CN116082500A - 抗SARS-CoV-2抗体nCoV1和nCoV2及其应用 - Google Patents
抗SARS-CoV-2抗体nCoV1和nCoV2及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116082500A CN116082500A CN202211581150.7A CN202211581150A CN116082500A CN 116082500 A CN116082500 A CN 116082500A CN 202211581150 A CN202211581150 A CN 202211581150A CN 116082500 A CN116082500 A CN 116082500A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- binding fragment
- seq
- antigen
- antigen binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 118
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 117
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 116
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 115
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 98
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 29
- 108091006197 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Proteins 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 12
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims description 3
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 24
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 abstract description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 abstract description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 19
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 15
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 15
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 10
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 5
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 4
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 4
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000012004 kinetic exclusion assay Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101000914947 Bungarus multicinctus Long neurotoxin homolog TA-bm16 Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N N-phenyl amine Natural products NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N n,n-dichlorotriazin-4-amine Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=NN=N1 ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及新的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2抗体及其应用。本发明的抗SARS‑CoV‑2抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1‑3所示的重链可变区CDR以及SEQ ID NO:4‑6所示的轻链可变区CDR。本发明的抗体或抗原结合片段对SARS‑CoV‑2突变新毒株灵敏度高,特异性强,且不与其他β属冠状病毒发生交叉反应。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学和分子病毒学领域,本发明涉及抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体或其抗原结合片段,以及包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物,此外,还涉及所述抗体或其抗原结合片段的用途,包括用于检测新冠病毒。
背景技术
SARS-CoV-2属于冠状病毒科的β冠状病毒属,为单股正链RNA(核糖核酸)病毒,基因组非常小,约30KB,RNA病毒复制依赖于自身携带的RNA聚合酶,RNA聚合酶不具有核酸酶校对活性,因此其基因组在复制过程中核苷酸的错配率就比较高。因此,RNA病毒突变率很高。
早期诊断对于感染病人的及早发现至关重要。目前新型冠状病毒的诊断方法主要有:1)基于病毒核酸扩增的分子检测,2)抗原快速检测,和3)抗体检测。抗原检测不需要复杂设备,具有速度快、成本低的优点,而且便于居家自检。核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP)是新冠病毒感染过程中含量最丰富的病毒结构蛋白,在病毒感染人体细胞后会大量表达,引起强烈的免疫反应。NP蛋白的基因序列相对保守稳定,与谱系上最接近的SARS-CoV NP蛋白存在约90%的同一性,因为其良好的免疫原性和稳定性,NP蛋白常作为新冠病毒的检测靶标,进行新冠抗原检测,用于病例筛查。
一些携带关键位点突变的病毒变异株,如被世界卫生组织(WHO)列为“关注变异株”(variants of concern,VOC)的Alpha株(B.1.1.7)、Beta株(B.1.351)、Gamma株(P.1)、Delta株(B.1.617.2)和Omicron株(B.1.1.529)等,表现出更强的感染能力或更强的免疫逃逸能力,使现有的公共卫生干预措施或疫苗的有效性降低。作为新冠抗原检测的主要靶标,NP蛋白发生突变可能会影响抗原检测的灵敏度。面对全球不断出现的变异毒株,特别是奥密克戎毒株,需要进一步寻找针对新毒株灵敏度更高、特异性更强的NP抗体,确保变异株能够被检测出来,同时,由于新型冠状病毒NP蛋白与其他β属冠状病毒的NP蛋白具有极高同源性,会干扰NP抗体的特异性识别从而产生“假阳性”,因此也需要一种不与这些冠状病毒产生交叉反应的抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对新毒株灵敏度更高、特异性更强且不与其他β属冠状病毒发生交叉反应的抗SARS-CoV-2抗体。
本发明第一方面提供一种抗体或其抗原结合片段,其与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合,所述抗体或其抗原结合片段的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述抗体或抗原结合片段的轻链包括分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQ ID NO:1所示序列为GYTFTSY;SEQ IDNO:2所示序列为YPGNGX1,其中X1为H或V;SEQ ID NO:3所示序列为FHYYGPX2DY,其中X2为L或F;SEQ ID NO:4所示序列为RX3QX4ISNYLN,其中X3为AG或TS,X4为G或D;SEQ ID NO:5所示序列为YTSRLHS;SEQ ID NO:6所示序列为QQGNTLPRT。
进一步地,所述X1为H,所述X2为L,所述X3为AG,所述X4为G,该抗体或其抗原结合片段为nCoV1,并且所述VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9表示,所述抗体或抗原结合片段是由杂交瘤细胞F1G11产生的,所述杂交瘤细胞F1G11于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45315(请求保藏人为:深圳重链生物科技有限公司)。
进一步地,所述X1为V,所述X2为F,所述X3为TS,所述X4为D,该抗体或其抗原结合片段为nCoV2,并且所述VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12表示。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段选自双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体中的任意一种。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段还包含恒定区。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的恒定区选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的恒定区的种属来源为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的恒定区来源于小鼠。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO:13所示,所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO:14所示。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO:15所示,所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO:16所示。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段以10-8M或更小的KD结合SARS-CoV-2NP蛋白。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段以小于100nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于10nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于1nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,例如以0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合SARS-CoV-2蛋白。
本发明第二方面提供一种杂交瘤细胞,所述杂交瘤细胞产生上述的单克隆抗体nCoV1,所述杂交瘤细胞于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45315。
本发明第三方面提供一种核苷酸序列,所述核苷酸序列编码上述的抗体或其抗原结合片段。
本发明第四方面提供一种载体,所述载体含有编码上述抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
进一步的,所述载体选自pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任意一种。
本发明第五方面提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述的核苷酸序列或包含上述的载体。
本发明第六方面提供上述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明第七方面提供一种试剂或试剂盒,包含上述的抗体或其抗原结合片段。
本发明第八方面提供一种检测新型冠状病毒的方法,所述方法用于非诊断目的,包括使用上述的抗体或抗原结合片段的步骤。
进一步地,所述方法是通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒蛋白检测的方法。
进一步地,所述通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法选自胶体金法、免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法中的任意一种或几种。
进一步的,所示可显示信号指示剂选自胶体金、荧光物质、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有下列优点:
本发明提供的抗体或其抗原结合片段或突变的抗体或其抗原结合片段,均可特异性结合SARS-CoV-2的NP蛋白,对奥密克戎、德尔塔和野生毒株都显示出很好的亲和力,且对其他四种常见冠状病毒HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白都没有交叉反应,说明上述的抗体或抗原结合片段应对SARS-CoV-2野生株及其突变株的检测中具有重要的研究和应用价值;同时采用重组技术获得了稳定性更好、批间差更小的重组抗体或其抗原结合片段,便于其应用,提高了检测效率,节约了试剂盒成本。使用包括抗体或其抗原结合片段和突变的抗体或其抗原结合片段的试剂盒,具有良好的广谱性和敏感性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为单克隆抗体nCoV1与SARS-CoV-2NP蛋白结合能力(突变株Omicron-NP蛋白,delta-NP蛋白以及野生型WT-NP蛋白)的对比实验结果;
图2为单克隆抗体nCoV2与SARS-CoV-2NP蛋白结合能力(突变株Omicron-NP蛋白,delta-NP蛋白以及野生型WT-NP蛋白)的对比实验结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例及附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的细胞株、试剂及载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得,它们仅作为举例,对本发明不是唯一的,可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的病毒学、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR,命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabatetal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefrancetal.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。在本发明中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Chothia编号系统确定。
如本文中所使用的,术语“构架区”或“FR”残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。通常参见Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989)。在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(singledomainantibody)、嵌合抗体、线性抗体(linearantibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、probody和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的,术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段;术语“Fab'片段”意指还原连接F(ab')2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段,由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的,术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是,能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为,六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而,即便是一个可变区(例如Fd片段,其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原,尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的,术语“Fc”意指,由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能,但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的,术语“scFv”是指,包含VL和VH结构域的单个多肽链,其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见,例如,Bird等人,Science242:423-426(1988);Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);和Pluckthun,The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113卷,Roseburg和Moore编,Springer-Verlag,纽约,第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),CancerRes.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。在一些情况下,scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成di-scFv,其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成(scFv)2,其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指,这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类),但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabillyetal.;Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。
如本文中所使用的,术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同一性。通常而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体),全部或部分的非CDR区(例如,可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地,人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”,提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中,供体免疫球蛋白是非人源(例如鼠)抗体,受体框架可以天然存在的人框架,或与其相比具有约85%、90%、95%、99%或更高同一性的序列。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定,例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
本文提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖本文提供的抗体序列的各种变体。术语“变体”是指,保留其亲本抗体对于SARS-CoV-2的结合特异性,但具有由突变赋予的一个或多种期望特性。抗体变体在上述的一个或多个CDR序列中、重链可变区或轻链可变区的一个或多个非CDR序列中和/或恒定区(例如Fc区)中,包括一个或多个突变。举例来说,抗体变体可具有改进的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、降低的糖基化风险、降低的脱氨基作用、降低或耗竭的效应功能、改进的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH灵敏性和/或与结合的相容性。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。包括质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可以含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
在本文中,核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”、“核苷酸”是同义的,包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如,Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Goluband D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A表示。
本发明实施例提供一种抗体或其抗原结合片段,其与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合,其包括下述三个依据Chothia编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):
(a)氨基酸序列SEQ ID NO:1,其序列组成为GYTFTSY,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(b)氨基酸序列SEQ ID NO:2,其序列组成为YPGNGX1,其中X1为H或V,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和/或,
(c)氨基酸序列SEQ ID NO:3,其序列组成为FHYYGPX2DY,其中X2为L或F,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
和/或,还包括下述三个依据Chothia编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):
(d)氨基酸序列SEQ ID NO:4,其序列组成为RX3QX4ISNYLN,其中X3为AG或TS,X4为G或D,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(e)氨基酸序列SEQ ID NO:5,其序列组成为YTSRLHS,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和/或,
(f)氨基酸序列SEQ ID NO:6,其序列组成为QQGNTLPRT,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
具体地,所述置换为保守置换。
具体地,所述抗体或其抗原结合片段可以是双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
具体地,所述抗体或其抗原结合片段包括一个或多个氨基酸突变但仍保持与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合。具体地,其中所述突变中的至少一个在一个或多个VH或VL序列中但不在任一个CDR序列中。
具体地,所述抗体或其抗原结合片段的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述抗体或抗原结合片段的轻链包括分别由SEQ IDNO:4-6所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQ ID NO:1所示序列为GYTFTSY;SEQ ID NO:2所示序列为YPGNGX1,其中X1为H或V;SEQ ID NO:3所示序列为FHYYGPX2DY,其中X2为L或F;SEQ ID NO:4所示序列为RX3QX4ISNYLN,其中X3为AG或TS,X4为G或D;SEQ ID NO:5所示序列为YTSRLHS;SEQ ID NO:6所示序列为QQGNTLPRT。
具体地,所述X1为H,所述X2为L,所述X3为AG,所述X4为G,该抗体或其抗原结合片段为nCoV1,并且所述VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9表示,所述抗体或抗原结合片段是由杂交瘤细胞F1G11产生的,所述杂交瘤细胞F1G11于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45315。具体地,所述X1为V,所述X2为F,所述X3为TS,所述X4为D,该抗体或其抗原结合片段为nCoV2,并且所述VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12表示。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是人源化的,以减少对人的免疫原性。对非人抗体进行人源化的方法是本领域已知的,例如可以使用本领域已知的方法将本发明抗体或其抗原结合片段的CDR区移植入人源框架序列。
在一个具体的实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段还包含恒定区。
具体地,本发明的抗体或抗原结合片段的恒定区是选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区。
具体地,本发明的抗体或抗原结合片段的恒定区的种属来源可以是大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人。
在一个具体的实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段的恒定区来源于小鼠。
在一个具体的实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO:13所示,轻链可变区序列如SEQ ID NO:14所示。
在另一个具体的实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO:15所示,轻链可变区序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明的抗体或抗原结合片段的亲和力可以通过本领域已知的任何方法确定。例如,可以通过Elisa、RIA、BIAcore或KinExA等技术测量结合的亲和力,还可以通过BIAcore或KinExA技术测量解离速率。例如使用BIAcore(SPR)通过表面等离子体共振测量结合亲和力和解离速率。
在一些实施方案中,本发明抗体或抗原结合片段以10-8M或更小的KD结合SARS-CoV-2NP蛋白。
在一些实施方案中,本发明抗体或抗原结合片段以小于100nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于10nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于1nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,例如以0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合SARS-CoV-2蛋白。
本发明实施例提供一种杂交瘤细胞,所述杂交瘤细胞产生上述的抗体,所述杂交瘤细胞于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45315。
可以通过免疫合适的宿主(例如,脊椎动物,包括人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、马、爬行动物、鱼、两栖动物,及鸟、爬行动物和鱼的卵)产生抗体。可以用本领域已知的任何方法免疫动物,免疫非人动物,如小鼠、大鼠、兔等的方法是本领域公知的。
在一个实施方案中,是用SARS-CoV-2NP蛋白免疫小鼠,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,得到杂交瘤细胞,并使用ELISA方法初步筛选出阳性杂交瘤细胞而制得。
本申请的抗体可以是来自杂交瘤的单克隆抗体,还可以是重组抗体。筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞后,可以通过逆转录酶-PCR从细胞回收重链和轻链可变区cDNAs,然后可以在宿主细胞诸如COS或CHO细胞中,选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区),表达这些可变区。然后在体外进行分析筛选,分离出表达目标抗体的宿主细胞。
在上述单克隆抗体基础上,还可以在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变,筛选出突变的重组载体。
本发明实施例提供一种核苷酸序列,所述核苷酸序列编码上述的抗体或其抗原结合片段。
具体地,所述核苷酸序列编码所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中,本发明的核苷酸序列还包括CDR区或非CDR区的突变,核苷酸序列还可以包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。
本发明实施例提供一种载体,所述载体含有编码本发明抗体或抗原结合片段的核苷酸序列,所述载体为克隆载体或表达载体,所述载体包括上述的核苷酸序列。
在一些具体实施方案中,所述载体选自pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任意一种。
在一个具体的实施方案中,所述克隆载体为pTOPO载体,所述表达载体为真核表达载体,在一个实施例中,所述表达载体为pCDNA3.1载体。
本发明实施例提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述的核苷酸序列或包含上述的载体。
具体地,所述宿主细胞的制备方法为,将包含上述的核苷酸序列或包含上述的重组载体导入宿主细胞内。
具体地,所述宿主细胞包括但不限于,原生动物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、BHK细胞、HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
在一些实施方案中,本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞,例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHODG44)。在一个具体的实施例中,本发明的宿主细胞是CHO细胞。
本发明实施例提供一种制备上述抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括培养上述的宿主细胞或杂交瘤细胞,回收得到所述抗体或其抗原结合片段。
本发明实施例提供一种上述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明实施例提供一种检测新型冠状病毒的方法,所述方法用于非诊断目的,包括使用上述的抗体或抗原结合片段的步骤。
在一些实施方案中,所述方法是通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒蛋白检测的方法。
在一些实施方案中,所述通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法选自胶体金法、免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法中的任意一种或几种。
在一些实施方案中,所述可显示信号指示剂选自胶体金、荧光物质、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
在一些实施方案中,所述催化底物显色的酶选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶和乙酰胆碱脂酶中的任意一种。
在一些实施方案中,所述荧光物质选自伞形酮,荧光素,异硫氰酸荧光素,若丹明,二氯三嗪基胺荧光素,丹磺酰氯和藻红蛋白中的任意一种。
在一些实施方案中,所述化学发光试剂为氨基苯二酰肼。
在一些实施方案中,所述放射性同位素选自3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm中的任意一种。
本发明实施例提供一种试剂或试剂盒,包含上述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,所述试剂盒基于乳胶微球的免疫层析方法或胶体金的免疫层析方法。
在一些实施方案中,所述试剂盒包括标记示踪物的标记抗体、包被在硝酸纤维素膜上的包被抗体,所述标记抗体为上述的抗体或所述包被抗体为上述的抗体。
在一些实施方案中,所述示踪物为乳胶微球、胶体金或荧光微球。
在一些优选的实施方案中,包被在硝酸纤维素膜上的包被抗体的浓度为0.5-2mg/mL,优选为1mg/mL,标记乳胶微球的标记抗体的量为20μg-200μg/mg,优选为50-150μg/mg,进一步优选为50-100μg/mg,再优选为100μg/mg,标记胶体金的标记抗体的量为5-20μg/mL,优选为10μg/mL。
在一个具体的实施方式中,试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备乳胶微球或胶体金标记的标记抗体;
(2)在乳胶微球或胶体金标垫上包被乳胶微球或胶体金标记的标记抗体;
(3)在硝酸纤维素膜上包被包被抗体,作为检测线(T线);
(4)在PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、乳胶微球垫或胶体金标垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸,即得。
若检测样品为阳性,其中的样本中的新型冠状病毒抗原与标记乳胶微球或胶体金的标记抗体结合形成复合物,在层析作用下复合物沿纸条向前移动,经过检测线时与包被在硝酸纤维素膜上的包被抗体反应,形成免疫复合物而呈现红色条带;若检测样本为阴性,其中样本中不含有新型冠状病毒抗原,不会形成免疫复合物,在检测线处不会出现条带,仅在质控线显色;质控线在检测阳性样本和阴性样本时均应出现条带,所显现的带色条带是判定层析过程是否是正常的标准,同时也作为试剂的内控标准。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
实施例1:杂交瘤细胞的建立及筛选
抗原偶联和免疫
将纯化出的SARS-CoV-2NP蛋白(WT野生型)作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄、雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次,每次免疫间隔2周,免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将SARS-CoV-2NP蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经背部皮下多点注射,后三次免疫将SARS-CoV-2NP蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经腹腔注射。第四次免疫后7天,对小鼠断尾采血,分离血清,采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平,以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1:10000的小鼠进行细胞融合实验,在细胞融合实验前3天用不加佐剂的SARS-CoV-2N蛋白经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立
融合当天,在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5的比例融合,充分混匀,在与PEG融合前,洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500,轻轻振荡,以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞,再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中,并且在37℃、5%CO2条件下培养细胞。培养4至7天后,改用HT培养基进行培养,当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时,取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选
取SARS-CoV-2NP蛋白,用包被缓冲液(0.05mol/L,pH9.6,PBS)稀释,最终浓度为1μg/ml,以100μL/孔加入至96孔板中,于4℃包被过夜;弃包被液,用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次,拍干;用含2%BSA的PBST封闭,150μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干;将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)底物,100μL/孔,室温避光显色10min;每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下,检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1,以测定孔(SARS-CoV-2NP)的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
实施例2:单抗的制备与纯化
阳性细胞株克隆化
将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后,稀释成100个细胞/10mL培养基,将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。6-7天后,显微镜下可观察到克隆细胞的形成,标记出单个克隆生长孔,取出细胞上清,进行ELISA检测(与上述融合检测相同),选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得两株稳定分泌抗SARS-CoV-2NP抗体的细胞株,分别命名为杂交瘤细胞株F1G11和D6C9。
杂交瘤细胞F1G11于2022年9月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.45315。
杂交瘤细胞D6C9的保藏号为CGMCC No.45316。
细胞上清单抗的制备与纯化
将上述的杂交瘤细胞株用含15%血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养,当扩培至约4×107个/皿时,以800rpm离心5min,弃上清并将细胞转移到2L转瓶中,加入无血清培养基,使细胞密度约为3×105个/ml,转瓶培养。继续培养1~2周后,当细胞死亡率达到80%-90%时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml),收取细胞悬液,以6000rpm高速离心20min,取上清,对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由F1G11杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作nCoV1。
经微量分光光度计鉴定,nCoV1单克隆抗体的浓度约为2-4mg/mL。将纯化后的单抗浓度测定,并分装(100μL/管,浓度为1mg/ml),保存在4℃-8℃。
纯度检测
用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析该单克隆抗体,在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下,利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比,纯度均达到大于98%。
实施例3:抗体与SARS-CoV-2NP蛋白结合能力(突变株Omicron-NP蛋白,delta-NP蛋白以及野生型WT-NP蛋白)测试
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释三种SARS-CoV-2NP蛋白,使其浓度为1μg/ml,以100μL/孔加入至96孔酶标板,于4℃包被过夜,在自动洗板机上用PBST洗涤3次,拍干。HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白,以相同浓度、方式包板处理,作为对照。用含2% BSA的PBST封闭,150μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗SARS-CoV-2NP蛋白nCoV1单克隆抗体进行梯度稀释,抗体起始浓度为5μg/ml,依次按三倍用PBS进行梯度稀释,得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板,于37℃孵育1h,洗涤3次,拍干。加入1:20000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干。TMB底物以100μL/孔加入,于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪在450nm(OD)下测定光密度(OD450nm)。
通过Elisa实验分析单克隆抗体nCoV1对SARS-CoV-2NP的结合活性。结果如图1所示,尽管强度不同,该单克隆抗体均可特异性结合SARS-CoV-2的NP,对奥密克戎、德尔塔和野生毒株都显示出很好的亲和力,其中,nCoV1单克隆抗体与野生毒株的NP蛋白结合的EC50为0.2nM,与奥密克戎的NP蛋白结合的EC50为0.24nM,与德尔塔的NP蛋白结合的EC50为0.24nM,并且,该单克隆抗体对其他四种常见冠状病毒:HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白都没有交叉反应(图片仅显示了HCoV-HKU1作为对照的结果)。
实施例4:抗SARS-CoV-2NP蛋白单克隆抗体可变区序列的克隆和测序
从上述杂交瘤细胞株分离总RNA,通过反向转录制备cDNA,以从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列,并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(北京聚合美)说明书,对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录,参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit说明书(北京聚合美)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录,制得cDNA,冻存于-20℃备用。以上一步骤所得cDNA为模板,采用通用引物扩增重链及轻链cDNA,回收PCR扩增产物,PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(北京聚合美)说明书,将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,进行测序。对测序得到的杂交瘤细胞株的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析,经分析,重链可变区、轻链可变区、重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表1所示。
表1:抗体nCoV1的重链可变区、轻链可变区、重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
备注:划线部分为CDR区域
实施例5:重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体,通过真核表达制备稳定表达抗SARS-CoV-2NP抗体的细胞株,并对其进行大规模培养纯化。
采用PCR方法,以反转录得到的cDNA为模板,扩增鼠单克隆抗体重轻链可变区基因(VH和VL),并经测序确定序列。
对抗体的VL和VH基因,用分子克隆的方法构建重组抗体真核表达载体。将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞,电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20天后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG为二抗进行筛选,方法同上),筛选出稳定表达的重组抗体细胞株,得到的重组抗体记为nCoV1-C。
另外,对nCoV1的轻链CDR1:RAGQGISNYLN突变为RTSQDISNYLN,将nCoV1的重链CDR2:YPGNGH突变为YPGNGV;将重链CDR3:FHYYGPLDY突变为FHYYGPFDY,得到突变后的抗体nCoV2。其余序列保持不变,以相同的方式构建重组抗体真核表达载体。将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞,筛选出稳定表达的重组抗体细胞株,得到的重组抗体记作nCoV2,nCoV2的重链可变区、轻链可变区、重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表2所示:
表2:抗体nCoV2的重链可变区、轻链可变区、重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
备注:划线部分为CDR区域
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养,进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/ml接种于滚瓶中,1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO),根据生产需求决定接种瓶数量,将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时,温度为37℃,二氧化碳为5%。培养7-9天后取样显微镜下观察,当细胞活率小于50%,离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体即为重组单克隆抗体。
同实施例3所述方法,检测重组抗体nCoV2与NP蛋白的结合能力,结果如图2所示。重组抗体nCoV2可特异性结合SARS-CoV-2的NP,对奥密克戎、德尔塔和野生毒株都显示出很好的亲和力,其中,nCoV2重组抗体与野生毒株的NP蛋白结合的EC50为0.26nM,与奥密克戎的NP蛋白结合的EC50为0.2nM,与德尔塔的蛋白结合的EC50为0.3nM,并且重组抗体nCoV2且对其他四种常见冠状病毒:HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白都没有交叉反应。
亲和力分析
进一步通过表面等离子共振技术(SPR)对nCoV1-C、nCoV2重组抗体与SARS-CoV-2NP蛋白进行亲和力鉴定。
将SARS-CoV-2NP蛋白和重组抗体换至pH7.4的SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl、150mM NaCl、0.05%Tween-20)。将nCOV1-C、nCOV2抗体稀释至1μg/mL,捕获到Protein A芯片上,之后将梯度稀释的SARS-CoV-2NP蛋白依次流过Protein A芯片各通道,数据用BIAevaluation软件进行分析,结合动力学参数,并计算亲和力常数(KD),结果如表3所示。
从表3可看出,nCoV1-C抗体与WTSARS-CoV-2的亲和力为1.78×10-9M,说明该抗体可以以高亲和力结合WTSARS-CoV-2NP蛋白。
表3:nCoV1-C、nCoV2重组抗体与不同株别的SARS-CoV-2NP蛋白的亲和力测定结果
株别 | nCoV1-C | nCoV2 |
WT | <![CDATA[1.78×10<sup>-9</sup>M]]> | <![CDATA[2.07×10<sup>-9</sup>M]]> |
Omicron | <![CDATA[1.83×10<sup>-9</sup>M]]> | <![CDATA[1.75×10<sup>-9</sup>M]]> |
Delta | <![CDATA[1.81×10<sup>-9</sup>M]]> | <![CDATA[2.29×10<sup>-9</sup>M]]> |
实施例6:基于乳胶微球的免疫层析测试检测SARS-CoV-2NP
抗体标记微球,其包括如下步骤:
1.清洗微球:1mg微球加入一定量0.1M的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液pH 6.0,混匀后20000rpm离心20min,去上清;
2.活化:加入一定体积的MES缓冲液pH 6.0,超声混匀,加入12μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与12μg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),37℃反应15min,每5min混匀一次,离心20000rpm,20min弃上清;
3.偶联:加入一定体积的50mM pH=8.0的硼酸缓冲液,超声混匀,加入100ug标记抗体,37℃混匀反应过夜;
4.封闭:加入1ml BSA(5%)封闭1h,20000rpm离心20min,弃上清。
5.清洗:用0.1M pH8.5 Tris-HCl清洗2次,20000rpm离心20min,弃上清;
6.保存:加入25mM MES(pH=7.4)0.5ml保存,用25mM MES(pH=7.4),1%BSA,0.1%Tween20稀释50倍后冻干密封备用。
包被硝酸纤维素膜(NC膜):包被抗体,用10mM pH 7.4PBS,2%蔗糖溶液稀释至终浓度1mg/mL,作为T线划线液;10mM pH 7.4PBS,2%蔗糖溶液稀释鼠抗人IgG至1.5-2mg/mL作为C线划线液。采用划膜仪,将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维膜(赛多利斯140)上,划线液体量:1uL/cm;划膜速度:50mm/s。将划好的NC膜置于37℃环境烘干6-12小时,密封备用。
准备样品垫:使用10mM pH7.4 PBS处理样品垫,冻干备用;
免疫层析体系的组装:将上述已标记抗体的乳胶微球、包被有抗体的NC膜、样品垫、吸水纸、聚酯板按常规方式组装成免疫层析快速测试卡。
灵敏度测试:
分别检测含有不同浓度(2ng/mL至0.001ng/mL)的重组抗原的样本。具体地,将80μL待测样本滴加至快速测试卡,室温放置15分钟后,肉眼观察并判定结果。根据显色条带颜色的深浅,可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性,结果如表4-5所示,以HCoV-HKU1 NP蛋白作为对照。将显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较,选出最接近的颜色,将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性。色卡分为C1-C9九档,其中,C1为强阳性,表示单位活性最高,中间梯度递减,C9为最弱阳性,表示单位活性最低。另外,表中的B表示空白。
本实施例T线(包被)抗体为nCoV1,浓度1mg/mL,标记抗体为HA811-41MB(Heavybio,产品代码2C10MB),每1mg乳胶微球偶联100μg抗体,结果见下表4:
表4:基于乳胶微球的免疫层析反应结果
稀释梯度(ng/mL) | 2 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 | 0.005 | 0.001 |
WT-NP | C1 | C1 | C3 | C4 | C5 | C6 | C7+ | C7 |
Delta-NP | C1 | C2 | C4+ | C5+ | C6+ | C7+ | C7 | C8 |
Omicron-NP | C1 | C2 | C4+ | C5+ | C6+ | C7+ | C7 | C8 |
HCoV-HKU1 NP | B | B | B | B | B | B | B | B |
若以C7为阳性标准,T线(对野生型NP的最低检测限为1pg/ml,对delta型NP的最低检测限为5pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为5pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为nCoV2,浓度2mg/mL,标记抗体为HA811-41MB,每1mg乳胶微球偶联200ug抗体,结果见下表5:
表5:基于乳胶微球的免疫层析反应结果
稀释梯度(ng/mL) | 2 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 | 0.005 | 0.001 |
WT-NP | C1 | C1 | C3 | C4 | C6+ | C7+ | C7 | C9 |
Delta-NP | C1 | C2 | C4 | C5 | C6 | C7 | C8 | C9 |
Omicron-NP | C1 | C2 | C4+ | C5+ | C6 | C7 | C8 | C9 |
HCoV-HKU1 NP | B | B | B | B | B | B | B | B |
若以C7为阳性标准,对野生型NP的最低检测限为5pg/ml,对delta型NP的最低检测限为10pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为10pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为HA811-41MB,浓度1mg/mL,标记抗体为nCoV1-C,每1mg乳胶微球偶联50ug抗体,对野生型NP的最低检测限为1pg/mL,对delta型NP的最低检测限为5pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为5pg/mL。
实施例7:胶体金免疫层析测试
胶体金制备:在三角烧瓶中加入100ml超纯水,加热至沸腾,加入2ml 2%氯金酸(Sigma-Aldrich公司,货号:16961-25-4)溶液,沸腾后立刻加1ml 2%柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司,货号:6132-04-3)水溶液,继续搅拌沸腾10分钟,自然冷却备用。
标记胶体金偶合物:取10ml上述胶体金放入烧杯中,搅拌中加入120μl的0.2MK2CO3调节pH至7.0,继续搅拌10秒;加入100μg标记抗体,继续搅拌5分钟;加入0.1ml 10%BSA,继续搅拌5分钟;12000g离心10分钟,弃掉上清,将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB,150mMNaCl,0.2%BSA,0.1%TritonX-100,3%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml,作为抗SARS-CoV-2NP单克隆抗体胶体金复合物。
制备胶体金垫:将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(上海金标公司),冻干,即制成金标垫。
硝酸纤维素膜(NC膜)包被:稀释包被抗体至1mg/ml,制成检测线工作液,用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号:HF135002)的相应位置上,50℃干燥1小时,备用。
胶体金免疫层析测试试剂条的组装:将上述金标垫、包被有抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成胶体金免疫检测试剂条。
灵敏度检测:
分别检测不同浓度的重组抗原的样本。具体地,将80μl待测样本滴加至样品垫处,室温放置15-30分钟,判定结果。根据显示条带颜色的深浅,可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较,选出最接近的颜色,将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性,结果如表6-7所示,以HCoV-HKU1 NP蛋白作为对照。
本实施例T线抗体为nCoV1,浓度1mg/mL,标记抗体为HA811-41MB,每1mL胶体金偶联10μg抗体,结果见下表6:
表6:基于胶体金的免疫层析反应结果(重组抗原单位为ng/ml)
稀释梯度(ng/mL) | 10 | 5 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 | 0.005 |
WT-NP | C1 | C1 | C3 | C4 | C6+ | C6 | C7+ | C7 |
Delta-NP | C1 | C2 | C4 | C5 | C6+ | C7+ | C7 | C8 |
Omicron-NP | C1 | C2 | C4 | C5+ | C6+ | C7+ | C7 | C8 |
HCoV-HKU1 NP | B | B | B | B | B | B | B | B |
若以C7为阳性标准,对野生型NP的最低检测限为5pg/mL,对delta型NP的最低检测限为10pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为10pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为nCoV2,浓度2mg/mL,标记抗体为HA811-41MB,每1ml胶体金偶联20μg抗体,结果见下表7:
表7:基于胶体金的免疫层析反应结果(重组抗原单位为ng/ml)
稀释梯度(ng/mL) | 10 | 5 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 | 0.01 | 0.005 |
WT-NP | C1 | C1 | C3 | C4 | C6+ | C7+ | C7 | C8 |
Delta-NP | C1 | C2 | C4 | C5 | C6 | C7 | C8 | C9 |
Omicron-NP | C1 | C2 | C4+ | C5+ | C6 | C7 | C8+ | C9 |
HCoV-HKU1 NP | B | B | B | B | B | B | B | B |
若以C7为阳性标准,对野生型NP的最低检测限为10pg/mL,对delta型NP的最低检测限为50pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为50pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为HA811-41MB,浓度1mg/mL,标记抗体为nCoV1-C,每1ml胶体金偶联5μg抗体,对野生型NP的最低检测限为5pg/mL,对delta型NP的最低检测限为10pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为10pg/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗体或其抗原结合片段,其特征在于,其与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合,所述抗体或其抗原结合片段的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3,所述抗体或抗原结合片段的轻链包括分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQ ID NO:1所示序列为GYTFTSY;SEQ ID NO:2所示序列为YPGNGX1,其中X1为H或V;SEQ ID NO:3所示序列为FHYYGPX2DY,其中X2为L或F;SEQID NO:4所示序列为RX3QX4ISNYLN,其中X3为AG或TS,X4为G或D;SEQ ID NO:5所示序列为YTSRLHS;SEQ ID NO:6所示序列为QQGNTLPRT。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述X1为H,所述X2为L,所述X3为AG,所述X4为G,并且所述VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1分别由SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9表示,优选地,所述抗体或抗原结合片段是由杂交瘤细胞F1G11产生的,所述杂交瘤细胞F1G11于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45315。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述X1为V,所述X2为F,所述X3为TS,所述X4为D,并且所述VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1分别由SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12表示。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段选自双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv、(dsFv)2、dsFv、dsFv-dsFv'、二硫键稳定的双功能抗体、scFv、scFv二聚体、多特异性抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体中的任意一种;
优选的,所述抗体或抗原结合片段还包含恒定区;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的恒定区选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的恒定区的种属来源为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的恒定区来源于小鼠;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO:13所示,所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO:14所示;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO:15所示,所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO:16所示。
5.一种杂交瘤细胞,其特征在于,所述杂交瘤细胞的保藏号为CGMCC No.45315。
6.一种载体,其特征在于,所述载体含有编码权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段,优选的,所述载体选自pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任意一种。
7.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含如权利要求5所述的载体。
8.权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒蛋白的试剂或试剂盒中的应用。
9.一种试剂或试剂盒,其特征在于,其含有权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段。
10.一种检测新型冠状病毒的方法,其特征在于,所述方法用于非诊断目的,包括使用权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段的步骤;
优选的,所述方法是通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法;
优选地,所述通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法选自胶体金法、免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法中的任意一种或几种;
优选地,所示可显示信号指示剂选自胶体金、荧光物质、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211581150.7A CN116082500B (zh) | 2022-12-09 | 2022-12-09 | 抗SARS-CoV-2抗体nCoV1和nCoV2及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211581150.7A CN116082500B (zh) | 2022-12-09 | 2022-12-09 | 抗SARS-CoV-2抗体nCoV1和nCoV2及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116082500A true CN116082500A (zh) | 2023-05-09 |
CN116082500B CN116082500B (zh) | 2023-08-22 |
Family
ID=86212807
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211581150.7A Active CN116082500B (zh) | 2022-12-09 | 2022-12-09 | 抗SARS-CoV-2抗体nCoV1和nCoV2及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116082500B (zh) |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111491661A (zh) * | 2017-07-27 | 2020-08-04 | 诺莫坎制药有限责任公司 | M(h)dm2/4的抗体及其在诊断和治疗癌症中的用途 |
CN111560070A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-08-21 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 针对新型冠状病毒np蛋白的抗体及其检测应用 |
CN111748032A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-10-09 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测 |
CN111978396A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-11-24 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 特异性结合sars-cov-2 np蛋白的抗体及其用途 |
CN112979794A (zh) * | 2020-05-27 | 2021-06-18 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 检测新型冠状病毒抗原的产品及其包含的抗体 |
CN113045646A (zh) * | 2020-05-29 | 2021-06-29 | 广东菲鹏生物有限公司 | 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体 |
US20220048991A1 (en) * | 2020-08-12 | 2022-02-17 | Biond Biologics Ltd. | Antibodies Against ILT2 and Use Thereof |
WO2022041745A1 (zh) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 针对SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的抗体及其用途 |
WO2022115538A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Bio-Techne Corporation | Anti-severe acute respiratory syndrome coronavirus antibodies |
CN115043938A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-13 | 段良伟 | SARS-CoV-2及其突变株的抗体及应用 |
-
2022
- 2022-12-09 CN CN202211581150.7A patent/CN116082500B/zh active Active
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111491661A (zh) * | 2017-07-27 | 2020-08-04 | 诺莫坎制药有限责任公司 | M(h)dm2/4的抗体及其在诊断和治疗癌症中的用途 |
CN111560070A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-08-21 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 针对新型冠状病毒np蛋白的抗体及其检测应用 |
CN111748032A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-10-09 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测 |
CN112979794A (zh) * | 2020-05-27 | 2021-06-18 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 检测新型冠状病毒抗原的产品及其包含的抗体 |
CN113045646A (zh) * | 2020-05-29 | 2021-06-29 | 广东菲鹏生物有限公司 | 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体 |
CN111978396A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-11-24 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 特异性结合sars-cov-2 np蛋白的抗体及其用途 |
US20220048991A1 (en) * | 2020-08-12 | 2022-02-17 | Biond Biologics Ltd. | Antibodies Against ILT2 and Use Thereof |
WO2022041745A1 (zh) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 针对SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的抗体及其用途 |
WO2022115538A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Bio-Techne Corporation | Anti-severe acute respiratory syndrome coronavirus antibodies |
CN115043938A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-13 | 段良伟 | SARS-CoV-2及其突变株的抗体及应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JAMES S. TERRY等: "Development of a SARS-CoV-2 nucleocapsid specific monoclonal antibody", 《VIROLOGY》, vol. 558, pages 28 - 37, XP086530250, DOI: 10.1016/j.virol.2021.01.003 * |
LI ZHANG等: "Development of Patient-Derived Human Monoclonal Antibodies Against Nucleocapsid Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 for Coronavirus Disease 2019 Diagnosis", 《FRONTIERS IN IMMUNOLOGY》, vol. 11, pages 1 - 11 * |
陈玉磊等: "新冠病毒中和单克隆抗体及纳米抗体研究进展", 《生物工程学报》, vol. 38, no. 9, pages 3173 - 3193 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116082500B (zh) | 2023-08-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2765306C2 (ru) | Антитело против в7-н3, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение | |
JP2006516408A (ja) | 高親和性抗体の生成方法 | |
EP4092050A1 (en) | Method and antibody for detecting hbcag | |
CN106999576A (zh) | 癌细胞特异性抗体、抗癌剂、及癌症的检查方法 | |
CN115838419B (zh) | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 | |
CN115724951A (zh) | 与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
CN109336973B (zh) | 抗转铁蛋白抗体及其用途 | |
MX2011004923A (es) | Anticuerpos para peptidos de igf-1/e humanos modificados. | |
CN116082500B (zh) | 抗SARS-CoV-2抗体nCoV1和nCoV2及其应用 | |
CN115925909B (zh) | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 | |
CN113683692B (zh) | SARS-CoV-2 N蛋白抗体及其应用 | |
CN115960216B (zh) | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 | |
CN116023483B (zh) | 抗SARS-CoV-2抗体及其应用 | |
CN113603786B (zh) | 特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的双特异性抗体 | |
CN113004413B (zh) | 猪IgG3的单克隆抗体、该单克隆抗体特异性识别的抗原表位肽及其应用 | |
WO2024067151A1 (zh) | 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用 | |
TW202028239A (zh) | 針對可溶性bcma之抗體 | |
CN116789807B (zh) | 抗腺病毒单克隆抗体及其应用 | |
CN116396392B (zh) | 一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元的抗体及其相关应用 | |
CN116143914B (zh) | 一种针对登革病毒ns1蛋白的抗体及其相关应用 | |
CN112724253B (zh) | 抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用 | |
CN115825415B (zh) | 阻断剂和体外免疫诊断产品、应用 | |
CN112574305B (zh) | 针对前体脑源性神经营养因子的抗体及其应用 | |
CN117106073A (zh) | 抗新型冠状病毒单克隆抗体及其应用 | |
CN114395042B (zh) | 抗il-33人源化抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |