTMMRGLELLFYFCYGTPCDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRADTGELFFGEGSRLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
168 PRAME-004 SLLQHLIGL
169 100(A)-NU(17)-PRAME-dsFcKO-GK (α-VL) QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYQEGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVIDNDQGGILTFGTGTRLTIIPNIQNGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGQTLPWTFGQGTKVEIKEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
170 100(A)-NU(17)-PRAME-dsFcKO-GK (VH-β) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYKGVSTYAQKFQDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGSGGGGKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPIPGHRAVSWYQQTPGQGLQFLFEYVHGEERNKGNFPGRFSGRQFSNSSSEMNISNLELGDSALYLCASSPWDSPNVQYFGPGTRLTVTEDLKNEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
171 INTS4-002 KLLDLMPRL
172 SAMH-001 KLLSYIQRL
173 PPP1CA-006 SIIGRLLEV
174 RPL-007 KIYEGQVEV
175 SETD1A-001 ILLEHNYAL
176 NOMAP-1-0320 ALSNLEVKL
177 NOMAP-1-1223 LLDVPTAAV
178 ODC-001 ILDQKINEV
179 COL6A3-010 KLLPYIVGV
180 FAM115A-001 KLGSVPVTV
181 PHTF2-001 KLFGHLTSA
182 RPP1-001 KTLSAILRI
實施例
與靶向作用於病毒抗原的 TCR 相比，抗癌抗原的 T細胞受體 (TCR) 通常親和力較低，這可能是腫瘤免疫逃逸的一種可能解釋 (Aleksic et al. 2012, Eur J Immunol.2012 Dec;42(12):3174-9)。因此，希望產生更高親和力的 TCR 變體用作過繼細胞療法中的癌症抗原靶向構建體，或者作為可溶性治療藥物的識別模組，即，雙特異性分子 (Hickman et al.2016, J Biomol Screen.2016 Sep;21(8):769-85)。因此，本發明涉及 T細胞受體 R7P1D5 的修飾和優化，其基於對腫瘤相關肽 MAG-003 (SEQ ID NO: 1) 的高親和力和選擇性根據人天然 TCR 庫鑒定。TCR R7P1D5 包含具有 SEQ ID NO: 4 氨基酸序列的 α 可變結構域以及具有 SEQ ID NO: 11 氨基酸序列的 β 可變結構域，這在 WO 2017/158103 中公開。
實施例 1：穩定 scTCR 的產生
對於本發明，TCR R7P1D5（SEQ ID NO: 2和9，全長）被轉化為單鏈 TCR構建體(scTCR R7P1D5, SEQ ID NO:19)，轉化方法為使用可變 α (SEQ ID NO: 4)和β (SEQ ID NO: 11) 結構域和適當的甘氨酸-絲氨酸連接子序列。為了透過酵母表面展示 TCR 成熟，合成相應序列的 DNA 並將其與基於 pCT302 的含有前導序列和 Aga2p 酵母交配蛋白 (SEQ ID NO: 19) 的酵母展示載體轉化至釀酒酵母 EBY100 (MATa AGA1::GAL1¬AGA1::URA3 ura3¬52 trp1 leu2¬delta200 his3¬delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL) (ATCC® MYA¬ 4941™) 中 (Boder and Wittrup, Methods Enzymol.2000;328:430-44)。在酵母中同源重組後得到的融合蛋白 (SEQ ID NO: 16) 在 Aga2p 蛋白的 N-端含有前導肽（負責展示目的蛋白）(Boder and Wittrup, Nat Biotechnol.1997 Jun;15(6):553-7)、短肽標籤，包括用於表達對照的連接子序列（SEQ ID NO: 18和20）和目的蛋白質，即 scTCR R7P1D5 (SEQ ID NO:19) 或其變體。透過跨越 scTCR R7P1D5 的完整基因序列的隨機突變 PCR 方法產生 scTCR 變體的文庫。如 WO 2018/091396 中所述進行酵母細胞轉化，每個文庫產生多達 109 個酵母克隆。
攜帶突變 scTCR 變體且在 HLA-A*02 背景下與 MAG-003 的結合改善的酵母克隆選擇過程基本按照 Smith 等人 (Methods Mol Biol.2015;1319:95-141) 所述進行。為了確保酵母表面展示的 R7P1D5 scTCR 變體的高表達和正確構象，使用了抗 Vβ8（Life technologies，克隆 1C1）抗體染色以及 HLA-A*02/MAG-003 四聚體染色（圖 1）。透過酵母表面展示的 scTCR 轉化揭示了兩個關鍵的穩定突變，以將scTCR 正確提呈在細胞表面，一個在 scTCR α 鏈的框架區域 FR1-a (SEQ ID NO: 83) 中，一個在 α 鏈 (SEQ ID NO: 6) 的 CDR2 中，其產生穩定版本 scTCR R7P1D5S (SEQ ID NO: 22)，顯示出 HLA-A*02/MAG-003 四聚體結合改善。
實施例 2：穩定 scTCR 的親和力成熟
為了產生對 HLA-A*02/MAG-003 具有更高結合親和力的 scTCR 分子，使用先前鑒定的穩定 scTCR R7P1D5S (SEQ ID NO: 22) 讓所有 CDR 單獨成熟。透過使用基本上如前所述的簡併 DNA 寡聚引物隨機化處理 CDR 殘基 (Smith et al., Methods Mol Biol.2015;1319:95-141)。所得到的 DNA 文庫按實施例 1 所述進行轉化。為了保留結合特異性，對包含正常組織衍生肽（SEQ ID NO: 23 至 32）的 HLA‑A*02 四聚體的混合物進行陰性選擇，其顯示出與 MAG-003 肽 (SEQ ID NO: 1) 的高度序列相似性。
為了選擇親和力增強的和選擇性的 R7P1D5S scTCR 變體，每輪選擇均使用遞減濃度的 HLA-A*02/MAG-003 四聚體或單體。在三輪選擇後，分離單個 scTCR 克隆並測序，產生不同親和力成熟的 CDR 序列。如具有成熟 CDRa3 序列（SEQ ID NO: 35 至 39）的 scTCR 示例性顯示，可證明 HLA-A*02/MAG-003 單體結合大大改善。HLA-A*02/MAG-003 結合的選擇性得以保留，這由與 10 種含有正常組織衍生肽的 HLA-A*02 四聚體混合物的低結合力得到證實，所述正常組織衍生肽與 MAG-003 肽 (SEQ ID NO: 1) 具有高度序列相似性。CDRa3 突變體 5 (SEQ ID NO: 39) 顯示對四聚體 HLA-A*02/類似肽的交叉結合略有增加（圖 2A）。此外，含有突變的 CDRs α2（SEQ ID NO: 56、57、59）、β1 (SEQ ID NO: 62)或β2（SEQ ID NO: 63、64、65、66、70）的酵母克隆揭示了與 HLA-A*02/MAG-003 的結合大大改善，同時主要保留了對 HLA-A*02/MAG-003 的特異性（圖 2B）。
實施例 3：成熟 TCR 對於細胞表達的用途
修飾 T細胞以表達識別腫瘤特異性肽-MHC 的 TCR 是將 T細胞重定向至癌細胞的有前景策略。使用成熟的 CDR3 序列可以改善針對 HLA-A*02/MAG-003 的細胞結合 TCR的 反應性，並且將鑒定的 CDRa3 突變體序列（SEQ ID NO: 35 至 39）移植到親本 TCR R7P1D5 α 鏈 (SEQ ID NO: 2) 上並與親本 TCR R7P1D5 β 鏈 (SEQ ID NO: 9) 組合。在電穿孔透過 PCR 擴增 DNA 構建體的體外轉錄產生的相應 mRNA 後，在人 CD8+ T細胞中表達所得的突變 TCR 變體（R7P1D5 CDRa3 突變體 1-5 分別包含 α 鏈變體序列SEQ ID NO: 40 至 44）。出於對照目的，表達針對與 HLA-A*02 複合的 NYESO1-001 肽 (SEQ ID NO: 45) 的 1G4 TCR（SEQ ID NO: 132和134）。在 RNA 電穿孔的 CD8+ T細胞過夜孵育後，透過用 PE 標記的肽-HLA-A*02 四聚體和 FITC-標記的抗-Vβ 8 抗體染色來分析引入 TCR 變體的表達。與空白對照電穿孔樣本和Vβ 8 陰性 NYESO1 TCR 對照背景水平相比，親本 TCR R7P1D5及其衍生的所有變體顯示出相似的抗 Vβ 8 染色，這證明瞭表達效率相似。相反，與親本 TCR R7P1D5 相比，所有 R7P1D5 CDRa3 突變體的 HLA-A*02/MAG-003 四聚體染色均顯著增加（圖 3），這表明與這些突變的變體的肽-HLA 結合改善。表達不同 R7P1D5 TCR 變體的 CD8+ T細胞（20,000 個細胞/孔）的功能激活透過測量為了應對 T2 靶細胞（20,000 個細胞/孔）的 T細胞介導 IFN-γ 釋放來研究，所述 T2 靶細胞載入有稀釋系列的 MAG-003（圖 4）或 10 μM MAG-003 和潛在脫靶肽（圖 5）。基於與 MAG-003 存在高度序列相似性（相似性 BLAST 搜索），從正常組織提呈 HLA-A*02 結合肽數據庫（XPRESIDENT 數據庫）中選擇潛在的脫靶肽。與親本 TCR R7P1D5 相比，成熟 R7P1D5 CDRa3 突變體1-5顯示反應性增加（圖 4），如誘導半數最大 IFN-γ 釋放所需的 3 至 9 倍更低濃度（EC50 值，表 3）所示。如所預期的，對於不表達額外 TCR（空白對照）的 T細胞或表達對 NYESO1-001 特異的 1G4 對照 TCR 的 T細胞僅觀察到背景 IFN-γ 釋放。為了分析成熟 R7P1D5 TCR 變體對 MAG-003的識別選擇性，分析了應對負載不同相似肽（SEQ ID NO: 23 至 34 ）的 T2 細胞的 IFN-γ 釋放。透過減去空白對照電穿孔的 CD8+ T細胞與分別載入 T2 細胞共培養後釋放的 IFN-γ 水平，對背景 IFN-γ 釋放資料進行了校正。除了 R7P1D5 CDRa3 突變體 5 顯示對數種類似肽的信號略微增加和 R7P1D5 CDRa3 突變體 2 對 MIA3-001 的低信號之外，所有其他成熟的 R7P1D5 TCR 變體都具有高度選擇性，對受測類似肽無交叉反應性（圖 5）。與親本 TCR 相比，所有 TCR 突變體變體均誘導明顯更高的 MAG-003 特異性 IFN-γ 釋放，因此R7P1D5 CDRa3 突變體 4、1和3（和可能包括 2）是基於細胞 TCR 的腫瘤靶向作用最有前景的候選者。對 R7P1D5 CDRa3 突變體 1-5 的結合表位進一步描述表徵，方法是突變分析。R7P1D5 CDRa3 突變體 1-4 顯示了廣泛的結合表位，並嚴格識別第 1、5、7和8 位置，因為這些位置的丙氨酸取代消除了所述反應。對於某些 R7P1D5 變體（例如突變體 1）在第 3 位置的丙氨酸取代也觀察到了輕微影響。與其對類似肽所示的較低特異性一致，與突變體 1-4 相比，R7P1D5 CDRa3 突變體 5 TCR 以降低嚴格性識別了的第 7和8 位置（圖 6）。在提呈不同拷貝數 HLA-A*02/MAG-003 的腫瘤細胞系上進一步評估了 CDRa3 突變 TCR 變體的功能活性。RNA 電穿孔的 CD8+ T細胞與腫瘤細胞系以效應子與靶標比率為 3:1 共培養（NCI-H1755、MCF-7：25,000 個細胞/孔；Hs695T、A375、U2O：12,500 個細胞/孔）。 如上所述驗證了導入 TCR 變體在 CD8+ T細胞中的表達。將效應細胞和靶細胞共同培養 24h 後，定量檢測釋放至上清液中的 LDH和IFN-γ 水準。用 CytoTox96 非放射性細胞毒性測定套件 (PROMEGA) 測定 LDH 水準，細胞毒性計算為減去效應子和靶細胞的自發 LDH 釋放量後總裂解對照物的百分比。與親本 TCR 相比，所有 CDRa3 突變 TCR 變體均對所有分析的腫瘤細胞系誘導更強的殺傷力，而對靶標陰性的 MCF-7 細胞則無殺傷力。對於提呈較低靶拷貝數的腫瘤細胞系（A375、U2OS），野生型 TCR 僅發現了很小的細胞毒性，然而尤其是成熟的變體 1-4 能夠誘導重大殺傷，這表明這些變體將可以治療靶拷貝數較低的患者人群。與野生型相比，表達成熟 TCR 變體的 T細胞也觀察到 IFN-γ 釋放增強，這與細胞毒性資料一致。
表 3：親本 R7P1D5和CDRa3 突變體 1-5 的半數最大 IFN-γ 釋放濃度 [nM]。親本 TCR R7P1D5 基於SEQ ID NO: 2 和11，而突變體變體 TCR 1-5 分別基於 SEQ ID NO: 40 至 44 以及 SEQ ID NO: 11。
Figure 02_image005
實施例 4：scTCR 變體的生產、純化和特徵分析
由 Vα和Vβ 結構域組成的 TCR 以單鏈 (scTCR) 形式與衍生自人源化 CD3 特異性 T細胞募集抗體 UCHT1 的Fab 片段一起設計、生產和測試。因此，產生了含有人源化 UCHT1 抗體的輕鏈（對於變體 S 為 SEQ ID NO: 123，對於除 S 以外的其他變體為 SEQ ID NO: 80）或與人源化 UCHT1 抗體的 VH -CH1 的C-端偶聯的各 scTCR 序列，它們由 HCMV 衍生的啟動子元件控制。
表 4：與 Fab 片段一起表達的用於產生 scTCR 變體的序列組合。為了進行轉染，含有輕鏈序列的質粒與含有各 Fab 重鏈序列的質粒混合。
變體 輕鏈 (SEQ ID No:) 重鏈 (SEQ ID No:)
S 123 124
I 80 126
#1 80 58
#2 80 76
#19 80 125
#20 80 60
#21 80 61
#29 80 67
#30 80 68
#31 80 69
#32 80 75
根據標準培養方法在大腸桿菌中擴增質粒 DNA，隨後使用市售套件 (Macherey& Nagel) 純化。根據製造商的說明書（ExpiCHO™ system；Thermo Fisher Scientific），將純化的質粒 DNA 用於 CHO-S 細胞的暫態轉染。將轉染的 CHO 細胞在 32℃ 至 37℃ 下培養 10-12 天，並接受一次 ExpiCHO™ Feed 進料。
利用 Sartoclear Dynamics® Lab Filter Aid (Sartorius) 透過過濾 (0.22 µm) 澄清條件細胞上清液。使用配備的 Äkta Pure 25 L FPLC 系統 (GE Lifesciences) 純化雙特異性抗原結合蛋白，以線上進行親和力和尺寸排阻色譜。按照標準親和層析方案，在蛋白 L 柱 (GE Lifesciences) 上進行親和層析。在從親和柱酸洗脫 (pH 2.8) 後直接進行尺寸排阻色譜，以使用 Superdex 200 pg 16/600 柱 (GE Lifesciences) 按照標準方案獲得高純度單體蛋白。使用根據預測的蛋白質序列計算的消光係數，在 NanoDrop 系統 (Thermo Scientific) 上測定蛋白質濃度。如有需要，使用 Vivaspin 裝置 (Sartorius) 調整濃度。最後，將純化的分子在 2-8℃ 溫度下以約 1mg/mL 的濃度保存在磷酸鹽緩衝鹽水 (DPBS, pH 7.2) 中。透過計算產量來評估每個分子的產率[純化的毫克蛋白/升細胞上清液]。
純化的 scTCR-Fab 抗原結合蛋白的品質，透過 HPLC-SEC 在 MabPac SEC-1 色譜柱 (5 µm, 7.8x300 mm) 上測定，所述色譜柱在 Vanquish uHPLC 系統內包含 300 mM NaCl 的 50mM 磷酸鈉 pH 6.8 中運行。檢測器波長設定為 214 nm。使用相同的方法分析各分子的熱應力樣本（在 40°C 下以 1 mg/mL 儲存於 DPBS 中 7或14 天後）。誘導的聚集體按[聚集體百分比（應力後）]-[聚集體百分比（開始時）]計算。單體回收率按[單體峰面積（應力後）]/[單體峰面積（開始時）]×100% 計算。如圖 7A 所示，不同的 scTCR 變體之間觀察到產量（左圖）和熱應力穩定性存在明顯差異。含有野生型 CDR 序列並與兩個框架突變 (aS19A, aF57Y) 組合的穩定 scTCR 變體 S (SEQ ID NO: 124) 只能以低水平表達。親和力成熟的 CDRa2、CDRa3和CDRb1 序列（變體 #1）和親和力成熟的 CDRa2、CDRa3和CDRb1 序列摻在一起且親和力成熟的 CDRb2 序列與相鄰框架突變 bI66C（變體 I）結合後，可提高表達水平並提高熱應力穩定性。使用兩個 CDR 成熟的 scTCR  變體 I和#1 測試了框架區的進一步修飾情況，以提高表達產量和熱應力穩定性。3 個構架突變（aL50P、bM46P和bM47G）摻入變體 #1 產生更高產量的變體 #30，可透過將構架突變 aS19A 替換為 aS19V（變體 #32）來進一步提高產量。變體 #29（代表具有 aS19 反向突變的變體 #32）突出顯示了 aS19A或aS19V 突變的影響，這使產率大大降低並且聚集水平升高。值得注意的是，aS19 反向突變對產量的負面影響可透過引入框架突變 aA48K（變體 #31）逆轉。在 CDR 成熟的scTCR 變體 I 的背景下，β 鏈 CDR3中另一個框架突變 bI54F（變體 #19）和 bN109D 突變（變體 #20）以單獨或組合（變體 #21）的形式進行了測試。CDRb3 中的突變 bN109D 將NT-基序（可能易於對 Asn 殘基進行脫醯胺化）轉化為 DT 基序，這可能有利於設計移除 CDR 序列內序列責任的方法。將 bI54F 框架突變引入變體 I（變體 #19）提高了產量並提高了 scTCR 的熱應力穩定性。將 CDRb3 突變 bN109D 額外引入變體 #19 產生了 scTCR 變體 #21，熱應力穩定性進一步大大改善，儘管與變體 I 相比，單獨的 bN109D 突變（變體 #20）僅顯示產率稍有提高且穩定性類似。
scTCR-Fab 抗原結合蛋白對與 HLA-A*02 複合的 SEQ ID NO: 1 MAGE-A抗原肽的結合親和力透過生物膜層干涉法進行了分析。使用製造商推薦的設置在 Octet RED384 系統上進行測量。簡言之，在 30°C和 1000 rpm 轉速下以 PBS、0.05% 吐溫-20、0.1% BSA 用作緩衝液來測量結合動力學。在分析連續稀釋的肽-HLA-A*02 複合體之前，將雙特異性分子載入到生物感測器 (FAB2G) 上。包含穩定的 scTCR 變體 S（SEQ ID NO: 123和124）的雙特異性抗原結合蛋白，在濃度高達 500 nM 時僅顯示非常弱的結合信號（圖 7B，表 5）。引入親和力成熟的 CDRa2、CDRa3和CDRb1序列（變體 #1 和變體 #2）可大大改善與靶肽-MHC 的結合。變體 #1（SEQ ID NO: 80、58）和變體 #2（SEQ ID NO: 80、76）的 KD 值測定為 2-3 nM。成熟的 CDRb2 序列與框架突變 bI66C 一起額外納入 scTCR 變體 #2 使變體 I（SEQ ID NO: 80、126）的結合親和力進一步提高，測得 KD 為150 pM。
表 5：變體S（SEQ ID NO: 123、124）、#1、#2和I（SEQ ID NO: 80 分別與 58、76或126 組合）的框架突變、CDR 組合和 KD 值。透過生物膜層干涉法測量 KD 值。
TCR 變體 CDRa1 CDRa2 CDRa3 CDRb1 CDRb2 CDRb3 KD [M]
S   aS19A DSSSTY SEQ ID NO 5 IYSNMDM SEQ ID NO 21 CAEYSSASKIIF SEQ ID NO 7 SGHDY SEQ ID NO 12 FNNNVP SEQ ID NO 13 CASRANTGELFF SEQ ID NO 14 -*
#1   aS19A DSSSTY SEQ ID NO 5 IYSSQDQ SEQ ID NO 56 CAEMTSESKIIF SEQ ID NO 35 PGHDY SEQ ID NO 62 FNNNVP SEQ ID NO 13 CASRANTGELFF SEQ ID NO 14 2.35E-09
#2   aS19A DSSSTY SEQ ID NO 5 IYSSQDS SEQ ID NO 59 CAEMTSESKIIF SEQ ID NO 35 PGHDY SEQ ID NO 62 FNNNVP SEQ ID NO 13 CASRANTGELFF SEQ ID NO 14 2.69E-09
I   aS19A bI66C DSSSTY SEQ ID NO 5 IYSSQDS SEQ ID NO 59 CAEMTSESKIIF SEQ ID NO 35 PGHDY SEQ ID NO 62 FCYGTP SEQ ID NO 65 CASRANTGELFF SEQ ID NO 14 1.53E-10
*濃度高達 500 nM 時無相關結合信號
scTCR-Fab 抗原結合蛋白的特異性透過分析與 HLA-A*02 複合的潛在脫靶肽的結合而進一步對其特徵進行表述。基於透過相似性 BLAST 搜索確定的序列相似性，從正常組織提呈的 HLA-A*02 結合肽數據庫（XPRESIDENT 數據庫）中選擇潛在脫靶肽。結合情況基本上如上所述透過生物膜層干涉法分析。所有相互作用的結合信號在雙特異性 scTCR-Fab 濃度 1 µM 下使用 HIS1K 生物感測器載入肽-HLA-A*02 複合體來測定。分析了潛在脫靶肽締合階段結束時的結合反應。與 scTCR 變體 I（SEQ ID NO: 80、126）相比，包含額外框架突變 bI54F 的變體 #19（SEQ ID NO: 80、125）除了如上所示產量和穩定性提高以外，結合特異性也改善（圖7C，表6）。儘管兩種變體的 MAG-003 (SEQ ID NO: 1) 結合曲線相似（圖 7C），但變體 #19 缺乏結合信號（表 6），顯示與脫靶肽 SYNE3-001 (SEQ ID NO: 27)、TPX2-001 (SEQ ID NO: 26)和PSME2-001 (SEQ ID NO: 30) 的結合消失。
表 6：具有 scTCR 變體 I（SEQ ID NO: 80、126）和變體 #19（SEQ ID NO: 80、125）的 scTCR-Fab 抗原結合蛋白的特異性。透過生物膜層干涉法測量了 1 µM 雙特異性抗體的結合動力學。締合階段結束時的反應（以 nm或MAG-003 信號的百分比表示）如下。
  I #19
載入樣本 ID 反應 反應（MAG-003 的百分比） 反應 反應（MAG-003 的百分比）
MAG-003 0.738 100.0 0.719 100.0
SYNE3-001 0.226 30.6 -0.006 -0.9
TPX2-001 0.136 18.4 -0.003 -0.3
PSME2-001 0.074 10.0 -0.010 -1.4
實施例 5：雙特異性 TCER™ 分子的生產、純化和特徵分析
圖 15 顯示了根據本公開一實施方案所述的雙特異性 TCER™ 分子。雙特異性 T細胞銜接受體 (TCER™) 為融合蛋白，其包含親和力成熟的 TCR 的可變結構域 (Vα, Vβ) 和人源化 T細胞募集抗體的可變結構域 (VH, VL)。分子使用效應子功能沉默的 Fc 部分，可延長半衰期，同時提高穩定性/可製造性。
雙特異性 TCER™ 分子的設計基於具有優選 CDR 和框架突變的選定 TCR α和β 鏈可變結構域。將 scTCR 變體 #21 的各 TCR 可變結構域與有益的框架突變 aS19V和aA48K 組合，從而獲得 TCR 變體 #114-iso0（SEQ ID NO: 138和SEQ ID NO: 150）。為了進一步優化 TCR #114-iso0 的可變結構域序列，分別位於 CDRa1 (aD27E)和CDRa2 (aS65Q) 內的兩個潛在異構化位點（DS-誘發因素）進行取代，從而獲得 TCR 變體 #114-iso1 (SEQ ID NO: 151和SEQ ID NO: 150)和114-iso2 (SEQ ID NO: 152和SEQ ID NO: 150)，其分別在 CDR 內具有一個或沒有翻譯後修飾共有序列。上述 TCR 變體 #114-iso0、#114-iso1和#114-iso2 的可變結構域與 VL-和VH-結構域組合，VL-和VH-結構域分別源自衍生自兩個新人源化 T細胞募集抗體 BMA031(36)（SEQ ID NO:159和160）、UCHT1(17)（SEQ ID NO:153和154）的變體以及不同的 UCHT1(17) 變體 UCHT1(17opt)（SEQ ID NO:153和162）、UCHT1(21)（SEQ ID NO:153和164）和 UCHT1(23)（SEQ ID NO:153和156）。
我們使用 TCR/抗體雙抗體-Fc形式設計了 TCER™ 分子（表 7 中所示的示例性全長序列）和帶有單順反子的各載體（由 HCMV 衍生的啟動子元件 pUC19 衍生物控制）。根據標準培養方法在大腸桿菌中擴增質粒 DNA，隨後使用市售套件 (Macherey& Nagel) 純化。純化的質粒 DNA 用於透過電穿孔系統 (MaxCyte STX) 暫態轉染 CHO-S 細胞。將轉染的 CHO 細胞在 32℃ 至 37℃ 下培養 10-12 天，並接受一至三次 Cellboost 7a和7b (GE Healthcare™) 溶液進料。
表 7：用於產生 TCER™ 分子各變體的 TCR 可變結構域序列和 T細胞募集抗體可變結構域序列的組合。為了進行轉染，含有 A 鏈的質粒與含有 B 鏈的質粒混合。
TCER™ 分子 A 鏈 SEQ ID No: B 鏈 SEQ ID No:
114-iso0-UCHT1(17) 127 130
114-iso1-UCHT1(17) 131 130
114-iso2-UCHT1(17) 133 130
114-iso0-BMA(36) 135 136
114-iso1-BMA(36) 137 136
114-iso2-BMA(36) 139 136
利用 Sartoclear Dynamics® Lab Filter Aid (Sartorius) 透過過濾 (0.22 µm) 澄清條件細胞上清液。使用配備的 Äkta Pure 25 L FPLC 系統 (GE Lifesciences) 純化雙特異性抗原結合蛋白，以線上進行親和力和尺寸排阻色譜。按照標準親和層析方案，在 MAbSelect SuRE 或蛋白 L 柱 (GE Lifesciences) 上進行親和層析。在從親和柱洗脫 (pH 2.8) 後直接進行尺寸排阻色譜，以使用 Superdex 200 pg 26/600 柱 (GE Lifesciences) 按照標準方案獲得高純度單體蛋白。使用根據預測的蛋白質序列計算的消光係數，在 NanoDrop 系統 (Thermo Scientific) 上測定蛋白質濃度。如有需要，使用 Vivaspin 裝置 (Sartorius) 調整濃度。最後，將純化的分子在 2-8℃ 溫度下以約 1mg/mL 的濃度保存在磷酸鹽緩衝鹽水中。
純化的雙特異性抗原結合蛋白的品質，透過 HPLC-SEC 在 MabPac SEC-1 色譜柱 (5 µm, 4x300 mm) 上測定，所述色譜柱在 Vanquish uHPLC 系統內包含 300 mM NaCl 的 50mM 磷酸鈉 pH 6.8 中運行。檢測器波長設定為 214 nm。誘導的聚集體按[聚集體百分比（應力後）]-[聚集體百分比（開始時）]計算。單體回收率按[單體峰面積（應力後）]/[單體峰面積（開始時）]×100% 計算。
圖 8A 顯示了不同 TCER™ 分子的產率和應力穩定性資料。除了變體 114-iso1-UCHT1 (17opt) 外，所有其他變體的產量均超過 10 mg/l（圖 8，左圖）。40°C 下進行的分子熱應力測試提示，經受 14 天熱應力後，所有產生的 TCER™ 分子具有非常好至可接受的穩定性，聚集體形成均少於 10%（圖 8A，右圖）。
對於雙特異性 TCER™ 抗原結合蛋白（包含 TCR 變體 114-iso0、114-iso1和114-iso2 分別與 UCHT1 (17)和BMA031 (36) 組合，如表 7 所示），使用生物膜層干涉法對其與和 HLA-A*02 複合的 MAGE-A抗原肽 (SEQ ID NO: 1) 的結合親和力（圖 8A，表 8）特徵進行了分析。使用製造商推薦的設置在 Octet RED384 系統上進行測量。簡言之，在 30°C和 1000 rpm 轉速下以 PBS、0.05% 吐溫-20、0.1% BSA 用作緩衝液來測量結合動力學。在分析連續稀釋的雙特異性 TCER™ 分子之前，將肽-HLA-A*02 複合體載入到生物感測器 (HIS1K) 上。TCER™ 變體 114-iso0、114-iso1和114-iso2 與和 HLA-A*02 複合的 MAG-003 強烈結合，可相比的KD 值分別為 1.8 nM、2.0 nM和2.3 nM，表明 HLA-A*02/MAG-003 的結合不受移除 TCR 可變 α 結構域 CDRa1 (aD27E)和CDRa2 (aS65Q) 中兩個異構化位點影響。
表 8：TCER™ 變體 114-iso0、114-iso1和114-iso2 與 UCHT1 (17)和BMA031 (36) 組合（如表 7 所示）的親和力分析。KD 值透過生物膜層干涉法測量。
  UCHT1(17) BMA031(36)  
  114-iso0 114-iso1 114-iso2 114-iso0 114-iso1 114-iso2
KD (MAG-003) [M] 1.79E-09 1.97E-09 2.32E-09 1.79E-09 1.97E-09 2.42E-09  
TCR 變體 114-iso0、114-iso1和114-iso2 的特異性，透過使用生物層干涉分析法分析與正常組織來源脫靶肽的結合，對其進行了表徵。如上所述進行了測量。對於 114-iso0-UCHT1(17) 對與 HLA-A*02 複合的 MAG-003 (SEQ ID NO: 1) 和脫靶肽 CNOT1-003 (SEQ ID NO: 32)、COL6A3-010 (SEQ ID NO: 179)、FAM115A-001 (SEQ ID NO: 180)、HEATR5A-001 (SEQ ID NO: 31)、HERC4-001 (SEQ ID NO: 29)、INTS4-002 (SEQ ID NO: 171)、PHTF2-001 (SEQ ID NO: 181)、PPP1CA-006 (SEQ ID NO: 173)、RPL-007 (SEQ ID NO: 174)、RPP1-001 (SEQ ID NO: 182)、SAMH-001 (SEQ ID NO: 172)、SETD1A-001 (SEQ ID NO: 175) 的結合親和力，進行了測定，並計算了親和力窗。親和力窗的範圍為 200 倍以上至完全無脫靶結合（表 9）。114-iso1-BMA(36)和114-iso2-UCHT1(17) 的特異性透過測量以 1 µM TCER™ 的濃度和與 HLA-A*02 複合的 MAG-003 (SEQ ID NO: 1) 和脫靶肽 ODC-001 (SEQ ID NO: 178)、NOMAP-1-0320 (SEQ ID NO: 176)和NOMAP-1-1223 (SEQ ID NO: 177) 的結合信號來分析（圖 8C，表 10）。檢測到 MAG-003 信號 1% 或更低的結合反應，表明 TCR 變體對 MAG-003 具有高度特異性。
表 9：TCER™ 分子 114-iso0-UCHT1(17) 的特異性。透過生物層干涉法分析 114-iso0-UCHT1(17) 的系列稀釋液（500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM）來測量 KD 值。親和力窗計算為 KD （相似肽）/KD (MAG-003)。
  KD [M] KD （相似肽）/KD (MAG-003)
MAG-003 1.56E-09 -
CNOT1-003 1.64E-06 1050
COL6A3-010 9.03E-07 579
FAM115A-001 7.84E-07 503
HEATR5A-001 3.70E-07 238
HERC4-001 4.91E-07 315
INTS4-002 1.98E-06 1273
PHTF2-001 1.02E-06 656
PPP1CA-006 無結合 無結合
RPL-007 無結合 無結合
RPP1-001 8.97E-07 576
SAMH-001 2.11E-06 1356
SETD1A-001 無結合 無結合
表 10：TCER™ 分子 114-iso1-BMA(36) 和114-iso2-UCHT1(17) 的特異性。透過生物膜層干涉法測量了 1 µM TCER™ 的結合動力學。締合階段結束時的反應（以 nm或MAG-003 信號的百分比表示）如下。
  114-iso1-BMA(36) 114-iso2-UCHT1(17)
載入樣本 ID 反應 反應（MAG-003 的百分比） 反應 反應（MAG-003 的百分比）
MAG-003 0.8246 100.0 0.8233 100.0
ODC-001 0.0061 0.7 0.0104 1.3
NOMAP-1-0320 0.0025 0.3 0.0025 0.3
NOMAP-1-1223 0.0005 0.1 0.0057 0.7
實施例 6：TCER™ 介導的 MAG-003 陽性和腫瘤細胞系殺傷
成熟的 TCR 變體以 TCR/抗 CD3雙抗體-Fc形式表示為可溶性 TCER™ 分子 #114-iso0-UCHT1(17)、#114-iso1-UCHT1(17)、#114-iso2-UCHT1(17)、#114-iso0-BMA031(36)、#114-iso1-BMA031(36)和#114-iso2-BMA031(36)（另請參見表 7）。雙特異性 TCER™ 分子對抗 MAG-003 陽性和 MAG-003 陰性腫瘤細胞系的細胞毒活性分別透過 LDH-釋放測定法分析。因此，在 TCER™ 分子濃度遞增情況下，將細胞表面上提呈不同量 HLA-A*02/MAG-003 分子的腫瘤細胞系與來自健康 HLA-A*02+ 供體的 PBMC 共同孵育。48 小時後，利用 CytoTox 96 非放射性細胞毒性測定套件 (PROMEGA) 測量靶細胞系的裂解情況。如圖 9 和圖 10 所示，根據基於質譜法的 HLA-A*02/MAG-003 複合體定量測定結果，TCER™分子顯示可有效裂解 MAG-003 陽性腫瘤細胞系 Hs695T、A375和U2OS（分別展示 1100、230和120 拷貝/腫瘤細胞）。為了進行殺傷力測定，使用來自兩個健康供體的 PBMC（圖 9中的 HBC-720 和圖 10 中的 HBC-982）。在同一實驗中，對於表達 HLA-A*02 但不提呈可檢測水平 MAG-003 肽的 BV-173 細胞系，雙特異性 TCER™ 分子未誘導出細胞裂解或僅誘導了少量細胞裂解，表明 TCR 結構域具有特異性。
實施例 7：在負有異種移植瘤的 NOG 小鼠中的體內療效
在免疫力高度缺陷的 NOG 小鼠品系中進行了藥效學研究，目的是檢測 TCER™ 分子透過與 T細胞抗原特異性結合以及與人癌症細胞上的人腫瘤特異性 HLA-肽複合體特異性結合來募集人免疫 T細胞活性的能力。負有皮下注射人腫瘤細胞系 HS695T 的 NOG 小鼠品系透過靜脈注射人外周血單核 (PBMC) 細胞異種移植物。當根據卡尺法測量值計算單個 Hs695T 腫瘤體積達到 50 mm3 時，在 24 小時內移植人 PBMC（1x107 個細胞/小鼠）。人血細胞移植後一小時內開始治療。每組 8 至 10 隻雌性小鼠（根據腫瘤大小隨機分組）接受尾靜脈靜脈推注（5 mL/kg 體重，每週兩次，共 6 劑）。TCER™ 分子的注射劑量為 0.5（第 2 組）和 0.05（第 3 和第 4 組）mg/kg 體重 x 注射，溶媒對照組（第 1 組）使用 PBS。如圖 11 所示，單個小鼠用 TCER™ 分子治療誘導出明顯的抗腫瘤反應。用靶向作用於 PRAME-004 (SEQ ID NO: 168) 的 TCER™（SEQ ID NO: 169和170）（第 2 組）治療可強烈抑制腫瘤生長（腫瘤平均體積增加下降），在第 25 天時，該治療組的腫瘤平均體積從基礎水平（開始隨機分組時）的 90 mm3 增加至 209 mm3 ，而相比之下，第 25 天時，觀察到溶媒對照組 1 從基礎水平的 74 mm3 增加至 1081 mm3 。用靶向作用於 MAG-003 的 TCER™ 治療（SEQ ID NO: 127和130，第 3 組；SEQ ID NO: 135和136，第 4 組）在第 18 天至第 25 天研究結束時在所有小鼠中均誘導出 Hs695T 腫瘤完全緩解，相較於隨機分組日時的基礎水平為 86 mm3 （第 3 組）和 80 mm3 （第 4 組）。
實施例 8：原代健康細胞的體外安全性
TCER™ 分子114-iso1-BMA (36) 的安全性特徵在使用來自不同器官的人正常組織原代細胞進行的 LDH 殺傷實驗中進行了評估。圖 12 顯示了 11 種不同原代正常組織細胞 (HLA-A*02+) 與來自健康 HLA-A*02+ 供體的 PBMC效應細胞在 TCER™ 濃度遞增的情況下以 1:10 的比例共培養的結果。細胞在健康組織原代細胞特異性培養基和 T細胞培養基 1:1 比例混合物中進行了共孵育。為了確定安全窗，在正常組織原代細胞的相應培養基組合物中，TCER™ 分子在相同的環境下與 MAG-003 陽性腫瘤細胞系 Hs695T 進行了共孵育。共培養 48 小時後，收集上清液，並使用 LDH-Glo™ 套件 (Promega) 透過測量 LDH 釋放來分析腫瘤細胞的裂解情況。
在圖 12 中，各細胞毒性圖顯示了在 PBMC 和遞增濃度的 TCER 分子共孵育後，在相同培養基組合物下，正常組織原代細胞類型（空心圓圈）相對於對照腫瘤細胞系 Hs695T（實心圓圈）的 LDH 釋放。在所有情況下，對正常組織原代細胞的反應都過低，無法計算 EC50 。相反，我們基於最低觀測效應水平 (LOEL) 定義了安全窗，所述 LOEL 確定為超過臨界值反應的首個 TCER™ 濃度。臨界值定義為（[所有三份樣本的標準差x 3] + 不含 TCER™ 的正常對照組織樣本），在各細胞毒性圖中以虛線表示。對於每種正常組織細胞類型，基於 LOEL 的安全窗被確定大於 1,000 倍。
在第二項 LDH 殺傷力實驗中，使用 12 種不同原代健康組織細胞 (HLA-A*02+)，其中一些細胞與第一次實驗重疊，評估了 TCER™ 分子 114-iso1-BMA(36) 的安全性特徵。實驗條件如上所述。
在圖 16 中，各細胞毒性圖顯示了在 PBMC 和遞增濃度的 TCER™ 分子共孵育後，在相同培養基組合物下，正常組織原代細胞類型（空心圓圈）相對於對照腫瘤細胞系 Hs695T（實心圓圈）的 LDH 釋放。在所有情況下，對正常組織原代細胞的反應都過低，無法計算 EC50 。相反，我們基於最低觀測效應水準 (LOEL) 定義了安全窗，所述 LOEL 確定為超過臨界值反應的首個 TCER™ 濃度。臨界值定義為（[所有三份樣本的標準差x 3] + 不含 TCER™ 的正常對照組織樣本），在各細胞毒性圖中以虛線表示。對於每種正常組織細胞類型，基於 LOEL 的安全窗被確定大於 1,000 倍。
實施例 9：在負有異種移植瘤的 NOG 小鼠中每週一次治療的體內療效
在超免疫缺陷 NOG 小鼠品系中進行了藥效學研究，目的是檢測 TCER™ 分子透過與 T細胞抗原特異性結合以及與人癌症細胞上的人腫瘤特異性 HLA-肽複合體特異性結合來募集人免疫 T細胞活性的能力。容留皮下注射人腫瘤細胞系 Hs695T 的 NOG 小鼠品系透過靜脈注射人外周血單核 (PBMC) 細胞異種移植物。當根據卡尺法測量值計算單個 Hs695T 腫瘤體積達到 50 mm3 時，在 24 小時內移植人 PBMC（1x107 個細胞/小鼠）。人血細胞移植後一小時內開始治療。每組 6 至 10 隻雌性小鼠（根據腫瘤大小隨機分組）接受尾靜脈靜脈推注（5 mL/kg 體重，每週一次，共 3 劑）。TCER™ 分子的注射劑量為 0.01 mg/kg 體重 x 注射（第 2 組和第 3 組），溶媒對照組（第 1 組）使用 PBS。如圖 13 所示，用 TCER™ 分子治療誘導出明顯的抗腫瘤反應。使用 MAG-003 TCER™ 分子 114-iso1-BMA(36)（SEQ ID NO: 137和136，第 2 組）和114-iso1-UCHT1(V17opt)（SEQ ID NO: 131和167，第 3 組）治療第 21 天時，在所有小鼠中誘導了 Hs695T 腫瘤緩解。第 21 天時腫瘤平均體積增加從基礎水準（開始隨機分組時）的 84 mm3 下降至 8 mm3 （第 2 組）和 83 mm3 下降至 14 mm3 （第 3 組），而相比之下，第 21 天時，溶媒對照組（第 1 組）觀察到從基礎水準的 85 mm3 增加至 1024 mm3 ，這提示治療強烈抑制了腫瘤生長。第 2 組和第 3 組發現各有 2 隻小鼠獲得完全緩解。
實施例 10：NOG 小鼠中的體內藥代動力學
在接受 2mg/kg 體重單次靜脈內注射的超免疫缺陷 NOG 小鼠中，分析了 TCER™ 114-iso1-UCHT1(17)（SEQ ID NO: 130和131）的藥代動力學特性。在不同時間點（0 h、0.1 h、2 h、8 h、24 h、48 h、120 h、240 h和360 h）從眼球後叢中收集血漿樣本。透過 ELISA、使用兩種不同的測定法設置（Fc – VL 測定法和 CD3 – pMHC 測定法）來測定 114-iso1-UCHT1(17) 的血漿水準。使用 Fc - VL 測定法設置、透過檢測各蛋白質亞單位來定量 TCER™ 血漿水準。簡言之，用 2 μg/ml 濃度的山羊抗人 IgG Fc （在PBS 中）在 4℃ 下包被過夜。使用含有 2% BSA 的 PBS 封閉其餘的結合位點。在用蛋白質 L-HRP和TMB 受質溶液檢測之前，使在封閉緩衝液中稀釋的樣本在室溫下孵育 1 個小時。使用 CD3 – pMHC 測定法，透過 TCER™ 114-iso1-UCHT1(17) 的雙特異性結合活性，僅測量能夠同時與兩個靶分子結合的分子來測定其血漿水準。透過將人 CD3δ和CD3ε 的細胞外結構域與 Fc 結構域的 N 端融合生成CD3δε-Fc ，如 TCER™-構建體（包含杵臼結構突變和其他 C 端 His-標籤）內使用的一樣。CD3δε-Fc 分子在 ExpiCHO 細胞中表達，先使用蛋白 A 親和力色譜法、接著使用如上所述的尺寸排阻色譜法進行純化。用 1 μg/ml 濃度的 CD3δε-Fc （在PBS中）在 4℃ 下包被過夜。如上所述進行封閉和樣本孵育，然後使用 HLA-A*02/MAG-003 和抗 b2m-HRP 進行兩步法檢測。透過從相應的標準曲線插補獲得樣本的血漿濃度。兩種測定法設置均可測定出相似的 TCER™ 血漿濃度，表明血漿中的分子保留了蛋白質完整性以及結合活性（圖 14）。24 h、48 h、120 h、240 h和360 h 時間點的線性回歸顯示血漿終末半衰期為 150 h。結果表明 114-iso1-UCHT1(17) 的半衰期 (T1/2 ) 約為 6-7 天。
實施例 11：透過質譜法檢測原代組織上的 MAG-003 肽
對來自急速冷凍的組織樣本的 HLA 分子進行純化，並分離 HLA 相關肽。 將分離的肽分開，並透過線上納米-電噴霧-電離 (nanoESI) 液相色譜-質譜 (LC-MS) 實驗鑒定序列。多個組織樣本上鑒定的 MAG-003 用無標記 LC-MS 資料的離子計數方法進行量化。所述方法假定肽的 LC-MS 信號區域與樣本中其豐度相關。各種 LC-MS 實驗中肽的所有量化信號在集中趨勢基礎上進行歸一化，根據每個樣本進行平均，並合併入圖（被稱為提呈圖）。提呈圖整合了不同分析方法，如：蛋白資料庫檢索、譜分群、電荷狀態解卷積（除電）和保留時間校準。對所有自動得出的定量和定性資料進行了手動檢查（參見圖 18）。
圖1-18 描繪了本文的實施方案。
圖 1 顯示了透過酵母表面展示技術將 TCR 轉化為穩定 scTCR 的結果。展示於轉化釀酒酵母 EBY100 表面上的 scTCR 分子用 FITC 標記的抗 Vβ8 抗體和 PE 標記的 HLA-A*02/MAG-003 四聚體染色。將未修飾的 scTCR R7P1D5（左圖，SEQ ID NO: 19）與帶有兩個穩定單點突變的 scTCR 變體（右圖，SEQ ID NO: 22）進行比較，其源自隨機突變 scTCR 文庫的選擇。從中可以看出，帶有兩個穩定單點突變的 scTCR 變體顯示 HLA-A*02/MAG-003 四聚體染色增加。
圖 2A 顯示了 CDR3 α 的 scTCR 親和力成熟的酵母表面展示技術結果。包含未修飾和成熟的 CDR3 α 的穩定 scTCR 用濃度為 15 nM 的 HLA-A*02/MAG-003 單體進行染色。用 10 種 HLA-A*02 四聚體的混合物複染，各四聚體均以 10 nM 的濃度施用，其含有與MAG-003 (SEQ ID NO: 1) 具有高度序列相似性的肽（SEQ ID NO: 23 至 32）。含有未修飾的 α 鏈 CDR3 序列 CAEYSSASKIIF (SEQ ID NO: 7) 的穩定 scTCR (SEQ ID NO: 22) 與分別包含親和力成熟的 α 鏈 CDR3 序列 CAEFSSASKIIF (SEQ ID NO: 38)、CAEMTSESKIIF (SEQ ID NO: 35)、CAEFTSESKIIF (SEQ ID NO: 36)、CAEFNSESKIIF (SEQ ID NO: 37)和CAEATSESKIIF (SEQ ID NO: 39) 的scTCR 變體進行比較。由此可看出，含有突變的 CDR α2（SEQ ID NO: 56、57、59）、β1 (SEQ ID NO: 62)或β2（SEQ ID NO: 63、64、65、66、70）的酵母克隆還揭示了結合大大改善，同時主要保留了對 HLA-A*02/MAG-003 的特異性。
圖 2B 分別顯示了 CDR2 α、CDR3 α、CDR1 β和CDR2 β 的 scTCR 親和力成熟的酵母表面展示結果。用HLA-A*02/MAG-003 單體（目標 pHLA 單體）對包含未修飾和成熟 CDR 的穩定 scTCR 進行染色，並用 10 種 HLA-A*02 四聚體的混合物複染，各四聚體均以 10 nM 的濃度施用，其含有與MAG-003 (SEQ ID NO: 1) 具有高度序列相似性的肽（SEQ ID NO: 23 至 32）。(a) 含有未修飾 (SEQ ID NO: 6) 和成熟的 α 鏈 CDR2 序列 IYSSQDQ (SEQ ID 56)、IYSSQDV (SEQ ID 57)和IYSSQDS (SEQ ID 59) 的scTCR 變體進行比較，分別用 40 nM HLA-A*02/MAG-003 單體染色。(b) 含有未修飾 (SEQ ID NO: 7) 和成熟的 α 鏈 CDR3 序列 CAEFSSASKIIF (SEQ ID NO: 38)、CAEMTSESKIIF (SEQ ID NO: 35)、CAEFTSESKIIF (SEQ ID NO: 36)、CAEFNSESKIIF (SEQ ID NO: 37)和CAEATSESKIIF (SEQ ID NO: 39) 的scTCR 變體進行比較，分別用 15 nM HLA-A*02/MAG-003 單體染色。(c) 含有未修飾 (SEQ ID NO: 12) 和成熟的 β 鏈 CDR1 序列 PGHDY (SEQ ID NO: 62) 的 scTCR 變體進行比較，分別用 40 nM HLA-A*02/MAG-003 單體染色。(d) 含有未修飾 (SEQ ID NO: 13) 和成熟的 β 鏈 CDR2 序列 FCYGHP (SEQ ID NO: 63)、FCYGVP (SEQ ID NO: 64)、FCYGTP (SEQ ID NO: 65)、FCYGAP (SEQ ID NO:66)、FCYGMP (SEQ ID NO:70) 的 scTCR 變體進行比較，分別用 5 nM HLA-A*02/MAG-003 單體染色。與親本 TCR R7P1D5 相比，所有 R7P1D5 CDRa3 突變體的 HLA-A*02/MAG-003 四聚體染色均顯著增加，這表明與這些突變的變體的肽-HLA 結合改善。
圖 3 顯示了用 PE 標記的 HLA-A*02/MAG-003 四聚體和 FITC 標記的抗 Vβ8 抗體染色表達成熟 R7P1D5 TCR 變體的人 CD8+ T細胞。出於對照目的，表達沒有 TCR（空白對照）或對 NYESO1-001 特異的 1G4 TCR，並且使用 PE 標記的 HLA-A*02/NYESO1-001 四聚體進行染色。
圖 4 顯示了應對 MAG-003 的表達成熟 R7P1D5 TCR 變體的人 CD8+ T細胞的 IFN-γ 釋放。出於對照目的，表達沒有 TCR（空白對照）或對 NYESO1-001 特異的 1G4 TCR。在電穿孔的 CD8+ T細胞與載有連續稀釋的 MAG-003 的 T2 細胞共培養後，透過 ELISA 法測定 IFN-γ 釋放。減去基線的IFN-γ 水平（由空白對照電穿孔的 CD8+ T細胞與分別載入的 T2 細胞共培養後釋放）。與親本 TCR R7P1D5 相比，成熟的 R7P1D5 CDRa3 突變體 1-5 顯示了應對MAG-003，IFN-γ 釋放增加。
圖 5 顯示了應對 MAG-003 和不同相似肽的表達成熟 R7P1D5 TCR 變體的人 CD8+ T細胞的 IFN-γ 釋放。出於對照目的，表達沒有 TCR（空白對照）或對 NYESO1-001 特異的 1G4 TCR。在電穿孔的 CD8+ T細胞與載有 10 µM 肽 的 T2 細胞共培養後，透過 ELISA 法測定 IFN-γ 釋放。減去基線的 IFN-γ 水平（由空白對照電穿孔 CD8+ T細胞與分別載入的 T2 細胞共培養後釋放）。與親本 TCR R7P1D5 相比，成熟的 R7P1D5 CDRa3 突變體 1-5 顯示了應對MAG-003，IFN-γ 釋放增加，並且對於受測的類似肽沒有 IFN-γ 釋放。
圖 6 顯示了應對 MAG-003 和相應丙氨酸取代肽的表達成熟 R7P1D5 TCR 變體的人 CD8+ T細胞的 IFN-γ 釋放。出於對照目的，表達沒有 TCR（空白對照）或對 NYESO1-001 特異的 1G4 TCR。在電穿孔的 CD8+ T細胞與載有 10 μM 肽 的 T2 細胞共培養後，透過 ELISA 法測定 IFN-γ 釋放。減去基線的 IFN-γ 水平（由空白對照電穿孔 CD8+ T細胞與分別載入的 T2 細胞共培養後釋放）。
圖 7A 顯示了可溶性 scTCR-Fab 抗原結合蛋白的產量和熱應力穩定性資料，所述可溶性 scTCR-Fab 抗原結合蛋白包含具有不同親和力成熟的 CDR 和/或框架突變的 TCR 可變結構域。
圖 7B 顯示了透過生物膜層干涉法測得的可溶性 scTCR-Fab 抗原結合蛋白 S、#1、#2和I 與和 HLA-A*02 複合的 MAG-003 的結合曲線。增加溶液中 HLA-A*02/MAG-003 單體濃度可用於每次相互作用的測量，單位為 nM。
圖 7C 顯示了可溶性 scTCR-Fab 抗原結合蛋白 I（灰色曲線)）和 #19（黑色曲線）與和 HLA-A*02 複合的 MAG-003 以及正常組織衍生脫靶肽（分別為 SYNE3-001、TPX2-001、PSME2-001）的結合曲線。使用生物膜層干涉法用於測量，並在溶液中應用濃度為 1 µM 的 scTCR-Fab。
圖 8A 顯示了可溶性 TCER™ 抗原結合蛋白的產量和熱應力穩定性資料，所述可溶性 TCER™ 抗原結合蛋白包含 TCR 可變結構域，其具有選定親和力成熟的 CDR 並組合了人源化 T細胞募集抗體 BMA031 (36) 的不同 VH/VL 序列以及人源化 T細胞募集抗體 UCHT1 的不同變體 17、17opt、21、23。
圖 8B 顯示了 TCER™ 抗原結合蛋白（包含 TCR 可變結構域變體 114-iso0、114-iso1和114-iso2 與 UCHT1 (17)和BMA031 (36) 組合）與和 HLA-A*02 複合的 MAG-003 的結合曲線。使用生物膜層干涉術進行測量，並增加溶液中 TCER™ 分子的濃度，以 nM 表示。
圖 8C 顯示了 114-iso1-BMA(36)和114-iso2-UCHT1(17) TCER™ 分子分別與和二硫鍵穩定的 HLA-A*02 複合的 MAG-003 以及正常組織衍生脫靶肽 NOMAP-1-0320、NOMAP-1-1223、ODC-001 的結合曲線。使用生物層干涉法進行測量，並應用濃度為 1 μM 的 TCER™ 溶液。
圖 9 顯示了具有可檢測的 MAG-003 表達（Hs695T和A375）和沒有可檢測的 MAG-003 表達 (BV173) 的 HLA-A*02陽性腫瘤細胞系的 TCER™ 介導殺傷的體外療效資料。檢測了包含 UCHT1 (17) 抗體可變結構域與 TCR 變體 #114-iso0（SEQ ID NO: 127和130）、#114-iso1（SEQ ID NO: 131和130）和 #114-iso2（SEQ ID NO: 133和130）的可變結構域的 TCER™ 分子（上圖）。此外，檢測了包含 BMA031(36) 抗體可變結構域與 TCR 變體 #114-iso0（SEQ ID NO: 135和136）和 #114-iso2（SEQ ID NO: 139和136）的可變結構域的 TCER™ 分子（下圖）。將腫瘤細胞與來自健康 HLA-A*02+ 供體的人 PBMC (HBC-720) 以 1:10 的比例共孵育，並透過 LDH-釋放測定法分析在 TCER™ 分子濃度遞增情況下的細胞毒性活性。48 小時後，利用 CytoTox 96 非放射性細胞毒性測定套件 (PROMEGA) 測量靶細胞系的裂解情況。包含UCHT1 (17)和BMA031 (36) 抗體的 TCER™ 分子顯示出了有效的細胞裂解作用。
圖 10 顯示了具有可檢測的 MAG-003 表達（Hs695T、A375和U2OS）的 HLA-A*02陽性腫瘤細胞系的 TCER™ 介導的體外殺傷情況。檢測了包含 UCHT1 (17) 抗體可變結構域與 TCR 變體 #114-iso1（SEQ ID NO: 131和130）和 #114-iso2（SEQ ID NO: 133和130）的可變結構域的 TCER™ 分子以及包含 BMA031(36) 抗體可變結構域與 TCR 變體 #114-iso1（SEQ ID NO: 137和136）的可變結構域的 TCER™ 分子。將腫瘤細胞與來自健康 HLA-A*02+ 供體的人 PBMC (HBC-982) 以 1:10 的比例共孵育，並透過 LDH-釋放測定法分析在 TCER™ 分子濃度遞增情況下的細胞毒性活性。48 小時後，利用 CytoTox 96 非放射性細胞毒性測定套件 (PROMEGA) 測量腫瘤細胞系的裂解情況。包含UCHT1 (17)和BMA031 (36) 抗體的 TCER™ 分子顯示出了有效的腫瘤細胞裂解作用。
圖 11 顯示了在人 PBMC 移植的免疫缺陷型 NOG 小鼠中對抗 Hs695T細胞腫瘤異種移植物（為 HLA-A*02 陽性腫瘤細胞系，含有可檢測到提呈量的MAG-003 (SEQ ID NO:1)和PRAME-004 (SEQ ID NO:168)）的 TCER™ 介導的體內療效。包含 UCHT1 (17) 抗體可變結構域與 TCR 變體 #114-iso0（SEQ ID NO: 127和130，第 3 組）的可變結構域的 TCER™ 與包含 BMA031(36) 抗體可變結構域與 TCR 變體 #114-iso0（SEQ ID NO: 135和136，第 4 組）的可變結構域的 TCER™ 進行了比較。使用 PRAME-004 靶向 TCER（SEQ ID NO: 169和170，第 2 組）作為對照。第 1 組代表溶媒治療的對照組，其中第 11 天時由於出現腫瘤潰瘍而處死了一隻動物。線連接的每個符號代表個體動物，箭頭表示治療天數。包含進行 T細胞募集的UCHT1 (17) 抗體和 BMA031 (36) 抗體的 TCER™ 分子顯示出了完全緩解。
圖 12 顯示了根據用 11 種來自不同器官的人 HLA-A*02 陽性正常組織原代細胞進行 LDH 殺傷實驗評估結果的 TCER™ 分子114-iso1-BMA (36)（SEQ ID NO: 137和136）的體外安全性資料。將不同的細胞與來自健康 HLA-A*02+ 供體的 PBMC 效應細胞以 1:10 的比例和遞增的 TCER™ 濃度進行了共培養。細胞在原代組織細胞特異性培養基和 T細胞培養基的50% 混合物中進行了共孵育。為了確定安全窗，TCER™ 分子在相同的環境下與 MAG-003 陽性腫瘤細胞系 Hs695T 進行了共孵育。安全窗的定義基於最低觀測效應水平 (LOEL)，該水平根據表現出超過臨界值反應的首個 TCER™ 濃度確定。臨界值定義為（[所有三份樣本的標準差x 3] + 不含 TCER 的正常對照組織樣本），在各細胞毒性圖中以虛線表示。對於每種正常組織細胞類型，基於 LOEL 的安全窗大於 1,000 倍或 10,000 倍，表明 114-iso1-BMA (36) TCER™ 分子的安全性特徵良好。
圖 13 顯示了在人 PBMC 移植的免疫缺陷型 NOG 小鼠中對抗 Hs695T細胞腫瘤異種移植體（為 HLA-A*02 陽性腫瘤細胞系，含有可檢測到提呈量的MAG-003 (SEQ ID NO:1)）的 TCER™ 介導的體內療效。包含 UCHT1(V17opt) 抗體可變結構域和 TCR 變體 114-iso1 可變結構域（SEQ ID NO: 131和167，第 3 組）的 TCER™ 分子與包含 BMA031(36) 抗體可變結構域和 TCR 變體 114-iso1 可變結構域（SEQ ID NO: 137和136，第 2 組）的 TCER™ 進行了比較。第 1 組表示經溶媒治療的對照組。這些圖顯示了獲得自每組六隻（第 2 組和第 3 組）至十隻（溶媒組）小鼠的平均腫瘤體積。在每週一次靜脈內給予 0.01mg/kg 體重藥物後，用於 T細胞募集的包含 UCHT1(17opt) 抗體和 BMA031(36) 抗體的 TCER™ 分子顯示出了完全緩解。
圖 14 顯示了 114-iso1-UCHT1(17) TCER™ 分子在 NOG 小鼠中的藥代動力學特徵。小鼠接受 2mg/kg 體重劑量的單次靜脈內注射。不同時間點採集樣本的 TCER™ 血漿濃度透過 ELISA 法測定檢測特定蛋白結構域（Fc - VL 測定法）或雙特異性結合活性（CD3 - pMHC 測定法）的存在。
圖 15 顯示了 TCER™ 分子的設計。雙特異性 T細胞銜接受體 (TCER™) 為融合蛋白，其包含親和力成熟的 TCR 的可變結構域 (Vα, Vβ) 和人源化 T細胞募集抗體的可變結構域 (VH, VL)。分子使用效應子功能沉默的 Fc 部分，可延長半衰期，同時提高穩定性/可製造性。
圖 16 根據用 12 種來自不同器官的人 HLA-A*02 陽性正常組織原代細胞進行 LDH 殺傷實驗評估結果，其顯示了 TCER™ 分子114-iso1-BMA(36)（SEQ ID NO: 137和136）的體外安全性資料。將不同的細胞與來自健康 HLA-A*02+ 供體的 PBMC 效應細胞以 1:10 的比例和遞增的 TCER™ 濃度進行了共培養。細胞在原代組織細胞特異性培養基和 T細胞培養基的50% 混合物中進行了共孵育。為了確定安全窗，TCER™ 分子在相同的環境下用 MAG-003 陽性腫瘤細胞系 Hs695T 進行了共孵育。安全窗的定義基於最低觀測效應水準 (LOEL)，該水準根據表現出超過臨界值反應的首個 TCER™ 濃度確定。臨界值定義為（[所有三份樣本的標準差x 3] + 不含 TCER 的正常對照組織樣本），在各細胞毒性圖中以虛線表示。對於每種正常組織細胞類型，基於 LOEL 的安全窗大於 1,000 倍或 10,000 倍，表明 114-iso1-BMA (36) TCER™ 分子的安全性特徵良好。
圖 17 顯示了表達 R7P1D5 TCR 變體的成熟人 CD8+ T細胞應對提呈不同拷貝數 HLA-A*02/MAG-003 的腫瘤細胞系的細胞毒性和 IFN-γ 釋放。出於對照目的，表達無 TCR（空白對照）或對 NYESO1-001 特異的1G4 TCR。在電穿孔的 CD8+ T細胞與腫瘤細胞系共培養後，測定上清液中的 LDH和IFN-γ 水準。
圖 18：進行肽提呈分析的正常組織和腫瘤樣本已根據其起源器官進行了分組。上面部分：繪製了檢測到該肽的單一 HLA-A*02 陽性正常（左圖）以及腫瘤樣本（右圖）根據技術重複測量值和等分試樣測量值得出的中位值 MS 信號強度為點。箱鬚圖表示多個樣本的歸一化信號強度，並在對數空間中定義。箱顯示中位值、第 25 和第 75 百分位數。鬚延伸到最低資料點仍在下四分位數的 1.5 四分位數範圍 (IQR) 內，最高資料點仍在上四分位數的 1.5 IQR 內。下面部分：每個器官的相對肽檢測頻率顯示為脊柱圖。圖表下面的數字表示本分析中每個器官的可評估總樣本數中檢測到肽的樣本數（正常樣本 N = 581，腫瘤樣本 N = 771）。如果在一個樣本上檢測到肽，但因技術原因無法量化，則該樣本納入檢測頻率圖中，但圖表上面部分不顯示任何點。
使用的縮寫詞：脂肪：脂肪組織；adrenal gl：腎上腺；膀胱：膀胱；bloodvess：血管；esoph：食管；gall bl：膽囊；intest. la：大腸；intest. sm：小腸；nerve cent：中樞神經；nerve perith：周圍神經；parathyr：甲狀旁腺；perit：腹膜；pituit：垂體；skel. mus：骨骼肌；AML：急性髓性白血病；BRCA：乳腺癌；CCC：膽管細胞癌；CLL：慢性淋巴細胞白血病；CRC：結直腸癌節；GBC：膽囊癌；GBM：膠質母細胞瘤；GC：胃癌；GEJC：胃食管交界癌；HCC：肝細胞癌；HNSCC：頭頸部鱗狀細胞癌；MEL：黑色素瘤；NHL：非霍奇金淋巴瘤；NSCLCadeno：非小細胞肺癌腺癌；NSCLCother：無法明確分配至 NSCLCadeno或NSCLCsquam 的 NSCLC 樣本；NSCLCsquam：鱗狀細胞非小細胞肺癌；OC：卵巢癌；OSCAR：食管癌；PACA：胰腺癌；PRCA：攝護腺癌；RCC：腎細胞癌；SCLC：小細胞肺癌；UBC：膀胱癌；UEC：子宮和子宮內膜癌。
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Claims (27)

  1. 一種抗原結合蛋白，其與 MAGE-A抗原肽特異性結合，所述 MAGE-A抗原肽包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成，其中所述抗原肽與主要組織相容性複合體 (MHC) 蛋白形成複合體，所述抗原結合蛋白包含 a)   包含第一可變結構域的第一條多肽鏈，所述第一可變結構域包含三個互補決定區 (CDR) CDRa1、CDRa2和CDRa3，其中： -    CDRa1 包含氨基酸序列「X1 SSSTY」SEQ ID NO:72 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，或與 SEQ ID NO: 72 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基， -    CDRa2 包含氨基酸序列「IX1 SX2 X3 DX4 」SEQ ID NO: 73 或由其組成，其中 X1 至 X4 為任何氨基酸， -    CDRa3 包含氨基酸序列「CAEX1 X2 SX3 SKIIF」SEQ ID NO:77 或由其組成，其中 X1 至 X3 為任何氨基酸，前提是：如果 CDRa1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 5 或由其組成並且CDRa2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 6 或由其組成，則 CDRa3 不包含「CAEYSSASKIIF」 (SEQ ID NO: 7) 也不是由其組成，優選前提是：CDRa3 不包含「CAEYSSASKIIF」 (SEQ ID NO: 7) 也不是由其組成， (b)  包含第二可變結構域的第二條多肽鏈，所述第二可變結構域包含三個 CDR - CDRb1、CDRb2和CDRb3，其中： -    CDRb1 包含氨基酸序列「X1 GHDY」SEQ ID NO:78 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，或與 SEQ ID NO: 78 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基， -    CDRb2 包含氨基酸序列「FX1 X2 X3 X4 P」SEQ ID NO: 79 或由其組成，其中 X1 至 X4 為任何氨基酸， -    CDRb3 包含氨基酸序列「CASRAX1 TGELFF」SEQ ID NO:82 或由其組成，其中 X1 為任何氨基酸，或與 SEQ ID NO: 82 不同的氨基酸序列，不同點為：至少有一個氨基酸取代基。
  2. 根據權利要求 1 中所述的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白與所述抗原肽的 SEQ ID NO:1 氨基酸序列「KVLEHVVRV」特異性結合，並且其中所述抗原肽與 MHC蛋白形成複合體，其中，優選為 MHC蛋白為人白細胞抗原 (HLA) 蛋白，優選為 HLA-A*02。
  3. 根據權利要求 1或2 所述的抗原結合蛋白，其中，所述抗原結合蛋白與表位特異性結合，所述表位包含 SEQ ID NO: 1 的 MAGE-A抗原肽的至少三個氨基酸位置或由其組成，優選為至少三個氨基酸位置選自由 SEQ ID NO: 1 氨基酸序列的氨基酸位置 1、5、7和8或1、3、5和7 組成的組。
  4. 根據權利要求 1 至 3 任一項所述的抗原結合蛋白，其中，所述抗原結合蛋白與所述 MAGE-A抗原肽與 HLA-A*02 之複合體結合，所述 MAGE-A抗原肽包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列或由其組成，其 KD ≤100 µM、≤50 µM、≤30 µM、≤25 µM、≤1 µM、≤500 nM、≤100 nM、≤ 50 nM、≤10 nM，優選為 50pM 至 100µM、50pM 至 10µM、50pM 至 1µM，更優選為 50pM 至 500nM、50pM 至 100nM、50pM 至 50nM和50pM 至 10nM。
  5. 根據權利要求 1 至 4 任一項所述的抗原結合蛋白，其中，所述抗原結合蛋白對 MAGE-A/MHC 複合體提呈細胞的 EC50 值小於 100nM、小於 50nM、小於 10nM、小於 900pM、小於 500pM、小於 300pM、小於 200pM、小於 150pM、小於 100pM、小於 50pM、小於 20pM、小於 10pM，例如 0.1nM 至 20nM，例如 0.5nM 至 15nM、0.8nM 至 12nM、0.8nM 至 10nM 或例如 1pM 至 150pM、1 至 100pM、1 至 50pM、1 至 20pM。
  6. 根據權利要求 1 至 5 任一項所述的抗原結合蛋白，其中，當選自由 RABGAP1L-001、AXIN1-001、ANO5-001、TPX2-001、SYNE3-001、MIA3-001、HERC4-001、PSME2-001、HEATR5A-001、CNOT1-003、TEP1-003、PITPNM3-001、INTS4-002、SAMH-001、PPP1CA-006、RPL-007、SETD1A-001、NOMAP-1-0320、NOMAP-1-1223和ODC-001，優選為 HEATR5A-001和CNOT1-003 組成的列表中的肽與 MHC蛋白形成複合體，優選與 HLA-A*02 形成複合體時，所述抗原結合蛋白不與所述肽顯著結合。
  7. 根據權利要求 1 至 6 任一項所述的抗原結合蛋白，其中，抗原結合蛋白為抗體或其片段，或雙特異性抗體或其片段，或 T細胞受體 (TCR) 或其片段，或雙特異性 T細胞受體 (TCR) 或其片段。
  8. 根據權利要求 1 至 7 任一項所述的抗原結合蛋白，其中，第一多肽和第二多肽被共價或非共價連接在一起。
  9. 根據權利要求 8 所述的抗原結合蛋白，其中，所述抗原結合蛋白為單鏈 TCR (scTCR) 或單鏈雙特異性抗體。
  10. 根據權利要求 1 至 9 任一項所述的抗原結合蛋白，其中，所述第一可變結構域還包含選自由 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 組成組中的一個或多個框架區，其中 -    FR1-a 包含 SEQ ID NO:83 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 83 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR2-a 包含 SEQ ID NO:84 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 84 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR3-a 包含 SEQ ID NO:85 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 85 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR4-a 包含 SEQ ID NO:86 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 86 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成，和 所述第二可變結構域還包含選自由 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 組成組中的一個或多個框架區，並且其中 -    FR1-b 包含 SEQ ID NO:87 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 87 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR2-b 包含 SEQ ID NO:88 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 88 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR3-b 包含 SEQ ID NO:89 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 89 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成，或 -    FR4-b 包含 SEQ ID NO:90 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 90 具有至少 85%、至少 90% 或至少 95% 同一性的氨基酸序列或由其組成。
  11. 根據權利要求 10 所述的抗原結合蛋白，其中，框架區包含至少一個選自包含以下的氨基酸取代基組中的氨基酸取代基： -    FR1-a 中第 19 位置處的氨基酸取代基，其中所述氨基酸取代基優選為 S19A、S19V，更優選為 S19V， -    FR2-a 中第 48 和/或第 50 位置處的氨基酸取代基，其中所述第 48 位置處的氨基酸取代基優選為 A48K，所述第 50 位置處的氨基酸取代基優選為 L50P， -    FR2-b 中第 46、47和/或 54 位置處的氨基酸取代基，其中所述第 46、47和54 位置處的氨基酸取代基分別優選為 M46P、M47G和I54F，其中，當上面定義的 CDRb3 氨基酸序列在第 109 位置處包含氨基酸 109D 時，優選第 54 位置處的所述氨基酸為 I54F， -    FR3-b 中第 66 位置處的氨基酸取代基，其中所述第 66 位置處的氨基酸取代基分別優選為 I66C，其中，當上面定義的 CDRb2 氨基酸序列在第 57 位置處包含氨基酸 57C 時，優選第 66 位置處的所述氨基酸為 66C， 其中取代基的位置根據 IMGT 命名法給出。
  12. 根據權利要求 11 所述的抗原結合蛋白，其中，所述第一可變結構域還包含選自由 FR1-a、FR2-a、FR3-a和FR4-a 組成組中的一個或多個框架區，其中 -    FR1-a 包含 SEQ ID NO:91 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 91 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 91 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含氨基酸 19V， -    FR2-a 包含 SEQ ID NO:92 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 92 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 92 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含氨基酸 48K 和任選為第 50 位置處的氨基酸取代基，優選為 L50P， -    FR3-a 包含 SEQ ID NO:85 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 85 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR4-a 包含 SEQ ID NO:86 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 86 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，和 所述第二可變結構域還包含一個或多個框架區，優選為選自由 FR1-b、FR2-b、FR3-b和FR4-b 組成組的框架區，其中 -    FR1-b 包含 SEQ ID NO:87 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 87 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR2-b 包含 SEQ ID NO:93 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 93 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 93 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含優選為氨基酸 54F 和任選為第 46 和/或 47 位置處的氨基酸取代基，其中第 46和/或 47 位置處的所述氨基酸取代基分別優選為 M46P 和/或 M47G， -    FR3-b 包含 SEQ ID NO: 89 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 89 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，或包含 SEQ ID NO: 94 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 94 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成，其中優選為與 SEQ ID NO: 94 具有至少 85% 同一性的所述氨基酸序列包含氨基酸 66C，並且其中，當上面定義的 CDRb2 氨基酸序列在第 57 位置處包含氨基酸 57C 時，FR3-b 優選包含與包含氨基酸 66C 的 SEQ ID NO: 94 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成， -    FR4-b 包含 SEQ ID NO:90 氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 90 具有至少 85% 同一性的氨基酸序列或由其組成。
  13. 根據權利要求 1 至 12 中任一項所述的抗原結合蛋白，其中所述第一可變結構域是 TCR α或γ 鏈的一部分；和/或其中所述第二可變結構域是 TCR β或δ 鏈的一部分。
  14. 根據權利要求 1 至 13 中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含以下一種或多種： (i)  一個或多個其他抗原結合位點； (ii) 跨膜區，任選為包括胞質信號傳導區； (iii) 診斷劑； (iv) 治療劑；或 (v)  PK 修飾部分。
  15. 根據權利要求 1 至 7 和權利要求 10 至 13 中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含兩條形成兩個抗原結合位點的多肽鏈，其中第一條多肽鏈具有下式表示的結構： V3 –L1 -V4 -L2 –CL [I] 其中，V3 為第三可變結構域；V4 為第四可變結構域；L1 和L2 為連接子；L2 可能存在也可能不存在；CL 為輕鏈恒定結構域或其一部分且可能存在也可能不存在； 其中第二條多肽鏈具有下式表示的結構： V5 -L3 -V6 -L4 –CH1 [II] 其中，V5 為第五可變結構域；V6 為第六可變結構域；L3 和L4 為連接子； L4 可能存在也可能不存在；CH1 為重鏈恒定結構域 1 或其一部分且存在或不存在；其中 V3 或V4 為權利要求 1 中定義的第一可變結構域，而 V5 或V6 為權利要求 1 中定義的第二可變結構域，或 V5 或V6 為權利要求 1 中定義的第一可變結構域，而 V3 或V4 為權利要求 1 中定義的第二可變結構域，並且其中 V3 為權利要求 1 中定義的第一可變結構域而 V5 為第二可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域，或， V3 為權利要求 1 中定義的第二可變結構域而 V5 為第一可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域，或， V3 為權利要求 1 中定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V5 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V5 為輕鏈可變結構域，或 V3 為權利要求 1 中定義的第二可變結構域而 V6 為第一可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V5 為重鏈可變結構域，或者 V4 為重鏈可變結構域而 V5 為輕鏈可變結構域， V4 為權利要求 1 中定義的第一可變結構域而 V5 為第二可變結構域，並且 V3 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V3 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域，或 V4 為權利要求 1 中定義的第二可變結構域而 V5 為第一可變結構域，並且 V3 為輕鏈可變結構域而 V6 為重鏈可變結構域，或者 V3 為重鏈可變結構域而 V6 為輕鏈可變結構域， 其中，輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域一起形成一個抗原結合位點，並且其中第一和第二可變結構域一起形成一個抗原結合位點 。
  16. 根據權利要求 15 所述的抗原結合蛋白，其中，所述重鏈可變結構域和所述輕鏈可變結構域與選自由 CD3（例如：CD3γ、CD3δ和CD3ε 鏈）、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、FcεRI、TCRα/β、TCRγ/δ、HLA-DR 所組成組中的抗原結合和/或與效應細胞結合。
  17. 根據權利要求 15或16 中所述的抗原結合蛋白，其包含形成兩個抗原結合位點的兩條多肽鏈， 其中一條多肽鏈具有式 [III] 表示的結構： V3 –L1 -V4 -L2 –CL -L5 -Fc1 [III] 以及一條多肽鏈具有式 [IV] 表示的結構： V5 -L3 -V6 -L4 –CH1 -L6 -Fc2 [IV] 其中 V3 、L1 、V4 、L2 、CL 、V5 、L3 、V6 、L4 、CH1 的定義見前述權利要求，並且其中 L5 和L6 為連接子且存在或不存在，並且 Fc1 和Fc2 為 Fc 結構域，且其中 Fc1 和Fc2 相同或不同。
  18. 根據權利要求 17 所述的抗原結合蛋白，其中，V3 為前述權利要求所定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為輕鏈可變結構域而 V5 為重鏈可變結構域，或 V3 為前述權利要求所定義的第一可變結構域而 V6 為第二可變結構域，並且 V4 為重鏈可變結構域而 V5 為輕鏈可變結構域，並且其中，L1 和L2 包含 SEQ ID NO: 96 的氨基酸序列「GGGSGGGG」或由其組成，其中 L2 、L5 、L4 和L6 不存在，其中當 V4 為重鏈可變結構域時 Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113 或由其組成，當 V5 為輕鏈可變結構域時 Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112 或由其組成，或 當 V4 為輕鏈可變結構域時 Fc1 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 112 或由其組成，且當 V5 為重鏈可變結構域時 Fc2 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 113 或由其組成。
  19. 一種分離的核酸或核酸載體，所述核酸包含編碼根據權利要求 1 至 18 任一項所述的抗原結合蛋白的序列，所述核酸載體包含所述核酸。
  20. 一種重組宿主細胞，其包含根據權利要求 1 至 18 中任一項所述的抗原結合蛋白或根據權利要求 19 所述的核酸或載體，其中所述宿主細胞優選為 a) 淋巴細胞，諸如 T 淋巴細胞或 T 淋巴細胞祖細胞，例如：CD4或CD8 陽性 T細胞或 b) 用於重組表達的細胞，諸如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
  21. 一種藥物組合物，其包含根據權利要求 1 至 18 中任一項所述的抗原結合蛋白、根據權利要求 19 所述的核酸或載體或根據權利要求 20 所述的宿主細胞，以及藥用載體、稀釋穩定劑和/或賦形劑。
  22. 一種製造根據權利要求 1 至 18 中任一項所述的抗原結合蛋白的方法，包括： a.   提出合適的宿主細胞， b.   提出一種基因構建體，其包含編碼根據權利要求 1 至 18 中任一項所述的抗原結合蛋白的編碼序列， c.   將所述基因構建體引入所述合適的宿主細胞，和 d.   由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體。
  23. 根據權利要求 22 所述的方法，進一步包括從合適的宿主細胞分離和純化所述抗原結合蛋白，和任選為在 T細胞中重構所述抗原結合蛋白。
  24. 根據權利要求 1 至 18 中任一項所述的抗原結合蛋白、根據權利要求 19 所述的核酸或載體、根據權利要求 20 所述的宿主細胞或根據權利要求 21 所述的藥物組合物，用於藥物。
  25. 根據權利要求 1 至 18 中任一項所述的抗原結合蛋白、根據權利要求 19 所述的核酸或載體、根據權利要求 20 所述的宿主細胞或根據權利要求 21 所述的藥物組合物，用於診斷、預防和/或治療增生性疾病，例如癌症（如，MAGEA4 和/或 MAGEA8 陽性癌症）。
  26. 根據權利要求 25 所述的抗原結合蛋白，其中所述癌症選自由肺癌、肝癌、頭頸癌、皮膚癌、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、默克爾細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、膽囊癌、膽管癌、骨肉瘤癌和食道癌組成的組。
  27. 根據權利要求 26 所述的抗原結合蛋白，其中 (i)  肺癌為非小細胞肺癌 (NSCLC)，優選為非小細胞肺癌腺癌或鱗狀細胞非小細胞肺癌 (SNSCLC)，或小細胞肺癌 (SCLC)； (ii) 皮膚癌為黑色素瘤； (iii) 頭頸癌為頭頸鱗狀細胞癌 (HNSCC)； (iv) 肝癌為肝細胞癌 (HCC)； (v)  食管癌為胃食管交界癌。
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