TW202043270A - 靶向拉比林(labyrinthin)或其部分之構築體及其用途 - Google Patents

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麥克 巴比奇
詹姆士 Ａ 拉多斯維奇
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美商拉比林免疫治療美國有限公司
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Abstract

本發明提供包含特異性結合至拉比林(Labyrinthin)或其部分之抗體部分及效應域之構築體。亦提供製備並使用此等構築體及其組合物之方法。

Description

靶向拉比林(LABYRINTHIN)或其部分之構築體及其用途
本申請案係關於包含特異性結合至拉比林(Labyrinthin)或其部分之抗體部分及效應域之構築體。亦提供製造及使用此等構築體及其組合物之方法。
歷史上，癌症之特徵主要是基於癌症起源之組織類型或器官，例如，肺癌、乳癌及結腸癌。許多癌症治療亦基於基於組織或器官之癌症分類。眾所周知，此種基於組織或器官之癌症分類可能無法為選擇有效治療提供足夠的指導。此部分是由於發現源自單一組織類型或器官之癌症可能高度異質，且此類差異可能需要個人化癌症治療方法。例如，藉由生物標誌定義癌症，與起源之組織類型或器官相反，可允許改良的癌症治療，例如，三陰性乳癌，其缺乏雌激素受體、孕酮受體及HER2/neu之表現，對靶向已鑑定受體中之任何一者或多者之傳統基於激素之療法無反應及需要替代療法。在基於生物標誌鑑定癌症亞型後，需要大量研究來開發用於有效治療此類癌症亞型之新穎藥劑。
一種此類經鑑定癌症亞型係表現拉比林之癌症。拉比林係在一些癌症(諸如腺癌)之質膜之細胞外表面上表現之細胞表面蛋白。拉比林之細胞表面表現不係細胞週期特異性的。此外，拉比林並未在正常患者或帶有腫瘤的患者之血清中發現，且未藉由拉比林陽性細胞系脫落進入至培養基中。
人類中之免疫療法受到限制，部分原因是對非人類單株抗體之不利反應。使用囓齒動物抗體之早期臨床試驗揭示，人類抗小鼠抗體(HAMA)及人類抗大鼠抗體(HARA)反應，此導致抗體之快速清除。此後，已開發出較低免疫原性抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體、PRIMATIZED®抗體、及使用轉殖基因小鼠或噬菌體顯示庫製備的人類抗體。參見，例如，Morrison等人，Proc Natl Acad Sci USA，81，1984；及Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA，86，1989。避免HAMA反應允許高劑量及重複劑量投與以達成治療反應。
使用噬菌體顯示以生成mAb之最新進展使得有可能從大抗體庫選擇具有針對所限定抗原決定基之細緻特異性之藥劑。在HLA-A01及HLA-A02之內文中，已從噬菌體顯示庫成功選擇許多特異性針對實體腫瘤抗原之此類mAb (Noy等人，Expert Rev Anticancer Ther，5，2005；Chames等人，Proc Natl Acad Sci USA，97，2000；Held等人，Eur J Immunol，34，2004；Lev等人，Cancer Res，62，2002；Klechevsky等人，Cancer Res，68，2008)。最近，已顯示特異性針對人類WT1/HLA-A02複合體(一種已充分描述的T細胞抗原決定基)之人類mAb在細胞分析中及在活體內模型中藉由Fc介導之效應細胞功能抑制多個癌細胞系及原發癌細胞(Dao等人，Sci Transl Med，5，2013；Veomett等人，Clin Cancer Res，2014)。
本文所引述的所有參考文獻(包括專利申請案及公開案)之全文係以引用的方式併入。
在一個態樣中，本申請案提供經分離的抗拉比林構築體，其包含特異性結合至拉比林或其部分之抗體部分及效應域。
在一些實施例中，該抗體部分係結合至效應域。在一些實施例中，該效應域包含效應分子。在一些實施例中，該效應分子包含治療劑。在一些實施例中，該治療劑係選自由藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸組成之群。在一些實施例中，該經分離的抗拉比林構築體係抗體藥物結合物(ADC)。
在一些實施例中，該效應域包含診斷劑。在一些實施例中，該診斷劑係標記。
在一些實施例中，該抗體部分係融合至效應域。
在一些實施例中，該經分離的抗拉比林構築體係包含細胞外域之嵌合抗原受體(CAR)，該細胞外域包含融合至效應域之抗體部分，其中該效應域包含跨膜域及細胞內傳訊域。
在一些實施例中，該經分離的抗拉比林構築體係包含細胞外域之雙特異性T細胞接合子(BiTE)，該細胞外域包含融合至抗CD3抗體或其片段之抗體部分。
在一些實施例中，該經分離的抗拉比林構築體係包含細胞外域之T細胞受體(TCR)，該細胞外域包含融合至效應域之抗體部分，其中該效應域包含跨膜域及/或TCR亞單元之細胞內傳訊域。
在一些實施例中，該抗體部分係全長抗體、Fab、Fab’ 、(Fab’ )2、Fv或單鏈Fv (scFv)。在一些實施例中，該抗體部分以約0.1 pM至約500 nM之Kd結合拉比林或其部分。
在一些實施例中，該抗體部分特異性結合至拉比林衍生肽，該肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:2至32。在一些實施例中，該拉比林衍生肽包含B細胞及T細胞抗原決定基。在一些實施例中，該拉比林衍生肽包含B細胞抗原決定基。在一些實施例中，該拉比林衍生肽包含T細胞抗原決定基。
在一些實施例中，該抗體部分係多特異性的。在一些實施例中，該多特異性抗體部分係串聯scFv、雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙重親和力再靶向(DART)抗體、雙重可變域(DVD)抗體、結進孔(knob-into-hole) (KiH)抗體、對接及鎖定(DNL)抗體、化學交聯抗體、異多聚體抗體或異結合物抗體。在一些實施例中，該多特異性抗體部分係包含藉由可選之肽連接子連接之兩個scFv之串聯scFv。
在另一個態樣中，本申請案提供包含本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者之醫藥組合物。
在另一個態樣中，本申請案提供表現本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者之宿主細胞。
在另一個態樣中，本申請案提供編碼本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者之多肽組分之核酸。
在另一個態樣中，本申請案提供包含本文所述的核酸中之任何者之效應細胞。在一些實施例中，該效應細胞係T細胞。
在另一個態樣中，本申請案提供偵測其表面上呈遞拉比林或其部分的細胞之方法，該等方法包括：(a)使該細胞與經分離的抗拉比林構築體接觸，其中該經分離的抗拉比林構築體包含包含標記之效應域；及(b)偵測該細胞上該標記之存在。
在另一個態樣中，本申請案提供治療患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該等方法包括對該個體投與：(a)有效量之本文所述的醫藥組合物中之任何者；或(b)有效量之本文所述的效應細胞中之任何者。在一些實施例中，該拉比林狀態係用作選擇個體以進行治療之基礎。
在另一個態樣中，本申請案提供診斷患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該等方法包括：(a)對該個體投與有效量之經分離的抗拉比林構築體，其中該經分離的抗拉比林構築體包含包含標記之效應域；及(b)測定該個體中該標記之量，其中該標記之量高於閾值指示該個體患有拉比林陽性疾病。
在另一個態樣中，本申請案提供診斷患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該等方法包括：(a)使衍生自該個體之樣品與本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者接觸；及(b)鑑定該樣品中與經分離的抗拉比林構築體結合之一或多個細胞，從而診斷患有拉比林陽性疾病之個體。
在一些實施例中，該拉比林陽性疾病係拉比林陽性癌症。在一些實施例中，該拉比林陽性癌症係腺癌。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年1月8日申請之美國臨時專利申請案第62/789,871號之優先權，其全部揭示內容係以引用的方式併入本文中。基於 ASCII 文字檔案提交序列表
基於ASCII文字檔案之以下提交之全部內容係以引用的方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式(CRF) (檔案名稱：185722000240SEQLIST.TXT，記錄日期: 2020年1月7日，大小：9 KB)。
在一些態樣中，本申請案提供經分離的構築體(稱為「抗拉比林構築體」或「抗LAB構築體」)，其包含特異性結合至拉比林或其部分之抗體部分及效應域。亦提供製造及使用此等構築體及其組合物之方法。
本申請案部分基於發現特定癌症(諸如腺癌)選擇性地表現細胞表面拉比林及拉比林陽性癌症並未脫落拉比林。此外，正常、非癌性癌症不表現細胞表面拉比林。因此，拉比林代表用於定義拉比林陽性癌症之有用的標誌及用於基於免疫療法之治療之靶標。
因此，在一些實施例中，本申請案提供經分離的抗拉比林構築體，其包含特異性結合至拉比林或其部分之抗體部分及效應域。
在一些實施例中，該經分離的抗拉比林構築體係包含細胞外域之嵌合抗原受體(CAR)，該細胞外域包含融合至效應域之抗體部分，其中該效應域包含跨膜域及細胞內傳訊域。
在一些實施例中，該經分離的抗拉比林構築體係包含細胞外域之雙特異性T細胞接合子(BiTE)，該細胞外域包含融合至抗CD3抗體或其片段之抗體部分。
在一些實施例中，該經分離的抗拉比林構築體係包含細胞外域之T細胞受體(TCR)，該細胞外域包含融合至效應域之抗體部分，其中該效應域包含跨膜域及/或TCR亞單元之細胞內傳訊域。
在一些實施例中，本申請案提供包含本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者之醫藥組合物。
在一些實施例中，本申請案提供表現本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者之宿主細胞。
在一些實施例中，本申請案提供編碼本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者之多肽組分之核酸。
在一些實施例中，本申請案提供包含本文所述的核酸中之任何者之效應細胞。在一些實施例中，該效應細胞係T細胞。
在一些實施例中，本申請案提供偵測其表面上呈遞拉比林或其部分的細胞之方法，該等方法包括：(a)使細胞與經分離的抗拉比林構築體接觸，其中該經分離的抗拉比林構築體包含包含標記之效應域；及(b)偵測該細胞上該標記之存在。
在一些實施例中，本申請案提供治療患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該等方法包括對該個體投與：(a)有效量之本文所述的醫藥組合物中之任何者；或(b)有效量之本文所述的效應細胞中之任何者。
在一些實施例中，本申請案提供診斷患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該等方法包括：(a)對個體投與有效量之經分離的抗拉比林構築體，其中該經分離的抗拉比林構築體包含包含標記之效應域；及(b)測定該個體中該標記之量，其中該標記之量高於閾值指示該個體患有拉比林陽性疾病。
在一些實施例中，本申請案提供診斷患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該等方法包括：(a)使衍生自個體之樣品與本文所述的經分離的抗拉比林構築體中之任何者接觸；及(b)鑑定該樣品中與分離的抗拉比林構築體結合之一或多個細胞，從而診斷患有拉比林陽性疾病之個體。
熟習此項技術者亦應明瞭，在不脫離本發明之範疇下，可對本文所述的實現案之形式及詳細內容進行改變。另外，儘管已參考各種實施案描述各種優點、態樣及標的，但本發明之範疇不應受此類優點、態樣及標的的參考限制。 定義
術語「抗體部分」包括全長抗體及其抗原結合片段。全長抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈。輕鏈及重鏈之可變區負責抗原結合。兩個鏈中之可變區通常包含三個高度可變環，稱為互補決定區(CDR) (輕鏈(LC) CDR包括LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，重鏈(HC) CDR包括HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3)。本文所揭示的抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat、Chothia或Al-Lazikani (Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)之約定來定義或鑑定。重鏈或輕鏈之三個CDR係插入在稱為框架區(FR)之側面延伸之間，其等相比CDR更高度保守並形成支架以支撐超變環。重鏈及輕鏈之恆定區不參與抗原結合，但展現各種效應功能。基於抗體重鏈之恆定區之胺基酸序列將抗體指定類別。抗體之五個主要類別或同型物係IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其特徵分別係存在α、δ、ε、γ及μ重鏈。幾種主要抗體類別分為亞類，諸如lgG1 (γ1重鏈)、lgG2 (γ2重鏈)、lgG3 (γ3重鏈)、lgG4 (γ4重鏈)、lgA1 (α1重鏈)、或lgA2 (α2重鏈)。
如本文所用，術語「抗原結合片段」係指抗體片段，包括(例如)雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定之雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚物(二價雙功能抗體)、由包含一或多個CDR之抗體之一部分形成之多特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體、二價域抗體或結合至抗原但不包含完整抗體結構之任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠結合至親本抗體或親本抗體片段(例如，親本scFv)結合的相同抗原。在一些實施例中，抗原結合片段可包含接枝至來自一或多種不同人類抗體之框架區之來自特定人類抗體之一或多個CDR。
如本文所用，術語「抗原決定基」係指抗體或抗體部分所結合之抗原上之原子或胺基酸之特定基團。若兩個抗體或抗體部分展現對抗原之競爭性結合，則其等可結合抗原內之相同抗原決定基。
如本文所用，當在等莫耳濃度之第一抗體部分之存在下第一抗體部分抑制第二抗體部分之靶拉比林結合至少約50%(諸如至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中之任何一者)時，第一抗體部分與第二抗體部分「競爭」結合至靶拉比林，或反之亦然。基於抗體之交叉競爭來「分選(binning)」抗體之高通量製程描述於PCT公開案第WO 03/48731號中。
如本文所用，術語「特異性結合」或「特異性針對」係指可測量且可再現之相互作用，諸如靶標與抗體或抗體部分之間的結合，該相互作用係決定在異質分子群體(包括生物分子)之存在下靶標之存在。例如，特異性結合至靶標(其可係抗原決定基)之抗體或抗體部分係相比其與其他靶標之結合以更大親和力、結合性、更容易及/或更長持續時間結合該靶標之抗體或抗體部分。在一些實施例中，特異性結合至抗原之抗體或抗體部分與該抗原(例如拉比林或其部分)之一或多個抗原決定子反應，其結合親和力為其對其他標靶之結合親和力的至少約10倍。
如本文所用，「經分離的」抗拉比林構築體係指：(1)不與自然界中發現的蛋白質締合之抗拉比林構築體，(2)不含來自相同來源之其他蛋白質之抗拉比林構築體，(3)由來自不同物種之細胞表現之抗拉比林構築體；或(4)不存在於自然界中之抗拉比林構築體。
如本文所用，術語「經分離的核酸」意指基因組、cDNA或合成來源之核酸或其某種組合，由於其來源，該「經分離的核酸」(1)不與其中發現自然界中「經分離的核酸」的多核苷酸之全部或部分締合；(2)係以可操作方式連接至其在自然界中不連接的多核苷酸；或(3)在自然界中不作為較大序列之部分出現。
如本文所用，術語「CDR」或「互補決定區」意指在重鏈多肽及輕鏈多肽之可變區內均發現的非連續抗原結合位點。Kabat等人，J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977)；Kabat等人，美國衛生及人類服務部(U.S. Dept. of Health and Human Services)，「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991)；Chothia等人，J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)；及MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996)已描述此等特定區域，其中該等定義包括當彼此比較時胺基酸殘基之重疊或子組。然而，指抗體或接枝抗體或其變異體之CDR之任一定義之應用預期在如本文所定義及使用的術語之範疇內。下表 1 中陳述涵蓋如由每個以上所引用的參考文獻所定義的CDR之胺基酸殘基作為比較。表 1 ： CDR 定義 Kabat 1 Chothia 2 MacCallum 3 VH CDR1          31-35           26-32        30-35 VH CDR2          50-65           53-55        47-58 VH CDR3          95-102         96-101    93-101 VL CDR1           24-34           26-32        30-36 VL CDR2           50-56           50-52        46-55 VL CDR3           89-97           91-96        89-961 殘基編號遵循Kabat等人，同前述之命名法2 殘基編號遵循Chothia等人，同前述之命名法3 殘基編號遵循MacCallum等人，同前述之命名法
術語「嵌合抗體」是指其中一部分重鏈及/或輕鏈與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的其餘部分與衍生自另一個物種或屬於另一個抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源的抗體，以及此類抗體的片段，只要它們表現出本發明的生物學活性(參見美國專利第4,816,567號；和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ， 81：6851-6855(1984))。
就抗體或抗體部分而言，術語「半合成」意指該抗體或抗體部分具有一或多個天然存在之序列及一或多個非天然存在 (亦即，合成) 之序列。
「Fv」係包含完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。該片段由呈緊密、非共價締合方式的一個重鏈可變區及一個輕鏈可變區之二聚物組成。由這兩個域之折疊產生六個超變環(各來自重鏈及輕鏈之3個環)，該等環貢獻用於抗原結合之胺基酸殘基並賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單個可變域(或僅包含對抗原具有特異性之三個CDR之Fv的一半)具有識別並結合抗原之能力，但是親和力低於整個結合位點。
「單鏈Fv」(亦縮寫為「sFv」或「scFv」)為包含連接至單個多肽鏈中之VH 及VL 抗體域之抗體片段。在一些實施例中，scFv多肽進一步包含在VH 域與VL 域之間的多肽連接子，其使得scFv形成用於抗原結合之所需結構。關於scFv的評審，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag，New York，第269頁-第315頁 (1994)。
術語「雙功能抗體」係指藉由通常以在VH 域與VL 域之間的短連接子(諸如約5至約10個殘基)構建scFv片段(參見前一段)製備的小抗體片段，使得達成V域之鏈間但非鏈內配對，從而產生二價片段，亦即，具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙功能抗體係兩個「交叉」scFv片段之異二聚體，其中該兩個抗體之VH 域及VL 域係存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更充分地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90: 6444-6448 (1993)中。
非人類(例如，囓齒動物)抗體之「人類化」形式係包含衍生自非人類抗體之最小序列之嵌合抗體。對於大部分而言，人類化抗體係人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之超變區(HVR)之殘基係經來自非人類物種(供體抗體) (諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之超變區之具有所需抗體特異性、親和力及能力之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基係經對應之非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在接受者抗體或在供體抗體中未發現的殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體性能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個(且通常兩個)可變域之實質上所有，其中所有或實質上所有超變環對應於非人類免疫球蛋白之其等超變環並所有或實質上所有FR係人類免疫球蛋白序列之其等。人類化抗體亦視需要包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常是人類免疫球蛋白之恆定區)之至少一部分。關於更多詳細內容，參見Jones等人，Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature 332: 323-329 (1988)；及Presta，Cu rr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述結合至抗體之Fc區之受體。在一些實施例中，本發明之FcR係結合IgG抗體(γ受體)並包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體之FcR，包括此等受體之對偶基因變異體及或者剪接形式。FcγRII受體包括具有主要區別在於其細胞質域之相似胺基酸序列之FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中包含基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中包含基於免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM) (參見評審M.，Daëron，Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997))。該術語包括同種異型，諸如FcγRIIIA同種異型：FcγRIIIA-Phe 158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131及/或FcγRIIA-H131。在以下中評審FcR：Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4: 25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)。本文術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來要鑑定的其等FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其係負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J. Immunol. 117: 587 (1976)及Kim等人，J. Immunol. 24: 249 (1994))。
術語「FcRn」係指新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn結構上類似於主要組織相容性複合體(MHC)並由非共價結合至β2-微球蛋白之α鏈組成。新生兒Fc受體FcRn之多種功能在以下中評審：Ghetie及Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18，739-766。FcRn在免疫球蛋白IgG從母體至幼兒之被動傳遞及血清IgG含量之調節中發揮作用。FcRn可充當救援受體，在細胞內及跨越細胞結合並運輸以完整形式胞吞之IgG，並從預設降解途徑營救胞吞IgG。
人類IgG Fc區之「CH1域」(亦稱為「H1」域之C1)通常從約胺基酸118延伸至約胺基酸215 (EU編號系統)。
一般而言，「鉸鏈區」定義為從人類IgG1之Glu216延伸至Pro230 (Burton，Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985))。藉由將形成重鏈間S-S鍵之第一個及最後一個半胱胺酸殘基置於相同位置，可將其他IgG同種型之鉸鏈區與IgG1序列進行比對。
人類IgG Fc區之「CH2域」(亦稱為「H2」域之C2)通常從約胺基酸231延伸至約胺基酸340。CH2域之獨特之處在於其沒有與另一域緊密配對。而是，兩個N連接之分支化碳水化合物鏈插入在完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。據推測，碳水化合物可提供域-域配對之替代物並有助於穩定CH2域。Burton，Molec Immunol. 22: 161-206 (1985)。
「CH3域」(亦稱為「C2」或「H3」域)包含Fc區中殘基C端至CH2域之延伸(亦即從抗體序列之約胺基酸殘基341至C端，通常在IgG之胺基酸殘基446或447)。
「功能性Fc片段」具有天然序列Fc區之「效應功能」。示例性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調等。一般而言，此等效應功能需要將Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合並可使用本技術中已知的各種分析進行評估。
包含具有「改變之」FcR結合親和力或ADCC活性之變異體IgG Fc之抗體為具有與親本多肽或與包含天然序列Fc區之多肽相比增強或減弱之FcR結合活性(例如，FcγR或FcRn)及/或ADCC活性之抗體。「展現增強之結合」至FcR之變異體Fc以比親本多肽或天然序列IgG Fc更高之親和力(例如，更低表觀Kd 或IC50 值)結合至少一個FcR。根據一些實施例，與親本多肽相比，結合之改良為約3倍，諸如約5、10、25、50、60、100、150、200或高達500倍中之任何一者、或約25%至1000%之結合改良。「展現減少之結合」至FcR之多肽變異體以比親本多肽更低之親和力(例如，更高表觀Kd 或更高IC50 值)結合至少一個FcR。與親本多肽相比，結合之減少可係約40%或更多之結合之減少。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指細胞毒性之形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)之分泌的Ig使得此等細胞毒性效應細胞特異性結合至帶有抗原之靶細胞並於隨後用細胞毒素殺死靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞並絕對是此種殺死所必需的。介導ADCC之主要細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)第464頁的表3中。為評估受關注分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析，諸如描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中之活體外ADCC分析。用於此類分析之可用之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如，在動物模型(諸如揭示於Clynes等人，PNAS(USA) 95: 652-656 (1998)中之動物模型)中評估所述分子之ADCC活性。
當該分析中具有變異體Fc區之多肽及具有野生型Fc區之多肽(或親本多肽)之量基本上相同時，包含變異體Fc區之多肽為在活體外或在活體內實質上更有效介導ADCC之多肽，該變異體Fc區比具有野生型IgG Fc之多肽或親本多肽「展現增強之ADCC」或在人類效應細胞之存在下更有效地介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。一般而言，將例如在動物模型中使用本技術中已知的任何活體外ADCC分析，諸如用於確定ADCC活性之分析或方法等來鑑定此類變異體。在一些實施例中，變異體比野生型Fc (或親本多肽)在介導ADCC方面約5倍至約100倍，例如約25倍至約50倍更有效。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體之存在下靶細胞之裂解。經典補體途徑之活化係藉由使補體系統(C1q)之第一組分結合至結合至其同源抗原之(適宜亞類之)抗體而引發。為評估補體活化，可進行CDC分析，例如如在Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202 :163 (1996)中所述。具有改變之Fc區胺基酸序列及增加或減少之C1q結合能力之多肽變異體描述於美國專利第6,194,551 B1號及第WO99/51642號中。此等專利公開案之內容係以引用的方式明確地併入本文中。亦可參見，Idusogie等人，J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)。
除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此為簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其程度為編碼蛋白質之核苷酸序列在某種形式中可包含內含子。
術語「以可操作方式連接」係指調節序列與異源核酸序列之間的功能性連接，其導致後者表現。例如，當將第一核酸序列放置於與第二核酸序列處於功能關係時，第一核酸序列係與第二核酸序列以可操作方式連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子係以可操作方式連接至該編碼序列。一般而言，以可操作方式連接之DNA序列相鄰並在需要的情況下於相同閱讀框中將兩個蛋白質編碼區連接。
「同源」係指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。當兩個比較序列兩者中之位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞單元佔據時，例如，若兩個DNA分子各者中之位置被腺嘌呤佔據，則此等分子在該位置係同源。兩個序列之間的同源性百分比係兩個序列共享的匹配或同源位置數除以所比較的位置數乘以100之函數。例如，若兩個序列中10個位置中的6個係匹配或同源的，則該兩個序列係60%同源的。舉例而言，DNA序列ATTGCC及TATGGC共享50%同源性。一般而言，當兩個序列係經比對以給出最大同源性時進行比較。
如本文所用，術語「實質上同源」係指與參考序列相比本文所揭示的序列之序列相似性，其中該序列與參考或其部分具有至少約85%相似性(例如，同源性)，諸如至少約86%相似性、87%相似性、88%相似性、89%相似性、90%相似性、91%相似性、92%相似性、93%相似性、94%相似性、95%相似性、96%相似性、97%相似性、98%相似性、99%相似性或100%相似性中之任何一者。用於確定序列相似性之方法係本技術中已知的，例如，如在Pearson, W. R.，Curr Protoc Bioinformatics，2013中所述。
當在本文中使用時，術語「標記」係指可偵測之化合物或組合物，其可直接或間接結合至抗拉比林抗體部分。標記本身可係可偵測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或在酵素標記之情況下，可催化可偵測之基質化合物或組合物之化學變化。
如本文所用，「治療(treatment)」或「治療(treating)」係用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)之方法。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於以下中之一者或多者：減輕由疾病引起之一或多種症狀，減弱疾病之程度，穩定疾病(例如，預防或延遲疾病之惡化)，預防或延遲疾病之擴散(例如，轉移)，預防或延遲疾病之復發，延遲或減慢疾病之發展，改善疾病狀態，緩解疾病(部分或全部)，減少治療疾病所需的一或多種其他藥物之劑量，延遲疾病之發展，增加或改良生活品質，增加體重增加，及/或延長存活期。「治療」亦包涵減少癌症之病理結果(諸如，例如，腫瘤體積)。本發明之方法涵蓋此等治療態樣中之任何一者或多者。
術語「復發(recurrence)」、「復發(relapse)」或「復發的(relapsed)」係指在對疾病消失進行臨床評估後癌症或疾病之回歸。診斷為遠端轉移或局部復發可認為係復發。
術語「難治性」或「抗性」係指對治療沒有反應之癌症或疾病。
如本文關於T細胞所用，「活化」係指已被充分刺激以引起可偵測之細胞增殖之T細胞之狀態。活化亦可與引起的細胞介素之產生及可偵測之效應功能相關。
如本文所用，術語「有效量」係指足以治療特定病症、病情或疾病，諸如改善、緩解、減弱及/或延遲病症、病情或疾病之一或多種症狀之化合物或組合物之量。就癌症而言，有效量包括足以例如引起腫瘤縮小及/或降低腫瘤之生長速率(諸如抑制腫瘤生長)或預防或延遲癌症中其他非所欲細胞增殖之量。在一些實施例中，有效量係足以延遲癌症發展之量。在一些實施例中，有效量係足以預防或延遲復發之量。可以一次或多次投藥來投與有效量。在癌症之情況下，藥物或組合物之有效量可：(i)減少癌細胞數量；(ii)縮小腫瘤尺寸；(iii)抑制、延遲、減慢至某種程度並較佳阻止癌細胞浸潤至周邊器官中；(iv)抑制(例如，在某種程度上減慢並較佳停止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤之發生及/或復發；及/或(vii)在某種程度上減輕與癌症有關之症狀中之一者或多者。
如本文所用，「醫藥上可接受」或「藥理學上相容」意指非生物學上或在其他方面非所需之材料，例如，該材料可經併入至投與患者的醫藥組合物中而不會引起任何顯著非所需的生物學效應或以有害方式與其中包含其的組合物之任何其他組分相互作用。醫藥上可接受之載劑或賦形劑較佳已滿足毒理學及製造測試之所需標準及/或包括在由美國食品及藥物管理局(U.S. Food and Drug administration)編寫的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)。
如本文所用，「延遲」癌症之發展意指推遲、妨礙、減慢、阻礙、穩定及/或延緩疾病之發展。該延遲可具有不同時間長度，取決於疾病之歷史及/或所治療之個體。對熟習此項技術者顯而易見的是，充分或顯著延遲可實際上包涵預防，因為個體不會發展疾病。當與不使用該方法相比時，「延遲」癌症之發展之方法係一種在給定時間框內降低疾病發展可能性及/或在給定時間框內降低疾病程度之方法。此類比較通常係基於使用統計學上顯著數目之個體之臨床研究。癌症發展可使用標準方法偵測到，包括但不限於電腦軸向斷層攝影術(CAT掃描)、磁共振成像(MRI)、腹部超音波、凝血試驗、動脈造影或活組織檢查。發展亦可指最初可能無法偵測到的癌症進展且包括發生、復發及發作。
術語「個體」係指哺乳動物且包括但不限於人類、牛、馬、貓科、犬科、囓齒動物或靈長類動物。
如本文所用，術語「基於」或「……之基礎」包括評估、確定、獲得或測量如本文所述的個體或其中的癌症之一或多種特徵，及在一些實施例中，選擇適於接受如本文所揭示的方法中所述的治療之個體。例如，當癌症之拉比林狀態用作用於選擇個體進行本文治療方法之基礎時，評估(或協助評估)、測量、獲得或確定拉比林狀態可包括在如本文所述的治療方法中，例如，在治療之前及/或期間及/或之後測量拉比林狀態，並由臨床醫生將獲得的值用於評估以下中之任何一者：(a)個體可能或極有可能適合最初接受治療；(b)個體可能或極有可能不適合最初接受治療；(c)對治療之反應；(d)個體可能或極有可能適合繼續接受治療；(e)個體可能或極有可能不適合繼續接受治療；(f)調整劑量；或(g)預測臨床效益之可能性。
在一些態樣中，本文所揭示的適於與本申請案之方法(諸如拉比林狀態)一起使用的基礎可基於與對照之比較。在一些實施例中，對照係從文獻獲得的已知標準(例如，已知基因序列、RNA序列、蛋白質序列、基因表現量)。在一些實施例中，對照係使用本文所揭示的方法從待治療或正在治療的個體獲得的對照樣品(例如，來自非癌性組織之對照樣品)。在一些實施例中，對照係使用本文所揭示的方法從除了待治療或正在治療的個體以外的個體獲得的對照樣品(例如，來自健康志願者或不患有癌症之志願者之對照樣品)。在一些實施例中，對照係從給定的患者群體獲得的。例如，關於基因表現量或酵素活性量，對於患者群體，對照量可係該基因之中位表現量或該酵素之中位酵素活性量。此外，例如，若確定單個患者之受關注基因之表現量高於患者群體之中位表現量，則確定該患者具有受關注基因之高表現。或者，例如，若確定單個患者之受關注基因之表現量低於患者群體之中位表現量，則確定該患者具有受關注基因之低表現。在一些實施例中，單個患者患有疾病(諸如癌症)及患者群體不患有疾病。在一些實施例中，單個患者及患者群體具有相同組織學類型之疾病。就所測量個體的數量而言，群體可為約以下或或者至少約以下中之任何一者：2、5、10、15、20、25、30、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、300、400、500。較佳地，測量足夠數量的個體以提供統計學上顯著的群體，此可藉由本技術中已知的方法來確定。在一些實施例中，群體係參與臨床試驗之群。
如本文所用，術語「包括」、「具有」、「含有」、及「包含」、及其他類似形式、及其語法等效物意欲在含義上等效且其為開放性在於此等詞語中之任何一者之後的一或多個項目並非意指該一或多個項目之詳述清單，或非意指僅受限於所列出的一或多個項目。例如，「包括」組件A、B及C之製品可由(亦即，僅包含)組件A、B及C組成，或不僅可包含組件A、B及C，而且可包含一或多個其他組件。因此，應希望且應明瞭，「包括」及其類似形式、及其語法等效物包括「基本由……組成」或「由……組成」之實施例之揭示內容。
在提供值範圍之情況下，應明瞭，除非本文清楚地另作指明否則在該範圍之上限與下限之間的至下限單位的十分之一之每個介入值及該規定範圍內的任何其他規定或介入值被包括在本發明內，受到該規定範圍內的任何明確排除的限制。在規定範圍包括該等極限中之一者或兩者之情況下，排除彼等所包含限值之任一者或兩者之範圍亦包括在本發明中。
本文中提及「約」某一值或參數時包括(並描述)針對該值或參數本身之變化。例如，關於「約X」之描述包括「X」之描述。
如本文所用，包括在隨附申請專利範圍中，單數形式「一個」、「一種」及「該」包括複數個指代，除非本文清楚地另作指明。 抗LAB構築體
本申請案提供抗拉比林構築體(在本文中稱為「抗LAB構築體」)，諸如經分離的抗LAB構築體，其包含特異性結合至拉比林或其部分之抗體部分及效應域。在一些實施例中，該抗體部分係結合至效應域。例如，效應域可包含可係治療劑或標記之效應分子。在一些實施例中，該治療劑係選自由藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸組成之群。在一些實施例中，效應分子係診斷劑，諸如標記。效應分子之結合係本技術中熟知的，且可包括共價結合(例如，經由化學鍵或經由連接子)或非共價相互作用(例如，經由生物素/鏈黴親和素及其他蛋白質-蛋白質相互作用對)。
在一些實施例中，抗拉比林構築體係融合蛋白。例如，抗拉比林抗體部分可係CAR (嵌合抗原受體)、經工程改造之TCR或雙特異性T細胞接合分子之部分。此等不同構築體更詳細地論述於以下部分中。 抗LAB CAR
本申請案之一個態樣中提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含特異性結合至拉比林或其部分之抗體部分(本文稱為「抗LAB CAR」)。亦提供包含包含抗LAB抗體部分之CAR之CAR效應細胞(例如，T細胞) (本文亦稱為「抗LAB CAR效應細胞」，例如，「抗LAB CAR T細胞」)。
抗LAB CAR包含(a)包含特異性結合至拉比林之抗LAB抗體部分之細胞外域及(b)細胞內傳訊域。跨膜域可存在於細胞外域與細胞內域之間。在抗LAB CAR之細胞外域與跨膜域之間，或在抗LAB CAR之細胞內域與跨膜域之間，可能存在連接子或間隔子域。連接子或間隔子域可係任何寡肽或多肽，用於將跨膜域連接至多肽鏈中之細胞外域或細胞內域。間隔子域可包含至多約300個胺基酸，包括例如約10個至約100個、或約25個至約50個胺基酸。
跨膜域可衍生自天然來源或衍生自合成來源。在來源係天然之情況下，該域可衍生自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。本發明中之特定用途之跨膜區可衍生自以下之α、β、δ或γ鏈(亦即，包含至少以下之α、β、δ或γ鏈之跨膜區)：T細胞受體、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。在一些實施例中，跨膜域可係合成的，在該情況下，其可主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些實施例中，可在合成跨膜域之每個末端發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。在一些實施例中，長度為例如約2個至約10個(諸如約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個中之任何一者)胺基酸長度之短寡肽或多肽連接子可形成在抗LAB CAR之跨膜域與細胞內傳訊域之間的連接。在一些實施例中，連接子係甘胺酸-絲胺酸雙聯體。
在一些實施例中，使用天然與抗LAB CAR之細胞內域中之序列中之一者相關聯之跨膜域(例如，若抗LAB CAR細胞內域包含CD28共刺激序列，則該抗LAB CAR之跨膜域係衍生自CD28跨膜域)。在一些實施例中，可藉由胺基酸取代來選擇或修飾跨膜域以避免此類域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域以最小化與受體複合體之其他成員之相互作用。
抗LAB CAR之細胞內傳訊域負責活化免疫細胞之正常效應功能中之至少一者，該免疫細胞中已置入抗LAB CAR之。例如，T細胞之效應功能可係細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞介素之分泌。因此，術語「細胞內傳訊域」係指蛋白質之部分，其轉導效應功能信號並指導細胞執行專門的功能。儘管通常可使用整個細胞內傳訊域，但在許多情況下，不必使用整個鏈。就使用細胞內傳訊域之截短部分而言，該截短部分可用於替代完整鏈，只要其轉導效應功能信號即可。因此，術語「細胞內信號序列」意指包括足以轉導效應功能信號之細胞內傳訊域之任何截短部分。
用於本發明之抗LAB CAR中之細胞內傳訊域之實例包括T細胞受體(TCR)之細胞質序列及協同作用以在抗原受體接合後引起信號轉導之共受體、以及此等序列之任何衍生物或變異體以及具有相同功能能力之任何合成序列。
已知在一些實施例中，僅藉由TCR生成的信號不足以完全活化T細胞且亦可能需要次級或共刺激信號。因此，在一些實施例中，T細胞活化可藉由兩個不同類別之細胞內信號序列介導：彼等經由TCR引起抗原依賴性初級活化之序列(初級信號序列)及彼等以抗原依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號之序列(共刺激信號序列)。初級信號序列以刺激方式或以抑制方式調節TCR複合體之初級活化。以刺激方式起作用的初級信號序列可包含稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM之信號基序。在一些實施例中，抗LAB CAR構築體包含一或多個ITAM。本發明中之具有特定用途之包含ITAM之初級信號序列之實例包括彼等衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之序列。
在一些實施例中，抗LAB CAR包含衍生自CD3ζ之初級信號序列。例如，CAR之細胞內傳訊域可包含CD3ζ細胞內信號序列本身或與可用於本發明之抗LAB CAR之內文中之任何其他所需細胞內信號序列組合包含CD3ζ細胞內信號序列。例如，抗LAB CAR之細胞內域可包含CD3ζ細胞內信號序列及共刺激信號序列。共刺激信號序列可係共刺激分子之細胞內域之部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體及類似者。
在一些實施例中，抗LAB CAR之細胞內傳訊域包含CD3ζ之細胞內信號序列及CD28之細胞內信號序列。在一些實施例中，抗LAB CAR之細胞內傳訊域包含CD3ζ之細胞內信號序列及4-1BB之細胞內信號序列。在一些實施例中，抗LAB CAR之細胞內傳訊域包含CD3ζ之細胞內信號序列及CD28及4-1BB之細胞內信號序列。
因此，例如，在一些實施例中，提供一種抗LAB CAR，其包含：(a)包含特異性結合至拉比林之抗LAB抗體部分之細胞外域，(b)跨膜域，及(c)細胞內傳訊域。在一些實施例中，細胞內傳訊域能夠活化免疫細胞。在一些實施例中，細胞內傳訊域包含初級信號序列及共刺激信號序列。在一些實施例中，初級信號序列包含CD3ζ細胞內信號序列。在一些實施例中，共刺激信號序列包含CD28細胞內信號序列。在一些實施例中，細胞內域包含CD3ζ細胞內信號序列及CD28細胞內信號序列。 抗LAB TCR
在一些實施例中，將抗LAB抗體部分融合至T細胞受體(TCR)亞單元之N端，從而形成抗LAB T細胞受體(本文稱為「抗LAB TCR」)。
如本文所用，「T細胞受體」或「TCR」係指包含結合至結合在MHC分子中之特異性抗原肽之細胞外抗原結合域之內源或重組T細胞受體。在一些實施例中，TCR包含TCRα多肽鏈及TCRβ多肽鏈。在一些實施例中，TCR包含TCRγ多肽鏈及TCRδ多肽鏈。在一些實施例中，TCR特異性結合腫瘤抗原。「TCR-T」係指表現重組TCR之T細胞。如本文所用，「TCR複合體」係指TCR及CD3之複合體。本文所用的「TCR亞單元」係指TCR複合體之亞單元，其包括例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ及CD3ζ。抗LAB抗體部分可融合至任何TCR亞單元的N端。
因此，例如，在一些實施例中，提供一種經工程改造之TCR，其包含：(a)特異性結合至拉比林之抗LAB抗體部分，及(b)TCR亞單元。在一些實施例中，抗體部分係融合至TCR亞單元的N端。在一些實施例中，TCR亞單元係選自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ及CD3ζ組成之群。 抗拉比林雙特異性抗體
在一些實施例中，該抗LAB構築體係多特異性抗體。具有不同特異性之抗體或其抗原結合片段亦可經化學交聯以生成多特異性異結合物抗體。例如，可將分別對不同抗原具有特異性之兩個F(ab’)2分子化學連接。
在一些實施例中，該抗體部分係多特異性的。在一些實施例中，該多特異性抗體部分係串聯scFv、雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙重親和力再靶向(DART)抗體、雙重可變域(DVD)抗體、結進孔(KiH)抗體、對接及鎖定(DNL)抗體、化學交聯抗體、異多聚體抗體或異結合物抗體。在一些實施例中，該多特異性抗體部分係包含藉由可選之肽連接子連接之兩個scFv之串聯scFv。
在一些實施例中，可使用重組DNA技術來製備多特異性抗體。例如，可藉由融合兩個scFv，諸如藉由使其等經由肽連接子融合，從而產生串聯scFv，來工程改造雙特異性抗體。串聯scFv之一個實例係雙特異性T細胞接合子。藉由將抗CD3 scFv連接至對靶細胞之表面抗原(諸如腫瘤相關抗原(TAA))具特異性之scFv，從而使T細胞再定向至靶細胞，來製得雙特異性T細胞接合子。
因此，例如，在一些實施例中，提供雙特異性T細胞接合子，其包含：(a)特異性結合至拉比林之抗LAB抗體部分，及(b)特異性結合至CD3之抗CD3抗體部分。在一些實施例中，提供雙特異性T細胞接合子，其包含：(a)特異性結合至拉比林之scFv，及b)特異性結合至CD3之scFv。 抗LAB抗體-藥物結合物(ADC)或其他結合物
在一些實施例中，抗LAB構築體包含含有抗LAB抗體部分連接至效應分子之免疫結合物(本文中亦稱為「抗LAB免疫結合物」)。在一些實施例中，效應分子係治療劑，諸如癌症治療劑，其係細胞毒性、細胞生長抑制性，或以其他方式提供一些治療效益。在一些實施例中，效應分子係標記，其可直接或間接產生可偵測之信號。
在一些實施例中，提供一種包含抗LAB抗體部分及治療劑之抗LAB免疫結合物(本文亦稱為「抗體-藥物結合物」或「ADC」)。在一些實施例中，治療劑係細胞毒性、細胞生長抑制性或以其他方式防止或降低靶細胞分裂能力之毒素。重要地，由於大多數正常細胞在其表面上不存在LAB，因此其等不能結合抗LAB免疫結合物，並受到保護免受毒素或其他治療劑之殺死效應。
用於抗LAB免疫結合物中之治療劑包括例如道諾黴素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)，甲胺蝶呤及長春地辛(vindesine) (參見例如Rowland等人，Cancer Immunol Immunother，21，1986)。用於抗LAB免疫結合物之毒素包括細菌毒素(諸如白喉毒素)、植物毒素(諸如蓖麻毒素)、小分子毒素(例如格爾德黴素(geldanamycin))、類美登素(maytansinoids)及卡奇黴素(calicheamicin)。毒素可藉由機制(包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制)發揮其細胞毒性及細胞抑制性效應。一些細胞毒性藥物在結合至大抗體或蛋白質受體配位體時傾向為無活性或較低活性。
在一些實施例中，可將抗LAB抗體部分結合至「受體」(諸如鏈黴親和素)用於腫瘤預靶向，其中將該抗體-受體結合物投與患者，然後使用清除劑從循環除去未結合的結合物及然後投與結合至細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)之「配位體」(例如抗生物素蛋白(avidin))。
本申請案進一步提供包含抗LAB抗體部分連接至效應分子之抗LAB免疫結合物，其中該效應分子係標記，其可間接或直接產生可偵測之信號。此等抗LAB免疫結合物可用於研究或診斷應用，諸如用於活體內偵測癌症。標記較佳能夠直接或間接產生可偵測之信號。例如，標記可係不透放射線的(radio-opaque)或放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；螢光(螢光團)或化學發光(發色團)化合物，諸如異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)或蟲螢光素；酵素，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；成像劑；或金屬離子。在一些實施例中，抗LAB免疫結合物係間接可偵測的。例如，對於抗LAB免疫結合物具有特異性並包含可偵測標記之二級抗體可用於偵測抗LAB免疫結合物。
因此，例如，在一些實施例中，提供抗LAB免疫結合物，其包含：(a)特異性結合至拉比林之抗LAB抗體部分；及(b)效應分子。在一些實施例中，該效應分子係治療劑。在一些實施例中，該效應分子係標記。 抗LAB抗體部分
在一個態樣中，本申請案提供特異性結合至拉比林或其部分之抗體部分(本文稱為「抗LAB抗體部分」)。抗拉比林構築體包含抗LAB抗體部分。在一些實施例中，抗LAB抗體部分特異性結合至存在於細胞之表面上之拉比林。在一些實施例中，該細胞係癌細胞。在一些實施例中，該癌細胞係實體腫瘤，諸如轉移性癌細胞。
在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係全長抗體。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係抗原結合片段，例如，選自由Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)及單鏈抗體分子(scFv)組成之群之抗原結合片段。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係scFv。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係人類、人類化或半合成的。
在一些實施例中，該抗LAB抗體部分特異性結合至拉比林衍生肽或其部分。在一些實施例中，該拉比林衍生肽包含選自拉比林之部分(SEQ ID NO:1；參見表 2 )之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係衍生自藉由使用拉比林衍生肽作為免疫原產生的抗體。在一些實施例中，當使用拉比林衍生肽作為免疫原時，拉比林衍生肽係結合至載劑，諸如白蛋白或KLH。
在一些實施例中，該拉比林衍生肽係與拉比林之部分(SEQ ID NO:1)具有至少約60%相似性，諸如至少約65%相似性、70%相似性、75%相似性、80%相似性、85%相似性、90%相似性或95%相似性之序列相似性之肽，其中該拉比林衍生肽不包含末端脯胺酸殘基，且其中該拉比林衍生肽包含至少一個脯胺酸殘基，諸如2個、3個、4個或5個脯胺酸殘基。在一些實施例中，該拉比林衍生肽係與拉比林之部分(SEQ ID NO:1)具有至少約60%相似性，諸如至少約65%相似性、70%相似性、75%相似性、80%相似性、85%相似性、90%相似性或95%相似性之序列相似性之肽，其中該拉比林衍生肽之一個末端不包含末端脯胺酸殘基，且其中該拉比林衍生肽包含至少一個脯胺酸殘基，諸如2個、3個、4個或5個脯胺酸殘基。在一些實施例中，該拉比林衍生肽為7至50個胺基酸長度，諸如7至25個胺基酸長度、7至13個胺基酸長度或21至25個胺基酸長度中之任何一者。在一些實施例中，該拉比林衍生肽為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸長度。在一些實施例中，該拉比林衍生肽與拉比林之部分實質上同源(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，該拉比林衍生肽與拉比林之部分(SEQ ID NO:1)具有至少約60%相似性，諸如至少約65%相似性、70%相似性、75%相似性、80%相似性、85%相似性、90%相似性或95%相似性中之任何一者之序列相似性。在一些實施例中，拉比林衍生肽或其衍生物與拉比林之部分(SEQ ID NO:1)具有至少約60%相似性之序列相似性，其中該拉比林衍生肽之序列之5個胺基酸中的1個、2個、3個、4個係經缺失、取代、插入及/或新增至該拉比林衍生肽，且其中當存在取代、插入及/或新增時，一個部分係經取代、插入、及/或新增至該序列。在一些實施例中，經取代、插入或新增之部分係天然胺基酸(例如，α-胺基酸或L-胺基酸或D-胺基酸)或非天然胺基酸。在一些實施例中，經取代、插入或新增之部分係胺基酸替代物或連接子。在一些實施例中，拉比林衍生肽包含T細胞抗原決定基及/或B細胞抗原決定基。
在一些實施例中，該拉比林衍生肽包含選自SEQ ID NO:2至32 (表 2 )之序列或其變異體。在一些實施例中，包含選自SEQ ID NO:2至32 (表 2 )之序列或其變異體之拉比林衍生肽包含一個或兩個側接胺基酸序列，該一個或兩個側接胺基酸序列係新增在以SEQ ID NO:2至32提供的核心序列之末端。在一些實施例中，包含一個或兩個側接胺基酸序列之拉比林衍生肽為與拉比林之部分(SEQ ID NO:1)具有至少約60%相似性，諸如至少約65%相似性、70%相似性、75%相似性、80%相似性、85%相似性、90%相似性或95%相似性中之任何一者之序列相似性之肽。在一些實施例中，側接胺基酸序列係基於拉比林之部分(SEQ ID NO:1)之序列且為來自以SEQ ID NO:2至32提供的每個核心序列之拉比林序列之各自的延續，諸如從核心序列之一個或兩個末端開始。例如，對於SEQ ID NO:3，在SEQ ID NO:3左側的兩個胺基酸之第一側接胺基酸序列將係Pro-Ala，及在SEQ ID NO:3右側的兩個胺基酸之第二側接胺基酸序列將係Glu-Ala。表 2. 拉比林及拉比林衍生肽之胺基酸序列。
   胺基酸序列
SEQ ID NO: 1 Met-Val-Ile-Ala-Leu-Leu-Gly-Val-Trp-Thr-Ser-Val-Ala-Val-Val-Trp-Phe-Asp-Leu-Val-Asp-Tyr-Glu-Glu-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Gly-Ile-Tyr-Asp-Ala-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Phe-Asp-Val-Asp-Asp-Ala-Lys-Val-Leu-Leu-Gly-Leu-Lys-Glu-Arg-Ser-Thr-Ser-Glu-Pro-Ala-Val-Pro-Pro-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-His-Thr-Glu-Pro-Glu-Glu-Gln-Val-Pro-Val-Glu-Ala-Glu-Pro-Gln-Asn-Ile-Glu-Asp-Glu-Ala-Lys-Glu-Gln-Ile-Gln-Ser-Leu-Leu-His-Glu-Met-Val-His-Ala-Glu-His-Val-Glu-Gly-Glu-Asp-Leu-Gln-Gln-Glu-Asp-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Pro-Gln-Gln-Glu-Asp-Asp-Glu-Phe-Leu-Met-Ala-Thr-Asp-Val-Asp-Asp-Arg-Phe-Glu-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Val-Ser-His-Glu-Glu-Thr-Glu-His-Ser-Tyr-His-Val-Glu-Glu-Thr-Val-Ser-Gln-Asp-Cys-Asn-Gln-Asp-Met-Glu-Glu-Met-Met-Ser-Glu-Gln-Glu-Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Glu-Pro-Val-Val-Glu-Asp-Glu-Arg-Leu-His-His-Asp-Thr-Asp-Asp-Val-Thr-Tyr-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Gln-Ala-Val-Tyr-Glu-Pro-Leu-Glu-Asn-Glu-Gly-Ile-Glu-Ile-Thr-Glu-Val-Thr-Ala-Pro-Pro-Glu-Asp-Asn-Pro-Val-Glu-Asp-Ser-Gln-Val-Ile-Val-Glu-Glu-Val-Ser-Ile-Phe-Pro-Val-Glu-Glu-Gln-Gln-Glu-Val-Pro-Pro-Asp-Thr
SEQ ID NO: 2 Glu-Pro-Ala
SEQ ID NO: 3 Val-Pro-Pro-Glu
SEQ ID NO: 4 Glu-Pro-His
SEQ ID NO: 5 Glu-Pro-Glu
SEQ ID NO: 6 Val-Pro-Val
SEQ ID NO: 7 Glu-Pro-Gln
SEQ ID NO: 8 Gly-Pro-Thr
SEQ ID NO: 9 Asn-Pro-Asp
SEQ ID NO: 10 Glu-Pro-Val
SEQ ID NO: 11 Glu-Pro-Leu
SEQ ID NO: 12 Ala-Pro-Pro-Glu
SEQ ID NO: 13 Asn-Pro-Val
SEQ ID NO: 14 Phe-Pro-Val
SEQ ID NO: 15 Val-Pro-Pro-Asp
SEQ ID NO: 16 Glu-Pro-Ala-Val-Pro-Pro-Glu
SEQ ID NO: 17 Val-Pro-Pro-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-His
SEQ ID NO: 18 Glu-Pro-His-Thr-Glu-Pro-Glu
SEQ ID NO: 19 Glu-Pro-Glu-Glu-Gln-Val-Pro-Val
SEQ ID NO: 20 Val-Pro-Val-Glu-Ala-Glu-Pro-Gln
SEQ ID NO: 21 Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Pro-Gln
SEQ ID NO: 22 Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Glu-Pro-Val
SEQ ID NO: 23 Ala-Pro-Pro-Glu-Asp-Asn-Pro-Val
SEQ ID NO: 24 Phe-Pro-Val-Glu-Glu-Gln-Gln-Glu-Val-Pro-Pro-Asp
SEQ ID NO: 25 Asp-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Pro-Gln-Gln-Glu
SEQ ID NO: 26 Glu-Gln-Glu-Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Glu-Pro-Val
SEQ ID NO: 27 Ala-Pro-Pro-Glu-Asp-Asn-Pro-Val-Glu-Asp
SEQ ID NO: 28 Glu-Glu-Gln-Gln-Glu-Val-Pro-Pro-Asp
SEQ ID NO: 29 Gly-Glu-Asp-Leu-Gln-Gln-Glu-Asp-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Pro-Gln-Gln-Glu-Asp-Asp-Glu-Phe-Leu
SEQ ID NO: 30 Asp-Met-Glu-Glu-Met-Met-Ser-Glu-Gln-Glu-Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Glu-Pro-Val-Val-Glu-Asp-Glu
SEQ ID NO: 31 Asn-Glu-Gly-Ile-Glu-Ile-Thr-Glu-Val-Thr-Ala-Pro-Pro-Glu-Asp-Asn-Pro-Val-Glu-Asp-Ser-Gln
SEQ ID NO: 32 Asp-Ser-Gln-Val-Ile-Val-Glu-Glu-Val-Ser-Ile-Phe-Pro-Val-Glu-Glu-Gln-Gln-Glu-Val-Pro-Pro-Asp
在一些實施例中，抗LAB抗體部分(或包含抗LAB抗體部分之抗LAB構築體)以在約0.1 pM至約500 nM之間(諸如約0.1 pM、1.0 pM、10 pM、50 pM、100 pM、500 pM、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM或500 nM中之任何一者，包括在此等值之間之任何範圍)之Kd 結合至拉比林或其部分。
在一些實施例中，抗LAB抗體部分(或包含抗LAB抗體部分之抗LAB構築體)結合至拉比林或其部分之一或多個(諸如2個或3個)抗原決定基。
在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含特異性序列或此等序列之某些變異體。在一些實施例中，變異體序列中之胺基酸取代實質上不降低抗LAB抗體部分結合拉比林或其部分之能力。例如，可進行實質上不降低拉比林結合親和力之改變。亦考慮實質上改良拉比林結合親和力或影響某種其他性質之改變，諸如與拉比林之相關變異體之特異性及/或交叉反應性。
本技術中已揭示抗拉比林抗體，例如，美國專利第6,166,176號、美國專利第7,635,759號及國際公開案第WO2011116014號，其各自之全部揭示內容係以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含結合至拉比林之MCA44-3A6或其部分。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係MCA44-3A6。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係與結合至拉比林之MCA44-3A6或其部分競爭。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含來自MCA44-3A6之一或多個CDR。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含結合至拉比林之X373或其部分。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係X373。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係與結合至拉比林之X373或其部分競爭。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含結合至拉比林之X509或其部分。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係X509。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分係與結合至拉比林之X509或其部分競爭。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含以SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 35所顯示的可變重鏈域互補決定區(CDR)中之一者或多者。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含以SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 38所顯示的可變輕鏈域互補決定區(CDR)中之一者或多者。在一些實施例中，該抗LAB抗體部分包含以SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 35所顯示的可變重鏈域互補決定區(CDR)中之一者或多者，及以SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 38所顯示的可變輕鏈域互補決定區(CDR)中之一者或多者。 表3.CDR序列
   CDR 序列
SEQ ID NO: 33 Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr-Leu-Asn
SEQ ID NO: 34 Leu-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser
SEQ ID NO: 35 Leu-Gln-Gly-Ser-His-Phe-Pro-Arg-Thr
SEQ ID NO: 36 Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Arg-Tyr-Thr-Met-Ser
SEQ ID NO: 37 Tyr-Ile-Ser-Asn-Gly-Gly-Arg-Ser-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly
SEQ ID NO: 38 Ala-Met-Asp-Asn
核酸及效應細胞
本文亦提供編碼抗LAB構築體或抗LAB抗體部分之核酸分子。在一些實施例中，提供編碼全長抗LAB抗體之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，提供編碼多特異性抗LAB分子(例如，多特異性抗LAB抗體、雙特異性抗LAB抗體或雙特異性T細胞接合子抗LAB抗體)之核酸(或一組核酸)或其多肽部分。在一些實施例中，提供編碼抗LAB抗體部分之核酸(或一組核酸)。在一些實施例中，提供編碼抗LAB免疫結合物之核酸(或一組核酸)或其多肽部分。
本申請案亦包括此等核酸序列之變異體。例如，該等變異體包括在至少中等嚴格雜合條件下雜合至編碼本申請案之抗LAB構築體或抗LAB抗體部分之核酸序列之核苷酸序列。
本發明亦提供其中插入本發明之核酸之載體。
簡而言之，可藉由將核酸插入至適宜表現載體中，以使核酸以可操作方式連接至5'及3'調節元件，包括例如啟動子(例如，淋巴細胞特異性啟動子)及3'未轉譯區(UTR)，來達成抗LAB構築體(例如，抗LAB CAR)或其多肽部分藉由編碼抗LAB構築體或其多肽部分之天然或合成核酸表現。該等載體可適合在真核宿主細胞中複製及整合。典型選殖及表現載體包含轉錄及轉譯終止子、引發序列及可用於調節所需核酸序列之表現之啟動子。
使用標準基因遞送方案，本發明之核酸亦可用於核酸免疫接種及基因療法。用於基因遞送之方法係本技術中已知的。參見，例如，全文以引用的方式併入本文中之美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號。在一些實施例中，本發明提供基因療法載體。
可將核酸選殖至許多類型之載體中。例如，可將核酸選殖至載體(包括但不限於質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體)中。特別受關注的載體包括表現載體、複製載體、探針生成載體及定序載體。
此外，表現載體可以病毒載體之形式提供至細胞。病毒載體技術係本技術中熟知的且描述於例如Sambrook等人(2001，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)、及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。一般而言，適宜載體包含在至少一種生物中起作用的複制起點、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個可選擇之標誌(參見，例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已開發許多基於病毒之系統以用於至哺乳動物細胞中之基因轉移。例如，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供方便的平臺。可使用本技術中已知的技術將所選的基因插入至載體中並包裝在逆轉錄病毒粒子中。然後可分離重組病毒並在活體內或離體遞送至個體之細胞。許多逆轉錄病毒系統係本技術中已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體係本技術中已知的。在一些實施例中，使用慢病毒載體。衍生自逆轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體係達成長期基因轉移之適宜工具，因為其等允許轉殖基因之長期穩定地整合轉殖基因及其在子代細胞繁殖中。慢病毒載體與衍生自癌逆轉錄病毒之載體(諸如鼠類白血病病毒)相比具有增加的優點，因為其等可轉導非增殖性細胞(諸如肝細胞)。其等亦具有增加的低免疫原性優點。
另外啟動子元件(例如，增強子)調節轉錄引發之頻率。通常，此等元件位於起始位點上游的區域30至110 bp中，儘管最近已顯示許多啟動子亦包含起始位點下游的功能性元件。啟動子元件之間的間隔通常係可撓的，因此當元件相對於彼此反轉或移動時，啟動子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可在活性開始下降之前增加至隔開50 bp。
適宜啟動子之一個實例係即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列係強組成型啟動子序列，能夠驅動以可操作方式連接至其之任何多核苷酸序列之高量表現。適宜啟動子之另一個實例係延伸生長因子-1α (EF-1α)。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複蛋白(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、Epstein-Barr病毒即刻早期啟動子、Rous肉瘤病毒啟動子、以及人類基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應受限於組成型啟動子之使用。誘導型啟動子亦被認為是本發明之一部分。誘導型啟動子之使用提供一種分子開關，該分子開關能夠在需要此種表現時開啟以可操作方式連接其的多核苷酸序列之表現，或在不需要表現時關閉該表現。誘導型啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
為評估多肽或其部分之表現，待引入至細胞中之表現載體亦可包含可選擇之標記基因或報導子基因中任一者或兩者以促進從尋求待經由病毒載體轉染或感染的細胞群體鑑定並選擇表現細胞。在其他態樣中，可選擇之標誌可攜帶在單獨的DNA片上並用於共轉染程序中。可選擇之標誌及報導子基因均可側接有適宜調節序列以達成宿主細胞中之表現。可用的可選擇之標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo及類似者。
報導子基因係用於鑑定潛在轉染之細胞及用於評估調節序列之功能性。一般而言，報導子基因係不存在於受體生物體或組織中或不由受體生物或組織表現且編碼多肽之基因，該多肽之表現藉由一些易於偵測之性質(例如酵素活性)表現出來。在將DNA引入至接受者細胞後的適宜時間分析報導子基因之表現。適宜報導子基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌的鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因 (例如，Ui-Tel等人，FEBS Letters，479，2000)。適宜表現系統係熟知的且可使用已知技術來製備或市售獲得。一般而言，將具有顯示最高量之報導子基因表現之最小5'側接區之構築體鑑定為啟動子。此等啟動子區可經連接至報導子基因並用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄之能力。
引入並表現基因至細胞中之方法係本技術中已知的。在表現載體之情況下，可藉由本技術中之任何方法將載體容易地引入至宿主細胞(例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。例如，可藉由物理、化學或生物學方法將表現載體轉移至宿主細胞中。
用於引入多核苷酸至宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及類似者。用於產生包含載體及/或外源核酸之細胞之方法係本技術中熟知的。參見，例如，Sambrook等人(2001，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。在一些實施例中，藉由磷酸鈣轉染將多核苷酸引入至宿主細胞中。
用於引入受關注多核苷酸至宿主細胞中之生物學方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體(且尤其是逆轉錄病毒載體)已成為用於將基因插入至哺乳動物(例如，人類細胞)之最廣泛使用的方法。其他病毒載體可衍生自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒1、腺病毒及腺相關病毒、及類似者。參見，例如，美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
用於引入多核苷酸至宿主細胞中之化學方法包括膠態分散系統，諸如大分子複合體、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。在活體外及活體內用作遞送媒劑之一個例示性膠態系統係脂質體(例如，人工膜囊泡)。
在使用非病毒遞送系統之情況下，一個示例性遞送媒劑係脂質體。考慮使用脂質調配物以將核酸引入至宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一個態樣中，該核酸可與脂質締合。經脂質締合之核酸可封裝在脂質體之水性內部中，散佈在脂質體之脂質雙層中，藉由經脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子連接至脂質體，被包裹在脂質體中，與脂質體複合，分散在包含脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，呈含在脂質中之懸浮液包含，與膠束包含或複合，或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合之組合物不受限於含在溶液中之任何特定結構。例如，其等可以雙層結構、呈膠束或以「塌陷結構」存在。其等亦可簡單地散佈在溶液中，可能會形成大小或形狀不均勻之聚集體。脂質係可係天然存在之脂質或合成脂質之脂肪物質。例如，脂質包括天然存在於細胞質中之脂肪滴以及包含長鏈脂族烴及其衍生物之一類化合物，諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。
不管用於引入外源核酸至宿主細胞中或以其他方式將細胞暴露至本發明之抑制劑之方法，為確認宿主細胞中重組DNA序列之存在，可進行多種分析。此類分析包括例如熟習此項技術者熟知的「分子生物學」分析，諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如例如藉由免疫學方法(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所述的分析來偵測特定肽之存在或不存在以鑑定落在本發明之範疇內之藥劑。
在一些實施例中，提供在其表面上呈遞本文所述的抗LAB構築體之效應細胞(諸如T細胞)。在一些實施例中，該效應細胞(諸如T細胞)在其表面上包含本文所述的抗LAB CAR多肽。在一些實施例中，該效應細胞包含編碼本文所述的抗LAB CAR多肽之核酸，其中該自核酸表現之抗LAB CAR多肽或其部分係位於效應細胞之表面上。在一些實施例中，該效應細胞(諸如T細胞)在其表面上包含本文所述的抗LAB TCR多肽。在一些實施例中，該效應細胞包含編碼本文所述的抗LAB TCR多肽之核酸，其中該自核酸表現之抗LAB TCR多肽或其部分係位於效應細胞之表面上。在一些實施例中，該效應細胞(諸如T細胞)在其表面上包含本文所述的多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)、多肽。在一些實施例中，該效應細胞包含編碼本文所述的多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)、多肽之核酸，其中該自核酸表現之多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)、多肽或其部分係位於效應細胞之表面上。
可用於本發明之示例性效應細胞包括但不限於樹突狀細胞(包括未成熟樹突狀細胞及成熟樹突狀細胞)、T淋巴細胞(諸如初始T細胞、效應T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴細胞、T輔助細胞、自然殺手T細胞、Treg細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)及淋巴因子活化殺手(LAK)細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、粒細胞及其組合。效應細胞之亞群可藉由本技術中已知的一或多種細胞表面標誌之存在或不存在來定義(例如，CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等)。
在一些實施例中，該效應細胞係工程效應細胞，諸如經工程改造之哺乳動物效應細胞。在醫藥組合物包含複數個經工程改造之哺乳動物效應細胞之情況下，該經工程改造之哺乳動物效應細胞可係效應細胞類型之特定亞群、效應細胞類型之亞群之組合或兩種或更多種效應細胞類型之組合。在一些實施例中，該效應細胞係存在於同源細胞群體中。在一些實施例中，該效應細胞係存在於在效應細胞中增強之異源細胞群體中。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係淋巴細胞。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞不係淋巴細胞。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係適於授受性免疫療法。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係PBMC。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係衍生自PBMC之效應細胞。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係T細胞。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係CD4+ T細胞。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係CD8+ T細胞。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係B細胞。在一些實施例中，該經工程改造之哺乳動物細胞係NK細胞。
在一些實施例中，該效應細胞係T細胞。在一些實施例中，該效應細胞係選自由細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺手T細胞及抑制因子T細胞組成之群。在一些實施例中，該效應細胞係經修飾以阻斷或降低嵌合受體多肽所衍生之內源TCR亞單元中之一者或兩者之表現。破壞基因表現之細胞修飾包括本技術中已知的任何此類技術，包括例如RNA干擾(例如，siRNA、shRNA、miRNA)、基因編輯(例如，基於CRISPR或基於TALEN之基因剔除)及類似者。 製造抗LAB抗體部分及其構築體之方法
本申請案在一個態樣中提供製造抗LAB抗體部分及其構築體之方法。 單株抗體
在一些實施例中，抗LAB抗體部分或其構築體包含單株抗體。可例如使用融合瘤方法，諸如由Kohler及Milstein，Nature，256，1975及Sergeeva等人，Blood，117(16): 4262-4272描述之其等方法，使用本文中及以下實例中所述的噬菌體顯示方法，或使用重組DNA方法(參見，例如，美國專利第4,816,567號)，來製備單株抗體。
在融合瘤方法中，通常用免疫劑使倉鼠、小鼠或其他適宜宿主動物免疫以引發會產生或能夠產生將特異性結合至免疫劑之抗體之淋巴細胞。或者，可活體外免疫淋巴細胞。免疫劑可包括受關注蛋白質之多肽或融合蛋白、或包含至少兩種分子之複合體。一般而言，若需要人類來源之細胞，則使用周邊血液淋巴細胞(「PBL」)，或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾臟細胞或淋巴結細胞。然後使用適宜融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細胞與永生化細胞系融合以形成融合瘤細胞。參見，例如，Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press，1986)。永生化細胞系通常係轉形之哺乳動物細胞，特別是囓齒動物、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。可在適宜培養基中培養融合瘤細胞，該培養基較佳包含抑制未融合、永生化細胞之生長或存活之一或多種物質。例如，若親本細胞缺乏酵素次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則融合瘤之培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(「HAT培養基」)，此會阻止HGPRT缺陷細胞之生長。
在一些實施例中，永生化細胞系有效地融合，支持所選抗體產生細胞穩定地高量表現抗體，且對培養基(諸如HAT培養基)敏感。在一些實施例中，永生化細胞系係鼠類骨髓瘤細胞系，其可例如從索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center) (San Diego，California)及美國菌種保藏中心(the American Type Culture Collection) (Manassas，Virginia)獲得。亦已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。Kozbor，J. Immunol.， 133: 3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.：New York，1987) 第51-63頁。
然後可分析培養融合瘤細胞之培養基之針對該多肽之單株抗體之存在。融合瘤細胞產生的單株抗體之結合特異性可藉由免疫沉澱或藉由活體外結合分析，諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)來確定。此類技術及分析係本技術中已知的。單株抗體之結合親和力可例如藉由Scatchard analysis of Munson and Pollard，Anal. Biochem.，107: 220 (1980)來測定。
在鑑定出所需的融合瘤細胞後，純系可藉由有限稀釋程序進行次選殖並藉由標準方法生長。Goding，同前述。用於該目的之適宜培養基包括例如杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)及RPMI-1640培養基。或者，融合瘤細胞可在哺乳動物中作為腹水活體內生長。
可藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如，例如，蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養基或腹水流體分離或純化由次純系所分泌之單株抗體。
亦可藉由篩選組合庫之具有所需一或多種活性之抗體來鑑定抗LAB抗體部分。例如，本技術中已知用於生成噬菌體顯示庫並篩選此類庫中具有所需結合特性之抗體之多種方法。此類方法參見例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien等人編，Human Press，Totowa, N.J.，2001)並進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348: 552-554；Clackson等人，Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248: 61-175 (Lo編，Human Press，Totowa，N.J.，2003)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004)中。
在某些噬菌體顯示方法中，VH及VL基因之譜系係藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖並在噬菌體庫中隨機重組，其然後可如在Winter等人，Ann. Rev. Immunol.，12: 433-455 (1994) 中所述進行抗原結合噬菌體之篩選。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自免疫化來源之庫無需構建融合瘤即可提供針對免疫原之高親和力抗體。或者，初始譜系可經選殖(例如，自人類)以提供針對寬廣範圍之非自身亦及自身抗原之抗體之單一來源，無需任何免疫接種，如由Griffiths等人，EMBO J， 12: 725-734 (1993)所述。最後，初始庫亦可藉由從幹細胞選殖未重排之V-基因片段，及使用包含隨機序列之PCR引物以編碼高度可變之CDR3區及達成活體外再重排來合成性製備，如藉由Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol.，227: 381-388 (1992)所述。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號、及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
可使用噬菌體顯示來製備抗體或其抗原結合片段以篩選庫中對拉比林或其部分具有特異性之抗體。該庫可係具有至少1 x 109 個(諸如至少約1 x 109 個、2.5 x 109 個、5 x 109 個、7.5 x 109 個、1 x 1010 個、2.5 x 1010 個、5 x 1010 個、7.5 x 1010 個或1 x 1011 個中之任何一者)獨特人類抗體片段之人類scFv噬菌體顯示庫。在一些實施例中，該庫係藉由從來自健康供體之人類PMBC及脾臟提取之DNA構建之初始人類庫，包涵所有人類重鏈及輕鏈亞家族。在一些實施例中，該庫係藉由從自患有多種疾病之患者(諸如患有自體免疫疾病之患者、癌症患者及患有傳染性疾病之患者)分離的PBMC提取之DNA構建之初始人類庫。在一些實施例中，該庫係半合成人類庫，其中重鏈CDR3係完全隨機的，且所有胺基酸(半胱胺酸除外)等可能地存在於任何給定位置(參見，例如，Hoet, R.M.等人，Nat. Biotechnol. 23(3): 344-348，2005)。在一些實施例中，半合成人類庫之重鏈CDR3具有約5至約24個(諸如約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個中之任何一者)胺基酸長度。在一些實施例中，該庫係非人類噬菌體顯示庫。
可藉由使噬菌體迭代結合至拉比林，該拉比林結合至固體支撐物(諸如，例如，用於溶液淘選之珠粒或用於細胞淘選之哺乳動物細胞)，然後去除未結合的噬菌體並洗脫特異性結合的噬菌體，來選擇以高親和力結合至拉比林或其部分之噬菌體純系。在溶液淘選之一個實例中，可將拉比林生物素化以固定至固體支撐物。將生物素化拉比林與噬菌體庫及固體支撐物(諸如鏈黴親和素結合戴諾珠粒(Dynabeads) M-280)混合，且然後分離拉比林-噬菌體-珠粒複合體。然後洗脫結合的噬菌體純系並用於感染適宜宿主細胞，諸如大腸桿菌(E. coli) XL1-Blue，以用於表現及純化。可利用溶液淘選、細胞淘選或二者之組合來進行淘選多輪(諸如約2、3、4、5、6輪或更多輪中之任何一者)，以富集特異性結合至拉比林之噬菌體純系。可藉由本技術中已知的任何方法，包括例如ELISA及FACS，測試富集的噬菌體純系與拉比林之特異性結合。
單株抗體亦可藉由重組DNA方法(諸如彼等描述於美國專利第4,816,567號中之方法)來製備。編碼本發明之單株抗體之DNA可使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)輕易地分離並進行定序。如以上所述的融合瘤細胞或本發明之拉比林特異性噬菌體純系可充當此種DNA之來源。一旦分離，即可將DNA置於表現載體中，然後將該等表現載體轉染至宿主細胞(諸如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或否則不產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞)中，以達成重組宿主細胞中單株抗體之合成。亦可藉由例如用同源非人類序列取代人類重鏈及輕鏈恆定域及/或框架區之編碼序列 (美國專利第4,816,567號；Morrison等人，同前述)或藉由將非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列共價接合至免疫球蛋白編碼序列來修飾DNA。此種非免疫球蛋白多肽可用本發明之抗體之恆定域取代，或可用本發明之抗體之一個抗原組合位點之可變域取代，以產生嵌合二價抗體。
該等抗體可係單價抗體。用於製備單價抗體之方法係本技術中已知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈及經修飾重鏈之重組表現。一般而言，該重鏈在Fc區中之任何點被截短，以防止重鏈交聯。或者，相關半胱胺酸殘基係經另一個胺基酸殘基取代或缺失以防止交聯。
活體外方法亦適於製備單價抗體。消化抗體以產生其片段(特別是Fab片段)可使用本技術中已知的任何方法來達成。
具有所需結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原結合位點)可融合至免疫球蛋白恆定域序列。融合物較佳係與免疫球蛋白重鏈恆定域，該域包含鉸鏈區、CH2區及CH3區中之至少一部分。在一些實施例中，包含輕鏈結合所必需的位點之第一重鏈恆定區(CH1)係存在於融合物中之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入至單獨表現載體中，並共轉染至適宜宿主生物中。關於產生雙特異性抗體之更多詳細內容，參見，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology，121: 210 (1986)。 人類及人類化抗體
在一些實施例中，該抗LAB抗體部分或其構築體包含人類化抗體或人類抗體。非人類(例如，鼠類)抗體之人類化形式為通常包含衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、或其他抗原結合序列)。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之CDR之殘基係經來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體) (諸如小鼠、大鼠或兔子)之CDR之殘基置換。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv框架殘基被對應的非人類殘基替換。人類化抗體亦可包含在接受者抗體或輸入之CDR或框架序列中均未發現的殘基。一般而言，人類化抗體可包含實質上所有至少一個，且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於彼等非人類免疫球蛋白之CDR區，及所有或實質上所有FR區為彼等人類免疫球蛋白共有序列之FR區。在一些實施例中，該人類化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人免疫球蛋白之恆定區。參見，例如，Jones等人，Nature，321: 522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature， 332: 323-329 (1988)；Presta，Curr. Op. Struct. Biol.， 2: 593-596 (1992)。
一般而言，人類化抗體具有自非人類的來源引入至其中之一或多個胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其通常係從「輸入」可變域取得。根據一些實施例，人類化可基本上遵循Winter及同仁之方法(Jones等人，Nature，321: 522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature，332: 323-327 (1988)；Verhoeyen等人，Science， 239: 1534-1536 (1988))，藉由用囓齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之對應序列來進行。因此，此類「人類化」抗體係抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於完整人類可變域，已經來自非人類物種之對應之序列取代。實務上，人類化抗體通常係人類抗體，其中一些CDR殘基及可能的一些FR殘基係經來自囓齒動物抗體中類似位點之殘基取代。
作為人類化之替代方案，可生成人類抗體。例如，現可產生轉殖基因動物(例如，小鼠)，該等動物在免疫接種後能夠在不產生內源性免疫球蛋白下產生人類抗體之完整譜系。例如，已描述在嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH)基因之純合缺失導致內源性抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此種生殖系突變小鼠中會導致抗原攻毒後產生人類抗體。參見，例如，Jakobovits等人，PNAS USA，90: 2551 (1993)；Jakobovits等人，Nature，362: 255-258 (1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.，7:33 (1993)；美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,591,669號；第5,545,807號；及WO 97/17852。或者，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入至內源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活之轉殖基因動物(例如，小鼠)中來製備人類抗體。攻毒後，觀察到人類抗體之產生，在所有態樣(包括基因重排、組裝及抗體譜系)中均與在人類中所見非常相似。該方法描述於例如美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號、及Marks等人，Bio/Technology，10: 779-783 (1992)；Lonberg等人，Nature，368: 856-859 (1994)；Morrison，Nature，368: 812-813 (1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology，14: 845-851 (1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14: 826 (1996)；Lonberg及Huszar，Intern. Rev. Immunol.，13: 65-93 (1995)中。
人類抗體亦可藉由活體外活化之B細胞(參見美國專利5,567,610及5,229,275)或藉由使用本技術中已知的各種技術(包括噬菌體顯示庫)來生成。Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol.，227: 381 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol.，222: 581 (1991)。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第77頁(1985)及Boerner等人，J. Immunol.， 147(1): 86-95 (1991)。 多特異性抗體
在一些實施例中，該抗LAB抗體部分或其構築體包含多特異性抗體。用於製備多特異性(例如，雙特異性)抗體之適宜方法係本技術中熟知的。例如，雙特異性抗體之產生可係基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共同表現，其中該兩對各具有不同特異性，並在締合後產生異二聚抗體(參見，例如，Milstein及Cuello，Nature，305: 537-539 (1983)；WO 93/08829、及Traunecker等人，EMBO J. 10: 3655 (1991))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，此等融合瘤(四染色體瘤)產生十種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。該正確分子之純化通常係藉由親和層析步驟來達成。類似程序揭示於WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO， 10: 3655-3659 (1991)中。或者，重鏈及輕鏈之組合可藉由利用物種限制性配對引導(參見，例如，Lindhofer等人，J. Immunol.， 155: 219-225 (1995))及重鏈之配對可藉由使用CH3域之「結進孔」工程改造(參見，例如，美國專利第5,731,168號；Ridgway等人，Protein Eng.， 9(7): 617-621(1995))來引導。亦可藉由工程改造靜電控制效應以製造抗體Fc-異二聚分子來製造多特異性抗體(參見，例如，WO 2009/089004A1)。在又一種方法中，可藉由受控Fab臂交換生成穩定的雙特異性抗體，其中將具有不同抗原特異性及CH3域中匹配點突變之兩種親本抗體在還原條件下混合以允許分離、重組裝及再氧化以形成高度純的雙特異性抗體。Labrigin等人，Proc. Natl. Acad. Sci，110(13): 5145-5150 (2013)。包含重鏈/輕鏈對之混合物之此類抗體在本文中亦稱為「異多聚體抗體」。
具有不同特異性之抗體或其抗原結合片段亦可經化學交聯以生成多特異性異結合物抗體。例如，分別對不同抗原具有特異性之兩個F(ab’)2分子可經化學連接。Pullarkat等人，Trends Biotechnol.，48:9-21 (1999)。例如，已提出此類抗體可將免疫系統細胞靶向非所欲細胞(美國專利第4,676,980號)，及用於治療HIV感染。WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089。設想可使用合成蛋白質化學中之已知方法(包括彼等涉及交聯劑之方法)活體外製備抗體。例如，可使用二硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構建免疫毒素。用於該目的之適宜試劑之實例包括亞胺基硫醇鹽及4-巰基丁醯亞胺酸甲酯及彼等揭示於例如美國專利第4,676,980號中者。
在一些實施例中，可使用重組DNA技術來製備多特異性抗體。例如，可藉由融合兩個scFv，諸如藉由使其等經由肽連接子融合，從而產生串聯scFv，來工程改造雙特異性抗體。串聯scFv之一個實例係雙特異性T細胞接合子。藉由將抗CD3 scFv連接至對靶細胞之表面抗原(諸如腫瘤相關抗原(TAA))具有特異性之scFv，從而使T細胞再定向至靶細胞，來製得雙特異性T細胞接合子。Mack等人，Proc. Natl. Acad. Sci，92: 7021-7025 (1995)；Brischwein等人，Mol. Immunol.，43(8): 1129-1143 (2006)。藉由縮短兩個可變域之間的肽連接子之長度，可防止其等自組裝並被迫與第二多肽上之域配對，從而產生緊湊雙特異性抗體(稱為雙功能抗體(Db))。Holliger等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，90: 6444-6448 (1993)。Db之兩個多肽各包含藉由連接子連接至VL之VH，該連接子過短而不允許相同鏈上的兩個域之間之配對。因此，一個多肽之VH域及VL域被迫與另一多肽之互補VL域及VH域配對，從而形成兩個抗原結合位點。在該形式之修飾中，兩個多肽係經另一肽連接子連接，產生單鏈雙功能抗體(scDb)。在Db形式之又一修飾中，可藉由在每個多肽的C端處之半胱胺酸殘基之間引入二硫鍵而生成雙重親和性再靶向(DART)雙特異性抗體，該多肽視需要包含在C端半胱胺酸殘基之前的會驅動所需異二聚結構之組裝之域。Veri等人，Arthritis Rheum.，62(7): 1933-1943 (2010)。雙重可變域免疫球蛋白(DVD-Ig™)在本技術中亦已知，其中兩個單株抗體之靶向結合可變域係經由天然存在之連接子組合以產生四價雙特異性抗體。Gu及Ghayur，Methods Enzymol.，502: 25-41 (2012)。在又一種形式對接及鎖定(DNL)中，藉由利用衍生自人類cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)之調節亞單元之肽(DDD2)與衍生自人類A激酶錨定蛋白(AKAP)之錨定域之肽(AD2)之二聚化來製備雙特異性抗體。Rossi等人，Proc. Natl. Acad. Sci，103: 6841-6846 (2006)。
亦已描述用於直接從重組細胞培養物製備及分離雙特異性抗體片段之多種技術。例如，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人，J. Immunol.，148(5): 1547-1553 (1992)。該方法亦可用於抗體同二聚體之產生。 抗LAB抗體部分變異體
在一些實施例中，設想本文所提供的抗體部分之胺基酸序列變異體。例如，可能期望改良抗體部分之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體部分之胺基酸序列變異體可藉由將適宜修飾引入至編碼抗體部分之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體部分之胺基酸序列內的殘基之缺失、及/或插入、及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件是最終構築體具有所需特性，例如抗原結合。
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體部分變異體。取代誘變之受關注位點包括HVR及FR。可引入胺基酸取代至受關注抗體部分中並針對所需活性，例如，保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)選擇產物。
保守性取代顯示於下表 4 中。 表4：保守性取代
原始殘基 示例性取代 較佳取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu(L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見側鏈性質分組為不同類別： a. 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； b. 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； c. 酸性：Asp、Glu； d. 鹼性：His、Lys、Arg； e. 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； f. 芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將一種此等類別之成員交換為另一類別。
示例性替代變異體係親和力成熟抗體部分，其可例如使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術方便地生成。簡而言之，一或多個CDR殘基係經突變及將該變異體抗體部分展示在噬菌體上並針對特定生物學活性(例如結合親和力)進行篩選。可在HVR中進行改變(例如，取代)，例如，以改良抗體部分親和力。可在HVR「熱點」，亦即，由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變之密碼子編碼之殘基(參見，例如，Chowdhury，Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))、及/或特異性確定殘基(SDR)中進行此類改變，其中測試所得變異體VH或VL之結合親和力。藉由構建並從二級庫再選擇之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中。
在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如，易錯PCR，鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中之任何一種將多樣性引入至針對成熟選擇的可變基因中。然後產生二級庫。然後選擇該庫以鑑定具有所需親和力之任何抗體部分變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方法，其中將幾個HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑑定涉及抗原結合之HVR殘基。特定言之，經常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在一些實施例中，取代、插入或缺失可在一或多個HVR內發生，只要此類改變實質上不降低抗體部分結合抗原之能力即可。例如，可在HVR中進行實質上不降低結合親和力之保守性改變(例如，如本文所提供的保守性取代)。此類改變可能在HVR「熱點」或SDR以外。在以上所提供的變異體VH及VL序列之一些實施例中，每個HVR係不變的，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種用於鑑定誘變可靶向之抗體部分之殘基或區之可用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham及Wells (1989) Science，244: 1081-1085所述。在該方法中，殘基或標靶殘基組(例如，帶電荷的殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)係經鑑定並經中性或帶負電荷的胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)取代以確定抗體部分與抗原之相互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入進一步取代，證實對初始取代之功能敏感性。或者或另外，可確定抗原-抗體部分複合體之晶體結構以鑑定抗體部分與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可經靶向或消除作為取代之候選者。可篩選變異體以確定其等是否包含所需性質。
胺基酸序列插入包括在從一個殘基至包含一百個或更多個殘基之多肽之長度範圍內之胺基端及/或羧基端融合、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體部分。抗體部分之其他插入變異體包括以下之融合：抗體部分之N端或C端與酵素(例如，針對ADEPT)或會增加抗體部分之血清半衰期之多肽。 Fc區變異體
在一些實施例中，可將一或多種胺基酸修飾引入至本文所提供的全長抗LAB抗體部分之Fc區中，從而產生Fc區變異體。在一些實施例中，Fc區變異體具有增強的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)效應功能，通常與結合至Fc受體(FcR)有關。在一些實施例中，Fc區變異體具有降低的ADCC效應功能。有許多可改變效應功能之Fc序列變化或突變之實例。例如，WO 00/42072及Shields等人，J Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) 描述具有改良或減少結合至FcRs之抗體變異體。彼等公開案之內容係以引用的方式特別地併入本文中。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)係治療性抗體抗腫瘤細胞之作用機制。ADCC係一種細胞介導之免疫防禦，其中免疫系統之效應細胞主動地溶解靶細胞(例如癌細胞)，其膜表面抗原已被特異性抗體(例如抗LAB抗體)結合。典型ADCC涉及由抗體活化NK細胞。NK細胞表現CD16，該CD16係Fc受體。該受體識別並結合於結合至靶細胞表面之抗體之Fc部分。NK細胞表面上最常見之Fc受體稱為CD16或FcγRIII。Fc受體結合至抗體之Fc區導致NK細胞活化、細胞溶解粒子之釋放及相繼之靶細胞凋亡。ADCC對腫瘤細胞殺死之貢獻可使用已經高親和力FcR轉染之NK-92細胞之特異性試驗來測量。將結果與不表現FcR之野生型NK-92細胞比較。
在一些實施例中，本發明涵蓋包含具有一些但非全部效應功能之FC區域之抗LAB構築體變異體，此區域使其對於抗LAB構築體在活體內之半衰期係重要但某些效應功能(諸如CDC及ADCC)係不必要或有害之應用係理想候選者。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析，以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消除。例如，可實施Fc受體(FcR)結合分析，以確保該抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之主要細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)中第464頁表3中。評估受關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.)；及CytoTox 96™非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, Wis.))。用於此類分析之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者，或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如揭示於Clynes 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998))中，評估受關注分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析，以確認該抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano- Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S.等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M. S.及M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定亦可使用此技術中已知的方法(參見例如Petkova, S. B.等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))進行。
具有降低之效應功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一者或多者之取代之彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括具有在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者之取代之Fc突變體，包括具有殘基265及297取代至丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
描述具有改良或減少結合至FcR之某些抗體變異體。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312、及Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。)
在一些實施例中，提供抗LAB構築體(例如，全長抗LAB抗體)變異體，其包含包含會改良ADCC之一或多個胺基酸取代之變異體Fc區。在一些實施例中，變異體Fc區包含會改良ADCC之一或多個胺基酸取代，其中該等取代係在變異體Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)。在一些實施例中，抗LAB構築體(例如，全長抗LAB抗體)變異體在其變異體Fc區中包含以下胺基酸取代：S298A、E333A及K334A。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變，從而導致經改變(亦即，改良或減少)之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、W0 99/51642、及Idusogie等人，J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)中所述。
在一些實施例中，提供抗LAB構築體(例如，全長抗LAB抗體)變異體，其包含包含會增加半衰期及/或改良至新生兒Fc受體(FcRn)之結合之一個或多個胺基酸取代之變異體Fc區。具有增加之半衰期及改良之至FcRn之結合之抗體描述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。其等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區至FcRn之結合。此類Fc變異體包括彼等具有在以下Fc區殘基中之一者或多者之取代之Fc變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區殘基434之取代 (美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例亦可參見Duncan及Winter，Nature 322: 738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
設想包含本文所述的任何Fc變異體或其組合之抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)。 糖基化變異體
在一些實施例中，本文所提供的抗LAB構築體係經改變以增加或減少抗LAB構築體糖基化之程度。可藉由改變抗LAB構築體或其多肽部分之胺基酸序列從而產生或去除一或多個糖基化位點方便地達成對抗LAB構築體添加或刪除糖基化位點。
在抗LAB構築體包含Fc區之情況下，可改變附接至其之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其通常係藉由N-鍵附接至Fc區之CH2域之Asn297。參見，例如，Wright等人，TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸、以及連接至在雙觸角寡醣結構之「莖」中之GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗LAB構築體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良之性質之抗LAB構築體變異體。
在一些實施例中，提供包含Fc區之抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)變異體，其中附接至Fc區之碳水化合物結構具有減少之岩藻糖或缺乏岩藻糖，其可改良ADCC功能。具體而言，本文考慮具有相對於在野生型CHO細胞中產生的相同抗LAB構築體上的岩藻糖之量減少之岩藻糖之抗LAB構築體。亦即，其特徵在於其岩藻糖之量比其另外在由天然CHO細胞(例如，產生天然糖基化模式之CHO細胞，諸如，含有天然FUT8基因之CHO細胞)產生之情況下之岩藻糖之量低。在一些實施例中，抗LAB構築體係其中其上少於約50%、40%、30%、20%、10%或5%之N-連接聚醣包含岩藻糖之構築體。例如，此種抗LAB構築體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。在一些實施例中，抗LAB構築體係其中其上N-連接聚醣無一包含岩藻糖(亦即，其中該抗LAB構築體完全不含岩藻糖，或不具有岩藻糖或係無岩藻糖基化)之構築體。如藉由MALDI-TOF質譜所測得，岩藻糖之量係藉由計算糖鏈中在Asn297之岩藻糖相對於連接至Asn 297之所有糖結構(例如，複合、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來確定，如(例如)WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中約位置297之天冬醯胺酸殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，由於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游之約±3個胺基酸，亦即，位置294與300之間。此等岩藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見，例如，美國專利公開案編號US 2003/0157108 (Presta, L)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。關於「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺陷型抗體變異體」之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742; WO2002/031140；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案No US 2003/0157108 A1，Presta, L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是在實例11)、及基因敲除細胞系，諸如asα-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因敲除CHO細胞(參見，例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng.，94 (4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)變異體進一步設置有一分為二型寡醣，例如，其中附接至抗LAB構築體之Fc區之雙觸角寡醣係經GlcNAc一分為二。此種抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)變異體可具有減少之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；US 2005/0123546 (Umana 等人)、及Ferrara等人，Biotechnology and Bioengineering， 93(5): 851-861 (2006)中。亦提供在附接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)變異體。此種抗LAB構築體變異體可具有改良之CDC功能。此種抗體變異體描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。
在一些實施例中，包含Fc區之抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)變異體能夠結合至FcγRIII。在一些實施例中，與包含人類野生型IgG1 Fc區之其他相同抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)相比，包含Fc區之抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)變異體在人類效應細胞之存在下具有ADCC活性或在人類效應細胞之存在下具有增加之ADCC活性。 半胱胺酸工程改造之變異體
在一些實施例中，可能希望產生其中一或多個胺基酸殘基係經半胱胺酸殘基取代之半胱胺酸工程改造之抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)。在一些實施例中，經取代之殘基出現在抗LAB構築體之可及位點。藉由以半胱胺酸取代其等殘基，反應性硫醇基藉此定位在抗LAB構築體之可及位點且可用於將抗LAB構築體結合至其他部分，諸如藥物部分或連接子藥物部分以產生如本文進一步描述的抗LAB免疫結合物。半胱胺酸工程改造之抗LAB構築體(諸如全長抗LAB抗體)可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生。 衍生物
在一些實施例中，本文所提供的抗LAB構築體可經進一步修飾以包含本技術中已知並容易獲得之另外非蛋白質部分。適於抗LAB構築體之衍生化之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及聚葡萄糖或聚(正乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而可在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可係分支鏈或直鏈。附接至抗LAB構築體之聚合物之量可改變，且若超過一個聚合物係經附接，則其等可係相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之量及/或類型可基於包括但不限於以下之考量來確定：待改良之抗LAB構築體之特定性質或功能、抗LAB構築體衍生物是否可在限定條件下用於療法中等。
在一些實施例中，提供可藉由暴露於輻射而選擇性加熱之抗LAB構築體及非蛋白質部分之結合物。在一些實施例中，該非蛋白質部分係碳奈米管(Kam等人，Proc .Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，且包括但不限於不損害尋常細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗LAB構築體-非蛋白質部分附近的細胞之溫度之波長。 抗LAB CAR、抗LAB TCR及抗LAB雙特異性T細胞接合子
本申請案在一個態樣中提供抗LAB構築體，其中該抗LAB構築體為例如抗LAB CAR、抗LAB TCR或抗LAB雙特異性T細胞接合子。製備此種抗LAB構築體之方法係本技術中已知的，且描述於例如以上部分中。 效應細胞之製備
本發明在一個態樣中提供表現例如抗LAB CAR之效應細胞(諸如淋巴細胞，例如T細胞)。本文提供製備表現抗LAB CAR之效應細胞(諸如T細胞) (抗LAB CAR效應細胞，諸如抗LAB CAR T細胞)之示例性方法。
在一些實施例中，可藉由引入包含抗LAB CAR (例如包含抗LAB抗體部分以及CD28及CD3ζ細胞內信號序列之CAR)之載體(包括例如慢病毒載體)至效應細胞(諸如T細胞)中來產生抗LAB CAR效應細胞(諸如T細胞)。在一些實施例中，本發明之抗LAB CAR效應細胞(諸如T細胞)能夠在活體內複製，從而導致長期持久性，從而可導致持續控制拉比林陽性疾病(諸如癌症，例如，腺癌)。
在一些實施例中，本發明係關於使用淋巴細胞輸注投與表現抗LAB CAR之遺傳修飾之T細胞以治療患有拉比林陽性疾病或處在患有拉比林陽性疾病風險中之患者。在一些實施例中，自體淋巴細胞輸注係用於治療中。從需要治療的患者收集自體PBMC且使用本文所述及本技術中已知之方法活化並擴增T細胞且然後輸注回至患者中。
在一些實施例中，抗LAB CAR T細胞表現包含抗LAB抗體部分之抗LAB CAR (本文中亦稱為「抗LAB CAR T細胞」)。在一些實施例中，抗LAB CAR T細胞表現包含包含抗LAB抗體部分之細胞外域及包含CD3ζ及CD28之細胞內信號序列之細胞內域之抗LAB CAR。本發明之抗LAB CAR T細胞可經歷可靠活體內T細胞擴增且可建立拉比林特異性記憶細胞，該記憶細胞在血液及骨髓中以高量持久存在。在一些實施例中，輸注至患者中之本發明之抗LAB CAR T細胞可在患有拉比林陽性疾病之患者中在活體內消除拉比林呈遞細胞，諸如拉比林呈遞癌細胞。在一些實施例中，輸注至患者中之本發明之抗LAB CAR T細胞可在患有至少一種習知治療難治癒的拉比林陽性疾病之患者中在活體內消除拉比林呈遞細胞，諸如拉比林呈遞癌細胞。
在T細胞之擴增及遺傳修飾之前，從個體獲得T細胞來源。T細胞可從多種來源(包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾臟組織及腫瘤)獲得。在本發明之一些實施例中，可使用本技術中可用之任何數目之T細胞系。在本發明之一些實施例中，可使用熟習此項技術者已知的許多技術(諸如Ficoll™分離)從從個體收集的單位血液獲得T細胞。在一些實施例中，藉由血液分離術來獲得來自個體循環血液之細胞。血液分離術產品通常包含淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白血球、紅血球及血小板。在一些實施例中，可洗滌藉由血液分離術收集的細胞以除去血漿部分並將細胞置於適宜緩衝液或培養基中以用於隨後的處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些實施例中，洗滌溶液缺乏鈣且可缺乏鎂或可缺乏許多(若非全部的話)二價陽離子。如熟習此項技術者將容易理解，洗滌步驟可藉由熟習本技術者已知的方法，諸如藉由使用半自動「流通式」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器，Baxter CytoMate或Haemonetics細胞回收機5)根據製造商說明來達成。洗滌後，可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液(諸如無Ca2+ 、無Mg2+ PBS、PlasmaLyte A或含有或不含緩衝液之其他鹽水溶液)中。或者，可去除血液分離術樣品之非所欲組分且將細胞直接再懸浮於培養基中。
在一些實施例中，例如藉由透過PERCOLL™梯度離心或藉由逆流離心淘析，藉由裂解紅血球並消耗單核細胞從周邊血液淋巴細胞分離T細胞。T細胞之特定亞群，諸如CD3+ 、CD28+ 、CD4+ 、CD8+ 、CD45RA+ 及CD45RO+ T細胞，可藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離。例如，在一些實施例中，藉由用抗CD3/抗CD28 (亦即3x28)結合珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)培養足以進行所需T細胞之陽性選擇之時間段來分離T細胞。在一些實施例中，該時間段為約30分鐘。在一些實施例中，該時間段在30分鐘至36小時或更長時間及其間的所有整數值之範圍內。在一些實施例中，該時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在一些實施例中，該時間段為10至24小時。在一些實施例中，培養時間段為24小時。為從患有白血病的患者分離T細胞，使用更長培養時間(諸如24小時)可提高細胞產量。在與其他細胞類型相比T細胞很少之任何情況中，諸如在從腫瘤組織或從免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)中，可使用更長培養時間來分離T細胞。此外，使用更長培養時間可提高捕捉CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單地縮短或延長允許T細胞結合至CD3/CD28珠粒之時間及/或藉由增加或降低珠粒與T細胞之比，在培養開始時或在製程期間的其他時間點可優先選擇或針對之T細胞亞群。另外，藉由增加或減少珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比，在培養開始時或在其他所需時間點可優先選擇或針對之T細胞亞群。熟習此項技術者將認識到，在本發明之上下文中亦可使用多輪選擇。在一些實施例中，可能希望進行選擇程序且在活化及擴增過程中使用「未選擇」細胞。「未選擇」細胞亦可進行更多輪選擇。
藉由陰性選擇富集T細胞群體可藉由針對陰性選擇細胞特有的表面標誌之抗體之組合來達成。一種方法係藉由負磁性免疫黏附或流式細胞測量術進行細胞分选及/或選擇，該方法使用針對存在於陰性選擇之細胞上的細胞表面標誌之單株抗體之混合物。例如，為藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施例中，可能希望富集或陽性選擇通常表現CD4+ 、CD25+ 、CD62Lhi、GITR+ 及FoxP3+ 之調節T細胞。或者，在一些實施例中，藉由抗CD25結合之珠粒或其他類似選擇方法來消除T調節細胞。
為藉由陽性或陰性選擇分離所需細胞群體，可改變細胞及表面(例如顆粒，諸如珠粒)之濃度。在一些實施例中，可能希望顯著減小其中珠粒及細胞混合在一起之體積(亦即，增加細胞濃度)，以確保細胞及珠粒之最大接觸。例如，在一些實施例中，使用約20億個細胞/ml之濃度。在一些實施例中，使用約10億個細胞/ml之濃度。在一些實施例中，使用大於約1億個細胞/ml。在一些實施例中，使用約10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/ml中任一者之細胞濃度。在一些實施例中，使用約75、80、85、90、95或100百萬個細胞/ml中任一者之細胞濃度。在一些實施例中，使用約125或約150百萬個細胞/ml之濃度。使用高濃度可導致細胞產量增加、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕捉可弱表現所述靶抗原之細胞，諸如CD28陰性T細胞，或從存在許多腫瘤細胞之樣品(亦即，白血病血液、腫瘤組織等)捕捉。此種細胞群體可具有治療價值且將希望獲得。例如，使用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在本發明之一些實施例中，在治療後直接從患者獲得T細胞。就此而言，已觀察到在某些癌症治療(特別是損害免疫系統之藥物之治療)之後，在患者通常會從治療恢復期間內之治療後不久，所獲得的T細胞之品質可係最佳的或針對於其離體擴增之能力改良。同樣地，在使用本文所述的方法進行離體操縱之後，此等細胞可處於較佳狀態以達成增強之植入及活體內擴增。因此，預期在本發明之上下文中在該恢復階段期間收集血液細胞，包括T細胞、樹突細胞、或造血譜系之其他細胞。此外，在一些實施例中，固定(例如，用GM-CSF固定)及調理方案可用於在個體中產生條件，其中特定細胞類型之再群體化、再循環、再生及/或擴增係有利，尤其在療法後限定的時間窗期間。示例性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突細胞、及免疫系統之其他細胞。
無論是在對T細胞進行基因修飾以表現期望之抗LAB CAR之前或之後，可通常使用如例如美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國專利申請公開案第20060121005號中所述的方法活化並擴增T細胞。
一般而言，本發明之T細胞藉由與表面接觸而擴增，該表面具有附接至其的會刺激CD3/TCR複合體相關信號之試劑及會刺激T細胞表面上之共刺激分子之配位體。特別地，可諸如藉由以下來刺激T細胞群體：與固定在表面上之抗CD3抗體或其抗原結合片段或抗CD2抗體接觸或藉由與結合鈣離子載體之蛋白激酶C活化劑(例如，苔蘚蟲素)接觸。為共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配位體。例如，T細胞群體可在適於刺激T細胞增殖之條件下與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。為刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone，Besangon，France)，可用作本技術中通常已知的其他方法(Berg等人，Transplant Proc. 30(8):3975-3977，1998；Haanen等人，J. Exp.Med. 190(9):13191328，1999；Garland等人，J. Immunol. Meth. 227(1-2): 53-63，1999)。 免疫結合物之製備
可使用本技術中已知的任何方法來製備抗LAB免疫結合物。參見，例如，WO 2009/067800、WO 2011/133886及美國專利申請公開案第2014322129號，其全文係以引用的方式併入本文中。
抗LAB免疫結合物之抗LAB抗體部分可藉由任何方法「附接至」效應分子，藉由該方法，抗LAB抗體部分可與效應分子締合或連接。例如，抗LAB免疫結合物之抗LAB抗體部分可藉由化學或重組方法附接至效應分子。用於製備融合物或結合物之化學方法係本技術中已知的且可用於製備抗LAB免疫結合物。用於結合抗LAB抗體部分及效應分子之方法必須能夠將結合蛋白與效應分子結合而不會干擾結合蛋白結合至靶細胞上抗原之能力。
抗LAB免疫結合物之抗LAB抗體部分可間接連接至效應分子。例如，抗LAB免疫結合物之抗LAB抗體部分可直接連接至包含幾種類型中一種類型之效應分子之脂質體。效應分子及/或抗LAB抗體部分亦可結合至固體表面。
在一些實施例中，抗LAB免疫結合物之抗LAB抗體部分及效應分子均係蛋白質且可使用本技術中熟知的技術進行結合。有數百種可結合兩種蛋白質之交聯劑。(參見例如「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」 1991，Shans Wong，CRC Press，Ann Arbor)。一般而言，基於可得到或插入在抗LAB抗體部分及/或效應分子上之反應性官能基來選擇交聯劑。另外，若沒有反應性基團，則可使用可光活化之交聯劑。在某些情況下，可能需要包含在抗LAB抗體部分與效應分子之間之間隔子。本技術已知的交聯劑包括同雙官能劑：戊二醛、己二醯亞胺酸二甲酯及雙(重氮聯苯胺)及雜雙官能劑：間-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺及磺基-間-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺。
在一些實施例中，抗LAB免疫結合物之抗LAB抗體部分可經特異性殘基工程改造以用於效應分子之化學附接。用於本技術已知的分子之化學附接之特定殘基包括離胺酸及半胱胺酸。交聯劑係基於插入於抗LAB抗體部分上之反應性官能基，且在效應分子上可用來選擇。
抗LAB免疫結合物亦可使用重組DNA技術來製備。在此種情況下，將編碼抗LAB抗體部分之DNA序列融合至編碼效應分子之DNA序列，從而產生嵌合DNA分子。嵌合DNA序列係經轉染至表現融合蛋白之宿主細胞中。融合蛋白可從細胞培養物回收並使用本技術中已知的技術純化。
將為標記之效應分子附接至結合蛋白之實例包括描述於Hunter等人，Nature 144:945 (1962)；David等人，Biochemistry 13:1014 (1974)；Pain等人，J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)；Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30:407 (1982)；Wensel及Meares，Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy，Elsevier，N.Y. (1983)；及Colcher等人，「Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice」，Meth. Enzymol.， 121: 802-16 (1986)中之方法。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入於免疫結合物中。例如，該肽可係生物合成的或可使用涉及例如氟-19代替氫之適宜胺基酸前驅物藉由化學胺基酸合成來合成。標記(諸如99 Tc或123 I、186 Re、188 Re及111 In)可藉由肽中之半胱胺酸殘基附接。釔-90可藉由離胺酸殘基附接。IODOGEN方法(Fraker等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))可用於併入碘123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal，CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
可使用多種雙官能蛋白偶聯劑，諸如丙酸N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)、環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)酯 (SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯HCI)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對-疊氮基苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，製備抗體部分和細胞毒劑的免疫結合物。例如，可如Vitetta等人，Science 238: 1098 (1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記之1-異硫氰酸基芐基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於將放射性核苷酸結合至抗體之示例性螯合劑。參見例如WO94/ 11026。連接子可係促進細胞中細胞毒性藥物之釋放之「可裂解之連接子」。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari 人，Cancer Research 52: 127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明之抗LAB免疫結合物明確考慮但不限於用以下交聯劑試劑製備的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、及磺基-SMPB、及SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其係市售(例如，購自Pierce Biotechnology, Inc.，Rockford，IL，U.S.A)。參見2003年至2004年應用手冊及目錄(2003-2004 Applications Handbook and Catalog) 第467至498頁。 醫藥組合物
本文亦提供包含抗LAB構築體之組合物(諸如醫藥組合物，本文亦稱為調配物)。在一些實施例中，該組合物進一步包含與抗LAB構築體相關之細胞(諸如效應細胞，例如，T細胞)。在一些實施例中，提供包含抗LAB構築體及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。在一些實施例中，該醫藥組合物進一步包含與抗LAB構築體相關之細胞(諸如效應細胞，例如，T細胞)。
藉由將具有所需純度之抗LAB構築體與視需要可選之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合獲得抗LAB構築體之適宜調配物(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A.編(1980))，呈凍乾調配物或水溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六甲基銨；氯化苄二甲烴銨、氯化苄乙氧銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。示例性調配物描述於在WO98/56418中，其係以引用的方式明確併入本文中。適用於皮下投藥之凍乾調配物描述於WO97/04801中。可用適宜稀釋劑將此種凍乾調配物復水為高蛋白質濃度且可將經復水之調配物皮下投與本文中待治療的個體。脂質轉染蛋白或脂質體可用於將本發明之抗LAB構築體遞送至細胞中。
除了為所治療的特定適應症所必需的抗LAB構築體之外，本文之調配物亦可包含一或多種活性化合物，較佳係彼等具有互補活性之不會彼此不利地影響之活性化合物。例如，除了抗LAB構築體之外，可能希望進一步提供抗腫瘤劑、生長抑制劑、細胞毒性劑或化學治療劑。此類分子以對於預期目的有效之量適當地組合存在。此類其他藥劑之有效量取決於存在於調配物中之抗LAB構築體之量、疾病或病症或治療之類型、及以上所論述的其他因素。該等藥劑通常以與本文所述相同的劑量及投藥途徑或迄今所用劑量之約1至99%使用。
抗LAB構築體亦可經包埋在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備的微膠囊中，例如，分別含在膠態藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或含在大乳液中之羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微膠囊。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol, A.編(1980)中。可製備持續釋放型製劑。
可製備抗LAB構築體之持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適宜實例包括包含抗體(或其片段)之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該基質係呈成型製品(例如，薄膜或微膠囊)之形式。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸及L-麩胺酸乙酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOT TM (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管聚合物(諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸)能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠歷時更短時間釋放蛋白質。當囊封的抗體長時間留在體內時，由於暴露至37℃之水分，其等可變性或聚集，導致生物學活性之喪失及可能之免疫原性之改變。可根據所涉及的機制設計合理策略來穩定抗LAB構築體。例如，若聚集機制經發現為藉由硫基-二硫鍵互換形成分子間S-S鍵，可藉由修飾硫氫基殘基，從酸性溶液凍乾，控制水分含量，使用適宜添加劑，及開發特定聚合物基質組合物來達成穩定化。
在一些實施例中，將抗LAB構築體在包含檸檬酸鹽、NaCl、乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘胺酸、聚山梨醇酯80 (Tween 80)或前述之任何組合之緩衝液中調配。在一些實施例中，將抗LAB構築體在包含約100 mM至約150 mM甘胺酸之緩衝液中調配。在一些實施例中，將抗LAB構築體在包含約50 mM至約100 mM NaCl之緩衝液中調配。在一些實施例中，將抗LAB構築體在包含約10 mM至約50 mM乙酸鹽之緩衝液中調配。在一些實施例中，將抗LAB構築體在包含約10 mM至約50 mM琥珀酸鹽之緩衝液中調配。在一些實施例中，將抗LAB構築體在包含約0.005%至約0.02%聚山梨醇酯80之緩衝液中調配。在一些實施例中，將抗LAB構築體在pH在約5.1與5.6之間之緩衝液中調配。在一些實施例中，將抗LAB構築體在包含10 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl、100 mM甘胺酸及0.01%聚山梨醇酯80之緩衝液中調配，其中該調配物係在pH 5.5。用於活體內投藥之調配物必須係無菌。此很容易藉由例如濾過無菌過濾膜來達成。 使用抗LAB構築體之方法
可將本申請案之抗LAB構築體及/或組合物投與個體(例如，哺乳動物，諸如人類)以治療及/或預防疾病及/或病症，包括例如癌症(諸如腺癌)。在一些實施例中，該癌症係拉比林陽性癌症。在一些實施例中，該癌症係腺癌，諸如拉比林陽性腺癌。因此，在一些實施例中，本申請案提供一種治療個體之拉比林陽性疾病(諸如癌症)之方法，該方法包括對個體投與有效量之包含包含抗LAB抗體部分之抗LAB構築體(諸如本文所述的抗LAB構築體中之任何一者)之組合物(諸如醫藥組合物)。在一些實施例中，該組合物包含表現抗LAB構築體(諸如CAR)之細胞(諸如效應細胞)。
例如，在一些實施例中，提供一種治療個體之拉比林陽性疾病之方法，該方法包括對個體投與有效量之包含包含特異性結合至拉比林之抗LAB抗體部分之抗LAB構築體之組合物。在一些實施例中，提供一種治療個體之拉比林陽性疾病之方法，該方法包括對個體投與有效量之包含表現抗LAB構築體(例如，本文所述的抗LAB CAR或抗LAB TCR)之效應細胞(諸如免疫細胞，例如T細胞)之組合物。在一些實施例中，當來自個體之癌症樣品顯示樣品中約10%或更高，諸如至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%或95%中之任何一者之癌細胞對拉比林呈陽性(諸如使用免疫組織化學(IHC)技術確定)時，選擇該個體以進行治療。在一些實施例中，當來自個體之癌症樣品顯示樣品中約10%或更高，諸如至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%或95%中之任何一者之癌細胞亞群(諸如在腫瘤周邊之細胞)對拉比林呈陽性(諸如使用免疫組織化學(IHC)技術確定)時，選擇該個體以進行治療。
在一些實施例中，該個體係人類。
投與個體(諸如人類)之抗LAB構築體組合物之劑量可隨特定組合物、投藥模式及所治療的疾病之類型而變化。在一些實施例中，組合物之量有效導致客觀反應(諸如部分反應或完全反應)。在一些實施例中，組合物中抗LAB構築體(例如，全長抗LAB抗體、多特異性抗LAB分子或抗LAB免疫結合物)之量包括在例如約0.001 μg至約1000 μg之範圍內。在任何上述態樣之一些實施例中，組合物中之抗LAB構築體(例如，全長抗LAB抗體、多特異性抗LAB分子或抗LAB免疫結合物)之有效量係在約0.1 μg/kg至約100 mg/kg總體重之範圍內。
可藉由各種途徑將抗LAB構築體組合物投與個體(諸如人類)，包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肺內、口服、吸入、囊泡內、肌肉內、氣管內、皮下、皮內、眼內、鞘內、透黏膜及經皮。在一些實施例中，可使用組合物之持續連續釋放型調配物。
本申請案亦提供使用抗LAB CAR或抗LAB TCR將效應細胞(諸如免疫細胞，例如T細胞)之特異性再定向至表現拉比林之細胞之方法。因此，本申請案亦提供一種刺激哺乳動物中針對表現拉比林之靶細胞群體或組織之效應細胞介導之反應(諸如T細胞介導之免疫反應)之方法，該方法包括對哺乳動物投與表現抗LAB CAR及抗LAB TCR之效應細胞(諸如T細胞)。
可將表現抗LAB CAR之抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)輸注至有此需要的接受者。所輸注的細胞能夠殺死接受者中之拉比林表現細胞。在一些實施例中，不像抗體療法，抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)能夠在活體內複製，從而導致長期持久性，此可導致持續腫瘤控制。
離體程序係本技術中熟知的且更全面地論述於下文。簡而言之，從哺乳動物(較佳人類)分離細胞且用表現本文所揭示的抗LAB CAR或抗LAB TCR之載體進行基因修飾(亦即，在活體外轉導或轉染)。可將抗LAB CART或抗LAB TCRT細胞投與哺乳動物接受者以提供治療益處。哺乳動物接受者可係人類及抗LAB CART或抗LAB TCRT細胞可係相對於接受者為自體。或者，該等細胞可係相對於接受者同種異體、同基因或異種。
除了就離體免疫接種而言使用基於細胞之疫苗外，本申請案亦提供用於活體內免疫接種以引發針對患者抗原之免疫反應之組合物及方法。
可由醫師考慮年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉移之程度及患者(個體)之病況之個體差異來確定本申請案之意欲投與之抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)組合物之精確量。在一些實施例中，以約104 至約109 個細胞/kg體重之劑量投與包含抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)之醫藥組合物。抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)組合物亦可以此等劑量投與多次。可藉由使用免疫療法中通常已知的輸注技術來投與細胞。藉由監測患者之疾病徵兆且對應地調整治療，熟習醫學領域者可容易地確定針對特定患者之最佳劑量及治療方案。
抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)之投與可以任何方便方式進行，包括藉由氣溶膠吸入、注射、攝取、輸血、植入或移植。本文所述的組合物可皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌內內、藉由靜脈內(i.v.)注射、或腹膜內投與患者。在一些實施例中，本申請案之抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)組合物係藉由皮內或皮下注射投與患者。在一些實施例中，本申請案之抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(諸如T細胞)組合物係藉由i.v.注射投與。抗LAB CAR或抗LAB TCR效應細胞(例如T細胞)之組合物可直接注射至腫瘤、淋巴結或感染部位中。
本文所揭示的方法可包括歷時一段時間對個體投與複數個劑量之本文所述的抗LAB構築體及/或組合物。在一些實施例中，基於投藥醫師的判斷，在治療過程中調整本文所述的抗LAB構築體及/或組合物之給藥頻率及/或劑量。
本文所揭示的治療及/或預防之方法可用於治療或預防個體之增生性疾病，諸如癌症。在一些實施例中，該癌症係拉比林表現癌症，諸如拉比林陽性癌症。在一些實施例中，該癌症係腺癌。在一些實施例中，該癌症係早期癌症、非轉移性癌症、原發性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症、緩解期癌症、復發性癌症、耐藥性癌症或難治性癌症。在一些實施例中，該癌症係局部化可切除之癌症(例如，局限於器官之允許完全手術切除之部分之腫瘤)、局部化不可切除之癌症(例如，由於關鍵血管結構而不可切除之局部化腫瘤)或不可切除之癌症。在一些實施例中，根據TNM分類，該癌症為I期腫瘤、II期腫瘤、III期腫瘤、IV期腫瘤、N1腫瘤或M1腫瘤。
本文所揭示的方法可用於治療或預防個體之癌症，諸如拉比林表現癌症。在一些實施例中，該個體具有以下特徵中之一者或多者：(i)理解並願意簽署知情同意書之能力；(ii)至少18歲，患有經組織學證實為腺癌及/或拉比林表現癌症；(iii)先前經至少1種先前全身療法(化學療法及/或生物療法)治療且在治療過程中無反應/進展或在全身療法完成後進展或拒絕所有其他治療；(iv)腫瘤必須過度表現拉比林抗原，如藉由對石蠟包埋檔案標本進行篩選免疫組織化學評估確定，證實＞10%之惡性細胞對抗原進行染色且強度為至少2x背景，根據由單一參考病理學家評分；(v)任何數目之先前化療方案；(vi)記錄第1次疫苗注射之前對常見召回抗原之遲發型過敏(DTH)反應；(vii)基於Karnofsky量表之表現狀態≥60%；(viii)治療時的預期壽命為≥6個月；(ix)可測量或可評估之疾病；(x)第1次疫苗注射前4週內獲得的預處理絕對粒細胞計數(AGC)為≥1,000及預處理血小板計數為≥75,000；(xi)需要≤1.5 mg/dl之預處理血清肌酸酐；及(xii)血清膽紅素≤1.5及AST≤2.5 x的正常之機構上限(若具有肝臟轉移，則為≤5X)。
熟習此項技術者將認識到，幾個實施例可能在本申請案之揭示內容之範疇及精神內。藉由以下實例進一步說明本發明，該等實例不應解釋為將本發明之範疇或精神限於其中所述的特定程序。實例 實例1
該實例證實衍生自抗拉比林抗體(MCA 44-3A6)之功能性單鏈可變片段(scFv)及抗原結合片段(Fab)之開發及測試。
用可用於cDNA合成及PCR方法之寡引物選殖MCA 44-3A6之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VH) cDNA。選殖係基於公開於免疫球蛋白資料庫中之序列。簡而言之，將由約5 x 108 個雜交瘤細胞製備的RNA藉由市售試劑用於製備cDNA。用限制性內切酶消化VH及VL之擴增cDNA，該等限制性內切酶位點之位點係在PCR擴增期間安裝。然後將基因次選殖至噬菌體顯示載體中以建構用於文庫選擇目的之scFv。
然後將scFv之文庫次選殖。對於每個scFV，將序列融合，使得於隨後表現後，產物將具有C端myc標記。對於噬菌體文庫選擇，將蛋白質抗原(經組胺酸標記之拉比林)固定至96孔板上過夜。將文庫噬菌體之等分試樣置於指定孔中。洗脫結合的噬菌體並添加至TG1培養物以進行感染，且然後藉由KO7輔助噬菌體救援。使受感染的TG1細胞生長(30℃過夜)且收獲細菌培養物上清液，沉澱，並再懸浮於PBS中以進行下一輪選擇或噬菌體ELISA。
對於抗原製備，使用pGEX-2T選殖拉比林之細胞外域並表現為GST融合蛋白。使用尺寸排除層析容易地製備粗製劑且藉由親和力層析來製備純製劑。觀察到由於蛋白質之一些部分中帶負電荷且酸性之殘基，拉比林隨著逐步純化強烈聚集。因此，產生經組胺酸標記之經修飾之拉比林蛋白質(少極具疏水性之前22個胺基酸：前導樣序列)並用於以上抗原-抗體篩選程序(噬菌體顯示)。雖然預期組胺酸不會對拉比林二級結構產生重大影響，但是有鑑於圍繞該蛋白質之純化之問題，亦合成對應於包含MCA 44-3A6之已知結合位點之胺基酸#109-130之另一種KLH結合肽。因此，雖然經修飾之His-拉比林用於噬菌體顯示抗體之選擇，但合成肽亦包括在Biacore結合測量中以確保最佳抗體候選選擇。
對於噬菌體ELISA，將His-拉比林涂覆至ELISA板上(4℃過夜)。將待測試的各噬菌體之等分試樣添加至各自孔(在37℃培養30至90分鐘)且然後用PBS充分洗滌。藉由用HRP結合之抗M13抗體培養來偵測噬菌體結合之抗原。
隨後，藉由胺偶聯將經純化之蛋白質拉比林抗原(His-拉比林及合成肽)固定在CM5晶片上以進行Biacore測量。將各種濃度之經純化之抗體前導變異體(選自噬菌體文庫)注射至系統中以評估抗體-抗原相互作用之締合及解離。抗體親和力測量係根據製造商協議(Biacore, Inc.，Piscataway，NJ)在Biacore 1000儀器上進行。根據不同純系彼此之親和力測量值之接近程度，儲存最終篩选及生長之前三個候選者且使用活體外篩選進一步評估最高親和力候選者。
如圖 1A 及圖 1B 中所顯示，進行使用經His標記之拉比林之經選殖及經表現之蛋白質(純系X373 scFv；圖 1B )及親本MCA 44-3A6抗體(圖 1A )之初始結合分析。測得X373 scFV之解離常數(Kd)比親本MCA 44-3A6抗體低約四倍。具體而言，測得X373 scFv之Kd為4.8 x 10-7 M及測得MCA 44-3A6之Kd為1.17 x 10-7 M。
修改上述開發策略，為Fab形式生成另外文庫。經由篩選鑑定一種Fab，X509Fab且於隨後使用以上詳述的Biacore方法評估對His-拉比林及KLH結合拉比林衍生肽之親和力。X509Fab之親和力測量報告於表 5 中。表 5. X509Fab之親和力測量。
   Kon/SE Koff/SE Kd(M)
His-拉比林蛋白質 3.23E+04/826 2.58E-03/3.89E-05 8.0e-8
KLH結合拉比林衍生肽 5.48E+04/1260 1.28E-03/3.19E-05 2.33e-8
於隨後測試X509Fab識別腺癌細胞中天然拉比林之能力。使用A549異種移植腫瘤切片(~6 μm厚度)之連續切片以在幾乎相同環境中比較X509Fab與親本MCA 44-3A6抗體。於隨後，利用適宜二級抗體(HRP結合之山羊抗小鼠或抗人類IgG)及DAB，使用標準ABC方法(Vector Laboratory，Burlingame，CA)，使暴露至10 μg/ml抗體(或無初級抗體)之組織切片顯影。結果(未顯示)證實，X509Fab結合至天然拉比林且在識別癌細胞上的抗原決定基(拉比林)之能力上至少等於親本抗體。
為確定X509Fab之陽性細胞結合結果是否代表對拉比林之特異性識別，利用WI39正常人類纖維母細胞(陰性對照)及A549肺腺癌細胞(陽性對照)裂解液進行標準西方免疫轉漬。在拉比林之預期尺寸(~40 kD)看到清晰條帶，而在陰性對照中未獲得 信號(圖 2 )。如同使用MCA 44-3A6之先前結果，存在一個較弱的較低譜帶(分解產物)及較高譜帶(~80 kD)，其證實拉比林自聚集(圖 2 )。
衍生自抗拉比林抗體(MCA 44-3A6)之scFv及Fab與His-拉比林及KLH結合之拉比林衍生肽之親和力測量值之概述顯示於表 6 中。表 6. X373 scFv及X509Fab之親和力測量值。
   His-拉比林 KLH結合之拉比林衍生肽
MCA 44-3A6 117 nM N/A
X373 scFv 479 nM 277 nM
X509Fab 80 nM 23 nM
圖 1A 至 1B 顯示MCA 44-3A6小鼠單株IgG抗體(圖 1A )及X373 scFV衍生物(圖 1B )之時間相對結合反應測量值。
圖 2 顯示使用X509Fab之來自A549肺腺癌細胞(陽性對照)及WI38纖維母細胞(陰性對照)之裂解物之西方免疫轉漬。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011

Claims (32)

  1. 一種經分離之抗拉比林(Labyrinthin)構築體，其包含特異性結合至拉比林或其部分之抗體部分及效應域。
  2. 如請求項1之經分離之抗拉比林構築體，其中該抗體部分係結合至該效應域。
  3. 如請求項2之經分離之抗拉比林構築體，其中該效應域包含效應分子。
  4. 如請求項3之經分離之抗拉比林構築體，其中該效應分子包含治療劑。
  5. 如請求項4之經分離之抗拉比林構築體，其中該治療劑係選自由藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、肽及核酸組成之群。
  6. 如請求項1至5中任一項之經分離之抗拉比林構築體，其中該經分離之抗拉比林構築體為抗體藥物結合物(ADC)。
  7. 如請求項3之經分離之抗拉比林構築體，其中該效應域包含診斷劑。
  8. 如請求項7之經分離之抗拉比林構築體，其中該診斷劑為標記。
  9. 如請求項1之經分離之抗拉比林構築體，其中該抗體部分係稠合至效應域。
  10. 如請求項9之經分離之抗拉比林構築體，其中該經分離之抗拉比林構築體為包含含有抗體部分稠合至效應域之細胞外域之嵌合抗原受體(CAR)，其中該效應域包含跨膜域及細胞內傳訊域。
  11. 如請求項9之經分離之抗拉比林構築體，其中該經分離之抗拉比林構築體為包含含有抗體部分稠合至抗CD3抗體或其片段之細胞外域之雙特異性T細胞接合子(engager)(BiTE)。
  12. 如請求項1至9中任一項之經分離之抗拉比林構築體，其中該經分離之抗拉比林構築體為包含含有抗體部分稠合至效應域之細胞外域之T細胞受體(TCR)，其中該效應域包含TCR亞單元之跨膜域及/或細胞內傳訊域。
  13. 如請求項1至12中任一項之經分離之抗拉比林構築體，其中該抗體部分為全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或單鏈Fv (scFv)。
  14. 如請求項1至13中任一項之經分離之抗拉比林構築體，其中該抗體部分以約0.1 pM至約500 nM之Kd結合拉比林或其部分。
  15. 如請求項1至14中任一項之經分離之抗拉比林構築體，其中該抗體部分特異性結合至拉比林衍生肽，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 2至32。
  16. 如請求項15之經分離之抗拉比林構築體，其中該拉比林衍生肽包含B細胞抗原決定基。
  17. 如請求項15或16之經分離之抗拉比林構築體，其中該拉比林衍生肽包含T細胞抗原決定基。
  18. 如請求項1至17中任一項之經分離之抗拉比林構築體，其中該抗體部分係多特異性的。
  19. 如請求項18之經分離之抗拉比林構築體，其中該多特異性抗體部分為串聯scFv、雙功能抗體(diabody)(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙重親和力再靶向(DART)抗體、雙重可變域(DVD)抗體、結進孔(knob-into-hole)(KiH)抗體、對接及鎖定(dock and lock)(DNL)抗體、化學交聯抗體、異多聚體(heteromultimeric)抗體或異結合物(heteroconjugate)抗體。
  20. 如請求項19之經分離之抗拉比林構築體，其中該多特異性抗體部分為串聯scFv，其包含兩個scFv藉由視需要之肽連接子連接。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之經分離之抗拉比林構築體。
  22. 一種宿主細胞，其表現如請求項1至20中任一項之經分離之抗拉比林構築體。
  23. 一種核酸，其編碼如請求項1至20中任一項之經分離之抗拉比林構築體之多肽組分。
  24. 一種包含如請求項23之核酸之效應細胞。
  25. 如請求項24之效應細胞，其中該效應細胞為T細胞。
  26. 一種偵測呈遞拉比林或其部分於細胞表面之細胞之方法，該方法包括： (a) 使該細胞與如請求項8之經分離之抗拉比林構築體接觸；及 (b) 偵測該細胞上該標記之存在。
  27. 一種治療患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該方法包括對該個體投與： (a) 有效量之如請求項21之醫藥組合物；或 (b) 有效量之如請求項24或25之效應細胞。
  28. 如請求項27之方法，其中該拉比林狀態係用作選擇治療個體之基礎。
  29. 一種診斷患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該方法包括： (a) 對該個體投與有效量之如請求項8之經分離之抗拉比林構築體；及 (b) 測定該個體中該標記之量，其中該標記之量高於閾值指示該個體患有拉比林陽性疾病。
  30. 一種診斷患有拉比林陽性疾病之個體之方法，該方法包括： (a) 使來自該個體之樣品與如請求項1至20中任一項之經分離之抗拉比林構築體接觸；及 (b) 鑑定該樣品中與該經分離之抗拉比林構築體結合之一或多個細胞， 從而診斷患有拉比林陽性疾病之個體。
  31. 如請求項25至29中任一項之方法，其中該拉比林陽性疾病為拉比林陽性癌症。
  32. 如請求項31之方法，其中該拉比林陽性癌症為腺癌。
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