JP2022517329A - ラビリンチン又はその一部を標的とする構築物及びその使用 - Google Patents

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Abstract

ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分とエフェクタードメインとを含む構築物。これらの構築物及びその組成物を作製及び使用する方法も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願との相互参照
この出願は、２０１９年１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７８９，８７１号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する次の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１８５７２２０００２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年１月７日、サイズ：９ＫＢ）。
技術分野
本出願は、ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分とエフェクタードメインとを含む構築物に関する。これらの構築物及びその組成物を作製及び使用する方法も提供される。
背景
歴史的に、がんは、例えば、肺がん、乳がん、及び結腸がんなど、がんが由来する組織型又は臓器に大きく基づいて特徴づけられてきた。多くのがん治療はまた、がんの組織又は臓器に基づく分類に基づいている。そのような組織又は臓器に基づくがんの分類は、効果的な治療法の選択のための十分な指針を提供しない場合があることはよく認識されている。これは、部分的には、単一の組織型又は臓器に由来するがんが非常に不均一である場合があり、そのような違いのため個別化されたがん治療アプローチが必要になる場合があるという知見による。例えば、起源の組織型又は臓器とは対照的に、バイオマーカーによってがんを明確化することで、がん治療の改善が可能になる場合があり、例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及びＨＥＲ２／ｎｅｕの発現を欠く三種陰性乳がんは、同定された受容体のいずれか１つ又は複数を標的とする伝統的なホルモンベースの治療法に反応性ではなく、代替治療法を必要とする。バイオマーカーに基づいてがんサブタイプを特定した後、そのようながんサブタイプの効果的な治療のための新薬を開発する重要な研究が必要とされる。
１つのそのような特定されたがんサブタイプは、ラビリンチンを発現するがんである。ラビリンチンは、腺癌などの一部のがんの細胞膜の細胞外表面に発現される細胞表面タンパク質である。ラビリンチンの細胞表面発現は細胞周期特異的ではない。さらに、ラビリンチンは、正常な又は腫瘍を有する患者の血清には見出せず、ラビリンチン陽性細胞株によって培地中に排出されない。
ヒトにおける免疫療法は、一部には非ヒトモノクローナル抗体に対する有害反応のために制限されてきた。げっ歯類の抗体を使用した初期の臨床試験では、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びヒト抗ラット抗体（ＨＡＲＡ）の反応が明らかになり、これは抗体の迅速なクリアランスにつながる。その後、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体、及びトランスジェニックマウス又はファージディスプレイライブラリーを使用して調製されたヒト抗体を含む、免疫原性の低い抗体が開発されている。例えば、Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81, 1984;及びQueen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86, 1989を参照。ＨＡＭＡ反応の回避により、治療反応を達成するための高用量投与及び反復投与が可能となる。
ファージディスプレイを用いてｍＡｂを生成する最近の進歩は、大規模な抗体レパートリーから、規定されたエピトープに対して精巧な特異性を有する薬剤を選択することを可能にした。固形腫瘍抗原に特異的なこのようなｍＡｂの多くは、ＨＬＡ－Ａ０１及びＨＬＡ－Ａ０２との関連において、ファージディスプレイライブラリーから首尾よく選択されている（Noy et al., Expert Rev Anticancer Ther, 5, 2005; Chames et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97, 2000; Held et al., Eur J Immunol, 34, 2004; Lev et al., Cancer Res, 62, 2002; Klechevsky et al., Cancer Res, 68, 2008）。さらに最近、よく説明されているＴ細胞エピトープであるヒトＷＴ１／ＨＬＡ－Ａ０２複合体に特異的なヒトｍＡｂが、Ｆｃ媒介性エフェクター細胞機能を介して複数のがん細胞株及び原発性がん細胞を阻害することが細胞アッセイ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルで示されている（Dao et al., Sci Transl Med, 5, 2013; Veomett et al., Clin Cancer Res, 2014）。
特許出願及び刊行物を含めて、ここに引用される全ての参考文献は、その全体について参照することにより組み込まれる。
概要
一態様では、本出願は、ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分とエフェクタードメインとを含む単離された抗ラビリンチン構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、抗体部分はエフェクタードメインにコンジュゲートされている。いくつかの実施態様では、エフェクタードメインはエフェクター分子を含む。いくつかの実施態様では、エフェクター分子は治療剤を含む。いくつかの実施態様では、治療剤は、薬物、毒素、放射性同位元素、タンパク質、ペプチド、及び核酸からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、単離された抗ラビリンチン構築物は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
いくつかの実施態様では、エフェクタードメインは診断剤を含む。いくつかの実施態様では、診断剤は標識である。
いくつかの実施態様では、抗体部分はエフェクタードメインに融合されている。
いくつかの実施態様では、単離された抗ラビリンチン構築物は、エフェクタードメインに融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、ここで、エフェクタードメインは、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施態様では、単離された抗ラビリンチン構築物は、抗ＣＤ３抗体又はその断片に融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
いくつかの実施態様では、単離された抗ラビリンチン構築物は、エフェクタードメインに融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、ここで、エフェクタードメインは、ＴＣＲサブユニットの膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施態様では、抗体部分は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施態様では、抗体部分は、約０．１ｐＭから約５００ｎＭのＫｄで、ラビリンチン又はその一部と結合する。
いくつかの実施態様では、抗体部分は、配列番号２～３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むラビリンチン由来ペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、Ｂ細胞及びＴ細胞エピトープを含む。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、Ｂ細胞エピトープを含む。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含む。
いくつかの実施態様では、抗体部分は多重特異性である。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体部分は、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重親和性リターゲティング（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、ノブ・イントゥー・ホール（ＫｉＨ）抗体、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）抗体、化学的に架橋された抗体、ヘテロ多量体抗体、又はヘテロコンジュゲート抗体である。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体部分は、任意選択のペプチドリンカーによって連結された２つのｓｃＦｖを含むタンデムｓｃＦｖである。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかを発現する宿主細胞を提供する。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかのポリペプチド成分をコードする核酸を提供する。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の核酸のいずれかを含むエフェクター細胞を提供する。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞はＴ細胞である。
別の態様では、本出願は、ラビリンチン又はその一部をその表面上に提示する細胞を検出する方法であって、（ａ）細胞を単離された抗ラビリンチン構築物と接触させることであって、ここで、単離された抗ラビリンチン構築物は、標識を含むエフェクタードメインを含む、接触させること；及び（ｂ）細胞上の標識の存在を検出すること、を含む方法を提供する。
別の態様では、本出願は、ラビリンチン陽性疾患を有する個体を治療する方法であって、個体に対して（ａ）本明細書に記載の薬学的組成物いずれかの有効量；又は（ｂ）本明細書に記載のエフェクター細胞のいずれかの有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、ラビリンチン状態は、治療のための個体を選択するための基準として使用される。
別の態様では、本出願は、ラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法であって、（ａ）単離された抗ラビリンチン構築物の有効量を個体に投与することであって、ここで、単離された抗ラビリンチン構築物は、標識を含むエフェクタードメインを含む、投与すること；及び（ｂ）個体における標識のレベルを決定することであって、ここで、閾値レベルを超える標識のレベルは、個体がラビリンチン陽性疾患を有することを示す、決定すること、を含む方法を提供する。
別の態様では、本出願は、ラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法であって、（ａ）個体に由来する試料を、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかと接触させること；及び（ｂ）試料中の単離された抗ラビリンチン構築物と結合した１つ又は複数の細胞を同定することを含み、それによってラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法を提供する。
いくつかの実施態様では、ラビリンチン陽性疾患は、ラビリンチン陽性がんである。いくつかの実施態様では、ラビリンチン陽性がんは、腺癌である。
図１Ａ－１Ｂは、ＭＣＡ ４４－３Ａ６マウスモノクローナルＩｇＧ抗体（図１Ａ）及びＸ３７３ ｓｃＦＶ誘導体（図１Ｂ）の時間対結合応答測定値を示す。 図２は、Ｘ５０９Ｆａｂを使用した、Ａ５４９肺腺癌細胞（陽性対照）及びＷＩ３８線維芽細胞（陰性対照）からの溶解物のウエスタン免疫ブロットを示す。
詳細な説明
本出願は、いくつかの態様において、ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分とエフェクタードメインとを含む単離された構築物（「抗ラビリンチン構築物」又は「抗ＬＡＢ構築物」と呼ばれる）を提供する。これらの構築物及びその組成物を作製及び使用する方法も提供される。
本出願は、腺癌などの特定のがんが細胞表面のラビリンチンを選択的に発現し、ラビリンチン陽性のがんがラビリンチンを脱落しないという知見に部分的に基づいている。さらに、正常な非がん性のがんは、細胞表面のラビリンチンを発現しない。したがって、ラビリンチンは、ラビリンチン陽性がんを定義するための有用なマーカーであり、免疫療法に基づく治療の標的である。
したがって、いくつかの実施態様では、本出願は、ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分とエフェクタードメインとを含む単離された抗ラビリンチン構築物を提供する。
いくつかの実施態様では、単離された抗ラビリンチン構築物は、エフェクタードメインに融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、ここで、エフェクタードメインは、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施態様では、単離された抗ラビリンチン構築物は、抗ＣＤ３抗体又はその断片に融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
いくつかの実施態様では、単離された抗ラビリンチン構築物は、エフェクタードメインに融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、ここで、エフェクタードメインは、ＴＣＲサブユニットの膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施態様では、本出願は、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施態様では、本出願は、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかを発現する宿主細胞を提供する。
いくつかの実施態様では、本出願は、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかのポリペプチド成分をコードする核酸を提供する。
いくつかの実施態様では、本出願は、本明細書に記載の核酸のいずれかを含むエフェクター細胞を提供する。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞はＴ細胞である。
いくつかの実施態様では、本出願は、ラビリンチン又はその一部をその表面に提示する細胞を検出する方法であって、（ａ）細胞を単離された抗ラビリンチン構築物と接触させることであって、ここで、単離された抗ラビリンチン構築物は、標識を含むエフェクタードメインを含む、接触させること；及び（ｂ）細胞上の標識の存在を検出すること、を含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、本出願は、ラビリンチン陽性疾患を有する個体を治療する方法であって、個体に対して（ａ）本明細書に記載の薬学的組成物いずれかの有効量；又は（ｂ）本明細書に記載のエフェクター細胞のいずれかの有効量を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、本出願は、ラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法であって、（ａ）単離された抗ラビリンチン構築物の有効量を個体に投与することであって、ここで、単離された抗ラビリンチン構築物は、標識を含むエフェクタードメインを含む、投与すること；及び（ｂ）個体における標識のレベルを決定することであって、ここで、閾値レベルを超える標識のレベルは、個体がラビリンチン陽性疾患を有することを示す、決定すること、を含む方法を提供する。
いくつかの実施態様では、本出願は、ラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法であって、（ａ）個体に由来する試料を、本明細書に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のいずれかと接触させること；及び（ｂ）試料中の単離された抗ラビリンチン構築物と結合した１つ又は複数の細胞を同定することを含み、それによってラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法を提供する。
本開示の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施の形態及び詳細の変更を行うことができることも当業者に理解されるであろう。加えて、様々な利点、態様、及び目的を様々な実施態様を参照して記載してきたが、本開示の範囲は、そのような利点、態様、及び目的を参照することによって限定されるべきではない。
定義
用語「抗体部分」は、完全長抗体及びその抗原結合断片を含む。完全長抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖で構成される。軽鎖と重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖の可変領域は、通常、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度可変ループを含む（ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、及びＬＣ－ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、及びＨＣ－ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ）。本明細書に開示される抗体及び抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって定義又は同定され得る（Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991）。重鎖又は軽鎖の３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる隣接ストレッチの間に挿入され、このフレームワーク領域（ＦＲ）はＣＤＲよりも高度に保存され、超可変ループを支持する足場を形成する。重鎖と軽鎖の定常領域は抗原結合に関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラス又はアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、それぞれα、δ、ε、γ、μ重鎖の存在を特徴とする。主要な抗体クラスのいくつかは、ｌｇＧ１（γ１重鎖）、ｌｇＧ２（γ２重鎖）、ｌｇＧ３（γ３重鎖）、ｌｇＧ４（γ４重鎖）、ｌｇＡ１（α１重鎖）、又はｌｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けられる。
本明細書で使用される用語「抗原結合断片」とは、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ又は複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を構成しない任意の他の抗体断片を含む抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合する同じ抗原に結合することが可能である。抗原結合断片は、１つ又は複数の異なるヒト抗体からのフレームワーク領域に移植された特定のヒト抗体からの１つ又は複数のＣＤＲを含み得る。
本明細書で使用される用語「エピトープ」は、抗体又は抗体部分が結合する抗原上の原子又はアミノ酸の特定のグループを指す。２つの抗体又は抗体部分は、それらが抗原に対して競合的結合を示す場合、抗原内の同じエピトープに結合し得る。
本明細書で使用される場合、第１の抗体部分が、第１の抗体部分の等モル濃度の存在下で、第２の抗体部分の標的ラビリンチン結合を少なくとも約５０％（少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のいずれかなど）阻害する場合、第１の抗体部分は第２の抗体部分と標的ラビリンチンへの結合について「競合」し、逆もまた同様である。それらの交差競合に基づく抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。
本明細書で使用する場合、用語「～に特異的に結合する」又は「～に特異的である」とは、生物学的分子を含む分子の不均一な集団の存在下で標的の存在を決定する、標的と抗体又は抗体部分との間の結合などの、測定可能かつ再現性のある相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体又は抗体部分は、他の標的への結合よりも、より高い親和性、結合活性、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこの標的に結合する抗体又は抗体部分である。いくつかの実施態様では、抗原に特異的に結合する抗体又は抗体部分は、抗原の１つ又は複数の抗原決定基（例えば、ラビリンチン又はその一部）と、他の標的に対するその結合親和性の少なくとも約１０倍の結合親和性で反応する。
本明細書で使用される「単離された」抗ラビリンチン構築物は、（１）天然に見出されるタンパク質と結合していない、（２）同一供給源由来の他のタンパク質が存在しない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、又は（４）天然に生じない、抗ラビリンチン構築物を指す。
本明細書で使用される用語「単離された核酸」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源の核酸、又はそれらのいくつかの組み合わせを意味することを意図しており、その起源により、「単離された核酸」は、（１）「単離された核酸」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部と結合しておらず、（２）天然では連結されていないポリヌクレオチドに操作可能に連結されている、又は（３）より大きな配列の一部として天然に存在しない。
本明細書で使用される用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味することを意図している。これらの特定の領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)；及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); and MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)によって記載されており、ここでその定義には、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又は移植された抗体又はそのバリアントのＣＤＲを参照するためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内であることが意図されている。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基を、比較として以下の表１に明記する。
Figure 2022517329000001
用語「キメラ抗体」とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の配列と同一又は相同である一方、残りの鎖は、他の種に由来する、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の配列と同一又は相同である抗体、並びにこの発明の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を意味する（米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照）。
抗体又は抗体部分に言及する用語「半合成」は、抗体又は抗体部分が、１つ又は複数の天然に存在する配列及び１つ又は複数の非天然に存在する（すなわち、合成）配列を有することを意味する。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（それぞれ重鎖及び軽鎖に由来する３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖中に連結されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施態様では、ｓｃＦｖポリペプチドは、さらに、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖのレビューについては、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
用語「ダイアボディ」は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に短いリンカー（約５～約１０残基など）を典型的に有するｓｃＦｖ断片（前段落参照）を構築し、Ｖドメインの鎖内ペアリングではなく鎖間ペアリングを達成させることによって、二価の断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片をつくることにより調製される小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」Ｆｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)にさらに詳細に記載されている。
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練させるためになされる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでは超可変ループの全て又は実質的に全てが非－ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。いくつかの実施態様では、本発明のＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するものであり（γ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び選択的スプライシング形態も含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)の概説Ｍを参照）。用語は、ＦｃγＲＩＩＩＡアロタイプ：ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｐｈｅ１５８、ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｖａｌ１５８、ＦｃγＲＩＩＡ－Ｒ１３１及び／又はＦｃγＲＩＩＡ－Ｈ１３１を含む。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)； Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に概説されている。他のＦｃＲは、将来同定されるべきものを含めて本明細書においては用語「ＦｃＲ」に含まれる。この用語には、胎児への母親ＩｇＧの移行を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
用語「ＦｃＲｎ」は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を指す。ＦｃＲｎは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と構造的に類似しており、β２－ミクログロブリンに非共有結合したα鎖からなる。新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎの多機能については、Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766で概説されている。ＦｃＲｎは、母親からこどもへの免疫グロブリンＩｇＧの受動的送達、及び血清ＩｇＧレベルの調節において役割を果たす。ＦｃＲｎは、サルベージ受容体として作用し、ピノサイトーシスされたＩｇＧを細胞内及び細胞間の両方でインタクトな形態で結合及び輸送し、それらをデフォルトの分解経路から救出する。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸１１８から約アミノ酸２１５（ＥＵ番号付けシステム）に及ぶ。
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までのストレッチとして定義される（Burton, Molec. Immunol.22:161-206(1985)）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ－Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｈ２」ドメインの「Ｃ２」とも呼ばれる）は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対にならないという点で独特である。それどころか、２つのＮ結合型分枝状炭水化物鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入されている。炭水化物は、ドメインとドメインの対合の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化に役立つ可能性があると推測されている。 Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)。
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」又は「Ｈ３」ドメインとも呼ばれる）は、Ｆｃ領域におけるＣ末端の残基からＣＨ２ドメインまでのストレッチ（すなわち、抗体配列の約アミノ酸残基３４１からＣ末端まで、典型的にはＩｇＧのアミノ酸残基４４６又は４４７まで）を含む。
「機能的Ｆｃ断片」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。このようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合するＦｃ領域を必要とし、当技術分野で公知の様々なアッセイを用いて評価することができる。
「改変された」ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性を有するバリアントＩｇＧ Ｆｃを有する抗体は、親ポリペプチド又は天然配列Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、増強又は減少したＦｃＲ結合活性（例えば、ＦｃγＲ又はＦｃＲｎ）及び／又はＡＤＣＣ活性を有する抗体である。ＦｃＲへの「増加した結合を示す」バリアントＦｃは、親ポリペプチド又は天然配列ＩｇＧ Ｆｃよりも高い親和性（例えば、より低い見かけのＫｄ又はＩＣ５０値）で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。いくつかの実施態様では、親ポリペプチドと比較した結合の改善は、約３倍、例えば、約５、１０、２５、５０、６０、１００、１５０、２００、若しくは最大５００倍、又は約２５％～１０００％の結合の改善である。ＦｃＲへの「減少した結合を示す」ポリペプチドバリアントは、親ポリペプチドよりも低い親和性（例えば、より高い見かけのＫｄ又はより高いＩＣ５０値）で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。親ポリペプチドと比較した結合の減少は、約４０％又はそれ以上の結合の減少であり得る。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原を保持する標的細胞に特異的に結合させ、続いて細胞障害性剤により標的細胞を死滅させることを可能にする、細胞傷害性の一形態を』指す。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させ、そのような死滅に絶対に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりに又は追加的に、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルでｉｎ ｖｉｖｏの評価がされ得る。
ヒトエフェクター細胞の存在下で、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチド又は親ポリペプチドよりも効果的に「増加したＡＤＣＣを示す」又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するバリアントＦｃ領域を含むポリペプチドは、アッセイにおいてバリアントＦｃ領域を有するポリペプチド及び野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチド（又は親ポリペプチド）の量が本質的に同じである場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＡＤＣＣを媒介するのに実質的により効果的であるものである。一般に、このようなバリアントは、例えば動物モデル等においてＡＤＣＣ活性を測定するためのアッセイ又は方法など、当技術分野で公知の任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを使用して同定されるであろう。いくつかの実施態様では、バリアントは、野生型Ｆｃ（又は親ポリペプチド）よりもＡＤＣＣを媒介するのに約５倍から約１００倍、例えば約２５倍から約５０倍、より効果的である。
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、その同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるＣＤＣアッセイを実行することができる。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増加又は減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチドバリアントは、米国特許第６，１９４，５５１号（Ｂ１）及び国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。それらの特許公報の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。また、Idusogie et al. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000)を参照。
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同一のアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするフレーズヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンにおいてイントロンを含み得る程度までイントロンを含み得る。
用語「作動可能に連結された」とは、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合は、同じリーディングフレーム内にある。
「相同」とは、２つのポリペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。比較した２つの配列の両方の位置が同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、その分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される一致する又は相同な位置の数を、比較される位置の数で割って１００をかけたものである。例えば、２つの配列中の位置の１０のうち６つが一致するか又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。一般に、比較は、最大の相同性を与えるように２つの配列が整列されているときに行われる。
本明細書で使用される用語「実質的に相同」は、参照配列と比較した場合の本明細書で開示される配列の配列類似性を指し、ここで該配列は、参照又はその一部と少なくとも約８５％の類似性（例えば、相同性）、例えば、少なくとも約８６％の類似性、８７％の類似性、８８％の類似性、８９％の類似性、９０％の類似性、９１％の類似性、９２％の類似性、９３％の類似性、９４％の類似性、９５％の類似性、９６％の類似性、９７％の類似性、９８％の類似性、９９％の類似性、又は１００％の類似性のうちのいずれかを有する。配列の類似性を決定する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Pearson, W. R., Curr Protoc Bioinformatics, 2013に記載されている。
本明細書で使用される用語「標識」は、抗ラビリンチン抗体部分に直接又は間接的にコンジュゲートされ得る検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であり得（例えば、放射性同位元素標識若しくは蛍光標識）、又は酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学的変化を触媒し得る。
本明細書で使用される「治療」又は「治療する」とは、臨床結果を含む、有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果には、限定されないが、以下の１つ又は複数の症状が含まれる：疾患に起因する１つ又は複数の症状の軽減、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防又は遅延化）、疾患の広がり（例えば、転移）の予防又は遅延化、疾患の再発の予防又は遅延化、疾患の進行の遅延化又は緩徐化、病状の回復、疾患の寛解（疾患の部分的又は全体的）の提供、疾患を治療するために必要な１つ又は複数の他の医薬の用量の減少、疾患の進行の遅延化、生活の質の向上又は改善、及び／又は生存の延長。
「治療」には、がんの病理学的結果（例えば、腫瘍体積など）の低減も含まれる。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいずれか１つ又は複数を意図している。
「再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）」、「再発（ｒｅｌａｐｓｅ）」又は「再発性（ｒｅｌａｐｓｅｄ）」という用語は、疾患の消失の臨床評価後の、がん又は疾患の再発を指す。遠隔転移又は局所再発の診断は再発とみなすことができる。
用語「難治性」又は「抵抗性」とは、治療に反応しなかったがん又は疾患を指す。
本明細書でＴ細胞に関連して使用される「活性化」とは、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能と関連し得る。
本明細書で使用される用語「有効量」とは、障害、状態、又は疾患の１つ又は複数の症状を寛解し、緩和し、軽減し、及び／又は遅延させるなど、特定の障害、状態、又は疾患を治療するのに十分な化合物又は組成物の量を指す。がんに関して、有効量は、例えば、腫瘍を縮小させ、及び／又は腫瘍の増殖速度を低下させ（腫瘍増殖を抑制するなど）、又はがんにおける他の望ましくない細胞増殖を防止又は遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの実施態様では、有効量は、がんの発生を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施態様では、有効量は、再発を防止又は遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回又は複数回の投与において投与することができる。がんの場合、薬剤又は組成物の有効量は、（ｉ）がん性細胞の数を減少させ；（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させ；（ｉｉｉ）末梢臓器へのがん細胞の浸潤を抑制し、遅らせ、ある程度遅くし、好ましくは停止させ；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し（例えば、ある程度遅くし、好ましくは停止させ）；（ｖ）腫瘍増殖を阻害し；（ｖｉ）腫瘍の発生及び／又は再発を防止又は遅延させ；及び／又は（ｖｉｉ）がんに関連する１つ又は複数の症状をある程度緩和することができる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」又は「薬学的に適合する」とは、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない材料を意味し、例えば、その材料は、いかなる重大な望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、あるいはそれが含有される組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される薬学的組成物中に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体又は添加物は、毒性学的及び製造試験の要求基準を満たしていることが好ましく、且つ／又は米国食品医薬品局が作成した不活性成分ガイドに含まれている。
本明細書で使用される場合、がんの発生を「遅延させる」とは、疾患の発生を延期し、妨害し、緩徐化し、遅延させ、安定化し、及び／又は延ばすことを意味する。このような遅延は、治療される疾患及び／又は個体の病歴に応じて、様々な長さの時間になり得る。当業者には明らかであるように、十分な又は有意な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で予防を包含し得る。がんの発生を「遅延させる」方法は、その方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠で疾患発症の可能性を低減し、及び／又は所与の時間枠で疾患の程度を低減する方法である。このような比較は、典型的には、統計的に有意な数の対象を使用した臨床試験に基づく。がんの発生は、限定されないが、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、腹部超音波、凝固検査、動脈造影法、又は生検を含む標準的な方法を使用して検出することができる。発生はまた、最初は検出できない場合があり、発生、再発、及び発症を含むがんの進行を指す場合がある。
用語「個体」とは、哺乳動物を指し、限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類、又は霊長類を含む。
本明細書で使用される用語「に基づく」又は「の基準」とは、本明細書に記載される個体又はその中のがんの１つ又は複数の特徴を評価し、決定し、取得し、又は測定すること、及びいくつかの実施態様では、本明細書に開示される方法に記載される治療を受けるのに適した個体を選択することを含む。例えば、がんのラビリンチン状態が、本明細書の治療方法のために個体を選択するための基準として使用される場合、ラビリンチン状態を評価し（又は評価を支援し）、測定し、取得し、又は決定することは、本明細書に記載の治療の方法に含めることができ、例えば、ラビリンチン状態は、治療前及び／又は治療中及び／又は治療後に測定され、得られる値は次のいずれかを評価する際に臨床医によって使用される：（ａ）個体が最初に治療を受けることが適切である高可能性又は可能性；（ｂ）個体が最初に治療を受けることが不適切である高可能性又は可能性；（ｃ）治療に対する反応性；（ｄ）個体が治療を受け続けることが適切である高可能性又は可能性；（ｅ）個体が治療を受け続けることが不適切である高可能性又は可能性；（ｆ）投薬量の調整；又は（ｇ）臨床的有用性の可能性の予測。
本出願の方法と共に使用される本明細書に開示される基準、例えばラビリンチン状態は、いくつかの態様では、対照との比較に基づき得る。いくつかの実施態様では、対照は、文献から得られる既知の標準（例えば、既知の遺伝子配列、ＲＮＡ配列、タンパク質配列、遺伝子発現レベル）である。いくつかの実施態様では、対照は、本明細書に開示される方法を使用して治療されるべき、又は治療されている個体から得られる対照試料（例えば、非がん性組織からの対照試料）である。いくつかの実施態様では、対照は、本明細書に開示される方法を使用して治療されるべき、又は治療されている個体以外の個体から得られる対照試料（例えば、健康なボランティア又はがんを有さないボランティアからの対照試料）である。いくつかの実施態様では、対照は、所与の患者集団から得られる。例えば、遺伝子発現のレベル又は酵素活性レベルに関して、対照レベルは、患者集団に対するその遺伝子の発現レベルの中央値、又はその酵素の酵素活性レベルの中央値であり得る。そして、例えば、一人の患者の目的の遺伝子の発現レベルが患者集団の発現レベルの中央値を超えると決定される場合、その患者は、目的の遺伝子の発現が高いと決定される。あるいは、一人の患者の目的の遺伝子の発現レベルが患者集団の発現レベルの中央値よりも低いと決定される場合、その患者は、目的の遺伝子の発現が低いと決定される。いくつかの実施態様では、その一人の患者は疾患（がんなど）を有し、患者集団は疾患を有さない。いくつかの実施態様では、一人の患者と患者集団が、同じ組織型の疾患を有する。集団は、測定される個体数に関して、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、あるいは少なくとも約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００のいずれかであり得る。好ましくは、当技術分野で公知の方法によって決定することができる統計的に有意な集団を提供するのに十分な数の個体が測定される。いくつかの実施態様では、集団は、臨床試験に参加している群である。
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、及び他の類似の形態、並びにそれらの文法的同義語は、意味が同等であり、これらの語のいずれか１つに続く１つ又は複数の事項が、そのような１つ又は複数の事項の限定列挙を意味するものではなく、列挙された１つ又は複数の事項のみに限定されることを意味しない点で、無制限（オープンエンド）であることが意図される。例えば、構成要素Ａ、Ｂ、及びＣを「含む」物品は、構成要素Ａ、Ｂ、及びＣから構成され（すなわち、それらのみを含み）得、又は構成要素Ａ、Ｂ、及びＣだけでなく、１つ又は複数の他の構成要素もまた含み得る。そのように、「含む」及びその類似の形態、並びにそれらの文法的同義語は、「から本質的になる」又は「からなる」の実施態様の開示を含むものと意図され、かつ理解される。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値及び下限値とその述べられた範囲内の任意の他の述べられた又は介在する値との間の、下限値の単位の１０分の１までの各介在値は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、述べられた範囲内の特に除外された限界を条件として、開示内に包含されることが理解される。述べられた範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、その含まれる限界値のいずれか又は両方を除外する範囲もまた開示に含まれる。
本明細書での「約」が付された値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体に対する変動を含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載が含まれる。
添付の特許請求の範囲を含み、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「又は」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。
抗ＬＡＢ構築物
本出願は、ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分とエフェクタードメインとを含む、単離された抗ＬＡＢ構築物などの抗ラビリンチン構築物（本明細書では「抗ＬＡＢ構築物」と呼ばれる）を提供する。いくつかの実施態様では、抗体部分はエフェクタードメインにコンジュゲートされている。例えば、エフェクタードメインは、治療剤又は標識となり得るエフェクター分子を含み得る。いくつかの実施態様では、治療剤は、薬物、毒素、放射性同位元素、タンパク質、ペプチド、及び核酸からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、エフェクター分子は、標識などの診断剤である。エフェクター分子のコンジュゲーションは当技術分野で周知であり、共有結合（例えば、化学結合を介して、又はリンカーを介して）又は非共有結合相互作用（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン及び他のタンパク質－タンパク質相互作用対を介して）を含み得る。
いくつかの実施態様では、抗ラビリンチン構築物は、融合タンパク質である。例えば、抗ラビリンチン抗体部分は、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）、操作されたＴＣＲ、又は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子の一部であり得る。これらの様々な構築物については、以下の節でさらに詳細に考察する。
抗ＬＡＢ ＣＡＲ
一態様における本出願は、ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分（本明細書では「抗ＬＡＢ ＣＡＲ」と呼ぶ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。抗ＬＡＢ抗体部分を含むＣＡＲを含むＣＡＲエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）（本明細書では「抗ＬＡＢ ＣＡＲエフェクター細胞」、例えば「抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞」とも呼ばれる）も提供される。
抗ＬＡＢ ＣＡＲは、（ａ）ラビリンチンに特異的に結合する抗ＬＡＢ抗体部分を含む細胞外ドメイン、及び（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと細胞内ドメインの間に存在し得る。抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、又は抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間には、リンカー又はスペーサードメインが存在し得る。リンカー又はスペーサースペーサードメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメイン又は細胞内ドメインに連結するように機能する任意のオリゴ－又はポリペプチドであり得る。スペーサードメインは、例えば、約１０から約１００、又は約２５から約５０のアミノ酸を含む、最大約３００のアミノ酸を含み得る。
膜貫通ドメインは、天然又は合成のいずれかの供給源に由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明で特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β、δ若しくはγ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む）。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは合成であってよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの主として疎水性残基を含み得る。いくつかの実施態様では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出され得る。いくつかの実施態様では、例えば、長さが約２から約１０（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のいずれか）アミノ酸の間の長さを有する短いオリゴ－又はポリペプチドリンカーが、膜貫通ドメインと抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成し得る。いくつかの実施態様では、リンカーは、グリシン－セリンダブレットである。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞内ドメインの配列の１つと天然に結合している膜貫通ドメインが使用される（例えば、抗ＬＡＢ ＣＡＲ細胞内ドメインがＣＤ２８共刺激配列を含む場合、抗ＬＡＢ ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインに由来する）。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの当該ドメインの結合を避けるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、抗ＬＡＢ ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与している。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を果たすように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用される範囲内において、そのような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトなの鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達配列」は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
本発明の抗ＬＡＢ ＣＡＲに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列、及び抗原受容体結合に続いてシグナル伝達を開始するために協調して作用する共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
いくつかの実施態様では、ＴＣＲ単独を介して生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナル又は共刺激シグナルも必要とされ得ることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、いくつかの実施態様では、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達配列：ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次シグナル伝達配列）、及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供するもの（共刺激シグナル伝達配列）によって媒介され得る。一次シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的な方法又は抑制的な方法のいずれかで調節する。刺激様式で作用する一次シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。いくつかの実施態様における抗ＬＡＢ ＣＡＲ構築物は、１つ又は複数のＩＴＡＭを含む。本発明において特に使用される一次シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲは、ＣＤ３ζに由来する一次シグナル伝達配列を含む。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、それ自体で、又は本発明の抗ＬＡＢ ＣＡＲとの関連で有用な他の任意の所望の細胞内シグナル伝達配列と組み合わせて、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列を含むことができる。例えば、抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列及び共刺激シグナル伝達配列を含むことができる。共刺激シグナル伝達配列は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部であってよく、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達配列及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達配列及び４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達配列と、ＣＤ２８及び４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達配列とを含む。
したがって、例えば、いくつかの実施態様では、（ａ）ラビリンチンに特異的に結合する抗ＬＡＢ抗体部分を含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗ＬＡＢ ＣＡＲが提供される。いくつかの実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞を活性化することができる。いくつかの実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達配列及び共刺激シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施態様では、一次シグナル伝達配列は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施態様では、共刺激シグナル伝達配列は、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施態様では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列及びＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列を含む。
抗ＬＡＢ ＴＣＲ
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットのＮ末端に融合され、こうして抗ＬＡＢ Ｔ細胞受容体（本明細書では「抗ＬＡＢ ＴＣＲ」と呼ばれる）を形成する。
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、ＭＨＣ分子中に結合した特定の抗原ペプチドに結合する細胞外抗原結合ドメインを含む内因性又は組換えＴ細胞受容体を指す。いくつかの実施態様では、ＴＣＲは、ＴＣＲαポリペプチド鎖及びＴＣＲβポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施態様では、ＴＣＲは、ＴＣＲγポリペプチド鎖及びＴＣＲδポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施態様では、ＴＣＲは、腫瘍抗原に特異的に結合する。「ＴＣＲ－Ｔ」は、組換えＴＣＲを発現するＴ細胞を指す。本明細書で使用される「ＴＣＲ複合体」は、ＴＣＲ及びＣＤ３の複合体を指す。本明細書で使用される「ＴＣＲサブユニット」は、例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζを含む、ＴＣＲ複合体のサブユニットを指す。抗ＬＡＢ抗体部分は、ＴＣＲサブユニットのいずれかのＮ末端に融合することができる。
したがって、例えば、いくつかの実施態様では、（ａ）ラビリンチンに特異的に結合する抗ＬＡＢ抗体部分、及び（ｂ）ＴＣＲサブユニットを含む、操作されたＴＣＲが提供される。いくつかの実施態様では、抗体部分は、ＴＣＲサブユニットのＮ末端に融合されている。いくつかの実施様態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζからなる群から選択される。
抗ラビリンチン二重特異性抗体
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、多重特異性抗体である。異なる特異性を有する抗体又はその抗原結合断片は、化学的に架橋されて、多重特異性ヘテロコンジュゲート抗体を生成することもできる。例えば、それぞれが異なる抗原に特異性を有する２つのＦ（ａｂ’）２分子を、化学的に連結することができる。
いくつかの実施態様では、抗体部分は多重特異性である。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体部分は、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重親和性リターゲティング（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、ノブ・イントゥー・ホール（ＫｉＨ）抗体、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）抗体、化学的に架橋された抗体、ヘテロ多量体抗体、又はヘテロコンジュゲート抗体である。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体部分は、任意選択のペプチドリンカーによって連結された２つのｓｃＦｖを含むタンデムｓｃＦｖである。
いくつかの実施態様では、多重特異性抗体は、組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。例えば、二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖを融合することによって、例えば、ペプチドリンカーを介して２つのｓｃＦｖを融合させるなどして、タンデムｓｃＦｖにすることで設計することができる。タンデムｓｃＦｖの一例は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などの標的細胞の表面抗原に特異的なｓｃＦｖに連結することによって作成され、Ｔ細胞の標的細胞へのリダイレクトをもたらす。
したがって、例えば、いくつかの実施態様では、（ａ）ラビリンチンに特異的に結合する抗ＬＡＢ抗体部分、及び（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する抗ＣＤ３抗体部分を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ－が提供される。いくつかの実施態様では、（ａ）ラビリンチンに特異的に結合するｓｃＦｖ、及びｂ）ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーが提供される。
抗ＬＡＢ抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）又は他のコンジュゲート
抗ＬＡＢ構築物は、いくつかの実施態様では、エフェクター分子に付着した抗ＬＡＢ抗体部分を含むイムノコンジュゲート（本明細書では「抗ＬＡＢイムノコンジュゲート」とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施態様では、エフェクター分子は、細胞傷害性、細胞増殖抑制性であるか、あるいはそうでなければある種の治療的利益を提供する、がん治療剤などの治療剤である。いくつかの実施態様では、エフェクター分子は、直接的又は間接的に、検出可能なシグナルを生成することができる標識である。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分及び治療剤（本明細書では「抗体薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」とも呼ばれる）を含む抗ＬＡＢイムノコンジュゲートが提供される。いくつかの実施態様では、治療剤は、細胞傷害性、細胞増殖抑制性であるか、あるいはそうでなければ標的細胞の分裂能力を妨げるか又は低下させる毒素である。重要なことに、大部分の正常細胞はその表面にＬＡＢを提示しないので、それらは抗ＬＡＢイムノコンジュゲートに結合できず、毒素又は他の治療剤による死滅作用から保護される。
抗ＬＡＢイムノコンジュゲートで使用される治療剤には、例えば、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンが挙げられる（例えば、Rowland et al., Cancer Immunol Immunother, 21, 1986を参照）。抗ＬＡＢイムノコンジュゲートに使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、カリケアマイシンなどの低分子毒素が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構により、それらの細胞傷害性効果及び細胞増殖抑制効果を発揮し得る。いくつかの細胞傷害性剤は、大きな抗体又はタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートされると不活性になるか又は活性が低下する傾向がある。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、腫瘍のプレターゲティングで利用するために「受容体」（ストレプトアビジンなど）にコンジュゲートさせることができ、ここでは、抗体－受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて、清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートが除去され、次いで、細胞傷害性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
本出願はさらに、エフェクター分子に付着した抗ＬＡＢ抗体部分を含む抗ＬＡＢイムノコンジュゲートを提供し、ここで、エフェクター分子は、間接的又は直接的に検出可能なシグナルを生成することができる標識である。これらの抗ＬＡＢイムノコンジュゲートは、がんのｉｎ ｖｉｖｏ検出などの研究又は診断適用に使用することができる。標識は、好ましくは、直接的又は間接的に、検出可能なシグナルを生成することができる。例えば、標識は、放射線不透過性又は放射性同位元素、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンなどの蛍光（フルオロフォア）又は化学発光（発色団）化合物；アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素；造影剤；又は金属イオンであり得る。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートは、間接的に検出可能である。例えば、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートに特異的であり、検出可能な標識を含む二次抗体を使用して、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートを検出することができる。
したがって、例えば、いくつかの実施態様では、（ａ）ラビリンチンに特異的に結合する抗ＬＡＢ抗体部分；及び（ｂ）エフェクター分子を含む、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートが提供される。いくつかの実施態様では、エフェクター分子は治療剤である。いくつかの実施態様では、エフェクター分子は標識である。
抗ＬＡＢ抗体部分
一態様における本出願は、ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分（本明細書では「抗ＬＡＢ抗体部分」と呼ぶ）を提供する。抗ラビリンチン構築物は、抗ＬＡＢ抗体部分を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、細胞の表面上に存在するラビリンチンに特異的に結合する。いくつかの実施態様では、細胞はがん細胞である。いくつかの実施態様では、がん細胞は、転移性がん細胞などの固形腫瘍内にある。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は完全長抗体である。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、抗原結合断片であり、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、及び単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合断片である。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分はｓｃＦｖである。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ヒト、ヒト化、又は半合成のものである。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチン由来ペプチド又はその一部に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、ラビリンチン（配列番号１；表２参照）の一部から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチン由来ペプチドを免疫原として使用することによって産生される抗体に由来する。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドが免疫原として使用される場合、ラビリンチン由来ペプチドは、アルブミン又はＫＬＨなどの担体にコンジュゲートされている。
いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、ラビリンチン（配列番号１）の一部に対して、少なくとも約６５％の類似性、７０％の類似性、７５％の類似性、８０％の類似性、８５％の類似性、９０％の類似性、又は９５％の類似性など少なくとも約６０％の類似性の配列類似性を有するペプチドであり、ここで、ラビリンチン由来ペプチドは、末端プロリン残基を含まず、ラビリンチン由来ペプチドは、２、３、４、又は５個のプロリン残基など少なくとも１つのプロリン残基を含む。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、ラビリンチン（配列番号１）の一部に対して、少なくとも約６５％の類似性、７０％の類似性、７５％の類似性、８０％の類似性、８５％の類似性、９０％の類似性、又は９５％の類似性など少なくとも約６０％の類似性の配列類似性を有するペプチドであり、ここで、ラビリンチン由来ペプチドの１つの末端は、末端プロリン残基を含まず、ラビリンチン由来ペプチドは、２、３、４、又は５個のプロリン残基など少なくとも１つのプロリン残基を含む。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、長さが７～５０アミノ酸、例えば、長さが７～２５アミノ酸、長さが７～１３アミノ酸、又は長さが２１～２５アミノ酸のいずれかである。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０アミノ酸長である。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、ラビリンチン（配列番号１）の一部と実質的に相同である。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、ラビリンチン（配列番号１）の一部に対して、少なくとも６５％の類似性、７０％の類似性、７５％の類似性、８０％の類似性、８５％の類似性、９０％の類似性、又は９５％の類似性のいずれかなど少なくとも約６０％の類似性の配列類似性を有する。ラビリンチン由来ペプチド又はその誘導体は、ラビリンチン（配列番号１）の一部に対して少なくとも約６０％の類似性の配列類似性を有し、ここで、ラビリンチン由来ペプチドの配列の５アミノ酸のうちの１、２、３、４つが、ラビリンチン由来ペプチドに対して欠失、置換、挿入、及び／又は付加され、ここで、置換、挿入、及び／又は付加が存在する場合には、配列に対してある部分が置換され、挿入され、及び／又は付加される。いくつかの実施態様では、置換、挿入、又は付加される部分は、天然アミノ酸（例えば、α－アミノ酸若しくはＬ－アミノ酸若しくはＤ－アミノ酸）又は非天然アミノ酸である。いくつかの実施態様では、置換、挿入、又は付加される部分は、アミノ酸置換又はリンカーである。いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを含む。
いくつかの実施態様では、ラビリンチン由来ペプチドは、配列番号２～３２（表２）から選択される配列、又はそのバリアントを含む。いくつかの実施態様では、配列番号２～３２（表２）から選択される配列を含むラビリンチン由来ペプチド又はそのバリアントは、１つ又は２つの隣接アミノ酸配列を含み、その１つ又は２つの隣接アミノ酸配列は、配列番号２～３２に提供されるコア配列の末端に付加されている。
いくつかの実施態様では、１つ又は２つの隣接アミノ酸配列を含むラビリンチン由来ペプチドは、ラビリンチン（配列番号１）の一部に対して、少なくとも６５％の類似性、７０％の類似性、７５％の類似性、８０％の類似性、８５％の類似性、９０％の類似性、又は９５％の類似性のいずれかなど少なくとも約６０％の類似性の配列類似性を有するペプチドである。いくつかの実施態様では、隣接アミノ酸配列は、ラビリンチン（配列番号１）の一部の配列に基づいており、配列番号２～３２で提供される各コア配列から、例えばそのコア配列の１つ又は２つの末端からのラビリンチン配列のそれぞれの連続である。例えば、配列番号３については、配列番号３の左側にある２つのアミノ酸の第１の隣接アミノ酸配列は、Ｐｒｏ－Ａｌａであり、配列番号３の右側にある２つのアミノ酸の第２の隣接アミノ酸配列は、Ｇｌｕ－Ａｌａであろう。
Figure 2022517329000002
Figure 2022517329000003
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分（又は抗ＬＡＢ抗体部分を含む抗ＬＡＢ構築物）は、約０．１ｐＭから約５００ｎＭの間のＫｄでラビリンチン又はその一部に結合する（例えば、約０．１ｐＭ、１．０ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、又は５００ｎＭのいずれかであって、これらの値の間の任意の範囲を含む）。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分（又は抗ＬＡＢ抗体部分を含む抗ＬＡＢ構築物）は、ラビリンチンの１つ又は複数のエピトープ、例えば２つ又は３つのエピトープ又はその一部に結合する。
いくつかの実施態様における抗ＬＡＢ抗体部分は、そのような配列のうちの特異的配列又は特定のバリアントを含む。いくつかの実施態様では、バリアント配列におけるアミノ酸置換は、抗ＬＡＢ抗体部分がラビリンチン又はその一部に結合する能力を実質的に低下させない。例えば、ラビリンチン結合親和性を実質的に低下させない改変を行ってもよい。ラビリンチン結合親和性を実質的に改善するか、又はラビリンチンの関連バリアントとの特異性及び／又は交差反応性などの何らかの他の特性に影響を及ぼす改変もまた、考えられる。
抗ラビリンチン抗体は、当技術分野、例えば、米国特許第６，１６６，１７６号、米国特許第７，６３５，７５９号、及び国際公開第２０１１１１６０１４号において開示されており、これらの各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチンに結合するＭＣＡ４４－３Ａ６又はその一部を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分はＭＣＡ４４－３Ａ６である。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチンに結合するＭＣＡ４４－３Ａ６又はその一部と競合する。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ＭＣＡ４４－３Ａ６由来の１つ又は複数のＣＤＲを含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチンに結合するＸ３７３又はその一部を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分はＸ３７３である。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチンに結合するＸ３７３又はその一部と競合する。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチンに結合するＸ５０９又はその一部を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分はＸ５０９である。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、ラビリンチンに結合するＸ５０９又はその一部と競合する。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載された可変重鎖ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８に記載された可変軽鎖ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分は、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に記載された可変重鎖ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ又は複数と、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８に記載された可変軽鎖ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ又は複数とを含む。
Figure 2022517329000004
核酸及びエフェクター細胞
抗ＬＡＢ構築物又は抗ＬＡＢ抗体部分をコードする核酸分子も本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、完全長抗ＬＡＢ抗体をコードする核酸（又は核酸のセット）が提供される。いくつかの実施態様では、多重特異性抗ＬＡＢ分子（例えば、多重特異性抗ＬＡＢ抗体、二重特異性抗ＬＡＢ抗体、若しくは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗ＬＡＢ抗体）、又はそのポリペプチド部分をコードする核酸（又は核酸のセット）が提供される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分をコードする核酸（又は核酸のセット）が提供される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢイムノコンジュゲート、又はそのポリペプチド部分をコードする核酸（又は核酸のセット）が提供される。
本出願はまた、これらの核酸配列に対するバリアントを含む。例えば、バリアントは、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本出願の抗ＬＡＢ構築物又は抗ＬＡＢ抗体部分をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、本発明の核酸が挿入されたベクターを提供する。
簡単に言えば、抗ＬＡＢ構築物（例えば、抗ＬＡＢ ＣＡＲ）又はそのポリペプチド部分の、抗ＬＡＢ構築物又はそのポリペプチド部分をコードする天然又は合成核酸による発現は、核酸が、例えばプロモーター（例えば、リンパ球特異的プロモーター）及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む５’及び３’調節エレメントに作動可能に連結されるように、核酸を適切な発現ベクターに挿入することによって達成することができる。ベクターは、真核生物の宿主細胞における複製及び組込みに適したものとすることができる。典型的なクローニング及び発現ベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含む。
本発明の核酸はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化及び遺伝子治療に使用され得る。遺伝子送達の方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照のこと。
これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様では、本発明は遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸は、多くの種類のベクター中にクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ又は複数の選択可能なマーカーを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号；及び米国特許第６，３２６，１９３号を参照）。
哺乳類細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスに基づくシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野で公知の技術を使用して、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスを単離して、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが当技術分野で知られている。いくつかの実施態様では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのレトロウイルスシステムが当技術分野で知られている。いくつかの実施態様では、レンチウイルスベクターが使用される。レンチウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定した組み込みと娘細胞での増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりも付加的な利点を有する。それらはまた、免疫原性が低いという付加的な利点を有する。
追加のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置しているが、最近、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であるため、エレメントが互いに反転又は移動したときでもプロモーター機能は維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐの間隔に増やすことができる。
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列も使用することができ、これには、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどが含まれる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として考慮される。誘導性プロモーターの使用は、ポリヌクレオチド配列の発現が望まれるときにそれが作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現が望まれないときにその発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる。
ポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させようとする細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含むことができる。他の態様では、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ断片上に運ばれ、コトランスフェクション手順において使用され得る。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方に、適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞における発現を可能にすることができる。有用な選択可能なマーカーには、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物若しくは組織に存在しないか、又は発現されず、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、適当な時期にアッセイされる。適当なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ui-Tel et al., FEBS Letters, 479, 2000）。適切な発現システムはよく知られており、既知の技術を使用して調製するか、又は商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の発現の最高レベルを示す最小の５’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域がレポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動型転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターとの関連で、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に、当技術分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照。いくつかの実施態様では、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクションによって行われる。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を、哺乳動物、例えばヒト細胞に挿入するために最も広く使用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス１、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号；同第５，５８５，３６２号を参照。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系が含まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞への核酸の導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）のために脂質製剤の使用が意図される。別の態様では、核酸は脂質と結合していてもよい。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と結合した連結分子を介してリポソームに付着され、リポソーム内に捕捉され、リポソームと複合体形成され、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁物として含有され、ミセルと含有され又は複合体形成され、あるいは他の方法で脂質と結合されてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは二層構造中に、ミセルとして、又は「崩れた」構造で存在し得る。またそれらは、単に溶液中に散在しているだけで、大きさや形状が均一でない凝集体を形成している可能性もある。脂質は、天然に存在する脂質又は合成脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質に自然に存在する脂肪滴、並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素、及びそれらの誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
宿主細胞に外因性核酸を導入するか、さもなければ細胞を本発明の阻害剤に曝露させるのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザンブロット法及びノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法及びＰＣＲ法などの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって、又は本発明の範囲内に入る物質を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって、特定のペプチドの存在又は非存在を検出するような「生化学的」アッセイが含まれる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＬＡＢ構築物をその表面上に提示するエフェクター細胞（Ｔ細胞など）が提供される。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞（Ｔ細胞など）は、本明細書に記載の抗ＬＡＢ ＣＡＲポリペプチドをその表面上に含む。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、本明細書に記載の抗ＬＡＢ ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、核酸から発現される抗ＬＡＢ ＣＡＲポリペプチド、又はその一部がエフェクター細胞の表面上に局在している。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞（Ｔ細胞など）は、本明細書に記載の抗ＬＡＢ ＴＣＲポリペプチドをその表面上に含む。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、本明細書に記載の抗ＬＡＢ ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、核酸から発現される抗ＬＡＢ ＴＣＲポリペプチド、又はその一部がエフェクター細胞の表面上に局在している。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞（Ｔ細胞など）は、その表面上に、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、本明細書に記載のポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、本明細書に記載の二重特異性抗体、ポリペプチドなどの多重特異性抗体をコードする核酸を含み、ここで、核酸から発現される二重特異性抗体、ポリペプチド、又はその一部などの多重特異性抗体は、エフェクター細胞の表面上に局在している。
本発明に有用な例示的なエフェクター細胞には、限定されないが、樹状細胞（未熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を含む）、Ｔリンパ球（ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、記憶Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、及びリンホカイン（ｌｙｐｈｏｋｉｎｅ）活性化キラー（ＬＡＫ）細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、並びにそれらの組み合わせが含まれる。エフェクター細胞の亜集団は、当技術分野で知られている１つ又は複数の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３など）の存在又は非存在によって定義することができる。
いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、操作された哺乳動物エフェクター細胞などの操作されたエフェクター細胞である。薬学的組成物が複数の操作された哺乳動物エフェクター細胞を含む場合、操作された哺乳動物エフェクター細胞は、エフェクター細胞型の特定の亜集団、エフェクター細胞型の亜集団の組み合わせ、又は２つ以上のエフェクター細胞型の組み合わせであり得る。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、均質な細胞集団中に存在する。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、エフェクター細胞中で増強される不均一な細胞集団中に存在する。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はリンパ球である。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はリンパ球ではない。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞は養子免疫療法に適している。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はＰＢＭＣである。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞は、ＰＢＭＣに由来するエフェクター細胞である。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はＴ細胞である。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はＢ細胞である。いくつかの実施態様では、操作された哺乳動物細胞はＮＫ細胞である。
いくつかの実施態様では、エフェクター細胞はＴ細胞である。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びサプレッサーＴ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、キメラ受容体ポリペプチドが由来する内因性ＴＣＲサブユニットの一方又は両方の発現を遮断又は減少させるように改変されている。遺伝子発現を破壊するための細胞の改変には、例えばＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ又はＴＡＬＥＮベースの遺伝子ノックアウト）などを含む、当技術分野で公知の任意のそのような技術が含まれる。
抗ＬＡＢ抗体部分及びその構築物を作製する方法
一態様における本出願は、抗ＬＡＢ抗体部分及びその構築物を作製する方法を提供する。
モノクローナル抗体
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分又はその構築物は、モノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256, 1975 and Sergeeva et al., Blood, 117(16):4262-4272によって記載されるようなハイブリドーマ法を使用して、本明細書及び以下の実施例に記載のファージディスプレイ法を使用して、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を使用して、調製することができる。
ハイブリドーマ法では、ハムスター、マウス、又は他の適当な宿主動物を、典型的には、免疫剤で免疫し、免疫剤に特異的に結合するであろう抗体を産生するか又は産生する能力のあるリンパ球を誘発する。代わりに、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化することができる。免疫剤は、目的のタンパク質のポリペプチド若しくは融合タンパク質、又は少なくとも２つの分子を含む複合体を含み得る。一般に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）は、ヒト起源の細胞が望まれる場合に使用され、又は脾臓細胞若しくはリンパ節細胞は、ヒト以外の哺乳動物起源が望まれる場合に使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986)を参照。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常は、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない不死化細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含む適切な培地中で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠損する場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含むであろう。
いくつかの実施態様では、不死化細胞株は効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性である。いくつかの実施態様では、不死化細胞株は、マウス骨髄腫株であり、これは、例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ及びバージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手することができる。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている。Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)； Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63。
ハイブリドーマ細胞を培養した培地は、次に、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定することができる。このような技術及びアッセイは、当技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限定希釈手順によりクローンをサブクローン化し、標準的方法により増殖させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ、上記。この目的に適した培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。代わりに、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腹水としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地又は腹水から単離又は精製することができる。
抗ＬＡＢ抗体部分はまた、所望の活性又は複数の活性を有する抗体についてのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)において総説され、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immunol. Methods284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされ、ファージライブラリー中でランダムに組換えられ、次いで、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代わりに、ナイーブレパートリーは、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)によって記載されているように、いかなる免疫化も伴わずに、広範囲の非自己及びまた自己抗原に対しても単一の抗体起源を提供するために（例えば、ヒトから）クローニングすることができる。最後に、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号及び同第２００９／０００２３６０号を含む。
抗体又はその抗原結合断片は、ラビリンチン又はその一部に特異的な抗体についてライブラリーをスクリーニングするために、ファージディスプレイを使用して調製することができる。ライブラリーは、少なくとも１×１０９（少なくとも１ｘ１０９、２．５ｘ１０９、５ｘ１０９、７．５ｘ１０９、１ｘ１０１０、２．５ｘ１０１０、５ｘ１０１０、７．５ｘ１０１０、又は１ｘ１０１１のいずれかなど）の固有のヒト抗体断片の多様性を有するヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーであり得る。いくつかの実施態様では、ライブラリーは、全てのヒト重鎖及び軽鎖サブファミリーを包含する、健康なドナー由来のヒトＰＭＢＣ及び脾臓から抽出されたＤＮＡから構築されたナイーブなヒトライブラリーである。いくつかの実施態様では、ライブラリーは、自己免疫疾患を有する患者、がん患者、及び感染症を有する患者など、様々な疾患を有する患者から単離されたＰＢＭＣから抽出されたＤＮＡから構築されたナイーブなヒトライブラリーである。いくつかの実施態様では、ライブラリーは半合成ヒトライブラリーであり、ここで、重鎖ＣＤＲ３は完全にランダム化されており、全てのアミノ酸（システインを除く）が任意の所与の位置に等しく存在する可能性が高い（例えば、Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005を参照）。いくつかの実施態様では、半合成ヒトライブラリーの重鎖ＣＤＲ３は、約５～約２４（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４のいずれかなど）アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施態様では、ライブラリーは、非ヒトファージディスプレイライブラリーである。
ラビリンチン又はその一部に高い親和性で結合するファージクローンは、固体支持体（例えば、溶液パンニング用のビーズ又は細胞パンニング用の哺乳動物細胞など）に結合しているラビリンチンにファージを反復的に結合させ、その後、結合していないファージを除去し、特異的に結合したファージを溶出することによって選択することができる。溶液パンニングの一例では、ラビリンチンをビオチン化して固体支持体に固定することができる。ビオチン化ラビリンチンは、ファージライブラリー及びストレプトアビジンコンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０のような固体支持体と混合され、次いで、ラビリンチン－ファージ－ビーズ複合体が単離される。次に、結合したファージクローンを溶出し、発現及び精製のために、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅのような適切な宿主細胞に感染させるために使用する。パニングは、ラビリンチンに特異的に結合するファージクローンを濃縮するために、溶液パニング、細胞パニング、又は両方の組み合わせを使用して、複数（約２、３、４、５、６又はそれ以上のいずれかなど）ラウンドで行うことができる。濃縮ファージクローンは、例えばＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳを含む、当技術分野で公知の任意の方法によって、ラビリンチンへの特異的結合について試験することができる。
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定することができる。上記のハイブリドーマ細胞又は本発明のラビリンチン特異的ファージクローンは、そのようなＤＮＡの供給源としての役割を果たすことができる。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に配置され、次いでこれが、免疫グロブリンタンパク質を他の方法では産生しない宿主細胞中に、例えば、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン及び／又はフレームワーク領域のコード配列を、相同的な非ヒト配列の代わりに置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、上記）、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって修飾することもできる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換することができ、また、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換することができ、キメラの二価抗体を生成することができる。
抗体は、一価抗体であり得る。一価抗体を調製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、１つの方法には、免疫グロブリン軽鎖及び改変された重鎖の組換え発現が含まれる。重鎖は、重鎖の架橋を防ぐために、一般に、Ｆｃ領域の任意の点で切断されている。あるいは、関連するシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されるか、又は架橋を防ぐために欠失される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、一価の抗体の調製にも適している。その断片、特にＦａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して達成することができる。
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。この融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。いくつかの実施態様では、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合物、及び必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照のこと。
ヒト及びヒト化抗体
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分又はその構築物は、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又は抗体の他の抗原結合サブ配列など）であり、これは典型的には非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。ヒト化抗体には、レシピエントのＣＤＲからの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列においても見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができ、ここで、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。例えば、Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照。
一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。こうした非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。いくつかの実施態様によれば、ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）に従い、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって本質的に実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基で置換されているヒト抗体である。
ヒト化の代替法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生されるであろう。例えば、Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５，８０６号、５，５６９，８２５号、５，５９１，６６９号、５，５４５，８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照。別法として、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。チャレンジすると、遺伝子の再配列、組み立て、抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトに見られるものと非常によく似たヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；及び５，６６１，０１６号、及びMarks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)に記載されている。
ヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞によって（米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号参照）、又はファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野で公知の様々な技術を使用することによって生成され得る。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。Ｃｏｌｅら、及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)。
多重特異性抗体
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ抗体部分又はその構築物は、多重特異性抗体を含む。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を作製するための適切な方法は、当技術分野で周知である。例えば、二重特異性抗体の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づくことができ、ここで、２つの対はそれぞれ異なる特異性を有し、会合するとヘテロ二量体抗体を生じる（例えば、 Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)；国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)を参照）。免疫グロブリン重鎖と軽鎖のランダムな組み合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正確な分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる。同様の手順は、国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker et al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。別法として、重鎖及び軽鎖の組み合せは、種制限対合（例えば、Lindhofer et al., J. Immunol., 155:219-225 (1995)を参照）を利用することによって導くことができ、重鎖の対合は、ＣＨ３ドメインの「ノブイントゥホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号； Ridgway et al., Protein Eng., 9(7):617-621 (1996)を参照）の使用によって導くことができる。多重特異性抗体は、抗体のＦｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することによっても作製することができる（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号（Ａ１）を参照）。さらに別の方法では、安定な二重特異性抗体は制御されたＦａｂアーム交換によって生成することができる。この方法では、ＣＨ３ドメインに異なる抗原特異性と一致した点突然変異を有する２つの親抗体が還元条件で混合され、分離、再構築、及び再酸化させ、高純度の二重特異性抗体を形成する。Labrigin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 110(13):5145-5150 (2013)。重鎖／軽鎖対の混合物を含むこのような抗体は、本明細書では「ヘテロ多量体抗体」とも呼ばれる。
異なる特異性を有する抗体又はその抗原結合断片は、化学的に架橋されて多重特異性ヘテロコンジュゲート抗体を生成することもできる。例えば、それぞれが異なる抗原に特異性を有する２つのＦ（ａｂ ’）２分子を、化学的に連結することができる。Pullarkat et al., Trends Biotechnol., 48:9-21 (1999)。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案されている。国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００３７３号；ＥＰ０３０８９。抗体は、架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学における公知の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することができると考えられる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、又はチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に適している試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル－４－メルカプトブチリミデート、並びに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが挙げられる。
いくつかの実施態様では、多重特異性抗体は、組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。例えば、二重特異性抗体は、ペプチドリンカーを介して２つのｓｃＦｖを融合することによってなど、２つのｓｃＦｖを融合することによって操作することができ、タンデムｓｃＦｖを得る。タンデムｓｃＦｖの一例は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などの標的細胞の表面抗原に特異的なｓｃＦｖに連結することによって作られ、Ｔ細胞の標的細胞へのリダイレクトをもたらす。Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025 (1995); Brischwein et al., Mol. Immunol., 43(8):1129-1143 (2006)。２つの可変ドメイン間のペプチドリンカーの長さを短くすることにより、それらは自己集合を妨げられ、第２のポリペプチド上のドメインと対合することを余儀なくされ、ダイアボディ（Ｄｂ）と呼ばれるコンパクトな二重特異性抗体を生じることができる。Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448 (1993)。Ｄｂの２つのポリペプチドはそれぞれ、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによってＶＬに接続されたＶＨを含む。したがって、１つのポリペプチドのＶＨ及びＶＬドメインは、別のポリペプチドの相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対になることを余儀なくされ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。このフォーマットの改変では、２つのポリペプチドが別のペプチドリンカーによって連結され、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）が生じる。Ｄｂフォーマットのさらに別の改変では、各ポリペプチドのＣ末端のシステイン残基間にジスルフィド結合を導入することにより、必要に応じて所望のヘテロ二量体構造の集合を駆動するＣ末端システイン残基の前にドメインを含めることにより、二重親和性リターゲティング（ＤＡＲＴ）二重特異性抗体を生成することができる。Veri et al., Arthritis Rheum., 62(7):1933-1943 (2010)。２つのモノクローナル抗体の標的結合可変ドメインが天然に存在するリンカーを介して組み合わされて四価の二重特異性抗体を生成する二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－ＩｇＴＭ）も当技術分野で公知である。Gu and Ghayur, Methods Enzymol., 502:25-41 (2012)。さらに別のフォーマットであるドックアンドロック（ＤＮＬ）では、ヒトｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節サブユニットに由来するペプチド（ＤＤＤ２）と、ヒトＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメインに由来するペプチド（ＡＤ２）との二量体化を利用して、二重特異性抗体が調製される。Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 103:6841-6846 (2006)。
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体断片を作製及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が作製されている。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。この方法は、抗体ホモ二量体の作製にも利用することができる。
抗ＬＡＢ抗体部分バリアント
いくつかの実施態様では、本明細書で提供される抗体部分のアミノ酸配列変異体が意図される。例えば、抗体部分の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体部分のアミノ酸配列変異体は、抗体部分をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変には、例えば、抗体部分のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合性を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合せを最終構築物に到達させることができる。
いくつかの実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体部分バリアントが提供される。置換突然変異誘発の対象部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。アミノ酸置換を目的の抗体部分に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。
保存的置換を以下の表４に示す。
Figure 2022517329000005
アミノ酸は共通の側鎖の性質によって異なるクラスに分類され得る：
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
ｂ．中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
ｅ．鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
ｆ．芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。
例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、例えば、ファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＣＤＲ残基を変異させ、バリアント抗体部分がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。ＨＶＲにおいて、例えば、抗体部分親和性を改善するために、改変（例えば、置換）を行ってもよい。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程の間に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）及び／又は特異性決定残基（ＳＤＲ）で行われ、結果として生じる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し、再選択することによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。
親和性成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、様々な方法（例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次に、所望の親和性を有する任意の抗体部分バリアントを同定するために、ライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入するもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化するＨＶＲ指向アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを用いて特異的に同定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３とＣＤＲ－Ｌ３が標的となることが多い。
いくつかの実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗体部分の抗原結合能を実質的に低下させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）がＨＶＲにおいてなされ得る。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側にあってもよい。上記で提供されるバリアントＶＨ及びＶＬ配列のいくつかの実施態様において、各ＨＶＲは変化していないか、又はわずか１個、２個若しくは３個のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
突然変異誘発の標的となり得る抗体部分の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体部分と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを判定する。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置にさらなる置換を導入することができる。代わりに、又は追加的に、抗原－抗体部分複合体の結晶構造を決定して、抗体部分と抗原との間の接触点を同定することができる。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的化又は除去され得る。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうか判定することができる。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体部分が挙げられる。抗体部分の他の挿入バリアントには、抗体部分の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）又はポリペプチドに対する抗体部分のＮ末端又はＣ末端への融合物が含まれる。
Ｆｃ領域バリアント
いくつかの実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾が、本明細書で提供される完全長抗ＬＡＢ抗体部分のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域バリアントを生成することができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域バリアントは、しばしばＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関連して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を増強している。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域バリアントは、ＡＤＣＣエフェクター機能を減少させている。エフェクター機能を変化させ得るＦｃ配列への変化又は突然変異の多くの例がある。例えば、国際公開第００／４２０７２号及びShields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)は、ＦｃＲへの結合が改善又は減少した抗体バリアントを記載している。それらの出版物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、腫瘍細胞に対する治療用抗体の作用機序である。ＡＤＣＣは細胞性免疫防御であり、免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原が特定の抗体（例えば抗ＬＡＢ抗体）に結合している標的細胞（例：癌細胞）を積極的に溶解する。典型的なＡＤＣＣは、抗体によるＮＫ細胞の活性化を伴う。ＮＫ細胞はＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する。この受容体は、標的細胞の表面に結合した抗体のＦｃ部分を認識し、それに結合する。ＮＫ細胞の表面上の最も一般的なＦｃ受容体は、ＣＤ１６又はＦｃγＲＩＩＩと呼ばれる。Ｆｃ受容体が抗体のＦｃ領域に結合すると、ＮＫ細胞が活性化され、細胞溶解性顆粒が放出され、その結果、標的細胞のアポトーシスが起こる。腫瘍細胞の死滅に対するＡＤＣＣの寄与は、高親和性ＦｃＲでトランスフェクトされたＮＫ－９２細胞を使用する特異的試験で測定することができる。結果を、ＦｃＲを発現しない野生型ＮＫ－９２細胞と比較する。
いくつかの実施態様では、本発明は、全てではないが一部のエフェクター機能を有するＦＣ領域を含む抗ＬＡＢ構築体バリアントを意図し、それは、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＬＡＢ構築体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣなど）が不必要又は有害である適用のための望ましい候補となる。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／喪失を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがってＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’ Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第５，８２１，３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記載されている。代わりに、非放射性アッセイ法を採用してもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６ＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりに、又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばClynes et al. Proc. Nat’ Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されたような動物モデルにおいて評価することができる。抗体がＣ１ｑに結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の測定は、当技術分野で公知の方法を用いて実施することもできる（例えば、Petkova, S. B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上の置換を伴うものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ突然変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体が含まれ、これには残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を伴う、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
いくつかの実施態様では、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域を含む抗ＬＡＢ構築物（例えば、完全長抗ＬＡＢ抗体）バリアントが提供される。いくつかの実施態様では、バリアントＦｃ領域は、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、ここで、該置換はバリアントＦｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４（残基のＥＵ番号付け）においてである。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物（例えば、完全長抗ＬＡＢ抗体）変異体は、そのバリアントＦｃ領域に以下のアミノ酸置換を含む：Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａ。
いくつかの実施態様では、例えば米国特許６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. 、J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載されているように、改変された（すなわち改善されたか又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす改変がＦｃ領域においてなされる。
いくつかの実施態様では、半減期を増加させる、且つ／又は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を改善する１つ又は複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域を含む抗ＬＡＢ構築物（例えば、完全長抗ＬＡＢ抗体）バリアントが提供される。半減期が増加しＦｃＲｎへの結合が改善された抗体については、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ａ１）（Ｈｉｎｔｏｎら）に記述されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ又は複数における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。
Ｆｃ領域バリアントのその他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature322:73840 (1988)、米国特許第５６４８２６０号、米国特許第５６２４８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
本明細書に記載のＦｃバリアントのいずれか、又はそれらの組み合わせを含む抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）が意図される。
グリコシル化バリアント
いくつかの実施態様では、本明細書に提供される抗ＬＡＢ構築物は、抗ＬＡＢ構築物がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。抗ＬＡＢ構築物へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作成又は除去されるように、抗ＬＡＢ構築物又はそのポリペプチド部分のアミノ酸配列を改変することによって簡便に達成され得る。
抗ＬＡＢ構築物がＦｃ領域を含む場合には、それに付着している炭水化物を改変してもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ－結合によって一般的に付着している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含み得る。いくつかの実施態様では、本発明の抗ＬＡＢ構築物中のオリゴ糖の改変は、特定の改善された特性を有する抗ＬＡＢ構築物バリアントを作製するために行われ得る。
Ｆｃ領域に付着した炭水化物構造がフコースを減少させているか、又はフコースを欠いており、それがＡＤＣＣ機能を改善し得るＦｃ領域を含む抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）バリアントが提供される。具体的には、ここでは、野生型ＣＨＯ細胞において産生された同じ抗ＬＡＢ構築物上のフコースの量に対してフコースを減少させた抗ＬＡＢ構築物が考えられる。すなわち、それらは、天然のＣＨＯ細胞（例えば、天然のＦＵＴ８遺伝子を含むＣＨＯ細胞など、天然のグリコシル化パターンを産生するＣＨＯ細胞）によって産生された場合に、そうでない場合よりも少ない量のフコースを有することを特徴とする。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、そのＮ結合型グリカンのうちの約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％未満がフコースを含むものである。例えば、このような抗ＬＡＢ構築物中のフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であり得る。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、そのＮ結合型グリカンのいずれもフコースを含まないもの、すなわち、抗ＬＡＢ構築物が完全にフコースを含まないか、又はフコースを有さないか、又はアフコシル化されるものである。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定されるＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造（複合体、ハイブリッド、高マンノース構造など）の合計に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指すが、抗体のわずかな配列変異のために、Ａｓｎ２９７は位置２９７の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち、位置２９４と３００の間に位置してもよい。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)、Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)を含む。脱フコシル化抗体を産生できる細胞株の例は、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌの米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、及びＡｄａｍｓらの国際公開第２００４／０５６３１２号（特に実施例１１））及びノックアウト細胞株、例えばα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばYamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)、Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)、及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）バリアントは、二分されたオリゴ糖をさらに含み、例えば抗ＬＡＢ構築物のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている。そのような抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）バリアントは、フコシル化が減少し、且つ／又はＡＤＣＣ機能が改善されている可能性がある。そのような抗体バリアントの例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）、及びFerrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851861 (2006)に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）バリアントも提供される。このような抗ＬＡＢ構築物バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域を含む抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）バリアントは、ＦｃγＲＩＩＩに結合することができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域を含む抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）バリアントは、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ活性を有するか、又はヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む他の点では同じ抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）と比較して、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ活性が増加している。
システイン操作バリアント
いくつかの実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗ＬＡＢ構築物（完全長抗ＬＡＢ抗体など）を作製することが望ましい場合がある。いくつかの実施態様では、置換残基は、抗ＬＡＢ構築物の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれによって抗ＬＡＢ構築物の接近可能な部位に配置され、本明細書でさらに記載されるように、抗ＬＡＢ構築物を薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートを作製するために使用することができる。システイン操作抗ＬＡＢ構築物（完全長の抗ＬＡＢ抗体など）は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成され得る。
誘導体
いくつかの実施態様では、本明細書に提供される抗ＬＡＢ構築物は、当技術分野で公知であり、かつ容易に入手できる追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに改変されてもよい。抗ＬＡＢ構築物の誘導体化に適した部分は、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例として、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体）及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため製造に利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量であり得、分枝状又は非分枝状であり得る。抗ＬＡＢ構築物に付着するポリマーの数は変化してよく、複数のポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、改善されるべき抗ＬＡＢ構築物の特定の特性又は機能、抗ＬＡＢ構築物誘導体が規定された条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物と、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。いくつかの実施態様では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線は任意の波長であってよく、限定されないが、通常の細胞に害を及ぼさないが、抗ＬＡＢ構築物－非タンパク質性部分の近位の細胞が死滅する温度に非タンパク質性部分を加熱する波長を含む。
抗ＬＡＢ ＣＡＲ、抗ＬＡＢ ＴＣＲ、及び抗ＬＡＢ二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
一態様における本出願は抗ＬＡＢ構築物を提供し、ここで抗ＬＡＢ構築物は、例えば、抗ＬＡＢ ＣＡＲ、抗ＬＡＢ ＴＣＲ、又は抗ＬＡＢ二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。そのような抗ＬＡＢ構築物を作製するための方法は当技術分野で公知であり、例えば上記のセクションに記載されている。
エフェクター細胞の調製
一態様における本発明は、例えば、抗ＬＡＢ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞（例えば、リンパ球、例えば、Ｔ細胞）を提供する。抗ＬＡＢ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞（Ｔ細胞など）（抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞などの抗ＬＡＢ ＣＡＲエフェクター細胞）を調製する例示的な方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）は、抗ＬＡＢ ＣＡＲ（例えば、抗ＬＡＢ抗体部分とＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列とを含むＣＡＲ）を含むベクター（例えば、レンチウイルスベクターを含む）をエフェクター細胞（Ｔ細胞など）に導入することによって生成され得る。いくつかの実施態様では、本発明の抗ＬＡＢ ＣＡＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製することができ、その結果、ラビリンチン陽性疾患（がん、例えば腺癌など）の持続的な制御につながり得る長期持続性をもたらす。
いくつかの実施態様では、本発明は、リンパ球注入を使用して、ラビリンチン陽性疾患を有する患者又はラビリンチン陽性疾患を有するリスクのある患者の治療のために、抗ＬＡＢ ＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞を投与することに関する。いくつかの実施態様では、自己リンパ球注入が、治療において使用される。自己ＰＢＭＣは治療を必要とする患者から収集され、Ｔ細胞は本明細書に記載され、当技術分野で知られている方法を使用して活性化及び増殖され、次いで患者に注入されて戻される。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＬＡＢ抗体部分を含む抗ＬＡＢ ＣＡＲを発現する（本明細書では「抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞」とも呼ばれる）。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＬＡＢ抗体部分を含む細胞外ドメインと、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインとを含む抗ＬＡＢ ＣＡＲを発現する。本発明の抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は、強力なｉｎ ｖｉｖｏＴ細胞増殖を受けることができ、血液及び骨髄中で長期間、高レベルで持続するラビリンチン特異的記憶細胞を確立することができる。いくつかの実施態様では、患者に注入された本発明の抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ラビリンチン陽性疾患を有する患者において、ｉｎ ｖｉｖｏで、ラビリンチン提示がん細胞などのラビリンチン提示細胞を除去することができる。いくつかの実施態様では、患者に注入された本発明の抗ＬＡＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも１つの従来の治療に抵抗性であるラビリンチン陽性疾患を有する患者において、ｉｎ ｖｉｖｏでラビリンチン提示がん細胞などのラビリンチン提示細胞を除去することができる。
Ｔ細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。本発明のいくつかの実施態様では、当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞系を使用することができる。本発明のいくつかの態様において、Ｔ細胞は、フィコールＴＭ分離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物には、通常、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板が含まれる。いくつかの実施態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿分画を除去し、次の処理工程のために細胞を適切な緩衝液又は培地中に配置するために洗浄され得る。いくつかの実施態様では、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施態様では、洗浄液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠くこともあれば、全てではないにしても多くの二価陽イオンを欠くこともある。当業者が容易に理解するように、洗浄工程は、製造業者の指示に従って半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１セルプロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することなど、当業者に公知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞を、Ｃａ２＋－フリー、Ｍｇ２＋－フリーＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、又は緩衝液を含むか含まない他の生理食塩水溶液など、様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁してもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。
いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることにより、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配による遠心分離又は対向流遠心溶出によって末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団は、正又は負の選択技術によってさらに単離することができる。例えば、いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の正の選択に十分な時間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって単離される。いくつかの実施態様では、期間は約３０分である。いくつかの実施態様では、期間は３０分～３６時間又はそれ以上であって、その間に存在する全ての整数値の範囲である。いくつかの実施態様では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、又は６時間である。いくつかの実施態様では、期間は１０～２４時間である。いくつかの実施態様では、インキュベーション期間は２４時間である。白血病患者からＴ細胞を単離するためには、２４時間など、より長いインキュベーション時間を使用すると、細胞収量を増加させることができる。腫瘍組織から又は免疫力が低下した個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合など、他の細胞型と比較してＴ細胞がほとんどない任意の状況では、Ｔ細胞を単離するために、より長いインキュベーション時間を用いることができる。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させることができる。したがって、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合できる時間を単に短縮又は延長することによって、及び／又はＴ細胞に対するビーズの比を増加若しくは減少させることによって、Ｔ細胞の亜集団を培養開始時又はその過程の間の他の時点に対して優先的に選択することができる。さらに、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比率を増加又は減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を培養開始時又は他の所望の時点に対して優先的に選択することができる。当業者は、本発明の文脈において、複数ラウンドの選択も使用することができることを認識するであろう。いくつかの実施態様では、選択手順を実施し、活性化及び増殖プロセスにおいて「非選択」細胞を使用することが望ましい場合がある。「非選択」細胞も、選択のさらなるラウンドに供することができる。
負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせで達成することができる。１つの方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体が含まれる。いくつかの実施態様では、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を典型的に発現する制御性Ｔ細胞について濃縮するか、又は正に選択することが望ましい場合がある。あるいは、いくつかの実施態様では、Ｔ制御性細胞は抗ＣＤ２５結合ビーズ又は他の同様な選択方法によって枯渇される。
正又は負の選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズのような粒子）の濃度を変化させることができる。いくつかの実施態様では、細胞とビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施態様では、約２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施態様では、約１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施態様では、約１億細胞／ｍｌを超えるものが使用される。いくつかの実施態様では、約１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、又は５０００万細胞／ｍｌのいずれかの濃度の細胞が使用される。いくつかの実施態様では、約７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、又は１億細胞／ｍｌのいずれかの濃度の細胞が使用される。いくつかの実施態様では、約１億２５００万又は約１億５０００万細胞／ｍｌの濃度が使用される。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化、及び細胞増殖の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現する可能性のある細胞、又は多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕捉を可能にする。このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、得られることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞を使用すると、通常はＣＤ２８の発現が弱いＣＤ８＋ Ｔ細胞をより効率的に選択することができる。
本発明のいくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、治療後に患者から直接得られる。この点に関して、特定のがん治療、特に免疫系を損傷する薬物による治療の後、患者が通常治療から回復している期間中の治療直後に、得られたＴ細胞の品質が、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖する能力に対して最適であり得るか、又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用したｅｘ ｖｉｖｏ操作に続いて、これらの細胞は、増強された生着及びｉｎ ｖｉｖｏ増殖のための好ましい状態にあり得る。したがって、この回復期の間に、Ｔ細胞、樹状細胞、又は造血系列の他の細胞を含む血液細胞を収集することが、本発明の文脈内で意図される。さらに、いくつかの実施態様では、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）及び移植前処置を使用して、特に治療後の規定された時間枠の間に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／又は増殖が好まれる状態を対象に作り出すことができる。
例示的な細胞型には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が含まれる。
望ましい抗ＬＡＢ ＣＡＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子改変の前後にかかわらず、Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；６，５３４，０５５号；６，９０５，６８０号；６，６９２，９６４号；５，８５８，３５８号；６，８８７，４６６号；６，９０５，６８１号；７，１４４，５７５号；７，０６７，３１８号；７，１７２，８６９号；７，２３２，５６６号；７，１７５，８４３号；５，８８３，２２３号；６，９０５，８７４号；６，７９７，５１４号；６，８６７，０４１号及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載された方法を使用して活性化され、増殖させることができる。
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドをそれに付着させた表面との接触によって増殖される。特に、Ｔ細胞集団は、例えば表面に固定化された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片、又は抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させる。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ブザンソン、フランス）が含まれ、当技術分野で一般に知られている他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。
イムノコンジュゲートの調製
抗ＬＡＢイムノコンジュゲートは、当技術分野で公知の任意の方法を用いて調製することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００９／０６７８００号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、及び米国特許出願公開第２０１４３２１２２９号を参照されたい。
抗ＬＡＢイムノコンジュゲートの抗ＬＡＢ抗体部分は、抗ＬＡＢ抗体部分がエフェクター分子に結合又は連結され得る任意の手段によってエフェクター分子に「付着」され得る。例えば、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートの抗ＬＡＢ抗体部分は、化学的又は組換え的手段によってエフェクター分子に付着され得る。融合体又はコンジュゲートを調製するための化学的手段は当技術分野で公知であり、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートを調製するために使用することができる。抗ＬＡＢ抗体部分及びエフェクター分子をコンジュゲートさせるために使用される方法は、標的細胞上の抗原に結合する結合タンパク質の能力を妨げることなく、結合タンパク質をエフェクター分子と結合させることが可能でなければならない。
抗ＬＡＢイムノコンジュゲートの抗ＬＡＢ抗体部分は、エフェクター分子に間接的に連結され得る。例えば、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートの抗ＬＡＢ抗体部分は、いくつかのタイプのうちの１つのエフェクター分子を含むリポソームに直接連結され得る。エフェクター分子及び／又は抗ＬＡＢ抗体部分もまた、固体表面に結合され得る。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートの抗ＬＡＢ抗体部分及びエフェクター分子は両方ともタンパク質であり、当技術分野で周知の技術を使用して結合させることができる。２つのタンパク質を結合できる数百の架橋剤が利用可能である。（例えば、“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking” 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arborを参照）。架橋剤は一般に、抗ＬＡＢ抗体部分及び／又はエフェクター分子に利用可能な又は挿入された反応性官能基に基づいて選択される。さらに、反応性基がない場合は、光活性化可能な架橋剤を使用することができる。特定の例において、抗ＬＡＢ抗体部分とエフェクター分子との間にスペーサーを含めることが望ましい場合がある。当技術分野で公知の架橋剤には、ホモ二官能性薬剤：グルタルアルデヒド、ジメチルアジピミデート及びビス（ジアゾベンジジン）並びにヘテロ二官能性薬剤：ｍマレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及びスルホ－ｍマレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドが含まれる。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢイムノコンジュゲートの抗ＬＡＢ抗体部分は、エフェクター分子の化学的付着のために特定の残基で操作され得る。当技術分野に公知の分子の化学的付着に使用される特定の残基には、リジン及びシステインが含まれる。架橋剤は、抗ＬＡＢ抗体部分上に挿入され、エフェクター分子上で利用可能な反応性官能基に基づいて選択される。
抗ＬＡＢイムノコンジュゲートは、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することもできる。このような場合、抗ＬＡＢ抗体部分をコードするＤＮＡ配列が、エフェクター分子をコードするＤＮＡ配列に融合され、キメラＤＮＡ分子をもたらす。このキメラＤＮＡ配列は、融合タンパク質を発現する宿主細胞にトランスフェクトされる。融合タンパク質は、細胞培養物から回収し、当技術分野で公知の技術を使用して精製することができる。
標識であるエフェクター分子を結合タンパク質に付着させる例としては、Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth.40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel and Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983)；及びColcher et al., “Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice”, Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986)に記載されている方法が挙げられる。
放射性標識又は他の標識は、公知の方法でイムノコンジュゲート中に取り込まれ得る。例えば、ペプチドは生合成され得るか、又は例えば水素の代わりにフッ素－１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成によって合成され得る。９９Ｔｃ又は１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１１１Ｉｎなどの標識は、ペプチドのシステイン残基を介して付着させることができる。イットリウム－９０はリジン残基を介して付着され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978)）を使用して、ヨウ素－１２３を取り込むことができる。「免疫シンチグラフィーにおけるモノクローナル抗体」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）では、その他の方法について詳細に記載されている。
抗体部分と細胞傷害性剤とのイムノコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデート ＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６－ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１、５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science238:1098 (1987)に記載されるように調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内で細胞傷害性剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本発明の抗ＬＡＢイムノコンジュゲートは、限定するものではないが、（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されている架橋剤：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエートを用いて調製したＡＤＣを明確に企図している。２００３－２００４ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇの４６７－４９８頁を参照。
薬学的組成物
また、本明細書では、抗ＬＡＢ構築物を含む組成物（薬学的組成物など、本明細書では製剤とも呼ばれる）が提供される。いくつかの実施態様では、組成物はさらに、抗ＬＡＢ構築物に関連する細胞（エフェクター細胞、例えばＴ細胞など）を含む。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの実施態様では、薬学的組成物はさらに、抗ＬＡＢ構築物に関連する細胞（エフェクター細胞、例えばＴ細胞など）を含む。
抗ＬＡＢ構築物の適切な製剤は、所望の純度を有する抗ＬＡＢ構築物を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で得られる。許容される、担体、賦形剤又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。例示的な製剤は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる国際公開第９８／５６４１８号に記載されている。皮下投与に適合した凍結乾燥製剤は、国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤で再構成されて高タンパク濃度にされてもよく、再構成された製剤は、本明細書で治療される個体に皮下投与されてもよい。リポフェクチン又はリポソームを使用して、本発明の抗ＬＡＢ構築物を細胞に送達することができる。
本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な抗ＬＡＢ構築物に加えて、１つ又は複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。例えば、抗ＬＡＢ構築物に加えて、抗腫瘍剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤又は化学療法剤をさらに提供することが望ましい場合がある。そのような分子は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗ＬＡＢ構築物の量、疾患又は障害又は治療の種類、及び上記の他の要因によって決まる。これらは一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又はこれまでに使用された投与量の約１から９９％で使用される。
また、抗ＬＡＢ構築物は、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中で、又はマクロエマルション中で、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入されてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。徐放性製剤が調製されてもよい。
抗ＬＡＢ構築物の徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の好適な例には、抗体（又はその断片）を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）のような分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン酢酸ビニルや乳酸－グリコール酸などのポリマーは１００日間以上分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い時間でタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が体内に長期間とどまると、３７℃で水分にさらされた結果として変性又は凝集し、生物活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機構に応じて、抗ＬＡＢ構築物の安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ－ジスルフィド交換による分子間Ｓ－Ｓ結合形成であることが分かれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化を達成することができる。
いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、クエン酸塩、ＮａＣｌ、酢酸塩、コハク酸塩、グリシン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、又は上記の任意の組み合わせを含む緩衝液中に製剤化される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、約１００ｍＭから約１５０ｍＭのグリシンを含む緩衝液中に製剤化される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、約５０ｍＭから約１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中に製剤化される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、約１０ｍＭから約５０ｍＭの酢酸塩を含む緩衝液中に製剤化される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、約１０ｍＭから約５０ｍＭのコハク酸塩を含む緩衝液中に製剤化される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、約０．００５％から約０．０２％のポリソルベート８０を含む緩衝液中に製剤化される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、約５．１から５．６の間のｐＨを有する緩衝液中に製剤化される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物は、１０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、及び０．０１％のポリソルベート８０を含む緩衝液中に製剤化され、ここで、製剤はｐＨ５．５である。ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
抗ＬＡＢ構築物を使用する方法
適用の抗ＬＡＢ構築物及び／又は組成物は、例えばがん（腺癌など）を含む疾患及び／又は障害を治療及び／又は予防するために、個体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することができる。いくつかの実施態様では、がんはラビリンチン陽性がんである。いくつかの実施態様では、がんは、ラビリンチン陽性腺癌のような腺癌である。したがって、本出願は、いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＬＡＢ構築物のいずれか１つなどの抗ＬＡＢ抗体部分を含む抗ＬＡＢ構築物を含む組成物（薬学的組成物など）の有効量を個体に投与することを含む、個体においてラビリンチン陽性疾患（がんなど）を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様では、組成物は、抗ＬＡＢ構築物（ＣＡＲなど）を発現する細胞（エフェクター細胞など）を含む。
例えば、いくつかの実施態様では、ラビリンチンに特異的に結合する抗ＬＡＢ抗体部分を含む抗ＬＡＢ構築物を含む組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体においてラビリンチン陽性疾患を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ構築物（例えば、本明細書に記載の抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲ）を発現するエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体においてラビリンチン陽性疾患を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様では、個体からのがん試料が、該試料中のがん性細胞の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％などの約１０％以上が、免疫組織化学（ＩＨＣ）技術を用いて決定されるようにラビリンチンに対して陽性であることを示す場合、該個体は治療のために選択される。いくつかの実施態様では、個体からのがん試料が、腫瘍の周辺部の細胞などの該試料中のがん性細胞の亜集団の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％などの約１０％以上が、免疫組織化学（ＩＨＣ）技術を用いて決定されるようにラビリンチンに対して陽性であることを示す場合、該個体は治療のために選択される。
いくつかの実施態様では、個体はヒトである。
個体（ヒトなど）に投与される抗ＬＡＢ構築物組成物の用量は、特定の組成物、投与様式、及び治療される疾患のタイプによって変化し得る。いくつかの実施態様では、組成物の量は、客観的応答（部分寛解や完全寛解など）をもたらすのに有効である。いくつかの実施態様では、組成物中の抗ＬＡＢ構築物（例えば、完全長抗ＬＡＢ抗体、多重特異性抗ＬＡＢ分子、又は抗ＬＡＢイムノコンジュゲート）の量は、例えば、約０．００１μｇから約１０００μｇの範囲に含まれる。上記態様のいずれかのいくつかの実施態様では、組成物中の抗ＬＡＢ構築物（例えば、完全長抗ＬＡＢ抗体、多重特異性抗ＬＡＢ分子、又は抗ＬＡＢイムノコンジュゲート）の有効量は、総体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。
抗ＬＡＢ構築物組成物は、様々な経路を介して個体（ヒトなど）に投与することができ、その経路には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、眼内、髄腔内、経粘膜、及び経皮が含まれる。いくつかの実施態様では、組成物の徐放性製剤を使用することができる。
本出願はまた、抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲを使用して、エフェクター細胞（免疫細胞、例えば、Ｔ細胞など）の特異性をラビリンチンを発現する細胞に向け直す方法を提供する。
したがって、本出願はまた、抗ＬＡＢ ＣＡＲ及び抗ＬＡＢ ＴＣＲを発現するエフェクター細胞（Ｔ細胞など）を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物においてラビリンチンを発現する標的細胞集団又は組織に対するエフェクター細胞媒介性応答（Ｔ細胞媒介性免疫応答など）を刺激する方法を提供する。
抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＣＡＲを発現する抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）は、それを必要とするレシピエントに注入することができる。注入された細胞はレシピエントのラビリンチン発現細胞を死滅させることができる。いくつかの実施態様では、抗体療法とは異なり、抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）はｉｎ ｖｉｖｏで複製することができ、持続的な腫瘍制御につながり得る長期持続をもたらす。
ｅｘ ｖｉｖｏ手順は当技術分野において周知であり、以下でより詳しく議論される。簡潔には、細胞は哺乳動物（好ましくはヒト）から単離され、本明細書に開示される抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲを発現するベクターを用いて遺伝子改変（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入又はトランスフェクト）される。抗ＬＡＢ ＣＡＲＴ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲＴ細胞は、治療的利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物のレシピエントはヒトであり得、抗ＬＡＢ ＣＡＲＴ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲＴ細胞は、レシピエントに関して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種異系、同系又は異種であり得る。
ｅｘ ｖｉｖｏ免疫化の観点から細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本出願はまた、患者において抗原に対して向けられた免疫応答を誘発するためのｉｎ ｖｉｖｏ免疫化のための組成物及び方法を提供する。
投与される本出願の抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度、及び状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。いくつかの実施態様では、抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）を含む薬学的組成物は、約１０４から約１０９細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与される。抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）組成物もまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用して投与することができる。特定の患者に対する最適な投与量及び治療レジメンは、疾患の徴候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定することができる。
抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、埋め込み又は移植を含む、任意の便利な方法で実施することができる。本明細書に記載の組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内に投与され得る。いくつかの実施態様では、本出願の抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与される。いくつかの実施態様では、本出願の抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）組成物は、静脈内注射によって投与される。抗ＬＡＢ ＣＡＲ又は抗ＬＡＢ ＴＣＲエフェクター細胞（Ｔ細胞など）の組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注射することができる。
本明細書に開示される方法は、本明細書に記載の抗ＬＡＢ構築物及び／又は組成物の複数の用量を一定期間にわたって個体に投与することを含み得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＬＡＢ構築物及び／又は組成物の投与頻度及び／又は投与量は、投与する医師の判断に基づいて、治療の過程にわたって調整される。
本明細書に開示される治療及び／又は予防のための方法は、個体におけるがんなどの増殖性疾患を治療又は予防するために有用である。いくつかの実施態様では、がんはラビリンチン陽性がんのようなラビリンチン発現がんである。いくつかの実施態様では、がんは腺癌である。いくつかの実施態様では、がんは、初期がん、非転移性がん、原発性がん、進行がん、局所進行がん、転移性がん、寛解中のがん、再発性がん、耐性がん、又は難治性がんである。いくつかの実施態様では、がんは、限局性の切除可能ながん（例えば、完全な外科的除去を可能にする臓器の一部に限定される腫瘍）、限局性の切除不能ながん（例えば、重要な血管構造のために切除不能である限局性腫瘍）、又は切除不能ながんである。いくつかの実施態様では、がんは、ＴＮＭ分類に従って、Ｉ期腫瘍、ＩＩ期腫瘍、ＩＩＩ期腫瘍、ＩＶ期腫瘍、Ｎ１腫瘍、又はＭ１腫瘍である。
本明細書に開示される方法は、個体におけるラビリンチン発現がんなどのがんを治療又は予防するために有用である。いくつかの実施態様では、個体は、以下の特徴の１つ又は複数を有する：（ｉ）インフォームドコンセントフォームを理解する能力と署名する意志；（ｉｉ）組織学的に確認された腺癌及び／又はラビリンチン発現がんを有する少なくとも１８歳；（ｉｉｉ）以前に少なくとも１回の全身療法（化学療法及び／又は生物学的療法）で治療され、治療中に反応がなかった／進行したか、全身療法の完了後に進行したか、又は他の全ての治療を拒否した；（ｉｖ）パラフィン包埋アーカイブ標本の免疫組織化学的評価スクリーニングによって決定して、腫瘍はラビリンチン抗原を過剰発現し、単一の参照病理医によるスコアリングに従って少なくとも２×バックグラウンドの強度で、＞１０％の悪性細胞が抗原の染色を示さなければならない；（ｖ）任意数の先の化学療法レジメン；（ｖｉ）一回目のワクチン注射前の共通リコール抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の文書化；（ｖｉｉ）カルノフスキー尺度で≧６０％のパフォーマンスステータス；（ｖｉｉｉ）治療時の平均余命が≧６か月；（ｉｘ）測定可能又は評価可能な疾患；（ｘ）一回目のワクチン注射前の４週間以内に得られた治療前の絶対顆粒球数（ＡＧＣ）≧１０００及び治療前の血小板数≧７５０００；（ｘｉ）≦１．５ｍｇ／ｄｌの治療前の血清クレアチニンが必要とされる；及び（ｘｉｉ）血清ビリルビン≦１．５及びＡＳＴ≦２．５×正常の施設上限（肝転移の場合は≦５Ｘ）。
当業者は、本出願の開示の範囲及び精神の範囲内で、いくつかの実施態様が可能であることを認識するであろう。本開示は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは範囲又は精神における開示を、ここに記載された特定の手順に限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１
この実施例は、抗ラビリンチン抗体（ＭＣＡ ４４－３Ａ６）に由来する機能性単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び抗原結合断片（Ｆａｂ）の開発及び試験を示す。
ＭＣＡ ４４‐３Ａ６の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ法に有用なオリゴプライマーでクローニングした。クローニングは、免疫グロブリンのデータベースに公開されている配列に基づいた。簡潔には、約５ｘ１０８個のハイブリドーマ細胞から調製したＲＮＡを、市販の試薬によるｃＤＮＡの調製のために使用した。ＶＨ及びＶＬの増幅されたｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅時に配置された部位を制限酵素で消化した。次いで、この遺伝子をファージディスプレイベクターにサブクローニングし、ライブラリー選択の目的でｓｃＦｖを構築した。
その後、ｓｃＦｖのライブラリーをサブクローニングした。各ｓｃＦＶについて、その配列を融合し、次の発現の際にその産物がＣ末端ｍｙｃタグを有するようにした。ファージライブラリーの選択のために、タンパク質抗原（ヒスチジンタグ付きラビリンチン）を９６ウェルプレート上に一晩固定化した。ライブラリーファージのアリコートを割り当てられたウェルに入れた。結合したファージを溶出させ、ＴＧ１培養液に加えて感染させ、ＫＯ７ヘルパーファージによって救出した。感染したＴＧ１細胞を増殖させ（３０℃で一晩）、細菌培養上清を回収し、沈殿させ、次の選択又はファージＥＬＩＳＡのためにＰＢＳに再懸濁した。
抗原調製のために、ラビリンチンの細胞外ドメインをクローニングし、ｐＧＥＸ‐２Ｔを使用してＧＳＴ融合蛋白質として発現させた。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して粗調製物を容易に調製し、アフィニティークロマトグラフィーによって純粋調製物を作製した。タンパク質の一部に負に帯電した酸性残基があるため、ラビリンチンは精製が進むにつれて強く凝集することが観察された。そこで、ヒスチジンタグ付きの修飾ラビリンチンタンパク質（非常に疎水性の高い最初の２２アミノ酸：リーダー様配列を除いたもの）を作製し、上記の抗原抗体スクリーニング手順（ファージディスプレイ）に使用した。ヒスチジンはラビリンチンの二次構造に大きな影響を及ぼすとは予想されていないが、このタンパク質の精製を取り巻く問題を考えると、ＭＣＡ ４４－３Ａ６の既知の結合部位を含むアミノ酸＃１０９～１３０に対応する代替のＫＬＨコンジュゲートペプチドも合成された。したがって、改変されたＨｉｓ－ラビリンチンがファージディスプレイ抗体選択において使用されたが、最適な抗体候補の選択を確実にするために、合成ペプチドもＢｉａｃｏｒｅ結合測定に含まれた。
ファージＥＬＩＳＡでは、Ｈｉｓ－ラビリンチンをＥＬＩＳＡプレートにコーティングした（４℃で一晩）。試験する各ファージのアリコートをそれぞれのウェルに加え（３７℃で３０～９０分間インキュベート）、ＰＢＳで十分に洗浄した。ファージ結合抗原は、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体とのインキュベーションによって検出された。
続いて、精製タンパク質ラビリンチン抗原（Ｈｉｓ－ラビリンチン及び合成ペプチド）を、Ｂｉａｃｏｒｅ測定のためにアミンカップリングによってＣＭ５チップに固定化した。精製した抗体リードバリアント（ファージライブラリーから選択）を様々な濃度でシステムに注入し、抗体－抗原相互作用の会合及び解離を評価した。抗体親和性測定は、製造業者のプロトコルに従ってＢｉａｃｏｒｅ１０００機器で実施された（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。異なるクローンについて測定された親和性が互いにどれだけ近いかに応じて、最終スクリーニング及び増殖のための上位３つの候補が保存され、最も高い親和性の候補がｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングを使用してさらに評価された。
図１Ａ及び図１Ｂに示すように、Ｈｉｓタグ付きラビリンチンを使用して、クローン化及び発現されたタンパク質（クローンＸ３７３ ｓｃＦｖ；図１Ｂ）及び親ＭＣＡ ４４－３Ａ６抗体（図１Ａ）の初期結合アッセイを実施した。Ｘ３７３ ｓｃＦＶは、親ＭＣＡ ４４－３Ａ６抗体よりも約４倍低い解離定数（Ｋｄ）を有することが測定された。具体的には、Ｘ３７３ｓｃＦｖのＫｄは４．８ｘ１０－７Ｍと測定され、ＭＣＡ４４－３Ａ６のＫｄは１．１７ｘ１０－７Ｍと測定された。
上記の開発戦略を改変して、Ｆａｂフォーマット用に追加のライブラリーが作成された。Ｆａｂ、Ｘ５０９Ｆａｂはスクリーニングによって同定され、続いて上記のＢｉａｃｏｒｅ法を使用して、Ｈｉｓ－ラビリンチン及びＫＬＨコンジュゲートラビリンチン由来ペプチドに対する親和性について評価した。Ｘ５０９Ｆａｂの親和性測定値を表５に報告する。
Figure 2022517329000006
続いてＸ５０９Ｆａｂを、腺癌細胞における天然ラビリンチンを認識する能力について試験した。Ａ５４９異種移植腫瘍切片の連続切片（～６μｍ厚）を使用して、ほぼ同一の環境下でＸ５０９Ｆａｂを親ＭＣＡ４４－３Ａ６抗体と比較した。続いて、標準ＡＢＣ法（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を使用して、１０μｇ／ｍｌの抗体（又は一次抗体なし）に曝露した組織切片を、適切な二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス又は抗ヒトＩｇＧ）及びＤＡＢで展開した。結果（図示せず）は、Ｘ５０９Ｆａｂが天然のラビリンチンに結合し、がん細胞上のエピトープ（ラビリンチン）を認識する能力において親抗体と少なくとも同等であることを実証した。
Ｘ５０９Ｆａｂの陽性細胞結合結果が、ラビリンチンの特異的認識を表すかどうかを判定するために、標準的なウエスタンイムノブロッティングを、ＷＩ３９正常ヒト線維芽細胞（陰性対照）及びＡ５４９肺腺癌細胞（陽性対照）溶解物を用いて実施した。ラビリンチンに対して期待されるサイズ（～４０ｋＤ）で明瞭なバンドが見られたが、陰性対照ではシグナルは得られなかった（図２）。ＭＣＡ ４４－３Ａ６を使用したこれまでの結果と同様に、かすかな低いバンド（分解生成物）と高いバンド（～８０ｋＤ）が認められ、ラビリンチンが自己凝集することを確認した（図２）。
Ｈｉｓ－ラビリンチン及びＫＬＨコンジュゲートラビリンチン由来ペプチドに対する抗ラビリンチン抗体（ＭＣＡ ４４－３Ａ６）由来のｓｃＦｖ及びＦａｂに対する親和性測定値の要約を表６に示す。
Figure 2022517329000007

Claims (32)

  1. ラビリンチン又はその一部に特異的に結合する抗体部分とエフェクタードメインとを含む単離された抗ラビリンチン構築物。
  2. 抗体部分がエフェクタードメインにコンジュゲートされている、請求項１に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  3. エフェクタードメインがエフェクター分子を含む、請求項２に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  4. エフェクター分子が治療剤を含む、請求項３に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  5. 治療剤が、薬物、毒素、放射性同位元素、タンパク質、ペプチド、及び核酸からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  6. 単離された抗ラビリンチン構築物が抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  7. エフェクタードメインが診断剤を含む、請求項３に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  8. 診断剤が標識である、請求項７に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  9. 抗体部分がエフェクタードメインに融合されている、請求項１に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  10. 単離された抗ラビリンチン構築物が、エフェクタードメインに融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、ここで、エフェクタードメインが、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項９に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  11. 単離された抗ラビリンチン構築物が、抗ＣＤ３抗体又はその断片に融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、請求項９に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  12. 単離された抗ラビリンチン構築物が、エフェクタードメインに融合された抗体部分を含む細胞外ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、ここで、エフェクタードメインが、ＴＣＲサブユニットの膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  13. 抗体部分が、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  14. 抗体部分が、約０．１ｐＭから約５００ｎＭのＫｄで、ラビリンチン又はその一部と結合する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  15. 抗体部分が、配列番号２～３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むラビリンチン由来ペプチドに特異的に結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  16. ラビリンチン由来ペプチドがＢ細胞エピトープを含む、請求項１５に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  17. ラビリンチン由来ペプチドがＴ細胞エピトープを含む、請求項１５又は１６に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  18. 抗体部分が多重特異性である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  19. 多重特異性抗体部分が、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重親和性リターゲティング（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、ノブ・イントゥー・ホール（ＫｉＨ）抗体、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）抗体、化学的に架橋された抗体、ヘテロ多量体抗体、又はヘテロコンジュゲート抗体である、請求項１８に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  20. 多重特異性抗体部分が、任意選択のペプチドリンカーによって連結された２つのｓｃＦｖを含むタンデムｓｃＦｖである、請求項１９に記載の単離された抗ラビリンチン構築物。
  21. 請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物を含む薬学的組成物。
  22. 請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物を発現する宿主細胞。
  23. 請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物のポリペプチド成分をコードする核酸。
  24. 請求項２３に記載の核酸を含むエフェクター細胞。
  25. エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項２４に記載のエフェクター細胞。
  26. ラビリンチン又はその一部をその表面上に提示する細胞を検出する方法であって、
    （ａ）細胞を、請求項８に記載の単離された抗ラビリンチン構築物と接触させること；及び
    （ｂ）細胞上の標識の存在を検出すること
    を含む、方法。
  27. ラビリンチン陽性疾患を有する個体を治療する方法であって、
    （ａ）請求項２１に記載の薬学的組成物の有効量；又は
    （ｂ）請求項２４又は２５に記載のエフェクター細胞の有効量
    を個体に投与することを含む、方法。
  28. ラビリンチン状態が、治療のための個体を選択するための基準として使用される、請求項２７に記載の方法。
  29. ラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法であって、
    （ａ）請求項８に記載の単離された抗ラビリンチン構築物の有効量を個体に投与すること；及び
    （ｂ）個体における標識のレベルを決定することであって、ここで、閾値レベルを超える標識のレベルは、個体がラビリンチン陽性疾患を有することを示す、決定すること
    を含む、方法。
  30. ラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する方法であって、
    （ａ）個体に由来する試料を、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離された抗ラビリンチン構築物と接触させること；及び
    （ｂ）試料中の単離された抗ラビリンチン構築物と結合した１つ又は複数の細胞を同定すること
    を含み、それによってラビリンチン陽性疾患を有する個体を診断する、方法。
  31. ラビリンチン陽性疾患がラビリンチン陽性がんである、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. ラビリンチン陽性がんが腺癌である、請求項３１に記載の方法。
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