FR2906533A1

FR2906533A1 - Procede de generation d'anticorps actifs contre un antigene de resistance,anticorps obtenus par ledit procede et leurs utilisations

Info

Publication number: FR2906533A1
Application number: FR0608514A
Authority: FR
Inventors: Liliane Goetsch; Alexandra Jouhanneaud
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2008-04-04
Anticipated expiration: 2026-09-28
Also published as: US8808667B2; TW200822934A; MA30954B1; FR2906533B1; EP2494984B1; EP2494984A1; US20130028835A1; IL197790A0; WO2008046724A1; HK1131063A1; EP2491945B9; AU2007312437C1; CN101516394A; BRPI0717246A2; EP2497491A1; AR063061A1; ZA200902697B; AU2007312437B2; AU2007312437A1; RU2009114682A

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un broyat et/ou d'une suspension et/ou d'un lysat cellulaire issu(e) d'une tumeur résistante à au moins un composé anti-tumoral pour immuniser et générer in vitro un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral exprimé spécifiquement à la surface de ladite tumeur résistante et susceptible d'être impliqué dans la résistance de ladite tumeur résistante.Plus particulièrement, la présente invention vise de tels anticorps obtenus par mise en oeuvre du procédé, comme les anticorps 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 et 3G7, ainsi que leur utilisation pour le traitement du cancer.

Description

1 La présente invention est relative à une nouvelle approche de génération

d'anticorps, notamment monoclonaux, à visée thérapeutique et/ou diagnostique. Plus particulièrement, la présente invention vise la génération d'anticorps dirigés contre un antigène tumoral absent à la surface de cellules tumorales de tumeurs natives et qui apparaîtrait après un traitement anti-tumoral de ces tumeurs natives, antigène qui serait également susceptible d'être impliqué dans la résistance des tumeurs à ces traitements anti-tumoraux.. L'invention comprend également de tels anticorps ainsi que l'utilisation de ces anticorps à titre de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de tumeurs résistantes. L'invention comprend enfin des compositions comprenant de tels anticorps pouvant être associés avec des agents anti-cancéreux et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains cancers. La découverte des anticorps et, plus particulièrement, la mise au point de procédés de génération d'anticorps, a consisté en une révolution dans le traitement thérapeutique ou le diagnostic et, plus spécifiquement dans le cadre du cancer. En effet, ce nouvel outil apportait pour la première fois la possibilité d'un traitement ciblé de par la propriété intrinsèque de reconnaissance des anticorps. Un challenge majeur de ces dernières décennies a consisté à développer des procédés de génération d'anticorps, que ce soient des anticorps polyclonaux dans un premier temps, des anticorps monoclonaux ou encore des fragments d'anticorps ou structures analogues.

A ce jour, plusieurs technologies ont été développées par l'homme de l'art pour pouvoir générer des anticorps à visée thérapeutique et/ou diagnostique. Les anticorps les plus anciens consistent en des anticorps polyclonaux, c'est-à-dire des populations hétérogènes d'anticorps contenues dans des sérums d'animaux immunisés. Pour ce faire, plusieurs animaux (souris, rat, lapin, chèvre, ...) sont immunisés par injection d'un antigène donné, naturel ou synthétique, en combinaison avec un ou plusieurs adjuvant(s), comme l'adjuvant de Freund ou l'hydroxide d'aluminium, visant à favoriser et augmenter la réponse immunitaire. Les animaux sont ensuite saignés et un sérum û ou antisérum - contenant à la fois des anticorps reconnaissant plus ou moins efficacement plusieurs épitopes de l'antigène (anticorps polyclonaux) et d'autres anticorps de l'animal est récupéré. La purification des anticorps obtenus se réalise, par exemple, par purification par chromatographie d'affinité. 2906533 2 Une première évolution a consisté en la génération d'anticorps monoclonaux pouvant être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MIELSTEIN (1975). Cette technique permet de générer des anticorps monoclonaux spécifiques d'un antigène prédéterminé et consiste à fusionner un clone d'un 5 lymphocyte B avec une cellule myélomateuse de manière à obtenir une cellule appelée hybridome. Cet hybridome présente non seulement la caractéristique d'être immortel mais également de produire en permanence des anticorps monoclonaux et donc monospécifiques. D'autres techniques basées sur le même principe ont également été décrites 10 comme la technique du trioma ou bien encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983). Ces techniques, initialement appliquées à la génération d'anticorps murins, ont évolué pour aboutir à la génération d'anticorps chimériques, humanisés ou encore humains. Toutes ces techniques sont bien connues, à ce jour, de l'homme de l'art. 15 Les anticorps humains peuvent être obtenus en utilisant la technologie des souris génétiquement modifiées, dite xenomouse telle que décrite dans les brevets US 5,814,318 et US 5,939,598. D'autres procédés récents ont été également développés pour générer des anticorps monoclonaux humains, et plus particulièrement des fragments d'anticorps, 20 comme les techniques utilisant des banques ou librairies de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou la technologie dite du phage display basée sur l'extraction d'ARNm d'un répertoire de cellules humaines issues du sang périphériques, la construction d'une banque ou librairie d'ADNc comprenant les séquences des régions variables et l'insertion des ADNc dans des phages pour produire les régions variables 25 des anticorps sous forme de fragments, préférentiellement des fragments Fab. Bien que ces procédés soient différents, ils présentent tous la même caractéristique, à savoir d'immuniser avec un antigène connu ou, dans le cadre des Iibrairies ou des banques, de cribler ces banques avec ce même antigène connu et défini. La présente invention se distingue de ces procédés de par l'utilisation, non plus 30 d'un antigène connu et défini, mais directement de tout ou partie d'une tumeur. Plus particulièrement, la présente invention vise l'utilisation directe d'un lysat et/ou d'une 2906533 3 suspension et/ou d'un broyat cellulaire issu(e) d'une tumeur. Dans le traitement du cancer, il est observé depuis plusieurs années qu'un certain nombre de patients qui, après avoir développé une réponse complète et satisfaisante suite à un premier traitement thérapeutique, ont tendance à faire une rechute. Plus particulièrement, il est 5 connu que les tumeurs sont capables de modifier leur génotype et/ou leur phénotype afin de résister aux différents traitements qui leur sont appliqués. Ce phénomène existe à la fois pour les traitements de type radiothérapie, chimiothérapie, mais également pour les traitements à l'aide d'anticorps monoclonaux. Historiquement, les premiers composés de chimiothérapie pour le traitement du 10 cancer ont fait l'objet d'essais cliniques dans les années 1940. Il s'agissait principalement d'agents de faible demie-vie tels que les corticostéroïdes, les antifolates ou encore les alcaloïdes de vinca. Cependant, même lorsqu'une rémission complète était obtenue, celle-ci ne durait généralement pas plus d'une année et une rechute systématique était observée, rechute associée à une résistance au composé de 15 chimiothérapie employé pour le traitement (Lehnert M., Eur. J. Cancer, 1996, 32A:912-920). En réponse à ce phénomène, il a été envisagé de réaliser des traitements dits de combinaison par l'utilisation de différents composés anti-tumoraux. De meilleurs résultats ont effectivement été obtenus par l'utilisation, simultanée ou séquencée, de 20 différents composés. En effet, dans le cas de l'utilisation de différents composés antitumoraux ayant chacun une activité cytotoxique mais des mécanismes d'action différents, une cellule tumorale résistante à un composé pourra toujours être sensible à au moins l'un des autres composés utilisés. Cependant, malgré l'utilisation de différents composés ou agents anti-tumoraux, 25 la résistance des tumeurs reste un problème majeur dans le cadre des traitements par chimiothérapie. L'utilisation de combinaisons a pour effet de retarder l'apparition des phénomènes de résistance mais ne les fait pas disparaître. La résistance aux chimiothérapies, soit liée au traitement initial soit apparaissant au moment de la rechute après une réponse initiale favorable, se produit dans pratiquement tous les cancers dits 30 curables . 2906533 4 Il peut être cité, à titre d'exemple, les demandes de brevet WO 2005/077385, WO 2004/026293 ou encore WO 2004/110497 qui illustrent bien cette recherche de nouvelles méthodes pour lutter contre les phénomènes de résistance, toutes ces demandes reposant sur le principe d'une injection supplémentaire d'une nouvelle 5 molécule, généralement chimique. Différents mécanismes d'acquisition d'une résistance chez une tumeur initialement sensible à un traitement ont été mis en évidence. L'hypothèse la plus largement reconnue implique que ce phénomène de résistance résulterait d'accumulations spontanées et faites au hasard, de mutations somatiques dans le 10 génotype de la cellule tumorale (Cancer Chemotherapy and Biotherapy : Principles and practice, Chabner & Lango editors, 1996, chapter 1). Un autre phénomène de résistance connu et décrit, appelé MDR (d'après la nomenclature anglaise MultiDrug Resistance ) repose sur la capacité de la cellule tumorale à survivre à des concentrations létales d'une grande quantité de composés 15 cytotoxiques pharmacologiquement, chimiquement ou encore structurellement différents. Les cellules montrant une MDR présentent une diminution de l'accumulation intracellulaire en composés cytotoxiques résultant de l'expulsion desdits composés par des protéines de transport. Ces protéines, appelées transporteurs multidrug sont des protéines membranaires capables d'expulser de la cellule une large 20 gamme de molécules toxiques. Ces transporteurs multi-drug appartiennent à la famille des protéines de transport ATP-binding cassette (ABC) super farnily qui utilisent l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP pour leur activité. Plusieurs mécanismes ont été présentés comme responsables de cette MDR . Le gène le plus connu et le plus documenté comme conférant une telle résistance liée à un mécanisme d'expulsion 25 dépendant de 1'ATP est le gène MDR1. Parallèlement à ces phénomènes de résistance induite par un traitement de chimiothérapie, il a également été décrit une résistance induite suite à un traitement par un anticorps monoclonal. Cette résistance peut être liée à la nature de l'hôte, à des considérations pharmacologiques ou bien peut être intrinsèque de la tumeur même. 30 En premier lieu, les premières utilisations d'anticorps concernant des anticorps murins, il en résultait une réponse anticorps contre lesdits anticorps murins, réponse dite 2906533 5 HAMA (d'après la nomenclature anglaise Human Anti-Mouse Antibody ). Cette forme de résistance, liée à l'hôte, a été en partie réglée par l'utilisation d'anticorps non plus murins, mais humains ou humanisés. Les différents essais avec de tels anticorps humains ou humanisés ont mis en 5 évidence de nouveaux phénomènes par lesquels la tumeur peut résister à des traitements immunologiques. Ces nouveaux mécanismes reposent principalement sur des mutations induites au niveau de la tumeur, une activation constitutive des récepteurs consécutive à un phénomène de clivage (ou shedding ) ou encore une perte de l'expression de l'antigène ciblé. 10 Comme il ressortira de l'exemple 1 ci-après, des études menées par la Demanderesse montrent, par exemple, qu'une tri-thérapie anti-IGF-1R, EGFR et Her/2neu permet de réduire considérablement la croissance tumorale des cellules A549 chez la souris Nude allant jusqu'à entraîner une disparition totale des tumeurs chez 90 % des animaux traités. Bien que cette thérapie multiple soit significativement plus 15 efficace qu'une mono-thérapie ou une bi-thérapie, il apparaît que les tumeurs, qui avaient pourtant complètement régressé réapparaissent progressivement malgré la poursuite du traitement : elles sont devenues résistantes au traitement multiple. Partant de cette observation, la Demanderesse envisage, pour la première fois, d'utiliser directement de telles tumeurs résistantes pour générer des anticorps, 20 préférentiellement des anticorps monoclonaux, thérapeutiques et/ou diagnostiques capables de reconnaître des antigènes dont l'expression serait induite à la surface des cellules tumorales de cette tumeur résistante à un traitement anti-tumoral, et qui seraient non exprimés à la surface des cellules tumorales de la tumeur native (non traitée), ces antigènes pouvant être également impliqués dans la résistance de la tumeur à ces 25 traitements anti-tumoraux. Selon un premier aspect, la présente invention a donc comme objet l'utilisation d'un broyat et/ou d'une suspension et/ou d'un lysat cellulaire issu(e) d'une tumeur résistante à au moins un composé anti-tumoral pour immuniser et générer in vitro un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral 30 exprimé à la surface des cellules tumorales de ladite tumeur résistante, cet antigène tumoral étant de préférence non exprimé à la surface des cellules tumorales de la tumeur 2906533 6 native dont est issue la tumeur résistante, cet antigène tumoral étant susceptible d'être impliqué dans la résistance de ladite tumeur résistante au composé anti-tumoral. Par l'expression broyat ou broyat cellulaire , il faut comprendre un mélange de cellules et/ou fragments cellulaires issus de tumeurs (xénogreffes, greffes 5 orthotopiques, greffes syngéniques, pièces opératoires issues de patients traités chez lesquels apparaît une récurrence tumorale ou de cultures cellulaires) obtenus par dissociation mécanique, comme par exemple avec un broyeur type Potter , à ultrasons, de type Ultraturax , etc. Par l'expression suspension ou suspension cellulaire , il faut comprendre 1 0 une suspension de cellules obtenues après culture in vitro en présence ou en absence de traitement et décollées de leur support par des solutions enzymatiques ou des solutions de dissociation non enzymatique. Par l'expression lysat ou lysat cellulaire , il faut comprendre un mélange de cellules et/ou fragments cellulaires issus de tumeurs (xénogreffes, greffes 15 orthotopiques, greffes syngéniques, pièces opératoires issues de patients traités chez lesquels apparaît une récurrence tumorale ou de cultures cellulaires) obtenus par dissociation enzymatique. Par tumeur résistante , il faut comprendre une tumeur qui ne répond pas ou plus au(x) traitement(s) qui lui est(sont) appliqué(s). Comme décrit plus haut, une telle 20 résistance peut être observée que ce soit après un traitement de chimiothérapie, de radiothérapie, d'hormonothérapie ou bien encore par l'utilisation particulière d'anticorps, ces traitements pouvant être appliqués de manière isolée ou bien sous forme de combinaisons. Divers mécanismes, connus ou non à ce jour, peuvent être à l'origine de cette capacité de résistance. Enfin, cette résistance peut se traduire par une perte ou 25 une diminution de l'effet du traitement initialement appliqué. Bien entendu, les phénomènes connus et décrits d'échappement font partie des phénomènes de résistance que l'invention cherche à combattre. Par tumeur native (ou tumeur mère), on entend désigner ici la tumeur dont est issue la tumeur résistante, la tumeur native n'ayant pas subi de traitement anti-tumoral 30 par opposition à la tumeur résistante. 2906533 7 Par antigène tumoral, on entendra désigner ici en particulier les antigènes exprimés à la surface des cellules tumorales, qu'elles soient issues de la tumeur native ou de la tumeur résistante, cet antigène tumoral étant non exprimé à la surface des cellules saines. Ces antigènes tumoraux sont généralement des macromolécules 5 naturelles (pouvant être synthétisées) auxquelles un anticorps peut se lier spécifiquement. L'antigène tumoral peut être notamment un polypeptide, un polysaccharide, un carbohydrate, un acide nucléique, un lipide, un haptène ou tout autre composé présent de manière naturelle à la surface de cellule tumorale. Enfin, les expressions "anticorps" ou "immunoglobuline" sont utilisées ici de 10 manière interchangeable dans leur sens le plus large et comprennent les anticorps monoclonaux (par exemple les anticorps monoclonaux entiers ou intacts), les anticorps polyclonaux, les anticorps multivalents, les anticorps multispécifiques (par exemple les anticorps bispécifiques à la condition qu'ils montrent l'activité biologique souhaitée). Les anticorps chimériques ou humanisés sont également compris dans cette désignation. 15 Plus particulièrement, une telle molécule consiste en une glycoprotéine comprenant au moins deux chaînes lourdes (H) et deux chaînes légères (L) reliées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne lourde est composée d'une région (ou domaine) variable de chaîne lourde (HCVR ou VH) et d'une région constante de chaîne lourde. La région constante de la chaîne lourde comprend trois domaines CH1, CH2 et 20 CH3. Chaque chaîne légère est composée d'une région variable de chaîne légère (LCVR ou VL) et d'une région constante de chaîne légère. La région constante de la chaîne lourde comprend un domaine CL. Les régions VH et VL peuvent être subdivisées en des régions d'hypervariabilité, appelées CDRs (d'après la nomenclature anglaise Complementary Determining Region ), intercalées avec des régions plus conservées, 25 appelées régions charpentes ou framework (FR). Chaque VH et VL est composée de trois CDRs et de quatre FRs, arrangés de l'acide amino-terminal au carboxy-terminal dans l'ordre suivant : FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Les régions variables des chaînes lourdes et légères comprennent un domaine de fixation qui interagit avec un antigène. Les régions constantes des anticorps peuvent médier la fixation de 30 l'immunoglobuline à des tissus ou facteurs hôte, incluant les diverses cellules du 2906533 8 système immunitaire (par exemple les cellules effectrices) et le premier composant (Clq) du système du complément classique. Elles peuvent également couvrir certains fragments d'anticorps (expression décrite plus en détails) montrant l'affinité et la spécificité souhaitée au regard de la 5 source ou du type d'immunoglobuline (IgG, IgE, IgM, IgA, etc.). En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments fonctionnels, notamment d'origine murine, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 10 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Parmi les anticorps que l'on cherche à générer selon la présente invention, on préfère les anticorps tels que définis ci-dessus, et dits actif , c'est-à-dire présentant une activité anti-tumorale ciblant des cellules tumorales résistantes à une thérapie. 15 Parmi les anticorps que l'on cherche à générer selon la présente invention et sous un aspect particulier de l'invention, on préfère les anticorps tels que définis ci-dessus et capables également d'exercer une activité anti-tumorale dirigée contre des cellules tumorales de phénotype agressif exprimant naturellement (avant tout traitement) l'antigène contre lequel sont dirigés ces anticorps. 20 Dans une première forme d'exécution, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite tumeur résistante est obtenue directement par biopsie et/ou chirurgie d'un patient suivant, ou ayant suivi, un traitement thérapeutique avec ledit au moins composé anti-tumoral susceptible d'induire une résistance ou pour lequel une résistance de la tumeur est constatée. 25 Dans cette forme d'exécution, il peut être envisagé un traitement adapté à chaque patient, en ce sens que des anticorps sont générés selon l'invention en réponse à une immunisation effectuée avec tout ou partie d'une tumeur résistante issue du patient même. Il peut ainsi être envisagé une thérapie personnalisée ex vivo d'un patient. Dans une seconde forme d'exécution, l'utilisation selon l'invention est 30 caractérisée en ce que ladite tumeur résistante est induite par greffe d'une lignée tumorale et/ou de tout ou partie d'une tumeur humaine sur un animal puis traitement de 2906533 9 cet animal par administration, notamment par injection, d'au moins un composé antitumoral pour le(s)quel(s) on souhaite induire ou constater une résistance. Plus particulièrement, ledit au moins un composé anti-tumoral est choisi parmi les agents de chimiothérapie tels que des molécules chimiques ou encore des anticorps 5 thérapeutiques ou encore des agents de radiothérapie. De manière générale dans l'ensemble de la présente description, on entend désigner par agent anti-tumoral ou agent thérapeutique anti-cancer une substance qui, lorsqu'elle est administrée à un patient, traite ou prévient le développement du cancer chez le patient. 10 A titre d'exemple non limitatif pour de tels agents, il peut être mentionné les agents dits cytotoxiques comme les agents alkylant , les anti-métabolites, les antibiotiques anti-tumoraux, les inhibiteurs mitotiques, les inhibiteurs de fonction chromatine, les agents anti-angiogénèse, les anti-oestrogènes, les anti-androgènes ou les immuno-modulateurs. 15 De tels agents sont, par exemple, cités dans l'édition 2006 du VIDAL, à la page consacrée aux composés attachés à la cancérologie et l'hématologie colonne Cytotoxiques , ces composés cytotoxiques cités par référence à ce document sont cités ici comme agents cytotoxiques préférés. Les agents alkylants font référence à toute substance qui peut se coupler de 20 manière covalente ou alkyler toute molécule, préférentiellement un acide nucléique (ex. : ADN), au sein d'une cellule. Comme exemples de tels agents alkylants, il peut être cité les moutardes à l'azote comme la méchloréthamine, le chlorambucil, le melphalan, le chlorhydrate, le pipobroman, la prednimustine, le phosphate disodique ou l'estramustine ; les oxazaphosphorines comme la cyclophosphamide, l'altrétamine, la 25 trofosfamide, la sulfofosfamide ou l'ifosfamide ; les aziridines ou éthylènes-imines comme le thiotepa, la triéthylèneamine ou l'altétramine ; les nitrosourées comme la carmustine, la streptozocine, la fotémustine ou la lomustine ; les sulfonates d'alkyle comme le busulfan, le tréosulfan ou 1'improsulfan ; les triazènes comme la dacarbazine ; ou encore les complexes du platine comme le cisplatine, l'oxaliplatine ou le 30 carboplatine. 2906533 10 Les anti-métabolites font référence à des substances qui bloquent la croissance et/ou le métabolisme cellulaire en interférant avec certaines activités, généralement la synthèse d'ADN. A titre d'exemple d'anti-métabolite, il peut être mentionné les methotrexate, 5-fluorouracile, floxuridine, 5-fluorodeoxyuridine, 5 capecitabine, cytarabine, fludarabine, cytosine arabinoside, 6-mercaptopurine (6-MP), 6-thioguanine (6-TG), chlorodésoxyadénosine, 5-azacytidine, gemcitabine, cladribine, déoxycoformycine et la pentostatine. Les antibiotiques anti-tumoraux font référence aux composés qui peuvent prévenir ou inhiber la synthèse d'ADN, d'ARN et/ou de protéines. Des exemples de tels 10 antibiotiques anti-tumoraux comprennent la doxorubicine, daunorubicine, idarubicine valrubicine, mitoxantrone, dactinomycine, mithramycine, plicamycine, mitomycine C, bleomycine, et la procarbazine. Les inhibiteurs mitotiques préviennent la progression normale du cycle cellulaire et de la mitose. En général, les inhibiteurs des microtubules ou taxoïdes 15 comme le paclitaxel et le docétaxel sont capables d'inhiber la mitose. Les alcaloïdes de vinca, comme la vinblastine, la vincristine, la vindésine et la vinorelbine sont également capables d'inhiber la mitose. Les inhibiteurs de fonction chromatine ou inhibiteurs de topo-isomérases font référence à des substances qui inhibent la fonction normale des protéines modélant 20 la chromatine comme les topo-isomérases I et II. Des exemples de tels inhibiteurs comprennent, pour la topo-isomérase I, la camptothécine ainsi que ses dérivés comme l'irinotécan ou le topotécan et, pour la topo-isomérase II, l'étoposide, le phosphate d'étiposide et le téniposide. Les agents anti-angiogénèse font référence à toute drogue, composé, 25 substance ou agent qui inhibe la croissance des vaisseaux sanguins. Des exemples d'agents anti-angiogénèse comprennent, sans aucune limitation, les razoxin, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginone, COL-3, neovastat, BMS-275291, thalidomide, CDC 501, DMXAA, L-651582, squalamine, endostatine, SU5416, SU6668, interferon-alpha, EMD121974, interleukine-12, IM862, 30 angiostatine et la vitaxine. 2906533 11 Les anti-oestrogènes ou agents anti-oestrogénique font référence à toute substance qui diminue, antagonise ou inhibe l'action des oestrogènes. Des exemples de tels agents sont les tamoxifène, toremifène, raloxifène, droloxifène, iodoxyfène, anastrozole, letrozole, et l'exemestane. 5 Les anti-androgènes ou agents anti-androgène font référence à toute substance qui réduit, antagonise ou inhibe l'action d'un androgène. Des exemples d'anti-androgènes sont les flutamide, nilutamide, bicalutamide, sprironolactone, cyproterone acétate, finasteride et la cimitidine. Les immunomodulateurs sont des substances qui stimulent le système 10 immunitaire. Des exemples de tels immunomodulateurs comprennent les interférons, les interleukines comme l'aldesleukine, OCT-43, denileukin diflitox ou l'interleukine-2, les facteurs de nécrose tumorale comme la tasonermine, ou d'autres types d'immunomodulateurs comme le lentinan, le sizofiran, le roquinimex, le pidotimod, la pégadémase, la thymopentine, le poly I:C, ou le levamisole en combinaison avec le 5- 15 fluorouracil. Pour plus de détails, l'homme de l'art pourra se reporter au manuel édité par l'Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique intitulé traité de chimie thérapeutique, Vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, édition TEC & DOC, 2003 . 20 Peuvent être également mentionnés, comme agents anti-tumoraux, les agents de radiothérapie, d'hormonothérapie ou de thérapie ciblée par des petites molécules telles que des inhibiteurs de tyrosine kinase. Enfin, selon une forme d'exécution préférée, les anticorps font partie des agents anti-tumoraux, utilisables selon l'invention. Plus particulièrement, il peut être mentionné, à titre d'exemple non limitatif, les anticorps 25 suivants : les anticorps anti-EGFR comme cetuximab (C225 ou erbitux), mrtuzumab, huR3, HuMax-EGFR ou panitumab ; les anticorps anti-VEGF comme bevacizumab (Avastin) ou 2C3 ; les anticorps anti-IGF-IR comme 7C10, h7C10, hEM164, ABX-IGF-1R, Mab 39, 1H7 ou 4G11 ; les anticorps anti-HER2 comme trastuzumab (Herceptin) ou pertuzumab ; les anticorps anti-CD20 commerituximab, ibritumomab ou 30 tositumomab ; les anticorps anti-CD33 comme gemtuzumab ou lintuzumab ; les anticorps anti-CD22 comme epratuzumab ; les anticorps anti-CD52 comme 2906533 12 alemtuzumab ; les anticorps anti-EpCAM comme edrecolomab, Ch 17-1A ou IGN-101 ; les anticorps anti-CTP21 ou 16 comme Xactin ; les anticorps anti-DNA-Ag comme 131I-Cotara TNT-1 ; les anticorps anti-MUC1 comme pemtumomab ou R1150 ; les anticorps anti-MUC18 comme ABX-MAl ; les anticorps anti-GD3 comme mitumomab ; les 5 anticorps anti-CEA comme CeaVac ou labetuzumab ; les anticorps anti-CAl25 comme OvaRex ; les anticorps anti-HLA-DR comme apolizumab ; les anticorps anti-CTLA4 comme MDX-010 ; les anticorps anti-PSMA comme MDX-070, 11In & 9 y-J591, '''Lu J591, J591-DM1 ; les anticorps anti-Lewis Y comme IGN311 ; les anticorps antiangiogénèse comme AS 1405 et 90YmuBC 1 ; les anticorps anti-Trail-R 1 comme TRAIL 10 R1mAb ou TRAIL R2mAb ; ou encore tout anticorps dirigé contre un récepteur à tyrosine kinase autre que ceux mentionnés plus haut ou les récepteurs type RON, cMET, CXCR 2, CXCR4, Ephrin, etc. De même pour les thérapies ciblées utilisant des petites molécules chimiques comme les inhibiteurs de tyrosine kinase. Bien entendu, cette liste n'est aucunement limitative mais a juste, comme objet, 15 de mentionner les anticorps utilisés ou en développement à ce jour. Selon un mode particulier de l'invention, il est envisagé que ladite tumeur résistante soit résistante à plusieurs traitements ou agents anti-tumoraux, ces derniers pouvant être de nature variée. Plus particulièrement, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que 20 ledit au moins un composé anti-tumoral consiste en au moins deux, préférentiellement au moins trois, composés de naturedifférente et/ou présentant des mécanismes d'action différents et/ou ciblant des protéines différentes. Par mécanisme d'action différent, il faut comprendre par exemple, que les agents anti-tumoraux viennent altérer différentes fonctions biologiques de la cellule comme 25 l'angiogénèse, la synthèse d'ADN ou encore la mitose. Le ciblage de protéines différentes se réfère plus particulièrement au cas ou les agents anti-tumoraux sont des anticorps capables de se lier à des protéines ou des récepteurs de nature différente. Bien évidemment, il peut être envisagé de combiner soit uniquement des 30 anticorps entre eux, soit uniquement des agents de chimiothérapie entre eux, ou bien de combiner ces deux familles de composés entre elles ou avec des traitements de 2906533 13 radiothérapie, d'hormonothérapie ou des thérapies ciblées utilisant des petites molécules chimiques comme décrit plus haut. Bien que préféré, il n'est pas également nécessaire que l'ensemble des composés anti-tumoraux utilisés aient tous un mécanisme d'action ou une cible différent(e). 5 Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de génération in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral exprimé à la surface d'une tumeur résistante à au moins un composé anti-tumoral, ledit antigène tumoral n'étant pas de préférence exprimé à la surface des cellules tumorales de la tumeur native (non traitée) correspondante, et ledit 10 antigène tumoral étant susceptible d'être impliqué dans la résistance de ladite tumeur résistante au traitement anti-tumoral, le procédé comprenant une étape consistant à immuniser des animaux directement avec un broyat et/ou une suspension et/ou un lysat cellulaire issu(e) de ladite tumeur résistante, et une étape consistant à sélectionner les anticorps reconnaissant la tumeur résistante et non la tumeur native dont est issue la 15 tumeur résistante. Selon un aspect particulier de ce procédé de l'invention, il est décrit un procédé de génération in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral exprimé à la surface d'une tumeur résistante et susceptible d'être impliqué dans la résistance de ladite tumeur résistante, ce procédé consistant à 20 immuniser des animaux directement avec un broyat et/ou une suspension et/ou un lysat cellulaire issu(e) de ladite tumeur résistante à au moins un composé anti-tumoral (composé anti-tumoral pour lequel on a constaté une résistance de la tumeur ou pour lequel on souhaite induire une résistance), après tolérisation ou non des animaux, avec un broyat et/ou une suspension et/ou un lysat cellulaire issu(e) d'une tumeur native 25 (tumeur n'ayant fait l'objet d'aucun traitement). Cette tolérisation, qui se fait à l'aide d'agent immunosuppresseur de type cyclophosphamide, a pour but d'annuler la réponse immunitaire dirigée contre tous les antigènes de surface présents avant le(s) traitement(s) anti-tumoral appliqué(s) à l'animal ou l'humain dans le but d'induire une résistance ou dans le cadre d'une thérapie pour ce qui est de l'humain. Ainsi, la réponse 30 immunitaire consécutive à l'administration, notamment l'injection de préparations issues de tumeurs résistantes sera focalisée sur les structures de surfaces induites par le 2906533 14 traitement et potentiellement impliquées dans l'établissement d'une résistance tumorale. L'efficacité de la tolérisation est évaluée par un suivi de la disparition du titre sérique établi suite à l'immunisation des animaux avec des cellules tumorales issues de la tumeur native. 5 Les rates des souris immunisées selon le procédé ci-dessus seront alors prélevées et les splénocytes fusionnés avec des cellules de myélome selon le processus classique connu de l'homme de l'art. Le criblage des hybridomes obtenus suite à cette fusion cellulaire sera effectué par immunohistochimie différentielle sur des lames préalablement préparées et 1 o portant des coupes de tumeurs natives (non traitées) ou des coupes de tumeurs résistantes (mono- ou poly-traitées à l'aide d'agents anti-tumoraux). Seuls les hybridomes produisant des anticorps reconnaissant les tumeurs résistantes et non les tumeurs natives seront sélectionnés, clonés et congelés en vue de produire les anticorps et de les tester pour leur activité anti-tumorale. L'ensemble de ce procédé est schématisé 15 en figures 2 et 3 plus loin. Il est à noter qu'une telle approche peut également être envisagée pour la recherche et l'identification de molécules de résistance intracellulaire. Les anticorps, tels que définis plus haut, selon la présente invention sont de préférence des anticorps monoclonaux spécifiques, notamment murins, chimériques ou humanisés qui pourront être obtenus selon les méthodes standards bien connues de 20 l'homme de l'art. En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments fonctionnels, notamment d'origine murine, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 25 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Sont également compris par anticorps selon la présente invention, les anticorps chimériques ou humanisés. Par anticorps chimérique, on entend désigner un anticorps qui contient une 30 région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne 2906533 15 lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée (souris, cheval, lapin, chien, vache, poulet, etc.). Les anticorps ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, 5 l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet 10 anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) ou le brevet US 4,816,567. 15 Par anticorps humanisé, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humain(s). En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986 ; Verhoeyen et 20 al., Science, 239:1534-1536, 1988 ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988). Les anticorps humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (comme par exemple celles décrites dans les documents Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992 ; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992 ; ou Bebbington et al., 25 Bio/Technology, 10:169-175, 1992). D'autres techniques d'humanisation sont également connues de l'homme de l'art comme par exemple la technique du CDR Grafting décrite par PDL faisant l'objet des brevets EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 ou encore US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 et US 5,693,761. On peut également citer les 30 brevets US 5,639,641 ou encore 6,054,297, 5,886,152 et 5,877,293. 2906533 16 Par fragment fonctionnel d'un anticorps selon l'invention, on entend désigner en particulier un fragment d'anticorps, tel que des fragments Fv, scFv (se pour simple chaîne), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment dont la durée de demie-vie aurait été augmentée par modification chimique, comme l'ajout de 5 poly(alkylène) glycol tel que le poly(éthylène)glycol ( PEGylation ), ou par incorporation dans un liposome. Ledit fragment présente généralement au moins un des CDRs caractéristiques de l'anticorps dont il est issu et il est capable d'exercer de manière générale l'activité même partielle de l'anticorps dont il est issu. De préférence, lesdits fragments fonctionnels seront constitués ou comprendront lo une séquence partielle de la chaîne variable lourde ou légère de l'anticorps dont ils sont dérivés, ladite séquence partielle étant suffisante pour retenir la même spécificité de liaison que l'anticorps dont elle est issue et une affinité suffisante, de préférence au moins égale à 1/100, de manière plus préférée à au moins 1/10 de celle de l'anticorps dont elle est issue. 15 Un tel fragment fonctionnel comportera au minimum 5 acides aminés, de préférence 10, 15, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de l'anticorps dont il est issu. De préférence, ces fragments fonctionnels seront des fragments de type Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diabodies, qui possèdent généralement la même 20 spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Selon la présente invention, des fragments d'anticorps de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière les fragments d'anticorps compris dans la présente invention 25 peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques bien connues également de l'homme de l'art ou encore par synthèse peptidique au moyen par exemple de synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc.. De manière plus préférée, l'invention comprend les anticorps, ou leurs fragments 30 fonctionnels, selon la présente invention, notamment chimériques ou humanisés, obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique. 2906533 17 Selon une forme de réalisation préférée du procédé selon l'invention, ladite immunisation est réalisée par injection intra-péritonéale et/ou sous-cutanée et/ou intraveineuse et/ou intra-splénique. Chaque mode d'immunisation pouvant être interchangeable, la sélection d'un mode par rapport à l'autre se faisant selon les 5 animaux utilisés et les connaissances et pratiques de l'homme du métier. Plus particulièrement, selon une première forme d'exécution, la tumeur résistante est obtenue directement par biopsie et/ou chirurgie d'un patient suivant, ou ayant suivi, un traitement thérapeutique avec au moins un composé anti-tumoral susceptible d'induire une résistance ou pour lequel une résistance a été constatée. 10 Selon une seconde forme d'exécution, la tumeur résistante est induite par greffe d'une lignée tumorale et/ou de tout ou partie d'une tumeur humaine sur un animal puis traitement de cet animal par injection d'au moins un composé anti-tumoral pour le(s)quel(s) on souhaite induire une résistance ou constater une résistance. Quelle que soit la forme d'exécution préférée ci-dessus, le procédé selon 15 l'invention est caractérisé en ce que ledit anticorps actif, ou l'un de ses fragments fonctionnels, consiste en un anticorps monoclonal. Plus particulièrement, ledit anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, consiste en une immunoglobuline sélectionnée parmi le groupe consistant en une IgG, une IgA, une IgM, une IgD ou une IgE. 20 De manière encore plus préférée, ledit anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, consiste en une IgG d'isotype gamma 1, gamma 2 ou gamma 4. Il faut comprendre néanmoins que, selon l'invention, les immunoglobulines de type IgG1 et IgG2 sont préférées de par leur propriété à induire des fonctions effectrices. De manière générale, l'homme du métier reconnaîtra que les fonctions 25 effectrices comprennent, à titre d'exemple non limitatif, la fixation au Clq, la CDC (d'après la nomenclature anglaise complement-dependent cytotoxicity ), la liaison au récepteur Fc, l'ADCC (d'après la nomenclature anglaise antibody-dependent cellular cytotoxicity ) et la phagocytose. Plus particulièrement, les fonctions effectrices préférées selon l'invention sont 30 l'ADCC et la CDC. 2906533 18 De manière générale, les fragments fonctionnels auxquels l'invention fait référence sont choisis parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fe et les diabodies, ou tout fragment dont la demie-vie aurait été augmentée comme des fragments pégylés. 5 De manière plus spécifique, mais aucunement limitative, le procédé selon l'invention comprend au moins les étapes suivantes : i) immuniser directement des animaux avec un broyat et/ou une suspension et/ou un lysat cellulaire issu(e) d'une tumeur résistante, ii) fusionner des cellules de la rate de l'animal immunisé de l'étape i) avec des 10 cellules de myélome de manière à obtenir des hybridomes, et iii) sélectionner, par sélection différentielle, les hybridomes sécrétant des anticorps reconnaissant spécifiquement les antigènes exprimés à la surface des cellules tumorales de la tumeur résistante et dont l'expression est induite par le traitement antitumoral. 15 Par sélection différentielle , il faut comprendre toute sélection basée sur des procédés permettant de distinguer les antigènes induits par l'apparition d'une résistance à un

traitement par rapport aux antigènes présents sur les cellules avant l'établissement de cette résistance. A titre d'exemple non limitatif de technique permettant une telle sélection 20 différentielle , il peut être cité l'immunohistochimie sur coupes congelées ou incluses en paraffine ou des approches de type protein arrays ou Bene arrays . Plus particulièrement, il est préféré d'utiliser la technique dite de tissue array . Le tissue array consiste à construire, à partir de blocs de tissus inclus en paraffine ou congelés, de nouveaux blocs contenant plusieurs dizaines à plusieurs centaines de 25 carottes de ces tissus afin de pouvoir, après coupe de ces blocs de tissue arrays , monter des lames de microscope comprenant plusieurs dizaines à plusieurs centaines de coupes de tissus. Selon un mode préféré, le procédé selon l'invention comprend en outre, préalablement à l'étape i) décrite ci-dessus, les étapes suivantes : 30 a) sélectionner et greffer sur des animaux une lignée tumorale et/ou tout ou partie d'une tumeur dite native , 2906533 19 b) traiter une partie de ces animaux greffés avec au moins un composé antitumoral, c) récupérer tout ou partie des tumeurs dites natives issues des animaux greffés à l'étape a) non traités, 5 d) récupérer tout ou partie des tumeurs résistantes issues des animaux traités de l'étape b), e) préparer un moyen de sélection différentielle des anticorps à partir des tumeurs récupérées, en intégralité ou en partie, respectivement aux étapes c) et d), et f) préparer un broyat et/ou un lysat cellulaire à partir des tumeurs résistantes 10 récupérées, en intégralité ou en partie, à l'étape d). Dans la présente description, il faut comprendre que les expressions tumeurs natives et tumeurs mères sont équivalentes et seront indifféremment utilisées. Selon une forme d'exécution de l'invention ladite lignée tumorale et/ou tumeur dite native est sélectionnée parmi le groupe consistant en les cellules tumorales de 15 poumon (A549), mais aussi de manière non limitative, colon, prostate, sein, ovaire ou toute tumeur pour lesquelles des résistances aux traitements sont constatées. En outre, un composé anti-tumoral utilisé selon l'invention est choisi parmi les agents de chimiothérapie, les agents de radiothérapie, les molécules chimiques ou les anticorps, l'ensemble des ces différents composés étant défini plus haut dans la présente 20 description. Selon une forme préférée de l'invention, ledit au moins un composé anti-tumoral consiste en un anticorps monoclonal, ledit anticorps monoclonal étant, de manière encore plus préférée, choisi parmi le groupe consistant en les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, dirigés contre les récepteurs de facteur de croissance, les 25 molécules impliquées dans l'angiogénèse, ou encore les chémokines et intégrines impliquées dans les phénomènes de migration cellulaire. Par récepteurs de croissance , il faut comprendre toute protéine transmembranaire qui, suite à la fixation de ligand(s) ou à un changement de conformation ligand indépendant ou à des homo- ou hétéro-dimérisations avec d'autres 30 protéines membranaires, va médier une réponse proliférative.Par molécules impliquées dans l'angiogénèse , il faut comprendre tout récepteur membranaire qui, 2906533 20 suite à la fixation de ligand(s) ou à un changement de conformation ligand indépendant ou à des homo- ou hétéro-dimérisations avec d'autres protéines membranaires, va aboutir à la formation de vaisseaux. Par chémokines et intégrines impliquées dans les phénomènes de migration 5 cellulaire , il faut comprendre toute molécule soluble susceptible d'avoir une activité de digestion des matrices extra-cellulaires et/ou une activité chemo-attractive. Selon une autre forme de réalisation de l'invention, le procédé se caractérise en ce que ledit au moins un composé anti-tumoral consiste en une combinaison d'au moins deux, préférentiellement au moins trois, composés anti-tumoraux de nature différente to et/ou présentant des mécanismes d'action différents et/ou ciblant des protéines différentes. De manière préférée, ladite combinaison de composés anti-tumoraux consiste en une combinaison d'anticorps monoclonaux, ou de leurs fragments fonctionnels. De manière encore plus préférée, ladite combinaison d'anticorps monoclonaux, 15 ou de ses fragments fonctionnels, consiste en une combinaison d'anticorps sélectionnés parmi les anticorps anti-IGF-IR, anti-EGFR, anti-Her/2neu, anti-VEGF, anti-VEGFR, anti-CXCR, anti-cMET, anti-RON, Ephrin, etc.. Selon une forme d'exécution, à titre d'exemple non limitatif, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite combinaison consiste en la combinaison d'un 20 anticorps anti-IGF-IR, d'un anticorps anti-EGFR et d'un anticorps anti-Her/2neu, lesdits anticorps mentionnés consistant respectivement, de préférence, en les anticorps monoclonaux 7C10, 225 et h4D5. L'anticorps monoclonal 7C10 consiste en l'anticorps décrit dans la demande de brevet WO 03/059951 déposée par la Demanderesse le 20 janvier 2003 et dont le 25 contenu est incorporé ici par référence. L'anticorps monoclonal 225 consiste en l'anticorps produit par l'hybridome déposé à l'ATCC sous la référence HB-8508. L'anticorps monoclonal h4D5 consiste en l'herceptine disponible dans le commerce, par exemple, à l'ICR (Institut Claudius Regaud). 30 Selon encore un mode préféré d'application, le procédé selon l'invention se caractérise en ce que ladite étape iii) de sélection des hybridomes sécrétant des anticorps 2906533 21 ne reconnaissant pas les antigènes de la cellule tumorale dite native est réalisée par criblage différentiel entre le tissu de la tumeur dite native non traitée et celui de la tumeur résistante et/ou rendue résistante. Par criblage différentiel , il faut comprendre un criblage permettant de 5 distinguer les antigènes induits par l'apparition d'une résistance à un traitement par rapport aux antigènes présents sur les cellules avant l'établissement de cette résistance. De manière préférée, le criblage différentiel est réalisé par mise en oeuvre du moyen obtenu à l'étape e) telle que décrite plus haut. Enfin, selon un dernier mode de réalisation de l'invention, il est préféré que le 10 procédé comprenne une étape supplémentaire de tolérisation préalablement à l'étape i). Par tolérisation , il faut comprendre extinction d'une réponse immunitaire induite à l'aide de composés immunosuppresseurs tels que la cyclophosphamide. Dans la pratique, ladite étape de tolérisation peut consister à : - administrer, notamment par injection, aux animaux un broyat et/ou une 15 suspension et/ou un lysat cellulaire obtenu(e) à partir des tumeurs dites natives issues de l'étape c), et - traiter avec un immunosuppresseur ces animaux afin d'éliminer les cellules B activées par l'injection de l'étape ci-dessus et ainsi inhiber toute réponse potentielle contre ladite tumeur dite native. 20 Bien évidemment, toute méthode ou pratique similaire, ou permettant d'aboutir au même résultat, doit être considérée comme équivalente et être comprise dans l'étendue de I'invention. Par immunosuppresseur , il faut comprendre toute substance capable de dépléter des populations cellulaires du système immunitaire. On peut citer, à titre d'exemple non limitatif, la cyclophosphamide. 25 Sous un autre aspect, la présente invention est relative à un procédé de génération et de sélection in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber la résistance d'une tumeur à un composé anti-tumoral ou procédé de génération et de sélection in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral exprimé à la surface d'une tumeur résistante à au 30 moins un composé anti-tumoral, ledit antigène tumoral étant impliqué dans la résistance de ladite tumeur au composé anti-tumoral, caractérisé en ce que le procédé comprend : 2906533 22 a) un procédé de génération in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, ledit anticorps étant dirigé contre ledit antigène tumoral exprimé spécifiquement à la surface de la tumeur résistante, ledit antigène tumoral n'étant pas exprimé à la surface des cellules de la tumeur native dont est issue la tumeur 5 résistante ; b) la mise en contact in vitro ou in vivo de l'anticorps obtenu à l'étape a) avec la tumeur résistante au composé anti-tumoral ; et c) la sélection dudit anticorps s'il est mis en évidence un effet inhibiteur de cet anticorps sur la résistance de la tumeur au composé anti-tumoral. 10 Selon une autre forme d'exécution, il peut être réalisé un test in vitro ou in vivo visant à définir si l'antigène dont l'expression est induite par le traitement anti-tumoral est impliqué ou non dans le phénomène de résistance. Selon une forme de réalisation préférée, une telle étape peut consister à tester in vitro ou in vivo l'anticorps obtenu selon l'invention sur la tumeur résistante et observer si une activité inhibitrice de la 15 résistance est développée sur la tumeur résistante. Sous encore un autre aspect, la présente invention est relative à un procédé de génération et de sélection in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'exercer une activité anti-tumorale, notamment d'inhiber la prolifération de cellules tumorales exprimant l'antigène contre lequel est dirigé ledit anticorps, 20 caractérisé en ce que le procédé comprend : a) un procédé de génération in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, ledit anticorps étant dirigé contre ledit antigène tumoral exprimé spécifiquement à la surface de la tumeur résistante, ledit antigène tumoral n'étant pas exprimé à la surface des cellules de la tumeur native dont est issue la tumeur 25 résistante ; b) la mise en contact in vitro ou in vivo de l'anticorps obtenu à l'étape a) avec une tumeur dont les cellules expriment ledit antigène tumoral, de préférence avec ladite tumeur résistante utilisée à l'étape a) ou avec une tumeur de phénotype agressif ; et c) la sélection dudit anticorps s'il est mis en évidence un effet anti-tumoral sur 30 cette tumeur, notamment une inhibition de la prolifération cellulaire de la tumeur. 2906533 23 A l'étape b) du procédé ci-avant, il doit être compris que la tumeur dont les cellules expriment ledit antigène tumoral n'est pas forcément la tumeur résistante au composé anti-tumoral ayant servi à générer ledit anticorps. Toute tumeur, notamment de phénotype agressif, dont les cellules tumorales expriment l'antigène tumoral reconnu 5 par ledit anticorps peut être utilisée à l'étape b). L'invention vise également, de manière évidente, l'utilisation d'un procédé tel que décrit plus haut pour générer des anticorps monoclonaux thérapeutiques et/ou diagnostiques. L'invention couvre également l'utilisation partielle d'un tel procédé qui pourrait être développée par un homme de l'art afin de répondre à un critère particulier 10 ou bien tout simplement pour se différencier de la présente description. Selon un troisième aspect de l'invention, il est envisagé un anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention tel que décrit plus haut. 15 La présente invention est innovante en ce sens qu'aucun anticorps, à ce jour, n'a été décrit comme ayant de telles propriétés, ni même comme ayant été obtenu par un tel procédé. De manière préférée, lesdits fragments fonctionnels selon la présente invention seront choisis parmi les fragments Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fe ou diabodies, 20 ou tout fragment fonctionnel dont la demie-vie aurait été augmentée par une modification chimique, notamment par PEGylation, ou par l'incorporation dans un liposome. Bien évidemment, cette énumération n'est aucunement limitative ou tout autre type de fragment connu de l'homme de l'art doit être considéré comme faisant partie de l'invention. 25 A titre d'exemple illustratif de l'invention, il est décrit ci-après 5 anticorps obtenus par mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Ces anticorps appelés 1A6, IA9, 2E11, 3C11 et 3G7 peuvent être murins, chimériques ou humanisés. Selon un premier mode d'exécution, la présente invention vise un anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce qu'il comprend : 2906533 24 - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 1, 2 et 3, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 1, 2 et 3 ; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 4, 5 5 et 6, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 4, 5 et 6. Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences polypeptidiques, peptides et protéines attachés aux composés anticorps ou à leur séquence sont interchangeables. 10 Il doit être compris ici que l'invention ne concerne pas les anticorps sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils peuvent alors comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin. 15 Par région(s) CDR(s) ou CDR(s), on entend désigner les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines comme définies par Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5`h Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions). Il existe 3 CDRs de chaîne lourde et 3 CDRs de chaîne légère. Le terme CDR ou CDRs est utilisé icipour 20 désigner suivant les cas, l'une de ces régions ou plusieurs, voire l'ensemble, de ces régions qui contiennent la majorité des résidus d'acides aminés responsables de la liaison par affinité de l'anticorps pour l'antigène ou l'épitope qu'il reconnaît. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de 25 nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant 30 ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison . L'alignement optimal des 2906533 25 séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Watennan (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman 5 (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides 10 aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le 15 résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences 20 (Tatusova et al., Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences , FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site http://www.ncbi.nim.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée 25 par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. Il est également possible d'utiliser d'autres programmes comme les logiciels ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Par séquence d'acide aminé présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité avec une séquences d'acide aminé de référence, on 30 préfère celles présentant par rapport à la séquence de référence, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une • 2906533 26 troncation ou un allongement. Dans le cas d'une substitution, d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) consécutif(s) ou non consécutif(s), on préfère les substitutions dans lesquelles les acides aminés substitués sont remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide aminé 5 susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des anticorps correspondants et telles qu'elles seront définies par la suite, notamment dans les exemples. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur 10 leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents anticorps susceptibles d'être effectués. A titre d'exemple non limitatif, le tableau 1 ci-dessous reprend les possibilités de substitution susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification 15 approfondie de l'activité biologique de l'anticorps modifié correspondant, les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. 2906533 27 Tableau 1 Résidu originel Substitution(s) Ala (A) Val, Gly, Pro Arg (R) Lys, His Asn (N) Gln Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (G) Asp Gly (G) Ala His (H) Arg Ile (I) Leu Leu (L) Ile, Val, Met Lys (K) Arg Met (M) Leu Phe (F) Tyr Pro (P) Ala Ser (S) Thr, Cys Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Phe, Trp Val (V) Leu, Ala De manière préférée, l'anticorps décrit ci-dessus est dénommé IA6 et comprend 5 une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 7 et une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 8. Plus particulièrement, la présente invention vise également l'hybridome murin (IA6) capable de sécréter l'anticorps 1A6 tel que décrit ci-dessus. Dans la présente description, le même code est utilisé indifféremment que l'on parle de l'hybridome 10 murin ou bien de l'anticorps produit pas ce même hybridome. Un tel hybridome murin consiste en l'hybridome déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 31 mai 2006 sous le N I-3612. Parmi les six courtes séquences de CDR, le troisième CDR de la chaîne lourde (CDRH3) a une plus grande variabilité de taille (grande diversité 15 essentiellement due aux mécanismes d'arrangement des gènes qui lui donnent naissance). Il peut être aussi court que 2 acides aminés alors que la taille la plus longue connue est de 26. Fonctionnellement, le CDRH3 joue un rôle à part dans la 2906533 28 détermination de la spécificité de l'anticorps (Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974 ; Amit et al., Science, 233:747-753, 1986 ; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987 ; Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989 ; Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990 ; Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990 ; Sharon et al., J. Irmmnuol., 5 144:4863-4869, 1990 ; Kabat et al., J. Irnmunol, 147:1709-1719, 1991). Il est connu que seul un faible pourcentage des acides aminés des CDRs contribue à la construction de site de liaison de l'anticorps, mais ces résidus doivent être maintenus dans une conformation tridimensionnelle très spécifique. Selon un second mode de réalisation, l'invention vise un anticorps monoclonal, 10 ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce qu'il comprend : - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 9, 10 et 11, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 9, 10 et 11 ; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 12, 15 13 et 14, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec Ies séquences SEQ ID Nos. 12, 13 et 14. Selon une autre forme de réalisation, ledit anticorps selon l'invention, dénommé 1 A9, comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 15 et une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 16. 20 Selon un autre aspect, il est également revendiqué l'Hybridome murin (lA9) capable de sécréter un anticorps tel que décrit ci-dessus. Enfin, selon une forme préférée de l'invention, il est couvert l'hybridome murin 1 A9 déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 31 mai 2006 sous le N I-3613. 25 Selon un troisième mode de réalisation, l'invention vise un anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, obtenu selon le procédé objet de l'invention et qui comprend : - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 17, 18 et 19, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement 30 optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 17, 18 et 19 ; et 2906533 29 - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 20, 21 et 22, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 20, 21 et 22. De manière préférée, ledit anticorps selon l'invention, dénommé 2E11, 5 comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 23 et une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 24. Selon un autre aspect, l'invention consiste également en l'hybridome murin 2E11 capable de sécréter un anticorps tel que décrit ci-dessus. Plus particulièrement, ledit hybridome murin consiste en l'hybridome déposé à la 10 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 31 mai 2006 sous le N I-3615. Selon un quatrième mode de réalisation, l'invention vise un anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, obtenu par un procédé tel que décrit plus haut et qui comprend : 15 - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 25, 26 et 27, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 25, 26 et 27 ; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 28, 29 et 30, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement 20 optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 28, 29 et 30. Plus précisément, ledit anticorps selon l'invention, dénommé 3C11 comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 31 et une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 32. Selon un autre aspect, l'invention concerne également l'hybridome murin 3C11 25 capable de sécréter un anticorps tel que décrit ci-dessus. Ledit hybridome consiste préférentiellement en l'hybridome déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 31 mai 2006 sous le N I••3614. Enfin, selon un cinquième mode de réalisation de l'invention, celle-ci concerne 30 un anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, obtenu par mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention et qui comprend : 2906533 30 - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquence SEQ ID No. 33, 34 ou 35, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 33, 34 et 35 ; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID No. 36, 5 37 et 38, ou dont les séquences présentent au moins 80% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 36, 37 et 38. De manière préférée, ledit anticorps, dénommé 3G7, comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 39 et une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 40. 10 Selon un autre aspect de l'invention, il est revendiqué un hybridome murin 3G7 capable de sécréter un anticorps tel que décrit ci-dessus. Ledit hybridome consiste préférentiellement en l'hybridome murin déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 31 mai 2006 sous le N I-3616. Dans un souci de clarté, il est regroupé dans 15 le tableau 2 ci-dessous la correspondance entre les anticorps objet de l'invention et les séquences respectives en acides aminés des CDRs desdits anticorps. 2906533 31 Tableau 2 Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère SEQ ID N CDR 1 1 CDR 2 2 1A6 CDR 3 3 CDR 1 4 CDR 2 5 CDR 3 6 CDR 1 9 CDR 2 10 l A9 CDR 3 11 CDR 1 12 CDR 2 13 CDR 3 14 CDR 1 17 CDR 2 18 2E11 CDR 3 19 CDR 1 20 CDR 2 21 CDR 3 22 CDR 1 25 CDR 2 26 3C11 CDR 3 27 CDR 1 28 CDR 2 29 CDR 3 30 CDR 1 33 CDR 2 34 3G7 CDR 3 35 CDR 1 36 CDR2 37 CDR 3 38 Le tableau 3 ci-dessous représente, quant à lui, la correspondance entre ces 5 mêmes anticorps objet de l'invention et les séquences respectives en acides aminés des chaînes lourdes et légères desdits anticorps. 2906533 32 Tableau 3 Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère SEQ ID N 1A6 entière 7 entière 8 1A9 entière 15 entière 16 2E11 entière 23 entière 24 3C11 entière 31 entière 32 3 G7 entière 39 entière 40 Enfin, le tableau 4 ci-dessous regroupe les noms de chaque anticorps objet de 5 l'invention avec les numéros de dépôt à la CNCM. Hybridome N de dépôt CNCM 1A6 I-3612 1A9 I-3613 3C11 I-3614 2E11 I-3615 3G7 1-3616 Bien évidemment, l'ensemble des propriétés ou modifications décrites plus haut pour l'anticorps 1A6 s'appliquent aux autres anticorps objet de l'invention et, tout 10 particulièrement, aux anticorps identifiés 1A9, 2E11, 3C11 et 3G7. De manière similaire à ce qui a été décrit plus haut pour tout anticorps obtenu selon le procédé objet de l'invention, il est également précisé que l'ensemble des caractéristiques, propriétés ou modifications décrites doit être considéré comme s'appliquant également aux anticorps identifiés dans la présente demande. 15 Plus particulièrement, il est précisé que tout fragment fonctionnel est choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc et les diabodies, ou tout fragment dont la demie-vie aurait été augmentée comme des fragments pégylés. De manière préférée, l'anticorps objet de la présente invention consiste préférentiellement en un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, sécrété par 2906533 33 l'un des hybridomes décrits plus haut, à savoir les hybridomes I-3612, I-3613, I-3614, I-3615 ou I-3616. Selon encore un mode de réalisation de l'invention, ledit anticorps est un anticorps chimérique et comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de 5 chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris. De manière préférée, ladite espèce hétérologue est l'Homme. De manière encore plus préférée, ledit anticorps chimérique, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, est caractérisé en ce que les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont 10 respectivement la région kappa et, gamma 1, gamma 2 ou gamm4. Enfin, de manière encore plus préférée, ledit anticorps consiste en un anticorps humanisé et comprend une chaîne légère et/ou une chaîne lourde dans lesquelles les segments de squelette FR1 à FR4 de ladite chaîne légère et/ou chaîne lourde sont dérivés respectivement de segments de squelette FR1 à FR4 de chaîne légère et/ou de 15 chaîne lourde d'anticorps humains. Sous un aspect également particulier, la présente invention est relative à un anticorps chimérique, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris, 20 notamment de l'Homme, et de manière préférée, en ce que les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région kappa et, gamma-1, gamma-2 ou gamma-4. Selon encore un aspect de l'invention, il est décrit un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : 25 a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention ; b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini en a) ; c) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'un des CDRs de séquences SEQ ID Nos. 30 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78, ou avec une séquence présentant au moins 80 % 2906533 34 d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78 ; et d) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'une des chaînes légères de séquence SEQ 5 ID No. 48, 56, 64, 72 ou 80 et/ou l'une des chaînes lourdes de séquence SEQ ID No. 47, 55, 63, 71 ou 79, ou avec une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 47, 48, 55, 56, 63, 64, 71, 72, 79 ou 80. Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront 10 employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription (lesdits ADNs. 15 Il doit être aussi compris ici que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également 20 désigner ici les acides nucléiques isolés obtenus par recombinaison génétique au moyen par exemple de cellules hôtes ou obtenus par synthèse chimique. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 /o, 95 % et 98 %, après alignement optimal avec une séquence de préférence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la 25 séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences codent pour les mêmes séquences d'acides aminés que la séquence de référence, ceci lié à la dégénérescence du code génétique, ou de séquences complémentaires qui sont 30 susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence de préférence dans des conditions de forte stringence notamment telles que définies ci-après. 2906533 Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de 5 définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. L'hybridation AI)N-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate 10 de sodium), 50 % de fonnamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e.: 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x 15 SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning : a 20 laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor). Pour plus de clarté, il est également précisé, dans le tableau 5 ci-dessous, la correspondance entre les anticorps objet de l'invention, plus particulièrement les séquences des CDRs ainsi que des chaînes variables, et leurs séquences nucléotidiques. 2906533 36 Tableau 5 Anticorps Chaîne lourde Chaîne légère SEQ ID N CDR 1 41 CDR 2 42 1A6 CDR 3 43 CDR 1 44 CDR 2 45 CDR 3 46 CDR 1 49 CDR 2 50 1 A9 CDR 3 51 CDR 1 52 CDR 2 53 CDR 3 54 CDR 1 57 CDR 2 58 2E11 CDR 3 59 CDR 1 60 CDR 2 61 CDR 3 62 CDR 1 65 CDR 2 66 3C11 CDR 3 67 CDR 1 68 CDR 2 69 CDR 3 70 CDR 1 73 CDR 2 74 3G7 CDR 3 75 CDR 1 76 CDR 2 77 CDR 3 78 1A6 entière 47 entière 48 1A9 entière 55 entière 56 2E11 entière 63 entière 64 3C11 entière 71 entière 72 3 G7 entière 79 entière 80 2906533 37 L'invention est également relative à un vecteur comprenant un acide nucléique selon la présente invention. L'invention vise notamment les vecteurs de clonage et/ou d'expression qui contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention. 5 Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule hôte déterminée. Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut 10 éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. 15 De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine 20 plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention. L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par ou comprenant un vecteur selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, 25 par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes. L'invention concerne également les animaux, excepté l'Homme, qui comprennent une cellule transformée selon l'invention. 2906533 38 Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule hôte selon 5 l'invention ; et b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ainsi produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées. Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des procédés de préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de préparation 10 d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un vecteur selon l'invention sont eux-mêmes compris dans la présente invention. De préférence, on cultive une cellule transformée par un vecteur selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression dudit polypeptide et on récupère ledit peptide recombinant. 15 Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifier des séquences nucléotidiques selon l'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système procaryote ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes, destinées à être 20 sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt sera facilitée par le fait qu'elles sont présentes dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à l'intérieur des cellules hôtes. On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention. 25 L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides (voir notamment Steward et al., Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ème éd., (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique 30 et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention. 2906533 39 Les anticorps, ou l'un de leurs fragments fonctionnels, susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'invention sont également compris dans la présente invention. Les anticorps bispécifiques ou .bifonctionnels constituent une seconde génération d'anticorps monoclonaux dans lesquels deux régions variables différentes 5 sont combinées dans la même molécule (Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis rev. 18:411-419). Leur utilité a été mise en évidence tant dans le domaine du diagnostic que dans le domaine de la thérapie de par leur capacité à recruter de nouvelles fonctions effectrices ou à cibler plusieurs molécules à la surface de cellules tumorales. Ces anticorps peuvent être obtenus par des méthodes chimiques (Glennie MJ 10 et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375 ; Repp R. et al., 1995, J. Hemat.

377-382) ou somatiques (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457 ; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol. 121:210-228) mais également et préférentiellement par des techniques d'ingénierie génétique qui permettent de forcer l'héterodimérisation et facilitent ainsi le procédé de purification de l'anticorps recherché (Merchand et al., 15 1998, Nature Biotech., 16:677-681). Ces anticorps bispécifiques peuvent être construits comme des IgG entières, comme des Fab'2 bispécifiques, comme des Fab'PEG ou comme des diabodies ou encore comme des scFv bispécifiques mais également comme un anticorps bispécifique tétravalent ou deux sites de fixation sont présents pour chaque antigène ciblé (Park et 20 al., 2000, Mol. Immunol., 37(18):1123-30) ou ses fragments comme décrit plus haut. Outre un avantage économique du fait que la production et l'administration d'un anticorps bispécifique soient moins onéreuses que la production de deux anticorps spécifiques, l'utilisation de tels anticorps bispécifiques a pour avantage de réduire la toxicité du traitement. En effet, l'utilisation d'un anticorps bispécifique permet de 25 diminuer la quantité globale d'anticorps circulants et, par suite, la toxicité éventuelle. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, l'anticorps bispécifique est un anticorps bivalent ou tétravalent. Dans la pratique, l'intérêt d'utiliser un anticorps bispécifique tétravalent est qu'il présente une avidité plus importantepar rapport à un anticorps bivalent du fait de la 30 présence de deux sites de fixation pour chaque cible.

2906533 De manière similaire à la sélection des fragments fonctionnels de l'anticorps décrit plus haut, ledit second motif est sélectionné parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2, Fab', Fab'PEG, scFv, scFv-Fc et les diabodies, ou toute forme dont la demie-vie aurait été augmentée.

5 Sous encore un autre aspect, l'invention a pour objet un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention à titre de médicament, de préférence un anticorps humanisé tel que défini ci-avant. Par anticorps, il faut comprendre, pour la suite de la présente description, aussi bien un anticorps obtenu par la mise en oeuvre du procédé de l'invention tel que décrit plus haut qu'un anticorps choisi parmi les anticorps 10 identifiés et nommés 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 ou encore 3G7. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, de préférence additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquernent acceptable.

15 Plus particulièrement, l'invention couvre une composition comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, tels que décrits plus haut ou produit par l'hybridome I-3612, I-3613, I-3614, I-3615 ou I-3616. Selon encore une autre forme d'exécution, la présente invention concerne 20 également une composition pharmaceutique telle que décrite plus haut qui comprend en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, un agent de chimiothérapie, un agent de radiothérapie ou un anticorps. On entend par utilisation simultanée , l'administration des deux composés de la composition selon l'invention compris dans une seule et même forme pharmaceutique.

25 On entend par utilisation séparée , l'administration, en même temps, des deux composés de la composition selon l'invention, compris dans des formes pharmaceutiques distinctes. On entend par utilisation étalée dans le temps , l'administration successive des deux composés de la composition selon l'invention, compris chacun dans une forme 30 pharmaceutique distincte. Par agent de chimiothérapie, il faut comprendre tout composé 2906533 41 entrant dans la définition et l'énumération apparaissant plus haut dans la présente description et faisant partie intégrante de l'invention. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent 5 cytotoxique est couplé chimiquement audit anticorps pour une utilisation simultanée. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique/cytostatique est choisi parmi les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, de préférence la vinorelbine et/ou la vinflunine.

10 Afin de faciliter le couplage entre ledit agent cytotoxique et ledit anticorps selon l'invention, on pourra notamment introduire des molécules espaceurs entre les deux composés à coupler, telles que des poly(alkylènes)glycols comme le polyéthylèneglycol, ou encore des acides aminés, ou, dans un autre mode de réalisation, utiliser des dérivés actifs desdits agents cytotoxiques dans lesquels auront été introduites des fonctions 15 capables de réagir avec ledit anticorps selon l'invention. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description. L'invention est, sous un autre aspect, relative à une composition caractérisée en ce que l'un, au moins, desdits anticorps, ou l'un de leur fragment fonctionnel, est 20 conjugué avec une toxine cellulaire et/ou un radioélément. De préférence, ladite toxine est une toxine d'entérobactéries, notamment l'exotoxine A de Pseudomonas. Par toxine ou radioélément conjugué à au moins un anticorps, ou l'un de leur fragment fonctionnel, selon l'invention, on entend désigner tout moyen permettant de 25 lier ladite toxine ou ledit radioélément audit au moins un anticorps, notamment par couplage covalent entre les deux composés, avec ou sans introduction de molécule de liaison. Une autre forme de couplage peut consister en l'utilisation d'un chélateur d'ions permettant de complexer de manière non-covalente, comme par exemple l'EDTA, le DOTA ou encore un complexe du type 99mTc.

2906533 42 De préférence également, ledit au moins un anticorps formant ledit conjugué selon l'invention est choisi parmi ses fragments fonctionnels, notamment les fragments amputés de leur composante Fc tels que les fragments scFv. La présente invention comprend en outre l'utilisation de la composition selon 5 l'invention pour la préparation d'un médicament. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps tel que décrit plus haut, ou encore obtenu par le procédé objet de l'invention et également décrit plus haut, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du cancer.

10 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps tel que décrit plus haut, ou encore obtenu par le procédé objet de l'invention et également décrit plus haut, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la résistance d'une tumeur à un traitement anti-tumoral chez un patient dans le cadre de la prévention ou du traitement de cancer chez ce patient.

15 De manière préférée, ledit cancer est un cancer de type résistant choisi parmi les cancers du colon, de la prostate, du sein, du poumon de l'ovaire ou du pancréas. Selon une autre forme d'utilisation de l'invention, il est également revendiqué l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé 20 biologiquement actif vers des tumeurs résistantes et/ou se trouvant à un stade tardif. Les anticorps marqués selon l'invention ou leurs fragments fonctionnels incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, l'a-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, 25 le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps ou leurs fragments fonctionnels selon l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour Green 30 Fluorescent Protein ), le dansyl, l'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps de l'invention ou leurs fragments fonctionnels peuvent être préparés par des 2906533 43 méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaison tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhyde, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), 5 ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate. D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes, des marqueurs 10 bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine, ou encore des marqueurs radioactifs. On entend désigner ici par composé biologiquement actif tout composé capable de moduler, notamment d'inhiber, l'activité cellulaire, en particulier leur croissance, leur prolifération, la transcription ou la traduction de gène.

15 Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, 20 l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en 25 particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, la composition comprenant les anticorps selon l'invention, sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimales 30 peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids 2906533 44 corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-5 après. Enfin, selon un dernier aspect de l'invention, il est envisagé l'utilisation du procédé selon l'invention pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques, intra- ou extracellulaires, impliquées dans des phénomènes de résistance. Enfin, ledit procédé d'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou 10 diagnostiques, intra- ou extracellulaires, impliquées dans des phénomènes de résistance est caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre le procédé selon l'invention tel que décrit plus haut pour obtenir un anticorps monoclonal puis à identifier le composé, en particulier la protéine reconnue par ledit anticorps monoclonal. Une telle identification de composé, notamment de protéine peut être réalisée par 15 toute technique connue de l'homme de l'art comme, par exemple, une immunoprécipitation et/ou innnunopurification de lysat cellulaire et identification de la protéine par des techniques de Western-blot couplées à des techniques classiques de protéomique. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer 20 l'invention sans aucunement en limiter la portée. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : La figure 1 représente l'évolution du volume tumoral suite à une trithérapie h4D5, 225 et 7C10 et met en évidence l'apparition d'une résistance à un tel traitement.

25 Figure 2 : La figure 2 représente, sous une première forme de représentation, un schéma explicatif d'un mode de réalisation de l'invention. 1 : Prélèvement des tumeurs contrôle, division en deux parties. 2 : Tolérisation des souris. Préparation des cellules pour l'immunisation : lysat, suspension cellulaire, etc. Tolérisation par injection i.p. de cyclophosphamide ou autre 30 agent tolérisant. 2906533 3 : Lames pour le criblage IHC : congélation ou inclusion des tumeurs. Préparation des lames pour le marquage = lames de contrôle négatif. 4 : Prélèvement des tumeurs résistantes, division en deux parties. 5 : Préparation des cellules pour l'immunisation : lysat, suspension cellulaire, etc. 5 6 : Congélation ou inclusion des tumeurs. Préparation des lames pour le marquage = lames essai. 7 : Prélèvement des tumeurs contrôles. 8 : Immunisation des souris : préparation cellulaire issue des tumeurs contrôles. 9 : Lames IHC contrôle. 10 10 : Tolérisation par injection(s) d'un agent immunosupresseur. 11 : Prélèvement des sera pour vérification de l'absence de réponse contre les cellules natives. 12 : Prélèvement des tumeurs résistantes. 13 : Immunisation des souris tolérisées : préparation cellulaire issue des tumeurs 15 résistantes. 14 : Lames IHC essai. 15 : Prélèvement des sera pour le marquage IHC tumeurs vs tumeurs résistantes. 16 : Sélection des hybridomes : absence de marquage sur les lames tumeurs contrôle, marquage positif sur les tumeurs résistantes (absence de marquage sur les cellules 20 stromales, marquages des cellules tumorales). Figure 3 : La figure 3 représente également, mais sous la forme cette fois-ci d'un diagramme, un mode de réalisation du procédé selon l'invention. Figure 4 : La figure 4 représente le profil des anticorps selon l'invention sur des lames de type tissue array générées à partir des tumeurs ayant servi à la tolérisation et aux 25 immunisations. Figure 5 : La figure 5 représente l'évaluation de l'activité anti-tumorale des anticorps 1A6 et 2E11 dans le modèle de xenogreffe de colon HT29. Figure 6 : La figure 6 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères des anticorps 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 et 3G7. Les CDRs respectifs apparaissent 30 soulignés et en gras.

2906533 46 Exemple 1 : Mise en évidence d'une résistance d'une cellule tumorale A549 à une tri-thérapie anti-IGF-IR, EGFR et Her/2neu Des cellules A549 sont greffées à des souris. Lorsque la tumeur est installée, les souris sont traitées deux fois par semaine avec un mélange contenant 300 g de chaun 5 des anticorps suivants, à savoir h4D5 (herceptine fournie auprès de l'ICR, Institut Claude Regaud, service pharmacie, 20-24 rue du Pont Saint-Pierre, 31052 Toulouse), 225 (N ATCC : HB-8508) et 7C10. Dès la première semaine de traitement, une régression de la croissance tumorale, jusqu'à la disparition totale de la tumeur, peut être observée chez certaines souris. Le 10 traitement est maintenu malgré la régression totale ou partielle de la tumeur. Il est observé, par la suite, une réapparition des tumeurs malgré la continuité du traitement, ce qui indique que des tumeurs résistantes à la tri-thérapie ont été générées. Un exemple est représenté à la figure 1 qui met en évidence une régression tumorale jusqu'au jour 15 et une réapparition des tumeurs à partir de J15 indiquant le 15 développement d'une résistance. Exemple 2 : Génération d'anticorps monoclonaux actifs dirigés contre un antigène impliqué dans la résistance à une thérapie combinée anti-IGF-1R, EGFR et Her/2ne 20 Des cellules A549 sont greffées à deux lots de 10 souris. Le premier lot reçoit des injections bi-hebdomadaires de PBS. Le second lot est traité avec une combinaison d'anticorps (7C10, 225 et h4D5) dirigés respectivement contre les récepteurs IGF-1R, EGFR et Her/2neu. Cette combinaison d'anticorps entraîne une régression tumorale aboutissant à la disparition des tumeurs chez 60 % des animaux traités. En dépit de cet 25 effet drastique, les tumeurs récidivent chez tous les animaux. Des tumeurs A549 sont récupérées chez les animaux traités avec du PBS lorsqu'elles atteignent 100 à 200 mm3. Chacune de ces tumeurs est divisée en deux portions : l'une est cryocongelée dans le but de générer des lames d'immunohistochimie de type tissue array , l'autre 30 est utilisée pour tolériser des souris BALB/c. Cette tolérisation se fait par injection intrapéritonéale d'un broyat de cellules issues de la tumeur suivi d'une administration de 2906533 47 cyclophosphamide et a pour but d'éradiquer totalement la réponse dirigée contre les tumeurs A549 mères non traitées. Lors de la récidive tumorale, les tumeurs sont également prélevées lorsqu'elles atteignent un volume compris entre 100 et 200 mm3. Elles sont ensuite partagées en deux portions égales. Une partie sera cryocongelée dans 5 le but de générer des lames d'immunohistochimie de type tissue array comme décrit ci-dessus pour les tumeurs témoin PBS. Un broyat sera préparé avec la seconde partie et servira à immuniser les souris préalablement tolérisées avec les tumeurs A549 non traitées. Ces souris recevront en tout 3 injections intra-péritonéales de broyats de tumeurs résistantes à la trithérapie adjuvées par l'adjuvant complet de Freund pour la 10 première injection et par l'adjuvant incomplet de Freund pour les injections suivantes. Une fusion cellulaire est ensuite effectuée et les hybridomes résultant de cette fusion criblés en immunohistochimie sur les lames type tissue array préalablement préparées. Les hybridomes sécrétant des anticorps reconnaissant les tissus résistant et ne 15 reconnaissant ni les tumeurs issues du lot témoin PBS ni la cellule A549 native ayant servi à établir la tumeur in vivo sont clonés et congelés. Les anticorps sont ensuite produits en liquide d'ascite, purifiés, re-testés en immunohistochimie avant d'être testés in vivo sur des cellules exprimant une structure ou antigène de surface reconnu par ces anticorps (ces cellules ont été préalablement sélectionnées par analyse au FACSCAN 20 d'un panel non exhaustif de lignées tumorales disponibles pour chaque anticorps). La figure 4 montre le profil des anticorps retenus. Le tableau 6 ci-dessous regroupe, quant à lui, les cellules reconnues par ces anticorps (Reconnaissance des anticorps sélectionnés en histologie au FACSCAN de différentes lignées cellulaires).

25 2906533 48 Tableau 6 Hybridome Clone Isotype Modèle vivo 1A6 C7 IgM k MCF7/Co1o205 D10 LnCap/HT29 1A9 El I IgG I k HepG2/H69/LnCap F1 2E11 A2 IgGI k HT29/BxPC3/H69 B11 2E11 A8 IgG 1 k HT29/BxPC3/H69 B9 3C11 E8 IgM k Colo205 E9 3G7 A7 IgM DU145 B2 Exemple 3 : Evaluation de l'activité anti-tumorale des anticorps générés selon 5 l'invention (plus particulièrement 1A6 et 2E11) dans un modèle de xénogreffe de colon HT29 5.106 cellules HT29 sont greffées à des souris Swiss-Nude . Cinq jours après la greffe, les tumeurs sont mesurables et les souris sont divisées en trois lots de six souris ayant des tumeurs de taille homogène. Les souris sont traitées soit avec du PBS 10 (contrôle négatif) soit avec 0,5 mg d'anticorps 1A6 ou 2E11, trois fois par semaine (première injection en dose d'appel : 1 mg/souris). Le suivi du volume tumoral est effectué deux fois par semaine, sachant que le volume tumoral est calculé classiquement selon la formule suivante : (rr/6)x(l)x(L)x(e), avec 1=largeur mesurée, L=longueur mesurée et e=épaisseur mesurée.

15 Les résultats sont représentés à la figure 5. Les cellules HT29 peuvent être considérées comme étant de phénotype agressif. Les résultats obtenus mettent en évidence la possibilité d'utiliser des anticorps dirigés contre des antigènes de cellules tumorales issues de tumeur traité par et résistante à une composition anti-tumorale (voir exemple 2) à titre de composé anti-tumoral pour traiter 20 des tumeurs de phénotype agressif Les résultats obtenus dans cette expérience valident l'approche originale de génération des anticorps et le concept de la génération d'anticorps à visée thérapeutique 2906533 49 à partir de résistances induites chez la souris. Ce procédé peut être appliqué à toute autre combinaison de drogue, y compris des drogues de chimiothérapie seules ou combinées entre elles ou à des anticorps ou à des inhibiteurs de tyrosine kinase ou à des inhibiteurs de protéasome, en procédant de la même façon.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de génération in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral exprimé à la surface d'une tumeur résistante à au moins un composé anti-tumoral, à partir d'animaux préalablement immunisés directement avec un broyat et/ou une suspension et/ou un lysat cellulaire issu(e) de ladite tumeur résistante, le procédé comprenant une étape consistant à sélectionner les anticorps reconnaissant la tumeur résistante et non la tumeur native dont est issue la tumeur résistante.

2. Procédé selon la revendication 1, à partir d'animaux préalablement immunisés par injection intra-péritonéale et/ou sous- cutanée et/ou intra-veineuse et/ou intra-splénique.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral exprimé à la surface de ladite tumeur résistante est un anticorps monoclonal.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, est une immunoglobuline sélectionnée parmi le groupe consistant en une IgG, une IgA, une IgM, une IgD ou une IgE.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, est une IgG d'isotype gamma 1, gamma 2 ou gamma 4.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit fragment fonctionnel est choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc et les diabodies, ou tout fragment dont la demie-vie aurait été augmentée comme des fragments pégylés.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) fusionner in vitro des cellules de la rate de l'animal préalablement immunisé avec des cellules de myélome de manière à obtenir des hybridomes, et ii) sélectionner, par sélection différentielle, les hybridomes sécrétant des anticorps reconnaissant spécifiquement les antigènes exprimés à la surface des cellules 2906533 51 tumorales de la tumeur résistante et dont l'expression est induite par le traitement antitumoral.

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite lignée tumorale et/ou tumeur native est sélectionnée parmi le groupe consistant en les cellules 5 tumorales de poumon, colon, prostate, sein, ovaire ou toute tumeur pour lesquelles des résistances aux traitements sont constatées.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 8, caractérisé en ce que ledit au moins un composé anti-tumoral est choisi parmi les agents de chimiothérapie, les agents de radiothérapie, d'hormonothérapie, les molécules 10 chimiques comme les inhibiteurs de tyrosine kinase ou les anticorps.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit au moins un composé anti-tumoral consiste préférentiellement en un anticorps monoclonal.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en 15 ce que ledit anticorps est un anticorps monoclonal et en ce qu'il est choisi parmi le groupe consistant en les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, dirigés contre les récepteurs de facteur de croissance, les molécules impliquées dans l'angiogénèse, ou encore les chémokines et intégrines impliquées dans les phénomènes de migration cellulaire. 20

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que ledit au moins un composé anti-tumoral consiste en une combinaison d'au moins deux, préférentiellement au moins trois, composés anti-tumoraux de nature différente et/ou présentant des mécanismes d'action différents et/ou ciblant des protéines différentes. 25

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite combinaison de composés anti-tumoraux consiste en une combinaison d'anticorps monoclonaux, ou de leurs fragments fonctionnels.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite combinaison d'anticorps monoclonaux, ou de ses fragments fonctionnels, consiste en 30 une combinaison d'anticorps sélectionnés parmi les anticorps anti-IGF-IR, anti-EGFR, anti-Her/2neu, anti-VEGF, anti-VEGFR, anti-CXCR, anti-cMET, anti-RON. 2906533 52

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite combinaison consiste en la combinaison d'un anticorps anti-IGF-IR, d'un anticorps anti EGFR et d'un anticorps anti-Her/2neu.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite 5 combinaison consiste en une combinaison des anticorps monoclonaux 7C10, 225 et h4D5.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé en ce que ladite étape ii) de sélection des hybridomes sécrétant des anticorps ne reconnaissant pas les antigènes de la cellule tumorale native est réalisée par criblage 10 différentiel des anticorps sécrétés par les hybridomes entre la tumeur native et la tumeur résistante.

18. Procédé de génération et de sélection in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable d'inhiber la résistance d'une tumeur à un composé anti-tumoral ou procédé de génération et de sélection in vitro d'un anticorps, ou l'un de 15 ses fragments fonctionnels, dirigé contre un antigène tumoral exprimé à la surface d'une tumeur résistante à au moins un composé anti-tumoral, ledit antigène tumoral étant impliqué dans la résistance de ladite tumeur au composé anti-tumoral, caractérisé en ce que le procédé comprend: a) un procédé de génération in vitro d'un anticorps, ou l'un de ses fragments 20 fonctionnels, selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, ledit anticorps étant dirigé contre ledit antigène tumoral exprimé spécifiquement à la surface de la tumeur résistante, ledit antigène tumoral n'étant pas exprimé à la surface des cellules de la tumeur native dont est issue la tumeur résistante; b) la mise en contact in vitro de l'anticorps obtenu à l'étape a) avec la tumeur 25 résistante au composé anti-tumoral ; et c) la sélection dudit anticorps s'il est mis en évidence un effet inhibiteur de cet anticorps sur la résistance de la tumeur au composé anti-tumoral.

19. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour générer des anticorps monoclonaux thérapeutiques et/ou diagnostiques. 30

20. Anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 18. 2906533 53

21. Anticorps monoclonal selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit fragment fonctionnel est choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2 Fab', scFv, scFv-Fc et les diabodies, ou tout fragment dont la demie-vie aurait été augmentée comme des fragments pégylés. 5

22. Anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 1, 2 et 3, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 1, 2 et 3 ; et 10 - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 4, 5 et 6, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 4, 5 et 6.

23. Anticorps selon la revendication 22, dénommé 1 A6 et caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 7 et 15 en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 8.

24. Hybridome murin capable de sécréter un anticorps selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23.

25. Hybridome murin selon la revendication 24 déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 20 le 31 mai 2006 sous le N I-3612.

26. Anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 9, 10 et 11, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement 25 optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 9, 10 et 11; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 12, 13 et 14, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 12, 13 et 14.

27. Anticorps selon la revendication 26, dénommé 1A9 et caractérisé en ce 30 qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 15 et en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 16. 2906533 54

28. Hybridome murin capable de sécréter un anticorps selon l'une quelconque des revendications 26 ou 27.

29. Hybridome murin selon la revendication 28 déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 5 le 31 mai 2006 sous le N I-3613.

30. Anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 17, 18 et 19, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement 10 optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 17, 18 et 19; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 20, 21 et 22, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 20, 21 et 22.

31. Anticorps selon la revendication 30, dénommé 2E11 et caractérisé en ce 15 qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 23 et en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 24.

32. Hybridome murin capable de sécréter un anticorps selon l'une quelconque des revendications 30 ou 31.

33. Hybridome murin selon la revendication 32 déposé à la CNCM 20 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 31 mai 2006 sous le N I-3615.

34. Anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 25, 25 25 26 et 27, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 25, 26 et 27 ; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 28, 29 et 30, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 28, 29 et 30. 30

35. Anticorps selon la revendication 34, dénommé 3C11 et caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 31 et en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No. 32. 2906533 55

36. Hybridome murin capable de sécréter un anticorps selon l'une quelconque des revendications 34 ou 35.

37. Hybridome murin selon la revendication 36 déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 5 le 31 mai 2006 sous le N I-3614.

38. Anticorps monoclonal, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 33, 34 et 35, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement 10 optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 33, 34 et 35 ; et - une chaîne lourde comprenant les régions CDRs de séquences SEQ ID Nos. 36, 37 et 38, ou dont les séquences présentent au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID Nos. 36, 37 et 38.

39. Anticorps selon la revendication 38, dénommé 3G7 et caractérisé en ce 15 qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence SEQ ID No. 39 et en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant la séquence SEQ ID No.

40. 40. Hybridome murin capable de sécréter un anticorps selon l'une quelconque des revendications 38 ou 39.

41. Hybridome murin selon la revendication 40 déposé à la CNCM 20 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 31 mai 2006 sous le N I-3616.

42. Anticorps selon l'une des revendications 20-23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38 ou 39, caractérisé en ce que ledit fragment fonctionnel est choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc et les diabodies, ou tout fragment dont la demie- 25 vie aurait été augmentée comme des fragments pégylés.

43. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce que ledit anticorps est sécrété par l'hybridome selon la revendication 25, 29, 33, 37 ou 41.

44. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une quelconque des revendication 20-23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38 ou 39, caractérisé en ce que ledit 30 anticorps est un anticorps chimérique et comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris. 2906533 56

45. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 44, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps chimérique et ladite espèce hétérologue est l'Homme.

46. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 5 45, caractérisé en ce que les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région kappa et, gamma I, gamma 2 ou gamm4.

47. Anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 44 à 46, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps humanisé et 10 comprend une chaîne légère et/ou une chaîne lourde dans lesquelles les segments de squelette FR1 à FR4 de ladite chaîne légère et/ou chaîne lourde sont dérivés respectivement de segments de squelette FR1 à FR4 de chaîne légère et/ou de chaîne lourde d'anticorps humains.

48. Acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides 15 nucléiques suivants: a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38 ou 39; b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini en a) ; 20 c) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'un des CDRs de séquences SEQ ID Nos. 41-46,

49-54, 57-62, 65-70, 73-78, ou avec une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78 ; et 25 d) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'une des chaînes légères de séquence SEQ ID No.48, 56, 64, 72 ou 80 et/ou l'une des chaînes lourdes de séquence SEQ ID No. 47, 55, 63, 71 ou 79, ou avec une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 47, 48, 55, 56, 63, 64, 71, 72, 79 ou 30 80. 49. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 48.

50. Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 49. 2906533 57

51. Animal transgénique à l'exception de l'Homme comprenant une cellule transformée par un vecteur selon la revendication 50.

52. Procédé de production d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38 ou 39, 5 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule selon la revendication 50; et b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ainsi produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées. 10

53. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39 ou 42 à 47, à titre de médicament.

54. Composition comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 20 15 à 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42 à 47ou 53, ou produit par l'hybridome selon l'une des revendications ou 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37 ou 40.

55. Composition selon la revendication 54, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, un agent de chimiothérapie, un agent de radiothérapie 20 ou un anticorps.

56. Composition selon la revendication 54 ou 55, à titre de médicament.

57. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 53 et/ou d'une composition selon la revendication 56 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer. 25

58. Utilisation selon la revendication 57, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer de type résistant choisi parmi les cancers du colon, de la prostate, du sein, du poumon, de l'ovaire ou du pancréas.

59. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42 à 47 ou 30 53, ou produit par l'hybridome selon l'une des revendications ou 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37 ou 40, pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un 2906533 58 composé biologiquement actif vers des tumeurs résistantes et/ou se trouvant à un stade tardif.

60. Procédé d'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques, intra- ou extracellulaires, impliquées dans des phénomènes de résistance, 5 caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour obtenir un anticorps monoclonal puis à identifier la protéine reconnue par ledit anticorps monoclonal.