CN111491661A - M(h)dm2/4的抗体及其在诊断和治疗癌症中的用途 - Google Patents

M(h)dm2/4的抗体及其在诊断和治疗癌症中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特定抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段，包含抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段的药物组合物，包含结合于细胞毒性药物的抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段的抗体‑药物偶联物，和这样的抗体、片段、组合物和偶联物用于治疗癌症和/或用于预防转移的用途。特别地，本文描述了特定抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位并在体内抑制肿瘤生长，包含这样的抗体或片段的药物组合物，包含这样的抗体或片段的抗体‑药物偶联物，和这样的抗体、片段、组合物和偶联物用于治疗癌症或用于预防转移的用途。

Description

M(H)DM2/4的抗体及其在诊断和治疗癌症中的用途
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月27日提交的第62/537,914号美国临时专利申请的权益，将其全部内容以引用方式并入本文。
2.对电子提交的序列表的引用
本申请通过引用并入了与本申请一起提交的序列表，该序列表是名称为“14160-006-228_ST25”的ASCII文本文件，其创建于2018年7月25日，并且具有88,287字节的大小。
3.技术领域
本发明涉及特定抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段，包含抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段的药物组合物，包含结合于细胞毒性药物的抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段的抗体-药物偶联物，和这样的抗体、片段、组合物和偶联物用于治疗癌症和/或用于预防转移的用途。
4.背景技术
MDM2(MDM2是HDM2的小鼠同源物)蛋白由489个氨基酸组成，并且包含p53结合结构域、两个核定位信号(氨基酸176-182和464-471)和锌指基序(氨基酸297-326和436-477)(参见UniProt网站，UniProt登录号P23804)。其人同源物HDM2由491个氨基酸组成，并且包含p53结合结构域、两个核定位信号(氨基酸179-185和466-473)和锌指基序(氨基酸299-328和438-479)(参见UniProt网站，UniProt登录号Q00987)。小鼠蛋白MDM4(也称为MDMX)是MDM2蛋白的同源物(参见UniProt网站，UniProt登录号O35618)，并且MDM2和MDM4二者均为p53的主要负调节剂(Wade等人,2013,Nat Rev.Cancer 13:83-96；Marine等人,2004,CellCycle 3:900-904；Momand等人,2011,Gene 486:23-30)。HDM4(也称为HDMX)是MDM4的人同源物(参见UniProt网站，UniProt登录号O15151)。在所有M(H)DM2和M(H)DM4蛋白内的最保守的结构域是RING结构域，其与其靶蛋白(包括p53蛋白)的泛素化，以及M(H)DM2和M(H)DM4之间的异二聚化有关。M(H)DM4是p53的M(H)DM2介导的多聚泛素化所需的。M(H)DM2和M(H)DM4的区别特征是它们非常复杂的表达模式。M(H)DM2的多个尺寸的转录物和蛋白产物已在癌细胞中由许多组确定(Olson等人,1993,Oncogene 8:2353-2360；Bartel等人,2002,Cancer Cell 2:9-15(“Bartel 2002”)；Sigalas等人,1996,Nat.Med.2:912-917(“Sigalas1996”)；Iwakuma&Lozano,2003,Mol.Cancer Res.1:993-1000(“Iwakuma&Lozano 2003”))。许多类型的人类癌症过表达MDM2蛋白，这些癌症之间的共同特征是mdm2剪接变体的相关增加。这些M(H)DM2变体已显示在多种肿瘤中表达，例如人卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌和星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、白血病和儿童横纹肌肉瘤(Iwakuma&Lozano 2003综述；Rosso等人,2014,Subcell Biochem.85:247-61(“Rosso 2014”))。最有趣的是，已发现它们在晚期肿瘤中更常见(Bartel 2002)。据报道，已显示作为M(H)DM2mRNA的剪接变体形式的多种尺寸的M(H)DM2转录物在肿瘤细胞中比在正常细胞中更频繁地表达(Bartel等人,2004,Mol.CancerRes.2:29(“Bartel 2004”))。已经提出在未转化的细胞中存在mRNA监视系统，其降解剪接的转录物并保护细胞免受转录、mRNA加工或mRNA运输的错误，而在转化的细胞中该系统可能无法正常运行(Bartel 2004)。此外，癌细胞中的这些变体中有一些编码蛋白产物，已证明在体外可转化NIH3T3细胞，而有一些在小鼠模型中则促进肿瘤形成(Sigalas 1996；Volk等人,2009,Mol Cancer Res.7(6):863–869)。
迄今为止，已经确定了70多种不同的M(H)DM2剪接变体(Bartel 2002；Bartel2004；Rosso 2014)。一些变体，例如MDM2-A和MDM2-B，对于几种肿瘤类型是常见的(Sigalas1996)。其他仅在特定的肿瘤中发现，例如儿童横纹肌肉瘤中的MDM2-FB25和MDM2-FB26。这些供选择地剪接的MDM2转录物的几种短形式与人卵巢肿瘤、膀胱癌和星形细胞肿瘤中的高度恶性相关(Sigalas 1996；Matsumoto等人,1998,Cancer Res.58:609-613；Tamborini等人,2001,Int.J.Cancer 92:790-796；Steinman等人,2004,JBC 279:4877-4886)。还显示出异常的mdm2(281-、254-和219-bp)和供选择的mdm2(653-bp)剪接产物与乳腺癌患者的总体生存期缩短有密切关系(Lukas等人,2001,Cancer Res.61:3212)。
一些研究已经评价了各种人和鼠M(H)DM2蛋白变体的细胞定位，以预测潜在的活性。在25％的非小细胞肺癌中，M(H)DM2变体异常定位在细胞质中(Evans等人,2001,Oncogene 20:4041-4049)。该结果导致以下发现，即全长M(H)DM2的细胞质区室化是由于供选择的剪接的M(H)DM2产物(HDM2ALT1)的结合和螯合所致。在另一项研究中，MDM2-D150-230定位于U20S细胞的细胞质(Schuster等人,2007,Mol.Cancer Res.5:403-412(“Schuster 2007”))。这两个M(H)DM2蛋白变体都缺少包含核定位信号(NLS)的NH2末端区域的部分，这表明该信号的丧失阻止了这两种蛋白进入核(Schuster 2007)。综上所述，这些数据表明M(H)DM2蛋白变体的细胞定位高度复杂。
还已经表征了多种M(H)DM4蛋白变体，包括剪接变体MDMX-S(Lenos和Jochemsen,2011,J.Biomed Biotechnol.,doi:10.1155/2011/876173)。
发现HDM2在癌细胞的质膜中表达(Sarafraz-Yazdi等人,2010,PNAS 107:1918-1923(“Sarafraz-Yazdi 2010”))。此外，已经开发了抗癌肽PNC-27和PNC-28，它们与癌细胞膜中表达的HDM2结合并通过诱导坏死杀死癌细胞(Sarafraz-Yazdi 2010；Davitt等人,2014,Annals Clin.Lab.Sci.44:241248)(PNC-27和PNC-28的氨基酸序列提供在第2012/0177566号美国专利申请公开案的表I中)。已经报道PNC-27在HDM2的氨基酸25-109内结合(Do等人,2003,Oncogene 22(10):1431-1444(“Do 2003”)；Chène,2003,Nat.Rev.Cancer 3(2):102-109)。此外，第2012/0177566号美国专利申请公开案公开了通过向细胞施用包括HDM-2靶向组分和连接到HDM-2靶向组分的细胞毒性组分的化合物(如PNC-27和PNC-28)使细胞选择性坏死的方法，其中所述化合物包括膜活性形式。仅当将货物(即p53序列组分)连接到MRP组分从而形成细胞毒性结构时，才能实现PNC-27和PNC-28肽(包含膜驻留肽(“MRP”)和p53序列)的膜活性功能(Kanovsky等人,2001,PNAS 98:12438-12443(“Kanovsky2001”)；Bowne等人,2008,Ann Surg Oncol.15:3588-3600(“Bowne 2008”))。当分别使用MRP组分或HDM-2靶向组分(即p53组分)时，发现它们对癌细胞无细胞毒性(Kanovsky 2001；Do 2003)，这表明仅有MRP组分和仅有HDM-2靶向组分时缺乏活性。当在细胞内重组表达时，观察到HDM-2靶向组分引起细胞凋亡(Bowne 2008)。第9,765,117号美国专利公开了HDM2靶向肽和包含HDM2靶向肽和跨膜穿透序列的融合肽，例如MRP；公开了MRP是诱导细胞坏死所必需的(参见第4栏，第27-28行)。第9,765,117号美国专利表明在癌细胞中不存在MRP的情况下，p53 HDM2靶向序列的表达引起p53依赖性细胞凋亡而不是肿瘤坏死(参见第4栏，第29-32行)。
细胞穿透肽(“CPP”)(如MRP，触角足的膜转导结构域，反式激活转录激活剂(“TAT”)和穿透素肽)能够使肽以及连接到该肽的分子细胞膜递送到质膜脂质双层，包括正常健康细胞的脂质双层。这些肽显示出可在活细胞内有效转运各种生物活性分子(Bechara等人,2013,FEBS Lett.587:1693-1702,Dupont等人,2015,Methods Mol.Biol.1324:29-37)。连接到各种货物(如其他肽、DNA、RNA、小分子、抗体或其片段)的这些CPP(如MRP、触角足的膜转导结构域、TAT和穿透素肽)的使用已显示改善这些货物在体内和体外的药代动力学、生物分布、保留、摄取和向各种肿瘤的递送(Torchilin等人,2003,PNAS 100:1972-1977；Shin等人,2014,J.Biomed.Mater Res.A.102:575-587；Kleemann等人,2005,J.Control Release 109:299-316；Olson等人,2009,Integr.Biol(Camb)1:382-393；Jain等人,2005,Cancer Res.65:7840-7846；William等人,2002,PNAS 99:10423-10428；Bolhassani,2011,Biochim Biophys.Acta 1816:232-246)。尽管大多数这些CPP都用作货物递送实体，但据报道，穿透素和MRP肽在与其货物连接时会形成独特的细胞毒性膜活性结构(Rosal等人,2005,Adv Drug Deliv Rev 57:653-60(“Rosal 2005”)；Bowne 2008；Kanovsky 2001)。PNC-27和PNC-28肽是穿透素-/MRP-货物偶联物的实例，其表现出的细胞毒性功能依赖于其货物与MRP的附着和连接，这是形成其膜活性结构所需的，因此是细胞毒性功能所需的(Kanovsky 2001；Rosal 2005；Bowne 2008)。
本领域中长期存在对有效地治疗癌症，例如转移性癌症，并预防患者中的转移的未满足的需要。
5.发明概述
一方面，本文描述了一种特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段。具体地，本文描述了特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段在体内抑制肿瘤生长(或在体内抑制肿瘤细胞增殖)。在某些实施方案中，本文所述的抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)。在某些实施方案中，本文所述的抗体或片段不结合于细胞毒性组分(即，不结合于细胞毒性剂)。
一方面，本文描述了特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。具体地，本文描述了特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的抗体或片段，其中所述抗体或片段特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在一个实施方案中，抗体或片段结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列为MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中，所述抗体或片段结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列为TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中，所述抗体或片段结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列为CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)。在某些实施方案中，本文描述了一种特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽内。在一个实施方案中，本文描述了一种特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1的肽内。在一个实施方案中，本文描述了一种特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其包含在SEQID NO:2的肽内。在一个实施方案中，本文描述了一种特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:3的肽内。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的人源化抗体或其片段，所述抗体或片段包含：(i)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR2和VH CDR3的重链可变区(VH)；所述VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3是具有选自SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SED ID NO:40的氨基酸序列的VH的CDR；或(ii)包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的轻链可变区(VL)，所述VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3是具有选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL的CDR。在一个实施方案中，特异性结合于HDM2的人源化抗体或片段包含VH，其中VH CDR 1、VH CDR 2和VH CDR 3属于具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH。在一个实施方案中，特异性结合于HDM2的人源化抗体或片段包含VH，其中VH CDR 1、VH CDR 2和VH CDR3属于具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH。在一个实施方案中，特异性结合于HDM2的人源化抗体或片段包含VH，其中VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3属于具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH。在一个实施方案中，特异性结合于HDM2的人源化抗体或片段包含VL，其中VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3属于具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL(和任选地，包含VH，其中VHCDR 1、VH CDR 2和VH CDR 3属于具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH)。在一个实施方案中，特异性结合于HDM2的人源化抗体或片段包含VL，其中VL CDR 1、VL CDR 2和VL CDR 3属于具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL(和任选地，包含VH，其中VH CDR 1、VH CDR 2和VHCDR 3属于具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH)。在一个实施方案中，特异性结合于HDM2的人源化抗体或片段包含VL，其中VL CDR 1、VL CDR 2和VL CDR 3属于具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL(和任选地，包含VH，其中VH CDR 1、VH CDR 2和VH CDR 3属于具有SEQID NO:40的氨基酸序列的VH)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于M(H)DM2/4的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VHCDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHY(SEQ ID NO:18)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列RNKAKGYT(SEQ ID NO:19)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ ID NO:20)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHYYMS(SEQ ID NO:42)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:45)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ IDNO:20)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列HYYMS(SEQ ID NO:43)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAEYSASVKG(SEQ ID NO:46)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQID NO:20)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列THYYMS(SEQ ID NO:44)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WLGFIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:47)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGD(SEQ IDNO:48)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列FTFTHYY(SEQ ID NO:144)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IRNKAKGYTA(SEQ ID NO:145)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGDN(SEQ IDNO:146)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGS(SEQ ID NO:24)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列HLNRGT(SEQ ID NO:25)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ ID NO:26)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSWMH(SEQ ID NO:52)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTN(SEQ ID NO:55)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ IDNO:26)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GSWMH(SEQ ID NO:53)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTNYNEKFKG(SEQ ID NO:56)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQID NO:26)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SGSWMH(SEQ ID NO:54)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGEIHLNRGTTN(SEQ ID NO:57)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ IDNO:58)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSW(SEQ ID NO:148)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IHLNRGTT(SEQ ID NO:143)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ IDNO:58)。
一方面，本文提供了一种特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSY(SEQ ID NO:30)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列NPRNGG(SEQ ID NO:31)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSYYMY(SEQ ID NO:62)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTN(SEQ ID NO:65)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQID NO:32)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SYYMY(SEQ ID NO:63)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:66)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；或
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列TSYYMY(SEQ ID NO:64)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGGINPRNGGTN(SEQ ID NO:67)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列TRSGYYAMD(SEQID NO:68)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的人源化抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHY(SEQ ID NO:18)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列RNKAKGYT(SEQ ID NO:19)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ ID NO:20)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHYYMS(SEQ ID NO:42)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:45)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ IDNO:20)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列HYYMS(SEQ ID NO:43)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAEYSASVKG(SEQ ID NO:46)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQID NO:20)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列THYYMS(SEQ ID NO:44)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WLGFIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:47)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGD(SEQ IDNO:48)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列FTFTHYY(SEQ ID NO:144)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IRNKAKGYTA(SEQ ID NO:145)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGDN(SEQ IDNO:146)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的人源化抗体或其片段，所述抗体或片段包含VH，其中所述VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ ID NO:20)；
(ii)所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGD(SEQ ID NO:48)；或
(iii)所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGDN(SEQ ID NO:146)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的人源化抗体或其片段，所述抗体或片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RSSKNLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:21)，所述VLCDR 2具有氨基酸序列RVSNLAS(SEQ ID NO:22)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPYT(SEQ ID NO:23)；
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列LHSNGITYLYWY(SEQ ID NO:49)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLISRVSNLA(SEQ ID NO:50)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPY(SEQID NO:51)；或
(iii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列KNLLHSNGITY(SEQ ID NO:147)，所述VL CDR2具有氨基酸序列RVS和所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPYT(SEQ ID NO:23)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的人源化抗体或其片段，所述抗体或片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHY(SEQ ID NO:18)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列RNKAKGYT(SEQ ID NO:19)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ ID NO:20)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHYYMS(SEQ ID NO:42)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:45)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ IDNO:20)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列HYYMS(SEQ ID NO:43)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAEYSASVKG(SEQ ID NO:46)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQID NO:20)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列THYYMS(SEQ ID NO:44)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WLGFIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:47)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGD(SEQ IDNO:48)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列FTFTHYY(SEQ ID NO:144)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IRNKAKGYTA(SEQ ID NO:145)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGDN(SEQ IDNO:146)；和
(b)轻链可变区(VL)，其包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RSSKNLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:21)，所述VLCDR 2具有氨基酸序列RVSNLAS(SEQ ID NO:22)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPYT(SEQ ID NO:23)；
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列LHSNGITYLYWY(SEQ ID NO:49)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLISRVSNLA(SEQ ID NO:50)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPY(SEQID NO:51)；或
(iii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列KNLLHSNGITY(SEQ ID NO:147)，所述VL CDR2具有氨基酸序列RVS和所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPYT(SEQ ID NO:23)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGS(SEQ ID NO:24)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列HLNRGT(SEQ ID NO:25)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ ID NO:26)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSWMH(SEQ ID NO:52)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTN(SEQ ID NO:55)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ IDNO:26)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GSWMH(SEQ ID NO:53)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTNYNEKFKG(SEQ ID NO:56)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQID NO:26)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SGSWMH(SEQ ID NO:54)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGEIHLNRGTTN(SEQ ID NO:57)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ IDNO:58)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSW(SEQ ID NO:148)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IHLNRGTT(SEQ ID NO:143)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ IDNO:58)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含VH，其中所述VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ ID NO:26)；或
(ii)所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ ID NO:58)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RSSKSLLHSNGNSYLY(SEQ ID NO:27)，所述VLCDR 2具有氨基酸序列RMSNLAS(SEQ ID NO:28)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQ ID NO:29)；
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列LHSNGNSYLYWF(SEQ ID NO:59)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLIYRMSNLA(SEQ ID NO:60)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPF(SEQID NO:61)；或
(iii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列KSLLHSNGNSY(SEQ ID NO:141)，所述VL CDR2具有氨基酸序列RMS和所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQ ID NO:29)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGS(SEQ ID NO:24)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列HLNRGT(SEQ ID NO:25)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ ID NO:26)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSWMH(SEQ ID NO:52)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTN(SEQ ID NO:55)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ IDNO:26)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GSWMH(SEQ ID NO:53)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTNYNEKFKG(SEQ ID NO:56)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQID NO:26)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SGSWMH(SEQ ID NO:54)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGEIHLNRGTTN(SEQ ID NO:57)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ IDNO:58)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSW(SEQ ID NO:148)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IHLNRGTT(SEQ ID NO:143)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ IDNO:58)；和
(b)轻链可变区(VL)，其包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RSSKSLLHSNGNSYLY(SEQ ID NO:27)，所述VLCDR 2具有氨基酸序列RMSNLAS(SEQ ID NO:28)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQ ID NO:29)；
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列LHSNGNSYLYWF(SEQ ID NO:59)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLIYRMSNLA(SEQ ID NO:60)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPF(SEQID NO:61)；或
(iii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列KSLLHSNGNSY(SEQ ID NO:141)，所述VL CDR2具有氨基酸序列RMS和所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQ ID NO:29)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSY(SEQ ID NO:30)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列NPRNGG(SEQ ID NO:31)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSYYMY(SEQ ID NO:62)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTN(SEQ ID NO:65)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQID NO:32)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SYYMY(SEQ ID NO:63)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:66)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；或
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列TSYYMY(SEQ ID NO:64)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGGINPRNGGTN(SEQ ID NO:67)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列TRSGYYAMD(SEQID NO:68)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含VH，其中所述VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；或
(ii)所述VH CDR 3具有氨基酸序列TRSGYYAMD(SEQ ID NO:68)。
一方面，本文描述了还包含轻链可变区(VL)的抗体或片段，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO:33)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:34)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列QQGNTLPRT(SEQ IDNO:35)；或
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列SNFLNWY(SEQ ID NO:69)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLIYYTSRLH(SEQ ID NO:70)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列QQGNTLPR(SEQ IDNO:71)。
一方面，本文描述了一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSY(SEQ ID NO:30)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列NPRNGG(SEQ ID NO:31)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSYYMY(SEQ ID NO:62)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTN(SEQ ID NO:65)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQID NO:32)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SYYMY(SEQ ID NO:63)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:66)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；或
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列TSYYMY(SEQ ID NO:64)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGGINPRNGGTN(SEQ ID NO:67)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列TRSGYYAMD(SEQID NO:68)；和
(b)轻链可变区(VL)，其包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO:33)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:34)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列QQGNTLPRT(SEQ IDNO:35)；或
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列SNFLNWY(SEQ ID NO:69)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLIYYTSRLH(SEQ ID NO:70)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列QQGNTLPR(SEQ IDNO:71)。
一方面，本文描述了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH。
一方面，本文描述了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL(和任选地，包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH)。
一方面，本文描述了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH。
一方面，本文描述了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL，或与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL(和任选地，包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH)。
一方面，本文描述了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH。
一方面，本文描述了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL，或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL(和任选地，包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH或与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH)。
在优选的实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体(例如，人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体)。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是人抗体。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是嵌合抗体。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是纯化的抗体。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是免疫球蛋白(例如，IgG或IgM)。在一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG。在一个实施方案中，免疫球蛋白是IgM。在某些实施方案中，免疫球蛋白属于IgG1同种型。在其他实施方案中，免疫球蛋白属于IgG3同种型。在其他实施方案中，免疫球蛋白属于IgG2同种型。在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体包含Fc区，其中所述Fc区是人IgG Fc区或人IgM Fc区。在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体包含Fc区，其为人IgG1 Fc区，人IgG2 Fc区或人IgG3 Fc区。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体包含人IgG1 Fc区。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体包含人IgG3 Fc区。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体包含人IgG2 Fc区。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体包含人IgM Fc区。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体包含人IgE Fc区。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段是抗M(H)DM2/4抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，本文所述的抗体或片段是Fv片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体分子或单链Fv(scFv)。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段是Fv片段。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段是Fab片段。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段是Fab′片段。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段是F(ab′)2片段。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段是单链抗体分子。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段是单链Fv(scFv)。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或抗原结合片段介导补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或抗原结合片段介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是双特异性抗体，其也特异性结合于效应细胞(例如，T细胞、B淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞或树突细胞)的细胞表面抗原。
在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段特异性结合于M(H)DM2(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位，并且不结合于M(H)DM4(例如，HDM4)。在另一个实施方案中，本文所述的抗体或片段特异性结合于M(H)DM2(例如，HDM2)和M(H)DM4(例如，HDM4)二者的细胞外可接近的表位。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位，并且任选地还可以结合于MDM2的细胞外可接近的表位。
在具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段特异性在SEQ ID NO:1的氨基酸(其为HDM2的氨基酸1至15(SEQ ID NO:4))内结合HDM2。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:2的氨基酸(其为HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸15至25)内特异性结合HDM2。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:3的氨基酸(其为HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸475-491)内特异性结合HDM2。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸19至50内特异性结合。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸154至167内特异性结合。在又一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸1至60内特异性结合。在又一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸1至100内特异性结合。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸100至110内特异性结合。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸50至6内特异性结合。在又一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸1至109内特异性结合。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在SEQID NO:4的氨基酸26至60内特异性结合。在一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在癌细胞的质膜上的HDM2的C端的末端60个氨基酸内特异性结合。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体在癌细胞的质膜上的HDM2的C端的末端100个氨基酸内特异性结合。
在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体不在SEQ ID NO:4的氨基酸101至200内结合。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体不结合于“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”(Abnova，目录号H00004193-M01)所结合的HDM2或MDM2的表位。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体不与“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”(Abnova，目录号H00004193-M01)竞争结合于HDM2。
在另一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸101至200内结合。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体结合于“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”(Abnova，目录号H00004193-M01)所结合的HDM2或MDM2的表位。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体与“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”(Abnova，目录号H00004193-M01)竞争结合于HDM2。
在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体不在SEQ ID NO:4的氨基酸153至222内结合。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体不在SEQ ID NO:4的氨基酸26至169内结合。在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体不在SEQ ID NO:4的氨基酸26至222内结合。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或片段靶向的暴露在癌细胞表面上的M(H)DM2/4是缺少一种或多种核定位信号结构域的M(H)DM2/4变体。在具体实施方案中，本文所述的抗体或片段靶向的暴露在癌细胞表面上的HDM2是HDM2变体缺少SEQ ID NO:4的氨基酸179至185的序列和/或SEQ ID NO:4的氨基酸464至471的序列。在一个实施方案中，本文所述的抗体或片段靶向的暴露在癌细胞表面上的HDM2是HDM2变体缺少SEQ ID NO:4的氨基酸181至185的序列。
一方面，本文提供了抗体或其片段，其与本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其片段竞争结合于M(H)DM2/4。优选地，竞争结合的这样的抗体或片段是单克隆抗体或其片段。
一方面，本文提供了与选自以下的小鼠抗HDM2免疫球蛋白(优选地IgG)抗体竞争结合于M(H)DM2/4的抗体或其片段:(i)包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的抗体；(ii)包含具有SEQ IDNO:38的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL的抗体；和(iii)包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL的抗体。
一方面，本文提供了抗体或其片段，其：(i)与包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的小鼠抗HDM2IgG1抗体竞争结合于序列SEQ ID NO:1的肽；或(ii)与包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL的小鼠抗HDM2 IgG3抗体竞争结合于SEQ IDNO:2的肽；或(iii)与包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL的小鼠IgM抗体竞争结合于SEQ ID NO:3的肽。
一方面，本文提供了抗体-药物偶联物，其包含本文所述的任何抗体或片段(例如，其中本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段共价结合于细胞毒性药物的抗体-药物偶联物)。
一方面，本文提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的任何抗体或片段。
一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)任何本文所述的抗M(H)DM2/4抗体；(ii)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)；或包含结合于细胞毒性药物的所述抗体或片段的抗体-药物偶联物(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗HDM2抗体或片段；(ii)特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，本文提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在一个实施方案中，本文提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽内。
一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段；(ii)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗HDM2抗体或片段；(ii)特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，所述抗体-药物偶联物包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，本文提供了在有此需要的对象中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在一个实施方案中，本文提供了在有此需要的对象中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的肽内。
一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤进展的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段；(ii)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤进展的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤进展的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗HDM2抗体或片段；(ii)特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤进展的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQID NO:3)组成。在一个实施方案中，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制肿瘤进展的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽内。
一方面，本文提供了用于在有此需要的对象(例如，从癌症中缓解的对象)中预防癌症复发或再发的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段；(ii)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象(例如，从癌症中缓解的对象)中预防癌症复发或再发的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象(例如，从癌症中缓解的对象)中预防癌症复发或再发的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗HDM2抗体或片段；(ii)特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，本文提供了用于在有此需要的对象(例如，从癌症中缓解的对象)中预防癌症复发或再发的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在一个实施方案中，本文提供了用于在有此需要的对象(例如，从癌症中缓解的对象)中预防癌症复发或再发的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽内。
一方面，本文提供了用于在患有癌症的对象中提高存活率的方法(例如，相对于未用抗M(H)DM2/4抗体或片段治疗的对象)，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段；(ii)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。一方面，本文提供了用于在患有癌症的对象中提高存活率的方法(例如，相对于未用抗M(H)DM2/4抗体或片段治疗的对象)，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。一方面，本文提供了用于在患有癌症的对象中提高存活率的方法(例如，相对于未用抗M(H)DM2/4抗体或片段治疗的对象)，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗HDM2抗体或片段；(ii)特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，本文提供了用于在患有癌症的对象中提高存活率的方法(例如，相对于未用抗M(H)DM2/4抗体或片段治疗的对象)，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在一个实施方案中，本文提供了用于在患有癌症的对象中提高存活率的方法(例如，相对于未用抗M(H)DM2/4抗体或片段治疗的对象)，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽内。
一方面，本文提供了用于在患有癌症的对象中预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段；(ii)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。一方面，本文提供了用于在患有癌症的对象中预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗HDM2抗体或片段；(ii)特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，本文提供了用于在患有癌症的对象中预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在一个实施方案中，本文提供了用于在患有癌症的对象中预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽内。
一方面，本文提供了用于在患有转移性癌症的对象中抑制转移(例如，降低转移的数量、尺寸或侵袭性)的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段；(ii)特异性结合于暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。一方面，本文提供了用于在有此需要的对象中抑制转移的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。一方面，本文提供了用于在患有转移性癌症的对象中抑制转移(例如，降低转移的数量、尺寸或侵袭性)的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)本文所述的任何抗HDM2抗体或片段；(ii)特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)本文所述的任何药物组合物，或(iv)本文所述的任何抗体-药物偶联物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，本文提供了用于在患有转移性癌症的对象中抑制转移(例如，降低转移的数量、尺寸或侵袭性)的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ IDNO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在一个实施方案中，本文提供了用于在患有转移性癌症的对象中抑制转移(例如，降低转移的数量、尺寸或侵袭性)的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽内。
一方面，本文提供了选择和治疗患有癌症的对象(例如，人)的方法，所述方法包括：(a)确定患有癌症的对象，其中特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段(例如，标记的抗体或片段)结合于癌症的完整细胞的表面；和(b)向所述对象施用：(i)本文所述的任何M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段，或包含所述抗体或片段(例如，特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3组成)的抗体-药物偶联物；(ii)特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段(即，不结合于细胞穿透肽的所述抗体或片段)的抗体-药物偶联物，(iii)特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分，(iv)本文所述的任何药物组合物或(v)本文所述的任何抗体-药物偶联物。步骤(b)的抗体或其片段可以与步骤(a)的抗体或其片段相同或不同。在某些实施方案中，本文提供的方法还包括在步骤(b)之前(使用本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体)确定抗体或其片段是否结合于癌症的完整细胞的表面的步骤(例如，使用FACS或基于细胞的ELISA分析)。在一个实施方案中，本文提供的方法还包括在确定步骤之前获得所述癌症的完整细胞的步骤(例如，通过对对象的癌性肿瘤进行活检，或通过从对象中获得具有循环癌细胞的血液样品)。在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。
一方面，本文提供了用于选择对象(例如，人)进行治疗以及治疗对象中的癌症的方法，所述方法包括：(a)通过以下选择患有癌症的对象进行治疗：(i)从对象获得完整癌细胞(例如，通过对对象的癌性肿瘤进行活检，或通过从对象中获得具有循环癌细胞的血液样品)，和(ii)确定特异性结合于M(H)DM2/4的抗体或其片段(例如，标记的抗体或片段)(例如，特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或片段，如本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段)是否结合于从对象获得的完整癌细胞的表面(例如，使用FACS或基于细胞的ELISA分析)，和(b)如果在步骤(a)中检测到结合，则向所述对象施用所述抗体或片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。一方面，本文提供了选择对象进行治疗以及治疗对象中的癌症的方法，所述方法包括：(a)通过以下选择患有癌症的对象进行治疗：(i)从对象获得完整癌细胞(例如，通过对对象的癌性肿瘤进行活检，或通过从对象中获得具有循环癌细胞的血液样品)，和(ii)确定特异性结合于HDM2的抗体或其片段(例如，特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或片段，如本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段)是否结合于从对象获得的完整癌细胞的表面(例如，使用FACS或基于细胞的ELISA分析)，和(b)如果在步骤(a)中检测到结合，则向所述对象施用所述抗体或片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。
在某些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是已知转移的癌症类型。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是晚期癌症。在其他实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是早期癌症。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是转移性癌症。被治疗的癌症可以是实体癌或非实体癌(例如，白血病)。
在某些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、乳腺癌、结肠直肠癌(例如结肠癌)、膀胱癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、儿童横纹肌肉瘤或肺癌(例如，非小细胞肺癌)。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌或卵巢癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肺癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是结肠直肠癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是结肠癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是黑色素瘤。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是胰腺癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是乳腺癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是卵巢癌。
根据本文所述的方法治疗的对象可以是人或非人类动物(如哺乳动物)。在优选的实施方案中，对象是人。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段静脉内、腹膜内、肌内、皮下或肿瘤内施用。在其他实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段口服施用。
在某些实施方案中，还向根据本文所述的方法治疗的对象施用与所述抗体或片段或抗体-药物偶联物不同的另外的抗癌治疗(例如，疫苗、靶向治疗、化学治疗、放射治疗、手术或免疫治疗)。在一个实施方案中，另外的治疗是疫苗。在一个实施方案中，另外的治疗是靶向治疗。在一个实施方案中，另外的治疗是化学治疗(例如，吉西他滨、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇或吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合)。在一个实施方案中，另外的治疗是免疫治疗。在一个实施方案中，另外的治疗是放射治疗。在一个实施方案中，另外的治疗是手术(例如，去除正在治疗的癌性肿瘤的部分或全部)。在具体实施方案中，另外的治疗是一种或多种检查点抑制分子功能的抑制剂(例如，抑制剂，如针对以下一种或多种的抑制抗体：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、OX40和LAG-3)。在某些实施方案中，另外的治疗不是细胞周期抑制剂。在具体实施方案中，在使用所述抗体或片段治疗期间不向使用本文所述的方法治疗的对象施用细胞周期抑制剂。在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段在没有任何另外的抗癌治疗的情况下单独施用(例如，在使用所述抗体或片段治疗期间不向使用本文所述的方法治疗的对象施用另外的抗癌治疗)。
在某些实施方案中，向根据本文所述的方法治疗的对象进一步施用化学治疗，其中所述化学治疗是顺铂。在某些实施方案中，向根据本文所述的方法治疗的对象施用化学治疗，其中所述化学治疗是5-FU。在某些实施方案中，向根据本文所述的方法治疗的对象进一步施用化学治疗，其中所述化学治疗是紫杉醇。在某些实施方案中，向根据本文所述的方法治疗的对象进一步施用化学治疗，其中所述化学治疗是配制为白蛋白结合的颗粒的紫杉醇(例如，
Figure BDA0002426459430000251
)。在某些实施方案中，向根据本文所述的方法治疗的对象进一步施用化学治疗，其中化学治疗是吉西他滨(例如，其中所治疗的癌症是胰腺癌)。在某些实施方案中，向根据本文所述的方法治疗的对象进一步施用化学治疗，其中所述化学治疗是白蛋白结合型紫杉醇(例如，其中所治疗的癌症是胰腺癌)。在某些实施方案中，癌症是胰腺癌，并且向根据本文所述的方法治疗的对象进一步施用化学治疗，其中所述化学治疗是吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合。在某些实施方案中，吉西他滨和/或白蛋白结合型紫杉醇的施用剂量比当吉西他滨和/或白蛋白结合型紫杉醇未与抗癌抗体(如本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段)组合施用时的剂量更低。在某些实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以小于1,500mg/m2的剂量施用，和/或白蛋白结合型紫杉醇以小于300mg/m2的剂量施用。在一个实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以等于或小于1,000mg/m2的剂量施用和/或白蛋白结合型紫杉醇以等于或小于125mg/m2的剂量施用。在一个实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以等于或小于500mg/m2的剂量施用和/或白蛋白结合型紫杉醇以等于或小于62.5mg/m2的剂量施用。在某些实施方案中，吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合以每2周或更短的频率施用。
在某些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象对其他癌症治疗(例如，疫苗、靶向治疗、化学治疗、放射治疗、手术或免疫治疗)有抗性。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象对化学治疗有抗性。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象具有化学治疗抗性卵巢癌。在其他实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象对一种或多种抑制性免疫检查点分子的抑制剂有抗性。在其他实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象对放射治疗有抗性。
在具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体或片段在SEQID NO:4的氨基酸19至50内特异性结合。在另一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸154至167内特异性结合。在又一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸1至60内特异性结合。在又一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在SEQID NO:4的氨基酸1至100内特异性结合。在又一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在SEQ ID NO:的4氨基酸1至109内特异性结合。在另一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在SEQ ID NO:4的氨基酸26至60内特异性结合。在一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在癌细胞的质膜上的HDM2的C端的末端60个氨基酸内特异性结合。在另一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在癌细胞的质膜上的HDM2的C端的末端100个氨基酸内特异性结合。在一个具体实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体在SEQID NO:4的氨基酸101至200内特异性结合。
在特定的实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体或片段与小鼠抗HDM2抗体OP145(本文所述，参见例如表10)竞争结合于M(H)DM2/4。在其他特定的实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体或片段与小鼠抗HDM2抗体965(SMP14)(本文所述，参见例如表3和10)竞争结合于M(H)DM2/4。在又其他特定的实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体或片段与兔抗HDM2抗体sc-813(N-20)(本文所述，参见例如表10)竞争结合于M(H)DM2/4。在另一个实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体或片段与兔抗HDM2抗体sc-812(C-18)(本文所述，参见例如表10)竞争结合于M(H)DM2/4。在另一个实施方案中，在本文所述的方法中使用的抗M(H)DM2/4抗体或片段与小鼠抗HDM2抗体M01克隆1A7(本文所述，参见例如表3)竞争结合于M(H)DM2/4。
在某些方面，本文提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症或预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体(如特异性结合于所述癌细胞表面上的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体)，其中所述抗体包括介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的人IgG Fc区和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在这些实施方案的一些中，本文使用的抗HDM2抗体或片段所靶向的HDM2的细胞外区域在HDM2的以下氨基酸区域之一内：SEQ ID NO:1的氨基酸(其为SEQ ID NO:4的氨基酸1至15)、SEQ ID NO:2的氨基酸(其为SEQ ID NO:4的氨基酸15至25)、SEQ ID NO:3的氨基酸(其为SEQ ID NO:4的氨基酸475至491)、SEQ ID NO:4的氨基酸19至50、SEQ ID NO:4的氨基酸50至60、SEQ IDNO:4的氨基酸100至110、SEQ ID NO:4的氨基酸154至167、SEQ ID NO:4的氨基酸1至60或癌细胞的质膜上的HDM2的C端的末端60个氨基酸。在该段中描述的方法的特定实施方案中，癌症是白血病、肺癌、结肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌或卵巢癌。
一方面，本文提供了诊断对象(例如，人)中的癌症的方法，所述方法包括：(a)检测特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的抗体或其片段(例如，标记的抗体或片段)是否结合于对象的完整细胞的表面，其中所述抗体或片段是本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段(在优选的实例中，其中所述抗体或片段是特异性结合于SEQ ID NO”1、SED ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段)；和(b)如果在步骤(a)中检测到结合，诊断所述对象患有癌症。在一个实施方案中，诊断方法是离体方法。在一个实施方案中，诊断方法还包括在步骤(a)之前从对象获得完整细胞。在一个实施方案中，诊断方法包括在步骤(a)中的检测之前向所述对象施用所述抗体或片段，并且其中所述检测通过所述对象的体内成像来进行。
5.1术语
如本文所使用，术语“HDM2”是指UniProt登录号Q00987的人E3泛素-蛋白连接酶(SEQ ID NO:4)(即，全长HDM2蛋白)或本领域已知或本文所述的全长HDM2蛋白的任何剪接变体的蛋白产物。全长HDM2蛋白的示例性剪接变体的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。
如本文所使用，术语“MDM2”是指UniProt登录号P23804的小鼠E3泛素-蛋白连接酶(SEQ ID NO:5)(即，全长MDM2蛋白)或本领域已知或本文所述的全长MDM2蛋白的任何剪接变体的蛋白产物。
如本文所使用，术语“M(H)DM2”是指HDM2、MDM2或作为HDM2或MDM2的同源物的来自除人和小鼠以外的物种的E3泛素-蛋白连接酶。
如本文所使用，术语“HDM4”是指UniProt登录号O15151的人蛋白(SEQ ID NO:6)(即，全长HDM4蛋白)或本领域已知或本文所述的全长HDM4蛋白的任何剪接变体的蛋白产物。
如本文所使用，术语“MDM4”是指UniProt登录号O35618的小鼠蛋白(即，全长MDM4蛋白)或本领域已知或本文所述的全长MDM4蛋白的任何剪接变体的蛋白产物。全长MDM4蛋白的示例性的剪接变体的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:6。本领域已知的全长MDM4蛋白的其他剪接变体包括但不限于MDM4-S、MDM4-A、MDM4-G、MDM4-XALT1/XALT2和MDM4-211。
如本文所使用，术语“M(H)DM4”是指HDM4(也称为HDMX)、MDM4(也称为MDMX)或作为HDM4或MDM4的同源物的来自除人和小鼠以外的物种的蛋白。
如本文所使用，术语“M(H)DM2/4”是指HDM2，MDM2，HDM4，MDM4或作为HDM2、MDM2、HDM4或MDM4的同源物的来自除人和小鼠以外的物种的蛋白。
如本文所使用，术语“约”在用于修饰数值时表示高于或低于该数值最高达10％的偏差保持在所述值的预期含义内。
如本文所使用，关于细胞的术语“完整的”是指存活或固定但未透化的细胞。
如本文所使用，关于M(H)DM2/4的表位的术语“细胞外可接近的”是指M(H)DM2/4的表位，当M(H)DM2/4由完整细胞表达时，该表位可用于与细胞外抗体结合(不需要抗体的细胞内转运)。当抗体在细胞外时结合于由完整细胞表达的M(H)DM2/4时，可以确定抗体或其片段结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位。
如本文所使用，术语“VL”是指抗体的轻链可变区。
如本文所使用，术语“VH”是指抗体的重链可变区。
如本文所使用，关于参考多肽序列的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“序列同一性百分比”定义为在比对序列并引入空位以在需要时实现最大序列同一性百分比后，与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域已知的各种方式实现，例如，使用公众可用的计算机软件如BLASTp、BLAST-2、ALIGN(例如，ALIGN-2)或Megalign(DNASTAR)软件。
6.附图简述
图1A-D显示在肽-ELISA实验中分别特异性结合于NMC-P1(SEQ ID NO:1)、NMC-P2(SEQ ID NO:2)和NMC-P3(SEQ ID NO:3)肽抗原的单克隆抗体NMC-103、NMC-204和NMC-303。(A)NMC-103结合于NMC-P1肽，而NMC-204未显示结合于NMC-P1。(B)NMC-204结合于NMC-P2肽，而NMC-103不结合于NMC-P2。(C)NMC-303结合于NMC-P3肽，而NMC-204不结合于NMC-P3。(D)当NMC-103结合于NMC-P1时，在板上用NMC-103预孵育NMC-P1肽消除NMC-103与NMC-P1肽的结合。相反，用NMC-P2或NMC-P3预孵育NMC-103不影响NMC-103与NMC-P1的结合。
图2显示单克隆抗体NMC-103、NMC-204、NMC-303结合于HDM2重组蛋白。
图3A-B显示单克隆抗体NMC-103结合于完整人(A)和鼠(B)癌细胞上的HDM2的细胞外可接近的表位。
图4A-B显示单克隆抗体NMC-204结合于完整人(A)和鼠(B)癌细胞上的HDM2的细胞外可接近的表位。
图5A-B显示单克隆抗体NMC-303结合于完整人(A)和鼠(B)癌细胞上的HDM2的细胞外可接近的表位。
图6显示单克隆抗体NMC-204结合于完整人癌细胞上的HDM2的细胞外可接近的表位，但不结合于完整正常人外周血单核细胞。
图7A-B描绘了单克隆抗体NMC-103(A)和NMC-204(B)与完整MIA PaCa-2细胞结合的结合曲线。
图8A-C显示单克隆抗体NMC-103与其完整人胰腺癌MIA PaCa-2细胞质膜上的HDM2的细胞外可接近的表位的结合被NMC-P1肽竞争(A)，单克隆抗体NMC-204与其完整人胰腺癌MIA PaCa-2细胞质膜上的HDM2的细胞外可接近的表位的结合被NMC-P2肽竞争(B)，并且单克隆抗体NMC-303与其完整人胰腺癌MIA PaCa-2细胞质膜上的HDM2的细胞外可接近的表位的结合被NMC-P3肽竞争(C)。
图9显示单克隆抗体NMC-103与其完整人类胰腺癌MIA PaCa-2细胞质膜上的HDM2的细胞外可接近的表位的结合被全长重组HDM2蛋白竞争。
图10显示了单克隆抗体NMC-103、单克隆抗体NMC-204、针对E-钙粘素的抗体和针对细胞色素C的抗体对完整人胰腺MiaPaCa-2细胞的细胞-ELISA结合结果。
图11A-C表示分别用单克隆抗体NMC-103(A)、NMC-204(B)和抗Na+/K+ATP酶α-1(C)染色的细胞百分比的流式细胞术数据。
图12A-D显示单克隆抗体NMC-103(A和D)和NMC-204(B和D)，而不是抗细胞色素C抗体(C和D)，抑制完整人胰腺MIAPaCa-2细胞的细胞增殖。
图13A-C显示与在任何抗体不存在的情况下(A)用正常人血清处理的细胞相比，单克隆抗体NMC-103(B和C)在正常人血清的存在下诱导针对人胰腺MIAPaCa-2细胞的补体介导的细胞毒性。
图14A-B显示许多市售单克隆抗体与NMC-P1(A)或NMC-P2(B)缺乏结合。
图15A-B显示称为“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”(Abnova，目录号H00004193-M01)的抗HDM2抗体与完整癌细胞(A)反应，但称为“抗MDM2(Ab-4)小鼠mAb(2A9C1.18)”(EMDMillipore，目录号OP144)的抗HDM2抗体和称为“抗MDM2(Ab-1)小鼠mAb(IF2)”(EMDMillipore，目录号OP46)的抗HDM2抗体不与完整癌细胞(B)反应。
图16描绘了单克隆抗体NMC-204对肺癌的LL/2同基因小鼠模型的肿瘤体积的影响。
图17A-B描绘了单克隆抗体NMC-103对结肠癌的MC-38同基因小鼠模型的肿瘤体积(A)和肿瘤细胞增殖(B)的影响。
图18A-B描绘了单克隆抗体NMC-204对结肠癌的MC-38同基因小鼠模型的肿瘤体积(A)和肿瘤细胞增殖(B)的影响。
图19描绘了单独的单克隆抗体NMC-103(2mg/kg)，低剂量吉西他滨(25mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)的组合，低剂量吉西他滨(25mg/kg)、白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)和NMC-103(2mg/kg)的组合，以及同种型对照小鼠IgG1(2mg/kg)分别对胰腺癌的Panc-2同基因小鼠模型的肿瘤体积的影响。当小鼠肿瘤达到约70mm3时开始处理。
图20分别描绘了单克隆抗体NMC-103的重链可变区和轻链可变区的DNA序列和蛋白序列。
图21分别描绘了单克隆抗体NMC-204的重链可变区和轻链可变区的DNA序列和蛋白序列。
图22分别描绘了单克隆抗体NMC-303的重链可变区和轻链可变区的DNA序列和蛋白序列。重链可变区和轻链可变区的DNA和蛋白序列之前的前导序列以粗体显示(但未加下划线)。
图23显示了用称为“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”(Abnova，目录号H00004193-M01)的抗HDM2抗体处理的小鼠的肿瘤尺寸，用NMC-103处理的小鼠的肿瘤尺寸，用NMC-204处理的小鼠的肿瘤尺寸，和用同种型对照处理的小鼠的肿瘤尺寸。
图24A-F.抗HDM2特异性抗体会使癌细胞表面染色，但不会使正常细胞表面染色。用EDTA或胰蛋白酶释放的完整细胞用5％人血清白蛋白封闭。然后用多克隆N-20M(H)DM2特异性抗体(sc-813，N-20，兔IgG；来自Santa Cruz；“N-20”)或单克隆M(H)DM2特异性OP145抗体(OP145，小鼠IgG1；来自Calbiochem；“OP145”)在冰上孵育细胞90min。将在相同条件下制备的另一组细胞用相同的抗体孵育，该抗体在与细胞一起孵育之前用相应的封闭肽预孵育。一抗孵育后，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，然后FITC二抗孵育60min。然后用PBS洗涤细胞3次，并用FACS分析仪处理。人黑色素瘤细胞(24A、24B和24C)、原发性人卵巢癌细胞(24D和24E)和正常小鼠脾细胞(24F)。图24A：曲线下面积1号表示仅用山羊抗兔二抗孵育的细胞；曲线下面积2号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的细胞，所述抗HDM2多克隆抗体N-20用其封闭肽预孵育；曲线下面积3号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的细胞。图24B：曲线下面积1号表示仅用山羊抗小鼠二抗孵育的细胞；曲线下面积2号表示用抗HDM2单克隆抗体OP145孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的细胞，所述抗HDM2单克隆抗体OP145用其封闭肽预孵育；曲线下面积3号表示用抗HDM2单克隆抗体OP145孵育，接着用山羊抗小鼠二抗孵育的细胞。图24C：曲线下面积1号表示仅用山羊抗兔二抗孵育的细胞；曲线下面积2号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的胰蛋白酶释放的细胞；曲线下面积3号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的EDTA释放的细胞，所述抗HDM2多克隆抗体N-20用其封闭肽预孵育；曲线下面积4号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的EDTA释放的细胞。图24D和E：曲线下面积1号表示仅用山羊抗兔二抗孵育的细胞；曲线下面积2号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的细胞，所述抗HDM2多克隆抗体N-20用其封闭肽预孵育；曲线下面积3号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的细胞。图24F：曲线下面积1号表示仅用山羊抗兔二抗孵育的细胞；曲线下面积2号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的胰蛋白酶释放的细胞；曲线下面积3号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的EDTA释放的细胞，所述抗HDM2多克隆抗体N-20用其封闭肽预孵育；曲线下面积4号表示用抗HDM2多克隆抗体N-20孵育，接着用山羊抗兔二抗孵育的EDTA释放的细胞。
图25A-C.(A)用单独的正常人血清(NHS)、NHS+抗HDM2 OP145单克隆抗体(小鼠IgG1，来自Calbiochem，“OP145”)或对照抗体(NHS+细胞色素C)处理的人胰腺或卵巢癌细胞和正常人纤维母细胞。当在NHS存在下用OP145抗体处理癌细胞时，观察到碘化丙啶(PI)染色显示的广泛的细胞死亡(参见图b和e)，而相同的抗体对正常人纤维母细胞的存活没有影响(参见图g)。细胞色素C的对照抗体没有显示出超出在未处理的细胞中(参见图a)观察到的细胞毒性(参见图c)。在图a、c、d、f和g中没有或只有很少的PI染色表明缺少细胞死亡。使用在Olympus IX81倒置显微镜上构建的Olympus FluoView FV1000共聚焦激光扫描生物学显微镜可以使细胞死亡标志物PI可视化。(B)用抗HDM2抗体和对照细胞色素C抗体处理啮齿动物胰腺癌细胞。当使用抗HDM2抗体N-20(多克隆，sc-813N-20，兔IgG，来自Santa Cruz，“N-20”)或C-18(多克隆，sc-812C-18，兔IgG；来自Santa Cruz；“C-18”)处理细胞时，观察到碘化丙啶(PI)染色显示的广泛的细胞死亡(参见图b和e)，而当使用抗HDM2单克隆OP46抗体(OP46(Ab-1)；小鼠IgG1；来自Calbiochem；“OP46”)处理细胞时未观察到细胞毒性(参见图e)。(C)在NHS存在下，M(H)DM2特异性抗体对胰腺癌MiaPaCa-2细胞具有细胞毒性。针对人胰腺癌细胞的M(H)DM2特异性抗体依赖性补体细胞毒性的定量示意图。在NHS存在下用抗M(H)DM2(C-18)抗体处理的细胞在处理后15-30min内显示出细胞毒性，而抗HDM2 OP46显示细胞毒性作用未超过使用对照抗细胞色素C抗体处理细胞时或在抗M(H)DM2抗体不存在时使用NHS处理细胞时所观察到的细胞毒性作用。
图26显示用抗HDM2抗体OP145处理的小鼠的肿瘤尺寸，和用PBS对照处理的小鼠的肿瘤尺寸(在胰腺癌的Panc02同基因小鼠模型中)。x轴显示肿瘤细胞注入小鼠后的天数。y轴显示以mm3为单位的肿瘤体积。箭头显示开始处理的日期。
图27描绘了单独的单克隆抗体NMC-103(10mg/kg)，低剂量吉西他滨(25mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)的组合，低剂量吉西他滨(25mg/kg)、白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)和NMC-103(10mg/kg)的组合，和同种型对照小鼠IgG1(10mg/kg)分别对胰腺癌的Panc-2同基因小鼠模型的肿瘤体积的影响(每组小鼠数＝8)。当小鼠肿瘤达到约80-100mm3时，开始该研究中的处理。
图28描绘了Kaplan Meier生存分析，其显示当在图27中描述的实验条件下与单独的化学治疗或对照抗体相比，接受单独的或与化学治疗组合的NMC-103的小鼠的生存益处。
图29显示了先前如图27所述用NMC-103处理的小鼠在停药后变得对肿瘤再刺激免疫。为了评价NMC-103的长期抗肿瘤作用，在研究开始后的第62天，对之前接受G+nP的组合的小鼠、C组小鼠(之前用NMC-103处理的小鼠)和D组小鼠(之前用NMC-103+G+nP的组合处理的小鼠)通过在左背侧上进行第二轮Panc-2接种(皮下注射2x106个细胞/小鼠)再刺激。监测肿瘤生长10天，此时在来自B组的小鼠中测量到90mm3的肿瘤。在先前已接受NMC-103抗体的两组(C组和D组)小鼠中未观察到肿瘤。
图30描绘了在大尺寸肿瘤(即晚期癌症)的治疗中，当单剂量的单克隆抗体NMC-103(10mg/kg)或同种型对照小鼠IgG1(10mg/kg)加入到低剂量吉西他滨(25mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)的组合的治疗方案中时，对胰腺癌的Panc-2同基因小鼠模型的肿瘤体积的影响。用胰腺癌标准治疗(吉西他滨(25mg/kg)+白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg))处理小鼠19天，此时它们达到约450mm3的肿瘤尺寸。然后将小鼠随机分为两组，分别接受单剂量的同种型对照小鼠同种型对照小鼠IgG1(10mg/kg)或NMC-103(10mg/kg)。如该图所示，单次i.p.注射NMC-103在治疗后6天使肿瘤尺寸几乎降低一半(从438mm3到233mm3)。
图31描绘了单克隆抗体NMC-103对结肠癌的MC-38同基因小鼠模型的肿瘤体积的影响。如该图所示，用10mg/kg的NMC-103，每周2次，持续2周处理的小鼠的平均肿瘤尺寸为210mm3，而用10mg/kg的同种型对照抗体处理的组中的小鼠生长迅速，到第12天时达到1168mm3。与用0.4mg/kg的NMC-103处理的小鼠相比(图17)，这些数据支持NMC-103抗体的剂量依赖性抗肿瘤作用。
图32A和32B描绘了单克隆抗体NMC-303的嵌合形式的作用。在小鼠NMC-303上进行同种型类别转换，以使其从小鼠IgM转化为嵌合IgG1。将小鼠重链和轻链可变区克隆到人Igγ-1链和人Igκ链作为恒定区。总共八(8)只BALB/c小鼠皮下注射CT-26。然后将小鼠分为两组(n＝4)，接受：A)对照抗体(10mg/kg)，B)NMC-303抗体的嵌合形式(10mg/kg)，每周两次，持续3周。图32A显示，在肿瘤接种后第24天，用NMC-303的嵌合形式(10mg/kg)处理的小鼠的平均肿瘤尺寸达到726mm3，而用对照抗体(10mg/kg)处理的小鼠的平均肿瘤尺寸为1746mm3。此外，图32B显示了肿瘤接种后第24天的单个小鼠肿瘤尺寸。
7.具体实施方式
本文提供了特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，细胞外可接近的表位包含在SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3内。本文提供的抗体在以下第5.1节中描述。本文还提供了抗体-药物偶联物，其包含(例如，共价)结合于细胞毒性药物的本文所述的特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或片段。本文还提供了特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。
本文还提供了药物组合物，其包含本文所述的特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或片段。在某些实施方案中，这样的药物组合物包含治疗有效量的这样的抗体或片段(即，例如通过实现本文所述的一种或多种抗肿瘤作用，可以用于治疗对象中的癌症的量)。
本文还提供了编码本文所述的抗体和抗原结合片段的核酸。在某些实施方案中，本文提供了包含编码这样的抗体或其抗原结合片段的核酸的载体和细胞。还提供了重组产生本文所述的抗体或其抗原结合片段的细胞。
嵌合抗原受体(CAR)是提供抗原结合和免疫细胞激活功能二者的工程化受体(Sadelain等人,2013,Cancer Discovery 3:388-398)。本文还提供了CAR，其包含特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的单链可变片段(scFv)，如包含本文所述的抗M(H)DM2/4抗体的所述VH和VL的scFv，其通过接头融合到(例如，CD3ζ的)跨膜结构域，融合到细胞内T细胞激活结构域如CD3ζ细胞内结构域，任选地还融合到共刺激结构域(例如，CD28细胞内结构域)。还提供了表达这样的CAR的T细胞。
本文还提供了肽，其氨基酸序列为MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)。肽可以是例如合成的或重组的。在一些实施方案中，肽是纯化的。在一些实施方案中，用可检测的标志物(例如，荧光标志物或同位素)标记肽。在一些实施方案中，(例如，用GST、His、Strep、myc、FLAG或HA标签)标记肽。在一些实施方案中，在肽的末端之一处添加半胱氨酸(这可以允许连接到载体蛋白)。在一些实施方案中，肽连接到载体蛋白(例如，连接到钥孔戚血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、破伤风类毒素或白喉类毒素)。本文还提供了编码本文所述的肽的核酸。本文还提供了包含编码本文所述的肽的核酸的载体和细胞。还提供了重组产生本文所述的肽的细胞。本文还提供了本文所述的肽作为免疫原的用途。本文所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的肽包含MDM2和HDM2的细胞外可接近的表位。特别地，本文提供了通过用本文所述的肽免疫动物(例如，小鼠或兔)制备抗M(H)DM2/4抗体(例如，特异性结合于M(H)DM2/4的抗体)的方法。本文还提供了筛选结合于本文所述的肽中的一种或多种的抗体的方法(例如，使用具有板结合肽的ELISA)。本文还提供了确定适用于在治疗癌症或预防转移中的治疗用途或适用于在癌症诊断中的用途的抗M(H)DM2/4抗体的方法，所述方法通过以下进行：使抗M(H)DM2/4抗体与本文所述的肽在适用于抗体和肽之间的结合的条件下接触，和检测或测量抗体和肽之间发生的结合，其中抗体和肽之间的结合的检测适用于治疗或诊断用途。例如，本文提供了确定适用于治疗用途的抗M(H)DM2/4抗体的方法，所述方法通过以下进行：使抗M(H)DM2/4抗体与本文所述的肽在适用于抗体和肽之间的结合的条件下接触，和检测或测量抗体和肽之间发生的结合，并且如果检测到抗体和肽之间的结合，则在本文所述的治疗癌症的方法中使用该抗体。在另一个实例中，本文提供了确定适用于诊断用途的抗M(H)DM2/4抗体的方法，所述方法通过以下进行：使抗M(H)DM2/4抗体与本文所述的肽在适用于抗体和肽之间的结合的条件下接触，和检测或测量抗体和肽之间发生的结合，并且如果检测到抗体和肽之间的结合，则在本文所述的诊断癌症的方法中使用该抗体。
本文还提供了通过向所述对象施用本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段，特别是特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位(特别地，暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)的抗体或其片段，用于在对象中治疗癌症，抑制肿瘤生长或增殖，抑制肿瘤进展，和/或预防转移的方法。优选地，抗体或其片段特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位(特别地，暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)。在某些实施方案中，抗体或片段(例如，用于本文所述的方法)不结合于或仅最低限度地结合于对象中的癌症所起源的组织类型的正常细胞的质膜表面。
当所治疗的对象是人时，在某些实施方案中，本文使用的抗体或其片段特异性结合于HDM2和/或HDM4的细胞外可接近的表位(暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)。在治疗人的一个实施方案中，本文使用的抗体或其片段特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位(暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)(任选地，不结合于HDM4的这样的抗体或片段)。在治疗人的一个实施方案中，本文使用的抗体或其片段特异性结合于HDM4的细胞外可接近的表位(暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)(任选地，不结合于HDM2的这样的抗体或片段)。
当对象是非人类动物(例如哺乳动物，如狗或猫)时，本文使用的抗体或其片段结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位(暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)，其中M(H)DM2/4是在这样的动物中表达的HDM2和/或HDM4的同源物。在一个实施方案中，本文使用的抗体或其片段结合于M(H)DM2的细胞外可接近的表位(暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)，其中M(H)DM2是在这样的动物中表达的HDM2的同源物(任选地，这样的抗体或片段不结合于M(H)DM4)。在一个实施方案中，本文使用的抗体或其片段结合于M(H)DM4的细胞外可接近的表位(暴露在癌细胞的质膜表面上的区域)，其中M(H)DM4是在这样的动物中表达的HDM4的同源物(任选地，这样的抗体或片段不结合于M(H)DM2)。
以下对本发明的描述主要针对HDM2及其抗体和抗体片段，应理解其为用于治疗人的用途；本领域技术人员将清楚的是，该描述也应被认为适用于：(i)HDM4及其抗体和抗体片段，及其用于治疗人的用途(除非另外明确指出或通过上下文指出)，和(ii)M(H)DM2/4及其抗体和抗体片段，及其用于治疗非人类动物例如哺乳动物的用途(除非另外明确指出或通过上下文指出)。在优选的实施方案中，使用本文所述方法治疗的患者或对象是人。
在优选的实施方案中，根据本文所述的方法使用的抗HDM2抗体或其片段介导补体依赖性细胞毒性(CDC)，介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，和/或结合于一种或多种细胞毒性药物(例如抗体-药物偶联物)。在优选的实施方案中，本发明提供了介导补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体的用途。
在某些实施方案中，根据本文所述的方法使用的抗HDM2抗体或其片段不结合于细胞穿透肽。细胞穿透肽可以插入细胞质膜并将其连接的分子转运到细胞中。这样的细胞穿透肽包括但不限于膜驻留肽(MRP)、触角足的膜转导结构域、反式激活转录激活剂(TAT)和穿透素肽。在某些实施方案中，根据本文所述的方法使用的抗HDM2抗体或其片段不连接于膜驻留肽(MRP)、触角的膜转导结构域、TAT和/或穿透素肽。在某些实施方案中，根据本文所述的方法使用的抗HDM2抗体或其片段不连接于可插入细胞质膜的脂质双层中的任何肽序列。在一个实施方案中，根据本文所述的方法使用的抗HDM2抗体或其片段不连接于MRP。在一个实施方案中，根据本文所述的方法使用的抗HDM2抗体或其片段不连接于穿透素肽。
本文阐述的实例显示单独的靶向HDM-2的抗体对癌细胞具有选择性细胞毒性。此外，如本文的实例中所述，已经显示HDM2的细胞外可接近的表位是抗HDM2抗体的合适的治疗靶标，并且在其表面上表达HDM2的癌细胞可以成功地被针对HDM2的这样的细胞外区域的抗体靶向和破坏。特别地，实例中提供的数据显示，选择的HDM2特异性抗体可以结合于完整癌细胞表面膜上的HDM2的细胞外可接近的序列，而显示与正常人血液单核细胞的表面膜结合最低限度的结合。另外，实例中提供的数据表明，这样的HDM2特异性抗体可以在体外和体内抑制癌细胞的生长，强烈表明它们可以在体内用作治疗剂。此外，实例中提供的数据表明，当与化学治疗药物组合时，这样的HDM2特异性抗体可具有协同的抗肿瘤作用。
7.1抗体
本文提供了(免疫)特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位(暴露在细胞的质膜表面上的区域)的抗体或其抗原结合片段。如本文所使用的那些术语“特异性结合(bind)/结合(binding)”不排除抗体或抗原结合片段的交叉反应性；因此，例如，(免疫)特异性结合于暴露在细胞的质膜表面上的HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其抗原结合片段也可以特异性结合于MDM2(与其交叉反应)。特别地，本文提供了抗M(H)DM2/4抗体及其片段，其(免疫)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，并且具有抗肿瘤作用(例如抑制体内肿瘤生长)。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合M(H)DM2/4的表位，其在癌细胞上是细胞外可接近的，但在非癌细胞(例如，与癌细胞相同的器官类型或组织类型的非癌细胞)上不是细胞外可接近的。在其他具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合M(H)DM2/4的表位，相对于其在非癌细胞(例如，宿主的器官或组织的非癌细胞)的质膜表面上的暴露或可接近性，其在癌细胞的质膜表面上的暴露或可接近性增加。本文还提供了(免疫)特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位的抗体或其抗原结合片段，其不结合于细胞穿透肽(例如，膜驻留肽)。
本文还提供了(免疫)特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)，特别是M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。在某些实施方案中，本文提供了(免疫)特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)，特别是M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ IDNO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成；并且其中这样的抗体或片段具有体内抗肿瘤作用，和/或其中这样的抗体或片段不结合于细胞穿透肽。
本文还提供了具有本文所述的重链可变区和/或轻链可变区的抗M(H)DM2/4抗体和片段(参见例如，具有本文提供的抗体NMC-103、NMC-204和NMC-303的重链可变区和/或轻链可变区的序列，参见例如第8节和图20-22)。本文还提供了具有一个或多个本文所述的互补决定区(CDR)的抗M(H)DM2/4抗体和片段(参见例如表4-9和图20-22中提供的CDR)。
CDR以本领域中的各种方式定义，包括Kabat、Chothia、AbM、Contact和IMGT。在某些方面，抗体的CDR可以根据基于序列变异性的Kabat系统来定义(参见例如参见例如，Kabat EA&Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391；Kabat EA等人,(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)。在具体实施方案中，就Kabat系统而言，(i)所述VH CDR1存在于重链的第31至35位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于重链的第50至68或50至66位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于重链的第101至105或99至104或99至106位氨基酸。在具体实施方案中，就Kabat系统而言，(i)所述VL CDR1存在于轻链的第24至39或24至34位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于轻链的第55至61或50至56位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于轻链的第94至102或89至97位氨基酸。如本领域技术人员所公知的，就Kabat系统而言，由于框架区(FR)和/或CDR的变短或变长，抗体可变结构域的实际线性氨基酸序列可以包含更少或另外的氨基酸，因此，氨基酸的Kabat数不一定与其线性氨基酸数相同。Kabat CDR位置可以根据抗体而变化，并且可以根据本领域已知的方法确定。在一个具体的实施方案中，使用Kabat系统确定本文所述抗体的CDR。在具体实施方案中，使用Kabat系统确定本文所述的抗体的CDR。
在某些方面，抗体的CDR可以根据基于免疫球蛋白结构环区域的位置的Chothia系统定义(参见例如，Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；和第7,709,226号美国专利)。术语“Chothia CDR”和类似术语在本领域中是公认的，并且是指根据Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917的方法确定的抗体CDR序列，其在本文中被称为“Chothia CDR”(也参见例如第7,709,226号美国专利和Martin,A.,“Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains”,Antibody Engineering,Kontermann和Dübel编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001))。在具体实施方案中，就Chothia系统而言，使用Kabat编号系统对所述VH区中的氨基酸残基进行编号，(i)所述VHCDR1存在于重链的第26至32位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于重链的第52至59或52至57位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于重链的第101至105或99至104或99至106位氨基酸。在具体实施方案中，就Chothia系统而言，使用Kabat编号系统对所述VL区中的氨基酸残基进行编号，(i)所述VL CDR1存在于轻链的第24至39或24至34位氨基酸；(ii)所述VL CDR2存在于轻链的第55至61或50至56位氨基酸；和(iii)所述VL CDR3存在于轻链的第94至102或89至97位氨基酸。Chothia CDR位置可以根据抗体而变化，并且可以根据本领域已知的方法确定。在具体实施方案中，使用Chothia系统确定本文所述的抗体的CDR。
在某些方面，抗体的CDR可以根据基于AbM高变区的AbM系统来定义，其表示KabatCDR和Chothia结构环之间的折衷，并且其中使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件确定CDR(Oxford Molecular Group,Inc.)。在具体实施方案中，就AbM系统而言，使用Kabat编号系统对所述VH区中的氨基酸残基进行编号，(i)所述VH CDR1存在于重链的第26至35位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于重链的第50至61或50至59位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于重链的第101至105或99至104或99至106位氨基酸。在具体实施方案中，就AbM系统而言，使用Kabat编号系统对所述VL区中的氨基酸残基进行编号，(i)所述VL CDR1存在于轻链的第24至39或24至34位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于轻链的第55至61或50至56位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于轻链的第94至102或89至97位氨基酸。AbM CDR位置可以根据抗体而变化，并且可以根据本领域已知的方法确定。在具体实施方案中，使用AbM编号系统确定本文所述的抗体的CDR。
在某些方面，抗体的CDR可以根据基于IMGT系统来定义(参见
Figure BDA0002426459430000391
theinternational ImMunoGeneTics information
Figure BDA0002426459430000392
website imgt.org,创始人和主管:Marie-Paule Lefranc,Montpellier,France；参见例如，Lefranc,M.-P.,1999,TheImmunologist,7:132-136和Lefranc,M.-P.等人,1999,Nucleic Acids Res.,27:209-212，二者均通过引用整体并入本文)。在具体实施方案中，就IMGT系统而言，(i)所述VH CDR1存在于重链的第27至33或26至33位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于重链的第51至60或51至58位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于重链的第99至105或97至103位氨基酸。在具体实施方案中，就IMGT系统而言，(i)所述VLCDR1存在于轻链的第27至37位氨基酸；(ii)所述VHCDR2存在于轻链的第55至57位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于轻链的第94至102位氨基酸。IMGT CDR位置可以根据抗体而变化，并且可以根据本领域已知的方法确定。在具体实施方案中，使用IMGT系统确定本文所述的抗体的CDR。
在某些方面，抗体的CDR可以根据Contact系统来定义。Contact定义基于对可用的复杂晶体结构的分析(bioinf.org.uk/abs)(参见MacCallum RM等人,(1996)J Mol Biol5:732-745；还参见例如,Martin A.“Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains”,Antibody Engineering,Kontermann和Dübel编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001))。在具体实施方案中，就Contact系统而言，使用Kabat编号系统对所述VH区中的氨基酸残基进行编号，(i)所述VH CDR1存在于重链的第30至35位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于重链的第47至61或47至59位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于重链的第99至104或97至103或97至105位氨基酸。在具体实施方案中，就Contact系统而言，使用Kabat编号系统对所述VL区中的氨基酸残基进行编号，(i)所述VLCDR1存在于轻链的第30至41或30至36位氨基酸；(ii)所述VH CDR2存在于轻链的第51至60或46至55位氨基酸；和(iii)所述VH CDR3存在于轻链的第94至101或89至96位氨基酸。Contact CDR位置可以根据抗体而变化，并且可以根据本领域已知的方法确定。在具体实施方案中，使用Contact系统确定本文所述的抗体的CDR。
在具体实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)，并且包含本文所述的抗体中的任一种(抗体NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的CDR，所述CDR根据上述系统中的任一种定义。
在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有本文所述的任何抗HDM2抗体(如NMC-103、NMC-204或NMC-303)的一个、两个或所有三个VH CDR(优选地所有三个VH CDR)。如本领域中已知的，VH包含被框架区包围的VH CDR(CDR和FR序列按以下顺序出现在VH中：FR1-VH CDR 1-FR2-VH CDR 2-FR3-VH CDR 3-FR4)，任选地，框架区是人框架区。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有氨基酸序列为SEQ ID NO:36的VH(其为NMC-103的VH)的一个、两个或所有三个VH CDR。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位，并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有氨基酸序列为SEQ ID NO:38的VH(其为NMC-204的VH)的一个、两个或所有三个VHCDR。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有氨基酸序列为SEQ ID NO:40的VH(其为NMC-303的VH)的一个、两个或所有三个VH CDR。在某些实施方案中，这样的抗体或片段是人源化抗体或片段。
在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位并且包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有本文所述的任何抗HDM2抗体(如NMC-103、NMC-204或NMC-303)的一个、两个或所有三个VL CDR(优选地所有三个VL CDR)。如本领域中已知的，VL包含被框架区包围的VL CDR(CDR和FR序列按以下顺序出现在VL中：FR1-VL CDR 1-FR2-VL CDR 2-FR3-VL CDR 3-FR4)；任选地，框架区是人框架区。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位并且包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有氨基酸序列为SEQ ID NO:37的VL(其为NMC-103的VL)的一个、两个或所有三个VL CDR。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位并且包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有氨基酸序列为SEQ ID NO:39的VL(其为NMC-204的VL)的一个、两个或所有三个VL CDR。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位并且包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有氨基酸序列为SEQ ID NO:40的VL(其为NMC-303的VL)的一个、两个或所有三个VL CDR。在某些实施方案中，这样的抗体或片段是人源化抗体或片段。
在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的细胞外可接近的表位，并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有本文所述的任何抗HDM2抗体(如NMC-103、NMC-204或NMC-303)的一个、两个或所有三个VH CDR(优选地所有三个VH CDR)，以及包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有这样的抗HDM2抗体的一个、两个或所有三个VL CDR(优选地所有三个VL CDR)。
在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有表4(提供NMC-103的VH CDR)中确定的一个、两个或所有三个VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含表3中确定的VH CDR3(“CDR-H3”)。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有表5(提供NMC-103的VL CDR)中确定的一个、两个或所有三个VL CDR。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2，并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有表4中确定的一个、两个或所有三个VH CDR；以及包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有表5中确定的一个、两个或所有三个VL CDR。
在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有表6(提供NMC-204的VH CDR)中确定的一个、两个或所有三个VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含表6中确定的VH CDR3(“CDR-H3”)。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有表7(提供NMC-204的VL CDR)中确定的一个、两个或所有三个VL CDR。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2，并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有表6中确定的一个、两个或所有三个VH CDR；以及包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有表7中确定的一个、两个或所有三个VL CDR。
在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有表8(提供NMC-303的VH CDR)中确定的一个、两个或所有三个VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含表8中确定的VH CDR3(“CDR-H3”)。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2并且包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有表9(提供NMC-303的VL CDR)中确定的一个、两个或所有三个VL CDR。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于HDM2，并且包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有表8中确定的一个、两个或所有三个VH CDR；以及包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有表9中确定的一个、两个或所有三个VL CDR。
在某些实施方案中，本文提供了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含任何本文所述的抗体的VH，如第8节或图20-22提供的任何抗体的VH(例如，NMC-103的VH、NMC-204的VH或NMC-303的VH)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的VH。在某些实施方案中，本文提供了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含任何本文所述的抗体的VL，如第8节或图20-22提供的任何抗体的VL(例如，NMC-103的VL、NMC-204的VL或NMC-303的VL)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的VL。在某些实施方案中，这些序列中的取代、插入或缺失发生在CDR外部的区域(即，在FR中)。
在某些实施方案中，本文提供了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含本文所述的任何抗体的VH和VL，如第8节或图20-22提供的任何抗体的VH和VL(例如，NMC-103的VH和VL、NMC-204的VH和VL或NMC-303的VH和VL)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的VH和VL。
在某些实施方案中，本文提供了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含：(i)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性的VH；和/或(ii)具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性的VL。
在某些实施方案中，本文提供了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含：(i)具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性的VH；和/或(ii)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性的VL。
在某些实施方案中，本文提供了特异性结合于HDM2的抗体或其片段，其包含：(i)具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性的VH；和/或(ii)具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性的VL。
在某些方面，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的一个或多个Kabat VL CDR，和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的一个或多个Kabat VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的Kabat VH CDR 3。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的三个Kabat VL CDR和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的三个Kabat VH CDR。
在某些方面，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的一个或多个Chothia VL CDR，和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的一个或多个Chothia VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的Chothia VH CDR 3。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的三个Chothia VL CDR和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的三个Chothia VHCDR。
在某些方面，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的一个或多个AbM VL CDR，和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的一个或多个AbM VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的AbM VH CDR 3。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的三个AbM VL CDR和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的三个AbM VH CDR。
在某些方面，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的一个或多个Contact VL CDR，和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的一个或多个Contact VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的Contact VH CDR 3。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的三个Contact VL CDR和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的三个Contact VHCDR。
在某些方面，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的一个或多个IMGT VL CDR，和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的一个或多个IMGT VH CDR。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的IMGT VH CDR 3。在一个实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VL的三个IMGT VL CDR和/或本文所述的抗体中的任一种(NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的VH的三个IMGT VH CDR。
在某些实施方案中，本文提供了抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)并且包含Kabat CDR、Chothia CDR、AbM CDR、IMGT CDR和Contact CDR的组合(或由这些CDR定义系统中的任何两个、三个、四个或五个定义的CDR的组合)。
在具体实施方案中，沿着本文所述的抗体的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的一个或多个CDR的位置可以变化一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸位置，只要保持与M(H)DM2/4(例如，HDM2)的免疫特异性结合即可(例如，基本上保持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。例如，在一个实施方案中，可以通过将CDR的N端和/或C端边界移位一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸来改变定义本文所述的抗体中的任一种(抗体NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的CDR的位置，只要保持与M(H)DM2/4(例如，HDM2)的免疫特异性结合即可(例如，基本上保持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在另一个实施方案中，沿着本文所述的抗体的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的一个或多个CDR的长度可以变化(例如，变短或变长)一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸，只要保持与M(H)DM2/4(例如，HDM2)的免疫特异性结合即可(例如，基本上保持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。
在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，HDM2)抗体是人源化免疫球蛋白(例如，IgG)，其分别包含本文所述的抗体中的任一种(鼠抗体NMC-103、NMC-204和NMC-303中的任一种)的3个VH CDR和3个VL CDR(即，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3)，人或人源性框架区，和人或人源性恒定区；本发明还提供了这样的人源化抗体的抗原结合片段。人框架区的非限制性实例在本领域中有描述，例如，参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH期刊号91-3242。在某些实施方案中，人源化抗M(H)DM2/4(例如，HDM2)抗体或其抗原结合片段包含具有如本文所述的VH CDR1，VH CDR2和VHCDR3(例如，MNC-103、NMC-204或NMC-303的那些)的VH，其被VH框架区包围，所述VH框架区是人框架区或源自人框架区。在某些实施方案中，抗M(H)DM2/4(例如，HDM2)抗体或其抗原结合片段包含具有如本文所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如，MNC-103、NMC-204或NMC-303的那些)的VL，其被VL框架区包围，所述VL框架区是人框架区或源自人框架区。在某些实施方案中，抗M(H)DM2/4(例如，HDM2)抗体或其抗原结合片段包含(i)具有如本文所述的VHCDR1，VH CDR2和VH CDR3(例如，MNC-103、NMC-204或NMC-303的那些)的VH，其被VH框架区包围，所述VH框架区是人框架区或源自人框架区；和(ii)具有如本文所述的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如，MNC-103、NMC-204或NMC-303的那些)的VL，其被VL框架区包围，所述VL框架区是人框架区或源自人框架区。
可以使用的人框架区包括但不限于:(i)使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；(ii)源自轻链或重链可变区特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；(iii)人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和(iv)源自筛选FR文库的框架区(参见例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。人框架区的列表参见例如Chothia等人,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)。
在具体实施方案中，使用常规重组DNA技术，可以将本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，HDM2)或其抗原结合片段的CDR中的一种或多种插入到已知框架区内。框架区可以使天然存在的或共有的框架区，且优选人框架区。
在某些实施方案中，本文描述了包含框架区和CDR的组合的多核苷酸，其编码特异性结合M(H)DM2/4(例如，HDM2)的抗M(H)DM2/4(例如，HDM2)或其抗原结合片段。可以在框架区内进行一种或多种(例如，一种或两种或三种)氨基酸取代，优选地，可以进行改善抗体与M(H)DM2/4(例如，HDM2)的结合的一种或多种(例如，一种或两种或三种)氨基酸取代。
在其中抗体或其片段未被人源化的供选择的实施方案中，可变结构域中的框架区可以是天然(例如鼠)抗体的那些。
本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段(即具有抗原结合位点的分子)，其特异性结合于癌细胞的质膜表面上可接近的M(H)DM2/4的细胞外区域(表位)(例如，在癌细胞的质膜上表达或暴露的水平高于在非癌细胞上表达或暴露的水平的表位(例如，当这样的癌细胞和非癌细胞起源于相同组织时))。
在优选的实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体是单克隆抗体或其片段。本文所述的抗体和片段优选地是人的、人源化的或嵌合的。人抗体可以是人免疫球蛋白，其可以从人免疫球蛋白文库中分离或从表达来自人基因的抗体的小鼠或其他动物中分离。在一个实施方案中，本文提供的抗体是人抗体(或人抗体的片段)。在一个实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体(或人源化抗体的片段)。在一个实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体(或嵌合抗体的片段)(其中嵌合抗体是具有一个物种(例如鼠)的可变区和另一物种(例如人)的恒定区的抗体)。优选地，本文提供的抗体是人、人源化或嵌合单克隆抗体(其特别适用于治疗人对象)。在一个实施方案中，本文提供的抗体是合成抗体。在一个实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。在一个实施方案中，本文提供的抗体是单链抗体，例如，单链Fv(scFv)。在一个实施方案中，本文提供了抗M(H)DM2/4抗体的抗原结合片段，其中所述片段可以是但不限于Fv片段、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段或二硫键连接的Fv(sdFv)。在一个实施方案中，本文提供的抗原结合片段是Fv片段。在一个实施方案中，本文提供的抗原结合片段是Fab片段。在一个实施方案中，本文提供的抗原结合片段是F(ab′)2片段。在一个实施方案中，本文提供的抗原结合片段是F(ab′)片段。
在具体实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(如双特异性抗体)，其特异性结合于在癌细胞的质膜表面上暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位并且特异性结合于第二抗原，其中这样的结合允许效应细胞重新靶向肿瘤细胞(针对不同靶标的这样的工程化双特异性抗体的实例，请参见Chames等人,2009,MAbs 1:539-547，其描述了称为卡妥索单抗的抗体，该抗体为一种T细胞靶向剂)。在一个实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(如双特异性抗体)，其特异性结合于在癌细胞的质膜表面上暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，并且还结合于在效应细胞的质膜表面上暴露的抗原。效应细胞包括但不限于T细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和B淋巴细胞。在一个实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其特异性结合于在癌细胞的质膜表面上暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，并且还特异性结合于在T细胞(例如，细胞毒性T细胞)的表面上暴露的抗原。在一个实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其特异性结合于在癌细胞的质膜表面上暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，并且还特异性结合于CD3。在具体实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其特异性结合于在癌细胞的质膜表面上暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，并且还特异性结合于在自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和/或B-淋巴细胞的表面上暴露的抗原。在具体实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其特异性结合于在癌细胞的质膜表面上暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，并且还特异性结合于在嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞、和/或B-淋巴细胞的表面上暴露的抗原。在具体实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其特异性结合于在癌细胞的质膜表面上暴露的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位，并且还特异性结合于在自然杀伤细胞、巨噬细胞和/或树突细胞的表面上暴露的抗原。
在优选的实施方案中，其中治疗人对象，使用的抗体是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，例如在治疗非人类对象，例如猫、狗、牛以及其他驯养、农场和野生动物的情况下，抗体可以是适用于被治疗的物种的(即该物种的)抗体或片段。本文所述的抗体可以来自任何动物物种，例如哺乳动物(例如，小鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、狗、猫)或鸟(例如，鸡)。
在具体实施方案中，其中所述抗体是免疫球蛋白，可以使用的免疫球蛋白分子是免疫球蛋白分子的任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)或亚类。在优选的实施方案中，抗体是免疫球蛋白，并且特别是IgG。在另一个实施方案中，抗体是IgM。
在优选的实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段是介导补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或归因于与抗体或片段结合的细胞毒性药物的细胞毒性的抗体或片段。
在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段是能够诱导针对抗体或片段靶向的癌细胞的细胞毒性的这样的抗体或片段，其中所述细胞毒性可以归因于补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)引起或归因于与抗体结合的药物的细胞毒性(其中使用的抗体是抗体-药物偶联物的形式)。
在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段是介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体或片段。制备具有CDC功能的抗体的方法是本领域已知的。在其中期望CDC活性的一些实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)型或人IgM型。在其中期望CDC活性的一些实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是小鼠IgG(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)或小鼠IgM型。在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG1同种型。在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG3同种型。在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG2同种型。在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是生物工程化的(例如，突变的)以增加其CDC活性。在一个实施方案中，抗体或片段是特异性结合于M(H)DM2/4上的两个不同的细胞外表位的双特异性抗体或片段(其可以例如导致补体激活的放大、癌细胞表面膜上的片段沉积的增加(C3b、iC3b、C3d、C3g、C4b)和/或MAC对癌细胞的杀伤增强)。在另一个实施方案中，抗体或片段是特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外表位和特异性结合于补体调节蛋白(CRP)的细胞外表位的双特异性抗体或片段(其可以例如防止新沉积的免疫活性片段(C3b、iC3b、C3d、C3g、C4b)被CRP降解，放大补体级联的激活和/或放大MAC诱导的癌细胞裂解)。这样的双特异性抗M(H)DM2/4抗体或片段可以增加CDC活性，增加ADCC活性，增加嗜中性粒细胞和巨噬细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或增加CDC、ADCC和ADCP。
在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段是介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的抗体或片段。
制备具有ADCC功能的抗体的方法是本领域已知的。制备具有ADCP功能的抗体的方法是本领域已知的。通常，抗体的Fc区介导其与嗜中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞上的Fc受体FcR的结合，其导致ADCC以及在嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞上，从而导致ADCP。在其中期望ADCC和/或ADCP活性的一些实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3)型或人IgE型。在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG1同种型。
在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是生物工程化的(例如，通过交联、通过二硫键形成、通过寡糖添加或通过突变)以增加其ADCC和/或ADCP活性。在一个实施方案中，使本文所述的抗体的Fc区突变，以增加完整抗体的寿命(例如，根据Vaccaro等人,2005,Nat Biotechnol.23:1283-8128所述的方法，其公开内容通过引用并入本文)。在另一个实施方案中，可以使用Fc CH2和CH3结构域中的氨基酸取代以引导功效朝向ADCC/ADCP并远离CDC，或增加所有三种细胞毒性活性(即，ADCC、ADCP和CDC)的效率。在另一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区的CH2和/或CH3结构域在其糖基化位点处被修饰以去除/减少岩藻糖残基，以便于改善ADCC和/或ADCP功能(例如，根据例如Satoh等人,2006,Expert Opin BiolTher.6:1161-1173和/或Liu等人,2015,Ca Immunol Res.3:173-183所述的方法，其公开内容通过引用并入本文)。
在具体实施方案中，本文所述的具有IgG Fc区的抗M(H)DM2/4抗体在其Fc区被生物工程化以将其糖基化位点处的N-聚糖结构改变为以GlcNAc(N-乙酰氨基葡萄糖)封端且无岩藻糖和唾液酸残基的G0聚糖类型(其可以导致例如补体途径的经典途径和替代途径二者的激活，并增加与凝集素的结合，包括在炎症反应过程中分泌的甘露糖结合凝集素)。
在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG1同种型，并且在其CH2结构域的第333位具有丙氨酸取代。在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG1同种型，并且具有三重突变S239D/I332E/A330L(其导致对FcγRIIIa的亲和力更高，以及对FcγRIIb的亲和力更低，导致ADCC增强)(这样的Fc修饰可以例如根据Lazar等人,2006,PNAS103:4005-4010所述的方法进行)。在一个实施方案中，本文所述的抗体的Fc区是人IgG1同种型，并且具有三重突变S239D/I332E/G236A(其导致改善的FcγRIIIa亲和力和FcγRIIa/FcγRIIb比，其介导增强的巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用)(这样的Fc修饰可以例如根据Richards等人,2008,Mol.Cancer Ther.7:2517-27所述的方法进行)。
在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段是介导补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)二者的抗体或片段。在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段是介导补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的抗体或片段。在其他实施方案中，本文考虑的是仅介导CDC或仅介导ADCC活性的抗体或片段。本文所述的抗体的CDC和ADCC功能可以通过本领域已知的任何体外和/或体内细胞毒性分析进行测试。在某些实施方案中，本文使用的抗体或片段在Fc区中包含一种或多种氨基酸突变或取代，其改善其CDC或ADCC活性(例如，本文所述的或本领域已知的任何突变或取代(参见例如，Idusogie等人,2001.J Immunol.166(4):2571-5；Strohl,2009,Curr Opin Biotechnol.20(6):685-91；Lazar等人,2006,PNAS 103(11):4005–4010，其公开内容通过引用并入本文))。
在具体实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或片段是未偶联的，例如，未偶联到细胞毒性药物)。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段未结合(例如，未偶联)到药物(例如，细胞毒性药物)。在这些实施方案的一些中，抗M(H)DM2/4抗体或片段介导CDC和/或ADCC。
在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或其片段特异性结合于HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸1至15、15至25或475至491内的细胞外可接近的区段(即表位)。
在一个实施方案中，抗HDM2抗体或其片段在SEQ ID NO:1的氨基酸(其为HDM2(SEQID NO:4)的氨基酸1至15)内特异性结合于HDM2。SEQ ID NO:1的氨基酸(其为SEQ ID NO:4的氨基酸1至15)在HDM2的细胞外可接近的表位中。
在一个实施方案中，抗HDM2抗体或其片段在SEQ ID NO:2的氨基酸(其为HDM2(SEQID NO:4)的氨基酸15至25)内特异性结合于HDM2。SEQ ID NO:2的氨基酸(其为SEQ ID NO:4的氨基酸15至25)在HDM2的细胞外可接近的表位中。
在一个实施方案中，抗HDM2抗体或其片段在SEQ ID NO:3的氨基酸(其为HDM2(SEQID NO:4)的氨基酸475至491)内特异性结合于HDM2。SEQ ID NO:3的氨基酸(其为SEQ IDNO:4的氨基酸475至491)在HDM2的细胞外可接近的表位中。
在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或其片段在M(H)DM2/4(SEQ ID NO:4或SEQID NO:6)的氨基酸50至60内特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或其片段在M(H)DM2/4(SEQ ID NO:4或SEQID NO:6)的氨基酸100至110内特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或其片段在M(H)DM2/4(SEQ ID NO:4或SEQID NO:6)的氨基酸1至126内特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外表位。
在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或其片段在M(H)DM2/4(SEQ ID NO:4或SEQID NO:6)的氨基酸436至482内特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或其片段在M(H)DM2/4(例如，已知或预期在被治疗的癌症类型的细胞的质膜上表达的M(H)DM2/4蛋白变体(剪接变体)，或被确定为在被治疗的对象的癌细胞的质膜上表达的M(H)DM2/4蛋白变体(剪接变体))的C端的末端100个氨基酸内特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位。
本发明还提供了抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其与在SEQ ID NO:1的氨基酸序列内特异性结合于HDM2的抗体竞争结合于HDM2(例如，本文所述的NMC-103抗体，或具有NMC-103的VH(即，SEQ ID NO:36的VH)和NMC-103的VL(即，SEQ ID NO:37的VL)的任何抗体或片段，或具有NMC-103的VH和VL CDR的任何抗体或片段)。本发明还提供了抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其与在SEQ ID NO:2的氨基酸序列内特异性结合于HDM2的抗体竞争结合于HDM2(例如，本文所述的NMC-204抗体，或具有NMC-204的VH(即，SEQ ID NO:38的VH)和NMC-204的VL(即，SEQ ID NO:39的VL)的任何抗体或片段，或具有NMC204的VH和VL CDR的任何抗体或片段)。本发明还提供了抗M(H)DM2/4抗体或其片段，其与在SEQ ID NO:3的氨基酸序列内特异性结合于HDM2的抗体竞争结合于HDM2(例如，本文所述的NMC-303抗体，或具有NMC-303的VH(即，SEQ ID NO:40的VH)和NMC-303的VL(即，SEQ ID NO:41的VL)的任何抗体或片段，或具有NMC-303的VH和VL CDR的任何抗体或片段)。
本领域已知的任何竞争分析可用于确定与本文所述的抗体竞争结合于M(H)DM2/4的抗体(参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY))。在示例性竞争分析中，将固定化的M(H)DM2/4(例如，固定在微量滴定板或孔上)在溶液中孵育，所述溶液包含结合于M(H)DM2/4的第一标记抗体和与第一抗体竞争结合于M(H)DM2/4的能力将被测试的第二未标记抗体。作为对照，可以在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育固定化的M(H)DM2/4。孵育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定化的M(H)DM2/4相关的标记的量。相对于对照样品，测试样品中标记的量的大幅减少表明第二抗体与第一抗体竞争结合于M(H)DM2/4。
在具体实施方案中，与本文所述的抗体(例如，具有NMC-103、NMC-204或NMC-303的VH和VL的抗体)竞争结合于M(H)DM2/4的抗体也结合于被这样的抗体结合的源自M(H)DM2/4的相同的肽(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽)。在具体实施方案中，与本文所述的抗体(例如，具有NMC-103、NMC-204或NMC-303的VH和VL的抗体)竞争结合于M(H)DM2/4的抗体也结合于被这样的抗体结合的M(H)DM2/4中的相同的表位。
在一个实施方案中，抗M(H)DM2/4抗体或其片段与具有SEQ ID NO:36的VH和SEQID NO:37的VL的抗体或片段结合于M(H)DM2/4的相同的表位。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与具有SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:39的VL的抗体或片段结合于M(H)DM2/4的相同的表位。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与具有SEQ ID NO:40的VH和SEQ ID NO:41的VL的抗体或片段结合于M(H)DM2/4的相同的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸19至50内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸19至108内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸154至167内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸1至60内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸1至100内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸1至108内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段特异性在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸26至60内结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(例如，已知或预期在被治疗的癌症类型的细胞的质膜上表达的HDM2蛋白变体(剪接变体)，或被确定为在被治疗的对象的癌细胞的质膜上表达的HDM2蛋白变体(剪接变体))的C端的末端60个氨基酸内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(例如，已知或预期在被治疗的癌症类型的细胞的质膜上表达的HDM2蛋白变体(剪接变体)，或被确定为在被治疗的对象的癌细胞的质膜上表达的HDM2蛋白变体(剪接变体))的C端的末端100个氨基酸内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段在HDM2(SEQ ID NO:4)的氨基酸101至200内特异性结合于细胞外可接近的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体OP145(购自Calbiochem的单克隆抗体，目录号OP145-100UG；有关OP145的更多详细信息，参见下表10)竞争结合于HDM2。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体965(SMP14)(购自Santa Cruz的单克隆抗体，目录号Sc-965；有关965(SMP14)的更多详细信息，参见下表3和10)竞争结合于HDM2。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体sc-813(N-20)(购自Santa Cruz的多克隆抗体，目录号Sc-813；有关sc-813(N-20)的更多详细信息，参见下表10)竞争结合于HDM2。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体sc-812(C-18)(购自Santa Cruz多克隆抗体，目录号Sc-812；有关sc-812(C-18)的更多详细信息，参见下表10)竞争结合于HDM2。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体M01克隆1A7(购自Abnova的单克隆抗体，目录号H00004193-M01；有关M01克隆1A7的更多详细信息，参见下表3)竞争结合于HDM2。
本领域已知的任何竞争分析可用于确定与抗体OP145、SMP14、N-20、C-18或M01克隆1A7竞争结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的抗体(参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY))。
在具体实施方案中，与抗体OP145、SMP14、N-20、C-18或M01克隆1A7竞争结合于M(H)DM2/4的抗体也结合于被这样的抗体结合的相同的表位。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体OP145(有关OP145的更多详细信息，参见下表10)结合于HDM2的相同的表位。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体965(SMP14)(有关965(SMP14)的更多详细信息，参见下表3和10)结合于HDM2的相同的表位。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与多克隆抗体sc-813(N-20)(有关813(N-20)的更多详细信息，参见下表10)结合于HDM2的相同的表位之一。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与多克隆抗体sc-812(C-18)(有关sc-812(C-18)的更多详细信息，参见下表10)结合于HDM2的相同的表位之一。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与抗体M01克隆1A7(即，购自Abnova单克隆抗体，目录号H00004193-M01；有关M01克隆1A7的更多详细信息，参见下表3)结合于HDM2的相同的表位。
在具体实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段是纯化的。在某些实施方案中，将抗体或片段纯化至通过例如电泳法(例如，SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)测定的大于95％或99％的纯度(参见Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)以获得对于评估抗体纯度的方法的综述)。
本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段可以融合或偶联(例如，共价或非共价连接)到可检测的标记或物质。这样的标记的抗体或片段可以用于检测细胞的质膜表面上的M(H)DM2/4。
可检测的标记或物质的实例包括酶标记、放射性同位素(例如，碘、碳、硫、氚、铟和锝)、发光标记、荧光标记和生物素。该方法可用于确定某些癌细胞(例如患者的癌细胞)是否在质膜上表达M(H)DM2/4或M(H)DM2/4的某些剪接变体，其中使用抗体(或片段)检测M(H)DM2/4可以表明抗体(或片段)(具有或不具有可检测的标记或物质)可用于诊断或治疗癌症或预防癌症转移。
7.2抗体-药物偶联物
在具体实施方案中，本发明提供了抗体-药物偶联物，其包含结合(例如，共价结合)于细胞毒性药物的本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段。在这样的实施方案中，抗体-药物偶联物旨在通过将细胞毒性药物递送的癌细胞来介导细胞毒性。
因此，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或抗原结合片段可以结合或偶联到一种或多种细胞毒性剂。细胞毒性剂可以是抑制或防止重要的细胞功能(例如，细胞分裂)和/或引起细胞死亡或破坏的任何药剂。可以结合或偶联到抗M(H)DM2/4抗体或片段的细胞毒性剂包括但不限于，化学治疗剂(例如，本领域已知的或本文所述的任何化学治疗剂)、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、放射性同位素、生长抑制剂和溶核酶。抗体-药物偶联物及其制备方法(包括可用于这样的偶联物的抗体类型、可用于这样的偶联物的药物以及可用于将抗体连接到药物的接头)是本领域已知的(参见例如，Peters&Brown,2015,Biosci.Rep.35,e00225,doi:10.1042/BSR20150089)。
可以偶联到本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段的细胞毒性剂的实例包括但不限于，蒽环霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、抗代谢剂、抗叶酸剂、奥里斯他汀(auristatin)(例如，MMAE或MMAF)、美登木素、卡利奇霉素、倍癌霉素(duocarymucin)和吡咯并苯并二氮杂环庚三烯(PBD)二聚体。
在具体实施方案中，本文所述的M(H)DM2/4抗体或片段偶联到以下药物中的一种或多种：美登木素生物碱、奥里斯他汀(如单甲基奥里斯他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF))、尾海兔素、卡利奇霉素或其衍生物、蒽环霉素(如道诺霉素或阿霉素)、甲氨蝶呤、长春地辛、紫衫烷(如多西紫杉醇)、紫杉醇、拉罗他赛、替司他赛、奥他赛和单端孢霉烯。
在另一个实施方案中，本文所述的M(H)DM2/4抗体或片段偶联到毒素或其片段(例如，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、药莲毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹蛋白(dianthin)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素或单端孢霉烯)。
在另一个实施方案中，本文所述的M(H)DM2/4抗体或片段偶联到放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212或Lu的放射性同位素)。
在另一个实施方案中，本文所述的M(H)DM2/4抗体或其片段偶联到纳米颗粒或其他靶向工具，以促进抗体向肿瘤部位的集中递送和在肿瘤部位的保留。
7.3抗体的制备
本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段可以通过本领域已知的任何方法产生。
产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Short Protocols inMolecular Biology,(2002)第5版,Ausubel FM等人编,John Wiley and Sons,New York的第11章)。
产生单克隆抗体的方法也是本领域已知的，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，以及使用人源化小鼠。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，例如在Harlow E和Lane D,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版.1988)；Hammerling GJ等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681(Elsevier,N.Y.,1981)，或Kohler G和Milstein C(1975)Nature 256:495中所教导的。在另一个实例中，可以使用人源化小鼠产生人单克隆抗体，如例如Laffleur等人,2012,Methods Mol.Biol.901:149-59中所教导的。
使用杂交瘤技术产生特异性抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。特别地，可以免疫小鼠或另外的合适的宿主动物以引发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生将与用于免疫的靶蛋白(即，M(H)DM2/4的细胞外区域)特异性结合的抗体。然后将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(参见Goding JW(编),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986)；还参见Kozbor D(1984)JImmunol 133:3001-5；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。然后使杂交瘤细胞在合适的培养基中生长，可以分析其针对M(H)DM2/4的单克隆抗体的产生。通过该方法产生的单克隆抗M(H)DM2/4抗体的结合特异性可以通过本领域已知的方法来确定，例如免疫沉淀或体外分析，例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)。然后通过标准方法使如此选择的杂交瘤克隆生长(参见Goding JW(编),Monoclonal Antibodies:Principles andPractice，同上)。然后可以从培养基中分离单克隆抗体并纯化。
此外，还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示技术来制备本文所述的抗体或片段(参见Brinkman U等人,(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames RS等人,(1995)JImmunol Methods 184:177-186；Kettleborough CA等人,(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic L等人,(1997)Gene 187:9-18；和Burton DR&Barbas CF(1994)Advan Immunol57:191-280)。
产生嵌合抗体(即，具有一种物种(例如，鼠)的可变区和另一物种(例如人)的恒定区的抗体)的方法是本领域已知的(参见Morrison SL(1985)Science 229:1202-7；Oi VT&Morrison SL(1986)BioTechniques 4:214-221；Gillies SD等人,(1989)J ImmunolMethods 125:191-202；和第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号和第6,331,415号美国专利)。
制备抗体片段的方法是本领域已知的。例如，例如，Fab和F(ab′)2片段可以通过使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)的酶通过蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生。
制备人源化抗体的方法也是本领域已知的(参见第WO 91/09967号国际公开；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5):489-498；Studnicka GM等人,(1994)ProtEngineering 7(6):805-814；和Roguska MA等人,(1994)PNAS91:969-973；第WO 93/17105号国际公开；Tan P等人,(2002)J Immunol 169:1119-25；Caldas C等人,(2000)ProteinEng.13(5):353-60；Morea V等人,(2000),Methods 20(3):267-79；Baca M等人,(1997)JBiol Chem 272(16):10678-84；Roguska MA等人,(1996)Protein Eng 9(10):895 904；Couto JR等人,(1995)Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s；Couto JR等人,(1995)Cancer Res 55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2):409-10和Pedersen JT等人,(1994)J Mol Biol 235(3):959-73)。在具体实施方案中，通过CDR移植制备人源化抗体。
制备人抗体的方法在本领域中是已知的，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法(参见第4,444,887号、第4,716,111号和第5,885,793号美国专利；和第WO 98/46645号、第WO 98/50433号、第WO98/24893号、第WO 98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号和第WO 91/10741号国际公开)。在一些实施方案中，可以使用小鼠-人杂交瘤产生人抗体(参见Shinmoto H等人,(2004)Cytotechnology 46:19-23；Naganawa Y等人,(2005)Human Antibodies 14:27-31)。
制备单结构域抗体，例如缺少轻链的抗体的方法也是本领域已知的(参见Riechmann L&Muyldermans S(1999)J Immunol 231:25-38；Nuttall SD等人,(2000)CurrPharm Biotechnol 1(3):253-263；Muyldermans S,(2001)J Biotechnol 74(4):277-302)。
制备单链Fv(scFv)抗体的方法也是本领域已知的(参见Ahmad等人,2012,Clinical and Developmental Immunology,doi:10.1155/2012/980250；Wang等人,2006,Anal.Chem.78,997–1004；Pansri等人,2009,BMC Biotechnology 9:6)。例如，scFv抗体可通过经由短的多肽接头(使用重组表达技术)融合免疫球蛋白的重链和轻链的可变结构域来构建，并且具有期望抗原结合特性的scFv抗体可通过噬菌体展示技术来选择。
产生双特异性抗体的方法是本领域众所周知的(Konterman,2012,MAbs 4:182-197；Gramer等人,2013,MAbs 5:962-973)。
对抗体(例如，开始不具有CDC或ADCC活性的抗体)赋予CDC或ADCC活性的方法是本领域已知的(参见Kellner等人,2014,Methods 65:105–113；第WO 2012010562号国际公开；Natsume等人,2009,Drug Design,Development and Therapy 3(3):7-16)。这样的包括但不限于，Fc区同种型改组，赋予增强或优化的CDC和/或ADCC活性的Fc区中的氨基酸突变，和赋予增强或优化的CDC和/或ADCC活性的Fc区糖基化谱的改变。
7.4抗体选择
如果尚未已知或尚未证明用于本文提供的治疗和诊断方法的候选抗体或片段结合于癌细胞的表面上暴露的M(H)DM2/4的区域，则抗体或片段可以任选地通过以下方法中的任一种进行测试：
在某些方面，本文提供了确定用于本文所述的方法(例如，用于诊断癌症、治疗癌症或预防转移)的抗M(H)DM2/4抗体或其片段的方法，包括：(a)使完整癌细胞(例如，预期、已知或确定表达M(H)DM2/4的癌细胞)与抗M(H)DM2/4抗体或其片段接触；和(b)确定抗体或片段是否结合到完整癌细胞，特别是在癌细胞的细胞外表面上结合(例如，相对于未被所述抗体或片段接触的完整癌细胞)，其中抗M(H)DM2/4抗体或片段结合于与这样的抗体或片段接触的完整癌细胞表明所述抗体或片段适用于本文所述的方法。在具体实施方案中，癌细胞来自提议使用该抗体或其片段治疗的患者。
在某些方面，本文提供了确定用于本文所述的方法(例如，用于诊断癌症、治疗癌症或预防转移)的抗M(H)DM2/4抗体或其片段的方法，包括：(a)使完整癌细胞(例如，预期、已知或确定表达M(H)DM2/4的癌细胞)与抗M(H)DM2/4抗体或其片段接触；和(b)相对于与完整正常细胞(例如，与癌细胞相同的组织或器官类型的非癌细胞)的结合，确定抗体或片段是否以增加的水平结合于完整癌细胞(特别是在癌细胞的细胞外表面上结合)，其中相对于正常细胞，抗M(H)DM2/4抗体或片段与完整癌细胞的增加的结合表明所述抗体或片段适用于本文所述的方法。
在某些方面，本文提供了确定用于本文所述的方法(例如，用于治疗癌症或用于预防转移)的抗M(H)DM2/4抗体或其片段的方法，包括：(a)使完整癌细胞(例如，已知、预期或确定表达M(H)DM2/4的癌细胞)与抗M(H)DM2/4抗体或其片段接触；和(b)相对于未被所述抗体或片段接触的完整癌细胞的死亡或破坏的量和/或相对于被所述抗体或片段接触的完整正常细胞(例如，与癌细胞相同的组织或器官的非癌细胞)的死亡或破坏的量，确定接触步骤是否导致增加量的完整癌细胞的细胞死亡或破坏(例如，如通过细胞死亡标志物如碘化丙啶染色确定的)，其中与所述抗体或片段接触的完整癌细胞的细胞死亡或破坏的量增加表明所述抗体或片段适用于本文所述的方法。
在某些方面，本文提供了确定用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段(例如，用于治疗癌症或用于预防转移)的方法，包括:(a)使完整癌细胞(例如，已知、预期或确定表达M(H)DM2/4的细胞)与抗M(H)DM2/4抗体或片段接触；和(b)相对于针对未被所述抗体或片段接触的完整癌细胞的CDC或ADCC的水平和/或相对于针对被所述抗体或片段接触的完整正常细胞(例如，与癌细胞相同的组织或器官的非癌细胞)的CDC或ADCC的水平，确定该接触步骤是否导致针对完整癌细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的水平升高(如通过一种或多种细胞毒性分析确定的)，其中针对完整癌细胞的CDC或ADCC的水平升高表明所述抗体或片段适用于本文所述的方法。
在某些方面，本文提供了确定用于本文所述的方法的抗M(H)DM2/4抗体或其片段(例如，用于治疗癌症或用于预防转移)的方法，包括：(a)使完整癌细胞(例如，已知、预期或确定表达M(H)DM2/4的细胞)与抗M(H)DM2/4抗体或其片段接触；和(b)相对于未被所述抗体或片段接触的完整癌细胞的生长和增殖的抑制和/或相对于被所述抗体或片段接触的完整正常细胞(例如，与癌细胞相同的组织或器官的非癌细胞)的生长和增殖的抑制，确定该接触步骤是否导致完整癌细胞的生长和增殖的抑制增加，其中与所述抗体或片段接触的完整癌细胞的生长和增殖的抑制增加表明所述抗体或片段适用于本文所述的方法。
7.5药物组合物
本文提供了包含抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。本文还提供了包含如本文所述的抗体-药物偶联物和药学上可接受的载体的药物组合物。适宜的药学上可接受的载体(包括但不限于赋形剂和稳定剂)是本领域已知的(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)。可以纯化本文所述的药物组合物中的抗M(H)DM2/4抗体或片段或抗体-药物偶联物。
药学上可接受的载体可以包括等渗剂、缓冲剂、助悬剂、分散剂、乳化剂、润湿剂、掩蔽剂(sequestering agent)或螯合剂、pH缓冲剂、溶解增强剂、抗氧化剂、麻醉剂和/或抗微生物剂。合适的赋形剂包括但不限于水、盐水、甘油、乙醇、淀粉、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、丙烯、硅胶、硬脂酸钠、基质乳膏和右旋糖。如果肠胃外施用，则合适的药学上可接受的载体可以包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有诸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇或其他药剂的溶液。
在具体实施方案中，本文提供的药物组合物包含在药学上可接受的载体中的本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段或抗体-药物偶联物，和任选地一种或多种其他治疗(例如，抗癌)剂。
可以针对向对象施用的任何途径配制药物组合物。注射剂的制剂可以制备成液体溶液剂、混悬剂、乳剂或适于在注射前制成溶液剂或混悬剂的固体形式。
抗M(H)DM2/4抗体或其片段或抗体-药物偶联物可以治疗有效量使用或存在于药物组合物中。抗体或偶联物的治疗有效量可以通过标准临床技术确定。
在具体实施方案中，预期用于本文所述的治疗方法中的药物组合物包含抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物偶联物，并且不包含任何另外的抗癌剂或抗癌治疗。在另一个具体实施方案中，预期用于本文所述的治疗方法中的药物组合物包含抗M(H)DM2/4抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体-药物偶联物，并且还包含另外的抗癌剂或抗癌治疗(例如，本文所述的任何一种、两种或更多种另外的抗癌剂或抗癌治疗)。
7.6治疗方法
一方面，本发明提供了在有此需要的对象中治疗癌症(例如，抑制癌症增殖、抑制癌症进展)的方法，包括向所述对象施用任何本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段。在具体实施方案中，本发明提供了一种治疗有此需要的对象的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段。在另一个具体实施方案中，本发明提供了在有此需要的对象中预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段。在本文所述方法的具体实施方案中，所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。
一方面，本发明提供了在有此需要的对象中治疗癌症(例如，抑制癌症增殖、抑制癌症进展)的方法，包括向所述对象施用抗体或其片段，其特异性结合于癌细胞表面上暴露的HDM2的细胞外可接近的表位(例如，其中所治疗的癌症类型的细胞已知或预期具有在其质膜表面上暴露的HDM2的这样的细胞外区域)，优选地其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。在一个实施方案中，治疗癌症的方法包括预防癌症的转移。在一个实施方案中，治疗癌症的方法是用于减小肿瘤尺寸(如例如通过肿瘤体积或直径测量的)、抑制肿瘤生长、降低肿瘤生长或根除肿瘤的方法。
另一方面，本发明提供了在患有癌症的对象中预防转移的方法，包括向所述对象施用任何本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段。另一方面，本发明提供了在患有癌症的对象中预防转移的方法，包括向所述对象施用抗体或其片段，其特异性结合于癌细胞表面上暴露的HDM2的细胞外区域(例如，其中被治疗的癌症的类型的细胞已知或预期具有在其质膜表面上暴露的HDM2的这样的细胞外区域)。
另一方面，本发明提供了在患有转移性癌症的对象中减少转移的数量、尺寸或侵袭性或根除转移的方法，包括向所述对象施用任何本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段。另一方面，本发明提供了在患有转移性癌症的对象中减少转移的数量、尺寸或侵袭性或根除转移的方法，包括向所述对象施用抗体或其片段，其特异性结合于癌细胞表面上暴露的HDM2的细胞外可接近的表位(例如，其中被治疗的癌症的类型的细胞已知或预期具有在其质膜表面上暴露的HDM2的这样的细胞外可接近的表位)。
一方面，本发明提供了治疗对另一种或多种癌症治疗(例如，疫苗、靶向治疗(如小分子靶向治疗)、化学治疗、放射治疗或免疫治疗(如用另一种单克隆抗体治疗))具有抗性的癌症。在一个实施方案中，本发明提供了治疗对化学治疗具有抗性(即，对一种或多种化学治疗药物具有抗性)的癌症。在一个实施方案中，本发明提供了治疗对使用另一种或多种单克隆抗体治疗有抗性的癌症。在一个实施方案中，本发明提供了治疗对放射治疗有抗性的癌症。在一个实施方案中，本发明提供了治疗对一种或多种小分子靶向治疗有抗性的癌症。
本文公开了抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其抗原结合片段在患有癌症(例如，已被诊断出患有癌症)的患者中的治疗用途。在优选的实施方案中，本文公开了抗HDM2抗体(或其片段)在患有已知会转移的癌症(即，通常已知会成为转移性癌症的癌症)的患者中的治疗用途。在一些实施方案中，被治疗的患者具有转移性癌症。在其他实施方案中，根据本文所述的方法治疗患有尚未转移的癌症的患者，以防止癌症的转移。在一些实施方案中，被治疗的患者之前已经用其他癌症治疗(例如疫苗、靶向治疗、化学治疗、免疫治疗)治疗过。在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗患有已转移的癌症的患者，以降低、减缓或阻止转移，或降低癌症转移的数量或尺寸。
本文所述的方法适用于治疗预期、已知或确定在其细胞表面上表达抗M(H)DM2/4(例如，HDM2)的癌症。通过本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2可以是本领域已知或本文所述的HDM2蛋白的剪接变体之一。不受作用机理的束缚，认为癌细胞表面上的HDM2通常是HDM2蛋白的剪接变体，其缺少至少一个或全部核定位信号(例如，在HDM2的N端部分的核定位序列、在HDM2的C端部分的核定位信号或两种核定位信号)。在具体实施方案中，癌细胞表面上的HDM2是HDM2蛋白的剪接变体，其缺少至少一种或全部核定位信号，并且还缺少核输出信号。在一个实施方案中，癌细胞表面上的HDM2是缺少在SEQ ID NO:4的氨基酸179-185处的核定位信号(即，缺少SEQ ID NO:4的氨基酸179至185)的HDM2。在一个实施方案中，癌细胞表面上的HDM2是缺少在SEQ ID NO:4的氨基酸466-473处的核定位信号(即，缺少SEQ ID NO:4的氨基酸466至473)的HDM2。在一个实施方案中，癌细胞表面上的HDM2是缺少在SEQ ID NO:4的氨基酸179-185和氨基酸466-473处的核定位信号(即，缺少SEQ ID NO:4的氨基酸179至185和466至473)的HDM2。在一些实施方案中，癌细胞表面上的HDM2是缺少核输出信号，如在SEQ ID NO:4的氨基酸190-202处的核输出信号(即，缺少SEQ ID NO:4的氨基酸190至202)的HDM2。
在某些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是HDM2蛋白的剪接变体，如本领域已知或本文所述的剪接变体之一(关于HDM2变体的列表，参见表1和表2和第8节)。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-A的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:8)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸28-222。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-A1的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:9)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸28-222和275-300。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-B的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:10)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸28-300。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-C的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:11)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸53-222。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-D的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:12)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸30-388。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-E的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:13)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸76-102和103-491。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-F的HDM2蛋白的剪接变体(SEQID NO:14)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸53-97。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-G的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:15)，其缺少SEQID NO:4的氨基酸115-169。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-11的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:16)，其中氨基酸M已经被SEQ IDNO:4中的M→MVRSRQM取代。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向的癌细胞表面上的HDM2是称为MDM2-KB2的HDM2蛋白的剪接变体(SEQ ID NO:17)，其缺少SEQ ID NO:4的氨基酸157-248。在一些实施方案中，本文所述的方法靶向癌细胞表面上的M(H)DM4的剪接变体，例如，靶向以下剪接变体中的一种或多种：MDMX-S、MDM4-S、MDM4-A、MDM4-G、MDM4-XALT1/XALT2和MDM4-211(或所列剪接变体的人等价物)。
在具体实施方案中，已经测试并确定用于本文所述的方法中的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其片段预期会结合于在待治疗的癌症的细胞表面上暴露的HDM2。该与HDM2的结合可以通过例如抗HDM2抗体或片段与治疗的癌症来源的组织的组织类型的完整癌细胞(其可以但不必来自被治疗的对象)结合的能力显示。在一个实施方案中，在向对象施用抗体或片段之前，测试并确定抗HDM2抗体或其片段预期会结合于对象的癌症的完整细胞。该测试可以例如通过显示抗HDM2抗体或片段与通过活检获得的完整癌细胞表面或与适当组织类型的癌细胞系的结合来进行。
任选地，可以使用本领域已知的技术测试待治疗的预期患者的癌细胞在其表面上的M(H)DM2/4(例如，HDM2)表达，以确定对象是否为本文所述的抗HDM2治疗的合适候选者；然而，如果患者患有已知或预期具有M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的组织类型的癌症，则这通常不会认为是必需的。在具体实施方案中，已经测试并确定了所治疗的对象中的癌细胞具有在其质膜表面上暴露的(被抗HDM2抗体或其片段靶向的)HDM2的细胞外可接近的表位(例如，确定表达已知具有在质膜表面上暴露的该细胞外区域的HDM2的变体)。在某些实施方案中，使用本文所述的方法治疗的癌症是已知或确定在其细胞的质膜表面上表达HDM2的剪接变体(例如，MDM2-A(SEQ ID NO:8)、MDM2-A1(SEQ ID NO:9)、MDM2-B(SEQ IDNO:10)、MDM2-C(SEQ ID NO:11)、MDM2-D(SEQ ID NO:12)、MDM2-E(SEQ ID NO:13)、MDM2-F(SEQ ID NO:14)、MDM2-G(SEQ ID NO:15)、MDM2-11(SEQ ID NO:16)或MDM-KB2(SEQ ID NO:17))的癌症。这可以使用本领域已知的技术(例如，对来自癌症活检的核酸样品进行RT-PCR)来检测。
在具体实施方案中，可以根据本文所述的方法进行抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其抗原结合片段的施用，以(例如，在患有癌性肿瘤的对象中)实现或发现能够实现以下作用中的至少一种、两种、三种、四种或更多种:(i)肿瘤尺寸减小(例如，体积或直径)，(ii)肿瘤生长降低，(iii)抑制肿瘤生长的进展，(iv)肿瘤消退，(v)抑制肿瘤复发，(vi)根除肿瘤(例如，原发性肿瘤或转移性肿瘤)，(vii)防止肿瘤转移，(vii)减少肿瘤转移的数量、尺寸或侵袭性，(viii)减少或改善肿瘤的一种或多种症状的严重程度或持续时间，(ix)抑制与癌症有关的一种或多种症状的发展或发作，(x)增强或改善另一种治疗的治疗效果，(xi)减少对象的住院治疗(例如住院时间)，(xii)改善对象的生活质量，(xiii)降低死亡率，(xiv)对象的无复发生存或缓解时间增加。这些作用中的任何一种都可以通过本领域已知的任何方法来评估。例如，可以使用磁共振成像(MRI)、动态对比增强MRI(DCE-MRI)、X射线、计算机断层(CT)扫描或正电子发射断层(PET)扫描来评估肿瘤尺寸。
在某些实施方案中，根据本文所述的方法的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其抗原结合片段的施用当单独使用或与另一种治疗组合使用时有效治疗对象中的癌症(例如，减小肿瘤体积或直径、降低肿瘤生长、降低肿瘤增殖、根除肿瘤或改善癌症的一种或多种症状)。在某些实施方案中，根据本文所述的方法的抗HDM2抗体或其抗原结合片段的施用当单独使用或与另一种治疗组合使用时有效预防患有癌症的对象中的转移。在某些实施方案中，根据本文所述的方法的抗HDM2抗体或其抗原结合片段的施用当单独使用或与另一种治疗组合使用时有效治疗转移性癌症(例如，减少转移的数量、尺寸或侵袭性，或根除转移)。
在特定的实施方案中，根据本文所述的方法的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其抗原结合片段的施用当单独使用时(即，无需另外的治疗)有效治疗对象中的癌症或预防转移。在其他特定的实施方案中，根据本文所述的方法的抗HDM2抗体或其抗原结合片段的施用当与一种或多种本文所述的另外的治疗组合使用时有效治疗对象中的癌症或预防转移。
可以通过在向被治疗的对象施用本文所述的治疗之前和之后评价参数(例如，肿瘤尺寸)来评估本文所述的治疗的有效性。供选择地，可以通过在向动物模型(例如，在治疗癌症的动物模型中，例如小鼠模型、大鼠模型或仓鼠模型)施用本文所述的治疗之前和之后评价参数(例如，肿瘤尺寸)来评估治疗的有效性。本领域已知的任何分析均可用于评价本文所述的治疗的治疗效果。
在本文所述的使用抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其抗原结合片段的治疗方法中，应理解可以供选择地使用本文所述的抗体-药物偶联物。
7.6.1要治疗的癌症
可以根据本文所述的方法治疗的癌症的实例包括但不限于，乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、胰腺癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、前列腺癌(例如，激素抵抗性前列腺癌，例如去势抵抗性前列腺癌)、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、结肠直肠癌(例如、结肠癌或直肠癌)、胃肠癌、胃癌、小肠癌、阑尾癌、食道癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、胆囊癌、肾癌(例如肾细胞癌或Wilms瘤))、肝癌(例如肝癌或肝细胞瘤)、中枢神经系统癌(例如脑癌)、外周神经系统癌、支气管癌、口腔或咽癌(例如口咽癌、喉癌)、甲状腺癌、胆道癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、外阴癌、睾丸癌、尿道癌、阴道癌、阴茎癌、骨癌、眼癌(例如视网膜母细胞瘤或葡萄膜黑色素瘤)和头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)。在具体实施方案中，癌症是宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌或结肠癌。在一个实施方案中，癌症是胰腺癌。在一个实施方案中，癌症是黑色素瘤。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个实施方案中，癌症是卵巢癌。
在某些实施方案中，可以根据本文所述的方法治疗的癌症对另一种或多种癌症治疗(例如，疫苗、靶向治疗(如小分子靶向治疗)、化学治疗、放射治疗或免疫治疗(如用另一种单克隆抗体的治疗))具有抗性。在一个实施方案中，可以根据本文所述的方法治疗的癌症对化学治疗具有抗性。在一个实施方案中，可以根据本文所述的方法治疗的癌症对用另一种或多种单克隆抗体的治疗具有抗性。在一个实施方案中，可以根据本文所述的方法治疗的癌症对放射具有抗性。在一个实施方案中，可以根据本文所述的方法治疗的癌症对小分子靶向治疗具有抗性。
在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是实体癌。在另一个具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是非实体癌(例如，血液学癌症)。
在具体实施方案中，根据本发明治疗的癌症是白血病(例如，急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病或急性粒细胞白血病)、慢性白血病(例如，慢性粒细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病)或毛细胞白血病)，淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或T细胞淋巴瘤)。
在具体实施方案中，根据本发明治疗的癌症是癌(例如，腺癌、基底细胞癌、肾细胞癌、鳞状细胞癌、骨癌、胸腺瘤/胸腺癌或绒毛膜癌)、胚细胞瘤、肉瘤(例如，软组织肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤或滑膜肉瘤)、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、鳞状细胞癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤(例如，多形性胶质母细胞瘤)、胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、肝细胞瘤、精原细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤或视网膜母细胞瘤。
在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肉瘤或癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤、肥大细胞肉瘤、成人软组织肉瘤、子宫肉瘤、卡波西肉瘤、Merkel细胞癌、尿路上皮癌、结肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、胚胎癌、肺癌(例如小细胞肺癌)、膀胱癌或上皮癌。
在某些实施方案中，根据本发明的方法治疗的癌症是转移性的。在一些实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是转移性黑色素瘤、转移性卵巢癌、转移性宫颈癌、转移性子宫内膜癌、转移性胰腺癌、转移性乳腺癌、转移性结肠癌或转移性脑癌。
7.6.2施用方法
本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段(和包含这样的抗体的药物组合物)可以通过任何合适的方式向对象施用，所述方式包括但不限于肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、骨内、脑内、脑室内、鞘内、皮下)、腹膜内、肿瘤内、肺内、皮内、透皮、结膜、眼内、鼻内、气管内、口服和局部病灶内施用途径。在某些实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段通过静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、肿瘤内或皮下施用。在一个实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段静脉内施用。在一个实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段腹膜内施用。在一个实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段肌内施用。在一个实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段皮下施用。在一个实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段肿瘤内施用(如通过注射到所治疗的癌症的肿瘤中)。在特定的实施方案中，本文所述的抗HDM2抗体或片段静脉内、腹膜内或肿瘤内施用。
在具体实施方案中，包被有本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其片段的纳米颗粒用于肿瘤靶向和治疗(关于包被有抗体的纳米颗粒，参见例如Cardoso等人,2012,Curr.Med.Chem.19(19):3103-27和Arruebo等人,2009,J.of Nanomater.2009:Article ID 439389)。在一个实施方案中，本文提供了在患有癌症的对象中治疗癌症或预防转移的方法，包括向所述对象施用包被有抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其片段的纳米颗粒。
考虑了本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段(以及包含这样的抗体的药物组合物)的各种给药方案，包括一段时间内的单次施用或多次施用。施用方法包括但不限于推注施用、脉冲输注和连续输注。
用于本文所述方法的治疗方案可以包括每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次，每六周一次，每八周一次或每十二周一次施用抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或其片段(和包含这样的抗体的组合物)(例如，使得对象接受至少两剂、至少三剂、至少四剂、至少五剂、至少六剂、至少八剂或至少十剂抗体或两剂至二十剂抗体)。在某些实施方案中，抗HDM2抗体或其片段(和包含这样的抗体的组合物)每天，每隔一天或每周两次、三次或四次施用(例如，持续一段时间，如一周、两周、三周、四周六周、两个月或三个月)。本文考虑的治疗方案包括以下方案，其中抗体的初始较高剂量之后可以是一个或多个较低剂量，或其中抗体的初始较低剂量之后是一个或多个较高剂量。示例性的治疗过程(其中施用抗HDM2抗体或片段)可以持续一周、两周、三周、四周、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年或几年。
在一些实施方案中，在初始治疗期(其中例如每月一次、两周一次、每周一次、每周两次或每周三次施用抗体)之后是停药期，其中不施用抗体(例如一周、两周、三周、四周、六周、两个月、三个月、四个月、六个月或一年)，然后是第二治疗期(其中例如，每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次或每周三次施用抗体)。这样的初始治疗和这样的第二治疗期可以持续例如两周、三周、四周、六周、两个月、三个月、四个月或六个月(其中初始治疗期可以与第二治疗期相同或不同)。该治疗过程(具有初始治疗期、停药期和第二治疗期)可以重复两次、三次、四次、五次、六次、十次或多于十次。
在一些实施方案中，向所治疗的对象同时或顺序施用对M(H)DM2/4(例如，HDM2)具有不同结合特异性的两种或更多种抗体或其片段。
用于本文所述方法中的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段的合适剂量将取决于施用的抗体的类型、所治疗的癌症的类型、所治疗的癌症的严重程度、施用途径、目标部位、患者状况(例如年龄、体重、健康状况)、患者对抗体的反应性、患者使用的其他药物以及进行治疗的医学从业者自行决定要考虑的其他因素。
在某些实施方案中，向对象施用的本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段的剂量可以为约1μg/kg至200mg/kg患者体重。在某些实施方案中，向对象施用的本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段的剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg患者体重(例如，约0.01mg/kg至约100mg/kg、约0.05mg/kg至约100mg/kg或约0.5mg/kg至约100mg/kg)。在某些实施方案中，向对象施用的本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或片段的剂量可以为约1mg/kg至200mg/kg患者体重。在一个实施方案中，向对象施用的本文所述的抗HDM2抗体或片段的剂量为0.025mg/kg至约5mg/kg。在一个实施方案中，向对象施用的本文所述的抗HDM2抗体或片段的剂量为0.05mg/kg至约2mg/kg。在一个实施方案中，向对象施用的本文所述的抗HDM2抗体或片段的剂量为5mg/kg至约30mg/kg。在具体实施方案中，可以向所治疗的对象施用约0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、75mg/kg或100mg/kg的本文所述的抗HDM2抗体或片段的剂量(例如，一个或多个剂量)。在一个实施方案中，(例如，当肿瘤内施用抗体时)可以向所治疗的对象施用约0.1mg/kg的本文所述的抗HDM2抗体或片段的剂量(例如，一个或多个剂量)。
7.7诊断、伴随诊断和预后方法
一方面，本文提供了在对象(例如，人)中诊断癌症的方法，所述方法包括：(a)检测特异性结合于M(H)DM2/4(例如，HDM2)的抗体或其片段(例如，标记的抗体或片段)是否结合于对象的完整细胞的表面，其中所述抗体或片段是本文所述的任何抗M(H)DM2/4抗体或片段(特别是特异性结合于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的任何抗体或片段)；和(b)如果在步骤(a)中检测到结合，则诊断对象患有癌症。在一个实施方案中，诊断方法还包括在步骤(a)的检测前从对象获得完整细胞，然后通过例如使用例如FACS或基于细胞的ELISA分析确定标记的抗体或片段是否结合于来自对象的完整细胞，进行检测。在一个实施方案中，诊断方法包括在步骤(a)中的检测之前向对象施用抗体或片段，并且其中通过对象的体内成像来进行检测。
一方面，基于本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或抗体片段与从患者获得的完整癌细胞的表面的结合的检测，选择患者以使用这样的抗体或片段进行治疗。在某些实施方案中，本文提供了选择患有癌症的患者以使用特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或片段治疗的方法，所述方法包括：(例如，通过患者的癌性肿瘤的活检或通过获得来自患者的具有循环癌细胞的血液样品)从患者获得完整癌细胞，并(使用本领域已知或本文描述的任何方法，例如使用基于细胞的ELISA或FACS分析)确定所述抗体或片段是否结合于患者的完整癌细胞的表面，其中检测到结合表明可以用所述抗体或片段治疗所述患者。在具体实施方案中，本文提供了选择患有癌症的患者以使用特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或片段进行治疗的方法，包括：(例如，通过患者的癌性肿瘤的活检或通过获得来自患者的具有循环癌细胞的血液样品)从所述患者获得完整癌细胞，(使用本领域已知或本文描述的任何方法，例如使用基于细胞的ELISA或FACS分析)确定所述抗体或片段是否结合于患者的完整癌细胞的表面，并且如果检测到结合，则向所述患者施用所述抗体或片段。向患者施用的抗体或片段可以与用于选择待治疗的患者的抗体或片段相同或不同。在一个实施方案中，本文提供了选择患有卵巢癌的患者以使用特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或片段进行治疗的方法，所述方法包括：从所述患者获得完整卵巢癌细胞，确定所述抗体或片段是否结合于患者的完整癌细胞的表面，并且如果检测到结合，则向所述患者施用所述抗体或片段。在一个实施方案中，特异性结合于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的任何抗体或其片段用于这样的患者选择和/或治疗。在一个实施方案中，不结合于细胞穿透肽的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的任何抗体或其片段用于这样的患者选择和/或治疗。在一个实施方案中，不结合于细胞穿透肽的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的任何抗体或其片段用于这样的患者选择，并且特异性结合于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的任何抗体或其片段用于患者的治疗。
可用于使用本文所述的抗M(H)DM2/4抗体(例如，抗HDM2抗体)或其片段的诊断或患者选择方法的非限制性示例性样品包括：组织活检、从恶性组织获得的完整细胞和从血液中分离的循环癌细胞。例如，可以从患者获得组织样品，并且可以进行免疫组织化学以检测标记的抗M(H)DM2/4抗体(例如，抗HDM2抗体)或其片段是否结合于组织样品。供选择地，可以从患者中分离(已知或疑似恶性的)完整细胞，并且可以进行FACS或基于细胞的ELISA分析，以检测标记的抗M(H)DM2/4抗体(例如，抗HDM2抗体)或其片段是否结合于这样的细胞。在又一个实例中，可以从患者获得具有循环癌细胞的血液样品，并且可以进行FACS或基于细胞的ELISA分析，以检测标记的抗M(H)DM2/4抗体(例如，抗HDM2抗体)或其片段是否结合于这样的细胞。
一方面，基于本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或抗体片段与从患者获得的完整癌细胞的表面的结合的检测，确定待用于治疗患者的这样的抗体或片段的治疗持续时间和/或剂量。在某些实施方案中，本文提供了确定是否继续用特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或片段治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：在第一时间段内向患者施用抗体或片段(例如，其中已如上所述选择患者进行治疗)，(例如，通过患者的癌性肿瘤的活检或通过获得来自患者的具有循环癌细胞的血液样品)从患者获得完整癌细胞，和(使用本领域已知或本文描述的任何方法，例如使用基于细胞的ELISA或FACS分析)确定所述抗体或片段是否结合于患者的完整癌细胞的表面，如果检测到结合，则继续在第二时间段内向患者施用所述抗体或片段(但是，例如，如果未检测到结合，则中止治疗)。在某些实施方案中，本文提供了确定是否增加用于治疗患有癌症的患者的特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或片段的剂量的方法，所述方法包括：在一段时间内向所述患者施用一定剂量的抗体或片段(例如，其中已如上所述选择患者进行治疗)，(例如，通过患者的癌性肿瘤的活检或通过获得来自患者的具有循环癌细胞的血液样品)从患者获得完整癌细胞，并且(使用本领域已知或本文描述的任何方法，例如使用基于细胞的ELISA或FACS分析)确定所述抗体或片段是否结合于患者的完整癌细胞的表面，如果检测到结合，则在第二时间段内向所述患者施用一定剂量的所述抗体或片段，其中在第二时间段内施用的剂量高于在第一段时间内施用的剂量(例如，高两倍或三倍)(但是例如，如果未检测到结合，则中止治疗或在第二时间段内施用更低剂量的所述抗体或片段)。
在另一个具体实施方案中，在治疗之前和之后，通过确定在从患者获得的癌细胞表面上表达的HDM2的量，在患者中监测用本文所述的抗M(H)DM2/4(例如，抗HDM2)抗体或抗体片段的治疗，其中量的减少是积极的预后。
7.8患者群体
根据本文所述的方法治疗的患者或对象包括但不限于人和非人类脊椎动物。在某些实施方案中，被治疗的对象是哺乳动物，例如人、狗、猫、猴子、兔、牛、马、山羊、绵羊或猪。在优选的实施方案中，被治疗的对象是人。
在某些实施方案中，根据本文描述的方法治疗的对象已经被诊断患有癌症(例如，使用活检或本领域已知的任何其他方法)。在特定的实施方案中，治疗的对象已被诊断患有早期癌症。在其他实施方案中，治疗的对象已被诊断患有晚期癌症。在特定的实施方案中，治疗的对象已被诊断患有高度肿瘤。在其他实施方案中，治疗的对象已被诊断患有低度肿瘤。在某些实施方案中，治疗的对象已被诊断患有可转移的癌症。在具体实施方案中，治疗的对象已被诊断患有转移性癌症。
在具体实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已被诊断患有宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌(例如，结肠癌)、膀胱癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、儿童横纹肌肉瘤或肺癌(例如，非小细胞肺癌)。在具体实施方案中、根据本文所述的方法治疗的对象已被诊断患有黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌或卵巢癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已被诊断患有黑色素瘤。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已被诊断患有胰腺癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已被诊断患有乳腺癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已被诊断患有卵巢癌。在一个实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象已被诊断患有肺癌。
在某些实施方案中，所治疗的对象先前已经经历过一种或多种其他癌症治疗(例如，疫苗、靶向治疗(如小分子靶向治疗)、化学治疗、放射治疗或免疫治疗(如使用另一种单克隆抗体的治疗))，并且对象的癌症已经对一种或多种其他癌症治疗产生抗性。在一个实施方案中，所治疗的对象对化学治疗有抗性。在一个实施方案中，所治疗的对象对放射治疗有抗性。在一个实施方案中，所治疗的对象对小分子靶向治疗有抗性。在一个实施方案中，所治疗的对象对使用另一种单克隆抗体的治疗有抗性。
在某些实施方案中，所治疗的对象患有已知或预期在其细胞表面上具有M(H)DM2/4(例如，HDM2)的类型的癌症。在具体实施方案中，所治疗的对象具有以下类型的癌症，其细胞在其细胞表面上表达HDM2的剪接变体中的一种或多种，例如(但不限于)以下剪接变体中的一种或多种：MDM2-A(SEQ ID NO:8)、MDM2-A1(SEQ ID NO:9)、MDM2-B(SEQ ID NO:10)、MDM2-C(SEQ ID NO:11)、MDM2-D(SEQ ID NO:12)、MDM2-E(SEQ ID NO:13)、MDM2-F(SEQ IDNO:14)、MDM2-G(SEQ ID NO:15)、MDM2-11(SEQ ID NO:16)或MDM-KB2(SEQ ID NO:17)。
在某些实施方案中，所治疗的对象患有已经(使用本领域已知的任何分析)测试和确定在其细胞的质膜上携带M(H)DM2/4(例如，HDM2)的癌症。在特定的实施方案中，所治疗的对象患有这样的癌症，已经(使用本领域已知的任何方法)测试和确定其细胞在其质膜表面上暴露出可以被抗HDM2抗体或片段靶向的HDM2的细胞外区域(并且可以向所述对象施用这样的抗体)。在具体实施方案中，所治疗的对象患有这样的癌症，已经(使用本领域已知的任何方法)测试和确定其细胞在其细胞表面上表达HDM2的剪接变体中的一种或多种，例如(但不限于)以下剪接变体中的一种或多种MDM2-A(SEQ ID NO:8)、MDM2-A1(SEQ ID NO:9)、MDM2-B(SEQ ID NO:10)、MDM2-C(SEQ ID NO:11)、MDM2-D(SEQ ID NO:12)、MDM2-E(SEQ IDNO:13)、MDM2-F(SEQ ID NO:14)、MDM2-G(SEQ ID NO:15)、MDM2-11(SEQ ID NO:16)或MDM-KB2(SEQ ID NO:17)。
7.9组合治疗和试剂盒
在某些实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与一种或多种不同于所述抗体或片段的抗癌治疗组合施用于对象，所述抗癌治疗例如化学治疗、手术、放射治疗、具有抗癌活性的另一种抗体、细胞因子、T细胞治疗、疫苗(例如，细胞疫苗)、具有抗癌活性的小分子、抗激素剂或本领域已知的任何其他抗癌治疗。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与化学治疗组合施用于对象。可用于本文所述方法的化学治疗剂的类型的实例包括但不限于，烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、芳香酶抑制剂、抗肿瘤抗生素、植物来源的生物碱、激素拮抗剂、P-糖蛋白抑制剂和铂络合物衍生物。可用于本文所述方法的化学治疗药的具体实例包括但不限于泰素、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、阿霉素、道诺霉素、秋水仙碱、米托蒽醌、他莫昔芬、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、乌拉莫司汀、盐酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、卡莫司汀、洛莫斯汀、司莫司汀、福莫司汀、链脲霉素、噻替哌、丝裂霉素、亚丝醌、四嗪、六甲蜜胺、达卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺、甲基苄肼、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、六甲蜜胺(altretamine)、克瘤灵、曲洛磷胺、雌莫司汀、苏消安、甘露舒凡、三亚胺醌、卡巴醌、尼莫斯汀、雷莫司汀、硫唑嘌呤、磺胺、氟嘧啶、硫嘌呤、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、克拉屈滨、卡培他滨、培美曲塞、氟达拉滨、甲氨蝶呤、羟基脲、奈拉滨或氯法拉滨、阿糖胞苷、地西他滨、普拉曲沙、氟尿苷、硫鸟嘌呤(thioquanine)、阿扎胞苷、克拉屈滨、喷司他丁、巯嘌呤、伊马替尼、放线菌素D、柔红霉素、博来霉素、放线菌素、藤黄霉素、表柔比星、伊达比星、普卡霉素、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁、紫杉醇、多西紫杉醇、依托泊苷、替尼泊苷、小长春花、长春花、长春花、紫杉烷、伊立替康、拓扑替康、喜树碱、替尼泊苷、吡柔比星、新生霉素、美巴龙、阿柔比星、安吖啶、抗雄激素、抗雌激素、比卡鲁胺、甲羟孕酮、氟甲睾酮、己烯雌酚、雌二醇、奥曲肽、甲地孕酮、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、强的松、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、氨鲁米特、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏罗唑、福美司坦、法屈唑、雄烯、白藜芦醇、麦斯明、儿茶素、芹菜素、圣草酚、异甘草素、倒捻子素、胺碘酮、阿奇霉素、卡托普利、克拉霉素、环孢菌素、胡椒碱、槲皮素、奎尼丁、奎宁、利血平、利托那韦、他立喹达、维拉帕米、顺铂、卡铂、奥沙利铂、反铂、奈达铂、赛特铂、三铂(triplatin)和卡铂。在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与以下化学治疗剂中的一种或多种组合施用于对象：吉西他滨、白蛋白结合型紫杉醇、卡培他滨、伊立替康和塞来昔布。在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与以下化学治疗剂中的一种或多种组合施用于对象：吉西他滨、白蛋白结合型紫杉醇、顺铂、5-FU和紫杉醇(例如，配制成白蛋白结合的颗粒的紫杉醇，如
Figure BDA0002426459430000741
)。在具体实施方案中，使用本文所述的组合疗法治疗的癌症是胰腺癌、乳腺癌、肺癌或卵巢癌。
在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与吉西他滨组合施用于对象(例如，用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌或卵巢癌)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与卡培他滨组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与伊立替康组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与塞来昔布组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与紫杉醇(例如，配制成白蛋白结合的颗粒的紫杉醇，如
Figure BDA0002426459430000742
)组合施用于对象(例如，用于治疗转移性乳腺癌)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与白蛋白结合型紫杉醇组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与顺铂组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与5-FU组合施用于对象(例如，用于治疗结肠直肠癌，如结肠癌)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与卡铂组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇组合施用于对象(例如，用于治疗胰腺癌)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与吉西他滨和卡铂组合施用于对象(例如，用于治疗卵巢癌)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与紫杉醇(例如，配制成白蛋白结合的颗粒的紫杉醇，如
Figure BDA0002426459430000743
)和吉西他滨组合施用于对象(例如，用于治疗乳腺癌或胰腺癌，如胰腺腺癌或胰腺转移性腺癌)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与吉西他滨和顺铂组合施用于对象(例如，用于治疗非小细胞肺癌)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与吉西他滨和5-FU组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与紫杉醇(例如，配制成白蛋白结合的颗粒的紫杉醇，如
Figure BDA0002426459430000751
)和卡铂(例如，用于治疗非小细胞肺癌)组合施用于对象。
在某些实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以1,500mg/m2的剂量施用。在某些实施方案中，其中所述对象是人，白蛋白结合型紫杉醇以300mg/m2的剂量施用。在某些实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以1,000mg/m2的剂量施用。在某些实施方案中，其中所述对象是人，白蛋白结合型紫杉醇以125mg/m2的剂量施用。
在某些实施方案中，吉西他滨和/或白蛋白结合型紫杉醇的施用剂量低于当吉西他滨和/或白蛋白结合型紫杉醇未与抗癌抗体(如本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或片段)组合施用时使用的剂量。在某些实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以小于1,500mg/m2的剂量施用，和/或白蛋白结合型紫杉醇以小于300mg/m2的剂量施用。在某些实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以小于1,000mg/m2的剂量施用，和/或白蛋白结合型紫杉醇以小于125mg/m2的剂量施用。在一个实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以等于或小于500mg/m2、400mg/m2、300mg/m2或200mg/m2的剂量施用，和/或白蛋白结合型紫杉醇以等于或小于62.5mg/m2、50mg/m2、40mg/m2、30mg/m2或20mg/m2的剂量施用。在一个实施方案中，其中所述对象是人，吉西他滨以等于或小于900mg/m2、800mg/m2、700mg/m2或600mg/m2的剂量施用，和/或白蛋白结合型紫杉醇以等于或小于110mg/m2、100mg/m2、90mg/m2、80mg/m2或70mg/m2的剂量施用。在某些实施方案中，吉西他滨和/或白蛋白结合型紫杉醇以每2周或更低的(例如每3周、每4周、每6周或每8周或更低的)频率施用。在某些实施方案中，吉西他滨以每天1次、每周4次、每周3次、每周2次或每周1次的频率施用。在某些实施方案中，吉西他滨以每天1次、每周4次、每周3次、每周2次或每周1次的频率给予。在某些实施方案中，白蛋白结合型紫杉醇以每天1次、每周4次、每周3次、每周2次或每周1次的频率给予。在某些实施方案中，吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇以每天1次、每周4次、每周3次、每周2次或每周1次的频率给予。在某些实施方案中，吉西他滨和/或白蛋白结合型紫杉醇每周一次施用。在某些实施方案中，用吉西他滨和/或白蛋白结合型紫杉醇治疗的总持续时间为2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周或大于2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。
在某些实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与适用于所述癌症的(多种)化学治疗药组合施用于患有癌症的对象，所述(多种)化学治疗药可以任选地以适用于所述癌症的剂量和/或施用方案施用。下面提供了适用于各种癌症的化学治疗药以及其剂量和施用方案的非限制性实例。
卵巢癌：以下信息取自
Figure BDA0002426459430000761
(注射用吉西他滨)，礼来公司(Eli Lilly andCompany)，处方信息集锦(Highlights of Prescribing Information)，2017年3月修订，http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdf(上次访问时间为2017年7月27日)。吉西他滨
Figure BDA0002426459430000762
与卡铂组合适用于治疗在基于铂的治疗完成后至少6个月复发的晚期卵巢癌患者。
Figure BDA0002426459430000763
的推荐剂量为1000mg/m2，在每个21天周期的第1天和第8天在30分钟内静脉内输注，在每个21天周期的第1天施用
Figure BDA0002426459430000764
后，与静脉内卡铂(AUC 4)组合施用。
乳腺癌：以下信息取自
Figure BDA0002426459430000765
(注射用吉西他滨)，礼来公司(Eli Lilly andCompany)，处方信息集锦(Highlights of Prescribing Information)，2017年3月修订，http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdf(上次访问时间为2017年7月27日)。吉西他滨
Figure BDA0002426459430000766
与紫杉醇组合适用于先前含蒽环霉素的辅助化学治疗失败后的转移性乳腺癌患者的一线治疗，除非蒽环霉素在临床上有禁忌。
Figure BDA0002426459430000767
的推荐剂量为1250mg/m2，在包括紫杉醇的每个21天周期的第1天和第8天，在30分钟内静脉内施用。紫杉醇可以在第1天以175mg/m2通过静脉内输注施用3小时，然后再施用
Figure BDA0002426459430000768
非小细胞肺癌：以下信息取自
Figure BDA0002426459430000769
(注射用吉西他滨)，礼来公司(Eli Lillyand Company)，处方信息集锦(Highlights of Prescribing Information)，2017年3月修订，http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdf(上次访问时间为2017年7月27日)。吉西他滨
Figure BDA00024264594300007610
与顺铂组合用于不能手术，局部晚期(IIIA或IIIB期)或转移性(IV期)非小细胞肺癌患者的一线治疗。每4周一次的方案：与顺铂治疗组合的
Figure BDA00024264594300007611
的推荐剂量为1000mg/m2，在第1天、第8天和第15天在30分钟内静脉内施用；输注
Figure BDA00024264594300007612
后的第1天，可以100mg/m2静脉内施用顺铂。每3周一次的方案：与顺铂治疗组合的
Figure BDA00024264594300007613
的推荐剂量为1250mg/m2，在第1天和第8天在30分钟内静脉内施用；输注
Figure BDA00024264594300007614
后的第1天，可以100mg/m2静脉内施用顺铂。
胰腺癌：以下信息取自
Figure BDA00024264594300007615
(注射用吉西他滨)，礼来公司(Eli Lilly andCompany)，处方信息集锦(Highlights of Prescribing Information)，2017年3月修订，http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdf(上次访问时间为2017年7月27日)。吉西他滨
Figure BDA00024264594300007616
适用于局部晚期(不可切除的II期或III期)或转移性(IV期)胰腺腺癌患者的一线治疗。
Figure BDA00024264594300007617
适用于先前接受5-FU治疗的患者。
Figure BDA00024264594300007618
的推荐剂量是1000mg/m2，在30分钟内静脉内施用。推荐治疗方案如下：第1-8周--前7周每周给用，然后休息一周；第8周后--在28天周期的第1天、第8天和第15天每周给药。
转移性乳腺癌：以下信息取自
Figure BDA0002426459430000771
(紫杉醇蛋白结合颗粒注射用混悬剂，白蛋白结合型)，Celgene Corporation，处方信息集锦(Highlights of PrescribingInformation)，2015年7月修订，http://www.abraxane.com/wp-content/pi/prescribing-info.html(上次访问时间为2017年7月27日)。
Figure BDA0002426459430000772
适用于治疗转移性疾病的组合化学治疗失败或辅助化学治疗6个月内复发之后的乳腺癌。除非有临床禁忌，否则先前的治疗应包括蒽环霉素。在转移性乳腺癌的组合化学治疗失败或辅助化学治疗6个月内复发后，
Figure BDA0002426459430000773
的推荐治疗方案为每3周在30分钟内静脉内施用260mg/m2。
非小细胞肺癌：以下信息取自
Figure BDA0002426459430000774
(紫杉醇蛋白结合颗粒注射用混悬剂，白蛋白结合型)，Celgene Corporation，处方信息集锦(Highlights of PrescribingInformation)，2015年7月修订，http://www.abraxane.com/wp-content/pi/prescribing-info.html(上次访问时间为2017年7月27日)。
Figure BDA0002426459430000775
与卡铂组合适用于不适合治愈性手术或放射治疗的患者的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的一线治疗。
Figure BDA0002426459430000776
的推荐剂量为100mg/m2，在每个21天周期的第1天、第8天和第15天，在30分钟内通过静脉内输注施用。
胰腺腺癌：以下信息取自
Figure BDA0002426459430000777
(紫杉醇蛋白结合颗粒注射用混悬剂，白蛋白结合型)，Celgene Corporation，处方信息集锦(Highlights of PrescribingInformation)，2015年7月修订，http://www.abraxane.com/wp-content/pi/prescribing-info.html(上次访问时间为2017年7月27日)。
Figure BDA0002426459430000778
与吉西他滨组合适用于胰腺转移性腺癌患者的一线治疗。
Figure BDA0002426459430000779
的推荐剂量为125mg/m2，在每个28天周期的第1天、第8天和第15天，在30-40分钟内通过静脉内输注施用。吉西他滨可以在每个28天周期的第1天、第8天和第15天在
Figure BDA00024264594300007710
之后立即施用。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与免疫调节剂(例如，细胞因子、抗原或检查点靶向剂)组合施用于对象。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与检查点靶向剂组合施用于对象，所述检查点靶向剂例如但不限于，PD-1的拮抗剂、PD-L1的拮抗剂、PD-L2的拮抗剂、CTLA-4的拮抗剂、TIM-3的拮抗剂、GITR的拮抗剂、OX40的拮抗剂、LAG-3的拮抗剂(例如，上述检查点分子中的任一种的拮抗剂可以是针对这些分子的抗体，例如抑制性抗体，抗体片段或小分子)。在一个实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与PD-1的抑制剂、PD-L1的抑制剂或CTLA-4的抑制剂组合施用于对象(其中所述抑制剂可以是拮抗性抗体，抗体片段或小分子)。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与放射治疗(例如，x射线、γ射线或另一种放射源)组合施用于对象。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与手术(例如用于去除部分或全部被治疗的癌性肿瘤的手术)组合施用于对象。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与Treg-抑制剂组合施用于对象。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与T细胞治疗组合施用于对象。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与肿瘤疫苗组合施用于对象。
在具体实施方案中，将本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段与EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼)组合施用于对象。
在某些实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段用于治疗未用细胞周期抑制剂治疗的对象(即，另外的治疗不是抑制细胞周期的药剂)。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段用于治疗未同时(在相同治疗期内)用细胞周期抑制剂治疗的对象(即，未使用抗M(H)DM2/4抗体或其片段和细胞周期抑制剂在相同的时间段，例如一天或一周内治疗对象)。在一个实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段用于治疗先前未接受治疗并且未使用细胞周期抑制剂同时治疗的对象。
在特定的实施方案中，本文所述的抗M(H)DM2/4抗体或其片段可以在第二治疗(例如，化学治疗、放射治疗、手术或本文所述或本领域已知的任何其他疗法)之前、期间或之后。
在某些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的对象在施用抗M(H)DM2/4抗体或其片段之前未接受抗癌治疗。在其他实施方案中，向在施用抗体或片段之前接受了抗癌治疗的对象施用抗M(H)DM2/4抗体或其片段施用于。在特定的实施方案中，向从免疫抑制治疗中恢复或接受免疫抑制治疗的对象施用抗M(H)DM2/4抗体或其片段。
在某些实施方案中，本文提供了包含抗M(H)DM2/4抗体或其片段和一种或多种另外的抗癌剂的试剂盒。在一个实施方案中，本文提供了包含以下的试剂盒：(i)抗M(H)DM2/4抗体或其片段(例如，其为治疗有效量)，和(ii)一种或多种化学治疗药，例如，吉西他滨、紫杉醇或吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇(例如，其为治疗有效量，如本文所述的任何量，当在没有抗M(H)DM2/4抗体或片段的情况下使用一种或多种药物，其可以小于所述一种或多种药物的治疗有效量)。
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。鉴于本文提供的一般描述，可以实践本发明的各种其他实施方案。
8.实施例
本文提供的数据表明，在完整(即，活的和未透化的)癌细胞的质膜表面上，HDM2的特定区段(即，表位)是细胞外可接近的。已经确定三(3)种不同的细胞外可接近的表位。HDM2的细胞外可接近的特定区段包括但不限于NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3肽序列(分别为SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)中存在的表位。这些细胞外可接近的序列是抗HDM2抗体的合适治疗和诊断靶标。因此，出于诊断和治疗(即，抗肿瘤细胞毒性和抑制作用)目的，可以将在其表面膜上表达HDM2的癌细胞用针对HDM2的抗体靶向。
特别地，本文提供的数据表明，选择的HDM2特异性抗体结合于几种啮齿动物和人癌细胞系以及来自人类患者的原代肿瘤细胞的完整细胞的表面膜上的M(H)DM2/4的细胞外可接近的序列。相反，相同的HDM2特异性抗体显示与正常人血液单核细胞的表面膜的最小结合。已发现这些HDM2特异性抗体在体外选择性结合于各种癌细胞，如：完整人黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌细胞。另外，本文提供的数据显示HDM2特异性抗体在体外和体内抑制癌细胞的生长，强烈表明它们可以用作体内治疗剂。来自体内研究并在本文中描述的数据显示，在啮齿动物肿瘤模型中，选择的HDM2特异性抗体抑制肿瘤生长并对肿瘤具有细胞毒性。以下实施例表明，在胰腺癌、肺癌和结肠癌的小鼠模型中，选择的HDM2特异性抗体不仅对肿瘤细胞具有细胞毒性，而且还抑制了肿瘤生长。本文的数据进一步证明仅选择的抗体识别HDM2的细胞外可访问的表位。
实施例中使用的制备抗体的方法：
使用杂交瘤方法产生特异性结合于以下的抗HDM2抗体：(i)NMC-P1，即SEQ ID NO:1的肽(“NMC-100s系列的单克隆抗体”)，(ii)NMC-P2，即SEQ ID NO:2的肽(“NMC-200s系列的单克隆抗体”)，和(iii)NMC-P3，即SEQ ID NO:3的肽(“NMC-300s系列的单克隆抗体”)。使用Sulfo-SMCC方法(Thermo Scientific，目录号22122)将NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3肽偶联到钥孔戚血蓝素(KLH)。简言之，蛋白-NH2是在偶联缓冲液(由制造商提供)中制备的。将二十倍摩尔过量的交联剂添加到蛋白溶液中，并将反应混合物在室温下孵育30分钟。然后使用用偶联缓冲液平衡的脱盐柱除去过量的交联剂。然后将蛋白-SH和脱盐的蛋白-NH2合并、混合并在室温下孵育30分钟。然后通过添加含有浓度为蛋白-SH的巯基的数倍的还原半胱氨酸的缓冲液来终止偶联反应。肽偶联后，通过以100μg/小鼠腹膜内注射，用肽NMC-P1、NMC-P2或NMC-P3免疫小鼠(BALB/c c雌性)。注射加强剂5-7次以激发免疫反应。然后通过小鼠血清的肽-ELISA评价特异性抗体的产生以进行抗体滴定。然后从每只小鼠中收获具有高抗体滴度的小鼠脾脏，并制备脾细胞的单细胞悬液。然后将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(比例为1:5)融合。简言之，将250μl的EDTA添加到脾细胞和骨髓瘤细胞的混合物中。然后将细胞离心并除去上清液。然后使细胞沉淀松动，并在1分钟内沿着管边缓慢分配1mL PEG，并将混合物在37℃水浴中孵育5分钟。然后加入1mL的100x FBS和10mL的IMDM培养基(10％FBS)并在培养箱中放置1小时。然后将细胞离心并除去上清液。然后将细胞沉淀重悬于含IMDM(20％FBS)的HAT融合培养基(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶培养基)中。然后将细胞铺在96孔培养皿中，孵育约10至14天。在10-14天后，当克隆变得可见时，通过ELISA测试每个孔的培养基上清液与其相应的特异性免疫原性肽(NMC-P1、NMC-P2或NMC-P3)的结合。然后选择ELISA阳性孔进行进一步的克隆选择、单细胞亚克隆和单克隆抗体纯化。使用NMC-P1、NMC-P2或NMC-P3肽抗原通过肽ELISA进行单克隆抗体选择。为了进一步选择与肽抗原以及质膜HDM2反应的抗体，还通过细胞-ELISA对完整癌细胞进行结合分析，以进行mAb选择。
产生的抗体的预测反应性：
表1和表2给出了具有不同HDM2同工型/变体的NMC-100s系列、NMC-200s系列和NMC-300s系列的单克隆抗体的预测的反应性。基于相应的同工型是否包含与P1、P2或P3的序列相对应的序列(以及相应的NMC系列mAb结合哪种肽(P1、P2或P3)的知识，基于哪种肽用作哪个系列的免疫原)进行预测。
表1.具有不同的HDM2同工型/变体的NMC-100s系列、NMC-200s系列和NMC-300s系列的单克隆抗体的预测的反应性
Figure BDA0002426459430000801
Figure BDA0002426459430000811
表2.具有不同的HDM2同工型/变体的NMC-100s系列、NMC-200s系列和NMC-300s系列的单克隆抗体的预测的反应性
Figure BDA0002426459430000812
Figure BDA0002426459430000821
Figure BDA0002426459430000831
实施例中使用的抗体：
单克隆抗体NMC-103是结合于NMC-P1(SEQ ID NO:1)的抗体(其为NMC-100s系列的抗体之一)。单克隆抗体NMC-204是结合于NMC-P2(SEQ ID NO:2)的抗体(其为NMC-200s系列的抗体之一)。单克隆抗体NMC-303是结合于NMC-P3(SEQ ID NO:3)的抗体(其为NMC-300s系列的抗体之一)。这些抗体的重链/轻链框架区序列、互补决定区(CDR)序列和可变区序列在以下第8节中列出。
以下抗HDM2抗体用于实施例1-9中所述的实验：(i)纯化的IgG1同种型的NMC-103小鼠单克隆抗体(mAb)(在蛋白G/A柱上纯化单细胞克隆杂交瘤细胞产生的NMC-103mAb)，(ii)纯化的IgG3同种型的NMC-204小鼠mAb(在蛋白G/A柱上纯化由单细胞克隆杂交瘤细胞产生的NMC-204mAb)；(iii)纯化的IgM同种型的NMC-303小鼠mAb(在蛋白G/A柱上纯化由单细胞克隆杂交瘤细胞产生的NMC-303mAb)；(iv)称为“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”的抗HDM2抗体(Abnova，目录号H00004193-M01)；(v)称为“MDM2抗体(D-7)”的抗HDM2抗体(SantaCruz，目录号sc-13161)；(vi)称为“p-MDM2抗体(2G2)”的抗HDM2抗体(Santa Cruz，目录号sc-53368)；(vii)称为“MDM2抗体(SPM344)”的抗HDM2抗体(Santa Cruz，目录号sc-56430)；(viii)称为“MDM2抗体(SMP14)”的抗HDM2抗体(Santa Cruz，目录号sc-965)；(ix)称为“抗MDM2克隆4B2C1.11”的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号MABE331)；(x)称为“抗MDM2克隆3G9”的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号04-1530)；(xi)称为“抗MDM2克隆2A10”的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号MABE281)；(xii)称为“抗MDM2(Ab-1)小鼠mAb(IF2)”的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号OP46)；(xiii)称为“抗MDM2(Ab-3)小鼠mAb(4B11)”的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号OP143)；(xiv)称为“抗MDM2(Ab-4)小鼠mAb(2A9C1.18)”的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号OP144)；(xv)称为“抗MDM2(Ab-5)小鼠mAb(4B2C1.11)”的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号OP145)；(xvi)称为“MDM2抗体(C-18):sc-812”的抗HDM2抗体(Santa Cruz，多克隆，目录号sc-812)；和(xvii)称为“MDM2抗体(N-20):sc-813”的抗HDM2抗体(Santa Cruz，多克隆，目录号sc-813)。
8.1实施例1：HDM2的细胞外可接近的表位的HDM2特异性mAb的选择
利用酶联免疫吸附分析(ELISA)，本文提供的数据显示mAb NMC-103特异性结合于对应于HDM2的氨基酸1-15的肽NMC-P1(SEQ ID NO:1)，而mAb NMC-204特异性结合对应于HDM2的氨基酸15-25的NMC-P2肽(SEQ ID NO:2)，并且mAb NMC-303特异性结合于对应于HDM2的氨基酸475-491的NMC-P3肽(SEQ ID NO:3)。此外，本文提供的免疫印迹分析显示，mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303识别全长重组HDM2蛋白。
肽-ELISA方法：将5μg/ml的NMC-P1、NMC-P2或NMC-P3肽抗原在96孔ELISA板上干燥过夜。然后在室温下，用5％BSA的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)(100μl/孔)溶液封闭板2小时。然后将微孔板孔用300μl冰冷的1x PBS洗涤5次。然后在室温下在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中将适当稀释的单克隆抗体NMC-103、NMC-204或NMC-303与其相应的肽(分别为NMC-P1、NMC-P2或NMC-P3)一起孵育。2小时后，将孔用300μl冰冷的PBS/孔洗涤5次，并加入在PBS-1％BSA溶液中以1:2500至1:5000稀释的100μl二抗(HRP-标记的山羊抗小鼠F(ab’)2H&L交叉吸附二抗(HRP-GaM F(ab’)2)，ThermoFisher，目录号A24524)，并在室温下继续孵育。1小时后，用200μl冰冷的PBS再洗涤孔5次，并向每个孔中加入50μL TMB底物溶液(1-StepTM Ultra TMB-ELISA，ThermoFisher，目录号34028)，并在室温下显色30分钟。通过向每个孔中添加50μL终止溶液(ThermoFisher，目录号SS04)来终止反应，并立即读取每个孔的吸光度，以得到450nm处的光密度(OD)。
竞争分析：对于肽抗原结合竞争实验，将1μl/ml的mAb NMC-103与10μl/ml的NMC-P1、NMC-P2或NMC-P3在室温下预孵育1小时。然后如上所述将mAb NMC-103与包被有NMC-P1的ELISA板一起孵育。
蛋白质印迹：对于免疫印迹，在8-16％十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上分离1μg/孔的重组HDM2蛋白(GST标记，Abcam，目录号ab188727)，然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用5％牛奶封闭，然后与1μg/ml的单克隆抗体NMC-103、NMC-204或NMC-303在1％牛奶的PBS溶液中孵育2小时。然后将膜洗涤3次(每次10分钟)，并与在1％BSA-PBS中以1:5000稀释的相应的HRP-偶联二抗(山羊抗小鼠IgG(H&L)，F(ab’)2Frag交叉吸附HRP(HRP-GaM F(ab’)2)，ThermoFisher，目录号A24524)孵育1小时。然后将膜洗涤3次，并与Pierce ECL Plus蛋白质印迹底物ThermoFisher，目录号#32132)孵育10分钟，然后在LICOR扫描仪上显色。
图1所示的肽-ELISA实验显示单克隆抗体(mAb)NMC-103、NMC-204和NMC-303与其相应的肽抗原的选择性和特异性结合。图1A显示NMC-103结合于NMC-P1肽，而NMC-204不结合于NMC-P1。图1B显示mAb NMC-204结合于NMC-P2肽，而mAb NMC-103不结合于NMC-P2。图1C显示mAb NMC-303结合于NMC-P3肽，而NMC-204不结合于NMC-P3。因此，肽-ELISA结果显示mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303中的每一个在ELISA板上选择性结合于其相应的抗原肽，而不结合于其他肽。图1D显示，虽然mAb NMC-103结合于NMC-P1，但NMC-P1肽与mAb NMC-103的预孵育消除了板上NMC-103与NMC-P1肽的结合。相反，将mAb NMC-103与NMC-P2或NMC-P3中的任一者一起预孵育不会影响mAb NMC-103与NMC-P1的结合。这些实验证明了mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303对其相应的肽抗原的特异性。
图2中免疫印迹实验的结果显示，mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303与重组全长HDM2蛋白反应。重组蛋白在其N端具有GST标签，这使分子量达到约83kD。免疫印迹的第2泳道显示针对人源MDM2(MDM2(D-7)；Santa Cruz，目录号sc-13161)的氨基酸100-320产生的市售抗体对全长重组HDM-2蛋白的反应性。免疫印迹的第3泳道显示mAb NMC-103与约83kD处的单个条带的反应性，其对应于重组HDM2-GST蛋白。免疫印迹的第4泳道显示mAb NMC-204结合于在约83kD处的单个条带，其对应于重组HDM2-GST蛋白。免疫印迹的第5泳道显示mAb NMC-303与在83kD处的重组HDM2-GST蛋白的反应性。相反，在第1泳道中，对照小鼠IgG(Abcam，目录号ab18447)不与重组HDM2-GST蛋白反应。此处提供的数据进一步证明了mAbNMC-103、NMC-204和NMC-303识别全长HDM2。
8.2实施例2：HDM2特异性抗体结合于来自不同啮齿动物和人类癌细胞系和新分离 的原代人癌细胞的完整癌细胞上的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位而不结合于正常细胞
一般说明：利用ELISA，本文提供的数据证明了mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303在NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3序列内与分别在人乳腺癌细胞、人三阴性乳腺癌细胞、人黑色素瘤细胞、化疗抗性人卵巢癌细胞以及原发患者来源的人卵巢癌细胞、人和小鼠胰腺癌细胞、小鼠结肠癌细胞和小鼠肺癌细胞的质膜上的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位结合。本文提供的数据还显示了这些mAb与癌细胞而非正常未转化细胞的选择性结合。此外，肽-抗原竞争结果表明，这些mAb中的每一种均特异性结合于其相应的质膜M(H)DM2/4的NMC-P1、NMC-P2或NMC-P3区。
细胞-ELISA方法：将8,000-10,000个细胞/孔的96孔微孔板培养过夜。第二天，将未结合的细胞用无菌1x PBS冲洗掉。将每个孔中的细胞用新制备的4％缓冲的多聚甲醛(pH7.2)固定1小时，然后用1x PBS洗涤3次。然后在室温下用5％BSA的PBS溶液(100μl/孔)封闭孔2小时。然后将微孔板孔用300μl冰冷的1x PBS洗涤5次。然后将1μg/mL的mAb NMC-103、NMC-204或NMC-303在1％BSA/PBS中与各种癌症或正常未转化细胞在室温下孵育2小时。然后将孔用300μl冰冷的1x PBS洗涤5次，并以100μl/孔加入在含1％BSA的PBS中以1:2500或1:5000稀释的相应二抗HRP-GaM F(ab’)2，在室温下放置1小时，然后用300μl冰冷的1x PBS洗涤5次。然后将50μL的TMB底物溶液(1-StepTM Ultra TMB-ELISA，ThermoFisher，目录号34028)添加到每个微孔板孔中，并在室温下孵育30分钟。通过向每个孔中添加50μL终止溶液(ThermoFisher，目录号SS04)终止反应，并在OD450 nm下测量每个孔的吸光度。将每个实验孔的吸光度值校正为从每个实验中包括的同种型-相同的mAb处理的孔中获得的吸光度值。结果因此表示为“相对结合”。
图3-5显示mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303与不同类型的人(A)和啮齿动物(B)癌症的完整细胞的相对结合。图3显示了mAb NMC-103对人乳腺癌MCF-7细胞，人三阴性乳腺癌HCC1806细胞，人胰腺癌MIA PaCa-2细胞，阿霉素、美法仑和顺铂抗性的人卵巢癌OVCAR-3细胞，原发患者来源的人卵巢癌OVCA4细胞，人黑色素瘤A2058细胞，人葡萄膜黑色素瘤92.1细胞，小鼠结肠癌MC-38细胞，小鼠Lewis肺LL/2细胞和小鼠胰腺Panc02细胞的反应性。图4显示了NMC-204单克隆抗体对人乳腺癌MCF-7细胞，人三阴性乳腺癌HCC1806细胞，人胰腺癌MIA PaCa-2细胞，人卵巢癌OVCAR-3细胞，原发患者来源的人卵巢癌OVCA4细胞，人黑色素瘤A2058细胞，人葡萄膜黑色素瘤92.1细胞，小鼠结肠癌MC-38细胞，小鼠Lewis肺LL/2细胞和小鼠胰腺Panc02细胞的反应性。图5显示了NMC-303单克隆抗体对人乳腺癌MCF-7细胞，人三阴性乳腺癌HCC1806细胞，人胰腺癌MIA PaCa-2细胞，人卵巢癌OVCAR-3细胞，原发患者来源的人卵巢癌OVCA.4细胞，人黑色素瘤A2058细胞，人葡萄膜黑色素瘤92.1细胞，小鼠结肠癌MC-38细胞，小鼠Lewis肺LL/2细胞和小鼠胰腺Panc02细胞的反应性。
图6显示NMC-204不与正常人PBMC反应。与癌细胞相反，mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303均不结合于正常完整细胞(NMC-103和NMC-303的数据未显示)。本文提供的数据表明，尽管mAb NMC-204与人胰腺癌MIA PaCa-2细胞反应，但在将mAb NMC-204与新分离的正常人外周血单核细胞(PBMC)孵育时，在背景以上未见到结合。此外，图6表明，尽管mAb NMC-204不与正常人PBMC反应(图6左；白色柱状图)，但这些细胞对针对T细胞的细胞表面标志物CD3e的mAb具有强反应性(图6左；带阴影的条形图)。
图7描绘了mAb NMC-103和NMC-204饱和曲线。图7A显示，随着抗体浓度的增加，mAbNMC-103与完整的MIA PaCa-2细胞的细胞-ELISA结合增加。然而，这种结合在高于50μg/mL的mAb NMC-103浓度时达到了平衡，这表明特异性抗体NMC-103可使抗原结合位点饱和。此外，图7B描绘了mAb NMC-204与完整的MIA PaCa-2细胞的结合饱和曲线。在高于50μg/mL的mAb NMC-204浓度下，mAb NMC-204与其在完整MIA PaCa-2细胞上的抗原的结合达到饱和，这表明mAb NMC-204的抗原位点结合饱和。
8.3实施例3：mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303分别对完整癌细胞上的HDM2的细胞 外可接近的NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3序列具有特异性
图8所示的数据显示mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303对在癌细胞膜上的细胞外可接近的HDM2的NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3序列的特异性。图8A显示了mAb NMC-103与完整人胰腺癌MIA PaCa-2细胞的结合(左，实心条)。当mAb NMC-103与可溶性NMC-P1竞争时，单克隆抗体NMC-103与其在MIA PaCa-2细胞表面质膜上可接近的HDM2表位的结合被完全消除(中间栏，实心条)。相反，与NMC-P2的竞争对NMC-103与结合于其且在MIA PaCa-2细胞的细胞表面上可接近的HDM2的表位的反应性没有任何影响(实心，填充条)。
另一方面，如图8B所示，mAb NMC-204与整MIA PaCa-2细胞的反应性与NMC-P2肽竞争，而不与NMC-P1竞争，表明在MIA PaCa-2细胞质膜上表达的HDM2的另一种细胞外可接近的表位/肽的表位特异性。
通过mAb NMC-303与完整MIA PaCa-2的结合与NMC-P3肽竞争而不与NMC-P2竞争的观察结果，进一步扩展了对新产生的mAb对HDM2上某些表位的特异性的观察结果(图8C)。综上所述，这些数据表明mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303对HDM2的3种不同的细胞外可接近的序列(即，分别为NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3)的特异性。
如图9所示，当将mAb NMC-103与全长重组HDM2预孵育时，抗体与完整MIA PaCa-2细胞的结合降低。该结果进一步证实了NMC抗体与HDM2的特异性结合。
8.4实施例4：质膜标志物抗体，即抗体NMC-103和抗体NMC-204使完整细胞的质膜 表面染色，而细胞内标志物抗体不使其染色.
本文提供的数据(图10)显示，选择的HDM2特异性抗体结合于用EDTA(10mmols；pH7.2；5min，37℃)处理的完整癌细胞(人胰腺MiaPaCa-2细胞s)的质膜上的细胞外可接近的HDM2。因此，EDTA处理似乎对癌细胞表面膜上的HDM2的表达影响很小或没有影响，强烈表明HDM2蛋白抗原是不可或缺的膜蛋白。此处提供的其他数据表明，针对质膜标志物，如E-钙粘素(Transduction Lab，目录号C37020)的抗体结合于完整细胞，而对位于细胞内的标志物，如细胞色素C(Santa Cruz，目录号sc-13156)具有特异性的抗体由于完整细胞中细胞内区室的不可接近性而无法结合其靶标。
8.5实施例5：完整癌细胞的细胞外蛋白酶消化去除了完整癌细胞质膜上M(H)DM2 的细胞外可接近的序列
分别针对HDM2的氨基酸1-15(NMC-P1)、15-25(NMC-P2)和475-491(NMC-P3)产生mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303，并且其对HDM2具有高度特异性。如图2的免疫印迹所示，所有三种mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303均识别并结合于纯化的HDM2蛋白，从而提供了分别由NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3中的三种mAb识别的独特抗原表位是完整HDM2的实际结构的证据。图3-5和图8中的细胞-ELISA的结果通过提供M(H)DM2表位在完整的啮齿动物和人癌细胞的表面膜上细胞外表达的证据，使观察结果更进一步：(1)mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303结合于完整癌细胞(图3-5)；(2)每种mAb的结合都被其特异性肽有效竞争，但未被其他肽竞争(图8)；(3)NMC-mAb的结合也被完整HDM2蛋白有效竞争(图9)；(4)几乎看不到mAb NMC-103、NMC-204或NMC-303与完整正常人PBMC结合(图6)。
为了进一步巩固M(H)DM2在癌细胞表面膜上的表达的发现，在蛋白酶处理细胞之前和之后，通过间接免疫荧光分别检查mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303与癌细胞的结合。细胞外蛋白酶消化已被证实是评价质膜蛋白的细胞表面定位的有力手段(Besingi和Clark,2015,Nat.Protoc.10(12):2074–2080；Schülein等人,1996,J.Biol.Chem.271(46):28844–28852)：蛋白酶处理后，细胞表面抗原特异性抗体与细胞的结合丧失，不仅表明该抗原易于蛋白水解，而且最重要的是，该抗原暴露在细胞的细胞外表面。因此，通过抗原对胰蛋白酶消化的敏感性来评价细胞外展示的M(H)DM2蛋白抗原，尤其是具有NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3的氨基酸序列的细胞外展示的M(H)DM2蛋白抗原的可接近性。然后如上所述使用细胞ELISA和HRP反应性在OD450 nm下检查胰蛋白酶对mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303结合的作用。
流式细胞术方法：用EDTA(10mmols；pH7.2；5min，37℃)或胰蛋白酶(Gibco TrypLEExpress)释放允许在25cm2组织培养瓶中生长至约80％汇合的细胞，在室温下用新制备的4％缓冲(pH 7.4)多聚甲醛固定1小时，用大量冰冷的PBS洗涤几次，并在室温下用5％的人血清白蛋白的PBS溶液封闭30分钟(完整，非透化细胞)。建立活力后，将细胞数调节至106个细胞/ml，并保存在冰冷的PBS中直至染色。用EDTA或胰蛋白酶释放另一组相同的细胞，并如上所述用4％缓冲的多聚甲醛固定，然后用5％人血清白蛋白的PBS溶液洗涤并封闭，并分别用Triton X-100(0.1％的PBS溶液)(International Biotechnologies Inc.07100)在室温下处理5分钟，以进行膜透化。用PBS冲洗掉Triton X-100溶液后，将细胞调节至106个细胞/ml，并保存在冰冷的PBS中。然后将来自每种制备物的细胞(106个/ml)与5μg/ml Na+/K+ATP酶α-1的mAb(Abcam，目录号ab2826)，5μg/ml mAb NMC-103或5μg/ml mAb NMC-204在室温下一起孵育90min。一抗孵育后，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，然后与兔抗小鼠PE-Cy5标记的二抗(PE-Cy5-RaM IgG(H&L)；Invitrogen，目录号M35018)在室温下孵育。60分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，并进行流式细胞术分析(BD Canto流式细胞术)。建立背景荧光的对照包括分析未染色细胞的样品以及在与实验样品中使用的相同条件下用二抗处理过的细胞的样品。
为了评价完整细胞上抗体的细胞外与细胞内可接近性，使用完整人胰腺癌MiaPaCa-2细胞测试抗体与质膜标志物E-钙粘素(Transduction Lab C37020)的结合以及抗体与细胞内蛋白细胞色素C(santa cruz sc-13156)的结合。图10中的细胞-ELISA结果表明E-钙粘素抗体与完整的EDTA释放的MiaPaCa-2细胞的结合(左起第一条)。相反，细胞色素C的mAb仅显示与EDTA释放的细胞的最小结合(左起第二条)，这表明完整细胞中的细胞内靶标对大分子如抗体的不可接近性。另一方面，mAb NMC-103和NMC-204均结合于完整的EDTA释放的MIAPaCa-2细胞，为它们与存在于HDM2的细胞外可接近的序列中的表位的相互作用提供了有力证据。
为了进一步验证质膜M(H)DM2的表位实际上是癌细胞上的细胞外可接近的序列，在EDTA与胰蛋白酶处理条件下，在小鼠Lewis肺LL/2癌细胞上进行了mAb NMC-103、NMC-204和NMC-303的结合。还对完整和透化的细胞测试了这两种条件。图11A、B和C图分别显示了用mAb NMC-103、NMC-204和抗Na+/K+ATP酶α-1染色的细胞％的流式细胞术数据。每种抗体与来自以下四个处理条件的细胞反应：EDTA处理的完整细胞、EDTA处理的透化细胞、胰蛋白酶处理的完整细胞、胰蛋白酶处理的透化细胞。EDTA处理的完整细胞显示用mAb NMC-103(70.4％)、NMC-204(51.2％)和抗Na+/K+ATP酶α-1抗体(29.9％)的染色。当EDTA处理的细胞被透化时，用NMC-103、NMC-204和抗Na+/K+ATP酶α-1的染色分别增加至75.8％、52.85和63.8％。然而，当与EDTA处理的细胞相比时，由于抗体识别表位的细胞外蛋白酶消化，mAbNMC-103、NMC-204和抗Na+/K+ATP酶α-1与用胰蛋白酶处理的完整细胞的结合分别降低至36.8％、27％和20.5％。然而，当胰蛋白酶处理的细胞被透化时，上述结合的减少被抗体对细胞内MDM2或Na+/K+ATP酶α-1的反应性弥补。综合起来，本文提供的结果进一步证明了完整癌细胞上的跨膜M(H)DM2的细胞外序列的可接近性，其可以通过细胞外蛋白酶处理而裂解。
8.6实施例6：特异性HDM2抗体在体外抑制完整癌细胞的生长
本文提供的数据证明识别HDM2的细胞外可接近的序列的抗体能够在体外抑制癌细胞的生长。
所使用的方法：将人胰腺癌MIAPaCa-2细胞(8,000个细胞/孔)分别与1、5和10μg/mL的mAb NMC-103、NMC-204和抗细胞色素C抗体(Santa Cruz，目录号sc-13156)预孵育。然后在多种浓度下的抗体之一的存在下，将细胞一式三份铺在96孔细胞培养板中过夜。第二天，对每个板孔进行形态学分析，并使用EVOS FL显微镜从每个孔中拍摄照片。还进行细胞计数，并将活细胞数绘制为对照的百分比。
图12(AD)显示用mAb NMC-103或NMC-204处理的人胰腺癌MIAPaCa-2细胞表现出浓度依赖性生长抑制，而针对细胞内标志物(即细胞色素C)的抗体对这些癌细胞的生长没有影响。如图12A所示，用1μg/mL(上图，左图)、5μg/mL(上图，中图)和10μg/mL(上图，左图)mAbNMC-103处理的MIAPaCa-2细胞显示出增加的抑制其生长的作用。图12B显示了用1、10和20μg/mL的mAb NMC-204处理的细胞的图像，显示了细胞生长的浓度依赖性抑制。相比之下，图12C显示在1、10和20μg/mL浓度中任一种下用针对细胞色素C的抗体处理MIAPaCa-2细胞对这些细胞的生长没有影响，所述细胞色素C用作细胞内标志物对照。图12D定量了mAb NMC-103在1μg/mL(65％)、5μg/mL(84％)和10μg/mL(91％)下(黑色实线)和NMC-204在1μg/mL(65％)、5μg/mL(73％)和10μg/mL(77％)下(黑色虚线)的生长抑制作用。相比之下，用针对细胞色素C(细胞内靶标；Santa Cruz，目录号sc-13156)的抗体处理在1μg/mL(100％)、5μg/mL(100％)和10μg/mL(104％)(灰色实线)下未显示生长抑制迹象。
8.7实施例7:HDM2特异性抗体引发针对癌细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)
本文提供的数据显示，HDM2特异性抗体不仅能够结合于癌细胞表面膜上HDM2的细胞外可接近的序列，而且还能在新鲜正常人血清(NHS)的存在下引发强力的细胞毒性作用。在胰腺癌细胞以及正常人纤维母细胞中测量了细胞毒性作用。当在NHS存在下用mAb NMC-103处理人胰腺癌MIAPaCa-2细胞时，本文提供的数据证明了一种这样的细胞毒性作用。
所使用的方法：将接种在24孔培养皿中的细胞在提供5％CO2–95％空气混合物的湿润气氛中于37℃下生长过夜。第二天，将细胞用冰冷的PBS彻底洗涤，并与在含有1％BSA的培养基中稀释至最终抗体浓度为30μg/ml的HDM2特异性mAb NMC-103一起孵育。30分钟后，在含有1％BSA和1％碘化丙啶(PI)溶液的培养基中，以1:10的终浓度将NHS加入细胞中。然后将细胞与NHS孵育2小时，并使用EVOS FL荧光显微镜(Life Technologies)拍摄图像。
图13显示HDM2特异性mAb NMC-103对人胰腺细胞的细胞毒性作用。在NHS的存在下，mAb NMC-103触发癌细胞中补体介导的细胞毒性，导致癌细胞死亡，如细胞死亡标志物碘化丙啶(PI)的核摄取所证明。图13C提供了针对人胰腺癌细胞的HDM2特异性抗体补体依赖性细胞毒性(CDC)的定量示意图。与在任何抗体不存在的情况下用NHS处理的细胞相比，在NHS的存在下用mAb NMC-103处理的细胞(图13B)在处理后2小时内显示出细胞毒性(图13A)。用抗细胞色素C抗体或用在NHS存在下未经处理的细胞进行对照实验。
8.8实施例8：其他抗HDM2 mAb抗体与NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3以及与完整癌细胞 的结合的评价
存在许多可商购的HDM2特异性单克隆抗体。为了评价市售mAb与HDM2的结合，我们利用肽和细胞-ELISA测试了许多这样的mAb与完整癌细胞的结合。这些mAb包括针对来自N端或C端的多个区域或HDM2蛋白的中间的区段产生的抗体，并针对其与新确定的细胞外可接近的NMC-P1和NMC-P2序列以及完整癌细胞的结合进行了测试。
表3总结了经测试的市售mAb，产生这些mAb的公司以及针对其产生mAb的HDM2的氨基酸残基。
表3.测试的市售单克隆抗体
Figure BDA0002426459430000921
Figure BDA0002426459430000931
利用肽-ELISA，图14A和14B显示缺乏这些mAb中的任一种与NMC-P1或NMC-P2中任一种的结合。相反，NMC-103和NMC-204分别显示出与NMC-P1和NMC-P2的强结合。
在这些实验中，进一步评价了HDM-2结合成分(如肽，例如PNC-27)是否干扰mAb抗体与NMC-P1和NMC-P2的结合。尽管尚不清楚PNC-27和PNC-28肽的HDM2结合成分在HDM2上的确切结合位置，但据报道它在HDM2的氨基酸25-109内结合(Do等人,2003,Oncogene 22(10):1431-1444(“Do 2003”)；Chène,2003,Nat.Rev.Cancer 3(2):102-109)。为了排除PNC-27和PNC-28肽与NMC-P1或NMC-P2结合，通过肽-ELISA评价肽与这些HDM2序列的结合。如图14A和14B所示，PNC-27(10μg/mL)不与NMC-103和NMC-204(1μg/mL)分别与NMC-P1和NMC-P2的结合竞争。发现PNC-27不结合到HDM2的NMC-P1或NMC-P2区域。总体而言，这些观察结果表明PNC-27的HDM2结合成分不与NMC-P1或NMC-P2反应。此外，已经证明PNC-27和PNC-28的HDM-2结合成分本身不具有抗癌活性，仅当附着于膜驻留肽(MRP或穿透素序列)时才具有活性(参见Kanovsky 2001，Do 2003和Bowne 2008)。
在通过细胞-ELISA分析mAb的过程中，尽管事实是测试的市售抗体均未结合NMC-P1或NMC-P2中的任一种，但“抗MDM2(Ab-5)小鼠mAb(4B2C1.11)”的针对HDM2的氨基酸残基19-50产生的抗HDM2抗体(EMD Millipore，目录号OP145)和称为的“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”的抗HDM2抗体(Abnova，目录号H00004193-M01)被确定为与完整癌细胞具有反应性(参见图15A，显示MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7的数据)。针对全长HDM2的氨基酸101至200产生MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7。因此，数据表明除了NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3以外，HDM2的表位在癌细胞上可能是细胞外可接近的，以用于结合。在类似的实验中，确定了两种不与完整癌细胞反应的HDM2特异性单克隆抗体(图15B)。一种mAb是抗HDM2抗体，称为“抗MDM2(Ab-4)小鼠mAb(2A9C1.18)”(EMD Millipore，目录号OP144)，其针对全长HDM2(SEQ IDNO:4)的氨基酸153至222产生，包括一个核定位信号(NLS)和一个核输出信号(NES)。不与完整癌细胞膜反应的另一种HDM2特异性mAb是抗HDM2抗体，称为“抗MDM2(Ab-1)小鼠mAb(IF2)”(EMD Millipore，目录号OP46)，其针对HDM2的氨基酸26-169产生(图15B)。
8.9实施例9：靶向癌细胞中HDM2的细胞外可接近的序列的抗体的体内抗肿瘤作用
如上所述，存在在癌细胞上细胞外可接近的HDM2的选择的表位。本文描述了HDM2的三(3)个这样的细胞外可接近的区段，即NMC-P1(SEQ ID NO:1)、NMC-P2(SEQ ID NO:2)和NMC-P3(SEQ ID NO:3)。本文的数据证明针对这3个区段产生的选择的抗体选择性地和特异性地与各种类型的癌症结合，但不与正常的健康细胞结合(图3-9)。此外，本文提供的结果证明了癌细胞上的HDM2的这3个区段的细胞外可接近性(图10和11)。此外，本文的数据显示，HDM2特异性抗体在体外对癌细胞具有生长抑制和细胞毒性作用。最后，在体内评价了HDM2特异性抗体的抗肿瘤活性。例如，测试了mAb NMC-103和NMC-204对肺癌、结肠癌和胰腺癌的功效。
所使用的方法(肺癌、结肠癌和胰腺癌的同基因小鼠模型)：为了研究HDM2特异性抗体对肺、结肠和胰腺肿瘤的体内抗肿瘤作用，使用三种众所周知的肺癌、结肠癌和胰腺癌的同基因小鼠模型(Sharma等人,1999,J.Immunol.163(9):5020-5028；McIntyre,2015,Bioassays 37(8):909–920；Li,等人,2015,Sci.Rep.5:7856)。通过在8周龄雌性C57BL/6小鼠(n＝6-7)的右侧腹中植入小鼠Lewis肺癌LL/2细胞(2.5x105个细胞/小鼠)、小鼠结肠癌MC-38细胞(5x105个细胞/小鼠)或小鼠胰腺癌Panc-2细胞(2x106个细胞/小鼠)来制备皮下肿瘤。肿瘤植入后，将小鼠放回各自的笼子中。从肿瘤植入后第7天开始，用数字卡尺每周两次测量肿瘤体积。在MC-38和Panc-2研究的情况下，当肿瘤达到平均70-80mm3时就开始治疗。在LL/2研究的情况下，肿瘤细胞接种和治疗同时开始。在肿瘤植入后为小鼠配备微芯片并登记。记录肿瘤体积测量值和体重，并将小鼠随机分为以下组，其接受：A)0.4mg/kg(每周3次，持续3周)、2mg/kg(每周2次，持续3周)或4mg/kg(每周2次，持续3周)的mAb NMC-103；B)0.4mg/kg(每周3次，持续3周)的NMC-204；C)0.4mg/kg(每周3次，持续3周)或4mg/kg(每周2次，持续3周)的同种型对照小鼠IgG1(Abcam，目录号ab18447)或IgG3(Abcam，目录号ab18392)；D)吉西他滨(25mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)，每周2次，持续3周；或E)吉西他滨(25mg/kg)、白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)和mAb NMC-103(2mg/kg；每周2次，持续3周)或(10mg/kg；每周2次，持续3周)的组合。对所有肿瘤进行皮下注射，并通过腹膜内注射进行所有治疗。对任何表现出长期不良临床症状或体重减轻相对于第0天的体重超过15％的小鼠安乐死。用HDM2特异性抗体、同种型对照小鼠抗体和标准治疗(吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇)治疗后进行肿瘤测量，结果如图16-19所示。
图16显示mAb NMC-204(0.4mg/kg，每周3次，持续3周；虚线)在同时接种有LL/2Lewis肺癌细胞的小鼠中的抗肿瘤功效。如肿瘤体积测量图所示，到第21天，与同种型对照小鼠IgG3(2138mm3)相比，NMC-204治疗使肿瘤体积减小(1446mm3)。这些结果证明了抗HDM2特异性抗体(即，mAb NMC-204)靶向肺癌细胞上的HDM2的细胞外可接近的表位的功效。对于未来的患者治疗，可以将给药剂量和给药方法进一步扩展到例如口服或静脉内递送药物，以获得最佳效果。
图17和18分别显示mAb NMC-103和NMC-204对结肠癌的MC-38同基因小鼠模型的功效。如图17A所示，用mAb NMC-103(0.4mg/kg；每周3次，持续2.5周；虚线)治疗18天的小鼠生长至1268mm3，而用同种型对照小鼠IgG1治疗的小鼠达到2205mm3的肿瘤体积(实线)。此外，公认的细胞增殖标志物Ki67蛋白的免疫组化染色(Li等人,2015,Mol.Med.Rep.11(3):1566-72)，显示用mAb NMC-103治疗的小鼠只有5％的肿瘤细胞的Ki67染色为阳性，而用同种型对照抗体治疗的小鼠中80％的肿瘤的Ki67染色为阳性(图17B)。这些结果进一步证实并与体外观察到的生长抑制结果一致(图12)。此外，评价了另一种HDM2特异性抗体mAbNMC-204的抗肿瘤功效，该抗体识别膜HDM2的不同的细胞外可接近的区段，即NMC-P2(SEQID NO:2)。如图18A所示，用mAb NMC-204(0.4mg/kg；每周3次，持续3周)治疗的小鼠的肿瘤体积增长到1670mm3，而对照抗体治疗组的肿瘤体积达到2555mm3。此外，图18B显示，用NMC-204治疗的小鼠有30％的肿瘤细胞的Ki67为阳性染色，而对照组的小鼠有约80％的肿瘤细胞的Ki67为阳性染色，证明了NMC-204治疗对肿瘤生长的抗增殖作用。
进一步比较了HDM2特异性抗体治疗和标准化学治疗的功效。利用胰腺癌的Panc-2同基因小鼠模型，图19显示了NMC-103与胰腺癌标准治疗药物：吉西他滨(G)+白蛋白结合型紫杉醇(nP)组合的协同作用。如图19的肿瘤体积图所示，当小鼠中的肿瘤达到约70mm3时，将小鼠分为4组(n＝6)，其接受：A)同种型对照小鼠IgG1(2mg/kg)；B)低剂量吉西他滨(25mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)；C)NMC-103(2mg/kg)；或D)低剂量吉西他滨(25mg/kg)、白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)和NMC-103(2mg/kg)的组合。每周2次腹膜内注射所有药物，持续3周。在第19天接受第6剂后，停止治疗2周。到第35天，接受同种型对照IgG的组(A组)或接受低剂量吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合的组(B组)的小鼠分别达到平均2175mm3(空心三角形)和2314mm3(空心圆形)。这两个组均已达到发病标准并被终止。到第35天，接受mAb NMC-103(2mg/kg)的C组小鼠中的肿瘤仅达到平均1523mm3(实心三角形)，而接受了NMC-103(2mg/kg)、吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合的D组小鼠的肿瘤的测量平均值为797mm3(实心圆形)。然后用NMC-103(10mg/kg)、吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合治疗这两组小鼠(C和D组)，每周2次，持续2周。如图19所示，两组(C和D)的肿瘤在2周内达到未发现可测量的肿瘤的程度。
利用以上讨论的胰腺癌的Panc-2同基因小鼠模型进一步在体内评价了NMC-103的抗肿瘤功效以及其与胰腺癌标准治疗吉西他滨(G)和白蛋白结合型紫杉醇(nP)的组合的抗肿瘤功效。在这项Panc-2研究中，Panc-2细胞接种后开始治疗，并且当肿瘤达到80-100mm3时，在比用于图19的研究更多数量的小鼠(n＝8只/组)中以10mg/kg施用mAb NMC-103，每周两次。
图27显示了研究结果，其中当Panc-02肿瘤的大小达到80-100mm3时，将小鼠随机分为4组(n＝8只/组)，分别接受：A)同种型对照小鼠IgG1(10mg/kg)；B)低剂量吉西他滨(25mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)；C)NMC-103(10mg/kg)；或D)低剂量吉西他滨(25mg/kg)、白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg)和NMC-103(10mg/kg)的组合。每周两次腹膜内注射所有药物，持续4周。到第30天，接受同种型对照抗体的A组小鼠的平均肿瘤尺寸达到2028mm3，并被终止。到第34天，B组中接受低剂量标准G&nP化学治疗的一半小鼠死亡(n＝4)，而另一半(n＝4)的肿瘤平均尺寸达到1654mm3。相比之下，C组中所有接受NMC-103的小鼠(n＝8)均存活，其平均测量值为230mm3，这是由于最初肿瘤接种部位的瘢痕和炎症所致。另一方面，在接受NMC-103与G+nP组合的D组中，有一只小鼠死亡，该组其余小鼠(n＝7)的平均测量值为117mm3，这是由于肿瘤接种部位的瘢痕和炎症所致。然后将C组(n＝8)和D组(n＝7)的小鼠再饲养4周(自研究开始以来62天)，不进行另外的药物治疗，在此期间，没有观察到超过最初的疤痕尺寸的肿瘤生长迹象，表明这些小鼠中没有肿瘤。
如图28所示，Kaplan Meier生存分析显示，在图27中描述的实验条件下，与单独的化学治疗或对照抗体相比，接受单独的或与化学治疗组合的NMC-103的小鼠中有显著的生存益处。该研究证实了以上结合图19讨论的观察结果以及NMC-103抗体用作单臂或与化学治疗组合的能力。
为了进一步评价NMC-103的长期抗肿瘤作用的潜在免疫学反应，如图27所示，在研究开始后第62天，通过在左背侧上进行第二轮Panc-2接种(皮下注射2x106个细胞/小鼠)，对之前接受过G+nP组合的小鼠、C组小鼠(先前已用NMC-103治疗的小鼠)和D组小鼠(已用NMC-103+G+nP组合治疗的小鼠)进行再激发。监测肿瘤生长10天，此时，在来自B组的小鼠中测得的肿瘤为90mm3(图29)。相反，如图29所示，在先前已接受NMC-103抗体的两组(C和D组)的小鼠中未观察到肿瘤。这些研究证明了靶向M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体能够强大地激活宿主免疫系统并提供针对癌症的长期抗肿瘤免疫力。
为了进一步确立NMC-103抗体在治疗大尺寸肿瘤(即晚期癌症)中的有效性，在另一项Panc-2研究中(结果显示在图30中)，用胰腺癌标准治疗方法(吉西他滨(25mg/kg)+白蛋白结合型紫杉醇(5mg/kg))治疗小鼠19天，此时肿瘤尺寸达到约450mm3。然后将小鼠随机分为两组，分别接受单剂量的：A)同种型对照小鼠IgG1(10mg/kg)或B)NMC-103(10mg/kg)。如图30所示，单次i.p.注射NMC-103在治疗后6天使肿瘤尺寸减小近一半(从438mm3减小到233mm3)。
为了进一步评价NMC-103的剂量依赖性抗肿瘤作用，在另一项研究中，重建小鼠(n＝5)的MC-38同基因肿瘤，并与图17的研究类似地进行治疗，其中有以下改变：抗体浓度从0.4mg/kg增加到10mg/kg。如图31所示，与用0.4mg/kg的NMC-103治疗的小鼠相比，每周两次连续3周用10mg/kg的NMC-103治疗的小鼠导致更大的肿瘤减小(图17)。这些数据支持与M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位结合的抗体的剂量依赖性抗肿瘤作用。
利用结肠癌的另一个同基因小鼠模型CT-26(Selby等人,2016,PLoS One.9；11(9):e0161779)评估单克隆抗体NMC-303的嵌合形式的抗肿瘤功效。为了产生单克隆抗体NMC-303的嵌合形式，在小鼠NMC-303(具有SEQ ID NO:40的重链可变区和SEQ ID NO:41的轻链可变区)上进行同种型类别转换，以将其从小鼠IgM转化为嵌合IgG1。将小鼠重链和轻链可变区(分别为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41)克隆到人Igγ-1链和人Igκ链中作为恒定区。总共八(8)只BALB/c小鼠皮下注射了CT-26(800,000个细胞/小鼠)。然后将小鼠分为两组(n＝4)，接受：A)对照抗体(10mg/kg)或B)单克隆抗体NMC-303的嵌合形式(10mg/kg)，每周两次，持续3周。图32A显示，在肿瘤接种后第24天，用单克隆抗体NMC-303的嵌合形式(10mg/kg)治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸达到726mm3，而用对照抗体(10mg/kg)治疗的小鼠平均肿瘤尺寸为1746mm3。此外，图32B显示肿瘤接种后第24天的个体小鼠肿瘤尺寸。由于单克隆抗体NMC-303的嵌合形式的人恒定区，如果在具有人类免疫背景的小鼠模型中进行测试，该抗体的抗肿瘤功效可能会得到改善。上述体内结果进一步支持针对NMC-P3免疫原产生的抗体靶向癌细胞上的M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗肿瘤功效。
综上所述，这些结果证明了M(H)DM2/4特异性抗体的两个重要治疗方面：第一，靶向M(H)DM2/4的细胞外可接近的序列的抗M(H)DM2/4抗体本身就是有效的抗癌药。第二，与低浓度的化疗药物联合使用的M(H)DM2/4抗体具有有效的协同抗肿瘤作用。考虑到经常观察到的副作用及在其临床有效浓度下使用化学治疗的局限性，这一点尤其重要。此外，这些结果表明，M(H)DM2/4抗体可导致针对癌症的长期抗肿瘤免疫力的形成，这通过先前用M(H)DM2/4抗体治疗过的动物的癌症复发的预防和长期生存得以证明。
体外数据显示，当用各种类型的化学治疗剂如吉西他滨和紫杉醇处理细胞时，质膜M(H)DM2/4增加(数据未显示)。这种治疗可能使这些细胞对抗HDM2抗体治疗更敏感，这进一步解释了其组合施用的协同作用(图19)。
8.10：基于实施例1-9的结论：
综上所述，本文提供的数据证明识别癌细胞中M(H)DM2/4的细胞外可接近的区段的选择的M(H)DM2/4特异性抗体具有针对多种癌症的生长抑制和细胞毒性作用，同时保留正常的未转化细胞。认为这些抗体的选择性抗肿瘤作用至少部分是由于它们识别在癌细胞表面上表达的M(H)DM2/4蛋白变体的细胞外可接近的表位，而这些M(H)DM2/4变体的表达水平正常细胞的细胞表面上很低或不存在。
以下的实施例10-12描述了使用其他抗HDM2抗体获得的数据，所述抗HDM2抗体结合于癌细胞上的细胞外可接近的HDM2的区段。
8.11实施例10：也结合于来自不同人癌细胞系和新分离的原代人癌细胞的完整细 胞，但不结合于正常细胞的其他HDM2特异性抗体
为了进一步扩展针对M(H)DM2/4产生的其他抗体的治疗和诊断潜能，我们评价了几种其他可用抗体的结合和抗肿瘤活性。如上所述，这些抗体中的一些(即Calbiochem/Millipore OP-46和OP-144)不与M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位反应，证明癌细胞膜上缺乏表位可用性，表明表示所有抗M(H)DM2/4抗体都可以用于治疗癌症。然而，几种其他抗M(H)DM2/4抗体不仅显示与癌细胞膜上的细胞外可接近的表位相互作用，而且还具有体外和/或体内抗肿瘤活性。
在实施例10-12中描述的实验中使用了以下抗HDM2抗体：(i)多克隆sc-813，N-20，兔IgG，来自Santa Cruz(在整个说明书中简称为“N-20”或“sc-813(N-20)”)；(ii)单克隆OP145，小鼠IgG1，来自Calbiochem(在整个说明书中简称为“OP145”)；(iii)单克隆OP46(Ab-1)，小鼠IgG1，来自Calbiochem(在整个说明书中简称为“OP46”)；(iv)单克隆OP144(Ab-4)，小鼠IgG1，来自Calbiochem(在整个说明书中简称为“OP144”)；(v)多克隆sc-812，C-18，兔IgG，来自Santa Cruz(在整个说明书中简称为“C-18”或“sc-812(C-18)”)；和(vi)单克隆965(SMP14)，小鼠IgG1，来自Santa Cruz(在整个说明书中简称为“SMP14”或“965(SMP14)”)。下表10提供了关于这些抗体的HDM2识别位点(即，这些抗体识别的HDM2的氨基酸)，以及这些抗体是否对癌细胞具有细胞毒性的信息。OP145、N-20、C-18和SMP14对测试的癌细胞具有细胞毒性，并且OP46和OP144对测试的癌细胞没有细胞毒性。
利用荧光激活细胞分选(FACS)，本文提供的数据显示，选择的HDM2特异性抗体结合于活的人癌细胞的表面膜，所述人癌细胞为维持在培养物中的人黑色素瘤A2058细胞和从卵巢癌组织中新分离的两种原发患者来源的卵巢癌细胞OVCA-1和OVCA-4。相反，对活的正常小鼠脾细胞的FACS分析表明，不存在用相同的HDM2特异性抗体的质膜染色。
使用的方法：用5％的人血清白蛋白封闭用EDTA或胰蛋白酶释放的完整细胞。然后将细胞与多克隆(N20)或单克隆(OP145)HDM2特异性抗体在冰上孵育90分钟。将在相同条件下制备的另一组细胞与相同的抗体孵育，该抗体与其相应的封闭肽一起预孵育，然后再与细胞孵育。一抗孵育后，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，然后用FITC二抗孵育60分钟。然后用PBS洗涤细胞3次，并用FACS分析仪处理。
图24显示了人黑色素瘤、原发性卵巢癌和正常小鼠脾细胞的FACS分析结果。图24A：#1曲线下面积表示仅与山羊抗兔二抗一起孵育的细胞；#2曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20孵育的细胞，所述细胞与其封闭肽预孵育，接着与山羊抗兔二抗预孵育；#3曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20一起孵育，接着与山羊抗兔二抗一起孵育的细胞。图24B：#1曲线下面积表示仅与山羊抗小鼠二抗一起孵育的细胞；#2曲线下面积表示与抗HDM2单克隆抗体OP145孵育的细胞，所述抗HDM2单克隆抗体OP145与其封闭肽预孵育，接着与山羊抗兔二抗预孵育；#3曲线下面积表示与抗HDM2单克隆抗体OP145一起孵育，接着与山羊抗兔二抗一起孵育的细胞。图24C：#1曲线下面积表示仅与山羊抗兔二抗一起孵育的细胞；#2曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20一起孵育，接着与山羊抗兔二抗一起孵育的胰蛋白酶释放的细胞；#3曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20一起孵育的EDTA释放的细胞，所述细胞与其封闭肽预孵育，接着与山羊抗兔二抗预孵育；#4曲线下面积表示与HDM2多克隆抗体N20一起孵育，接着与山羊抗兔二抗一起孵育的EDTA释放的细胞；图24D和E：#1曲线下面积表示仅与山羊抗兔二抗一起孵育的细胞；#2曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20一起孵育的细胞，所述细胞与其封闭肽一起预孵育，接着与山羊抗兔二抗一起预孵育；#3曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20一起孵育，接着与山羊抗兔二抗一起孵育的细胞。图24F：#1曲线下面积表示仅与山羊抗兔二抗一起孵育的细胞；#2曲线下面积表示与HDM2多克隆抗体N-20一起孵育，接着与山羊抗兔二抗一起孵育的胰蛋白酶释放的细胞；#3曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20一起孵育的EDTA释放的细胞，所述细胞与其封闭肽一起预孵育，接着与山羊抗兔二抗一起预孵育；#4曲线下面积表示与抗HDM2多克隆抗体N-20一起孵育，接着与山羊抗兔二抗一起孵育的EDTA释放的细胞。
与抗HDM2多克隆N-20抗体(图24A；#3曲线下面积)或单克隆OP145抗体(图24B；#3曲线下面积)孵育的EDTA释放的完整人黑色素瘤A2058细胞显示细胞在其细胞表面上对HDM2染色呈阳性。为了控制表位特异性，当在与细胞一起孵育之前将这些抗体中的任一种与其相应的封闭肽预孵育时，未观察到超过背景的特异性染色(参见图24A和24B；#2曲线下面积)。有趣的是，在使用切割细胞表面蛋白的外部部分的胰蛋白酶释放的人黑色素瘤细胞的情况下，未观察到HDM2的细胞表面染色(参见图24C；与EDTA释放的细胞相比的#3曲线下面积，#4曲线下面积)，进一步表明在质膜外表面上存在至少部分HDM2蛋白。此外，当与多克隆N-20抗体一起孵育时，来自两名患有卵巢癌的患者的新分离的肿瘤(OVCA-1和OVCA-4)显示广泛的表面染色(参见图24D和24E；#3曲线下面积)。当在与细胞孵育之前将抗体与其封闭肽一起预孵育时，这种染色被完全封闭(参见图24D和24E；#2曲线下面积)。然而，完整的小鼠正常脾细胞在背景上没有被相同的抗体染色(参见图24F；将在#4曲线下面积中与HDM2特异性N-20抗体一起孵育时的染色与#3曲线下面积中的与N-20封闭肽预孵育的抗体处理的样品的染色相比较)。总之，FACS分析的结果强烈表明完整癌细胞的质膜上存在M(H)DM2的细胞外可接近的表位，而在正常未转化细胞中则不存在。
8.12实施例11：某些HDM2特异性抗体引发针对不同类型癌症的补体介导的细胞毒 性
本文提供的数据显示了选择的HDM2特异性抗体不仅能够结合癌细胞表面膜，而且还能够在新鲜正常人血清(NHS)存在下引发细胞毒性作用的能力。在各种癌细胞如人黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌细胞以及正常人纤维母细胞和血细胞中测量了细胞毒性作用。
使用的方法：将24孔培养皿中接种的细胞在37℃下在提供5％CO2–95％空气混合物的潮湿气氛中生长过夜。第二天，将细胞用冰冷的PBS彻底洗涤，并与在含有1％BSA的培养基中稀释至5-10ug/ml的最终抗体浓度的各种HDM2特异性抗体(即，OP145、N-20和C-18抗体；参见表10中的抗体描述)或对照抗体(针对细胞内蛋白细胞色素C)一起孵育。30min后，将NHS加入细胞中，使其在含有1％BSA和1％碘化丙啶(PI)溶液的培养基中的终浓度为1:30。作为在新鲜人血清中的补体作用的对照，将用HDM2特异性抗体处理的平行培养物暴露于已在56℃下孵育30min的新鲜人血清(HiNHS)中，该过程已知会抑制补体活性。孵育后15、30、45和60min使用在Olympus IX81倒置显微镜上建立的Olympus FluoView FV1000共聚焦激光扫描生物学显微镜拍摄图像。
图25显示了HDM2特异性抗体对人胰腺和卵巢癌细胞(图25A)和啮齿动物胰腺细胞(图25B)的细胞毒性作用。在NHS的存在下，OP145、N-20和C-18抗体会在用这样的抗体孵育的癌细胞中触发补体介导的细胞毒性，导致癌细胞死亡，这可以通过细胞标志物碘化丙啶(PI)的核摄取来证明(对于与OP145孵育的卵巢癌细胞，参见图25A，图b和e，对于分别与N-20和C-18孵育的胰腺癌细胞，参见图25B，图b和c)。在对照抗体(即抗细胞色素C抗体，参见图25A，图c，和图25B，图e)的存在下，癌细胞死亡与没有任何抗体的单独的对照NHS(参见图25A，图a和d，和图25B，图a)或用HDM2特异性抗体处理的正常细胞(成纤维母细胞，图25A，图g)相似(即，没有或仅有最小的细胞死亡，如缺乏PI染色所示，参见图25A，图a、c、d、f和g，和图25B，图1)。此外，当用抗HDM2单克隆OP46抗体处理细胞时，未观察到细胞毒性(参见图25B，图d)。图25C提供了针对人胰腺癌细胞的HDM2特异性抗体依赖性补体细胞毒性的定量示意图。在NHS存在下用抗HDM2(C-18)抗体处理的细胞在处理后15-30分钟内显示出细胞毒性，而抗HDM2 OP46显示细胞毒性作用不超过当使用对照抗细胞色素C抗体处理细胞或当在NHS存在下不处理细胞时观察到的毒性。
此外，HDM2特异性抗体在热灭活的人血清(即在56℃下孵育30分钟的新鲜人血清(HiNHS))存在下对癌细胞没有任何细胞毒性作用(即，如通过PI染色所证实的，其未导致癌细胞的死亡)，表明细胞毒性作用是由于补体活性所致。
表10列出了本发明人测试的抗体，并总结了获得的与各种抗HDM2抗体针对癌细胞的体外细胞毒性作用有关的结果。
表10：使用的抗体及其在癌细胞中诱导体外细胞毒性作用的能力
Figure BDA0002426459430001021
*H—结合于人蛋白；M—结合于鼠蛋白；R—结合于兔蛋白
8.13实施例12：与结合于HDM2的细胞外可接近的表位的其他抗体的体内抗肿瘤作 用有关的结果
为了进一步评价针对癌细胞上的HDM2(除NMC-P1、NMC-P2和NMC-P3以外)的细胞外可接近的表位产生的mAb的抗癌活性，对抗HDM2单克隆抗体OP-145(Calbiochem)和“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”(Abnova，目录号H00004193-M01)的抗肿瘤功效进行了研究。如上所述，这些抗体均未显示与NMC-P1和NMC-P2的反应性(参见图14A-B)，但是这两种抗体均显示了与完整癌细胞的反应性(参见图15A和24B)。
抗体OP145对体内胰腺肿瘤生长的抗肿瘤作用的评价：通过将Panc02细胞(每只小鼠2x106个)植入雌性8周龄C57BL/6小鼠的右侧腹来制备皮下肿瘤。肿瘤植入后，将小鼠放回各自的笼子中。从肿瘤植入后第7天开始，用数字卡尺每周两次测量肿瘤体积。当肿瘤达到平均200mm3时开始治疗(参见图26，第14天)。在肿瘤植入后为小鼠配备微芯片并登记。记录肿瘤体积的测量值和体重，并将小鼠随机分为两组，接受OP145抗体(通过瘤内注射0.1mg/kg的小鼠单克隆抗体OP145，每周3次)或PBS。三只小鼠用OP145治疗，五只小鼠用PBS治疗。对任何表现出长期不良临床症状或体重减轻相对于第0天的体重超过15％的小鼠安乐死。从使用OP145抗体和PBS治疗后的前10天开始进行肿瘤测量，结果如图26所示。
发现在肿瘤细胞注射后21天，施用OP145抗体的小鼠中的皮下肿瘤的尺寸为260mm3，而施用PBS的小鼠中的皮下肿瘤的尺寸为375mm3(参见图26)。
“MDM2单克隆抗体(M01)克隆1A7”对结肠癌的MC-38同基因小鼠模型的作用的体内研究(使用0.4mg/kg的M01克隆1A7抗体；每周3次，腹膜内；n＝4)表明，虽然抗体治疗的小鼠最初对治疗有反应(6剂后平均肿瘤大小在抗体治疗组中为1588mm3，而在同种型对照-治疗组中为1999mm3)，但到第三周，对照小鼠和抗体治疗小鼠中的肿瘤均达到约2500mm3(图23)。在相同的时间段内，以相同剂量(0.4mg/kg；每周3次，持续3周，腹膜内)给予小鼠mAb NMC-103和NMC-204显示肿瘤体积显著(p<0.005)减小，具有持久的抗肿瘤活性(图19；分别为空心圆形和空心方形；也参见图17A和18A)。该发现表明，尽管mAb M01在体外与细胞具有强结合，但NMC-103和NMC-204的抗肿瘤作用优于mAb M01(图23)。
必须注意的是，与单克隆抗体OP-145和M01的体内抗肿瘤功效有关的这些结果必须谨慎解释，因为所使用的商业抗体制剂不一定具有用于体内功效测试期望的克隆性、纯度或药学上可接受的制剂。
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10.序列
SEQ ID NO:1(NMC-P1)
MCNTNMSVPTDGAVT
SEQ ID NO:2(NMC-P2)
TTSQIPASEQE
SEQ ID NO:3(NMC-P3)
CPVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:4(人HDM2蛋白):
MCNTNMSVPT DGAVTTSQIP ASEQETLVRP KPLLLKLLKS VGAQKDTYTM KEVLFYLGQYIMTKRLYDEK QQHIVYCSND LLGDLFGVPS FSVKEHRKIY TMIYRNLVVV NQQESSDSGT SVSENRCHLEGGSDQKDLVQ ELQEEKPSSS HLVSRPSTSS RRRAISETEE NSDELSGERQ RKRHKSDSIS LSFDESLALCVIREICCERS SSSESTGTPS NPDLDAGVSE HSGDWLDQDS VSDQFSVEFE VESLDSEDYS LSEEGQELSDEDDEVYQVTV YQAGESDTDS FEEDPEISLA DYWKCTSCNE MNPPLPSHCN RCWALRENWL PEDKGKDKGEISEKAKLENS TQAEEGFDVP DCKKTIVNDS RESCVEENDD KITQASQSQE SEDYSQPSTS SSIIYSSQEDVKEFEREETQ DKEESVESSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQPIQMIVLTYF P
SEQ ID NO:5(小鼠MDM2蛋白):
MCNTNMSVST EGAASTSQIP ASEQETLVRP KPLLLKLLKS VGAQNDTYTM KEIIFYIGQYIMTKRLYDEK QQHIVYCSND LLGDVFGVPS FSVKEHRKIY AMIYRNLVAV SQQDSGTSLS ESRRQPEGGSDLKDPLQAPP EEKPSSSDLI SRLSTSSRRR SISETEENTD ELPGERHRKR RRSLSFDPSL GLCELREMCSGGSSSSSSSS SESTETPSHQ DLDDGVSEHS GDCLDQDSVS DQFSVEFEVE SLDSEDYSLS DEGHELSDEDDEVYRVTVYQ TGESDTDSFE GDPEISLADY WKCTSCNEMN PPLPSHCKRC WTLRENWLPD DKGKDKVEISEKAKLENSAQ AEEGLDVPDG KKLTENDAKE PCAEEDSEEK AEQTPLSQES DDYSQPSTSS SIVYSSQESVKELKEETQDK DESVESSFSL NAIEPCVICQ GRPKNGCIVH GKTGHLMSCF TCAKKLKKRN KPCPVCRQPIQMIVLTYFN
SEQ ID NO:6(人HDM4蛋白):
MTSFSTSAQCSTSDSACRISPGQINQVRPKLPLLKILHAAGAQGEMFTVKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGELLGRQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTLATATTDAAQTLALAQDHSMDIPSQDQLKQSAEESSTSRKRTTEDDIPTLPTSEHKCIHSREDEDLIENLAQDETSRLDLGFEEWDVAGLPWWFLGNLRSNYTPRSNGSTDLQTNQDVGTAIVSDTTDDLWFLNESVSEQLGVGIKVEAADTEQTSEEVGKVSDKKVIEVGKNDDLEDSKSLSDDTDVEVTSEDEWQCTECKKFNSPSKRYCFRCWALRKDWYSDCSKLTHSLSTSDITAIPEKENEGNDVPDCRRTISAPVVRPKDAYIKKENSKLFDPCNSVEFLDLAHSSESQETISSMGEQLDNLSEQRTDTENMEDCQNLLKPCSLCEKRPRDGNIIHGRTGHLVTCFHCARRLKKAGASCPICKKE IQLVIKVFIA
SEQ ID NO:7(小鼠MDMX-S蛋白):
MTSHSTSAQCSASDSACRISSEQISQVRPKLQLLKILHAAGAQGEVFTMKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGDLLGCQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTSASINTARC NRILQSQKKN
M(H)DM2/4变体:
SEQ ID NO:8(HDM2变体MDM2-A):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLD(28-222)
LDAGVSEHSGDWLDQDSVSDQFSVEFEVESLDSEDYSLSEEGQELSDEDDEVYQVTVYQAGESDTDSFEEDPEISLADYWKCTSCNEMNPPLPSHCNRCWALRENWLPEDKGKDKGEISEKAKLENSTQAEEGFDVPDCKKTIVNDSRESCVEENDDKITQASQSQESEDYSQPSTSSSIIYSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKKRNKPCPVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:9(HDM2变体MDM2-A1):
MCNTNMSVPT DGAVTTSQIP ASEQETLD(28-222)
LDAGVSEH SGDWLDQDSV SDQFSVEFEV ESLDSEDYSL SEEGQELSDE DDEDY(275-300)WKCTS CNEMNPPLPS HCNRCWALRE NWLPEDKGKD KGEISEKAKL ENSTQAEEGF DVPDCKKTIVNDSRESCVEE NDDKITQASQ SQESEDYSQP STSSSIIYSS QEDVKEFERE ETQDKEESVE SSLPLNAIEPCVICQGRPKN GCIVHGKTGH LMACFTCAKK LKKRNKPCPV CRQPIQMIVL TYFP
SEQ ID NO:10(HDM2变体MDM2-B):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLD(28-300)
YWKCTSCNEMNPPLPSHCNRCWALRENWLPEDKGKDKGEISEKAKLENSTQAEEGFDVPDCKKTIVNDSRESCVEENDDKITQASQSQESEDYSQPSTSSSIIYSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKKRNKPCPVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:11(HDM2变体MDM2-C):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQKDTYTMKED(53-222)
LDAGVSEHSGDWLDQDSVSDQFSVEFEVESLDSEDYSLSEEGQELSDEDDEVYQVTVYQAGESDTDSFEEDPEISLADYWKCTSCNEMNPPLPSHCNRCWALRENWLPEDKGKDKGEISEKAKLENS
TQAEEGFDVPDCKKTIVNDSRESCVEENDDKITQASQSQESEDYSQPSTSSSIIYSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKK
RNKPCPVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:12(HDM2变体MDM2-D):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRQ(30-388)
ESEDYSQPSTSSSIIYSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKKRNKPCPVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:13(HDM2变体MDM2-E):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQKDTYTMKEVLFYLGQYIMTKRLYDEKQQHIVN(76-102)(103-491)DCANLFPLVDLSIRELYISNYITLGI
SEQ ID NO:14(HDM2变体MDM2-F):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQKDTYTMKE(53-97)KIYTMIYRNLVVVNQQESSDSGTSVSENRCHLEGGSDQKDLVQELQEEKPSSSHLVSRPSTSSRRRAISETEENSDELSGERQRKRHKSDSISLSFDESLALCVIREICCERSSSSESTGTPSNPDLDAGVSEHSGDWLDQDSVSDQFSVEFEVESLDSEDYSLSEEGQELSDEDDEVYQVTVYQAGESDTDSFEEDPEISLADYWKCTSCNEMNPPLPSHCNRCWALRENWLPEDKGKDKGEISEKAKLENSTQAEEGFDVPDCKKTIVNDSRESCVEENDDKITQASQSQESEDYSQPSTSSSIIYSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKKRNKPCPVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:15(HDM2变体MDM2-G):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQKDTYTMKEVLFYLGQY
IMTKRLYDEKQQHIVYCSNDLLGDLFGVPSFSVKEHRKIYTMIYRNLVVVNQQEE(115-169)
NSDELSGERQRKRHKSDSISLSFDESLALCVIREICCERSSSSESTGTPSNPDLDAGVSEHSGDWLDQDSVSDQFSVEFEVESLDSEDYSLSEEGQELSDEDDEVYQVTVYQAGESDTDSFEEDPEISLADYWKCTSCNEMNPPLPSHCNRCWALRENWLPEDKGKDKGEISEKAKLENSTQAEE
GFDVPDCKKTIVNDSRESCVEENDDKITQASQSQESEDYSQPSTSSSIIYSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKKRNKPC PVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:16(HDM2变体MDM2-11):
MVRSRQMCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQKDTYTMKEVL
FYLGQYIMTKRLYDEKQQHIVYCSNDLLGDLFGVPSFSVKEHRKIYTMIYRNLVVVNQQE
SSDSGTSVSENRCHLEGGSDQKDLVQELQEEKPSSSHLVSRPSTSSRRRAISETEENSDE
LSGERQRKRHKSDSISLSFDESLALCVIREICCERSSSSESTGTPSNPDLDAGVSEHSGDWLDQDSVSDQFSVEFEVESLDSEDYSLSEEGQELSDEDDEVYQVTVYQAGESDTDSFEED
PEISLADYWKCTSCNEMNPPLPSHCNRCWALRENWLPEDKGKDKGEISEKAKLENSTQAE
EGFDVPDCKKTIVNDSRESCVEENDDKITQASQSQESEDYSQPSTSSSIIYSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKKRNKP
CPVCRQPIQMIVLTYFP
SEQ ID NO:17(HDM2变体MDM2-KB2):
MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQKDTYTMKEDYWKCTSC
NEMNPPLPSHCNRCWALRENWLPEDKGKDKGEISEKAKLENSTQAEEGFDVPDCKKTIVN DSRESCVEENDDKITQASQSQESEDYSQPSTSSSII(157-248)
YSSQEDVKEFEREETQDKEESVESSLPLNAIEPCVICQGRPKNGCIVHGKTGHLMACFTCAKKLKKRNKPCPVCRQPIQMIVLTYFP
表4.使用Chothia、AbM、Kabat、Contact和IMGT CDR定义的mAb NMC-103重链CDR和 HFR序列
Figure BDA0002426459430001101
Figure BDA0002426459430001111
————————————
1列出的残基是NMC-103的重链可变区(SEQ ID NO:36)的残基编号.
表5.使用Chothia、AbM、Kabat、Contact和IMGT CDR定义的mAb NMC-103轻链CDR和 HFR序列:
Figure BDA0002426459430001112
Figure BDA0002426459430001121
————————————
2列出的残基是NMC-103的轻链可变区(SEQ ID NO:37)的残基编号
表6.使用Chothia、AbM、Kabat、Contact和IMGT CDR定义的mAb NMC-204重链CDR和 HFR序列:
Figure BDA0002426459430001131
Figure BDA0002426459430001143
————————————
3列出的残基是NMC-204的重链可变区(SEQ ID NO:38)的残基编号
表7.使用Chothia、AbM、Kabat、Contact和IMGT CDR定义的mAb NMC-204轻链CDR和 HFR序列
Figure BDA0002426459430001142
Figure BDA0002426459430001151
————————————
4列出的残基是NMC-204的轻链可变区(SEQ ID NO:39)的残基编号.
表8.使用Chothia、AbM、Kabat和Contact CDR定义的mAb NMC-303重链CDR和HFR序 列:
Figure BDA0002426459430001152
Figure BDA0002426459430001161
————————————
5列出的残基是NMC-303的重链可变区(SEQ ID NO:40)的残基编号.
表9.使用Chothia、AbM、Kabat和Contact CDR定义的mAb NMC-303轻链CDR和HFR序 列:
Figure BDA0002426459430001162
Figure BDA0002426459430001171
————————————
6列出的残基是NMC-303的轻链可变区(SEQ ID NO:41)的残基编号.
mAb NMC-103重链可变区DNA序列(SEQ ID NO:132)
gaggtgcagctgcaggagtctggaggaggcttggtacagcctgggggttctctgagactctcctgtacaacttctgggttcaccttcactcattactacatgagctgggtccgccagcctccaggcaaggcacttgagtggttgggctttattagaaataaagctaagggttacacagcagagtacagtgcatctgtgaagggtcggttcaccatctccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagacctgaggacagtgccacttattactgtgcaagagatattggggacaactggggtcaaggaaccttagtcaccgtctcctcag
mAb NMC-103重链可变区蛋白序列(SEQ ID NO:36)(根据IMGT编号系统确定的互 补决定区(CDR)加下划线):
Figure BDA0002426459430001172
VSS
mAb NMC-103轻链可变区DNA序列(SEQ ID NO:134)
gatattgtgatgacgcaggctgccttctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaagaatctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaggccaggccagtctcctcagctcctgatatctcgggtgtccaatctggcctcaggagtcccaaacaggttcagtggcagtgagtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttatttctgtgctcaactgctagaactcccgtacacgttcggaggggggaccaagttggaaataaaac
mAb NMC-103轻链可变区蛋白序列(SEQ ID NO:37)(根据IMGT编号系统确定的互 补决定区(CDR)加下划线):
Figure BDA0002426459430001173
mAb NMC-204重链可变区DNA序列(SEQ ID NO:136)
gaggtgcagctgcaggagtctgggtctgtgctggtgaggcctggagcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggcgacaccctcagcggctcctggatgcactgggcgatgcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattcatcttaatagaggtactactaactacaatgagaagttcaagggcaaggccacagtgactgtggacacatcctccagcacagcctacgtggatctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagaagcccggggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcag
mAb NMC-204重链可变区蛋白序列(SEQ ID NO:38)(根据IMGT编号系统确定的互 补决定区(CDR)加下划线):
Figure BDA0002426459430001181
mAb NMC-204轻链可变区DNA序列(SEQ ID NO:138)
ggcattgtgatgacccaggctgcaccctctgtacctgtcactcctggagagtcagtatccatctcctgcaggtctagtaagagtctcctgcatagtaatggcaacagttacttgtattggttcctgcagaggccaggccagtctcctcagctcctgatatatcggatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtggcagtgggtcaggaactgctttcacactgagaatcactagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtatgcaacatctagaatatcctttcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaac
mAb NMC-204轻链可变区蛋白序列(SEQ ID NO:39)(根据IMGT编号系统确定的互 补决定区(CDR)加下划线):
Figure BDA0002426459430001182
mAb NMC-303重链可变区DNA序列(SEQ ID NO:140):
caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagctactatatgtactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggggggattaatcctaggaatggtggtactaacttcaatgagaagttcaagaacaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatgcaactcagtagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagatctggttactatgctatggactattggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
mAb NMC-303重链可变区蛋白序列(SEQ ID NO:40)(根据Kabat编号系统确定的互 补决定区(CDR)加下划线):
Figure BDA0002426459430001183
mAb NMC-303轻链可变区DNA序列(SEQ ID NO:142)
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagcaattttttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttcctcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
mAb NMC-303轻链可变区蛋白序列(SEQ ID NO:41)(根据Kabat编号系统确定的互 补决定区(CDR)加下划线):
Figure BDA0002426459430001184
以引用方式并入
本文引用了各种参考文献，如专利、专利申请和出版物，其公开内容通过引用整体并入本文。
序列表
<110> 诺莫坎制药有限责任公司
<120> M(H)DM2/4的抗体及其在诊断和治疗癌症中的用途
<130> 14160-006-228
<150> US 62/537,914
<151> 2017-07-27
<160> 148
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NMC-P1
<400> 1
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr
1 5 10 15
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NMC-P2
<400> 2
Thr Thr Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NMC-P3
<400> 3
Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe
1 5 10 15
Pro
<210> 4
<211> 491
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys
50 55 60
Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His
85 90 95
Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln
100 105 110
Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn Arg Cys His
115 120 125
Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu Val Gln Glu Leu Gln Glu
130 135 140
Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser Arg Pro Ser Thr Ser Ser
145 150 155 160
Arg Arg Arg Ala Ile Ser Glu Thr Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu Ser
165 170 175
Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg His Lys Ser Asp Ser Ile Ser Leu Ser
180 185 190
Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu Cys Val Ile Arg Glu Ile Cys Cys Glu
195 200 205
Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu
210 215 220
Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gln Asp Ser
225 230 235 240
Val Ser Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser
245 250 255
Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln Glu Leu Ser Asp Glu Asp
260 265 270
Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp Thr
275 280 285
Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys
290 295 300
Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn
305 310 315 320
Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys
325 330 335
Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln
340 345 350
Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val Asn
355 360 365
Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr Gln
370 375 380
Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser
385 390 395 400
Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg
405 410 415
Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu
420 425 430
Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly
435 440 445
Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys
450 455 460
Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln
465 470 475 480
Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro
485 490
<210> 5
<211> 489
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Ser Thr Glu Gly Ala Ala Ser Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Asn Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Ile Ile Phe Tyr Ile Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys
50 55 60
Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Leu Gly Asp Val Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His
85 90 95
Arg Lys Ile Tyr Ala Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Ala Val Ser Gln
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Thr Ser Leu Ser Glu Ser Arg Arg Gln Pro Glu Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Leu Lys Asp Pro Leu Gln Ala Pro Pro Glu Glu Lys Pro
130 135 140
Ser Ser Ser Asp Leu Ile Ser Arg Leu Ser Thr Ser Ser Arg Arg Arg
145 150 155 160
Ser Ile Ser Glu Thr Glu Glu Asn Thr Asp Glu Leu Pro Gly Glu Arg
165 170 175
His Arg Lys Arg Arg Arg Ser Leu Ser Phe Asp Pro Ser Leu Gly Leu
180 185 190
Cys Glu Leu Arg Glu Met Cys Ser Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser
195 200 205
Ser Ser Ser Glu Ser Thr Glu Thr Pro Ser His Gln Asp Leu Asp Asp
210 215 220
Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp Cys Leu Asp Gln Asp Ser Val Ser
225 230 235 240
Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser Glu Asp
245 250 255
Tyr Ser Leu Ser Asp Glu Gly His Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu
260 265 270
Val Tyr Arg Val Thr Val Tyr Gln Thr Gly Glu Ser Asp Thr Asp Ser
275 280 285
Phe Glu Gly Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys Cys Thr
290 295 300
Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Lys Arg Cys
305 310 315 320
Trp Thr Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Asp Asp Lys Gly Lys Asp Lys
325 330 335
Val Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Ala Gln Ala Glu
340 345 350
Glu Gly Leu Asp Val Pro Asp Gly Lys Lys Leu Thr Glu Asn Asp Ala
355 360 365
Lys Glu Pro Cys Ala Glu Glu Asp Ser Glu Glu Lys Ala Glu Gln Thr
370 375 380
Pro Leu Ser Gln Glu Ser Asp Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser
385 390 395 400
Ser Ile Val Tyr Ser Ser Gln Glu Ser Val Lys Glu Leu Lys Glu Glu
405 410 415
Thr Gln Asp Lys Asp Glu Ser Val Glu Ser Ser Phe Ser Leu Asn Ala
420 425 430
Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys Ile
435 440 445
Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ser Cys Phe Thr Cys Ala Lys
450 455 460
Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile
465 470 475 480
Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Asn
485
<210> 6
<211> 490
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Thr Ser Phe Ser Thr Ser Ala Gln Cys Ser Thr Ser Asp Ser Ala
1 5 10 15
Cys Arg Ile Ser Pro Gly Gln Ile Asn Gln Val Arg Pro Lys Leu Pro
20 25 30
Leu Leu Lys Ile Leu His Ala Ala Gly Ala Gln Gly Glu Met Phe Thr
35 40 45
Val Lys Glu Val Met His Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Val Lys Gln
50 55 60
Leu Tyr Asp Gln Gln Glu Gln His Met Val Tyr Cys Gly Gly Asp Leu
65 70 75 80
Leu Gly Glu Leu Leu Gly Arg Gln Ser Phe Ser Val Lys Asp Pro Ser
85 90 95
Pro Leu Tyr Asp Met Leu Arg Lys Asn Leu Val Thr Leu Ala Thr Ala
100 105 110
Thr Thr Asp Ala Ala Gln Thr Leu Ala Leu Ala Gln Asp His Ser Met
115 120 125
Asp Ile Pro Ser Gln Asp Gln Leu Lys Gln Ser Ala Glu Glu Ser Ser
130 135 140
Thr Ser Arg Lys Arg Thr Thr Glu Asp Asp Ile Pro Thr Leu Pro Thr
145 150 155 160
Ser Glu His Lys Cys Ile His Ser Arg Glu Asp Glu Asp Leu Ile Glu
165 170 175
Asn Leu Ala Gln Asp Glu Thr Ser Arg Leu Asp Leu Gly Phe Glu Glu
180 185 190
Trp Asp Val Ala Gly Leu Pro Trp Trp Phe Leu Gly Asn Leu Arg Ser
195 200 205
Asn Tyr Thr Pro Arg Ser Asn Gly Ser Thr Asp Leu Gln Thr Asn Gln
210 215 220
Asp Val Gly Thr Ala Ile Val Ser Asp Thr Thr Asp Asp Leu Trp Phe
225 230 235 240
Leu Asn Glu Ser Val Ser Glu Gln Leu Gly Val Gly Ile Lys Val Glu
245 250 255
Ala Ala Asp Thr Glu Gln Thr Ser Glu Glu Val Gly Lys Val Ser Asp
260 265 270
Lys Lys Val Ile Glu Val Gly Lys Asn Asp Asp Leu Glu Asp Ser Lys
275 280 285
Ser Leu Ser Asp Asp Thr Asp Val Glu Val Thr Ser Glu Asp Glu Trp
290 295 300
Gln Cys Thr Glu Cys Lys Lys Phe Asn Ser Pro Ser Lys Arg Tyr Cys
305 310 315 320
Phe Arg Cys Trp Ala Leu Arg Lys Asp Trp Tyr Ser Asp Cys Ser Lys
325 330 335
Leu Thr His Ser Leu Ser Thr Ser Asp Ile Thr Ala Ile Pro Glu Lys
340 345 350
Glu Asn Glu Gly Asn Asp Val Pro Asp Cys Arg Arg Thr Ile Ser Ala
355 360 365
Pro Val Val Arg Pro Lys Asp Ala Tyr Ile Lys Lys Glu Asn Ser Lys
370 375 380
Leu Phe Asp Pro Cys Asn Ser Val Glu Phe Leu Asp Leu Ala His Ser
385 390 395 400
Ser Glu Ser Gln Glu Thr Ile Ser Ser Met Gly Glu Gln Leu Asp Asn
405 410 415
Leu Ser Glu Gln Arg Thr Asp Thr Glu Asn Met Glu Asp Cys Gln Asn
420 425 430
Leu Leu Lys Pro Cys Ser Leu Cys Glu Lys Arg Pro Arg Asp Gly Asn
435 440 445
Ile Ile His Gly Arg Thr Gly His Leu Val Thr Cys Phe His Cys Ala
450 455 460
Arg Arg Leu Lys Lys Ala Gly Ala Ser Cys Pro Ile Cys Lys Lys Glu
465 470 475 480
Ile Gln Leu Val Ile Lys Val Phe Ile Ala
485 490
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
Met Thr Ser His Ser Thr Ser Ala Gln Cys Ser Ala Ser Asp Ser Ala
1 5 10 15
Cys Arg Ile Ser Ser Glu Gln Ile Ser Gln Val Arg Pro Lys Leu Gln
20 25 30
Leu Leu Lys Ile Leu His Ala Ala Gly Ala Gln Gly Glu Val Phe Thr
35 40 45
Met Lys Glu Val Met His Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Val Lys Gln
50 55 60
Leu Tyr Asp Gln Gln Glu Gln His Met Val Tyr Cys Gly Gly Asp Leu
65 70 75 80
Leu Gly Asp Leu Leu Gly Cys Gln Ser Phe Ser Val Lys Asp Pro Ser
85 90 95
Pro Leu Tyr Asp Met Leu Arg Lys Asn Leu Val Thr Ser Ala Ser Ile
100 105 110
Asn Thr Ala Arg Cys Asn Arg Ile Leu Gln Ser Gln Lys Lys Asn
115 120 125
<210> 8
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-A
<400> 8
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Asp Leu Asp Ala Gly
20 25 30
Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gln Asp Ser Val Ser Asp
35 40 45
Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser Glu Asp Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu Val
65 70 75 80
Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp Thr Asp Ser Phe
85 90 95
Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys Cys Thr Ser
100 105 110
Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn Arg Cys Trp
115 120 125
Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys Asp Lys Gly
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Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln Ala Glu Glu
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Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val Asn Asp Ser Arg
165 170 175
Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr Gln Ala Ser Gln
180 185 190
Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ile
195 200 205
Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu Glu Thr
210 215 220
Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala Ile
225 230 235 240
Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys Ile Val
245 250 255
His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys Ala Lys Lys
260 265 270
Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile Gln
275 280 285
Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro
290 295
<210> 9
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-A1
<400> 9
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Asp Leu Asp Ala Gly
20 25 30
Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gln Asp Ser Val Ser Asp
35 40 45
Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser Glu Asp Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser
85 90 95
His Cys Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp
100 105 110
Lys Gly Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn
115 120 125
Ser Thr Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr
130 135 140
Ile Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys
145 150 155 160
Ile Thr Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro
165 170 175
Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu
180 185 190
Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser
195 200 205
Leu Pro Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro
210 215 220
Lys Asn Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys
225 230 235 240
Phe Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val
245 250 255
Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro
260 265 270
<210> 10
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-B
<400> 10
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Asp Tyr Trp Lys Cys
20 25 30
Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn Arg
35 40 45
Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys Asp
50 55 60
Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln Ala
65 70 75 80
Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val Asn Asp
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Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr Gln Ala
100 105 110
Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser
115 120 125
Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu
130 135 140
Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn
145 150 155 160
Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys
165 170 175
Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys Ala
180 185 190
Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro
195 200 205
Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro
210 215
<210> 11
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-C
<400> 11
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Asp Leu Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp
50 55 60
Trp Leu Asp Gln Asp Ser Val Ser Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu
65 70 75 80
Val Glu Ser Leu Asp Ser Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln
85 90 95
Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln
100 105 110
Ala Gly Glu Ser Asp Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser
115 120 125
Leu Ala Asp Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro
130 135 140
Leu Pro Ser His Cys Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu
145 150 155 160
Pro Glu Asp Lys Gly Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys
165 170 175
Leu Glu Asn Ser Thr Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys
180 185 190
Lys Lys Thr Ile Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn
195 200 205
Asp Asp Lys Ile Thr Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr
210 215 220
Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp
225 230 235 240
Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val
245 250 255
Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln
260 265 270
Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu
275 280 285
Met Ala Cys Phe Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro
290 295 300
Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe
305 310 315 320
Pro
<210> 12
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-D
<400> 12
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Gln Glu Ser
20 25 30
Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu
50 55 60
Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val
65 70 75 80
Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr
85 90 95
Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg
100 105 110
Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu
115 120 125
Thr Tyr Phe Pro
130
<210> 13
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-E
<400> 13
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys
50 55 60
Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Asn Asp Cys Ala Asn
65 70 75 80
Leu Phe Pro Leu Val Asp Leu Ser Ile Arg Glu Leu Tyr Ile Ser Asn
85 90 95
Tyr Ile Thr Leu Gly Ile
100
<210> 14
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-F
<400> 14
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val
50 55 60
Val Asn Gln Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn
65 70 75 80
Arg Cys His Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu Val Gln Glu
85 90 95
Leu Gln Glu Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser Arg Pro Ser
100 105 110
Thr Ser Ser Arg Arg Arg Ala Ile Ser Glu Thr Glu Glu Asn Ser Asp
115 120 125
Glu Leu Ser Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg His Lys Ser Asp Ser Ile
130 135 140
Ser Leu Ser Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu Cys Val Ile Arg Glu Ile
145 150 155 160
Cys Cys Glu Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn
165 170 175
Pro Asp Leu Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp
180 185 190
Gln Asp Ser Val Ser Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser
195 200 205
Leu Asp Ser Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln Glu Leu Ser
210 215 220
Asp Glu Asp Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu
225 230 235 240
Ser Asp Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp
245 250 255
Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser
260 265 270
His Cys Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp
275 280 285
Lys Gly Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn
290 295 300
Ser Thr Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr
305 310 315 320
Ile Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys
325 330 335
Ile Thr Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu
355 360 365
Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser
370 375 380
Leu Pro Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro
385 390 395 400
Lys Asn Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys
405 410 415
Phe Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val
420 425 430
Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro
435 440 445
<210> 15
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-G
<400> 15
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys
50 55 60
Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His
85 90 95
Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln
100 105 110
Gln Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu Ser Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg
115 120 125
His Lys Ser Asp Ser Ile Ser Leu Ser Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu
130 135 140
Cys Val Ile Arg Glu Ile Cys Cys Glu Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser
145 150 155 160
Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu Asp Ala Gly Val Ser Glu His
165 170 175
Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gln Asp Ser Val Ser Asp Gln Phe Ser Val
180 185 190
Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu
195 200 205
Glu Gly Gln Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr
210 215 220
Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro
225 230 235 240
Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met
245 250 255
Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu
260 265 270
Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu
275 280 285
Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val
290 295 300
Pro Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val
305 310 315 320
Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser
325 330 335
Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser
340 345 350
Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu
355 360 365
Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val
370 375 380
Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr
385 390 395 400
Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg
405 410 415
Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu
420 425 430
Thr Tyr Phe Pro
435
<210> 16
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-11
<400> 16
Met Val Arg Ser Arg Gln Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr
1 5 10 15
Asp Gly Ala Val Thr Thr Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr
20 25 30
Leu Val Arg Pro Lys Pro Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly
35 40 45
Ala Gln Lys Asp Thr Tyr Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly
50 55 60
Gln Tyr Ile Met Thr Lys Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile
65 70 75 80
Val Tyr Cys Ser Asn Asp Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser
85 90 95
Phe Ser Val Lys Glu His Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn
100 105 110
Leu Val Val Val Asn Gln Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val
115 120 125
Ser Glu Asn Arg Cys His Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu
130 135 140
Val Gln Glu Leu Gln Glu Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser
145 150 155 160
Arg Pro Ser Thr Ser Ser Arg Arg Arg Ala Ile Ser Glu Thr Glu Glu
165 170 175
Asn Ser Asp Glu Leu Ser Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg His Lys Ser
180 185 190
Asp Ser Ile Ser Leu Ser Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu Cys Val Ile
195 200 205
Arg Glu Ile Cys Cys Glu Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr
210 215 220
Pro Ser Asn Pro Asp Leu Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asp Gln Asp Ser Val Ser Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu
245 250 255
Val Glu Ser Leu Asp Ser Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln
260 265 270
Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln
275 280 285
Ala Gly Glu Ser Asp Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser
290 295 300
Leu Ala Asp Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro
305 310 315 320
Leu Pro Ser His Cys Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu
325 330 335
Pro Glu Asp Lys Gly Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys
340 345 350
Leu Glu Asn Ser Thr Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys
355 360 365
Lys Lys Thr Ile Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn
370 375 380
Asp Asp Lys Ile Thr Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr
385 390 395 400
Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp
405 410 415
Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val
420 425 430
Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln
435 440 445
Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu
450 455 460
Met Ala Cys Phe Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro
465 470 475 480
Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe
485 490 495
Pro
<210> 17
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HDM2变体MDM2-KB2
<400> 17
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Asp Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn
50 55 60
Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn
65 70 75 80
Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys
85 90 95
Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro
100 105 110
Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu
115 120 125
Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr Gln Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu
130 135 140
Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln
145 150 155 160
Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu
165 170 175
Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile
180 185 190
Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly
195 200 205
His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn
210 215 220
Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Phe Pro
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H2区重链(Chothia)
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Thr His Tyr
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H1区重链(Kabat)
<400> 19
Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H3区重链(Chothia)
<400> 20
Asp Ile Gly Asp Asn
1 5
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-L1区轻链(Chothia)
<400> 21
Arg Ser Ser Lys Asn Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-L2区轻链(Chothia)
<400> 22
Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-L2区轻链(Chothia)
<400> 23
Ala Gln Leu Leu Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H1区重链(Chothia)
<400> 24
Gly Asp Thr Leu Ser Gly Ser
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H2区重链(Chothia)
<400> 25
His Leu Asn Arg Gly Thr
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H3区重链(Chothia)
<400> 26
Ser Pro Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-L1区轻链(Chothia)
<400> 27
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-L2区轻链(Chothia)
<400> 28
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-L2区轻链(Chothia)
<400> 29
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-H1区重链(Chothia)
<400> 30
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-H2区重链(Chothia)
<400> 31
Asn Pro Arg Asn Gly Gly
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-H3区重链(Chothia)
<400> 32
Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-L1区轻链(Chothia)
<400> 33
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-L2区轻链(Chothia)
<400> 34
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-L2区轻链(Chothia)
<400> 35
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Arg Thr
1 5
<210> 36
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103重链可变区
<400> 36
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Ala Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Gly Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103轻链可变区
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Asn Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Ser Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ala Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204重链可变区
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Leu Ser Gly Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Met Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Leu Asn Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204轻链可变区
<400> 39
Gly Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303重链可变区
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303轻链可变区
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H1区重链(AbM)
<400> 42
Gly Phe Thr Phe Thr His Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H1区重链(Kabat)
<400> 43
His Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H1区重链(Contact)
<400> 44
Thr His Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H2区重链(AbM)
<400> 45
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Ala Glu
1 5 10
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H2区重链(Kabat)
<400> 46
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Ala Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H2区重链(Contact)
<400> 47
Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Ala Glu
1 5 10 15
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H3区重链(Contact)
<400> 48
Ala Arg Asp Ile Gly Asp
1 5
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-L1区轻链(Contact)
<400> 49
Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-L2区轻链(Contact)
<400> 50
Leu Leu Ile Ser Arg Val Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-L2区轻链(Contact)
<400> 51
Ala Gln Leu Leu Glu Leu Pro Tyr
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H1区重链(AbM)
<400> 52
Gly Asp Thr Leu Ser Gly Ser Trp Met His
1 5 10
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H1区重链(Kabat)
<400> 53
Gly Ser Trp Met His
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H1区重链(Contact)
<400> 54
Ser Gly Ser Trp Met His
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H2区重链(AbM)
<400> 55
Glu Ile His Leu Asn Arg Gly Thr Thr Asn
1 5 10
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H2区重链(Kabat)
<400> 56
Glu Ile His Leu Asn Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H2区重链(Contact)
<400> 57
Trp Ile Gly Glu Ile His Leu Asn Arg Gly Thr Thr Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H3区重链(Contact)
<400> 58
Ala Arg Ser Pro Gly Phe Ala
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-L1区轻链(Contact)
<400> 59
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1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-L2区轻链(Contact)
<400> 60
Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-L2区轻链(Contact)
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Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe
1 5
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<211> 10
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<220>
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<223> mAb NMC-303CDR-H1区重链(Contact)
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-H2区重链(AbM)
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Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-H2区重链(Kabat)
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Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-H2区重链(Contact)
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Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn
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Thr Arg Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-L2区轻链(Contact)
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Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303CDR-L2区轻链(Contact)
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Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR1区重链(Chothia)
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR1区重链(Kabat)
<400> 73
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 74
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR1区重链(Contact)
<400> 74
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe
20 25
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR2区重链(Chothia)
<400> 75
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Phe Ile
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR2区重链(Kabat)
<400> 76
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR2区重链(Contact)
<400> 77
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR3区重链(Chothia)
<400> 78
Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
1 5 10 15
Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu
20 25 30
Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
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<211> 39
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR3区重链(AbM)
<400> 79
Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser
20 25 30
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR3区重链(Kabat)
<400> 80
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR3区重链(Contact)
<400> 81
Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser
20 25 30
Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR4区重链(Chothia)
<400> 82
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103HFR4区重链(Contact)
<400> 83
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR1区轻链(Chothia)
<400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 85
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR1区轻链(Contact)
<400> 85
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Asn Leu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR2区轻链(Chothia)
<400> 86
Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Ser
1 5 10 15
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR2区轻链(Contact)
<400> 87
Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln
1 5
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR3区轻链(Chothia)
<400> 88
Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 89
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR3区轻链(Contact)
<400> 89
Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe
1 5 10 15
Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe
20 25 30
Cys
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR4区轻链(Chothia)
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103LFR4区轻链(Contact)
<400> 91
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 92
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR1区重链(Chothia)
<400> 92
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 93
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR1区重链(Kabat)
<400> 93
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Leu Ser
20 25 30
<210> 94
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR1区重链(Contact)
<400> 94
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Leu
20 25
<210> 95
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR2区重链(Chothia)
<400> 95
Trp Met His Trp Ala Met Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
1 5 10 15
Gly Glu Ile
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR2区重链(Kabat)
<400> 96
Trp Ala Met Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR2区重链(Contact)
<400> 97
Trp Ala Met Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
1 5 10
<210> 98
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR3区重链(Chothia)
<400> 98
Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Val Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
20 25 30
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 99
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR3区重链(Kabat)
<400> 99
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Val Asp Thr Ser
1 5 10 15
Ser Ser Thr Ala Tyr Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35
<210> 100
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR3区重链(Kabat)
<400> 100
Lys Ala Thr Val Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Val Asp
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 101
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR3区重链(Contact)
<400> 101
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Val Asp Thr Ser
1 5 10 15
Ser Ser Thr Ala Tyr Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR4区重链(Chothia)
<400> 102
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204HFR4区重链(Contact)
<400> 103
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 104
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR1区轻链(Chothia)
<400> 104
Gly Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys
20
<210> 105
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR1区轻链(Contact)
<400> 105
Gly Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
20 25
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR2区轻链(Chothia)
<400> 106
Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR2区轻链(Contact)
<400> 107
Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln
1 5
<210> 108
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR3区轻链(Chothia)
<400> 108
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
1 5 10 15
Leu Arg Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 109
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR3区轻链(Contact)
<400> 109
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe
1 5 10 15
Thr Leu Arg Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
20 25 30
Cys
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR4区轻链(Chothia)
<400> 110
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204LFR4区轻链(Contact)
<400> 111
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 112
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR1区重链(Chothia)
<400> 112
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 113
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR1区重链(Kabat)
<400> 113
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 114
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR1区重链(Contact)
<400> 114
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
20 25
<210> 115
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR2区重链(Chothia)
<400> 115
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
1 5 10 15
Gly Gly Ile
<210> 116
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR2区重链(Kabat)
<400> 116
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR2区重链(Contact)
<400> 117
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
1 5 10
<210> 118
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR3区重链(Chothia)
<400> 118
Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp
1 5 10 15
Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
20 25 30
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
35 40
<210> 119
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR3区重链(AbM)
<400> 119
Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
1 5 10 15
Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
35
<210> 120
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR3区重链(Kabat)
<400> 120
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 121
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR3区重链(Contact)
<400> 121
Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
1 5 10 15
Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR4区重链(Chothia)
<400> 122
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 123
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303HFR4区重链(Contact)
<400> 123
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 124
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR1区轻链(Chothia)
<400> 124
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys
20
<210> 125
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR1区轻链(Contact)
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
20 25
<210> 126
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR2区轻链(Chothia)
<400> 126
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR2区轻链(Contact)
<400> 127
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
1 5
<210> 128
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR3区轻链(Chothia)
<400> 128
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 129
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR3区轻链(Contact)
<400> 129
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe
20 25 30
Cys
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR4区轻链(Chothia)
<400> 130
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303LFR4区轻链(Contact)
<400> 131
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 132
<211> 349
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103重链可变区
<400> 132
gaggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtacaa cttctgggtt caccttcact cattactaca tgagctgggt ccgccagcct 120
ccaggcaagg cacttgagtg gttgggcttt attagaaata aagctaaggg ttacacagca 180
gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240
ctctatcttc aaatgaacac cctgagacct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300
gatattgggg acaactgggg tcaaggaacc ttagtcaccg tctcctcag 349
<210> 133
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303重链
<400> 133
atgggatgga actatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60
gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120
tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactatatgt actgggtgaa gcagaggcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat tggggggatt aatcctagga atggtggtac taacttcaat 240
gagaagttca agaacaaggc cacactgact gcagacaaat cctccaccac agcctacatg 300
caactcagta gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag atctggttac 360
tatgctatgg actattgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 134
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103轻链可变区
<400> 134
gatattgtga tgacgcaggc tgccttctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gaatctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat ctcgggtgtc caatctggcc 180
tcaggagtcc caaacaggtt cagtggcagt gagtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tatttctgtg ctcaactgct agaactcccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagttggaa ataaaac 337
<210> 135
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303重链可变区
<400> 135
Met Gly Trp Asn Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 136
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204重链可变区
<400> 136
gaggtgcagc tgcaggagtc tgggtctgtg ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcga caccctcagc ggctcctgga tgcactgggc gatgcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag attcatctta atagaggtac tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacagtg actgtggaca catcctccag cacagcctac 240
gtggatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaagcccg 300
gggtttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcag 346
<210> 137
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303轻链可变区
<400> 137
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 180
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctcggac gttcggtgga 360
ggcaccaagc tggaaatcaa a 381
<210> 138
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204轻链可变区
<400> 138
ggcattgtga tgacccaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacagtta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
actagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcct 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaac 337
<210> 139
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303轻链可变区
<400> 139
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 140
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303重链可变区
<400> 140
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattgggggg attaatccta ggaatggtgg tactaacttc 180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgcagaca aatcctccac cacagcctac 240
atgcaactca gtagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatctggt 300
tactatgcta tggactattg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 141
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H2区重链(IMGT)
<400> 141
Ile His Leu Asn Arg Gly Thr Thr
1 5
<210> 142
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-303轻链可变区
<400> 142
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctcggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-L1区轻链(IMGT)
<400> 143
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Ser Tyr
1 5 10
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H1区重链(IMGT)
<400> 144
Phe Thr Phe Thr His Tyr Tyr
1 5
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H2区重链(IMGT)
<400> 145
Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-H3区重链(IMGT)
<400> 146
Ala Arg Asp Ile Gly Asp Asn
1 5
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-103CDR-L1区轻链(IMGT)
<400> 147
Lys Asn Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr
1 5 10
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb NMC-204CDR-H1区重链(IMGT)
<400> 148
Gly Asp Thr Leu Ser Gly Ser Trp
1 5

Claims (118)

1.一种特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合于肽，其中所述肽的序列由MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)、TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)、或CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ ID NO:3)组成。
2.权利要求1所述的抗体或片段，其中所述肽的序列为MCNTNMSVPTDGAVT(SEQ ID NO:1)。
3.权利要求1所述的抗体或片段，其中所述肽的序列为TTSQIPASEQE(SEQ ID NO:2)。
4.权利要求1所述的抗体或片段，其中所述肽的序列为CPVCRQPIQMIVLTYFP(SEQ IDNO:3)。
5.一种特异性结合于HDM2的人源化抗体或其片段，所述抗体或片段包含：(i)包含重链可变区(VH)互补决定区(“CDR”)1、VH CDR2和VH CDR3的VH；所述VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3是具有选自SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SED ID NO:40的氨基酸序列的VH的CDR；或(ii)包含轻链可变区(VL)CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL；所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3是具有选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL的CDR。
6.权利要求5所述的人源化抗体或片段，其包含VH，其中VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3属于具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH。
7.权利要求5或6所述的人源化抗体或片段，其包含VL，其中VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3属于具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。
8.权利要求5所述的人源化抗体或片段，其包含VH，其中VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3属于具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH。
9.权利要求5或8所述的人源化抗体或片段，其包含VL，其中VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3属于具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL。
10.权利要求5所述的人源化抗体或片段，其包含VH，其中VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3属于具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH。
11.权利要求5或10所述的人源化抗体或片段，其包含VL，其中VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3属于具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL。
12.一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHY(SEQ ID NO:18)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列RNKAKGYT(SEQ ID NO:19)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ ID NO:20)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GFTFTHYYMS(SEQ ID NO:42)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:45)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ ID NO:20)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列HYYMS(SEQ ID NO:43)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列FIRNKAKGYTAEYSASVKG(SEQ ID NO:46)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列DIGDN(SEQ IDNO:20)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列THYYMS(SEQ ID NO:44)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WLGFIRNKAKGYTAE(SEQ ID NO:47)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGD(SEQ ID NO:48)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列FTFTHYY(SEQ ID NO:144)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IRNKAKGYTA(SEQ ID NO:145)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARDIGDN(SEQ ID NO:146)。
13.一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGS(SEQ ID NO:24)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列HLNRGT(SEQ ID NO:25)，所述VH CDR3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ ID NO:26)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSWMH(SEQ ID NO:52)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTN(SEQ ID NO:55)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ ID NO:26)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GSWMH(SEQ ID NO:53)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列EIHLNRGTTNYNEKFKG(SEQ ID NO:56)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SPGFAY(SEQ IDNO:26)；
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SGSWMH(SEQ ID NO:54)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGEIHLNRGTTN(SEQ ID NO:57)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ ID NO:58)；或
(v)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GDTLSGSW(SEQ ID NO:148)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列IHLNRGTT(SEQ ID NO:143)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列ARSPGFA(SEQ ID NO:58)。
14.一种特异性结合于HDM2的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含VH互补决定区(“CDR”)1、VH CDR 2和VH CDR 3，其中：
(i)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSY(SEQ ID NO:30)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列NPRNGG(SEQ ID NO:31)，所述VH CDR3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ ID NO:32)；
(ii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列GYTFTSYYMY(SEQ ID NO:62)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTN(SEQ ID NO:65)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ IDNO:32)；
(iii)所述VH CDR 1具有氨基酸序列SYYMY(SEQ ID NO:63)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列GINPRNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:66)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列SGYYAMDY(SEQ IDNO:32)；或
(iv)所述VH CDR 1具有氨基酸序列TSYYMY(SEQ ID NO:64)，所述VH CDR 2具有氨基酸序列WIGGINPRNGGTN(SEQ ID NO:67)，所述VH CDR 3具有氨基酸序列TRSGYYAMD(SEQ IDNO:68)。
15.权利要求12所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段还包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RSSKNLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:21)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列RVSNLAS(SEQ ID NO:22)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPYT(SEQID NO:23)；
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列LHSNGITYLYWY(SEQ ID NO:49)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLISRVSNLA(SEQ ID NO:50)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPY(SEQ IDNO:51)；或
(iii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列KNLLHSNGITY(SEQ ID NO:147)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列RVS，所述VL CDR 3具有氨基酸序列AQLLELPYT(SEQ ID NO:23)。
16.权利要求13所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段还包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RSSKSLLHSNGNSYLY(SEQ ID NO:27)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列RMSNLAS(SEQ ID NO:28)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQID NO:29)；
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列LHSNGNSYLYWF(SEQ ID NO:59)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLIYRMSNLA(SEQ ID NO:60)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPF(SEQ IDNO:61)；或
(iii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列KSLLHSNGNSY(SEQ ID NO:141)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列RMS，所述VL CDR 3具有氨基酸序列MQHLEYPFT(SEQ ID NO:29)。
17.权利要求14所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段还包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含VL互补决定区(“CDR”)1、VL CDR 2和VL CDR 3，其中：
(i)所述VL CDR 1具有氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO:33)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:34)，所述VL CDR3具有氨基酸序列QQGNTLPRT(SEQ ID NO:35)；或
(ii)所述VL CDR 1具有氨基酸序列SNFLNWY(SEQ ID NO:69)，所述VL CDR 2具有氨基酸序列LLIYYTSRLH(SEQ ID NO:70)，所述VL CDR 3具有氨基酸序列QQGNTLPR(SEQ ID NO:71)。
18.权利要求12所述的抗体或片段，其包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的VH。
19.权利要求1、12或18所述的抗体或片段，其包含具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的VL。
20.权利要求13所述的抗体或片段，其包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的VH。
21.权利要求1、13或20所述的抗体或片段，其包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL，或与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的VL。
22.权利要求14所述的抗体或片段，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH，或与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的VH。
23.权利要求1、14或22所述的抗体或片段，其包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL，或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的VL。
24.权利要求1-4和12-23中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体是人源化抗体。
25.权利要求1-4和12-23中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体是人抗体。
26.权利要求1-4和12-23中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体是嵌合抗体。
27.权利要求1-26中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
28.权利要求1-27中任一项所述的抗体或片段，其为免疫球蛋白。
29.权利要求28所述的抗体或片段，其中所述免疫球蛋白是IgG。
30.权利要求28所述的抗体或片段，其中所述免疫球蛋白属于IgG1同种型。
31.权利要求28所述的抗体或片段，其中所述免疫球蛋白属于IgG3同种型。
32.权利要求1-28中任一项所述的抗体或片段，其包含Fc区，并且其中所述Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4或人IgM Fc区。
33.权利要求32所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段介导补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
34.权利要求33所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
35.权利要求1-27中任一项所述的抗体或片段，其为Fv片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体分子或单链Fv(scFv)。
36.权利要求5-23中任一项所述的抗体或片段，其中所述HDM2是缺少核定位信号结构域的HDM2变体，缺少SEQ ID NO:4的氨基酸179至185的序列的HDM2变体，和/或缺少SEQ IDNO:4的氨基酸464至471的序列的HDM2变体。
37.权利要求1-36中任一项所述的抗体或片段，其是纯化的。
38.权利要求1-37中任一项所述的抗体或片段，其抑制肿瘤细胞的体内增殖。
39.一种抗体或其片段，其与权利要求1-38中任一项所述的抗体或片段竞争结合于M(H)DM2/4。
40.一种抗体或其片段，其(i)与小鼠抗HDM2 IgG1抗体竞争结合于序列SEQ ID NO:1的肽，所述小鼠抗HDM2 IgG1抗体包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或(ii)与小鼠抗HDM2 IgG3抗体竞争结合于SEQ ID NO:2的肽，所述小鼠抗HDM2 IgG3抗体包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH，和具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL；或(iii)与小鼠IgM抗体竞争结合于SEQ IDNO:3的肽，所述小鼠IgM抗体包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH，和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL。
41.一种抗体-药物偶联物，其包含结合于细胞毒性药物的权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段。
42.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段或权利要求41所述的抗体-药物偶联物。
43.一种在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽，(ii)权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段，(iii)权利要求41所述的抗体-药物偶联物，或(iv)权利要求42所述的药物组合物。
44.一种在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。
45.一种在患有癌症的对象中抑制或预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽，(ii)权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段，(iii)权利要求41所述的抗体-药物偶联物，或(iv)权利要求42所述的药物组合物。
46.一种在患有癌症的对象中抑制或预防转移的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。
47.一种在有此需要的对象中预防癌症复发或预防癌症再发的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽，(ii)权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段，(iii)权利要求41所述的抗体-药物偶联物，或(iv)权利要求42所述的药物组合物。
48.一种在患有癌症的对象中预防癌症复发或预防癌症再发的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。
49.一种相对于未用抗M(H)DM2/4抗体或片段治疗的对象在患有癌症的对象中提高存活率的方法，所述方法包括向所述对象施用：(i)抗体或其片段，其特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽，(ii)权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段，(iii)权利要求41所述的抗体-药物偶联物，或(iv)权利要求42所述的药物组合物。
50.一种相对于未用抗M(H)DM2/4抗体或片段治疗的对象在患有癌症的对象中提高存活率的方法，所述方法包括向所述对象施用：特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分。
51.权利要求43-50中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述对象施用权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段。
52.权利要求43、45、47和49中任一项所述的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段，权利要求41所述的抗体-药物偶联物或权利要求42所述的药物组合物。
53.权利要求52所述的方法，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。
54.权利要求43、45、47和49中任一项所述的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。
55.权利要求43-52和56中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段是特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的人源化抗体或其片段。
56.权利要求43-50和54中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段是特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的人抗体或其片段。
57.权利要求43-50和54中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段是嵌合抗体。
58.权利要求43-50和54-57中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段是特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的单克隆抗体或其片段。
59.权利要求43-50和54-58中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段是免疫球蛋白。
60.权利要求59所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG。
61.权利要求59所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG1同种型。
62.权利要求59所述的方法，其中所述免疫球蛋白是IgG3同种型。
63.权利要求43-50和54-59中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段包含Fc区，并且其中所述Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4或人IgM Fc区。
64.权利要求63所述的方法，其中所述抗体或片段介导补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
65.权利要求64所述的方法，其中所述抗体或片段介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
66.权利要求43-50和54-58中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段是Fv片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体分子或单链Fv(scFv)。
67.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位在SEQ ID NO:4的氨基酸19至50内。
68.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位在SEQ ID NO:4的氨基酸154至167内。
69.权利要求43-52和56-68中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位在SEQ ID NO:4的氨基酸1至60内。
70.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位在SEQ ID NO:4的氨基酸26至60内。
71.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位在SEQ ID NO:4的氨基酸101至200内。
72.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位在SEQ ID NO:4的氨基酸50至60内。
73.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位在癌细胞的质膜上的HDM2的C端的末端60个氨基酸内。
74.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段与小鼠抗HDM2抗体OP145竞争结合于M(H)DM2/4。
75.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段与小鼠抗HDM2抗体965(SMP14)竞争结合于M(H)DM2/4。
76.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段与兔抗HDM2抗体sc-813(N-20)竞争结合于M(H)DM2/4。
77.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段与兔抗HDM2抗体sc-812(C-18)竞争结合于M(H)DM2/4。
78.权利要求43-50和54-66中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段与小鼠抗HDM2抗体M01克隆1A7竞争结合于M(H)DM2/4。
79.权利要求43-50和54-78中任一项所述的方法，其中所述M(H)DM2/4是缺少核定位信号结构域的HDM2变体，缺少SEQ ID NO:4的氨基酸179至185的序列的HDM2变体，和/或缺少SEQ ID NO:4的氨基酸464至471的序列的HDM2变体。
80.权利要求43-50和54-79中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段是纯化的。
81.权利要求43、45、47和49中任一项所述的方法，所述方法包括向所述对象施用抗体-药物偶联物，所述抗体-药物偶联物包含结合于细胞毒性药物的特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽。
82.权利要求54-80中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性药物。
83.权利要求43-82中任一项所述的方法，其中所述癌症是已知转移的癌症类型。
84.权利要求43-83中任一项所述的方法，其中所述癌症是晚期癌症。
85.权利要求43-84中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
86.权利要求43-85中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体癌。
87.权利要求86所述的方法，其中所述癌症是肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤或儿童横纹肌肉瘤。
88.权利要求87所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、肺癌或结肠癌。
89.权利要求43-85中任一项所述的方法，其中所述癌症是非实体癌。
90.权利要求89所述的方法，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤。
91.权利要求43-90中任一项所述的方法，其中所述抗体或片段静脉内、腹膜内、肌内、皮下或肿瘤内施用。
92.权利要求43-91中任一项所述的方法，还包括向所述对象施用与所述抗体或片段或抗体-药物偶联物不同的癌症治疗。
93.权利要求92所述的方法，其中所述癌症治疗是化学治疗。
94.权利要求93所述的方法，其中所述化学治疗是吉西他滨。
95.权利要求93所述的方法，其中所述化学治疗是白蛋白结合型紫杉醇。
96.权利要求93所述的方法，其中所述化学治疗是顺铂。
97.权利要求93所述的方法，其中所述化学治疗是5-FU。
98.权利要求93所述的方法，其中所述化学治疗是紫杉醇。
99.权利要求93所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌，并且其中所述化学治疗是吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合。
100.权利要求99所述的方法，其中所述吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的施用剂量比当吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇未与抗癌抗体组合施用时的剂量更低。
101.权利要求99所述的方法，其中所述对象是人，并且其中所述吉西他滨以等于或小于1,000mg/m2的剂量施用，所述白蛋白结合型紫杉醇以等于或小于125mg/m2的剂量施用。
102.权利要求99所述的方法，其中所述对象是人，并且其中吉西他滨以等于或小于等于或小于500mg/m2的剂量施用，所述白蛋白结合型紫杉醇以等于或小于62.5mg/m2的剂量施用。
103.权利要求99-102中任一项所述的方法，其中吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的所述组合以每2周或更短的频率施用。
104.权利要求43-100中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
105.权利要求92所述的方法，其中所述癌症治疗是免疫治疗。
106.权利要求105所述的方法，其中所述免疫治疗是一种或多种抑制性检查点分子的抑制剂。
107.权利要求106所述的方法，其中所述一种或多种抑制性检查点分子选自：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、OX40和LAG-3。
108.一种选择和治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括：
确定患有癌症的对象，其中特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段结合于癌症的完整细胞的表面；和
向所述对象施用：(i)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞穿透肽，或包含结合于细胞毒性药物的抗体或片段的抗体-药物偶联物，(ii)特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段不结合于细胞毒性组分，(iii)权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段，(iv)权利要求41所述的抗体-药物偶联物或(v)权利要求42所述的药物组合物。
109.权利要求108所述的方法，其还包括在步骤(b)之前确定特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段是否结合于癌症的完整细胞的表面的步骤，其中特异性结合于M(H)DM2/4的细胞外可接近的表位的抗体或其片段是权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段。
110.权利要求109所述的方法，其进一步包括在所述确定步骤之前获得所述癌症的完整细胞的步骤。
111.一种在对象中诊断癌症的方法，所述方法包括：
(a)检测权利要求1-40中任一项所述的抗体或片段是否结合于对象的完整细胞的表面；和
(b)如果在步骤(a)中检测到结合，则诊断所述对象患有癌症。
112.权利要求111所述的方法，其为离体方法。
113.权利要求111所述的方法，还包括在步骤(a)之前从对象获得完整细胞。
114.权利要求111所述的方法，其包括在步骤(a)中的检测之前向所述对象施用所述抗体或片段，并且其中所述检测通过所述对象的体内成像来进行。
115.权利要求108-114中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述抗体或片段被标记。
116.权利要求108-114中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
117.权利要求1-4中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位。
118.权利要求43-50中任一项所述的方法，所述方法包括向所述对象施用特异性结合于HDM2的细胞外可接近的表位的抗体或其片段。
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