WO2010076400A1 - Utilisation d'un anticorps anti-cd20 pour le traitement du lymphom intraoculaire primitif - Google Patents

Utilisation d'un anticorps anti-cd20 pour le traitement du lymphom intraoculaire primitif Download PDF

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WO2010076400A1
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Sylvain Fisson
Catherine Fridman
Rémi Urbain
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Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, whose variable region of each of the light chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, the variable region of each of the heavy chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and whose constant regions of the light and heavy chains are from a non-murine species, as a drug for the treatment of primary intraocular lymphoma (also called primary lymphoma). intraocular ").
  • the CD20 antigen is a hydrophobic transmembrane protein with a molecular weight of 35-37 kDa present on the surface of mature B cells (Valentine et al (1987) Proc Natl Acad Sci US A. 84 (22) : 8085-9 [1], Valentine et al (1989) J. Biol Chem 264 (19): 11282-11287 [2]). It is expressed during the development of B lymphocytes from the early pre-B stage to differentiation into a plasmocyte, a stage in which this expression disappears.
  • the CD20 antigen is present on both normal B cells and malignant B cells. More particularly, the CD20 antigen is expressed on most B-cell lymphomas (80% of lymphomas): it is expressed for example on more than 90% of non-Hodgkin's lymphoma (NHL) of B lymphocytes.
  • CD20 The function of CD20 is not yet fully understood, but it could act as a calcium channel and intervene in the regulation of first steps in differentiation (Golay et al (1985) J. Immunol .; 135 (6): 3795-801 [3]) and B-cell proliferation (Tedder et al (1986) J. Immunol. 1986 Aug; 16 (8): 881-7 [4]).
  • the CD20 antigen is, by its location, an important target for the treatment of pathologies involving tumor B cells, such as for example the NHL or the
  • LLC-B chronic lymphocytic leukemia B
  • this antigen is an ideal target because it is a membrane protein for which no modulation of expression or polymorphism is known.
  • rituximab A single radiolabelled anti-CD20 monoclonal antibody, rituximab (Genentech), is currently available on the market for the treatment of B-cell lymphoma. In NHL patients, it shows encouraging clinical results when combined with chemotherapy. However, its efficacy remains variable and often modest when used as a single agent (Teeling et al., (2004) Blood 104 (6), -1793-800 [5]).
  • PIOL Primary intraocular lymphoma
  • the eye signs of PIOL may precede, sometimes for several years, central or systemic nerve damage, and the ophthalmologist is sometimes the first to make the diagnosis.
  • the age of appearance of the first symptoms is variable, but the affection is exceptional before quarantine.
  • patients are over 60 years old. Initially, the attack is unilateral, but it becomes bilateral in 50 to 80% of cases.
  • the first ocular manifestations are usually a drop in vision or blurred vision. Diagnosis can be made by cytological examination of the posterior chamber puncture, revealing the presence of characteristic cells of a highly malignant non-Hodgkin's lymphoma.
  • the most commonly used treatment method is methotrexate chemotherapy in systemic or intravitreal injection. However, treatment with methotrexate requires numerous injections and induces ocular complications, such as corneal epithelopathy (Ohguro et al., 2008), Ophthalmol Arch / Vol 126 (No. 7), 1002-1003 [6]. ]).
  • methotrexate administered intravitreally is generally well tolerated and induces rapid remission, it does not prevent the occurrence of recurrence in case of monotherapy (SMET et al., Bull. Belgian Ophthalmol., 279, 91-95, 2001 [20]).
  • methotrexate is known to have a number of other adverse effects, including immunosuppression and liver damage.
  • PIOL is a lymphoma with large B-cell neoplasms expressing CD20.
  • Intravenous injections of rituximab have helped prolong the survival of patients with large systemic B-cell lymphoma.
  • rituximab did not affect the prognosis of central nervous system lymphoma, probably due to the fact that the monoclonal antibody does not cross the blood-brain barrier.
  • intravenous treatment with rituximab for ocular lesions associated with central nervous system lymphoma is unlikely to be beneficial because of the blood-brain barrier ([6]).
  • a first subject of the invention thus relates to the use of a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, whose variable region of each of the light chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 , whose variable region of each of the heavy chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and whose constant regions of the light and heavy chains come from a non-murine species, for the treatment of primary intraocular lymphoma (also called "primary intraocular lymphoma").
  • the antibodies consist of heavy chains and light chains, linked together by disulfide bridges.
  • Each chain is constituted, in the N-terminal position, of a variable region (or domain) (encoded by the rearranged genes VJ for the light chains and VD-J for the heavy chains) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position, of a constant region consisting of a single CL domain for the light chains or of several domains for the heavy chains.
  • the terms “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody composition” refer to a preparation of antibody molecules having identical and unique specificity.
  • the antibody according to the invention in which the variable regions of the light and heavy chains belong to a species different from the constant regions of the light chains and heavy chains, is referred to as "chimeric
  • the murine nucleic acid sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 encode the variable domain of each of the light chains and the variable domain of each of the heavy chains respectively of the antibody produced by the mouse hybridoma. 13.6E12, available from the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) under the number ACC 474.
  • This hybridoma produces a mouse monoclonal antibody of IgG2a type, ⁇ directed against CD20.
  • the sequence SEQ ID NO. 1 nevertheless has a nucleic acid which differs from the sequence coding for the variable region of the light chain of the antibody produced by the murine hybridoma CAT-13.6E12.
  • variable regions of the antibodies according to the invention comprise at least 70% identity with the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, this identity of sequences conferring an identity of specificity of the antibodies according to the invention with the antibody murine CAT-13.6E12.
  • this sequence identity also confers an affinity identity for the target between the antibody according to the invention and the murine antibody CAT-13.6E12.
  • the antibodies used in the invention further possess constant regions of its light and heavy chains belonging to a non-murine species.
  • non-murine mammals all families and species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular humans, monkeys, murids (except mice), suids, cattle, equines, felids , canids, for example, and birds.
  • the antibodies used as a medicament in the invention can be constructed using standard techniques of recombinant DNA, which are well known to those skilled in the art, and more particularly by using the "chimeric" antibody construction techniques described for example in Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-55 (1984), where recombinant DNA technology is used to replace the constant region of a heavy chain and / or the constant region of a light chain of an antibody from a non-human mammal with the regions of a human immunoglobulin.
  • recombinant DNA technology is used to replace the constant region of a heavy chain and / or the constant region of a light chain of an antibody from a non-human mammal with the regions of a human immunoglobulin.
  • variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention is coded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1
  • variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is coded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is coded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, and the variable region of each of the heavy chains of the The antibody according to the invention is encoded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention is encoded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1
  • variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is encoded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention is encoded by a sequence having at least 99% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1
  • variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is encoded by a sequence having at least 99% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • any antibody having variable regions of their heavy and light chains presenting one or more substitution (s), insertion (s) or deletion (s) of one or more nucleic acids, these sequence modifications corresponding to the percentages of identities sequences as defined above, and not altering the specificity of the antibody for its target, nor its affinity for its target, can be used for the purposes of the invention.
  • the antibodies used in the invention also include any antibody having the CDR (Complementary Determining Region) regions of the CAT-13.6E12 antibody, associated with FR regions (framework, highly conserved regions of the variable regions, also called " frame ").
  • CDR Complementary Determining Region
  • FR regions frame, highly conserved regions of the variable regions, also called " frame ".
  • Such antibodies have a very comparable affinity and specificity, preferably identical, to the murine CAT-13.6E12 antibody.
  • variable region of each of the light chains of the antibody used in the invention is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1
  • variable region of each of the heavy chains of the antibody is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • an antibody used, especially as a medicine, in the invention is therefore a monoclonal antibody directed against the CD20 antigen, whose variable region of each of the light chains is encoded by the Murine nucleic acid SEQ ID NO: 1, the variable region of each of the heavy chains is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, and the constant regions of the light and heavy chains are constant regions from of a non-murine species.
  • the term "directed against the CD20 antigen” is intended to mean the ability of the monoclonal antibody to bind all or part of the CD20 antigen, and in particular the epitope recognized by the EMAB603 antibody.
  • the constant regions of each of the light chains and each of the heavy chains of the antibody used in the invention are human constant regions.
  • This embodiment preferred embodiment of the invention makes it possible to reduce the immunogenicity of the antibody in humans and thereby to improve its efficacy during its therapeutic administration in humans.
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type K. Any allotype is suitable for carrying out the invention, for example Km (1), Km (1, 2), Km (1, 2, 3) or Km (3) but the preferred allotype is Km (3).
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type ⁇ .
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type ⁇ .
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody may be of type ⁇ 1, of type ⁇ 2, of type ⁇ 3, these three types of constant regions having the particularity of fixing the human complement, or of type ⁇ 4 .
  • Antibodies possessing a constant region of each of the ⁇ heavy chains belong to the IgG class.
  • Immunoglobulin type G are heterodimers consisting of 2 heavy chains and 2 light chains, linked together by disulfide bridges. Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain (encoded by the rearranged genes VJ for the light chain and VDJ for the heavy chain) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position, of a constant region consisting of a single CL domain for the light chain or of 3 domains (CH 1, CH 2 and CH 3) for the heavy chain.
  • variable domains and the CH 1 and CL domains of the heavy and light chains forms the Fab portions, which are connected to the Fc region by a very flexible hinge region allowing each Fab to bind to its antigenic target while the Fc region, mediator of the effector properties of the antibody, remains accessible to the molecules effectors such as Fc ⁇ R receptors and C1q.
  • the Fc region consisting of the 2 globular domains CH2 and CH3, is glycosylated at the CH2 domain with the presence, on each of the two chains, of a biantennary N-glycan of lactosaminic type, bound to Asn 297.
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type ⁇ 1, since such an antibody shows an ability to generate ADCC activity in the largest number of (human) individuals.
  • any allotype is suitable for carrying out the invention, for example G1m (3), G1m (1, 2, 17), G1m (1, 17) or GMI (I 1 3).
  • the allotype is G1 m (1, 17).
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type ⁇ 1, and it is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, the constant region of each of its light chains being encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4.
  • an antibody has a murine variable region and a human constant region, with heavy chains of ⁇ 1 type. This antibody therefore belongs to the subclass of IgGL.
  • the antibody has two light chains whose variable domain is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO 1 and the human constant region is encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4, and two heavy chains whose variable domain is encoded by the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2 and the constant region is encoded by the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5
  • each of the heavy chains is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 encoding each of the anti-light chains. body is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 coding for the variable domain of each of the light chains of the antibody and of the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 4 coding for the constant region of each of the light chains of the antibody.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 coding for each of the heavy chains of the antibody is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2 coding for the variable domain of each of the heavy chains of the antibody and the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 coding for the constant region of each of the heavy chains of the antibody.
  • each of the light chains of the antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the sequence of Murine human chimeric nucleic acid SEQ ID NO: 6,
  • the peptide sequence of each of the light chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 is the sequence SEQ ID NO: 7
  • the peptide sequence of each of the heavy chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 is the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid located at position 106 is a lysine (K) in the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the invention also encompasses the use of the antibodies, each of which has light chains encoded by a chimeric murine-human nucleic acid sequence having at least 70% homology or identity with the chimeric nucleic acid sequence.
  • murine-human SEQ ID NO: 7 and each of the heavy chains encoded by a chimeric murine-human nucleic acid sequence has at least 70% homology or identity with the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8, these modifications do not alter the specificity of the antibody nor its effector activities, such as ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) activity.
  • ADCC Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
  • the antibody used in the invention is produced by a rat hybridoma cell line.
  • Line Producing the antibody according to the invention is an important characteristic since it confers on the antibody some of its particular properties. Indeed, the means of expression of the antibodies is at the origin of the post-translational modifications, in particular modifications of the glycosylation, which may vary from one cell line to another, and thus confer different functional properties on antibodies having identical primary structures.
  • the antibody is produced in the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HLP2.G11.16Ag.2O cell, deposited at the American Type Culture Collection as ATCC number CRL-1662). This line was chosen because of its ability to produce antibodies with improved ADCC activity compared to antibodies of the same primary structure produced for example in CHO.
  • another antibody according to the invention is the EMAB603 antibody produced by the clone R603 deposited on November 29, 2005 under the registration number CNCM 1-3529 to the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15).
  • Each of the light chains of the EMAB603 antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and each of the heavy chains is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • This chimeric antibody competes with murine CAT-13.6E12 for binding CD20 and has a much higher cytotoxic activity than rituximab, which can be attributed in part to the particular glycosylation of N-glycan heavy chain of these antibodies.
  • the R603 clone has the particularity of producing an EMAB603 antibody composition having a fucose / galactose content ratio of less than 0.6, for which it has been demonstrated in patent application FR 03 12229 that is optimal for conferring strong ADCC activity to antibodies.
  • This antibody can be particularly interesting as a therapeutic tool for the treatment of PIOL.
  • the antibodies of the invention may allow the formation of memory T lymphocytes. These memory T cells may possess the ability to proliferate, and to reactivate rapidly upon second exposure to tumor cells.
  • the antibodies of the invention may allow infiltration of T cells into the tumor, which may induce slowing of tumor growth, and better clearance of tumor cells.
  • a monoclonal antibody can have a significant antitumor effect.
  • such an antibody may allow tumor cell replication inhibition of at least 20%, or at least 30%, or at least 50%, and preferably at least 60%, or 70% in the subject with intraocular lymphoma to which it is administered.
  • Such antibodies, as well as a method for their manufacture, are described in WO 2006/064121.
  • An example of an expression vector of an antibody according to the invention is the vector of sequence SEQ ID NO: 17.
  • This vector is a vector allowing the expression of an antibody according to the invention whose light chain is coded by the nucleic acid sequence SED ID NO: 5, whose deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 7, and whose heavy chain is encoded by the nucleic acid sequence SED ID NO: 6, whose sequence deduced peptide is the sequence SEQ ID NO: 8.
  • This vector is a nucleic acid molecule in which the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 coding for each of the light chains of the antibody and the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 encoding each of the heavy chains of the antibody were inserted, to introduce and maintain them in a host cell. It allows the expression of these foreign nucleic acid fragments in the host cell because it possesses essential sequences (promoter, polyadenylation sequence, selection gene) to this expression.
  • Such vectors are well known to those skilled in the art, and may be an adenovirus, a retrovirus, a plasmid or a bacteriophage, this list not being limiting.
  • any mammalian cell can be used as a host cell, that is to say as a cell expressing the antibody according to the invention, for example YB2 / 0, CHO, CHO dhfr- (for example CHO DX BII, CHO DG44), CHO Lec13, SP2 / 0, NSO, 293, BHK or COS.
  • the antibody of the invention may be produced by coexpression in a cell of two expression vectors, one for expression of the light chain, and one for expression of the light chain.
  • these vectors possess indispensable sequences (promoter, polyadenylation sequence, selection gene) for this expression.
  • the vectors may be for example a plasmid, an adenovirus, a retrovirus or a bacteriophage, and the host cell may be any mammalian cell, for example YB2 / 0, CHO, CHO dhfr- (CHO DX BII, CHO DG44), CHO Lecl3, SP2 / 0, NSO, 293, BHK or COS.
  • the stable cell line expressing an antibody used in the invention is selected from the group consisting of: SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F, a human myeloma such as Namalwa or any other cell of human origin such as PERC6, the CHO lines, in particular CHO-K-1, CHO-LeCl O, CHO-Led, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX BII, CHO DG44), or other lines selected from Wil- 2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag 14 and P3X63Ag8.653.
  • SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F a human myeloma such as Namalwa or any other cell of human origin such as PERC6, the CHO lines, in particular CHO-K-1, CHO-LeCl O,
  • the line used is the YB2 / 0 rat hybridoma (YB2 / 3HL.P2.G11.Ag.2O cell, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL-1662).
  • This line was chosen because of its ability to produce antibodies with improved ADCC activity compared to antibodies of the same primary structure produced for example in CHO.
  • a particular object of the invention relates to a method of treatment using the previously described antibodies of primitive intraocular lymphoma.
  • the method of treatment comprises the step of administering the antibodies to a patient with PIOL.
  • the antibody used in the invention is administered with a pharmaceutically acceptable carrier, suitable for the expected therapeutic effect.
  • the antibody used in the invention may be used in combination with one or more other antibodies, e.g. monoclonal (ux), directed against one or more other antigen (s) expressed on lymphoid cells, such as, for example, without limitation, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD1, CD16, CD18, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD29 antigens , CD30, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69, CD70, CD71, CD80, CD81, CD82, CD86, CD95, CD103, CD118, CD1 19, CD120, CD132, CD210, CD217.
  • ux monoclonal
  • the antibody according to the invention may be used in combination with cells expressing Fc ⁇ R such as NK cells, NKT (Natural Killers T) cells, T ⁇ lymphocytes, macrophages, monocytes or dendritic cells, i.e., in combination with cell therapy (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78: 1569 ([8]), Kimby E et al., 1989 Leukemia 3 (7): 501-504 ([9]), Soorskaar D et al., 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87 (2); 159-164 ([10]); Ziegler HW et al. 1981 J Cancer 27 (3); 321-327 ([11]); Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9): 1667-77 ([12]); Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9): 744-50 ([13])).
  • Fc ⁇ R such as NK cells, NKT (Natural Killers T) cells, T
  • the dose of antibody administered to the patients is preferably less than 375 mg / m 2 , 187.5 mg / m 2 , 75 mg / m 2 , 37.5 mg / m 2 , 15 mg / m 2 , 7.5 mg / m 2 or particularly advantageously less than 3.75 mg / m 2 or 1 mg / m 2 or 0.5 mg / m 2 .
  • the dose administered is advantageously between 187.5 mg / m 2 and 75 mg / m 2 , or between 75 mg / m 2 and 37.5 mg / m 2 , between 75 mg / m 2 and 15 mg / m 2 , between 75 mg / m 2 and 7.5 mg / m 2 or between 75 mg / m 2 and 3.75 mg / m 2 .
  • the dose administered is between 3.75 mg / m 2 and 0.5 mg / m 2 , more particularly between 2 mg / m 2 and 1 mg / m 2 .
  • these doses are administered intravenously.
  • the amount of antibody administered to the patient may be between 0.001 ⁇ g and 1000 ⁇ g of antibody, or between 0.001 ⁇ g and 100 ⁇ g of antibody, or between 10 ⁇ g and 100 ⁇ g of antibody, advantageously between 0.01 ⁇ g and 10 ⁇ g of antibody, or between 1 ⁇ g and 10 ⁇ g, or between 0.01 ⁇ g and 1 ⁇ g, or between 0.01 ⁇ g and 0.1 ⁇ g or between 0.02 ⁇ g and 0.08 ⁇ g of antibody.
  • the administration of the antibody can be done in the eye with the disease.
  • the quantity of antibody administered to the patient may be between 0.001 ⁇ g and 1000 ⁇ g of antibody, or between 0.001 ⁇ g and 100 ⁇ g of antibody, or between 10 ⁇ g and 100 ⁇ g of antibody, advantageously between 0. , 01 ⁇ g and 10 ⁇ g of antibody, or between 1 ⁇ g and 10 ⁇ g, or between 0.01 ⁇ g and 1 ⁇ g, or between 0.01 ⁇ g and 0.1 ⁇ g or between 0.02 ⁇ g and 0.08 ⁇ g of antibody per eye.
  • each administration is done either in single dose, or in repeated injections.
  • each administration is sufficiently spaced from the previous one for each administration to be considered as a single dose administration.
  • each administration may be spaced at least a week, or at least 2 weeks, at least 3 weeks, or at least 4 weeks, or at least 6 weeks, or at least 10 weeks, or at least 6 months.
  • the administration of the antibody can be carried out intravitreally, at a quantity of 0.02 ⁇ g of antibody per eye or 0.002 mg of antibody / ml of vitreous humor.
  • each administration is spaced a minimum of one week, for example 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks or 5 weeks.
  • the mode of administration of the antibody used in the invention may be intraocular, for example by injection into the vitreous body, by peri-and intraocular injection, subconjunctival, peri-or latero-bulbar, retrobulbar by instillation of eye drops, in particular by intravitreal instillation, by iontophoresis, by intrascleral implantation, by the application of an ophthalmic ointment, by intravenous retinal injection or by the application of ultrasound.
  • the antibody can be administered as a drug according to the standard rules, well known to those skilled in the art, for the treatment of lymphomas.
  • the antibodies used in the invention have the particularity and advantage of being cytotoxic.
  • effector cells the binding of the Fc region of the antibody to its receptor carried by the effector cell causes the activation of Fc ⁇ RIIIA and the destruction of target cells.
  • the effector cells are, for example, NK cells (Natural Killer), macrophages, neutrophils, CD8 lymphocytes, T ⁇ lymphocytes, NKT cells, eosinophils, basophils or mast cells.
  • Another object of the invention is the use of an antibody according to the invention, for the manufacture of a medicament for the treatment of primary intraocular lymphoma.
  • another subject of the invention is a method for preparing a medicament for the treatment of primary intraocular lymphoma, comprising mixing the monoclonal antibody used in the invention with a pharmaceutically acceptable carrier, and then obtaining the medicament .
  • Another object of the invention is a method of therapeutic treatment of primary intraocular lymphoma, comprising administering, to a patient with the need, an antibody or a drug as described above.
  • FIG. 1 is the schematic representation of the vector CKHu used for the chimericization of the kappa light chain of the EMAB603 antibodies.
  • FIG. 2 is the schematic representation of the G1 Hu vector used for the chimericization of the heavy chain of the EMAB603 antibodies.
  • FIG. 3 is the schematic representation of the expression vector of the heavy and light chains used for the production of the EMAB603 antibody.
  • FIG. 4 represents the absolute number of tumor ocular cells ( ⁇ 10 -6 ) in murine PIOL models after injection of 1 ⁇ PBS, of the antibody LFB-R603 (20 ⁇ g) or of the antibody Rituxir ⁇ ab (20 ⁇ g), in FIG. the eye having developed the tumor
  • FIG. 5 represents the absolute number of tumor ocular cells (x10 6 ) in mouse models of PIOL after injection of buffer of the LFB R603 antibody or of the LFB R603 antibody at doses of
  • RNA of the murine hybridoma CAT-13.6E12 (supplier: DSMZ, ref ACC 474) producing lgG2a immunoglobulin, ⁇ was isolated
  • variable domains of the light (VK) and heavy (VH) chains of the CAT-13.6E12 antibody were amplified by the 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) technique (GeneRacer kit, Invitrogen ref. L1500-01).
  • 5'RACE Rapid Amplification of cDNA Ends
  • Kappa specific antisense primer (SEQ ID NO: 11) 5'-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3 '
  • Murine G2a specific antisense primer (SEQ ID NO: 12) 5 1 - GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG -3 1
  • VH and VK PCR products thus obtained were cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector (Zero blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, K2875-
  • nucleotide sequence of the VK region of the murine antibody CAT-13.6E12 is indicated under the sequence SEQ ID NO:
  • the VK gene belongs to the V ⁇ 4 family (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [19]).
  • the nucleotide sequence of the VH region of CAT-13.6E12 is the sequence
  • the VH gene belongs to the VH1 family ([19]).
  • Kappa light chain vector of the EMAB603 antibody The VK sequence cloned into the pCR4Blunt-TOPO sequencing vector was amplified using the following cloning primers:
  • the underlined sequence corresponds to the restriction site Spe I 1 the sequence in bold corresponds to a consensus Kozak sequence, I 1 ATG initiator is in italics.
  • VK antisense primer (SEQ ID NO: 14)
  • This primer joins the murine VK (in italic) and human constant region (CK) sequences (in bold).
  • the underlined sequence corresponds to the Dra III restriction site.
  • the VK PCR product thus obtained contains the sequence coding for the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12, with the mutation AAC ⁇ AAA (nucleotide framed in the sequence of the antisense primer SEQ ID NO: 14) which corresponds to the N106K mutation compared to the natural V ⁇ sequence of CAT-13.6E12.
  • sequence of the light chain of the chimeric antibody EMAB603 encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 5 for the nucleotide sequence and corresponds to the deduced peptide sequence SEQ ID NO: 7.
  • This VK PCR was then cloned between the Spe I and Dra III sites of the light chain chimeric vector (FIG 1) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1, 5 'of the human CK constant region, whose sequence The human CK sequence of this chimerization vector was previously modified by silent mutagenesis to create a Dra III restriction site to allow the cloning of murine VK sequences.
  • This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the dhfr (dihydrofolate reductase) selection gene.
  • VH sequence cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector was first amplified using the following cloning primers: a) sense primer VH (SEQ ID NO: 15) 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACC ⁇ TGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3
  • the underlined sequence corresponds to the Spe I restriction site, the bold sequence corresponds to a consensus Kozak sequence, the initiator ATG is italicized.
  • VH antisense primer SEQ ID NO: 16 5'-
  • This primer joins the murine VH sequences (in italics) and the human Gl constant region (in bold).
  • the underlined sequence corresponds to the Apa I restriction site.
  • the amplified VH fragment contains the sequence encoding the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12.
  • This VH PCR was then cloned between the Spe I and Apa I sites of the heavy chain chimeric vector (FIG 2) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2, 5 'of the human ⁇ 1 constant region whose nucleic sequence is the sequence SEQ ID NO: 3.
  • This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (bovine Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the neo selection gene.
  • EMAB603 Antibody Expression Vector A single expression vector containing the two heavy chain and light chain transcription units of the anti-CD20 EMAB-603 antibody was constructed from the two light chain chimerization vectors
  • This expression vector HK463-25 FDA has two selection genes, neo (neo-phosphotranspherase II) and dhfr (dihydrofolate reductase), as well as two heavy chain and light chain transcription units under the control of an RSV promoter ( Figure 3).
  • the rat YB2 / 0 (ATCC # CRL-1662) line was cultured in EMS medium (Invitrogen, Cat # 041-95181M) containing 5% fetal calf serum (JRH Biosciences, Cat # 12107).
  • EMS medium Invitrogen, Cat # 041-95181M
  • Optimix medium Equibio, ref EKITE 1
  • the electroporation conditions applied were 230 volts and 960 microfarads for a 0.5 ml cuvette.
  • Each electroporation cuvette was then distributed over 5 P96 plates with a density of 5000 cells / well.
  • the RPMI selective medium (Invitrogen, ref 21875-034) containing 5% dialyzed serum (Invitrogen, ref 10603-017), 500 ⁇ g / ml of G418 (Invitrogen, ref.10131-027) and 25 nM of methotrexate. (Sigma, M8407), was performed 3 days after transfection.
  • the clone R603 was selected for the production of the EMAB603 chimeric antibody and progressively adapted to the CD Hybridoma production medium (Invitrogen, ref 11279-023).
  • the production of chimeric EMAB603 antibodies was carried out by expansion of the adapted culture in CD Hybridoma medium, obtained by dilution to 3 ⁇ 10 5 cells / ml in flasks of 75 cm 2 and 175 cm 2 and then by dilution to 4.5 ⁇ 10 5 cells / ml. in roll-type bottle. After reaching maximum volume, culture was continued until cell viability was only 20%.
  • chimeric EMAB603 antibodies were purified by protein A affinity chromatography (purity estimated by HPLC ⁇ 95%) and monitored by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the cells are cultured in RPMI medium (Roswell Park Memorial Institute medium, Glutamax, invitrogen-Gibco, Cergy Pontoise, France), supplemented with 10% calf serum (FCS, PAA Laboratories, C ⁇ lbe, Germany), penicillin 100U: ml, and streptomycin 100 ⁇ g: ml (Eurobio, The US, France), 10 mM sodium pyruvate (Invitrogen Gibco), and 50 mM mercaptoethanol (Invotrogen-Gibco), and are maintained at 37 ° C with 5% CO2 (Touitou et al., Impaired Th1 / Tc1 cytokine production of tumor-infiltrating lymphocytes in a model of intraocular primary B-cell lymphoma, Investigative Ophthalmology & Visual Science, July 2007, Volume 48, No. 7, [22]).
  • the IIA1.6 cells are transfected by nucleofection, using a plasmid of 3.5kb pmax GFP (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany), under the control of a cytomegalovirus (CMV) promoter, and by means of a plasmid carrying the gene coding for human CD20.
  • CMV cytomegalovirus
  • the GFP Green Fluorescent Protein
  • the cells are cultured in a culture medium containing 0.5 mg / ml of neomycin (G418).
  • Clones expressing high levels of GFP and human CD20 (hCD20) are obtained by limiting dilution and are denoted A20.IIA-GFP-hCD20.
  • mice Females of BALB / c (H2 d ) mice 6 to 12 weeks old are obtained from Charles River Laboratories (L'ArbresIe, France). The mice are fed ad libitum with sterile food and filtered water, and kept in 12-hour light-dark cycles. All mice are handled according to European Union Directives and the ARVO Statement for the Use of Ophthalmic and Vision Research. Intravitreal injections and clinical evaluation
  • Anesthesia is performed by intraperitoneal injection of a combination of ketamine at 120 mg / kg (Imalgene 1000, Merial, Lyon, France) and xylazine at 6 mg / kg (Rompun 2%, Bayer, Leverkusen, Germany).
  • the tumor cells (104 cells) are incubated in 2 ⁇ l 1 ⁇ PBS (pH 7.4), and are injected intravitreally through the pars plana with the aid of a dissecting microscope.
  • the injection is performed under asceptic conditions in the right eye after dilation with 0.5% tropicamide (Théa, Clermont-Ferrand, France).
  • mice (Hamilton, Hamilton Bonaduz, Switzerland). The mice are injected intravitreally with 2 ⁇ L PBS in the right eye. Drops of rifamycin
  • Slit lamp examination is performed at regular intervals, including a bilateral examination of the fundus of each mouse.
  • the clinical progression is graded according to a clinical ocular engagement score.
  • mice 7 days after the intravitreal injection of the A20.IIA-GFP-hCD20 cells, the mice are divided into 3 groups: a group of 8 mice are injected with 1X PBS (2 ⁇ l) into the eye having received the tumor cells, 16 mice received an injection of LFB R603 antibody (also called "EMAB603") at 20 ⁇ g / 2 ⁇ L into the eye having received the tumor cells, and 8 mice received an injection of the Rituximab antibody at 20 ⁇ g / 2 ⁇ L .
  • LFB R603 antibody also called "EMAB603”
  • mice 8 days after the injection of PBS, LFB_R603 antibody or Rituximab antibody, the mice are euthanized by cervical dislocation.
  • the eyes After death, the eyes are collected, fixed in paraformaldehyde at 4% containing 5% sucrose for 2 hours, and encased in a resin for fine histology according to the indications of the supplier (Historesin embedding kit, Leica Microsystems, Heidelberg, Germany). Serial sections (5 ⁇ m) are marked with blue toluidine. The microscopic examination of the sections of the eyes is then carried out (Leitz microscope, Aristoplan, Rueil-Malmaison, France). Images are collected (DFC480 Leica, with IM50 Image Manager software, Leica Microsystems).
  • the enucleated eyes are fixed in a solution containing 4% paraformaldehyde and 5% sucrose for 2 hours, and then immersed overnight in PBS containing 15% sucrose.
  • the samples are embedded and frozen in a suitable compound (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Zoeterwoude, The Nederlands) and stored at -80 ° C.
  • the anteroposterior frozen sections (10 ⁇ m thick) of the eyes at the level of the nerve Optics are cut with a cryostat (CM2050S, Leica, Wetzlar, Germany) and mounted in slides covered with gelatin for immunohistochemical analysis.
  • tissue sections are incubated with a purified rat monoclonal antibody (mAb) directed against T cells (CD4 clone GK1.5, clone CD8 53-6-7), BD Biosciences, Le Pont-de-Claix, France), macrophages (clone F4 / 80) and polynuclear neutrophils (clone 7/4, Serotec, Cergy Saint-Christophe, France).
  • mAb monoclonal antibody directed against T cells
  • CD4 clone GK1.5 clone CD8 53-6-7
  • BD Biosciences Le Pont-de-Claix, France
  • macrophages clone F4 / 80
  • polynuclear neutrophils clone 7/4, Serotec, Cergy Saint-Christophe, France.
  • Alexa594 anti-mouse conjugate antibody Invitrogen-Gibco.
  • the slides are incubated with the propidium iodine nuclear labeling agent (Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR).
  • Negative control experiments are performed by incubating tissue sections with an isotype control mAb. Sections were mounted in PBS containing 5% glycerol and observed by fluorescence photomicroscopy (FXA, Microphot, Nikon, Melville, NY). Confocal microscopy and image analysis
  • Confocal microscopy is performed on sections of frozen eyes with a confocal scanning laser microscope (LSM510; Carl Zeiss Mleée, GmbH, Oberkochen, Germany), equipped with an argon laser (488 nm) and a helium laser -neon (543 nm).
  • LSM510 Carl Zeiss Mleée, GmbH, Oberkochen, Germany
  • argon laser 488 nm
  • helium laser -neon 543 nm
  • the eyes are dissected in RPMI medium, digested with 0.1 mg / ml of DNase I (Roche, Meylan, France) and 1.67 units of Wnsch / ml of purified enzymes (Liberase, Roche) at 37 ° C. for 20 minutes, filtered and rinsed in PBS with 2 mM EDTA and 3% FCS (fetal calf serum).
  • DNase I Roche, Meylan, France
  • FCS fetal calf serum
  • the cells are pre-incubated with 2.4G2 mAb (10 ⁇ g / mL) to block non-specific binding to Fc receptors and then 10 5 cells per well are labeled with the following mAbs: anti-CD3 conjugated with biotin (145-2C11; BD Biosciences), phycoerythrin-conjugated anti-CD4 (GK1,5, BD Biosciences), fluorochrome-conjugated anti-CD8 (Cy-Chromium) (53-6.7, BD Biosciences), phycoerythrin-conjugated anti-CD19 (6D5; e-Bioscience, San Diego, CA), anti-CD20 conjugated with phycoerythrin (LFB_R603, LFB SA) or the corresponding control isotype mAb (BD Biosciences).
  • Flow cytometry (FACSCalibur) assays are performed with CelIQuest and FACS Diva software (BD Biosciences).
  • GFP-hCD20 expressing human CD20. Since these cells also express GFP, it is possible to discriminate B cells from lymphomas
  • A20.IIA-GFP-hCD20 B cells are detected by flow cytometry in all eyes that have been inoculated by double detection of GFP and CD19.
  • the percentage of intraocular lymphoma cells is correlated in dose-response to the number of cells initially injected into the right eye at an initial dose of 10 4 cells.
  • the results are reproducible, with the development of intraocular lymphoma in all eyes injected with A20.IIA-GFP-hCD20 cells. So the model mimics human PIOL very closely
  • mice are injected with 1X PBS, 16 mice are treated with LFB R603 antibody (20 ⁇ g / 2 ⁇ L), and 8 mice are treated. with Rituximab antibody (20 ⁇ g / 2 ⁇ L).
  • the absolute number of tumor cells is measured in the eyes, for each group tested in a pool of 2 independent experiments named LC_08 and LC 09, performed according to the protocol detailed above, and compared by Mann-Whitney statistical test.
  • FIG. 4 represents the number of tumor cells among the total number of living cells after injection of PBS, or after treatment using the LFB-R603 antibody or the Rituximab antibody.
  • Example 4 Study of the Efficacy of the LFB R603 and Rituximab Antibodies in a PIOL Murine Model According to a Second Experimental Protocol
  • a PIOL model is obtained by injecting lymphoma B cells expressing human CD20 into mouse eyes according to the protocol detailed in Example 3.
  • the mice are divided into 3 groups: a group of 46 mice are injected with LFB_R603 antibody buffer, 16 mice. are treated with the antibody LFB_R603 (0.02 ⁇ l / 2 ⁇ l) and 32 mice are treated with the antibody LFB_R603 (0.2 ⁇ g / 2 ⁇ l).
  • mice are euthanized by cervical dislocation.
  • mice develop an intraocular lymphoma of B cells, following intravitreal injections of A20.MA-GFP-hCD20 cells (thus expressing human CD20).
  • the absolute number of tumor cells is measured in the eyes that received the lymphoma cells, for each group tested in a pool of 6 independent experiments named LC 12, LC_14, LC 15, LC_16,
  • FIG. 5 represents the number of tumor cells among the total number of living cells after treatment using the buffer of the LFB_R603 antibody, and the LFB_R603 antibody (0.02 ⁇ g and 0.2 ⁇ g).
  • the percentage inhibition of tumor cell replication is given in Table II.
  • the grouping of these experiments shows that the treatment with the LFB-R603 antibody has a significant anti-tumor effect 12 days after the treatment even when injected at a low concentration (0.02 ⁇ g / 2 ⁇ L and 0.2 ⁇ g / 2 ⁇ L).

Abstract

La présente invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 1, dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour le traitement du lymphome intraoculaire primitif.

Description

UTILISATION D'UN ANTICORPS ANTI-CD20 POUR LE TRAITEMENT DU LYMPHOME INTRAOCULAIRE PRIMITIF
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 1 dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO: 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, comme médicament pour le traitement du lymphome intraoculaire primitif (également appelé « lymphome primaire intraoculaire »).
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée après les exemples.
Etat de la technique L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire hydrophobe d'un poids moléculaire de 35-37 kDa présente à la surface des lymphocytes B matures (Valentine et al. (1987) Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9 [1]; Valentine et al. (1989) J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 [2]). Il est exprimé au cours du développement des lymphocytes B dès le stade pré-B précoce et ce jusqu'à la différenciation en plasmocyte, stade où cette expression disparaît. L'antigène CD20 est présent à la fois sur les lymphocytes B normaux et sur les cellules B malignes. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur la plupart des lymphomes de phénotype B (80% des lymphomes) : il est exprimé par exemple sur plus de 90% des lymphomes non-Hodgkiniens (NHL) de lymphocytes B.
La fonction du CD20 n'est pas encore totalement élucidée, mais il pourrait agir comme un canal calcique et intervenir dans la régulation des premières étapes de la différenciation (Golay et al. (1985) J. Immunol.; 135(6) :3795-801 [3]) et de la prolifération des lymphocytes B (Tedder et al. (1986) Sur J. Immunol . 1986 Aug;16(8) :881-7 [4]).
Ainsi, bien qu'il subsiste des incertitudes quant à son rôle dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B, l'antigène CD20 est, de par sa localisation, une cible importante pour le traitement des pathologies impliquant des lymphocytes B tumoraux, comme par exemple les NHL ou la
LLC-B (leucémie lymphoïde chronique B) par des anticorps reconnaissant spécifiquement le CD20. De plus, cet antigène est une cible idéale car il s'agit d'une protéine membranaire pour laquelle on ne connaît pas de modulation d'expression ou de polymorphisme.
Un seul anticorps monoclonal anti-CD20 non radiomarqué, le rituximab (Genentech), est actuellement disponible sur le marché, pour le traitement des lymphomes de cellules B. Il montre chez les patients atteints de NHL des résultats cliniques encourageants lorsqu'il est associé à une chimiothérapie. Toutefois, son efficacité reste variable et souvent modeste lorsqu'il est utilisé comme agent unique (Teeling et al. (2004) Blood 104(6). -1793-800 [5]).
Le lymphome intraoculaire primitif (PIOL) est un lymphome non- Hodgkinien du système nerveux central. Cette forme affecte en général le vitré ou la rétine.
Les signes oculaires du PIOL peuvent précéder, parfois de plusieurs années, l'atteinte nerveuse centrale ou systémique, et l'ophtalmologiste est parfois le premier à poser le diagnostic.
L'âge d'apparition des premiers symptômes est variable, mais l'affection est exceptionnelle avant la quarantaine. En général, les patients ont plus de 60 ans. Initialement, l'atteinte est unilatérale, mais elle devient bilatérale dans 50 à 80 % des cas.
Les premières manifestations oculaires sont en général une baisse de vision ou une vision trouble. Le diagnostic peut être réalisé au moyen d'un examen cytologique de la ponction de chambre postérieure, révélant la présence de cellules caractéristiques d'un lymphome non-Hodgkinien hautement malin. La méthode de traitement la plus couramment utilisée est la chimiothérapie par méthotrexate en systémique ou par injection intravitréenne. Toutefois, le traitement par méthotrexate nécessite de nombreuses injections et induit des complications oculaires, comme l'épithéliopathie de la cornée (Ohguro et al. (2008). Arch. Ophtalmol/Vol. 126 (No. 7) ; 1002-1003 [6]). Par ailleurs, un autre cas rapporté par SMET MD montre que même si le méthotrexate administré par voie intravitréenne est généralement bien toléré et induit une rémission rapide, il n'empêche pas la survenue de récidives en cas de monothérapie (SMET et al. Bull. Soc. Belge Ophtalmol., 279, 91-95, 2001 [20]). De plus le méthotrexate est connu pour présenter un certain nombre d'autres effets indésirables et notamment une immunosupression et des atteintes hépatiques.
Le PIOL est un lymphome comportant des néoplasmes à grandes cellules B exprimant le CD20. Des injections intraveineuses de rituximab ont contribué à prolonger la survie des patients présentant un lymphome à grandes cellules B systémiques. Toutefois, le rituximab n'a pas affecté le pronostic du lymphome du système nerveux central, probablement en raison du fait que l'anticorps monoclonal ne traverse pas la barrière hématoencéphalique. De même, il est peu probable qu'un traitement par injections intraveineuses de rituximab des lésions oculaires associées au lymphome du système nerveux central, soit bénéfique en raison de la barrière hématooculaire ([6]).
Toutefois, des essais d'injections intravitréennes de rituximab ont montré une absence d'effets toxiques oculaires significatifs chez des patients atteints d'un lymphome primaire du système nerveux central (Kitzamnn et al. (2007) Eye 21 , 1524-1527 [7]). Cependant, en raison des traitements complémentaires systémiques ou oculaires reçus par les patients, il n'est pas possible d'en tirer des conclusions quant à l'efficacité d'une thérapie au moyen d'administration intravitréenne de rituximab. Par ailleurs, des essais d'injections intravitréennes de rituximab chez deux patients atteints de PIOL ont montré, dans l'œil, une disparition des cellules malignes de lymphome ([6]). Cependant, un cas sur deux a présenté une réaction inflammatoire de la chambre antérieure de l'œil. L'étude indique aussi une absence de complications. Toutefois, les observations se sont limitées deux mois après le traitement par rituximab et elles n'ont pas été basées sur des résultats de biopsie, mais uniquement sur des observations cliniques.
Il existe donc un réel besoin d'un outil thérapeutique palliant ces inconvénients et obstacles quant au traitement du PIOL.
Description de l'invention
Un premier objet de l'invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1 , dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour le traitement du lymphome intraoculaire primitif (également appelé « lymphome primaire intraoculaire »). Les anticorps sont constitués de chaînes lourdes et de chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région (ou domaine) variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour les chaînes légères et V-D- J pour les chaînes lourdes) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères ou de plusieurs domaines pour les chaînes lourdes .
Aux fins de l'invention, les expressions " anticorps monoclonal " ou " composition d'anticorps monoclonal " se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique. L'anticorps selon l'invention, dont les régions variables des chaînes légères et lourdes appartiennent à une espèce différente des régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes, est qualifié d'anticorps " chimérique
Les séquences d'acide nucléique murines SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 codent pour le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes respectivement de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12, disponible à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) sous le numéro ACC 474. Cet hybridome produit un anticorps monoclonal murin de type lgG2a,κ dirigé contre le CD20. La séquence SEQ ID NO. 1 comporte néanmoins un acide nucléique qui diffère par rapport à la séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12.
Ces séquences murines ont été choisies pour dériver les séquences des régions variables des anticorps selon l'invention en raison de la spécificité de l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour l'antigène CD20. Les régions variables des anticorps selon l'invention comportent au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 cette identité de séquences conférant une identité de spécificité des anticorps selon l'invention avec l'anticorps murin CAT-13.6E12. De préférence, cette identité de séquences confère également une identité d'affinité pour la cible entre l'anticorps selon l'invention et l'anticorps murin CAT-13.6E12.
Les anticorps utilisés dans l'invention possèdent en outre des régions constantes de ses chaînes légères et lourdes appartenant à une espèce non- murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non- murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux.
Les anticorps utilisés comme médicament dans l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps " chimériques " décrites par exemple dans Morrison et al., Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A., 81 , pp. 6851-55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. Un mode de réalisation particulier sera illustré plus loin.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 95% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 95% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. Avantageusement, tout anticorps possédant des régions variables de leur chaînes lourdes et légères présentant une ou plusieurs substitution(s), insertion(s) ou délétion(s) d'un ou plusieurs acides nucléiques, ces modifications de séquences répondant aux pourcentages d'identités de séquences tels que définis ci-dessus, et n'altérant ni la spécificité de l'anticorps pour sa cible, ni son affinité pour sa cible, peut être utilisé aux fins de l'invention.
Les anticorps utilisés dans l'invention s'entendent aussi de tout anticorps possédant les régions CDR (Complementary Determining Région) de l'anticorps CAT-13.6E12, associées à des régions FR (framework, régions très conservées des régions variables, nommées aussi "charpente"). De tels anticorps possèdent une affinité et une spécificité très comparables, de préférence identiques, à l'anticorps murin CAT-13.6E12.
De manière préférée, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisé dans l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, un anticorps utilisé, notamment comme médicament, dans l'invention est donc un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 , la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.
Ainsi, par « dirigé contre l'antigène CD20 », on entend désigner la capacité de l'anticorps monoclonal à lier tout ou partie de l'antigène CD20, et notamment l'épitope reconnu par l'anticorps EMAB603. De manière préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1), Km(1 , 2), Km(1, 2, 3) ou Km(3) mais l'allotype préféré est Km(3) .
Dans un autre mode de réalisation complémentaire, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type λ. Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type γ1, de type γ2, de type γ3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type γ4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type γ appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CH 1 , CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH 1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcγR et le C1q. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné de type lactosaminique, lié à l'Asn 297. De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ1 , car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC chez le plus grand nombre d'individus (humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple G1m(3), G1 m (1 , 2, 17), G1m(1 , 17) ou GIm(I 1 3) . De manière préférentielle, l'allotype est G1 m(1 , 17) .
Dans un aspect particulier de l'invention, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ1 , et elle est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3, la région constante de chacune de ses chaînes légères étant codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4. Ainsi, un tel anticorps possède une région variable murine et une région constante humaine, avec des chaînes lourdes de type γ1. Cet anticorps appartient donc à la sous-classe des IgGL Selon le mode de réalisation de l'anticorps utilisé dans l'invention, l'anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 4, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 et la région constante est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3. De manière préférentielle, chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps.
La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps. Dans un aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine- humaine SEQ ID NO : 6, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5, est la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6, est la séquence SEQ ID NO : 8.
L'acide aminé situé en position 106 est une lysine (K) dans la séquence SEQ ID NO : 7.
L'invention s'entend aussi de l'utilisation des anticorps dont chacune des chaînes légères codées par une séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 7 et chacune des chaînes lourdes codées par une séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 8, ces modifications n'altérant ni la spécificité de l'anticorps ni ses activités effectrices, comme l'activité ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) .
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps utilisé dans l'invention est produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat. La lignée productrice de l'anticorps selon l'invention est une caractéristique importante puisqu'elle confère à l'anticorps certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des anticorps est à l'origine des modifications post-traductionnelles, notamment des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des anticorps ayant pourtant des structures primaires identiques.
Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HLP2.G11.16Ag.2O, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO.
Dans un autre mode de réalisation particulier, un autre anticorps selon l'invention est l'anticorps EMAB603 produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Chacune des chaînes légères de l'anticorps EMAB603 est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. Cet anticorps chimérique entre en compétition avec l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 et possède une activité cytotoxique très supérieure à celle du rituximab, qui peut être attribuée pour partie à la glycosylation particulière du N-glycanne de la chaîne lourde de ces anticorps. En effet, le clone R603 a pour particularité de produire une composition d'anticorps EMAB603 possédant un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur à 0,6, pour lequel il a été démontré dans la demande de brevet FR 03 12229 qu'il est optimal pour conférer une forte activité ADCC aux anticorps. Cet anticorps peut être particulièrement intéressant comme outil thérapeutique pour le traitement du PIOL.
Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre la formation de lymphocytes T mémoires. Ces lymphocytes T mémoires peuvent posséder la capacité de proliférer, et de se réactiver de manière rapide lors d'une deuxième exposition aux cellules tumorales.
Avantageusement, les anticorps de l'invention peuvent permettre une infiltration de cellules T dans la tumeur, ce qui peut induire un ralentissement de la croissance tumorale, et une meilleure clairance des cellules tumorales. Avantageusement, un tel anticorps monoclonal peut avoir un effet antitumoral significatif. Par exemple, un tel anticorps peut permettre une inhibition de la réplication des cellules tumorales d'au moins 20%, ou au moins 30 %, ou encore au moins 50%, et de préférence d'au moins 60%, ou 70% chez le sujet atteint de lymphome intraoculaire auquel il est administré. De tels anticorps, ainsi qu'un procédé permettant leur fabrication, sont décrits dans le document WO 2006/064121.
Un exemple de vecteur d'expression d'un anticorps selon l'invention, est le vecteur de séquence SEQ ID NO : 17. Ce vecteur est un vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne légère est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 5, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 7, et dont la chaîne lourde est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 6, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 8. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6 codant chacune des chaînes lourdes de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. De plus, toute cellule de mammifère peut être utilisée comme cellule hôte, c'est-à-dire comme cellule exprimant l'anticorps selon l'invention, par exemple YB2/0, CHO, CHO dhfr- (par exemple CHO DX BII, CHO DG44) , CHO Lec13 , SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS.
Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps de l'invention peut être produit par co-expression dans une cellule de deux vecteurs d'expression, l'un premettant l'expression de la chaîne légère, et l'autre celle de la chaîne lourde de l'anticorps.Tout comme indiqué précédemment, ces vecteurs possèdent des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Tout comme indiqué précédemment, les vecteurs peuvent être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute cellule de mammifère, par exemple YB2/0, CHO, CHO dhfr- (CHO DX BII, CHO DG44) , CHO Lecl3, SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable exprimant un anticorps utilisé dans l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0, IR983F, un myélome humain comme Namalwa ou toute autre cellule d'origine humaine comme PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1 , CHO-LeCl O, CHO-Led , CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX BII, CHO DG44), ou d'autres lignées choisies parmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
De manière préférée, la lignée utilisée est l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.Ag.2O, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO. Les milieux de culture adaptés à ces cellules sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer de manière non exhaustives les milieux de culture RPMI 1640 (The Journal of the American Médical Association, 199, 519 (1967) [14]), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952) [15]), Dulbecco's modified MEM (Virology, 8, 396 (1959) [16]), F12 Médium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965) [17]), IMDM (J. Expérimental Medicine,
147, 923 (1978) [18]), ou encore ceux décrits dans le document EP1229125.
Un objet particulier de l'invention se rapporte à une méthode de traitement au moyen des anticorps précédemment décrits du lymphome intraoculaire primitif.
Avantageusement, la méthode de traitement comprend l'étape d'administration des anticorps à un patient atteint de PIOL.
Avantageusement, l'anticorps utilisé dans l'invention est administré avec un support pharmaceutiquement acceptable, approprié pour l'effet thérapeutique attendu.
A cet égard, l'anticorps utilisé dans l'invention peut être utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autre(s) anticorps, par exemple monoclonal(ux), dirigé(s) contre un ou plusieurs autre(s) antigène(s) exprimé(s) sur les cellules lymphoides, comme par exemple, de façon non limitative, les antigènes CD1 , CD2, CD3, CD4, CD8, CD1 1 , CD16, CD18, CD19, CD21 , CD22, CD23, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31 , CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69, CD70, CD71 , CD80, CD81 , CD82, CD86, CD95, CD103, CD118, CD1 19, CD120, CD132, CD210, CD217. Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps selon l'invention peut être utilisé en association avec des cellules exprimant des FcγR telles que les cellules NK, les cellules NKT (Natural Killers T) , les lymphocytes Tγδ, les macrophages, les monocytes ou les cellules dendritiques, c'est-à-dire en association avec une thérapie cellulaire (Peller S, Kaufman S Blood 1991 , 78:1569 ([8]) ; Kimby E et al. 1989 Leukemia 3 (7) :501-504 ([9]); Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) ;159-164 ([1O]) ; Ziegler HW et al. 1981 lnt J Cancer 27(3) ;321 -327 ([11]) ; Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9) : 1667-77 ([12]) ; Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9) :744-50 ([13])) .
Par ailleurs, la dose d'anticorps administrée aux patients est de préférence inférieure à 375 mg/m2, 187,5 mg/m2, à 75 mg/m2, à 37,5 mg/m2, 15 mg/m2, 7,5 mg/m2 ou de manière particulièrement avantageuse inférieure à 3,75 mg/m2 ou encore à 1 mg/m2 ou à 0,5 mg/m2. La dose administrée est avantageusement comprise entre 187,5 mg/m2 et 75 mg/m2, ou entre 75 mg/m2 et 37,5 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 15 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 7,5 mg/m2 ou encore entre 75 mg/m2 et 3,75 mg/m2. De préférence, la dose administrée est comprise entre 3,75 mg/m2 et 0,5 mg/m2, plus particulièrement comprise entre 2 mg/m2 et 1 mg/m2. Avantageusement, ces doses sont administrées en intraveineuses.
Avatageusement, quand l'anticorps est administré par voie intravitréenne, la quantité d'anticorps administrée au patient peut être comprise entre 0,001 μg et 1000 μg d'anticorps, ou encore entre 0,001 μg et 100 μg d'anticorps, ou encore comprise entre 10 μg et 100 μg d'anticorps, avantageusement comprise entre 0,01 μg et 10 μg d'anticorps, ou entre 1 μg et 10 μg, ou entre 0,01 μg et 1 μg, ou entre 0,01 μg et 0,1 μg ou encore entre 0,02 μg et 0,08 μg d'anticorps.
Avantageusement, l'administration de l'anticorps peut se faire dans l'œil atteint de la maladie.
La quantité d'anticorps administrée au patient peut être comprise entre 0,001 μg et 1000 μg d'anticorps, ou encore entre 0,001 μg et 100 μg d'anticorps, ou encore comprise entre 10 μg et 100 μg d'anticorps, avantageusement comprise entre 0,01 μg et 10 μg d'anticorps, ou entre 1 μg et 10 μg, ou entre 0,01 μg et 1 μg, ou entre 0,01 μg et 0,1 μg ou encore entre 0,02 μg et 0,08 μg d'anticorps par œil.
Avantageusement, on peut administrer entre entre 0,1 μg et 1000 μg d'anticorps / mL d'humeur vitrée, ou encore entre 0,1 μg et 100 μg d'anticorps / mL d'humeur vitrée, ou encore comprise entre 10 μg et 100 μg d'anticorps / mL d'humeur vitrée, avantageusement comprise entre 1 μg et 100 μg d'anticorps / ml_ d'humeur vitrée, ou entre 100 μg et 1000 μg / mL d'humeur vitrée, ou entre 1 μg et 100 μg / mL d'humeur vitrée, ou entre 1 μg et 10 μg ou encore entre 2 μg et 8 μg d'anticorps / mL d'humeur vitrée.
Avantageusement, l'administration se fait soit à dose unique, soit en injections répétées. Alternativement, chaque administration est suffisamment espacée de la précédente pour que chaque administration soit considérée comme une administration en dose unique. Par exemple, chaque administration peut être espacée d'au moins une semaine, ou d'au moins 2 semaines, d'au ou moins 3 semaines, ou d'au mois 4 semaines, ou d'au moins 6 semaines, ou d'au moins 10 semaines, ou d'au moins 6 mois.
Avantageusement, l'administration de l'anticorps peut être réalisée par voie intravitréenne, à une quantité de 0,02 μg d'anticorps par oeil ou de 0,002 mg d'anticorps / ml d'humeur vitrée. Avantageusement, chaque administration est espacée d'une semaine minimum, par exemple de 1 semaine, de 2 semaines, de 3 semaines, de 4 semaines ou de 5 semaines.
Le mode d'administration de l'anticorps utilisé dans l'invention peut être intraoculaire, par exemple par injection dans le corps vitré, par injection péri- et intra-oculaire, sous-conjonctivale, péri- ou latéro-bulbaire, rétro-bulbaire, par instillation de collyres, notamment par instillation intravitréenne, par iontophorèse, par implatation intrasclérale, par l'application d'une pommade ophtalmique, par injection intraveineuse rétinienne ou encore par application d'ultrasons.
L'anticorps peut être administré comme médicament selon les règles standard, bien connues de l'homme du métier, de traitement des lymphomes. Les anticorps utilisés dans l'invention ont pour particularité et avantage d'être cytotoxiques.
A ce titre, ils présentent la capacité d'activer, in vivo et in vitro, par leur région Fc le récepteur FcγRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface de cellules appelées " cellules effectrices " : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule effectrice provoque l'activation du FcγRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer), des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CD8, les lymphocytes Tγδ, les cellules NKT, les éosinophiles, les basophiles ou les mastocytes.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lymphome intraoculaire primitif.
Par ailleurs, un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'un médicament destiné au traitement du lymphome intraoculaire primitif, consistant à mélanger l'anticorps monoclonal utilisé dans l'invention avec un support pharmaceutiquement acceptable, puis à obtenir le médicament.
Un autre objet de l'invention est une méthode de traitement thérapeutique du lymphome intraoculaire primitif, comprenant l'administration, à un patient en présentant le besoin, d'un anticorps ou d'un médicament tel que décrit ci-avant.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
- La figure 1 est la représentation schématique du vecteur CKHu utilisé pour la chimérisatiόn de la chaîne légère kappa des anticorps EMAB603.
- La figure 2 est la représentation schématique du vecteur G1 Hu utilisé pour la chimérisation de la chaîne lourde des anticorps EMAB603. - La figure 3 est la représentation schématique du vecteur d'expression des chaînes lourdes et légères utilisé pour la production de l'anticorps EMAB603.
- La figure 4 représente le nombre absolu des cellules oculaires tumorales (x10"6) dans des modèles murins de PIOL après injection de PBS 1X, de l'anticorps LFB_R603 (20 μg) ou de l'anticorps Rituxirήab (20 μg), dans l'œil ayant développé la tumeur. Les résultats sont issus d'un pool de 2 expériences. - La figure 5 représente le nombre absolu des cellules oculaires tumorales (x106) dans des modèles murins de PIOL après injection de tampon de l'anticorps LFB R603 ou de l'anticorps LFB R603 à des doses de
0,02 μg et 0,2 μg, dans l'œil ayant développé la tumeur. Les résultats sont issus d'un pool de 6 expériences.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction des vecteurs d'expression de l'anticorps chimériques anti-CD20 EMAB603
A. Détermination de la séquence des régions variables de l'anticorps murin
CAT-13.6E12
L1ARN total de l'hybridome murin CAT-13.6E12 (fournisseur : DSMZ, réf. ACC 474) produisant une immunoglobuline de type lgG2a,κ a été isolé
(kit RNAeasy, Qiagen réf. 74104). Après transcription inverse, les domaines variables des chaînes légères (VK) et lourdes (VH) de l'anticorps CAT- 13.6E12 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit GeneRacer, Invitrogen réf. L1500-01). Les amorces utilisées pour ces deux étapes sont les suivantes :
1. amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 9) 5' - ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 10) 5'- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3*
2. amorces de PCR 5'RACE a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 11) 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 12) 51- GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG -31
Les produits de PCR VH et VK ainsi obtenus ont été clones dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO (Zéro blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, réf. K2875-
20) puis séquences. La séquence nucléotidique de la région VK de l'anticorps murin CAT-13.6E12 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO :
1 , hormis le dernier nucléotide qui est remplacé par A (AAA au lieu de AAC) .
Le gène VK appartient à la famille Vκ4 (Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [19]). La séquence nucléotidique de la région VH de CAT-13.6E12 est la séquence
SEQ ID NO : 2. Le gène VH appartient à la famille VH1 ([19]).
B. Construction des vecteurs d'expression des chaînes lourdes et des chaînes légères des anticorps chimériques EMAB603
1. Vecteur chaîne légère Kappa de l'anticorps EMAB603 La séquence VK clonée dans le vecteur de séquençage pCR4Blunt-TOPO a été amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes :
a) amorce sens VK (SEQ ID NO : 13)
5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACC/\ΓGGATTTTCAAGTGCAGATTTTC
AG -3'
La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I1 la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, I1ATG initiateur est en italiques.
b) amorce antisens VK: (SEQ ID NO : 14)
5'- TGAAGAÇAÇJJGGIGCAGCCACAGTCCGgT7T/\ TTTCCAGCCTGGT - 3' Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III.
Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III.
Le produit de PCR VK ainsi obtenu contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12, avec la mutation AAC -> AAA (nucléotide encadré dans la séquence de l'amorce antisens SEQ ID NO : 14) qui correspond à la mutation N106K par rapport à la séquence naturelle Vκ de CAT-13.6E12.
La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 5 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 7.
Cette PCR VK a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Dra III du vecteur de chimérisation chaîne légère (Fig. 1) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 1 , en 5' de la région constante CK humaine, dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 4. La séquence CK humaine de ce vecteur de chimérisation avait été préalablement modifiée par mutagénèse silencieuse afin de créer un site de restriction Dra III pour permettre le clonage de séquences VK murines. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection dhfr (dihydrofolate reductase) .
2. Vecteur chaîne lourde
Une démarche similaire a été appliquée pour la chimérisation de la chaîne lourde de l'anticorps EMAB603. La séquence VH clonée dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO a été tout d'abord amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VH (SEQ ID NO :15) 5'- CTCAGTACTAGTGCCGCCACC^TGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3
La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italique.
b) amorce antisens VH (SEQ ID NO :16) 5'-
GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCΓGΛGGAGΛCGGTGΛCΓGΛGGΓΓC
C -3'
Cette amorce réalise la jonction des séquences VH murine (en italique) et région constante Gl humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Apa I .
Le fragment VH amplifié contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Cette PCR VH a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Apa I du vecteur de chimérisation chaîne lourde (Fig. 2) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 2, en 5' de la région constante γl humaine dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 3. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection néo. (
La séquence de la chaîne lourde de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présenté en SEQ ID NO : 6 pour la séquence nucléotidique et en séquence SEQ ID NO : 8 pour la séquence peptidique déduite. 3. Vecteurs d'expression finaux
Vecteur d'expression de l'anticorps EMAB603 Un vecteur d'expression unique contenant les deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère de l'anticorps anti-CD20 EMAB-603 a été construit à partir des deux vecteurs de chimérisation de la chaîne légère et de la chaîne Ce vecteur d'expression HK463-25(FDA) présente deux gènes de sélection, néo (neo-phosphotransphérase II) et dhfr (dihydrofolate reductase) ainsi que deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère sous le contrôle d'un promoteur RSV (Figure 3).
Exemple 2 : Création de lignées cellulaires dérivées de la lignée YB2/0 productrices de l'anticorps chimérique anti-CD20 EMAB603
La lignée de rat YB2/0 (ATCC # CRL-1662) a été cultivée en milieu EMS (Invitrogen, réf. 041-95181 M) contenant 5% de sérum de veau foetal (JRH Biosciences, réf. 12107). Pour la transfection, 5 millions de cellules ont été électroporées (électroporateur Biorad, modèle 1652077) en milieu Optimix (Equibio, réf. EKITE 1) avec 25 μg de vecteur chaîne légère, pRSV- HL-EMAB-603 pour l'expression de l'anticorps EMAB603. Les conditions d'électroporation appliquées étaient de 230 volts et 960 microfarads pour une cuvette de 0,5 ml. Chaque cuvette d'électroporation a été ensuite répartie sur 5 plaques P96 avec une densité de 5000 cellules/puits. La mise en milieu sélectif RPMI (Invitrogen, ref 21875- 034) contenant 5% de sérum dialyse (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 μg/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131- 027) et 25 nM de methotrexate (Sigma, réf. M8407), a été réalisée 3 jours après la transfection.
Les surnageants des puits de transfection résistants ont été criblés pour la présence d'immunoglobulines (Ig) chimériques par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines. Les 10 transfectants produisant le plus d'anticorps ont été amplifiés en plaques P24 et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules/plaque) .
A l'issue du clonage, le clone R603 a été sélectionné pour la production de l'anticorps chimérique EMAB603 et adaptés progressivement au milieu de production CD Hybridoma (Invitrogen, réf. 11279-023). La production des anticorps chimériques EMAB603 a été réalisée par expansion de la culture adaptée en milieu CD Hybridoma, obtenue par dilution à 3xlO5 cellules/ml en flacons de 75 cm2 et 175 cm2 puis par dilution à 4,5x105 cellules/ml en flacon de type roller. Après avoir atteint le volume maximal, la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la viabilité cellulaire ne soit plus que de 20%. Après production, les anticorps chimériques EMAB603 ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur protéine A (pureté estimée par HPLC < 95 %) et contrôlés par électrophorèse en gel de polyacrylamide.
Exemple 3 : Etude de l'efficacité des anticorps LFB_R603 et Rituximab dans un modèle murin de PIOL d'après un premier protocole expérimental
Matériels et méthodes
Lignée cellulaire
Les cellules IIA1.6 sont dérivées de la lignée lymphomateuse B murine
A20-2J (Jones C. et al. « Différent phenotypic variants of the mouse B cell tumor A20/2J are seletced by antigen- and mitogen-triggered cytotoxicity of L3T4-positive, l-A-restricted T cell clones. J. Immunol. 1986; 136-348-356, [21]). Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI (Roswell Park Mémorial Institute médium, Glutamax ; invitrogen-Gibco, Cergy Pontoise, France), supplémenté avec 10% de sérum de veau (FCS ; PAA Laboratories, Cόlbe, Germany), pénicilline 100U :ml_, et streptomycine 100 μg :ml_ (Eurobio, Les UNs, France), 10 mM de pyruvate de sodium (Invitrogen- Gibco), et 50 mM de mercaptoéthanol (Invotrogen-Gibco), et sont maintenues à 37°C avec 5% de CO2 (Touitou et al. « Impaired Th1/Tc1 cytokine production of tumor-infiltrating lymphocytes in a model of primary intraocular B-cell lymphoma, Investigative Ophtalmology & Visual Science, JuIy 2007, vol. 48, no. 7, [22]).
Transfection
Les cellules IIA1.6 sont transfectées par nucleofection, au moyen d'un plasmide de 3,5kb pmax GFP (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany), sous le contrôle d'un promoteur de cytomegalovirus (CMV), et au moyen d'un plasmide portant le gène codant pour le CD20 humain. Lorsqu'elles sont illuminées avec un laser Argon à 488 nm, les molécules de GFP (Green Fluorescent Protein) émettent dans les longueurs d'ondes du vert à 510 nm et permettent la détection des cellules transfectées in vivo. Après transfection, les cellles sont cultivées dans un milieu de culture contenant 0,5 mg/ml de néomycine (G418). Les clones exprimant de forts taux de GFP et de CD20 humain (hCD20) sont obtenus par dilution limite et sont dénomés A20.IIA-GFP-hCD20.
Souris
Des femelles de souris BALB/c (H2d) âgées de 6 à 12 semaines sont obtenues pas le Charles River Laboratories (L'ArbresIe, France). Les souris sont nourries ad libitum avec de la nourriture stérile et de l'eau filtrée, et tenues en cycles de 12 heures lumière-noir. Toutes les souris sont manipulées selon les Directives de l'Union européenne et le « ARVO Statement for the Use of Animais in Ophtalmie and Vision Research ». Injections intravitréennes et évaluation clinique
L'anésthésie est réalisée par injection intrapéritonéale d'une combinaison de kétamine à 120 mg/kg (Imalgene 1000 ; Merial, Lyon, France) et de xylazine à 6 mg/kg (Rompun 2% ; Bayer, Leverkusen, Germany). Les cellules tumorales (104 cellules) sont incubées dans 2 μL 1X de PBS (pH 7,4), et sont injectées en intravitréenne à travers le pars plana avec l'aide d'un microscope à dissection.
L'injection est réalisée dans des conditions asceptiques dans l'œil droit après dilatation avec du tropicamide à 0,5% (Théa, Clermont-Ferrand,
France), à travers une auguille de 32 gauge attachée à une seringue
(Hamilton ; Hamilton Bonaduz, Switzerland). On injecte aux souris contrôle en intravitréenne 2 μL PBS dans l'œil droit. Des gouttes de rifamycine
(Merck, Sharp & Dohme-Chribert, Clermont-Ferrand, France) sont instillées après l'injection.
Un examen par lampe à fente est réalisé à intervalles réguliers, incluant un examen bilatéral du fond de l'œil de chaque souris. La progression clinique est graduée selon un score clinique d'engagement oculaire.
7 jours après l'injection intravitréenne des cellules A20.IIA-GFP-hCD20, les souris sont réparties en 3 groupes : un groupe de 8 souris reçoivent une injection de PBS 1X (2 μL) dans l'œil ayant reçu les cellules tumorales, 16 souris reçoivent une injection d'anticorps LFB R603 (également appelé « EMAB603 ») à 20 μg/2 μL dans l'œil ayant reçu les cellules tumorales, et 8 souris reçoivent une injection de l'anticorps Rituximab à 20 μg/2 μL.
8 jours après l'injection du PBS, de l'anticorps LFB_R603 ou de l'anticorps Rituximab, les souris sont euthanasiées par dislocation cervicale.
Histologie
Après la mort, les yeux sont collectés, fixés dans du paraformaldéhyde à 4% contenant 5% de sucrose pendant 2 heures, et enchâssés dans une résine pour l'histologie fine selon les indications du fournisseur (Historesin embedding kit, Leica Microsystems, Heidelberg, Germany). Les sections sérielles (5 μm) sont marquées avec de la toluidine bleue. L'examen microscopique des sections des yeux est alors réalisée (Leitz microscope ; Aristoplan, Rueil-Malmaison, France). Les images sont collectées (DFC480 Leica, avec un logiciel IM50 Image manager ; Leica Microsystems).
Immunohistochimie
Les yeux énucléés sont fixés dans une solution contenant 4% de paraformaldéhyde et 5% de sucrose pendant 2 heures, puis immergés une nuit dans du PBS contenant 15% de sucrose. Les échantillons sont enchâssés et congelés dans un composé adapté (Tissue-Tek ; Sakura Finetek, Zoeterwoude, The Nederlands) et stockés à -800C. Les sections congelées antéro-postérieures (10 μm d'épaisseur) des yeux au niveau du nerf optique sont coupées avec un cryostat (CM2050S ; Leica, Wetzlar, Germany) et montées dans des slides couvertes de gélatine pour analyse immunohistochimique. Pour l'immunomarquage, les coupes tissulaires sont incubées avec un anticorps monoclonal (mAb) purifié de rat dirigé contre les cellules T (clone CD4 GK1.5, clone CD8 53-6-7 ; BD Biosciences, Le Pont- de-Claix, France), des macrophages (clone F4/80) et des polynucléaires neutrophiles (clone 7/4 ; Serotec, Cergy Saint-Christophe, France). La révélation est réalisée avec un anticorps conjugué anti-souris Alexa594 (Invitrogen-Gibco).
Dans certaines expériences, les slides sont incubées avec l'agent de marquage nucléaire iodine de propidium (Invitrogen-Molecular Probes, Eugène, OR). Les expériences de contrôle négatif sont réalisées par incubation des coupes tissualires avec un mAb isotype contrôle. Les sections sont montées dans du PBS contenant 5% de glycérol et observées par photomicroscopie à fluorescence (FXA, Microphot ; Nikon, Melville, NY). Microscopie confocale et analyse d'images
La microscopie confocale est réalisée sur des sections d'yeux congelées avec un microscope confocal à balayage laser (LSM510 ; Cari Zeiss Méditée, GmbH, Oberkochen, Germany), équipé d'un laser argon (488 nm) et d'un laser à hélium-néon (543 nm). Les images sont fusionnées avec un logiciel image-browser (LSM ; Cari Zeiss Méditée, GmbH) pour produire une image composite multicolore.
Cytométrie en flux
Les yeux sont disséqués dans du milieu RPMI, digérés avec 0,1 mg/mL de DNase I (Roche, Meylan, France) et 1 ,67 unités de Wϋnsch/mL d'enzymes purifiées (Liberase, Roche) à 37°C pour 20 minutes, filtrés et rincés dans du PBS avec 2 mM d'EDTA et 3% de FCS (fetal calf sérum).
Les cellules sont pré-incubées avec 2.4G2 mAb (10 μg/mL) pour bloquer la liaison non spécifique aux récepteurs Fc puis 105 cellules par puits sont marquées avec les mAbs suivants : anti-CD3 conjugués à la biotine (145-2C11 ; BD Biosciences), anti-CD4 conjugué à la phycoérythrine (GK1 ,5 ; BD Biosciences), anti-CD8 conjugué au fluorochrome (Cy-Chrome) (53-6.7 ; BD Biosciences), anti-CD19 conjugué à la phycoérythrine (6D5 ; e- Bioscience, San Diego, CA), anti-CD20 conjugué à la phycoérythrine (LFB_R603, LFB SA) ou les mAb isotypiques contrôle correspondants (BD Biosciences). Les analyses de cytométrie en flux (FACSCalibur) sont réalisées avec les logiciels CelIQuest et FACS Diva (BD Biosciences).
Résultats
Développement intraoculaire d'un lymphome de cellules B dans les injections intravitréennes de cellules A20.IIA-GFP-hCD20 Afin de générer un modèle de lymphome intraoculaire, des souris immunocompétentes normales BALB/c (H2d) reçoivent une injection intravitréenne de la lignée syngénique de lymphome de cellule B A20.IIA-
GFP-hCD20, exprimant le CD20 humain. Ces cellules exprimant également la GFP, il est possible de discriminer les cellules B de lymphomes
(CD19+GFP+), des cellules B des cellules B normales de l'hôte (CD19+GFP").
Les cellules B A20.IIA-GFP-hCD20 sont détectées par cytométrie en flux dans tous les yeux ayant été inoculés, par double détection de la GFP et de CD19. Le pourcentage de cellules lymphomateuses intraoculaires est corrélé sous forme dose-réponse au nombre de cellules intitiallement injectées dans les yeux droits à une dose initiale de 104 cellules. Les résultats sont reproductibles, avec le développement de lymphome intraoculaire dans tous les yeux ayant reçu l'injection avec les cellules A20.IIA-GFP-hCD20. Le modèle mime donc de manière très proche le PIOL humain
Efficacité de l'anticorps LFB R603 pour traiter in vivo le PIOL
Dans le modèle de PIOL obtenu par l'injection de cellules B lymphomateuses exprimant le CD20 humain, 8 souris reçoivent une injection avec du PBS 1X, 16 souris sont traitées avec l'anticorps LFB R603 (20μg/2μL), et 8 souris sont traitées avec l'anticorps Rituximab (20μg/2μL).
Le nombre absolu de cellules tumorales est mesuré dans les yeux, pour chaque groupe testé dans un pool de 2 expériences indépendantes nommées LC_08 et LC 09, réalisées selon le protocole détaillé ci-dessus, et comparé par test statistique de Mann-Whitney.
La figure 4 représente le nombre de cellules tumorales parmi le nombre total de cellules vivantes après injection de PBS, ou après traitement au moyen de l'anticorps LFB_R603 ou de l'anticorps Rituximab.
Le pourcentage d'inhibition de la réplication des cellules tumorales est donné dans le tableau I. Tableau I
Figure imgf000031_0001
Test statistique : Mann-Whitney NS signifie : non significatif
Aucune inhibition n'est observée chez les souris ayant reçu du PBS
1X.
Aucun effet anti-tumoral significatif n'est observé chez les souris traitées avec l'anticorps Rituximab.
Un effet anti-tumoral significatif est observé quand les souris sont traitées avec l'anticorps LFB_R603.
Exemple 4 : étude de l'efficacité des anticorps LFB R603 et Rituximab dans un modèle murin de PIOL d'après un second protocole expérimental
Matériels et méthodes
Un modèle de PIOL est obtenu par l'injection de cellules B lymphomateuses exprimant le CD20 humain dans des yeux de souris selon le protocole détaillé dans l'exemple 3. Dans ce second protocole expérimental, 4 jours après l'injection intravitréenne des cellules A20.IIA-GFP-hCD20, les souris sont réparties en 3 groupes : un groupe de 46 souris reçoivent une injection avec du tampon de l'anticorps LFB_R603, 16 souris sont traitées avec l'anticorps LFB_R603 (0,02μl_/2μl_) et 32 souris sont traitées avec l'anticorps LFB_R603 (0,2μg/2μL).
12 jours après l'injection du du tampon de l'anticorps LFB_R603, de l'anticorps LFB_R603 à 0,02μl_/2μL ou de l'anticorps LFB_R603 à 0,2μg/2μL, les souris sont euthanasiées par dislocation cervicale.
Résultats
Comme détaillé dans l'exemple 3, les souris dévelopent un lymphome intraoculaire de cellules B, suite aux injections intravitréennes de cellules A20.MA-GFP-hCD20 (exprimant donc le CD20 humain).
Le nombre absolu de cellules tumorales est mesuré dans les yeux ayant reçu les cellules de lymphome, pour chaque groupe testé dans un pool de 6 expériences indépendantes nommées LC 12, LC_14, LC 15, LC_16,
LC_19 et LC_20, réalisées selon le protocole détaillé ci-dessus, et comparé par test statistique de Mann-Whitney.
La figure 5 représente le nombre de cellules tumorales parmi le nombre total de cellules vivantes après traitement au moyen du tampon de l'anticorps LFB_R603, et de l'anticorps LFB_R603 (0,02μg et 0,2μg).
Le pourcentage d'inhibition de la réplication des cellules tumorales est donné dans le tableau II.
Tableau II
Figure imgf000033_0001
Test statistique : Mann-Whitney NS signifie : non significatif
Le regroupement de ces expériences montre que le traitement au moyen de l'anticorps LFB-R603 a un effet anti-tumoral significatif 12 jours après le traitement même injecté à faible concentration (0,02 μg/2μL et 0,2μg/2μL).
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Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1 , dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine, pour le traitement du lymphome intraoculaire primitif.
2. Anticorps selon la revendication 1 , dont les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes sont des régions constantes humaines.
3. Anticorps selon la revendication 1 ou 2, dont la région constante de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 et dont la région constante de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques humaine SEQ ID NO : 4.
4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et dont chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6.
5. Anticorps selon la revendication 4, dont chacune des chaînes légères est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et dont chacune des chaînes lourdes est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8.
6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HLP2.G11.16Ag.2O, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL- 1662).
7. Anticorps selon la revendication 5, produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM).
8. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications
1 à 7, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du lymphome intraoculaire primitif.
9. Méthode de traitement thérapeutique du lymphome intraoculaire primitif, comprenant l'administration, à un patient en présentant le besoin, dudit anticorps ou d'un médicament comprenant ledit anticorps, tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.
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