KR101504770B1 - 내성 항원에 대항하는 활성 항체의 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 항체 및 이의 용도 - Google Patents

내성 항원에 대항하는 활성 항체의 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 최소한 하나의 항-종양 물질에 대한 내성 종양으로부터 유래된 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물의, 상기 내성 종양의 종양 세포의 표면에 발현되는 종양 항원에 직접적으로 대항하며, 상기 항-종양 물질 내성 종양의 내성과 관계가 있을 수 있는 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 면역화하고 생산하기 위한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항체 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 및 3G7과 같은, 상기 방법을 적용함으로써 얻어진 항체 뿐만 아니라 암을 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

내성 항원에 대항하는 활성 항체의 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 항체 및 이의 용도{Method for generating active antibodies against a resistance antigen, antibodies obtained by said method and their uses}
본 발명은 치료학적 및/또는 진단학적 목적을 가진 단일클론 항체를 생산하기 위한 새로운 시도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 천연 종양의 종양 세포 표면에 존재하지 않으며, 이 천연 종양의 항-종양 치료 후에 나타나는 종양 항원-이 항원은 이들 항-종양 치료에 대한 종양 내성과 관련이 있을 수 있음-에 직접적으로 대항하는 항체를 생산하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 이러한 항체 뿐만 아니라 내성 종양의 예방학적 및/또는 치료학적 처치를 하기 위한 약물로서의 이들 항체의 용도도 포함한다. 최종적으로, 본 발명은 항암제와 관련이 있을 수 있는 이러한 항체 및 이러한 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 항체의 용도를 포함한다.
항체의 발견 및 보다 구체적으로 항체를 생산하기 위한 방법의 개발은 치료학적 치료 또는 진단, 보다 구체적으로는 암 분야에 있어서는 혁명이었다. 실제 로, 맨 처음으로, 이러한 새로운 기술은 항체의 내인성 인식 특징으로 인해 목적으로 하는 치료의 가능성을 제공하였다. 최근 10년 동안의 주요한 시도는 첫번째 단계에 다중클론 항체, 단일클론 항체 또는 심지어는 항체의 단편 또는 이의 유사 구조든 상관없이 항체를 생산하기 위한 방법으로 이루어졌었다.
오늘날, 치료학적 및/또는 진단학적 목적을 가진 항체를 생산할 수 있게 하기 위해 당업자에 의해 몇가지 기술이 개발되었다.
가장 오래된 항체는 다중클론 항체, 즉 면역화된 동물 혈청에 포함된 항체의 이종 집단으로 이루어졌다. 이를 수행하기 위해, 몇가지 동물들(생쥐, 집쥐, 토끼, 염소, ...)은 면역 반응을 촉진하고 강화하기 위한 목적으로, 천연 또는 합성 항원을 프루인트 항원보강제(Freund's adjuvant)와 같은 하나 이상의 항원보강제 및 알루미늄 하이드록사이드와 혼합하여 주입함으로써 면역화시켰다. 그리고 난 뒤, 이 동물들에서 피를 뽑고, 혈청 또는 항원의 몇가지 에피토프를 보다 더 혹은 적게 효과적으로 인식하근 항체(다중클론 항체)를 모두 포함하는 항-혈청, 및 동물의 다른 항체를 회수하였다. 회수된 항체의 정제는 예를 들어 친화 크로마토그래피 정제에 의해 수행되었다.
첫번째 개발은 콜러와 밀스테인에 의해 기술된 기술(KOHLER and MIELSTEIN, 1975)에 따라 하이브리도마로부터 얻어질 수 있는 단일클론 항체를 생산하는 기술이었다. 이 기술은 미리 결정된 항원에 특이적인 단일클론 항체를 생산할 수 있게 하며, 소위 하이브리도마라고 불리는 세포를 얻기 위해 림프구 B 클론을 골수종 세포와 혼합하는 것을 포함한다. 이 하이브리도마는 불멸의 특징을 가질 뿐만 아니 라 단일클론 항체, 단일특이적 항체를 영구적으로 생산하는 특징을 갖는다.
이와 동일한 기술을 기초로 하는 다른 기술은 트리오마(trioma) 기술 또는 코즈보 등의 문헌(KOZBOR et al. 1983)에 기술된 하이브리도마 기술이었다.
이들 기술은, 초기에는 인간화된 항체 또는 인간 키메라 항체를 생산하게 하는 생쥐 항체를 생산하는 것이었다. 이들 기술 모두는 오늘날 당업자들에게는 잘 알려진 것이다.
인간 항체는 유전학적으로 변형된 생쥐, 미합중국 특허 제5,814,318호 및 소위 <<제노마우스(xenomouse)>>라고 불리는 기술을 이용함으로써 얻을 수 있다.
인간 단일클론 항체, 보다 구체적으로는 항체의 단편을 생산하기 위해 최근 다른 방법들이 개발되었으며, 예를 들면 라이더 등의 문헌(RIDDER et al. 1995)에 기재된 파지 은행 또는 파지 라이브러리를 이용하는 기술 또는 말초혈액으로부터 유래되는 인간 세포의 디렉토리로부터 mRNA를 추출하고, cDNA 은행 또는 다양한 부위의 서열을 포함하는 라이브러리를 만들고, 단편, 바람직하게는 Fab 단편으로서 항체의 다양한 부위를 생산하기 위해 cDNA를 파지에 삽입하는는 것을 기초로 하는 소위 <<파지 디스플레이>>라고 불리는 기술을 개발하였다.
비록 이들 방법은 다르지만, 공지된 항원을 면역화하거나 라이브러리 또는 은행의 범위에 해당하고, 이러한 동일한 공지되고 확립된 항원을 이용해서 이들 은행을 스크리닝한다는 동일한 특성을 모두 갖고 있다.
본 발명은 더이상 공지되고 확립되었지만 종양의 전체 또는 일부인 항원을 이용하지 않는다는 점에서 이들 방법과는 다르다. 보다 구체적으로, 본 발명은 종 양으로부터 분해물 및/또는 현탁액 및/또는 가공된 세포 균질화물을 직접적으로 사용한다. 암을 치료하는데 있어서, 몇년 동안 첫번째 치료학적 처치를 하고 난 뒤에 완전하고 만족할 만한 반응을 나타낸 여러명의 환자들은 원래 상태로 되돌아가는 경향을 보인 것으로 관찰되었다. 보다 구체적으로, 암은 이들에게 적용된 다른 처치에 대해 저항하기 위해 그의 유전형 및/또는 표현형을 변형할 수 있는 것으로 알려졌다.
이러한 현상은 방사선요법, 화학요법 형태의 처치 및 단일클론 항체를 이용한 처치 모두에 대해 존재한다.
역사적으로, 암을 치료하기 위한 첫번째 화학요법 물질은 1940년도의 임상 실험의 주제였다. 이들은 주로 코르티코스테로이드(corticosteroid), 안티폴레이트(antifolate) 또는 빈카 알카로이드(vinca alcaloid)와 같은 짧은 반감기를 가진 제제였다. 그러나, 완전히 경감되었다고 하더라도, 후자는 1년 이상 더이상 지속되지 않았으며, 전반적으로 다시 되돌아가는 경향이 관찰되었어, 이러한 되돌아감은 치료에 사용된 화학요법 물질에 대한 내성과 관련이 있었다(Lehnert M., Eur. J Cancer, 1996, 32A:912-920).
이러한 현상에 대응하기 위해, 다양한 항-종양 물질을 이용하는 소위 <<혼합>> 처치라고 불리는 처치가 수행되었다. 더 좋은 결과는 다른 물질을 동시에 또는 연속적으로 사용함으로써 실제로 얻어졌다. 실제로, 세포독성을 갖지만 다른 작용 매커니즘을 갖는 다른 항-종양 물질을 사용하는 경우, 이 물질에 내성을 갖는 종양 세포는 사용된 다른 물질 중 최소한 하나에 대해 여전히 민감성을 나타낼 수 있다.
그러나, 다른 항-종양 물질 또는 제제를 사용함에도 불구하고, 종양의 내성은 화학요법 치료 범위 내에서의 주요한 문제로 남아있다. 혼합 사용은 내성 현상의 발생을 지연시켜주는 효과를 갖지만 이를 없애도록 하지는 않는다. 초기 치료와 관련이 있거나 유리한 초기 반응 이후에 다시 재발하는 화학요법에 대한 내성은 소위 <<치료할수 있는>> 것으로 불리는 암에서 발생한다.
그 예로서, 특허공보 WO 2005/077385, WO 2004/026293 또는 WO 2004/110497이 언급될 수 있으며, 이는 내성 현상을 조절하기 위한 새로운 방법에 대한 시도를 보여주며, 이들 특허 모두는 새로운 일반적인 화학 분자를 추가로 주입하는 것을 기본으로 한다.
치료에 대해 초기에 민감한 종양 내성을 얻기 위한 다른 매커니즘도 증명되었다. 가장 광범위하게 인식되는 가설은 이러한 내성 현상이 종양 세포의 유전형에 있어서 체세포 돌연변이의 축적이 연속적이고 무작위로 수행되는 결과를 나타낸다는 것을 포함한다(Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and practice, Chabner & Lango editors, 1996, chapter 1).
다른 공지되고 기술된 내성 현상인 소위 <<MDR>>(다중약물 내성, MultiDrug Resistance)은 약동학적, 화학적 또는 구조적으로 다른 세포독성 물질이 과량인 치사량 농도에서도 종양 세포가 생존할 수 있다는 성질을 기초로 한다. <<MDR>>의 특성을 나타내는 세포는 전달 단백질에 의해 상기 물질을 제외시킴으로써 유발되는 세포내 세포독성 물질의 축적을 감소시킨다. <<다중-약물 전달자(multi-drug transporters)>>는 라고 불리는 이들 단백질은 세포로부터 광범위한 독성 물질을 배제시킬 수 있는 막 단백질이다. 이들 <<다중-약물 전달자>>는 ATP 가수분해 에너지를 활성으로 사용하는 전달 단백질이다. 이 <<MDR>>의 원인이 되는 몇가지 메커니즘도 밝혀졌다. ATP 의존적인 제외 메커니즘과 관련된 이러한 내성을 포함하는 가장 잘 알려진 유전자는 MDR1 유전자이다.
화학요법 처치에 의해 유도되는 이러한 내성 현상과 동시에, 단일클론 항체를 처치하고 난 뒤에 유도되는 내성도 언급되었다. 이러한 내성은 약동학적 고려에 대해 숙주 세포의 특성과 관련이 있을 것이며, 실제 종양에 대해 내인성을 가질 수 있을 것이다.
먼저, 생쥐 항체와 관련된 항체를 맨처음 사용하는데 있어서, 그 결과는 항체가 상기 생쥐 항체에 대해 반응을 한다는 것이며, 이는 소위 HAMA(인간 항-생쥐 항체, Human Anti-Mouse Antibody) 반응으로 불린다. 숙주세포에 관련된 내성의 형태는 더이상 생쥐 항체를 사용하지 않게 하며, 인간 또는 인간화된 항체를 사용하게 한다.
이러한 인간 또는 인간화 항체를 이용한 다른 테스트들은 종양이 면역학적 치료에 대해 내성을 띌 수 있다는 새로운 현상을 설명해준다. 이들 새로운 매커니즘은 주로 종양에서 유도된 돌연변이, 표적 항원의 절단(또는 흘림) 또는 이 항원의 발현의 소실에 대해 그 다음으로 수반되는 수용체의 구조적 활성을 기초로 한다.
이후의 실시예 1에서 보는 바와 같이, 예를 들어 본 발명자에 의해 수행된 연구에서는 항-IGF-1R, EGFR 및 Her/2neu 삼중치료법이 처치된 생쥐의 약 90%에서 완전히 종양이 사라질때 까지 누드 생쥐에서의 A549 세포에서의 종양 성장을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 비록, 이러한 다중 치료법이 단일치료법 또는 이중치료법보다는 훨씬 효과적이지만, 종양이 완전히 없어지지는 않았으며, 치료를 계속함에도 불구하고 점차 재발하므로: 이는 다중 치료법에 대해 내성을 띄게 됨을 알 수 있다.
이러한 관찰을 통해, 본 출원인은 항원-이 항원은 항-종양 치료에 대해 내성인 이러한 종양의 종양 세포 표면에서 유도되고, 천연(미처치한) 종양의 종양 세포 표면에서는 발현하지 않으며, 항-종양 처치에 대해 내성을 띌 수 있음-을 인식할 수 있는 항체, 바람직하게는 치료학적 및/또는 진단학적 단일클론 항체를 생산하기 위해 이러한 내성 종양을 직접 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 첫번째 양태에 따르면, 본 발명의 목적은 최소한 하나의 항-종양 물질에 대한 내성 종양으로부터 유래된 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물의, 상기 내성 종양의 종양 세포의 표면에 발현되는 종양 항원에 직접적으로 대항하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 면역화하고 생산하기 위한 용도로서, 이 종양 항원은 내성 종양으로부터 유래되는 천연 종양의 종양 세포 표면에서 발현되지 않고, 이 종양 항원은 상기 항-종양 물질 내성 종양의 내성과 관계가 있을 수 있는 것을 특징으로 한다.
표현 <<가공된 균질화물(milled homogenate)>> 또는 <<세포 균질화물>>은 물리적인 분해, 예를 들어 <<Potter>> 타입인, 초음파 분쇄기, Ultraturax ? 타입, 분쇄기를 이용해 얻어진 종양(이종이식, 같은자리 이식(orthotopic graft), 동계 이식(syngeneic graft), 종양이 재발한 처치된 환자 또는 세포 배양물로부터 얻은 생검체)으로부터 유래된 세포 및/또는 세포 단편의 혼합물을 의미한다.
표현 <<현탁액(suspension)>> 또는 <<세포 현탁액>>은 시험관 내에서 처치를 하거나 하지 않으면서 배양하고, 효소 용액 또는 비-효소적 분해 용액에 의해 부착력이 떨어진 세포의 현탁액을 의미한다.
표현 <<분해물(lysate)>> 또는 <<세포 분해물>>은 효소적 분해에 의해 얻어진 종양(이종이식, 같은자리 이식(orthotopic graft), 동계 이식(syngeneic graft), 종양이 재발한 처치된 환자 또는 세포 배양물로부터 얻은 생검체)으로부터 유래된 세포 및/또는 세포 단편의 혼합물을 의미한다.
<<내성 종양>>은 적용된 처치에 대해 반응하지 않거나 더이상 반응하지 않는 종양을 의미한다. 상기에 기술한 바와 같이, 이러한 내성은 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법 처치, 또는 항체를 사용하고 난 뒤에 관찰될 수 있으며, 이러한 처치는 단독으로 또는 조합하여 적용될 수 있다. 현재 알려져 있거나 알려지지 않은 다양한 매커니즘은 내성 특징을 기원으로 할 것이다. 결국, 내성은 최초에 적용된 처치의 효과가 소실되거나 감소되는 것으로 표현될 수 있다.
물론, 알려지고 공지된 <<이탈(escape)>> 현상은 본 발명이 조절하기 위해 찾은 내성 현상의 일부이다.
천연 종양(또는 부모 종양)은 이로부터 내성 종양이 유발되는 종양을 나타내는 것을 의미하며, 천연 종양은 내성 종양에 대항하여 어떠한 항-종양 처치도 수행하지 않는다.
종양 항원은 구체적으로는 천연 종양 또는 내성 종양으로부터 유발되든지 간에 종양 세포의 표면에 발현되는 항원이며, 이 종양 항원은 건강한 세포의 표면에서는 발현되지 않는다. 일반적으로 이 종양 항원은 항원이 특이적으로 결합할 수 있는 천연의 거대분자(이는 합성될 수 있음)이다. 이 종양 항원은 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 탄수화물, 핵산, 지질, 헵텐 또는 종양 세포 표면에서 자연적으로 존재하는 다른 모든 물질이 될 수 있다.
마지막으로, 본원에 사용된 표현 "항체" 또는 "면역글로불린"은 광범위하게는 서로 혼용하여 사용되며, 단일클론 항체(예를 들어 전체 또는 완전 단일클론 항체), 다중클론 항체, 다원자가 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 요구되는 생물학적 활성을 나타내는 것으로 제공되는 이중특이성 항체)를 포함한다. 또한, 키메라 또는 인간화 항체도 이런 표현에 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 당단백질에 포함되는 분자는 이황 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 변이 부위(또는 도메인)(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 보존 부위로 구성된다. 중쇄의 보존 부위는 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 변이 부위(LCVR 또는 VL) 및 경쇄 보존 부위로 구성된다. 경쇄 보존 부위는 LC 도메인을 포함한다. VH 및 VL 부위는 CDR(상보적 결정 부위, Complementary Determining Region)이라고 불리는 과변이성 부위 및 프레임워크 부위(FR)라고 불리는 삽입된 보다 보존된 부위로 나뉜다. VH 및 VL 각각은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순으로 말단 아미노기에서 말단 카르복시기 방향으로 정열된다. 중쇄 및 경쇄의 변이 부위는 항원과 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 항원의 보존 부위는 숙주 조직 또는 면역 시스템의 다른 세포(예를 들어 작용자(effector) 세포) 및 첫번째 성분(Clq) 또는 표준 보체 시스템을 포함하는 인자에 대해 면역글로불린의 결합의 매개할 수 있다.
이들은 면역글로불린(IgG, IgE, IgM, IgA 등)의 기원이나 형태와 관련하여 바람직한 친화도 및 특이성을 보일 수 있는 특정한 항체 단편(보다 구체적으로 표현해서)을 포함할 수 있다.
원칙적으로, 생쥐를 기원으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편을 제조하기 위해, 지침서 <<항체>> (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)에 기재된 기술 또는 콜러와 마일스테인(Kohler et Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)에 의해 기재된 문헌의 하이브리도마로부터 제조하는 기술이 참조문헌으로 첨부될 수 있다.
본 발명에 따라 제조하기 위해 찾는 항체 중에서는, 상기에 기술된 항체가 바람직하며, 소위 <<활성>> 항체라고 불리는 것은 처치에 대해 저항하는 종양 세포를 표적으로 하는 항-종양 활성을 가진다.
본 발명에 따라, 구체적으로는 본 발명의 양태에 따라 제조하기 위해 찾는 항체 중에서는, 상기에 기재된 항체가 바람직하며 이들은 이들 항체에 대항하는 항원을 자연적으로(처치하기 전에) 발현하는 공격적인 표현형을 가진 종양 세포에 대해 직접적으로 항-종양 활성을 나타낼 수 있다.
첫번째 구현예에서, 본 발명에 따른 용도는 상기 내성 종양이, 내성을 유발할 수 있거나 종양의 내성이 확인된 최소한의 항-종양 물질을 이용하여 치료학적으로 처치하고 있는 중이거나 치료하고 난 뒤의 환자의 생검 및/또는 수술에 의해 직접적으로 얻어지는 것을 특징으로 한다.
이 구현예에서, 각 환자에 적용되는 치료법은 본 발명에 따라 생산된 항체가 실제 환자로부터 유래된 내성 종양의 전체 또는 일부를 이용해 수행되는 면역화에 대해 반응하는 것으로 설명될 수 있다. 따라서, 생체밖에서 적용되는 환자의 치료법이 고려될 수 있다.
두번째 구현예에서, 본 발명에 따른 용도는 상기 내성 종양이 종양 세포주 및/또는 인간 종양의 전체 또는 일부를 동물에게 이식한 뒤, 내성을 유발하거나 확인하기를 바라는 최소한 하나의 항-종양 물질을 투여하여, 구체적으로는 주입하여 동물을 처치함으로써 유도되는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 상기 최소한 하나의 항-종양 물질은 화학 분자와 같은 화학요법제 또는 치료학적 항체 또는 방사선요법제로부터 선택될 수 있다.
본 명세서 전체에서, <<항-종양제>> 또는 <<항-종양 치료제>>는 환자에게 투여될 때, 환자의 암을 치료하거나 암의 발생을 예방하는 물질을 나타내는 것을 의미한다.
이러한 제제의 비제한적인 예로는, <<알킬화>> 제제, 항-대사제, 항-종양 항생제, 세포분열 저해제, 염색질 기능 저해제, 항-신생혈관형성 저해제, 항-에스트로겐, 항-안드로겐 또는 면역조절제와 같은 소위 <<세포독성>> 제제가 언급될 수 있다.
이러한 제제는 예를 들어 VIDAL 2006년도판의 <<세포독성>> 컬럼에 있는 암발생학 및 혈액학과 관련된 물질에 제공되는 페이지에 언급되어 있으며, 이 문헌에 참고로 언급된 이들 세포독성 물질은 바람직한 세포독성 제제로서 본원에 언급된다.
<<알킬화제>는 모든 분자, 바람직하게는 세포 내에 있는 핵산(예, DNA)을 알킬화하거나 공유결합할 수 있는 모든 물질을 일컫는다. 이러한 알킬화제의 예로서, 메클로레타민(mechlorethamine), 클로람부실(chloranbucil), 멜팔란(melphalan), 클로르하이드레이트(chlorhydrate), 피포브로만(pipobroman), 프레드니머스틴(prednimustine), 디소듐 포스페이트(disodium phosphate) 또는 에스트라머스틴(estramustine)과 같은 질소머스타드(nitrogen mustard); 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 알트레타민(altretamine), 트로포스파마이드(trofosfamide), 설포포스파마이드(sulfofosfamide) 또는 이포스파마이드(ifosfamide)와 같은 옥사자포스포린(oxazaphosphorine); 아지리딘(aziridine) 또는 티오테파(thiotepa), 트리에틸렌아민(triethyleneamine) 또는 알테트라민(altetramine)과 같은 에틸렌-이민; 카머스틴(carmustine), 스트렙토조신(streptozocin), 포테머스틴(fotemustine) 또는 로머스틴(lomustin)과 같은 나이트로소유레아(nitrosourea); 부설판(busulfan), 트레오설판(treosulfan) 또는 임프로설판(improsulfan)과 같은 알킬 설포네이트; 다카바진(dacarbazine)과 같은 트리아젠(triazene); 또는 시스플래티늄, 옥살리플래티늄 또는 카보플래티늄과 같은 백금복합체가 언급될 수 있다.
<<항-대사제>>는 특정한 활성, 구체적으로는 DNA 합성을 간섭함으로써 세포 성장 및 또는 세포 대사를 차단하는 물질을 일컫는다. 항-대사제의 에로는, 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 플록스유리딘(floxuridine), 5-플로로데옥시유리딘, 카페시타빈(capecitabine), 사이타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine), 사이토신 아라비노사이드, 6-머캅토퓨린(6-MP), 6-티오구아닌(6-TG), 클로로데옥시아데노신, 5-아자사이티딘, 젬시타빈(gemcitabine), 클라드리빈(cladribine), 데옥시코포마이신(deoxycoformycine) 및 펜토스타틴(pentastatin)이 있다.
<<항-종양 항체>>는 DNA, RNA 및/또는 단백질 합성을 억제 또는 저해할 수 있는 물질을 일컫는다. 이러한 항-종양 항체의 예는 독소루비신, 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valrubicin), 마이토잔트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 미쓰라마이신(mithramycin), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C, 블레오마이신(bleomycin) 및 프로카바진(procarbazine)을 포함한다.
<<세포분열 저해제>>는 세포 주기 및 세포분열의 정상적인 진행을 억제한다. 일반적으로 미소관 저해제 또는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)과 같은 <<탁소이드(taxoid)>>는 세포분열을 저해할 수 있다. 빈블라스틴(vinblastin), 빈크리스틴(vincristin), 빈데신(vindesin) 및 비노렐빈(vinorelbin)과 같은 빈카(vinca) 알칼로이드도 세포분열을 저해할 수 있다.
<<염색질 기능 저해제>> 또는 <<토포-아이소머라아제 저해제>>는 토포-아이소머라아제 I 및 II와 같은 염색질-모델링 단백질의 정상적인 기능을 저해하는 물질을 일컫는다. 이러한 저해제의 예로는 토포아이소머라아제 I의 경우 캄토테신(camptothecin) 뿐만 아니라 이리노테칸(irinotecan) 또는 토포테칸(topotecan)과 같은 이의 유도체를 포함하며, 토포아이소머라아제 II의 경우는 에토포사이드(etoposide), 에티포사이드(etiopside) 포스페이트 및 테니포사이드(teniposide)를 포함한다.
<<항-혈관신생저해제>>는 혈관 성장을 저해하는 모든 약물, 화합물, 물질 또는 제제를 일컫는다. 항-혈관신생저해제의 예로는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 라조신(razoxin), 마리마스타트(marimastat), 바티마스타트(batimastat), 프리노마스타트(prinomastat), 타노마스타트(tanomastat), 일로마스타트(ilomastat), CGS-27023A, 할로푸기논(halofuginone), COL-3, 네오바스타트(neobastat), BMS-275291, 탈리도마이드(thalidomide), CDC 501, DMXAA, L-651582, 스쿠알라민(squalamine), 엔도스타틴, SU5416, SU6668, 알파-인터페론, EMD121974, 인터루킨-12, IM862, 안지오스타틴 및 비탁신(vitaxin)을 포함한다.
<<항-에스트로겐>> 또는 <<항-에스트로겐제>>는 에스트로겐의 활성을 감소, 중화 또는 저해하는 모든 물질을 일컫는다. 이러한 제제의 예로는 타목시펜(tamoxifen), 토레미펜(toremifen), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 이오독시펜(iodoxyfene), 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole) 및 엑세메스탄(exemestane)이 있다.
<<항-안드로겐>> 또는 <<항-안드로겐제>>는 안드로겐의 활성을 감소, 중화 또는 저해하는 모든 물질을 일컫는다. 항-안드로겐의 예로는 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비카루타미드(bacalutamide), 스피로노락톤(spironolactone), 사이프로테론 아세테이트(cyproterone acetate), 피나스테리드(finasteride) 및 시미티딘(cimitidine)이 있다.
면역조절제는 면역 시스템을 촉진하는 물질이다. 이러한 면역조절제의 예로는 인터페론, 알데스루킨(aldesleukin), OCT-43, 데니루킨 디플리톡스(denileukin diflitox) 또는 인터루킨-2와 같은 인터루킨, 타소네르민(tasonermin)과 같은 종양 괴사 인자, 또는 렌티난(lentinan), 시조피란(sizofiran), 로퀴니멕스(roquinimex), 피도티모드(pidotimod), 페가데마스(pegademase), 타이모펜틴(thymopentin), poly I:C, 또는 5-플로로우라실과 결합되어 있는 레바미솔(levamisole)과 같은 다른 형태의 면역조절제를 포함한다.
보다 구체적으로, 당업자라면 다음의 문헌 <<traite de chimie therapeutique, Vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspective dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003>>에 기재된 화학요법에 관한 문헌을 언급할 수 있다.
항-종양제로서, 방사선요법제, 호르몬요법제 또는 티로신 키나아제 저해제와 같은 작은 분자에 의해 표적화되는 치료제가 언급될 수 있다. 결국, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 항-종양 제제의 일부인 항체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 반드시 이 예에 한정되는 것은 아니지만 아래의 항체가 언급될 수 있다: 세툭시맵(cetuximab)(C225 또는 에비툭스(erbitux)), 메투주맵(matuzumab), huR3, HuMax-EGFR 또는 파니튜맵(panitumab)과 같은 항-EGFR 항체; 베바시쥬맵(bevacizumab, Avastin) 또는 2C3와 같은 항-VEGF 항체; 7C10, h7C10, hEM164, ABX-IGF-1R, Mab 39, 1H7 또는 4G11과 같은 항-IGF-IR 항체; 트라스투주맵(trastuzumab, 헤르셉틴) 또는 페르투주맵(pertuzumab)과 같은 항-HER2 항체; 코메리툭시맵(commerituximab), 이브리투모맵(ibritumomab) 또는 토시투모맵(tositumomab)과 같은 항-CD20 항체; 젬투주맵(gemtuzumab) 또는 린투주맵(lintuzumab)과 같은 항-CD33 항체; 에프라투주맵(epratuzumab)과 같은 항-CD22 항체; 알렘투주맵(alemtuzumab)과 같은 항-CD52 항체; 에드레콜로맵(edrecolomab), Ch 17-1A 또는 IGN-101과 같은 항-EpCAM 항체; 작틴(Xactin)과 같은 항-CTP21 또는 16 항체; 131I-코타라(Cotara) TNT-1과 같은 항-DNA-Ag 항체; 펨튜모맵(pemtumomab) 또는 R1150과 같은 항-MUC1 항체; ABX-MA1과 같은 항-MUC18 항체; 미튜모맵(mitumomab)과 같은 항-GD3 항체; CeaVac 또는 레베튜주맵(lebetuzumab)과 같은 항-CEA 항체; OvaRex와 같은 항-CA125 항체; 아폴리주맵(apolizumab)과 같은 항-HLA-DR 항체; MDX-010과 같은 항-CTLA4 항체; MDX-070, 111In & 90Y-J591, 177Lu J591, J591-DM1과 같은 항-PSMA 항체; IGN311과 같은 항-루이스 Y 항체; AS1405 및 90YmuBC1과 같은 항-혈관신생 항체; TRAIL R1mAb 또는 TRAIL R2mAb와 같은 항-Trail-R1 항체; 또는 상기에 언급된 것을 제외한 티로신 키나아제 수용체 또는 RON, cMET, CXCR 2, CXCR4, 에프린형 수용체 등에 직접적으로 대항하는 모든 항체.
물론, 이 리스트는 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 단지 오늘날 사용되거나 개발되는 항체를 언급하기 위한 목적을 가진다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 내성 종양은 수회의 치료 또는 항-종양제에 대해 내성을 띄며, 이로 인해 다양한 형태가 될 수 있는 것으로 이해된다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 용도는 상기 최소한 하나의 항-종양 물질이 다른 특성 및/또는 다른 작용 매커니즘 및/또는 다른 단백질을 표적으로 하는 최소한 두개, 바람직하게는 최소한 3개의 물질로 이루어져 있는 것을 특징으로 한다.
다른 작용 매커니즘은 예를 들어 항-종양제가 혈관신생형성, DNA 합성 또는 세포분열과 같은 세포의 다른 생물학적 특성을 변화시킬 수 있는 것을 의미한다.
다른 단백질을 표적으로 한다는 것은 보다 구체적으로는 항-종양제가 단백질 또는 다른 특성의 수용체에 결합할 수 있는 항체인 경우를 의미한다.
보다 명백하게는, 항체만를 다른 것과 결합하거나, 또는 화학요법제만을 다른 것과 결합하거나 또는 이들 물질의 그룹 모두를 다른것과 결합하거나 또는 방사선치료법, 호르몬요법 치료 또는 상기에 기재된 바와 같은 작은 화학 분자를 이용하는 표적화 치료법이 고려될 수 있다.
바람직하게는, 다른 작용 메커니즘 또는 표적을 갖는 항-종양 물질 전체가 요구되는 것은 아니다.
두번째 양태에 따르면, 본 발명의 목적은 최소한 하나의 항-종양 물질에 대한 내성 종양의 표면에서 발현되는 종양 항원에 직접적으로 대항하는 항체, 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 시험관 내에서 생산하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 종양 항원은 바람직하게는 대응되는 천연(처치되지 않은) 종양의 종양 세포 표면에서 발현되지 않고, 상기 종양 항원은 항-종양 처치에 대해 내성을 띄는 상기 종양의 내성과 관련이 있을수 있으며, 이 방법은 상기 내성 종양으로부터 유래된 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물을 이용해 직접적으로 동물을 면역화시키는 단계, 및 내성 종양을 인지하지만 내성 종양으로부터 유래된 천연 종양을 인지하지는 못하는 항체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법의 특정 양태에 따르면, 이 방법은 상기 내성 종양의 내성과 관련이 있을 수 있는 내성 종양의 표면에서 발현되는 종양 항원에 대해 직접적으로 대항하는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 시험관 내에서 생산하기 위해 기술되며, 이 방법은 천연 종양(어떠한 처치가 수행된 피험자에게도 존재하지 않는 종양)으로부터 유래한 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물을 이용해 동물을 내성화시키거나 그렇지 하지 않고 난 뒤에, 최소한 한개의 항-종양 물질(종양 내성이 확인되거나 내성을 유발하는 것이 바람직한 항-종양 물질)에 대해 내성을 띄는 상기 종양으로부터의 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물을 이용해 동물을 직접적으로 면역화시키는 단계를 포함한다. 사이클로포스파마이드 타입의 면역억제제를 이용해 수행되는 이 내성화는 내성을 유발하기 위한 목적으로 또는 인간으로 간주되는 치료법의 범주 내에서 동물 또는 인간에게 항-종양 처치(들)를 적용하기 전에 존재하는 모든 표면 항원에 직접적으로 대항하여 면역 반응을 중지시키기 위한 목적을 갖는다. 따라서, 투여, 즉 내성 종양으로부터의 제제를 주입하고 난 뒤에 유발되는 면역 반응은, 처치에 의해 유발되는 표면의 구조에 촛점을 맞추며, 잠재적으로는 종양 내성을 확립하는 것과 관련이 있다. 내성화의 효율은 천연 종양으로부터 유발되는 종양 세포를 이용해 동물을 면역화시키고 난 뒤에 확립되는 혈청 역가가 사라지고 난 뒤에 평가된다.
상기의 본 발명의 방법에 따라 면역화된 생쥐의 비장을 샘플링한 뒤, 비장세포는 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 골수종 세포와 융합된다.
이러한 세포 융합 이후에 얻어지는 하이브리도마의 선별은 (처치되지 않은) <<천연 종양>> 절편 또는 내성 종양(항-종양제로 단일처리되거나 다중처리된) 절편을 포함하는 미리 준비한 슬라이드 상에서 <<분별 면역조직학(differential immunohistochemistry)>>을 수행함으로써 수행될 것이다. 항체를 생산하고, 이의 항-종양 활성에 대해 테스트하기 위해, 내성 종양은 인식하지만 천연 종양은 인식하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마 만이 선별되고, 클로닝되며 동결될 것이다. 이 방법 모두는 도 2 및 도 3에 도식화되어 있다. 이러한 시도가 세포내 내성 분자를 찾고 확인하기 위해 고려될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 얻어질 수 있는 생쥐 특이적인 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체이다.
단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편- 구체적으로는 생쥐를 기원으로 하는-을 제조하기 위해, 도서 <<항체>>(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)에 기재된 기술이 참고문헌으로 참조되거나 하이브리도마로부터의 제조 기술은 콜러와 마일스테인(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)에 의해 기재된 문헌이 참조된다.
키메라 또는 인간화 항체는 본 발명에 따른 항체로서 포함된다.
키메라 항체는 지정된 종의 항체로부터 유도된 천연의 변이(경쇄 및 중쇄) 부위와 상기 지정된 종(생쥐, 말, 토끼. 개, 소, 닭, 등)과는 이종인 종의 항체의 보존 경쇄 및 중쇄 부위가 연결된 것을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 키메라 타입 단편은 유전자 재조합 기술을 이용해 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터, 비-인간 즉 본 발명에 따른 생쥐 단일클론 항체의 변이 부위를 코딩하는 서열, 및 인간 항체 보존 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝함으로써 제조될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 본 발명의 키메라 항체는 예를 들어 생쥐-인간 컨스트럭트일 것이며, 이 항체의 특이성은 생쥐 DNA로부터 유래되는 변이 부위에 의해 결정되며, 이의 아이소타입(isotype)은 인간 DNA로부터 유래되는 보존 부위에 의해 결정된다. 키메라 항체를 제조하기 위한 방법은 예를 들어 아래의 문헌에 따를 수 있다: Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) 또는 미합중국 특허 제4816,567호.
인간화된 항체는 비-인간 기원의 항체로부터 유래된 CDR 부위를 포함하는 항체를 나타내는 것을 의미하며, 상기 항체 분자의 다른 부위는 하나(또는 그 이상의) 인간 항체(들)로부터 유래된다. 추가로, 골격(FR로 불림) 조각의 잔기 중의 일부는 결합 친화성을 보유하기 위해 변화될 수 있다(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).
본 발명에 따른 인간화된 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다(예를 들어 다음의 문헌에 기재된 바와 같음: Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).
다른 인간화 기술은 예를 들어 아래의 특허의 주제가 되는 PDL에 의해 기술된 <<CDR 이식>> 기술과 같은 당업자에게 잘알려진 기술이다: EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 또는 US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 및 US 5,693,761. 특허 US 5,639,641 또는 US 6,054,297, US 5,886,152 및 US 5,877,293도 언급될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 기능적 단편은 단편 Fv, scFv(sc는 단순 체인(simple chain)을 의미함), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 또는 디아보디(diabodies)와 같은 항체 단편, 또는 폴리에틸렌 글리콜 <<PEG화(PEGylation)>>화 같이 폴리(알킬렌) 글리콜을 첨가하는 것과 같은 화학적 변형 또는 라이소좀 내로의 삽입에 의해 수명이 증가할 수 있는 모든 단편을 의미한다. 상기 단편은 일반적으로 항체로부터 유래되는 특징적인 CDR을 최소한 하나 가지며, 항체로부터 유래되는 부분 활성도 가질 수 있다.
바람직하게는, 상기 기능적 단편은 항체로부터 유래된 변이 중쇄 또는 경쇄의 부분 서열로 이루어지거나 포함할 것이며, 상기 부분 서열은 항체로부터 유래된 동일한 결합 특이성을 유지하기에 충분하며, 항체로부터 유래된 친화도의 최소 1/100, 더욱 바람직하게는 최소 1/10 정도의 충분한 친화도를 가진다.
이러한 기능적 단편은 항체로부터 유래되는 서열의 최소 5개 아미노산, 바람직하게는 10, 15, 25, 50 및 100개의 연속 아미노산을 포함할 것이다.
바람직하게는, Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc 또는 디아보디의 단편일 것이며, 이는 일반적으로 항체로부터 유래되는 동일한 결합 특이성을 가진다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 단편은 상기에 기재된 바와 같은 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 절단 및/또는 화학 환원에 의한 이황 결합의 절단과 같은 방법을 통해 항체로부터 얻어질 것이다. 다른 방법으로, 본 발명에 포함되는 항체 단편은 당업자에게 잘 알려진 유전자 재조합 기술에 의하거나 또는 예를 들어 Applied Biosystems 등에 의해 제공되는 것과 같은 자동 펩타이드 합성기를 이용함으로써 펩타이드 합성에 의해 얻어질 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하며, 구체적으로는 유전자 재조합 또는 화학 합성에 얻어진 키메라 또는 인간화된 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역화는 복강내 및/또는 피하내 및/또는 정맥내 및/또는 비장내 주사에 의해 수행된다. 각 면역화 방법은 혼용 가능해서, 다른것과 상대적으로 비교해 한가지 방법을 선택하는 것은 사용되는 동물 및 당업자에의 지식과 기술에 따라 수행된다.
보다 구체적으로, 첫번째 구현예에 따르면, 최종 종양은 내성을 유발할 수 있거나 내성이 확정된 최소한 하나의 항-종양 물질로 치료학적으로 처치를 하는 중 또는 하고난 뒤의 생검 및/또는 수술에 의해 직접 얻어질 수 있다.
두번째 구현예에 따르면, 내성 종양은 종양 세포주 및/또는 인간 종양의 전체 또는 일부를 동물에 이식하고 난 뒤, 내성을 유발하길 원하거나 내성이 확정된 최소한 한개의 항-종양 물질을 동물에 주입하는 처치를 함으로써 유도된다.
상기 바람직한 구현예가 무엇이든간에, 본 발명에 따른 방법은 상기 활성 항체 또는 이의 기능적 단편이 단일클론 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린을 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편은 IgG의 감마1, 감마 2 또는 감마 4 아이소타입을 포함한다.
그럼에도 불구하고, 본 발명에 따르면 타입 IgG1 및 IgG2 면역글로불린이 작용기 기능을 유발하는 특성을 갖기 때문에 바람직하다.
일반적으로, 당업자라면 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 작용기(effector) 기능이 C1q에 결합하는 CDC(보체-의존성 세포독성, complement-dependent cytotoxicity), Fc 수용체에 결합하는 ADCC(항체-의존성 세포 독성), 및 식균작용을 포함함을 알 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 바람직한 작용기 기능은 ADCC 및 CDC이다.
일반적으로, 본 발명에서 언급되는 기능적 단편은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc 및 디아보디의 단편이거나, PEG화된 단편과 같이 수명이 증가한 모든 단편으로부터 선택된다.
보다 구체적으로는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 방법은 최소한 아래의 단계를 포함한다:
i) 내성 종양으로부터 유래된 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물로 동물을 직접적으로 면역화시키는 단계,
ii) 하이브리도마를 얻기 위해 상기 단계 i)의 면역화된 동물의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키는 단계, 및
iii) 내성 종양의 종양 세포의 표면에 발현된 항원을 특이적으로 인식하고, 이의 발현이 항-종양 처치에 의해 유도되는 항체를 분비하는 하이브리도마를 차별적으로 선별함으로써 선별하는 단계.
<<차별적 선별>>은 유도된 항원이, 내성이 형성되기 전에 세포에 존재하는 항원과 비교하여 처치에 대한 내성이 발생하는 것으로서 구별될 수 있는 방법을 기초로 하는 모든 선별을 의미한다.
이러한 <<차별적 선별>>을 제공하는 기술은, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 동결된 단편 또는 파라핀에 함침된 단편 상에서의 면역조직화학법 또는 <<단백질 어레이(protein array)>> 또는 <<유전자 어레이(gene array)>> 타입의 시도가 언급될 수 있다.
보다 구체적으로, 소위 <<조직 어레이(tissue array)>>라고 불리는 기술을 사용하는 것이 바람직하다. <<조직 어레이>> 기술은 파라핀 또는 동결된 형태로 포함된 조직의 블록(block), 또는 수십개 내지 수백개의 핵(core)을 포함하는 새로운 블록으로부터 형성하고 난 뒤, 이들 <<조직 어레이>> 블록을 절단하고, 수십개 내지 수백개의 조직 절단물을 포함하는 현미경 슬라이드를 마운팅하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 상기에 기술된 단계 i) 이전에 아래의 단계를 추가로 포함한다:
a) 종양 세포주 및/또는 <<천연(native)>> 종양이라고 불리는 종양의 전부 또는 일부를 선별하여 동물에 이식하는 단계,
b) 이 이식된 동물의 일부를 최소한 하나의 항-종양 물질로 처치하는 단계,
c) 단계 a)에서 이식된 처치되지 않은 동물로부터 유도되는 <<천연>> 종양이라고 불리는 종양의 전부 또는 일부를 회수하는 단계,
d) 단계 b)에서 처치된 동물로부터 유래된 내성 종양의 전부 또는 일부를 회수하는 단계,
e) 단계 c) 및 d) 각각에서 회수된 종양 전체 또는 일부 종양으로부터 항체를 차별적으로 선별하기 위한 수단을 준비하는 단계, 및
f) 단계 d)에서 회수된 내성 종양 전부 또는 일부로부터 가공된 균질화물 및/또는 세포 분해물을 준비하는 단계..
본 명세서에서, 표현 <<천연 종양>> 및 <<부모 종양(parent tumors>>은 동일하며 다르게 사용되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기 종양 세포주 및/또는 소위 <<천연>> 종양이라고 불리는 종양은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 폐로부터의 종양 세포(A549) 뿐만 아니라 결장, 전립샘, 유방, 난소로 구성된 군으로부터 선택되며, 처치에 대한 내성이 확인된 모든 종양이다.
추가로, 본 발명에 따라 사용되는 항-종양 물질은 화학요법제, 방사선요법제, 화학 물질 또는 항체로부터 선택되며, 이들 화합물 모두는 본 명세서에서 상기에 언급되었다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 최소한 하나의 항-종양 물질은 단일클론 항체로 이루어지며, 상기 단일클론 항체는 성장 인자 수용체, 혈관신생형성과 관련된 분자 또는 케모카인 및 세포 이동 현상과 관련된 인테그린에 직접적으로 대항하는 항체 또는 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
<<성장 인자 수용체>>는 리간드(들)과 결합하고 난 뒤에 리간드 형태에 있어서 독립적인 변화가 있거나, 또는 증식 반응을 유도하는 다른 막 단백질과 호모- 또는 헤테로-다이머를 형성하는 모든 막투과 단백질을 의미한다. <<혈관신생형성과 관련된 분자>>는 리간드(들)과 결합하고 난 뒤에 리간드 형태에 있어서 독립적인 변화가 있거나, 또는 혈관 형성을 유발하는 다른 막 단백질과 호모- 또는 헤테로-다이머를 형성하는 모든 막 수용체를 의미한다.
<<세포 이동 현상과 관련된 케모카인 및 인테그린>>은 세포외 매트릭스를 절단하는 활성 및/또는 화학-유인성 특성을 가질수 있는 모든 수용성 분자를 의미한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 최소한 하나의 항-종양 물질이 다른 특성 및/또는 다른 작용 매커니즘을 갖고 및/또는 다른 단백질을 표적으로 하는 최소한 2개, 바람직하게는 최소한 3개의 항-종양 물질의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 항-종양 물질의 조합은 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편의 조합으로 이루어진다.
보다 더 바람직하게는, 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편의 조합은 항-IGF-IR, 항-EGFR, 항-Her/2neu, 항-VEGF, 항-VEGFR, 항-CXCR, 항-cMET, 항-RON, 에프린, 항체 등으로부터 선택되는 항체의 조합으로 이루어진다.
일 구현예에 따르면, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 방법에서 상기 조합은 항-IGF-IR 항체, 항-EGFR 항체 및 항-Her/2neu 항체의 조합을 포함하며, 상기에 언급된 항체는 단일클론 항체 7C10, 225 및 h4D5 각각을 포함하는 것이 바람직하다.
상기에 언급된 항체 7C10은 2003년 1월 20일에 출원된 특허공보 WO 03/059951에 기재된 항체로 이루어지며, 이 문헌은 참조로서 본원에 삽입된다.
단일클론 항체 225는 ATCC 기탁번호 HB-8508로 기탁된 하이브리도마에 의해생산된 항체로 이루어진다.
단일클론 항체 h4D5는 상업적으로 이용가능한 예를 들어 ICR(Institut Claudius Regaud)로부터 이용가능한 헤르셉틴으로 이루어진다.
보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법에서, 소위 <<천연>> 종양 세포라고 불리는 종양세포의 항원을 인지하지 않는 항체를 분비하는 하이브리도마를 선별하기 위한 상기 단계 ii)는 처치되지 않은 <<천연>> 종양의 조직 및 내성 종양의 조직 및/또는 내성을 띄어야 하는 종양간을 차별적으로 선별함으로써 수행되는 것을 특징으로 한다.
<<차별적 선별>>은 유도된 항원을, 이러한 내성이 형성되기 전에 세포 상에 존재하는 항원과 비교하여, 처치에 대한 내성이 발생한 것으로 구분하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 차별적 선별은 상기에 기재된 단계 e)에서 얻어진 수단을 적용함으로써 수행된다.
최종적으로, 본 발명의 마지막 구현예에 따르면, 상기 방법은 단계 i) 이전에 추가로 내성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
<<내성화>>는 사이클로스파마이드와 같은 면역억제 물질을 이용해 유도되는 면역 반응을 단절시키는 것을 의미한다. 실제로, 상기 내성화 단계는 아래의 단계를 포함한다:
- 단계 c)로부터 유래된 소위 천연 종양이라고 불리는 종양으로부터 얻어진 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물을 동물에게 투여, 즉 주입하는 단계, 및
- 상기 단계의 주입에 의해 활성화된 B 세포를 제거하기 위해 면역억제제를 이들 동물에게 투여함으로써 상기 천연 종양에 대한 모든 잠재적 반응을 억제시키는 단계.
물론, 모든 유사한 방법이나 실시 또는 얻어질 수 있는 유사한 결과는 동등한 것으로 간주되며 본 발명의 범위에 포함된다. <<면역억제제>>는 면역 시스템의 세포 군집을 제거할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 비제한적인 예로서, 사이클로스파마이드가 언급될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 항-종양 물질에 대한 종양의 내성을 저해할 수 있는 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 생산하고 선별하는 방법, 또는 최소한 하나의 항-종양 물질에 대해 내성을 띄는 종양의 표면에서 발현되는 종양 항원에 직접적으로 대항하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 생산하고 선별하는 방법에 관한 것으로서, 상기 종양 항원은 항-종양 물질에 대한 상기 종양의 내성과 관련이 있으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) 본 발명에 따라 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 생산하는 단계, 상기 항체는 내성 종양의 표면에서 특이적으로 발현하는 상기 종양 항원에 대해 직접적으로 대항하며, 상기 종양 항원은 내성 종양으로부터 유래되는 천연 종양 세포의 표면에서 발현되지 않는 것을 특징으로 함;
b) 단계 a)에서 얻어진 항체를 항-종양 물질에 대해 내성을 띄는 종양과 시험관내 또는 생체내에서 접촉하도록 놓아두는 단계; 및
c) 항-종양 물질에 대한 종양의 내성에 대해 상기 항체가 저해 활성을 갖는 다는 것이 증명된 항체를 선별하는 단계.
다른 구현예에 따르면, 항-종양 처치에 의해 유발되는 항원의 발현이 내성 현상과 관련이 있거나 관련이 없는지 여부를 확인하기 위한 목적으로 시험관내 또는 생체내에서 테스트가 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 단계는 시험관내 또는 생체내에서 본 발명에 의해 얻어진 항체를 내성 종양 상에서 테스트하고, 내성-저해 활성이 내성 종양에 의존하는지 여부를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 항-종양 활성을 나타낼 수 있는, 즉 상기 항체에 대해 항원을 발현하는 종양 세포의 증식을 저해할 수 있는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 시험관 내에서 생산하고 선별하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) 본 발명에 따라 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 생산하는 단계, 상기 항체는 내성 종양의 표면에서 특이적으로 발현하는 상기 종양 항원에 대해 직접적으로 대항하며, 상기 종양 항원은 내성 종양으로부터 유래되는 천연 종양 세포의 표면에서 발현되지 않는 것을 특징으로 함;
b) 단계 a)에서 얻어진 항체를 상기 종양 항원을 발현하는 종양과 시험관내 또는 생체내에서 접촉하도록 놓아두는 단계, 바람직하게는 상기 단계 a)에 사용된 내성 종양 또는 공격적인 표현형를 갖는 종양과 접촉하도록 놓아두는 단계; 및
c) 종양에 대해 항-종양 활성이 확립되고, 즉 종양의 세포 증식을 억제할 수 있는지 증명된 항체를 선별하는 단계.
상기에 기재된 방법의 단계 b)에서 종양의 세포는 상기 종양 항원을 발현하며, 상기 항원을 제조하기 위해 사용된 항-종양 물질에 대해 종양이 내성을 띌 필요는 없는 것으로 이해되어야 한다. 공격적 표현형을 갖는 모든 종양 -이 종양의 세포는 상기 항체에 의해 인지되는 종양 항원을 발현함- 이 단계 b)에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 방법의, 치료학적 및/또는 진단학적 단일클론 항체를 생산하기 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 구체적인 기준 또는 본 명세서와는 약간 다른 기준을 만족하기 위해 당업자에 의해 개발될 수 있는 방법의 부분적인 용도도 포함한다. 본 발명의 세번째 양태에 따르면, 상기에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 방법을 적용함으로써 얻어지는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나가 고려될 수 있다.
본 발명은 오늘날 이러한 특징을 가지며, 이러한 방법에 의해 얻어진 것으로 기재된 항체가 없다는 점에서 혁신적이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 기능적 단편은 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아보디로부터 선택되거나, 또는 화학적 변형, 즉 PEG화 또는 리포좀으로의 삽입에 의해 수명이 증가한 모든 기능적 단편이 될 수 있다. 물론, 이 리스튼 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 당업계에 공지된 모든 다른 형태의 단편도 본 발명의 일부로 간주되어야 한다.
본 발명의 예시로서, 본 발명에 따른 방법의 적용에 의해 얻어지는 5개의 항체가 아래에 기술되어 있다. 이들 항체는 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 및 3G7이라고 불리는 것이며 이들은 생쥐, 키메라 또는 인간화된 것일 수 있다.
첫번째 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나에 관한 것이다:
- 서열번호 1, 2 및 3의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 1, 2 및 3과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
- 서열번호 4, 5 및 6의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 4, 5 및 6과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
본 명세서에서, 항체 물질 또는 이의 서열에 결합된 용어 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 서열, 펩타이드 및 단백질은 혼용하여 사용가능하다.
본 발명은 천연 형태, 즉 천연의 항체와는 관계가 없는 것으로 이해되어야 하는데, 즉 이는 천연의 환경을 택하지 않아야 하고 천연의 원천으로부터 정제되어 분리 또는 획득되거나, 또는 유전자 재조합 또는 화학적 합성에 의해 얻어져야 하며, 비-천연의 아미노산을 포함하는 것들은 이후에 개시된다.
CDR 부위(들) 또는 CDR은 카바트 등의 문헌(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions)에 기재된 바와 같은 면역 글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 과변이성 부위를 나타내는 것을 의미한다. 3개의 중쇄 CDR 및 2개의 경쇄 CDR이 있다. 용어 CDR 또는 CDRs는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도에 필수적인 아미노산 잔기의 주요 부분을 포함하는 이들 부위 중의 하나 또는 이들 중 여러개, 또는 이들 부위 전체를 나타내기 위해 사용된다.
본 발명에 있는 핵산 또는 아미노산의 2개 서열 사이의 <<동일율(identity percentage)>>는 최적으로 정렬(최적 정렬)되고 난 뒤에 얻어지는 비교되어야 하는 2개 서열 간의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 동일율을 나타내는 것을 의미하며, 이 퍼센트는 순전히 확률적이며 이 두 서열 사이의 차이는 임의로 분포되어야 하고 전체 길이를 통해 확인해야 한다. 핵산 또는 아미노산의 2개 서열 사이의 서열 비교는 전통적으로는 최적의 방법으로 이들을 정렬하고 난 뒤에 이들 서열을 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 조각 또는 <<비교 윈도우(comparion window)>>를 통해 수행되어야 한다. 비교를 하기 위해 서열을 최적으로 정렬하는 것은 수동으로 할 뿐만 아니라 스미스와 워터맨의 국소 상동성 알고리즘(Smith and Watermnan, 1981, Al. App. Math. 2:482), 니들맨과 운크의 국소 상동성 알고리즘(Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443), 피어슨과 립맨의 유사성 조사 방법(Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), 이러한 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 소프트웨어 패키지(GAP, BESTFIT, FASTA and FTASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, 또는 비교 소프트웨어 패키지인 BLAST N 또는 BLAST P)을 사용함으로써 수행될 수 있다.
핵산 또는 아미노산의 2개 서열 사이의 동일율은 최적의 방법으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되며, 비교되어야 하는 핵산 또는 아미노산 서열은 두 서열 사이에 최적으로 정렬되기 위해 참조 서열에 비교해 부가 또는 결실을 포함해야 한다. 동일율은 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 2개의 서열 사이가 동일한 동일 부위의 갯수를 결정한 뒤, 이 동일 부위 갯수를 비교 윈도우 내에 있는 전체 부위 갯수로 나누고, 그리고 난 뒤 이 결과에 100을 곱하면 이들 서열 사이의 동일율이 얻어진다.
예를 들어, 사용될 수 있는 BLAST 프로그램, <<BLAST 2 sequence>>(Tatusova et al., <<Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences>>, FEMS Microbiiol. Lett. 174:247-250)은 다음 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html에서 이용가능하며, 여기에 사용되는 파라미터(구체적인 파라미터 <<open gap panalty>>: 5, <<extension gap panalty>>: 2; 선별된 매트릭스는 예를 들어 프로그램에서 제안되는 <<BLOSUM62>> 매트릭스)는 디폴트로 정해지며, 비교되어야 하는 2개 서열 사이의 동일율은 프로그램을 이용해 바로 계산된다. 또한, <<ALIGN>> 또는 <<Megalign>>(DNASTAR) 소프트웨어 패키지와 같은 다른 프로그램도 사용 가능하다.
참조 아미노산 서열과 최소한 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대해, 특정한 변형이 바람직한데, 구체적으로는 최소한 한개의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환, 절단 또는 연장이 있다. 하나 이상의 연속 또는 비연속 아미노산(들)의 치환의 경우, 치환은 치환된 아미노산이 <<등가의(equivalent)>> 아미노산과 교체되는 것이 바람직하다. 본원에서 표현 <<등가의 아미노산>>은 대응하는 항체의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않으면서 기본 구조의 아미노산에 대해 치환될 수 있는 모든 아미노산을 의미하는 것을 목적으로 하며, 이는 실시예에 표시될 것이다.
등가의 아미노산은 치환하는 아미노산과 동일한 구조를 갖는지에 따라 또는 수행되는 다른 항체 사이의 생물학적 활성을 비교 테스트한 결과에 의해 결정될 수 있다.
비제한적인 예로서, 하기의 표 1은 대응되는 변형된 항체의 생물학적 활성에 있어서 심각한 변화를 유발하지 않으면서 수행되는 치환의 가능성을 보여주며, 반대의 치환은 유사한 조건 하에서 수행될 수 있다.
Figure 112009025002079-pct00001
바람직하게, 상기에 기재된 항체는 1A6라고 불리며, 서열번호 7을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 8을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 항체 1A6를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마(1A6)에 관한 것이다. 본 명세서에서, 유사한 코드는 하나가 생쥐 하이브리도마로 불리든 다른 하나의 항체가 이와 동일한 하이브리도마에 의해 생산되든 간에 상관없이 사용된다.
이러한 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일자로 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)에 기탁번호 I-3612로 기탁된 하이브리도마를 포함한다. 6개의 짧은 CDR 서열 중에, 중쇄의 세번째 CDR(CDRH3)은 변이성이 더 크다(유전자를 정렬하기 위한 매커니즘으로 인한 더 큰 다양성). 이는 2개의 아미노산만큼 작을 수 있으나 알려진 가장 긴 길이는 26개이다. 기능적으로, CDRH3는 항체의 특이성을 결정하는데 있어서 개별적인 기능을 한다(Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233:747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989; Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990; Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; Kabat et al., J. Immunol, 147:1709-1719, 1991).
CDR 아미노산의 작은 부분만이 항체의 결합 부위 구조에 영향을 끼치지만, 이들 잔기는 매우 특이적인 3차원 형태를 유지하는 것으로 알려져 있다.
두번째 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나에 관한 것이다:
- 서열번호 9, 10 및 11의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 9, 10 및 11과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
- 서열번호 12, 13 및 14의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 12, 13 및 14와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 상기 항체는 1A9라고 불리며, 서열번호 15 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 16 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 상기에 언급된 바와 같은 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마(1A9)도 언급될 수 있다.
최종적으로, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 생쥐 하이브리도마 1A9는 2006년 5월 31일에 기탁번호 I-3613으로 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)에 기탁된 것이다.
세번째 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하며, 본 발명의 방법에 따라 얻어진, 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이다:
- 서열번호 17, 18 및 19의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 17, 18 및 19와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
- 서열번호 17, 18 및 19의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 17, 18 및 19와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 항체는 2E11이라고 불리며, 서열번호 23 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 24 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 상기에 언급된 바와 같은 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마 2E11도 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 기탁번호 I-3615로 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)에 기탁된 하이브리도마를 포함한다.
네번째 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하고 상기에 기재된 바와 같은 방법에 의해 얻어진 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이다:
- 서열번호 25, 26 및 27의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 25, 26 및 27과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
- 서열번호 28, 29 및 30의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 28, 29 및 30과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 상기 항체는 3C11이라고 불리며, 서열번호 31 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 32 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 상기에 언급된 바와 같은 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마 3C11도 포함한다.
바람직하게는, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 기탁번호 I-3614로 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)에 기탁된 하이브리도마를 포함한다.
최종적으로, 본 발명의 5번째 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하고 상기에 기재된 바와 같은 방법에 의해 얻어진 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이다:
- 서열번호 33, 34 및 35의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 33, 34 및 35와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
- 서열번호 36, 37 및 38의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 36, 37 및 38과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
바람직하게는, 상기 항체는 3G7이라고 불리며, 서열번호 39 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 40 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기에 언급된 바와 같은 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마 3G7도 포함한다.
바람직하게는, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 기탁번호 I-3616으로 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)에 기탁된 하이브리도마를 포함한다. 보다 더 명확하게 하기 위해, 하기 표 2에는 그룹지어 있는 것은 본 발명의 항체와 상기 항체의 CDR 아미노산의 개별 서열 사이에 상관성이 있음을 보여준다.
Figure 112009025002079-pct00002
하기에 기재된 표 3은 본 발명의 항체와 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 각각 사이에 상관성이 있음을 보여준다.
Figure 112009025002079-pct00003
마지막으로, 아래의 표 4는 CNCM에 기탁된 기탁번호를 갖는 본 발명의 각 항체의 이름을 그룹으로 나타낸 것이다.
Figure 112009025002079-pct00004
물론, 상기에 기재된 항체 1A6의 특징 또는 변형 모두는 본 발명의 다른 항체에도 적용되며, 보다 구체적으로 1A9, 2E11, 3C11 및 3G7과 같은 항체에 적용된다.
본 발명의 방법에 따라 얻어진 모든 항체에 대해 상기에 기재된 바와 같은 방법으로, 기재된 모든 특성, 특징 또는 변형은 본 명세서에 기재된 항체를 적용하는 것으로 간주되어야 한다.
보다 구체적으로, 모든 기능적 단편은 Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc 단편 및 디아보디, 또는 PEG화된 단편과 같이 반감기가 증가된 모든 단편이다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 바람직하게는 상기에 기재된 하이브리도마, 즉 하이브리도마 I-3612, I-3613, I-3614, I-3615 또는 I-3616에 의해 분비되는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 항체는 키메라 항체이며, 생쥐에 대해 이종인 종의 항체로부터 유래된 보존 경쇄 및 중쇄 부위를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 이종의 종은 인간 종이다.
보다 더 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 키메라 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는 인간 항체로부터 유래되는 보존 경쇄 및 중쇄 부위이며, 각각 카파 및 감마 1, 감마 2 또는 감마 4 부위이다.
최종적으로, 보다 바람직하게는, 상기 항체는 인간화된 항체로 이루어지며 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄 및/또는 중쇄의 구조 조각 FR1-FR4는 인간 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 구조 조각 FR1-FR4로부터 각각 유래된다.
또한, 보다 구체적인 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나에 관한 것이며, 상기 항체는 생쥐에 대해 이종인 종, 즉 인간의 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 보존 부위를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 인간 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 보존 부위는 각각 카파 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위이다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 분리된 핵산이 언급되며 이는 다음의 핵산으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다:
a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 코딩하는 DNA 또는 RNA 핵산;
b) 상기 a)에 기재된 핵산에 상보적인 핵산;
c) 서열번호 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78 서열의 CDR 부위 중 최소한 하나 또는 서열번호 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78 서열과 최적으로 정렬하고 난 뒤 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열과 강한 조건하에서 혼성화할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드로 구성된 핵산; 및
d) 서열번호 48, 56, 64, 72 또는 80 서열의 경쇄 중 최소한 하나 및/또는 서열번호 47, 55, 63, 71 또는 79 서열의 중쇄 중 하나, 또는 서열번호 47, 48, 55, 56, 63, 64, 71, 72, 79 또는 80과 최적으로 정렬하고 난 뒤 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열과 강한 조건하에서 혼성화할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드로 구성된 핵산. 용어 핵산, 핵산 서열, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 서열, 뉴클레오타이드 서열은 본 발명에서 관계없이 사용될 것이며, 변형되거나 되지 않는 뉴클레오타이드를 특이적으로 연결하는 것으로 간주되고, 핵산의 단편 또는 부위는 비-천연의 뉴클레오타이드를 포함하거나 하지 않는 것으로 간주되며, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 및 상기 DNA의 전사 산물과 관련이 있을 것이다.
또한, 본 발명은 천연의 염색질 환경, 즉 천연의 조건에 있는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이는 분리 및/또는 정제된 서열이며, 즉 이들은 예를 들어 복제에 의해 직접 또는 간접적으로 샘플링된 것이고, 이의 환경은 최소한 부분적으로 변형된 것이다. 또한, 본 발명은 예를 들어 숙주 세포를 이용한 유전자 재조합에 의해 얻어지거나 화학적 합성에 의해 얻어진 분리된 핵산에 관한 것이다.
바람직한 서열과 최적으로 정렬되고 난 뒤에 최소한 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 핵산은 참조 핵산 서열과 비교하여 결실, 절단, 연장, 키메라 융합 및/또는 포인트 치환과 같은 변형을 갖는 핵산 서열을 지칭한다. 바람직하게는 참조 서열-유전자 코드의 생성과 관련이 있음-과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열, 또는 아래에 정의되는 바와 같은 매우 강한 조건 하에서 바람직한 참조 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 상보적 서열이다.
강한 조건 하에서 혼성화한다는 것은 2개의 상보적 DNA 단편 사이에서 혼성화 가능하게 하기 위해 선택되는 온도 및 이온 강도의 조건을 의미한다. 예로서, 상기에 기재된 폴리뉴클레오타이드 단편을 확인하기 위한 목적의 강한 혼성화 조건은 아래와 같다.
DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 아래의 2 단계로 수행된다: (1) 5x SSC(1x SSC는 0.15M NaCl + 0.015 M 소듐 시트레이트 용액임), 50% 포름아마이드, 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 10x 덴하츠(Denhardt's), 5% 덱스트란 설페이트 및 1% 연어 정자 DNA를 포함하는 포스페이트 버퍼(20 mM, pH 7.5)에서 42℃로 3시간 동안 전혼성화하는 단계; (2) 프로브의 크기에 따른 온도(즉 100 뉴클레오타이드 이상의 크기를 갖는 프로브는 42℃)에서 20시간 동안 실제 혼성화한 뒤, 2x SSC + 2% SDS로 20℃에서 20분 동안 2회 세척하고, 0.1x SSC + 0.1% SDS로 20℃에서 20분동안 세척하는 단계. 마지막 세척은 100 뉴클레오타이드 이상의 프로브 크기인 경우 0.1x SSC + 0.1% SDS로 60℃에서 30분 동안 수행한다. 다른 크기를 가진 폴리뉴클레오타이드에 대한 강한 혼성화 조건은 삼부르크 등의 문헌(Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a loboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)에 따르면, 더 크거나 더 작은 크기의 올리고뉴클레오타이드의 경우도 당업자에 의해 적용될 수 있다.
보다 명확히 하기 위해, 본 발명의 항체 사이의 상관성, 보다 구체적으로는 CDR 서열 뿐만 아니라 변이 사슬 및 이의 뉴클레오타이드 서열 사이의 상관성은 하기의 표 5에 표시되어 있다.
Figure 112009025002079-pct00005
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 결정된 숙주 세포에 있는 뉴클레오타이드 서열의 발현 및/또는 분비를 가능하게 하는 요소를 포함한다. 상기 벡터는 전사를 시작하고 종료하기 위한 신호인 프로모터 뿐만 아니라 전사를 조절하기 위해 적합한 부위를 포함해야 한다. 이는 숙주 세포에서 안정하게 유지될 수 있어야 하며 전사된 단백질을 특이적으로 분비하는 특정 서열을 포함할 수 있다. 이들 다른 요소는 사용된 숙주 세포에 따라 당업자에 의해 선별되고 최적화된다. 이를 위해, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열이 선별된 숙주 내의 자가-복제 벡터 또는 선별된 숙주의 통합 벡터에 삽입될 수 있다.
이러한 벡터는 당업자에 의해 최근에 사용된 방법에 의해 제조되며, 제조된 클론은 리포펙션, 전기천공법(electroporation), 열 충격법 또는 화학적 방법과 같은 표준 방법에 의해 적합한 숙주에 전달될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스를 기원으로 하는 벡터이다. 이들은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하고 발현하기 위해 숙주 세포를 형질전환시키는데 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터에 의해 형질전환되거나 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
숙주 세포는 진핵세포 또는 단핵세포 시스템으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어 박테리아 세포 뿐만 아니라 효모 세포 또는 동물 세포, 즉 포유 동물 세포로부터 선택될 수 있다. 곤충 세포 또는 식물 세포도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 세포를 포함하는, 인간을 제외한 동물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명의 목적은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다:
a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 적합한 배양 조건으로 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 배양 배지 또는 상기 배양된 세포로부터 생산된 상기 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 회수하는 단계.
본 발명에 따른 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 재조합 형태로 제조하기 위한 방법은 벡터 및/또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포를 적용하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포는 상기 폴리펩타이드를 발현 가능하게 하는 조건 하에서 배양되며, 상기 재조합 펩타이드가 회수된다.
언급된 바와 같이, 숙주 세포는 진핵세포 또는 단핵세포 시스템으로부터 선택될 수 있다. 특히, 이는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 확인 가능하게 하며, 진핵세포 또는 단핵세포 시스템에서 분비를 촉진한다. 따라서, 이러한 서열을 포함하는 본 발명에 따른 벡터는 분비되어야 하는 재조합 단백질을 생산하기 위해 사용되는 것이 바람직하다. 실제로, 이러한 관심 재조합 단백질을 정제하는 것은 숙주 세포 내부 보다는 세포 배양 상등액에 존재한다는 사실에 의해 쉬워질 것이다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해서도 제조될 수 있다. 이런 제조 방법도 본 발명의 목적이다. 당업자라면 예를 들어 고체상을 적용하는 기술(Steward et al., Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)) 또는 단편을 응축하거나 표준 용액에서 합성함으로써 부분 고체상을 이용하는 기술과 같은 화학적 합성 방법을 고려한다. 화학적 합성에 의해 얻어진 폴리펩타이드는 상응하는 비-천연의 아미노산을 포함할 수 있으며, 이것도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 방법에 따라 얻어질 수 있는 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나도 본 발명에 포함된다. 단일클론 항체의 2차 제너레이션을 형성하는 이중특이적 또는 이중기능적 항체에서, 2개의 다른 변이 부위는 동일한 분자 내에 결합된다(Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis rev. 18:411-419). 이들의 용도는 종양 세포의 표면에 있는 몇가지 분자를 표적으로 하거나 새로운 작용기 기능을 가능하게 한다는 이유로, 진단 분야 및 치료 분야 모두에 사용된다. 이들 항체들은 화학적 방법(Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat. 377-382) 또는 체세포적 방법(Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol., 121:210-228) 뿐만 아니라 유전공학 기술에 의해 얻어질 수 있으며, 여기서 헤테로다이머화가 진행될 수 있고, 찾은 항체의 정제 방법을 촉진시킨다(Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681).
이러한 이중 특이성 항체는 이중 특이성 Fab'2, Fab'PEG 또는 디아보디와 같은 전체 IgG 또는 이중특이성 scFv 뿐만 아니라 4가의 이중특이성 항체로 조립될 수 있으며, 2개의 결합 위치는 각 표적 항원 또는 상기에 기재된 단편에 존재한다(Park et al., 2000, Mol. Immunol., 37(18):1123-30).
이중 특이성 항체의 생산 및 투여가 2개의 특이적 항체를 생산하는 것보다 더 비싸지 않다는 경제적 이점으로, 이러한 이중특이성 항체의 사용은 처치의 독성을 감소시키는 이점을 갖는다. 게다가 이중 특이성 항체의 사용은 순환하는 항체의 전체 양을 감소시킬 수 있고 결국에는 독성도 줄여준다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 이중 특이성 항체는 2가 또는 4가의 항체이다.
실제로, 4가 이중 특이성 항체를 사용하여 나타나는 이점은 각 표적에 대해 2개의 결합 위치가 존재하기 때문에 2가 항체와 비교해 더 큰 항원항체 결합력을 갖는다는 것이다.
상기에 기재된 항체의 기능적 단편을 선별하기 위한 유사한 방법에서, 상기 2번째 패턴은 Fv, Fab, (Fab')2, Fab', Fab'PEG, scFv, scFv-Fc 단편 및 디아보디, 또는 수명이 증가된 모든 형태로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명의 목적은 약물로서의 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이며, 바람직하게는 상기에 기재한 바와 같은 인간화 항체이다. 항체는 본 명세서에 기재된 것을 의미하며, 상기에 기재된 본 발명의 방법을 적용하여 얻어진 항체 및 확인되고 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 또는 3G7이라는 이름을 갖는 항체로부터 선택되는 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 활성 성분으로 포함하며, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 하이브리도마 I-3612, I-3613, I-3614, I-3615 또는 I-3616에 의해 생산된 항체를 포함하는 물질을 활성 성분으로 포함한다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 화학요법제, 방사선 요법제 또는 항체를 동시 사용, 단독으로 사용 또는 연장된 기간 동안 사용하기 위한 혼합 산물 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. <<동시 사용>>은 본 발명에 따른 조성물의 물질 모두를 단독으로 동일한 약제학적 형태로 투여하는 것을 의미한다.
<<단독 사용>>은 다른 약제학적 형태에 포함되어 있는 본 발명에 따른 조성물의 물질 모두를 같은 시간에 투여하는 것을 의미한다.
<<연장된 기간 동안 사용>>은 다른 약제학적 형태에 포함되어 있는 본 발명에 따른 조성물의 물질 모두를 연속적으로 투여하는 것을 의미한다. 화학요법제는 본 명세서에 나열되어 있으며 정의되어 있는 모든 물질을 으미하며, 본 발명의 일부에 포함된다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 혼합 산물로서의 상기 조성물은, 자극에 사용하기 위한 용도로 상기 세포독성제가 상기 항체와 화학적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 상기 제제로부터 선택된 세포독성제/세포증식억제제가 방추(spindle)를 저해 또는 안정화하는 제제로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 비노렐빈(vinorelbine) 및/또는 빈플루닌(vinflunine)이다.
상기 세포독성제와 본 발명에 따른 상기 항체 사이의 결합을 촉진시키기 위해, 결합되어야 하는 상기 물질 사이에 스페이서 분자가 도입되어야 하며, 이러한 분자로는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜 또는 아미노산과 같은 것이 있으며, 또는 다른 구현예에서는 상기 세포독성제의 활성 유도체가 사용될 수 있는데, 이의 기능은 본 발명에 따른 상기 항체에 도입되어 반응할 수 있다. 이러한 결합 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 명세서에는 언급하지 않았다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 항체 중의 최소한 하나 또는 이의 기능적 단편중의 하나가 세포 독소 및/또는 방사선 원소와 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 독소는 엔테로박테리아로부터 유래된 독소이며, 구체적으로는 슈도모나스로부터 유래된 엑소톡신 A(exotoxin A)이다.
본 발명에 따른 최소한 한개의 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나와 결합하는 독소 또는 방사선 원소는, 상기 독소 또는 상기 방사선 원소가 상기 최소한 하나의 항체에 결합할 수 있는, 구체적으로는 분자 결합을 유도하거나 유도하지 않으면서 상기 물질 모두에서 공유결합할 수 있는 모든 것을 나타내는 것을 의미한다. 다른 형태의 결합은 비공유결합 복합체를 제공하는 이온 킬레이터, 예를 들어 EDTA, DOTA 또는 99mTc 타입 복합체를 이용하는 것을 포함한다.
또한 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 접합체(conjugate)를 형성하는 최소한 하나의 항체는 이의 기능적 단편, 구체적으로는 scFv 단편과 같은 Fc 요소로부터 유래된 단편으로부터 선택된다.
또한 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 조성물의, 약물을 제조하기 위한 용도를 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기에 기재된 바와 같은 항체 또는 본 발명의 방법 및 상기에 기재된 방법에 의해 얻어진 항체의, 암을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로 약물을 제조하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기에 기재된 바와 같은 항체 또는 본 발명의 방법 및 상기에 기재된 방법에 의해 얻어진 항체의, 암을 치료 및 예방하기 위한 범위 안에서 환자의 항-종양 처치에 대한 종양 내성을 저해하기 위한 목적으로 약물을 제조하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
바람직하게, 상기 암은 결장, 전립샘, 유방, 폐, 난소 또는 췌장 암으로부터 선택되는 내성 타입의 암이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나의 용도는 내성 종양 및/또는 후기 단계에 있는 종양에 대해 생물학적으로 활성을 띄는 물질을 특이적으로 표적화하기 위한 목적으로 약물을 제조하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 표시된 항체 또는 이의 기능적 단편은 예를 들어 소위 면역접합 항체라고 불리는 것을 포함하며, 이는 예를 들어 퍼옥시아아제, 알칼라인 포스파타아제, α-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 글루코스 아밀라아제, 카보닉 안하이드라아제, 아세틸-콜리네스터라아제, 라이소좀, 말레이트 디하이드로게나아제 또는 글루코스-6 포스페이트 디하이드로게나아제와 같은 효소 또는 바이오틴, 디곡시게닌(digoxigenin), 또는 5-브로모-디옥시유리딘과 같은 분자와 접합할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편에는 형광 마커도 접합될 수 있는데, 구체적으로는 플루오레신 및 이의 유도체, 플루오로크로뮴, 로다민 및 이의 유도체, GFP(녹색 형광 단백질), 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone) 등을 포함한다. 이러한 접합체에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 효소 또는 형광 마커와 직접적으로 결합하거나, 또는 스페이서 그룹 또는 글루타르알데하이드와 같은 폴리알데하이드, 에틸렌 디아민 테트라아세틱산(EDTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세틱산(DPTA)와 같은 결합 그룹에 의해 결합되거나 페리오데이트(periodate) 등과 같은 결합체의 존재하에서 결합될 수 있다. 플루오레신 타입의 마커를 포함하는 접합체는 이소티오시아네이트와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
다른 접합체는 루미놀(luminol) 및 디옥세탄(dioxetane)과 같은 화학형광 마커, 루시퍼라아제 및 루시페린과 같은 생물형광 마커, 또는 방사성 마커를 포함할 수 있다.
본원에서 생물학적으로 활성을 띄는 물질은 세포 활성을 조절, 즉 세포 활성을 저해하고, 특히 세포의 성장, 증식, 유전자 전사 또는 번역을 조절할 수 있는 모든 물질을 나타내는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 부작용을 유발하지 않고, 활성 물질의 투여를 촉진시키며, 기관 내에서의 수명 및/또는 효능을 증가시키고, 수용액 내에서의 용해도를 증가시키거나 보존도를 향상시킬 수 있는 약제학적 조성물에 들어가는 물질 또는 물질의 조합을 나타내는 것을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체는 선택되는 활성 물질의 특징 및 투여 방법에 따라 당업자에 의해 손쉽게 적용될 수 있다.
바람직하게는, 이 물질들은 전신으로, 구체적으로는 정맥내 경로, 근육내, 경피내, 복강내 또는 피하내 경로 또는 구강으로 투여될 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물은 반복적으로, 장시간 동안 투여될 것이다.
투여 방법, 투여 용량 및 최적의 투약 형태는 환자에게 적합한 치료법으로 확립된 방법에 따라 결정될 것이며, 예를 들어 환자의 나이 또는 체중, 상태의 심각도, 치료에 대한 내성 및 보고된 부작용에 따라 결정될 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 아래의 실시예 및 도면의 설명을 포함하는 도면을 통해 알 수 있으며, 아래에 예시되어 있다.
마지막으로, 본 발명의 마지막 양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 세포내 또는 세포외를 표적으로 하는 내성 현상과 관련된 새로운 치료법 및/또는 진단법을 확인하기 위해 제공된다.
상기의 세포내 또는 세포외를 표적으로 하는 내성 현상과 관련된 새로운 치료법 및/또는 진단법을 확인하기 위한 방법은 단일클론 항체를 얻고, 그리고 난 뒤 상기 단일클론 항체에 의해 인식되는 단백질을 확인하기 위해 상기에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법을 적용하는 것을 특징으로 한다.
이러한 물질, 즉 단백질의 확인은 당업자에게 잘알려진 모든 기술에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 세포 분해물 및 단백질을 면역침전법 및/또는 면역정제법으로 수행한 뒤 표준 프로테오믹 기술과 함께 웨스턴-블랏 기술을 이용해 확인하여 수행할 수 있다.
하기의 도면의 간단한 설명과 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
도 1은 h4D5, 225 및 7C10으로 삼중처치하고 난 뒤의 시간에 따른 종양 부피를 나타내며, 이러한 처치에 대한 내성의 발생을 보여준다.
도 2는 본 발명의 일구현예의 첫번째 설명 형태인 예시적 도해를 나타낸다.
1: 대조군 종양의 샘플링, 2개 부분으로 분리.
2: 생쥐의 내성. 면역화하기 위한 세포의 준비: 분해물, 세포 현탁액 등. 사 이클로포스파마이드 또는 다른 내성 제제를 복강내 주입함으로써 내성화.
3: IHC 스크리닝을 하기 위한 슬라이드: 종양의 동결 또는 봉입. 라벨링하기 위한 슬라이드 = 음성 대조군 슬라이드의 준비.
4: 내성 종양의 샘플링, 2개 부분으로 분리.
5: 면역화하기 위한 세포의 준비: 분해물, 세포 현탁액 등.
6: 종양의 동결 또는 봉입: 라벨링하기 위한 슬라이드 = 테스트 슬라이드의 준비.
7: 대조군 종양의 샘플링.
8: 생쥐의 면역화: 대조군 종양으로부터 세포 준비.
9: 대조군 IHC 슬라이드.
10: 면역억제제의 주입에 의한 내성화.
11: 천연 세포에 대한 반응성이 결여되었는지 체크하기 위한 혈청의 샘플링.
12: 내성 종양의 샘플링.
13: 내성화된 생쥐의 면역화: 내성 종양으로부터 세포의 준비.
14: IHC 슬라이드의 테스트.
15. IHC 종양 대 내성 종양을 라벨링하기 위한 혈청의 샘플링.
16. 하이브리도마의 선별: 대조군 종양 슬라이드 상의 라벨링이 없고 내성 종양 슬라이드 상에 양성으로 라벨링(버팀질(stromal) 세포 상에 라벨링되어 있지 않고, 종양 세포에 라벨링 됨).
도 3은 본 발명에 따른 방법의 일 구현예를 도해로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 항체의 프로파일을 나타낸 것이며, 내성화 및 면역화를 하기 위해 사용된 종양으로부터 생산된 <<조직 어레이>> 타입의 슬라이드에 관한 것이다.
도 5는 결장 이종이식 모델 HT29에서의 항체 1A6 및 2E11의 항-종양 활성 평가를 나타낸 것이다.
도 6은 항체 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 및 3G7 각각의 중쇄 및 경쇄 서열을 나타낸 것이다. 각각의 CDR은 밑줄과 굵은색으로 표시되어 있다.
도 7은 췌장 이종이식 모델 BxPC3에서의 항체 2E11의 항-종양 활성 평가를 나타낸 것이다.
실시예 1 : 항-IGF-IR, EGFR 및 Her/2neu 삼중처치에 대한 종양 세포 A549의 내성 증명
A549 세포를 생쥐에 이식시켰다. 종양이 형성되었을때 생쥐에게 다음의 항체 즉 h4D5 (ICR(Institut Claude Regaud, service pharmacie, 20-24, rue du Pont Saint-Pierre, 31052 Toulouse)에 의해 제공되는 헤르셉틴), 225 (ATCC No. HB-8508) 및 7C10을 각각 300 ㎍ 포함하는 혼합액으로 일주일에 2회 처치하였다.
처치 첫번째 주가 되자마자, 종양의 전체가 사라질때까지 종양 성장이 퇴화하는 것은 특정 생쥐에서 관찰할 수 있다. 이 처치는 종양이 전체 혹은 부분적으로 퇴화하더라도 유지시켰다.
그 다음에 처치를 계속함에도 불구하고 종양이 재형성되는 것이 관찰되었는데, 이는 삼중처치에 대해 내성을 나타내는 종양이 형성되었음을 보여준다.
실험은 도 1에 표시되어 있으며, 이는 15일까지 종양이 감소하며 15일째에 종양이 재형성되는 것이 내성이 발생하는 것임을 보여준다.
실시예 2 : 항-IGF-IR, EGFR 및 Her/2neu 조합 처치에 대한 내성과 관련된 항원에 직접적으로 대항하는 활성 단일클론 항체의 제조
A549 세포를 10마리의 생쥐 2 배치에 이식시켰다. 첫번째 배치는 2주일에 한번 PBS를 투여하였다. 두번째 배치는 IGF-1R, EGFR 및 Her/2neu 수용체 각각에 대항하는 항체(7C10, 225 및 h4D5)의 조합으로 처치하였다. 항체의 조합은 처치된 동물의 60%에서 종양이 사라지는 결과로 종양 퇴화를 유발하였다. 이러한 확실한 효과에도 불구하고, 종양은 모든 동물에서 재발하였다.
A549 종양은 PBS로 처이한 동물에서 회복되어 100-200 ㎣의 크기가 되었다.
이들 종양 각각을 2개의 부분으로 나누었다: 하나는 <<조직 어레이>> 타입의 면역조직학 슬라이드를 만들기 위한 목적으로 동결시켰고, 다른 하나는 BALB/c 생쥐를 내성화시키기 위해 사용하였다. 이 내성화는 사이클로포스파마이드를 투여하고 난 뒤의 종양으로부터의 가공된 세포 균질화물을 복강내 주입함으로써 수행하였으며 이는 처치하지 않는 <<부모>> A549 종양에 직접적으로 반응하는 것을 완전히 박멸하기 위한 목적을 갖고 있다. 종양이 재발하는 동안, 부피가 100 내지 200 ㎣가 될때 종양을 샘플링하였다. 그리고 난 뒤 이를 2개의 동일한 부분으로 나누 었다. 한 부분은 PBS 대조군 종양에 대해 상기에 언급한 바와 같은 <<조직 어레이>> 타입의 면역조직학 슬라이드를 만들기 위한 목적으로 동결시켰다. 가공된 균질화물은 두번째 부분으로 준비하였으며 처치하지 않은 A549 종양으로 미리 내성화된 생쥐를 면역화시키기 위해 사용할 것이다. 이들 생쥐는 모두 삼중처치에 대해 내성을 띄는 종양의 가공된 균질화물을 3회 복강내 주입하였으며, 첫번째 주입에 대해서는 완전 프로인트 항원 보강제(Freund's adjuvant)로 항원 보강하고, 다음 주입에 대해서는 불완전 프로인트 항원 보강제로 항원 보강하였다.
그리고 난 뒤, 세포 융합을 수행하였으며 이 융합에 의해 형성된 하이브리도마는 미리 준비한 <<조직 어레이>> 타입 슬라이드 상에 면역조직학으로 스크리닝하였다.
내성 조직을 인식하는 항체를 분비하며, 대조군 배치 PBS 또는 천연 A549 세포-이는 생체내에서 종양을 형성하기 위해 사용됨-로부터의 종양에 대해 모두 인식하지 않는 하이브리도마를 클로닝하고 동결시켰다. 그리고 난 뒤 항체는 복수액에서 생산하고, 정제하였으며, 표면 조직 또는 항체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포에 대해 생체내에서 테스트하였다(이 세포는 각 항체에 대해 사용가능한 종양 세포주의 비-소모적 패널을 미리 FACSCAN 분석함으로써 선별하였다).
도 4는 유지되는 항체의 프로파일을 보여준다.
다음의 표 6은 이들 항체에 의해 인식되는 세포의 그룹을 나타낸다(다른 세포주의 FACSCAN 장비로 조직학적으로 선별된 항체의 인식).
Figure 112009025002079-pct00006
실시예 3 : 결장 이종이식 모델 HT29에서의 본 발명에 따라 제조된 항체(보다 구체적으로는 1A6 및 2E11)의 항-종양 활성의 확인
5 x 106개의 HT29 세포를 <<스위스-누드>> 생쥐에 이식시켰다. 이식후 5일째에 종양의 크기를 재었으며 생쥐는 동일한 크기의 종양을 가진 6 마리의 생쥐로 3개의 배치로 나누었다. 생쥐는 PBS(음성 대조군) 또는 0.5 mg의 항체 1A6 또는 2E11로 일주일에 3번 처치하였다(첫번째 주입 용량 : 1 mg/생쥐).
종양 부피 추적은 일주일에 2번 수행하였으며, 종양 부피는 다음의 식에 따라 컴퓨터로 계산하였다: (π/6)x(l)x(L)x(e), 상기 식에서 l= 측정된 너비, L= 측정된 길이, e=측정된 두께.
결과값은 도 5에 나타내었다.
HT29 세포는 활동적인(aggressive) 표현형을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 이렇게 얻어진 결과는 항-종양 조성물(실시예 2 참고)에 의해 처치된 종양으로부터 유래된 종양 세포의 항원에 직접적으로 대항하는 항체를 이용할 수 있으며, 활동적 표현형을 가진 종양을 처치하기 위한 항-종양 조성물로서의 가능성을 가짐을 증명해준다.
이 실험에서 얻어진 결과는 항체를 생산하기 위한 기본적 시도법 및 생쥐에서 유도된 내성으로부터 치료학적 목적으로 항체를 생산하기 위한 개념을 증명해준다. 이 방법은 동일한 방법으로 수행함으로써 화학요법제 약물을 포함하는 약물의 모든 조합, 항체 단독 또는 조합, 또는 티로시나아제 키나아제 저해제 또는 프로테아좀 저해제에 적용할 수 있다.
실시예 4 : 췌장 이종이식 모델 BxPC3에서의 본 발명에 따라 제조된 항체 2E11의 항-종양 활성의 확인
10 x 106개의 BxPC3 세포를 가슴샘없는 <<누드>> 생쥐에 이식시켰다. 이식후 5일째에, 종양 크기를 측정하고 동일한 크기의 종양을 가진 6마리의 생쥐로 2 그룹으로 나누었다. 그리고 난 뒤 이 생쥐에게 PBS(음성 대조군) 또는 항체 2E11 (1mg/투여량)로 일주일에 2회 처치하였다. 종양 부피 추적은 일주일에 2회 수행하였다.
결과값은 도 7에 나타내었다.
이 실험에서 얻어진 결과는 2E11 항체의 기능적 활성도 및 생쥐에서 유도된 내성으로부터 치료학적 목적으로 항체를 생산하기 위한 개념을 증명해준다.
<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> METHOD FOR GENERATING ACTIVE ANTIBODIES AGAINST A RESISTANCE ANTIGEN, ANTIBODIES OBTAINED BY SAID METHODS AND THEIR USES <130> D24754 <140> PCT/EP2007/060243 <141> 2007-09-27 <150> FR 06/08514 <151> 2006-09-28 <160> 80 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Arg Ala Arg Gln Asp Ile Arg Asn Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Thr Glu Tyr Thr Leu His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Gly Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Ser Asn Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> mus musculus <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser 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Claims (71)

  1. 최소한 하나의 항-종양 물질에 대한 내성 종양의 표면에서 발현되는 종양 항원에 직접적으로 대항하는 항체, 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 시험관 내에서 생산하기 위한 방법으로서, 이 방법은 상기 내성 종양으로부터 유래된 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물로 동물을 면역화시키는 단계, 및 내성 종양을 인지하지만 내성 종양이 유래된 천연 종양을 인지하지는 못하는 항체를 선별하는 단계를 포함하고,상기 내성 종양은 다음 방법들 중 하나에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
    a) 종양 내성을 유도하는 최소한 하나의 항-종양 물질로 치료적 처치 중이거나 처치 받은 환자의 생검 및/또는 수술에 의해 상기 내성 종양을 직접 얻는 방법, 및
    b) 종양 세포주 및/또는 인간 종양의 전부 또는 일부를 동물에 이식한 후, 천연 종양의 내성을 유도하는 최소한 하나의 항-종양 물질을 동물에 주입하여 상기 내성 종양을 얻는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역화는 복강내 및/또는 피하내 및/또는 정맥내 및/또는 비장내 주사에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 내성 종양의 표면에서 발현되는 종양 항원에 직접적으로 대항하는 상기 항체, 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나는 IgG의 감마 1, 감마 2 또는 감마 4 동형인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 기능적 단편은 Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc 단편 및 디아보디(diabodies)로부터 선택되거나, PEG화(pegylated) 단편과 같이 수명이 증가된 모든 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    i) 내성 종양으로부터 유래된 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물로 동물을 직접적으로 면역화시키는 단계,
    ii) 하이브리도마를 얻기 위해 상기 단계 i)의 면역화된 동물의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키는 단계, 및
    iii) 내성 종양의 종양 세포의 표면에 발현된 항원을 특이적으로 인식하고, 이의 발현이 항-종양 처치에 의해 유도되는 항체를 분비하는 하이브리도마를 차별적으로 선별함으로써 선별하는 단계.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 단계 i) 이전에 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 종양 세포주 및/또는 부모 종양의 전부 또는 일부를 선별하여 동물에 이식하는 단계,
    b) 이 이식된 동물의 일부를 최소한 하나의 항-종양 물질로 처치하는 단계,
    c) 단계 a)에서 이식된 처치되지 않은 동물로부터 유도되는 부모 종양의 전부 또는 일부를 회수하는 단계,
    d) 단계 b)에서 처치된 동물로부터 유래된 내성 종양의 전부 또는 일부를 회수하는 단계,
    e) 단계 c) 및 d) 각각에서 회수된 종양 전체 또는 일부로부터의 항체를 차별적으로 선별하기 위한 수단을 준비하는 단계, 및
    f) 단계 d)에서 회수된 내성 종양 전부 또는 일부로부터 가공된 균질화물 및/또는 세포 분해물을 준비하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 종양 세포주 및/또는 부모 종양은 폐, 결장, 전립샘, 유방, 난소 종양 세포 또는 처치에 대한 내성이 확정된 모든 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 항-종양 물질은 화학 요법제, 방사선 요법제, 호르몬 요법제, 티로신 키나아제 저해제와 같은 화학 물질 또는 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 항-종양 물질은 바람직하게는 단일클론 항체로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체이며, 성장 인자 수용체, 혈관신생과 관련된 분자, 또는 세포 이동 현상과 관련된 케모카인과 인테그린에 직접적으로 대항하는 항체 또는 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 항-종양 물질은 다른 기원이거나, 및/또는 다른 작용 매커니즘을 갖거나, 및/또는 다른 단백질을 표적으로 하는 최소한 2개, 바람직하게는 최소한 3개의 화합물로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 항-종양 물질의 조합은 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편의 조합은 항-IGF-IR, 항-EGFR, 항-Her/2neu, 항-VEGF, 항-VEGFR, 항-CXCR, 항-cMET, 항-RON 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 조합은 항-IGF-IR 항체, 항-EGFR 항체 및 항-Her/2neu 항체의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 조합은 단일클론 항체 7C10, 225 및 h4D5의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 7 항에 있어서, 천연 종양 세포의 항원을 인지하지 않는 항체를 분비하는 하이브리도마를 선별하기 위한 단계 iii)은 천연 종양과 내성 종양 사이의 하이브리도마에 의해 분비되는 항체를 차별적으로 스크리닝함으로써 구현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기의 차별적으로 스크리닝하는 것은 제 8 항에 따른 방법의 단계 e)에서 얻어진 수단을 적용함으로써 구현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 8 항에 있어서, 단계 i) 이전에 추가로 내성화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 내성화 단계는 하기의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    - 단계 c)로부터 유도된 소위 <<천연>> 종양이라고 불리는 종양으로부터 얻어진 가공된 균질화물 및/또는 현탁액 및/또는 세포 분해물을 동물에게 투여하는 단계, 및
    - 상기 단계의 투여에 의해 활성화된 B 세포를 제거하고, 그로 인해 상기 소위 <<천연>> 종양이라고 불리는 종양에 대한 모든 잠재적인 반응성을 저해하기 위해 상기 동물에게 면역억제제를 투여하는 단계.
  22. 항-종양 물질에 대한 내성 종양을 저해할 수 있는 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 생산하고 선별하는 방법, 또는 최소한 하나의 항-종양 물질에 대해 내성을 띄는 종양의 표면에서 발현되는 종양 항원에 직접적으로 대항하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 생산하고 선별하는 방법으로서, 상기 종양 항원은 항-종양 물질에 대한 상기 종양의 내성과 관련이 있으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법;
    a) 제 1 항에 따라 항체 또는 이의 기능적 단편을 시험관 내에서 생산하는 단계, 상기 항체는 내성 종양의 표면에서 특이적으로 발현하는 상기 종양 항원에 대해 직접적으로 대항하며, 상기 종양 항원은 내성 종양이 유래되는 천연 종양 세포의 표면에서 발현되지 않는 것을 특징으로 함;
    b) 단계 a)에서 얻어진 항체를 항-종양 물질에 대해 내성을 띄는 종양과 시험관내 또는 생체내에서 접촉하도록 놓아두는 단계; 및
    c) 항-종양 물질에 대한 종양의 내성에 대해 상기 항체가 저해 활성을 갖는 다는 것이 증명된 항체를 선별하는 단계.
  23. 제 1 항에 있어서, 치료학적 및/또는 진단적 단일클론 항체를 생산하기 위한 방법.
  24. 제 7 항에 따른 방법을 적용하여 얻어진, 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 기능적 단편은 Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc 단편 및 디아보디(diabodies)로부터 선택되거나, PEG화(pegylated) 단편과 같이 수명이 증가된 모든 단편인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  26. 제 25 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편:
    - 서열번호 1, 2 및 3의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 1, 2 및 3과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
    - 서열번호 4, 5 및 6의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 4, 5 및 6과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 항체는 1A6라고 불리며, 서열번호 7의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하며, 서열번호 8의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  28. 제 26 항에 따른 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 프랑스 파리 파스퇴르 연구소의 CNCM(미생물기탁국)에 기탁된 기탁번호 I-3612인 것을 특징으로 하는 생쥐 하이브리도마.
  30. 제 24 항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편:
    - 서열번호 9, 10 및 11의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 9, 10 및 11과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
    - 서열번호 12, 13 및 14의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 12, 13 및 14와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 항체는 1A9라고 불리며, 서열번호 15의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하며, 서열번호 16의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  32. 제 30 항에 따른 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 프랑스 파리 파스퇴르 연구소의 CNCM(미생물기탁국)에 기탁된 기탁번호 I-3613인 것을 특징으로 하는 생쥐 하이브리도마.
  34. 제 24 항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편:
    - 서열번호 17, 18 및 19의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 17, 18 및 19와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
    - 서열번호 17, 18 및 19의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 17, 18 및 19와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 항체는 2E11이라고 불리며, 서열번호 23의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하며, 서열번호 23의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  36. 제 34 항에 따른 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 프랑스 파리 파스퇴르 연구소의 CNCM(미생물기탁국)에 기탁된 기탁번호 I-3615인 것을 특징으로 하는 생쥐 하이브리도마.
  38. 제 24 항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편:
    - 서열번호 25, 26 및 27의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 25, 26 및 27과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
    - 서열번호 28, 29 및 30의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 28, 29 및 30과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 항체는 3C11이라고 불리며, 서열번호 31의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하며, 서열번호 32의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  40. 제 38 항에 따른 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 프랑스 파리 파스퇴르 연구소의 CNCM(미생물기탁국)에 기탁된 기탁번호 I-3614인 것을 특징으로 하는 생쥐 하이브리도마.
  42. 제 24 항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편:
    - 서열번호 33, 34 및 35의 CDR 부위를 포함하는 경쇄, 또는 서열번호 33, 34 및 35와 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열; 및
    - 서열번호 36, 37 및 38의 CDR 부위를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 36, 37 및 38과 최적으로 정렬하고 난 뒤에 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 항체는 3G7이라고 불리며, 서열번호 39의 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하며, 서열번호 40의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  44. 제 42 항에 따른 항체를 분비할 수 있는 생쥐 하이브리도마.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 생쥐 하이브리도마는 2006년 5월 31일에 프랑스 파리 파스퇴르 연구소의 CNCM(미생물기탁국)에 기탁된 기탁번호 I-3616인 것을 특징으로 하는 생쥐 하이브리도마.
  46. 제 24 항에 있어서, 상기 기능적 단편은 Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc 단편 및 디아보디(diabodies)로부터 선택되거나, PEG화(pegylated) 단편과 같이 수명이 증가된 모든 단편인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  47. 제 29 항에 따른 하이브리도마에 의해 분비되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  48. 제 24 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체이며, 생쥐와는 이종인 종의 항체로부터 유래된 보존 경쇄 및 중쇄 부위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체이며, 상기 이종은 인간 종인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  50. 제 49 항에 있어서, 인간 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 보존 부위는 각각 카파 및 감마 1, 감마 2 또는 감마 4 부위인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  51. 제 48 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄 및/또는 중쇄의 골격 단편 FR1-FR4는 인간 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 골격 단편 FR1-FR4로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  52. 하기의 핵산으로부터 선택되는 분리된 핵산:
    a) 제 25 항에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA;
    b) 상기 a)에 기재된 핵산에 상보적인 핵산;
    c) 서열번호 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78 서열의 CDR 부위 중 최소한 하나 또는 서열번호 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78 서열과 최적으로 정렬하고 난 뒤 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열과 강한 조건하에서 혼성화할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드로 구성된 핵산; 및
    d) 서열번호 48, 56, 64, 72 또는 80 서열의 경쇄 중 최소한 하나 및/또는 서열번호 47, 55, 63, 71 또는 79 서열의 중쇄 중 하나, 서열번호 47, 48, 55, 56, 63, 64, 71, 72, 79 또는 80과 최적으로 정렬하고 난 뒤 최소한 80%의 상동성을 갖는 서열과 강한 조건하에서 혼성화할 수 있는 최소한 18개의 뉴클레오타이드로 구성된 핵산.
  53. 제 52 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  54. 제 53 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  55. 제 54 항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환 동물.
  56. 하기 단계를 포함하는, 제 25 항에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나의 생산 방법:
    a) 제 54 항에 따른 세포를 적합한 배양 조건으로 배지에서 배양하는 단계; 및
    b) 배양 배지 또는 상기 배양된 세포로부터 생산된 상기 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나를 회수하는 단계.
  57. 제 24 항에 있어서, 암 예방 또는 치료용 약물인, 단일클론 항체 또는 이의 기능적 단편.
  58. 제 24 항에 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나 또는 제 28 항에 따른 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 이의 기능적 단편 중의 하나로 구성되는 화합물을 활성 성분으로 포함하는 조성물.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 조성물은 자극, 분리 사용 또는 오랫동안 확산 사용하기 위한 산물, 화학요법제, 방사선요법제 또는 항체의 조합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. 제 58 항에 있어서, 암 예방 또는 치료용 약물인, 조성물.
  61. 제 57 항에 따른 항체를 이용하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약물 제조 방법.
  62. 제 60 항에 따른 조성물을 이용하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약물 제조 방법.
  63. 제 61 항에 있어서, 상기 암은 결장, 전립샘, 유방, 폐, 난소 또는 췌장 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 내성 타입의 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 62 항에 있어서, 상기 암은 결장, 전립샘, 유방, 폐, 난소 또는 췌장 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 내성 타입의 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 24 항에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편 중 하나, 또는 제 28 항에 따른 하이브리도마에 의해 생산된 항체를 이용하는 단계를 포함하는, 내성 종양 지향성 및/또는 후기 단계에서 발견되는 생물학적 활성 화합물을 특이적으로 표적화하기 위한 약물 제조방법.
  66. 제 1 항에 따른 방법을 적용하여 단일클론 항체를 수득하고 상기 단일클론 항체에 의해 인식되는 단백질을 확인하는 방법을 적용하는 것을 특징으로 하는, 내성 현상과 관련된 세포내 또는 세포외의 신규한 치료학적 및/또는 진단학적 표적물질을 확인하는 방법.
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