TW202302650A - 針對dll3的結合分子及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及針對DLL3的結合分子或其抗原結合片段、包含所述結合分子或其抗原結合片段的衍生物以及藥物組合物。此外，本發明還涉及所述結合分子或其抗原結合片段在治療癌症和檢測診斷方面的相關應用。

Description

針對DLL3的結合分子及其應用
本發明屬於免疫學領域，更具體地，本發明涉及針對DLL3的結合分子及其抗原結合片段、包含所述結合分子或其抗原結合片段的衍生物、藥物組合物及其在治療癌症方面的相關應用。
肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。根據病理分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩個大類。
非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最重要的一種，有超過80%的肺癌患者屬於這種類型。肺癌靶向治療、PD-1免疫藥物、基因測序如今大熱，隨之而來的突破性進展，主要集中在非小細胞肺癌，大大增加了這一亞群肺癌的可選有效治療，極大的改善了非小細胞肺癌患者的五年生存率。
小細胞肺癌（SCLC）是一種具有高度侵襲性、致命性和廣泛轉移性肺癌，約占肺癌的15％，在病理學、分子學、生物學和臨床上與其他肺癌非常不同。據估計，每年確診超過23.4萬例SCLC患者，每年在全球造成約250,000人死亡。SCLC的特徵在於腫瘤快速生長，高血管分佈，基因組不穩定，早期轉移性傳播。在過去30年中，SCLC檢測、治療或存活僅見到了適度的改善，導致SCLC被歸類為頑固性癌症。局部治療，如手術或者放療或者兩者聯合，幾乎不可能完全治癒。以鉑類為基礎的聯合化療依然是治療的基石，一線標準方案由鉑類（卡鉑或順鉑）聯合其他細胞毒藥物（如依託泊苷），小細胞肺癌的化療緩解率很高，但也常伴復發，尤其是廣泛期的患者。對於局限期的患者中位生存期有14-20個月，廣泛期則只有9-11個月，而復發的患者，生存期更短，也幾乎無治療可選。唯一被FDA推薦的拓撲替康由於其血液學毒性受到限制，治療反應率也不盡人意，只有5-24%，中位生存期不足25周。目前暫無具體的三線治療方案推薦，因此急需一種新的有效的治療藥物。
Delta-like 3，也稱為DLL3，是一種由DLL3基因編碼的蛋白質，是Notch家族的配體之一。DLL3與DLL1只有36%的同源性，與其他deltatype dsl（delta/serate/lag-2）蛋白DLL1和DLL4不同，DLL3在胎兒大腦中的正常組織表達最高，在近軸中胚層的生長發育中起著關鍵作用。研究發現，在大約85％的小細胞肺癌和大細胞神經內分泌癌患者的腫瘤細胞表面表達，另外還高表達於多形性膠質母細胞瘤、黑色素瘤、胰腺癌和直腸癌等。但在健康組織和非神經內分泌腫瘤中不表達。該蛋白參與影響Notch調節信號通路，使Notch通路發出的信號最後促發癌症不受限制地生長。在正常組織中，DLL3的mRNA表達僅限於大腦、食道和胰腺。
研究進一步顯示，在腫瘤組織和正常組織標本的分析中，通過檢測原發性SCLC活檢標本、SCLC細胞系和正常肺活檢標本的整個轉錄組測序數據中DLL3的表達，顯示SCLC中DLL3的mRNA相對于正常肺的升高約35倍。將這些SCLC腫瘤樣本與來自正常組織和癌基因組中其他腫瘤類型的轉錄組資料進行比較，進一步證實原發性SCLC腫瘤樣本以及低級別膠質瘤(Low grade glioma，LGG)、膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)、黑色素瘤(melanoma，SKCM)中DLL3表達升高。臨床肺癌基因組計畫的Illumina BeadChip data也顯示，與NSCLC相比，原發性SCLC腫瘤標本中的DLL3升高。
從Cancer Cell Line Encyclopedia獲得的資料進一步證實DLL3 mRNA的表達在SCLC細胞系中特別升高。總的來說，這些跨多個技術平臺和樣本的表達資料表明，DLL3 mRNA在原發性SCLC腫瘤、SCLC PDX、傳統SCLC細胞系和LCNEC PDX中過度表達，而正常組織中的mRNA表達主要局限於大腦。
本發明的目的在於提供一種針對DLL3的結合分子及其抗原結合片段，所述結合分子或其抗原結合片段能夠特異性地結合DLL3，而對同家族蛋白DLL1及DLL4沒有非特異結合。
本發明提供一種DLL3結合分子或其抗原結合片段，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段包含：i) 重鏈互補決定區1（HCDR1），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：6、9、12、15或18；ii) 重鏈互補決定區2（HCDR2），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：7、10、13、16或19；和iii) 重鏈互補決定區3（HCDR3），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：8、11、14、17、20、110或111。在本發明的一實施例中，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH），所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分別為：a) SEQ ID NO：6、7和8；或b) SEQ ID NO：9、10和11；或c) SEQ ID NO：12、13和14；或d) SEQ ID NO：15、16和17；或e) SEQ ID NO：18、19和20；或f) SEQ ID NO：6、7和110；或g) SEQ ID NO：6、7和111。
在本發明的一實施例中，所述重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：1-5、21-29任一的氨基酸序列，或者包含與SEQ ID NO：1-5、21-29任一具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
本發明另提供另一種DLL3結合分子或其抗原結合片段，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段包含：i) 重鏈互補決定區1（HCDR1），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：57、63、69、72、78、84、93或99；ii) 重鏈互補決定區2（HCDR2），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：58、64、70、73、79、85、94或100；iii) 重鏈互補決定區3（HCDR3），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：59、65、71、74、80、86、95或101；iv) 輕鏈互補決定區1（LCDR1），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：60、66、75、81、87、90、96或102；v) 輕鏈互補決定區2（LCDR2），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：61、67、76、82、88、91、97或103；和vi) 輕鏈互補決定區3（LCDR3），其氨基酸序列選自：SEQ ID NO：62、68、77、83、89、92、98、104、112、113或114。
在本發明的一實施例中，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分別為：a) SEQ ID NO：57、58、59、60、61和62；或b) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和68；或c) SEQ ID NO：69、70、71、66、67和68；或d) SEQ ID NO：72、73、74、75、76和77；或e) SEQ ID NO：78、79、80、81、82和83；或f) SEQ ID NO：84、85、86、87、88和89；或g) SEQ ID NO：84、85、86、90、91和92；或h) SEQ ID NO：93、94、95、96、97和98；或i) SEQ ID NO：99、100、101、75、76和77；或j) SEQ ID NO：72、73、74、102、103和104；或k) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和112；或l) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和113；或m) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和114。
在本發明的一實施例中，所述重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一的氨基酸序列，或者包含與SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在本發明的一實施例中，所述輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一的氨基酸序列，或者包含與SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在本發明的一實施例中，所述重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含選自以下組的序列：1) SEQ ID NO：30和31；或2) SEQ ID NO：32和33；或3) SEQ ID NO：34和33；或4) SEQ ID NO：35和36；或5) SEQ ID NO：37和38；或6) SEQ ID NO：39和40；或7) SEQ ID NO：39和41；或8) SEQ ID NO：42和43；或9) SEQ ID NO：44和36；或10) SEQ ID NO：35和45；或11) SEQ ID NO：46和47；或12) SEQ ID NO：46和48；或13) SEQ ID NO：49和50；或14) SEQ ID NO：51和52；或15) SEQ ID NO：51和53；或16) SEQ ID NO：46和54；或17) SEQ ID NO：46和55；或18) SEQ ID NO：46和56。
本發明的DLL3結合分子或其抗原結合片段還包含重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區；優選地，所述重鏈恒定區包含Fc；更優選地，Fc來源於鼠或人；更優選地，Fc的序列是天然的或經過修飾的。
本發明的DLL3結合分子或其抗原結合片段可以是單克隆抗體、雙特異性結合分子、多特異性結合分子、人源化抗體、嵌合抗體、改型抗體、全人源抗體、全長抗體、重鏈抗體、納米抗體、Fab、Fv、scFv、F(ab’)2、線性抗體或單結構域抗體。
本發明的DLL3結合分子或其抗原結合片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。
本發明還提供一種偶聯物，是將本發明的DLL3結合分子或其抗原結合片段與捕獲標記物或檢測標記物偶聯形成；優選地，所述檢測標記物包括放射性核素、發光物質、有色物質或酶。
本發明還提供一種抗體藥物偶聯物（ADC），是將本發明的DLL3結合分子或其抗原結合片段與其他生物活性分子偶聯形成；優選地，所述其他生物活性分子為小分子藥物；優選地，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段與所述其他生物活性分子通過接頭連接。
本發明還提供編碼本發明DLL3結合分子或其抗原結合片段的核酸，以及包含該核酸的重組載體，以及包含上述核酸或載體的宿主細胞。優選地，所述宿主細胞為原核細胞（優選大腸桿菌），或者真核細胞（優選哺乳動物細胞或酵母；進一步優選地，所述哺乳動物細胞為CHO細胞或HEK293細胞）。
本發明還提供製備本發明DLL3結合分子或其抗原結合片段的方法，所述方法包括：在適合的條件下培養上述宿主細胞，並從所述細胞中純化獲得表達產物。
本發明還提供本發明DLL3結合分子或其抗原結合片段在製備治療或緩解腫瘤的藥物中的用途。
在本發明的一實施例中，所述藥物靶向DLL3異常表達的腫瘤細胞。
在本發明的一實施例中，所述腫瘤選自：小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌。
本發明還提供本發明DLL3結合分子或其抗原結合片段在製備檢測試劑或診斷試劑中的用途。
在本發明的一實施例中，所述檢測試劑用於檢測DLL3的表達；所述診斷試劑用於診斷腫瘤；優選地，所述腫瘤選自：小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌。
本發明還提供檢測樣品中DLL3表達的方法，所述方法包括：（1）將樣品與本發明的DLL3結合分子或其抗原結合片段接觸；（2）檢測所述DLL3結合分子或其抗原結合片段與DLL3的複合物的形成；任選地，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段是被可檢測地標記的。
本發明還提供一種藥物組合物，其包含有效量的本發明DLL3結合分子或其抗原結合片段、或者包含有效量的本發明的抗體藥物偶聯物、或者包含有效量的本發明的核酸、或者包含有效量的本發明的重組載體、或者包含有效量的本發明的宿主細胞。
在本發明的一實施例中，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載體。優選地，所述藥物組合物還包含一種或多種額外的其他治療劑。
本發明還提供一種藥盒或試劑盒，其包括容器，以及位於容器中的本發明的藥物組合物。
本發明還提供一種誘導表達DLL3的細胞死亡的方法，所述方法包括使所述細胞與本發明的藥物組合物接觸，所述表達DLL3的細胞是腫瘤細胞。
在本發明的一實施例中，所述腫瘤細胞是選自以下腫瘤的細胞：小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌。
本發明還提供一種治療受試者中與表達DLL3相關的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用本發明的藥物組合物、或前述的藥盒或試劑盒。
在本發明的一實施例中，所述疾病是腫瘤；小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌。
在本發明的一實施例中，所述方法還包括向所述受試者給予額外的治療劑。
本發明的技術方案具有如下有益效果：本發明的DLL3結合分子及其抗原結合片段能夠特異性地結合DLL3，而對同家族蛋白DLL1及DLL4沒有非特異結合。
本說明書中提及的所有公佈、專利和專利申請都以引用的方式併入本文，所述引用的程度就如同已特定地和個別地指示將各個別公佈、專利或專利申請以引用的方式併入本文。
在下文詳細描述本發明前，應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域中普通技術人員通常的理解具有相同的含義。
本文所公開的某些實施方案包含了數值範圍，並且本發明的某些方面可採用範圍的方式描述。除非另有說明，應當理解數值範圍或者以範圍描述的方式僅是出於簡潔、便利的目的，並不應當認為是對本發明的範圍的嚴格限定。因此，採用範圍方式的描述應當被認為具體地公開了所有可能的子範圍以及在該範圍內的所有可能的具體數值點，正如這些子範圍和數值點在本文中已經明確寫出。不論所述數值的寬窄，上述原則均同等適用。當採用範圍描述時，該範圍包括範圍的端點。
當涉及可測量值比如量、暫時持續時間等時，術語“約”是指包括指定值的±20％、或在某些情況下±10％、或在某些情況下±5％、或在某些情況下±1％、或在某些情況下±0.1％的變化。
本文所用氨基酸三字母代碼和單字母代碼如J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)中所述。
本文中的術語“抗體”可以包含完整抗體（例如全長單克隆抗體）及其任何抗原結合片段(即抗原結合部分)或其單鏈，還可以包含在完整抗體或其抗原結合片段或其單鏈的基礎上進行改造（例如連接其他肽段、功能單位重排等）而形成的具有抗原特異性結合能力的產物。
在一個實施方案中，抗體典型是指包含通過共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩條重（H）多肽鏈和兩條輕（L）多肽鏈的Y型四聚蛋白。天然IgG抗體即具有這樣的結構。每條輕鏈由一個可變結構域（VL）和一個恒定結構域（CL）組成。每條重鏈包含一個可變結構域（VH）和恒定區。
本領域已知五個主要類別的抗體：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，對應的重鏈恒定結構域分別被稱為α，δ，ε，γ和μ，IgG和IgA可以進一步分為不同的亞類，例如IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA可分為IgA1和IgA2。來自任何脊椎動物物種的抗體的輕鏈基於其恒定結構域的氨基酸序列可以被分配到兩種明顯相異的類型之一，稱為κ和λ。
在IgG、IgA和IgD抗體的情形中，該恒定區包含稱為CH1、CH2和CH3的三個結構域（IgM和IgE具有第四結構域CH4）。在IgG、IgA和IgD類別中，CH1和CH2結構域被柔性鉸鏈區分離，該鉸鏈區是可變長度的富含脯氨酸和半胱氨酸的區段。每類抗體進一步包含由配對半胱氨酸殘基形成的鏈間和鏈內二硫鍵。
術語“可變區”或“可變結構域”顯示出從一種抗體到另一種抗體的氨基酸組成的顯著變化，並且主要負責抗原識別和結合。每個輕鏈/重鏈對的可變區形成抗體結合位點，使得完整的IgG抗體具有兩個結合位點（即它是二價的）。重鏈的可變區（VH）和輕鏈的可變區（VL）結構域各包含具有極端變異性的三個區域，被稱為高變區（HVR），或更通常地，被稱為互補決定區（CDR），VH和VL各有4個骨架區FR，分別用FR1，FR2，FR3，FR4表示。因此，CDR和FR序列通常出現在重鏈可變結構域（或輕鏈可變結構域）的以下序列中：FR1-HCDR1（LCDR1）-FR2-HCDR2（LCDR2）-FR3-HCDR3（LCDR3）-FR4。
術語“Fc”用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，所述區域包含至少一部分的恒定區。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。
本文中“抗體”可在最廣的意義上使用，可包括如多克隆抗體（polyclonal antibodies）、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體及靈長類化抗體、CDR移植抗體（CDR-grafted antibody）、人類抗體（包括重組產生的人類抗體）、重組產生的抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、合成抗體（包括突變蛋白及其變體）等等。
術語“單克隆抗體”（或稱“單抗”）指由單一細胞克隆產生的基本均質、僅針對某一特定抗原表位的抗體。單克隆抗體可以使用本領域中已知的多種技術製備，包括雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物、合成技術或上述技術的組合等。
需說明的是，本發明的單克隆抗體可變區的CDR和FR的劃分是根據Kabat定義確定的。而其他命名和編號系統，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本領域技術人員已知的。因此，以本發明的單抗序列為基礎，包含任何命名系統衍生的一種或多種CDR的人源化抗體均明確地保持在本發明的範圍內。
術語“人源化抗體”是指其中非人抗體(如小鼠抗體)CDR以外的所有或部分氨基酸被源自人免疫球蛋白的相應氨基酸置換的抗體。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修飾是容許的，只要它們不消除抗體結合特定抗原的能力。“人源化”抗體保持與原抗體類似的抗原特異性。
術語“嵌合抗體”是指其中可變區源自一個物種而恒定區源自另一物種的抗體，例如其中可變區源自小鼠抗體而恒定區源自人抗體的抗體。
術語“抗體片段”包含完整抗體的至少一部分。如在此所使用，抗體分子的“片段”包括抗體的“抗原結合片段”，並且術語“抗原結合片段”是指免疫球蛋白或抗體中與所選抗原或其免疫原性決定部分特異性結合或反應的多肽片段，或由此片段進一步衍生的融合蛋白產物，例如單鏈抗體，嵌合抗原受體中的胞外結合區等。示例性的抗體片段或其抗原結合片段包括但不限於：可變輕鏈片段、可變重鏈片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、單結構域抗體、線性抗體、單鏈抗體（scFv）及由抗體片段形成的雙特異性抗體或多特異性抗體等。
術語“抗原”是指被抗體或抗體結合片段識別並特異性結合的物質，廣義上，抗原可以包括所選靶標的任何免疫原性片段或決定簇，包括單表位、多表位元、單結構域、多結構域、完整的胞外結構域（ECD）或蛋白質。肽、蛋白質、糖蛋白、多糖和脂質，其部分及其組合均可構成抗原。非限制性示例性抗原包括腫瘤抗原或病原體抗原等。“抗原”也可以指引發免疫反應的分子。任何形式的抗原或含有該抗原的細胞或製劑都可以用於生成對抗原決定簇具有特異性的抗體。抗原可以是分離的全長蛋白質、細胞表面蛋白（例如，用在其表面上表達至少一部分抗原的細胞進行免疫的）、或可溶性蛋白質（例如，僅用該蛋白質的ECD部分進行免疫的）或蛋白質構建體（例如，Fc抗原）。該抗原可以在基因修飾的細胞中產生。前述任何抗原可以單獨或與本領域已知的一種或多種免疫原性增強佐劑組合使用。編碼該抗原的DNA可以是基因組的或非基因組的（例如，cDNA），並且可以編碼足以引起免疫原性應答的至少一部分ECD。可以使用任何載體來轉化其中表達抗原的細胞，所述載體包括但不限於腺病毒載體、慢病毒載體、質粒以及非病毒載體如陽離子脂質。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的氨基酸、或通過蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的氨基酸形成。由相鄰的氨基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而通過三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象存在並且包括至少3-15個氨基酸。由給定的抗體確定其結合的表位的方法是本領域熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
術語“雙特異性結合分子”、“多特異性結合分子”分別指對兩種或更多種不同抗原（或表位）具有特異性的結合分子（例如抗體或包含抗體片段的分子），優選雙特異性抗體。
使用本發明中的可變區製作抗體、結合分子、雙特異性結合分子或多特異性結合分子時，恒定區沒有特別限定，可以使用本領域技術人員公知的恒定區或者自行獲得的恒定區，還可以在恒定區部分導入氨基酸突變（例如提高或降低與Fcγ受體或FcRn的結合的突變）。
獲得本發明的結合分子、抗原結合片段、抗體、雙特異性結合分子或多特異性結合分子的方法沒有特別限制，可通過任意方法獲得，例如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。發明的結合分子、抗原結合片段、抗體、雙特異性結合分子或多特異性結合分子可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以克隆並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。通過表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的克隆。陽性的克隆在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。
術語“抗體藥物偶聯物”（ADC）是指已共價偶聯治療活性物質或活性藥物成分（API）的抗體，從而治療活性物質或活性藥物成分（API）可以靶向至抗體的結合靶標以表現出其藥理學功能。治療活性物質或活性藥物成分可以是能夠殺死ADC靶向的細胞的細胞毒素，優選惡性或癌細胞。治療活性物質、活性藥物成分或細胞毒素的共價連接可以以非位元點特異性方式利用偶聯有效載荷至賴氨酸或半胱氨酸殘基的標準化學接頭進行，或者優選地，綴合以位元點特異性方式進行，其允許完全控制綴合位點以及產生的ADC的藥物比抗體比例。
術語“親和力”或“結合親和力”指分子（例如抗體）的單一結合位點與其結合配偶體（例如抗原）之間全部非共價相互作用總和的強度。術語“KD”是指特定的抗體-抗原相互作用的解離常數。可以使用本領域已知的各種技術來確定結合親和力，例如表面等離子體共振、生物層干涉法、雙極化干涉法、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定量熱法、ELISA、分析超速離心和流式細胞術等。
術語“生物學活性”指抗體結合抗原並導致可測量的生物學反應的能力，所述生物學反應可以在體外或體內進行測量。
本發明的藥物組合物，可以根據需要與對其為惰性的適當的藥學上可接受的載體、介質等進行混和而製劑化。例如：生理鹽水、滅菌水、賦形劑、穩定劑、抗氧化劑(如抗壞血酸等)、緩衝劑、防腐劑、表面活性劑、螯合劑（如EDTA等）或粘合劑等。另外，還可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠和免疫球蛋白等蛋白質、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、精氨酸和賴氨酸等氨基酸、多糖和單糖等糖類或碳水化物、甘露糖醇和山梨糖醇等糖醇。在制為注射用水溶液時，可舉出例如生理鹽水、含葡萄糖和其它輔藥的等滲液，例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉，還可以與適當的助溶劑，例如醇（乙醇等）、多元醇（丙二醇、PEG等）、非離子型表面活性劑（聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆188、HCO-50）等並用。另外，通過在製劑中混合透明質酸酶（hyaluronidase），還可以進行更大液量的皮下給藥。
本發明的結合分子或抗原結合片段可與其他藥物聯合使用，活性成分可以混合在一起形成單一的給藥單元，也可分別獨立成為給藥單元，分別使用。
術語“有效量”指本發明的抗體或片段的藥物製劑的劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在治療的患者中產生預期效果。有效量可以由作為本領域技術人員的主治醫師通過考慮以下多種因素來容易地確定：諸如人種差異；體重、年齡和健康狀況；涉及的具體疾病；疾病的嚴重程度；個體患者的應答；施用的具體抗體；施用模式；施用製劑的生物利用率特徵；選擇的給藥方案；和任何伴隨療法的使用。
術語“藥盒”或“試劑盒”包括有效量的一種或多種單位劑型的本發明的藥物組合物。在一些實施方案中，藥盒可含有無菌容器；這樣的容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、泡罩包裝或本領域已知的其它合適的容器形式。這種容器可以由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或其他適合於保持藥物的材料製成。此外，藥盒還包括將本發明的藥物組合物給予個體的說明書。說明書中通常包含使用本發明的藥物組合物來治療疾病的方法。
本文所用的術語“個體”或“受試者”是指任何動物，例如哺乳動物或有袋動物。本發明的個體包括但不限於人類、非人類靈長類動物（例如食蟹猴或恒河猴或其他類型的獼猴）、小鼠、豬、馬、驢、牛、綿羊、大鼠和任何種類的家禽。
本文所用的術語“疾病”或“病症”或“紊亂”等是指任何損害或干擾細胞、組織或器官的正常功能的改變或失調。例如，所述的“疾病”包括但不限於：腫瘤、病原體感染、自身免疫性疾病、T細胞功能障礙性疾病、或免疫耐受能力缺陷（如移植排斥）。
本文所用的術語“腫瘤”指的是一種以細胞或組織的病理性增生為特徵的疾病，及其隨後的遷移或侵襲其他組織或器官。腫瘤生長通常是不受控制的和進行性的，不誘導或抑制正常細胞增殖。
本文所用的術語“治療”是指在試圖改變個人或處理細胞引起的疾病過程中的臨床干預，既可以進行預防也可以在臨床病理過程干預。治療效果包括但不限於，防止疾病的發生或復發、減輕症狀、減少任何疾病直接或間接的病理後果、防止轉移、減慢疾病的進展速度、改善或緩解病情、緩解或改善預後等。
實施例
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件（如“J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002”中所述的條件），或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1：人DLL3及食蟹猴DLL3抗原信息
實施例中使用的人DLL3的全長氨基酸序列（SEQ ID NO：105）(Uniprot ID：Q9NYJ7)如下所示，其購買自愷佧生物(貨號DLL-HM103)。
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK
注釋：信號肽（1-26）； DLL3胞外區（27-492）；跨膜區（493-513）；胞內區（514-618）。
實施例中使用的食蟹猴DLL3（cyno-DLL3）的全長氨基酸序列（SEQ ID NO：106）(Uniprot ID：A0A2K5WSR4)如下所示，其購買自愷佧生物(貨號CM103)。
MVSPRMSRLLSQTVILALIFIPQARPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARGPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPEAPAPDLPLPNGLLQVPFRDAWPGTFSLIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVTRRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCELPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPPVCRAGCSLEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCMVPVSTSSCLGLRGPSSTTTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPGSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRNCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGVSALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHAQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGPGDVPSSSVDWNRPEDVDSRGIYVISAPSIYAREVAMPLFPPLHTGRAGQRQNLLFPFPSSILSVK
注釋：信號肽（1-26）； DLL3胞外區（27-490）；跨膜區（491-513）；胞內區（514-618）。
實施例2：同家族成員DLL1及DLL4抗原資訊
實施例中使用的人DLL1的全長氨基酸序列（SEQ ID NO：107）(Uniprot ID：O00548)如下所示，其購買自義翹神州(貨號11635-H08H)。
MGSRCALALAVLSALLCQVWSSGVFELKLQEFVNKKGLLGNRNCCRGGAGPPPCACRTFFRVCLKHYQASVSPEPPCTYGSAVTPVLGVDSFSLPDGGGADSAFSNPIRFPFGFTWPGTFSLIIEALHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPICLPGCDEQHGFCDKPGECKCRVGWQGRYCDECIRYPGCLHGTCQQPWQCNCQEGWGGLFCNQDLNYCTHHKPCKNGATCTNTGQGSYTCSCRPGYTGATCELGIDECDPSPCKNGGSCTDLENSYSCTCPPGFYGKICELSAMTCADGPCFNGGRCSDSPDGGYSCRCPVGYSGFNCEKKIDYCSSSPCSNGAKCVDLGDAYLCRCQAGFSGRHCDDNVDDCASSPCANGGTCRDGVNDFSCTCPPGYTGRNCSAPVSRCEHAPCHNGATCHERGHRYVCECARGYGGPNCQFLLPELPPGPAVVDLTEKLEGQGGPFPWVAVCAGVILVLMLLLGCAAVVVCVRLRLQKHRPPADPCRGETETMNNLANCQREKDISVSIIGATQIKNTNKKADFHGDHSADKNGFKARYPAVDYNLVQDLKGDDTAVRDAHSKRDTKCQPQGSSGEEKGTPTTLRGGEASERKRPDSGCSTSKDTKYQSVYVISEEKDECVIATEV
注釋：信號肽（1-17）； DLL3胞外區（18-545）；跨膜區（546-568）；胞內區（569-723）。
實施例中使用的人DLL4的全長氨基酸序列（SEQ ID NO：108）(Uniprot ID：Q9NR61)如下所示，其購買自義翹神州(貨號10171-H08H)。
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSFPWVAVSLGVGLAVLLVLLGMVAVAVRQLRLRRPDDGSREAMNNLSDFQKDNLIPAAQLKNTNQKKELEVDCGLDKSNCGKQQNHTLDYNLAPGPLGRGTMPGKFPHSDKSLGEKAPLRLHSEKPECRISAICSPRDSMYQSVCLISEERNECVIATEV
注釋：信號肽（1-26）； DLL3胞外區（27-529）；跨膜區（530-550）；胞內區（551-685）。
實施例3：駱駝免疫，僅重鏈的抗體免疫文庫的構建
用人DLL3抗原（實施例1中所述）對駱駝進行免疫。免疫的日期分別為第0天、第21天、第35天、第49天，共免疫4次。分別在第28天、第42天、第73天抽取血樣分離出血清，利用蛋白水準ELISA檢測血清中免疫應答反應情況。檢測血清效價大於1：128000，結束免疫，對免疫的駱駝重新抽取血樣100mL，按製造商說明書使用Solarbio公司淋巴細胞分離液分別分離駱駝PBMC，提取總RNA（OMEGA細胞總RNA提取試劑盒）後用Takara PrimeScriptTM II反轉錄試劑盒合成cDNA做範本，用設計的特異性引物進行巢式PCR擴增出VHH基因片段，回收VHH片段後通過Sfi I酶切連接到pADL-23c噬菌粒載體上，TG1電轉化感受態細胞建成DLL3駱駝免疫文庫（庫容為1.12E8）。
實施例4：駱駝來源的抗DLL3的陽性克隆的篩選
為了獲得可與人DLL3和食蟹猴DLL3交叉結合的陽性抗體，將上述文庫擴增加入M13K07 helper phage組裝成噬菌體後，投入1×1012pfu駱駝免疫文庫噬菌體與結合在磁珠上生物素化的人DLL3蛋白（8μg/mL）室溫孵育1h，0.05% PBST洗去未結合噬菌體後，用100mM三乙基胺將與DLL3特異性結合的噬菌體洗脫下來，梯度稀釋後侵染對數期生長的大腸桿菌SS320後塗在氨苄平板上37℃過夜培養；挑取單克隆進行IPTG誘導表達，上清用於ELISA檢測。ELISA板上分別包被2µg/ml人DLL3或食蟹猴DLL3抗原4℃過夜，0.05% PBST清洗3次後用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，0.05% PBST清洗3次後每孔加入誘導的上清30μL，陰性對照孔加入培養基，室溫孵育1h，最後用anti-Myc HRP檢測（IPTG誘導表達出的VHH帶有his和c-Myc標籤）；將ELISA測試得到的結合人和食蟹猴DLL3的OD450值大於1.0，且與結合培養基陰性對照的ELISA OD450比值均大於3的克隆進行測序，獲得本發明的5個重鏈抗體可變區的氨基酸序列，結果如表1所示：
表1：駱駝來源的抗DLL3的5個重鏈抗體可變區的氨基酸序列
克隆號 SEQ ID NO 重鏈可變區（VHH）
DLL3-3 1 DVQLVESGGGSVQAGGSLKLSCKSPTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISADNAEKTVYLQMNTLKPEDSAMYYCAAQLRPNSAYHPLDGRKYNYWGQGTQVTVSS
DLL3-12 2 QVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAGSGFAFSSYDMHWVRQAPGKDFEWVSSISRDGRGPRYADFVKGRFTISKDNGRNMLYLQLNSLEIEDTAMYYCSKGYPIMGGTTQGTQVTVSS
DLL3-26 3 QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDIYSSSYVGWFRQAPGKEREGVAIIYTSGDSTYYANSVKGRFTISQDKAKKTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARFAIDNSNYWGQGTQVTVSS
DLL3-122 4 QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASGDTYRSYCMGWFRKAPGKEREGVADIVSDGSTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAVDRGGSGGYCYTGRYDYWGQGTQVTVSS
DLL3-276 5 QVQLVESGGGSVQAGGSLNLSCATSGSTASTTYMGWFRQAPGKGREGVAIIYTARDNPWYANSVKGRFIISQDNAKKTLYLQMNTLKPEDTATYYCAATLANPTRTAWGQGTLVTVSS
在上述氨基酸序列的基礎上，利用Kabat編號規則劃分抗體可變區的CDR和FR，每個抗體的3個CDR序列組成如下表2所示。
表2：駱駝來源的抗DLL3的5個重鏈抗體的CDR序列
克隆號 HCDR1 HCDR2 HCDR3
DLL3-3 SEQ ID NO 6 7 8
氨基酸序列 SGYMG AAIYIGGSTTLYADSVKG QLRPNSAYHPLDGRKYNY
DLL3-12 SEQ ID NO 9 10 11
氨基酸序列 SYDMH SSISRDGRGPRYADFVKG GYPIMGG
DLL3-26 SEQ ID NO 12 13 14
氨基酸序列 SSYVG AIIYTSGDSTYYANSVKG RFAIDNSNY
DLL3-122 SEQ ID NO 15 16 17
氨基酸序列 RSYCMG ADIVSDGSTSYADSVKG DRGGSGGYCYTGRYDY
DLL3-276 SEQ ID NO 18 19 20
氨基酸序列 TTYMG IIYTARDNPWYANSVKG TLANPTRTA
實施例5：駱駝來源的抗DLL3嵌合抗體的構建及其在真核細胞中的暫態轉染表達
將測序完成的本發明的重鏈抗體可變區與人IgG1恒定區拼接後生成的目的基因片段克隆到pTT5表達載體中，製備轉染級別的表達質粒。重鏈抗體可變區可以通過連接短肽與人IgG1恒定區連接，即形成：重鏈抗體可變區-連接短肽-人IgG1恒定區。本實施中採用的連接短肽序列為GGGGS。
引入的人IgG1恒定區序列（SEQ ID NO：109）如下：DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG。
在無血清培養基中培養Expi293FTM細胞（Thermo Fisher Scientific），將細胞接種在搖瓶（Corning Inc.）中，並在37°C，8% CO2的環境中置於搖床上培養。調整細胞密度，將含有目的基因片段的重組表達載體和PEI轉染試劑按照合適的比例混合，並添加進細胞培養搖瓶中，細胞培養6天后收集表達上清，高速離心去除細胞碎片，用Protein A柱進行親和純化。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脫液洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，換液到PBS分裝備用。對最終純化的嵌合抗體進行SDS-PAGE及HPLC純度分析和A280濃度測定。
實施例6：駱駝來源的抗DLL3嵌合抗體與表達DLL3細胞的結合
HEK293細胞（來自中科院）轉染cyno-DLL3抗原全長基因（序列見實施例1），進行細胞培養傳代，單克隆挑選，流式鑒定單克隆細胞DLL3蛋白的表達水準，擴大培養，凍存入庫備用。
培養SHP-77和HEK293-cyno DLL3細胞，SHP-77細胞的培養基為RPMI1640+10%FBS，HEK293-cyno DLL3細胞的培養基為DMEM+10%FBS+200μg/ml Hygromycin（潮黴素），使用T75細胞培養瓶置於37℃ 5% CO2培養箱培養。待細胞使用時使用無菌DPBS洗細胞，0.25%胰酶EDTA消化約5分鐘後用完全培養基終止。
將消化好的細胞以1000rpm轉速常溫離心5分鐘，棄上清，用100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞。細胞計數，並將細胞密度調整到1E6/mL，鋪到96孔圓底培養板（corning 3799）中，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清，4℃放置備用。用1%BSA（在PBS中）稀釋待測抗體樣品，起始濃度為100nM，10倍往下稀釋7個濃度。使用稀釋好的抗體重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育1小時。1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。用1%BSA（在PBS中）按照說明書1:200稀釋二抗（goat anti human IgG Fc PE），用稀釋好的二抗重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小時。1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞，300目紗布過濾細胞，流式細胞儀檢測PE通道平均螢光強度。
從流式細胞儀匯出FCS檔，用flowjo軟體分析每個樣本的PE通道平均螢光強度（以下簡稱MFI），將分析得出的平均螢光強度導入Graphpad分析抗體與細胞的半數結合濃度（以下簡稱EC50）和最高平均螢光強度（Top MFI），結果如表3及附圖1所示。
表3：抗DLL3嵌合抗體與表達DLL3細胞的結合
克隆號 SHP-77 HEK293 - cyno DLL3
EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI) EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI)
陰性對照抗體 未擬合 92 未擬合 104
DLL3-3 0.047 874 0.025 438
DLL3-12 0.092 886 0.073 220
DLL3-26 0.519 821 0.439 450
DLL3-122 0.427 846 0.415 460
DLL3-276 0.374 763 0.897 175
實施例7：駱駝來源的抗DLL3重鏈抗體的人源化設計
通過序列比對選擇與候選重鏈抗體同源性較高的胚系基因序列作為VHH移植框架範本。將候選抗體CDR區嫁接至選定的人抗體可變區框架後，進行個別氨基酸的回復突變，得到人源化抗體，人源化可變區氨基酸序列如表4。
表4：駱駝來源的抗DLL3的7個人源化抗體可變區的氨基酸序列
克隆號 SEQ ID NO 重鏈可變區（VHH）
hDLL3-3-1 21 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPNSAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS
hDLL3-3-2 22 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKSPTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPNSAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS
hDLL3-12-1 23 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVSSISRDGRGPRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSKGYPIMGGTTQGTLVTVSS
hDLL3-12-2 24 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYDMHWVRQAPGKDFEWVSSISRDGRGPRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSKGYPIMGGTTQGTLVTVSS
hDLL3-26 25 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDIYSSSYVGWFRQAPGKEREGVAIIYTSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARFAIDNSNYWGQGTLVTVSS
hDLL3-122 26 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDTYRSYCMGWFRQAPGKEREGVADIVSDGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDRGGSGGYCYTGRYDYWGQGTLVTVSS
hDLL3-276 27 QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTASTTYMGWFRQAPGKGREGVAIIYTARDNPWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATLANPTRTAWGQGTLVTVSS
實施例8：駱駝來源的抗DLL3的人源化抗體的製備
參照實施例5所述，將人源化抗體的可變區與人IgG1恒定區拼接後生成的目的基因片段克隆到pTT5表達載體中，製備轉染級別的表達質粒。
在無血清培養基中培養Expi293FTM細胞（Thermo Fisher Scientific），將細胞接種在搖瓶（Corning Inc.）中，並在37°C，8% CO2的環境中置於搖床上培養。調整細胞密度，將含有目的基因片段的重組表達載體和PEI轉染試劑按照合適的比例混合，並添加進細胞培養搖瓶中，細胞培養6天后收集表達上清，高速離心去除細胞碎片，用Protein A柱進行親和純化。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脫液洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，換液到PBS分裝備用。對最終純化的人源化抗體進行SDS-PAGE及HPLC純度分析和A280濃度測定。
實施例9：駱駝來源的抗DLL3人源化抗體的體外細胞結合驗證
培養SHP-77和HEK293-cyno DLL3細胞，SHP-77細胞的培養基為RPMI1640+10%FBS，HEK293-cyno DLL3細胞的培養基為DMEM+10%FBS+200μg/ml Hygromycin（潮黴素），使用T75細胞培養瓶置於37℃ 5%CO2培養箱培養。待細胞使用時使用無菌DPBS洗細胞，0.25%胰酶EDTA消化約5分鐘後用完全培養基終止。
將消化好的細胞以1000rpm轉速常溫離心5分鐘，棄上清，用100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞。細胞計數，並將細胞密度調整到1E6/mL，鋪到96孔圓底培養板（corning 3799）中，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清，4℃放置備用。用1%BSA（在PBS中）稀釋待測抗體樣品，起始濃度為100nM，10倍往下稀釋7個濃度。使用稀釋好的抗體重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育1小時。1500rpm 轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。用1%BSA（在PBS中）按照說明書1:200稀釋二抗（goat anti human IgG Fc PE），用稀釋好的二抗重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小時。1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm 轉速4℃離心5分鐘，棄上清。100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞，300目紗布過濾細胞，流式細胞儀檢測PE通道平均螢光強度。
從流式細胞儀匯出FCS檔，用flowjo軟體分析每個樣本的PE通道平均螢光強度（以下簡稱MFI），將分析得出的平均螢光強度導入Graphpad 分析抗體與細胞的半數結合濃度（以下簡稱EC50）和最高平均螢光強度（Top MFI），結果如表5及附圖2所示。
表5 抗DLL3人源化抗體與表達DLL3細胞的結合。
克隆號 SHP-77 HEK293 - cyno DLL3
EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI) EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI)
DLL3-3 0.061 864 0.08 379
hDLL3-3-1 0.086 702 0.22 346
hDLL3-3-2 0.049 691 0.15 344
DLL3-12 0.114 935 1.38 232
hDLL3-12-1 0.052 690 2.36 178
hDLL3-12-2 0.081 804 1.35 190
DLL3-26 0.499 841 0.54 336
hDLL3-26 0.786 696 2.24 301
DLL3-122 0.478 877 0.58 351
hDLL3-122 0.589 778 0.99 351
DLL3-276 0.396 782 2.08 179
hDLL3-276 0.389 622 1.01 148
實施例10：駱駝來源的抗DLL3人源化抗體的Biacore親和力實驗
使用Biacore 8K儀器分析抗DLL3人源化抗體與人DLL3的親和力和動力學性質。CM5晶片先用EDC和NHS活化，然後固定抗人Fc的鼠單抗，再用乙醇胺封閉。
為測定與人DLL3的親和力與動力學性質，DLL3人源化抗體用HBS-EP+（10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20）緩衝液稀釋至0.2μg/mL，以10μL/min的流速捕獲45s。人DLL3兩倍逐級稀釋至系列濃度（100nM-0.39nM），以50μL/min的流速結合90s，解離600s。
每一輪實驗結束後，使用3M MgCl2溶液沖洗以30μL/min的流速沖洗30s，將捕獲的抗體連同抗原一起去除，完成晶片的再生。原始資料使用Biacore Insight Evaluation Software（3.0.12.15655）軟體進行分析，以(1∶1) Langmuir模型進行擬合，結果如表6所示。
表6：抗DLL3人源化抗體與人DLL3抗原蛋白的親和力測定結果
克隆號 ka (1/Ms) kd(1/s) KD(M)
DLL3-3 2.15E+06 2.74E-04 1.27E-10
hDLL3-3-1 1.91E+06 5.80E-04 3.04E-10
hDLL3-3-2 1.95E+06 7.76E-04 3.99E-10
DLL3-26 3.82E+05 1.23E-05 3.22E-11
hDLL3-26 2.10E+05 3.55E-04 1.69E-09
DLL3-122 9.32E+04 3.92E-04 4.21E-09
hDLL3-122 9.85E+04 4.66E-04 4.73E-09
實施例11：駱駝來源的抗DLL3人源化抗體與同家族蛋白DLL1及DLL4的結合實驗
將抗原蛋白human DLL1（SinoBiological，貨號11635-H08H）或human DLL4（SinoBiological，貨號10171-H08H）溶解在1×PBS中，濃度為1μg/mL。然後將抗原加到高親和力ELISA板中（Biolegend，貨號423501），100μL/孔，4℃放置過夜。用PBST洗滌抗原，300μL/孔，洗三遍。用1% BSA(在PBST中)封閉抗原，200μL/孔，37℃孵育1.5小時。
用1%BSA（在PBS中）稀釋待測抗體，起始濃度為100nM，10倍往下稀釋7個濃度。PBST洗滌板子，300μL/孔，洗三遍。將稀釋好的抗體加入到ELISA板中，100μL/孔，常溫孵育2小時。用PBST洗滌抗體，300μL/孔，洗三遍。用1%BSA（在PBST中）稀釋二抗（用於DLL4的山羊抗人IgG Fc (HRP), 1:20000稀釋；用於DLL1的HRP山羊抗鼠IgG(H+L)，1:10000稀釋）。將稀釋好的二抗加入到ELISA板中，100μL/孔，常溫孵育1小時。PBST洗滌板子，300μL/孔，洗6遍。配置顯色液（TMA與TMB 1:1混合），將顯色液加入到板中，100μL/孔，避光孵育5分鐘。加入50μL ELISA終止液到板中，搖勻。
在envision上讀取OD450，用OD450在GraphPad上作圖求EC50值。結果如圖3所示，顯示所測抗體與同家族蛋白DLL1及DLL4均無非特異結合。
實施例12：製備駱駝來源的抗DLL3人源化抗體的變體
經過對本發明的重鏈抗體進行翻譯後修飾（PTM）分析，發現hDLL3-3-1的可變區中存在1個脫醯胺位點，對第103位氨基酸進行單個位元點的定點突變，製備兩個hDLL3-3-1的突變體：分別是hDLL3-3-1-NA和hDLL3-3-1-QS。上述兩個變體的可變區氨基酸序列如表7所示。
表7：hDLL3-3-1人源化抗體變體的氨基酸序列
克隆號 SEQ ID NO 重鏈可變區（VHH） SEQ ID NO 重鏈CDR3
hDLL3-3-1-NA 28 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPNAAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS 110 QLRPNAAYHPLDGRKYNY
hDLL3-3-1-QS 29 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPQSAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS 111 QLRPQSAYHPLDGRKYNY
參照實施例5所述，製備上述2個變體，經哺乳動物細胞系瞬轉表達後，使用SHP-77細胞進行親和力檢測，結果參見表8及圖4，顯示2個變體能夠在細胞水準的結合不發生明顯變化的情況下去除翻譯後修飾風險。使用人DLL3抗原蛋白進行親和力檢測結果參見表9。
表8：hDLL3-3-1人源化抗體變體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合
克隆號 SHP-77
EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI)
hDLL3-3-1 0.068 1076
hDLL3-3-1-NA 0.104 1271
hDLL3-3-1-QS 0.055 1009
表9：hDLL3-3-1人源化抗體變體與人DLL3抗原蛋白的親和力測定結果
克隆號 ka (1/Ms) kd(1/s) KD(M)
hDLL3-3-1 1.36E+06 6.14E-04 4.50E-10
hDLL3-3-1-NA 1.29E+06 1.35E-04 1.05E-10
hDLL3-3-1-QS 1.22E+06 6.11E-03 5.02E-09
實施例13.   小鼠雜交瘤來源的抗DLL3抗體的獲得
抗DLL3單克隆抗體通過免疫小鼠產生。實驗用Swiss Webster白小鼠，雌性，6周齡 (Charles River公司)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1周，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。免疫抗原為帶His標籤的人DLL3重組蛋白（huDLL3-His）。用Titermax (sigma Lot Num：T2684)為佐劑。抗原與佐劑（titermax）比例為1:1，抗原乳化後進行接種，時間為第0、14、35、56天，在進行脾細胞融合前3天加強免疫。期間用ELISA及FACS方法檢測小鼠血清，確定小鼠血清中的抗體滴度。在第5次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合，採用優化的電融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞 (ATCC® CRL-8287™)進行融合得到雜交瘤細胞。
融合後的雜交瘤細胞培養7-14天后，取培養基上清，使用DLL3重組蛋白，ELISA實驗對雜交瘤上清進行抗體篩選，得到的陽性抗體株進一步使用穩轉表達DLL3的CHO-K1細胞，對比空白CHO-K1細胞以排除非特異性結合抗體雜交瘤株，用流式分選方法進行篩選，從而選定結合重組蛋白且也結合細胞表達抗原的雜交瘤。收集對數生長期雜交瘤細胞，用Trizol（Invitrogen,15596-018）提取RNA並反轉錄（PrimeScript™ Reverse Transcriptase，Takara #2680A）。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set（Novagen, TB326 Rev.B 0503）進行PCR擴增後測序，獲得本發明的10個單克隆抗體可變區的氨基酸序列，如表10A所示。
表10A：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3的10個單克隆抗體可變區的氨基酸序列
克隆號 重鏈可變區（VH） 輕鏈可變區（VL）
26C4D2 SEQ ID NO 30 31
氨基酸序列 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYSFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPTLGDTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARLGSLSMMDYWGQGTSVTVSS DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPARFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIAIYYCQQYSKFPYTFGGGTKLEIK
39E2D11-1 SEQ ID NO 32 33
氨基酸序列 QVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFISYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGSTTNYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTSVTVSS DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSINNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSVETEDFGMYFCQQTNSWPLTFGAGTKLELK
39E2D11-2 SEQ ID NO 34 33
氨基酸序列 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNPKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARENYYGNSLWFFDVWGTGTTVTVSS DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSINNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSVETEDFGMYFCQQTNSWPLTFGAGTKLELK
40G3D1 SEQ ID NO 35 36
氨基酸序列 QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSQWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGNGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARWFAYWGQGTLVTVSA DIVLTQSPVTLSVTPGDSVSLSCRASQSVRNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK
46A5A4 SEQ ID NO 37 38
氨基酸序列 QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGYTMYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVHFCARAFHALDYWGQGTSVTVSS DIQMTQTTSSLSASLGDRVTFTCSASQGISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIK
47E12D12-1 SEQ ID NO 39 40
氨基酸序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARNSRGFAYWGQGTLVTVSA DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPRTFGGGTKLEIK
47E12D12-2 SEQ ID NO 39 41
氨基酸序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARNSRGFAYWGQGTLVTVSA DIVLIQSPTIMSASPGEKVTMTCSASSSVSSMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWNSYHLTFGAGTKLELK
48B6D7 SEQ ID NO 42 43
氨基酸序列 QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCEASGYTFSNYWMQWVRQRPGQGLEWIGMILPNSDITNYNENFQTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARQARYSAMDYWGQGTSVTVSS DIQMTQTTSSLSVSLGDRVTINCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQHYSKFPYTFGGGTKLEIK
45E4D7 SEQ ID NO 44 36
氨基酸序列 QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTSHWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPISGSTNNNEKFRNKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAKIITVGGAYVMDYWGQGTSVTVSS DIVLTQSPVTLSVTPGDSVSLSCRASQSVRNNLHWYQQKSHESPRLLIKYVSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK
27E10C5 SEQ ID NO 35 45
氨基酸序列 QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSQWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGNGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARWFAYWGQGTLVTVSA DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLNSSHQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK
在上述氨基酸序列的基礎上，利用Kabat編號規則劃分抗體可變區的CDR和FR，每個抗體的6個CDR序列組成如下表10B所示。
表10B：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3的10個單克隆抗體的CDR序列
克隆號 CDR1 CDR2 CDR3
SEQ ID NO 氨基酸序列 SEQ ID NO 氨基酸序列 SEQ ID NO 氨基酸序列
26C4D2 重鏈 57 SYWMH 58 MIHPTLGDTNYNEKFKS 59 LGSLSMMDY
輕鏈 60 SASQGISNYLN 61 YTSSLHS 62 QQYSKFPYT
39E2D11-1 重鏈 63 SYWIT 64 DIYPGSGSTTNYNEKFKS 65 ETTVGGAYAMDY
輕鏈 66 RASQSINNNLH 67 YVSQSIS 68 QQTNSWPLT
39E2D11-2 重鏈 69 SYGVH 70 VIWSGGSTDYNAAFIS 71 ENYYGNSLWFFDV
輕鏈 66 RASQSINNNLH 67 YVSQSIS 68 QQTNSWPLT
40G3D1 重鏈 72 SQWMN 73 QIYPGNGDTNYNGKFKG 74 WFAY
輕鏈 75 RASQSVRNNLH 76 YVSQSIS 77 QQSNSWPLT
46A5A4 重鏈 78 DHTIH 79 YIYPRDGYTMYNEKFKG 80 AFHALDY
輕鏈 81 SASQGISNYLN 82 YTSSLHS 83 QQYSKLPYT
47E12D12-1 重鏈 84 DYGMH 85 YISSGSSTIYYADTVKG 86 NSRGFAY
輕鏈 87 SASSSVSYMY 88 DTSNLAS 89 QQWSSYPRT
47E12D12-2 重鏈 84 DYGMH 85 YISSGSSTIYYADTVKG 86 NSRGFAY
輕鏈 90 SASSSVSSMH 91 DTSKLAS 92 QQWNSYHLT
48B6D7 重鏈 93 NYWMQ 94 MILPNSDITNYNENFQT 95 QARYSAMDY
輕鏈 96 SASQGISNYLN 97 YTSNLHS 98 QHYSKFPYT
45E4D7 重鏈 99 SHWIT 100 DIYPISGSTNNNEKFRN 101 IITVGGAYVMDY
輕鏈 75 RASQSVRNNLH 76 YVSQSIS 77 QQSNSWPLT
27E10C5 重鏈 72 SQWMN 73 QIYPGNGDTNYNGKFKG 74 WFAY
輕鏈 102 KSSQSLLNSSHQKNYLA 103 FASTRES 104 QQHYSTPWT
實施例14：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3嵌合抗體的構建及其在真核細胞中的暫態轉染表達
將測序完成的本發明的單抗重鏈可變區及輕鏈可變區分別與IgG1重鏈恒定區和κ輕鏈恒定區拼接後生成的目的基因片段克隆到pTT5表達載體中，製備轉染級別的表達質粒。
在無血清培養基中培養Expi293FTM細胞（Thermo Fisher Scientific），將細胞接種在搖瓶（Corning Inc.）中，並在37°C，8% CO2的環境中置於搖床上培養。調整細胞密度，將含有目的基因片段的重組表達載體和PEI轉染試劑按照合適的比例混合，並添加進細胞培養搖瓶中，細胞培養6天后收集表達上清，高速離心去除細胞碎片，用Protein A柱進行親和純化。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脫液洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，換液到PBS分裝備用。對最終純化的嵌合抗體進行SDS-PAGE及HPLC純度分析和A280濃度測定。
實施例15：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3嵌合抗體的體外細胞結合驗證
培養SHP-77和HEK293-cyno DLL3細胞，SHP-77細胞的培養基為RPMI1640+10%FBS，HEK293-cyno DLL3細胞的培養基為DMEM+10%FBS+200μg/ml Hygromycin（潮黴素），使用T75細胞培養瓶置於37℃ 5%CO2培養箱培養。待細胞使用時使用無菌DPBS洗細胞，0.25%胰酶EDTA消化約5分鐘後用完全培養基終止。
將消化好的細胞以1000rpm轉速常溫離心5分鐘，棄上清，用100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞。細胞計數，並將細胞密度調整到1E6/mL，鋪到96孔圓底培養板（corning 3799）中，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清，4℃放置備用。用1%BSA（在PBS中）稀釋待測抗體樣品，起始濃度為100nM，10倍往下稀釋7個濃度。使用稀釋好的抗體重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育1小時。1500rpm 轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。用1%BSA（在PBS中）按照說明書1:200稀釋二抗（goat anti human IgG Fc PE），用稀釋好的二抗重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小時。1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm 轉速4℃離心5分鐘，棄上清。100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞，300目紗布過濾細胞，流式細胞儀檢測PE通道平均螢光強度。
從流式細胞儀匯出FCS檔，用flowjo軟體分析每個樣本的PE通道平均螢光強度（以下簡稱MFI），將分析得出的平均螢光強度導入Graphpad 分析抗體與細胞的半數結合濃度（以下簡稱EC50）和最高平均螢光強度（Top MFI），結果如表11及附圖5所示。
表11：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3嵌合抗體與表達DLL3細胞的結合
克隆號 SHP-77 HEK293 - cyno DLL3
EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI) EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI)
26C4D2 0.60 1053 0.43 421
39E2D11-1 0.85 999 1.03 445
39E2D11-2 8.63 193 未檢測 未檢測
40G3D1 未擬合 369 未檢測 未檢測
46A5A4 1.18 1013 0.67 475
47E12D12-1 1.45 178 未檢測 未檢測
47E12D12-2 69.28 455 未檢測 未檢測
48B6D7 0.65 990 0.53 480
45E4D7 0.68 965 0.71 454
27E10C5 1.20 813 1.39 396
實施例16：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3抗體的人源化
10個嵌合抗體經過表達純化測試及細胞水準結合測試等，進一步挑選3個克隆進行人源化設計。
鼠源抗人DLL3單克隆抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恒定結構域替代親本（鼠源抗體）恒定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列。在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系資料庫比較，獲得同源性高的人種系範本。
將鼠源抗體的CDR區移植到選擇好的相應人源化範本上，替換人源化可變區，再與IgG恒定區（優選重鏈為IgG1，輕鏈為κ）重組。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，設計了由如下人源化輕重鏈可變區序列組合而成的抗體，如表12所示。
表12：小鼠雜交瘤來源的3個人源化抗體可變區的氨基酸序列
克隆號 重鏈可變區（VH） 輕鏈可變區（VL）
H1-39E2D11 SEQ ID NO 46 47
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNSWPLTFGGGTKLEIK
H2-39E2D11 SEQ ID NO 46 48
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNSWPLTFGGGTKLEIK
H-46A5A4 SEQ ID NO 49 50
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHTIHWVRQAPGQGLEWMGYIYPRDGYTMYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAFHALDYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIK
H1-45E4D7 SEQ ID NO 51 52
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSHWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPISGSTNNNEKFRNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKIITVGGAYVMDYWGQGTLVTVSS EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYVSQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKLEIK
H2-45E4D7 SEQ ID NO 51 53
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSHWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPISGSTNNNEKFRNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKIITVGGAYVMDYWGQGTLVTVSS EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKLEIK
實施例17：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體的體外細胞結合驗證
培養SHP-77細胞，SHP-77細胞的培養基為RPMI1640+10%FBS，使用T75細胞培養瓶置於37℃ 5%CO2培養箱培養。待細胞使用時使用無菌DPBS洗細胞，0.25%胰酶EDTA消化約5分鐘後用完全培養基終止。
將消化好的細胞以1000rpm轉速常溫離心5分鐘，棄上清，用100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞。細胞計數，並將細胞密度調整到1E6/mL，鋪到96孔圓底培養板（corning 3799）中，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清，4℃放置備用。用1%BSA（在PBS中）稀釋待測抗體樣品，起始濃度為100nM，10倍往下稀釋7個濃度。使用稀釋好的抗體重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育1小時。1500rpm 轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。用1%BSA（在PBS中）按照說明書1:200稀釋二抗（goat anti human IgG Fc PE），用稀釋好的二抗重懸細胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小時。1500rpm轉速4℃離心5分鐘，棄上清。160μL 1%BSA（在PBS中）重懸洗滌，1500rpm 轉速4℃離心5分鐘，棄上清。100μL 1%BSA（在PBS中）重懸細胞，300目紗布過濾細胞，流式細胞儀檢測PE通道平均螢光強度。
從流式細胞儀匯出FCS檔，用flowjo軟體分析每個樣本的PE通道平均螢光強度（以下簡稱MFI），將分析得出的平均螢光強度導入Graphpad 分析抗體與細胞的半數結合濃度（以下簡稱EC50）和最高平均螢光強度（Top MFI），結果如表13及附圖6所示。
表13：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合
克隆號 SHP-77
EC 50(nM) 最高平均螢光強度 （Top MFI)
39E2D11-1 1.491 1647
H1-39E2D11 2.128 1426
H2-39E2D11 1.125 1574
46A5A4 1.204 1574
H-46A5A4 1.348 1525
45E4D7 0.894 1561
H1-45E4D7 5.163 1588
H2-45E4D7 2.228 1614
實施例18：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體的Biacore親和力實驗
使用Biacore 8K儀器分析抗DLL3人源化抗體與人DLL3的親和力和動力學性質。CM5晶片先用EDC和NHS活化，然後固定抗人Fc的鼠單抗，再用乙醇胺封閉。
為測定與人DLL3的親和力與動力學性質，DLL3人源化抗體用HBS-EP+（10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20）緩衝液稀釋至0.2μg/mL，以10μL/min的流速捕獲45s。人DLL3兩倍逐級稀釋至系列濃度（100nM-0.39nM），以50μL/min的流速結合90s，解離600s。
每一輪實驗結束後，使用3M MgCl2溶液沖洗以30μL/min的流速沖洗30s，將捕獲的抗體連同抗原一起去除，完成晶片的再生。原始資料使用Biacore Insight Evaluation Software（3.0.12.15655）軟體進行分析，以(1∶1) Langmuir模型進行擬合，結果如表14所示。
表14：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體與人DLL3抗原蛋白的親和力測定結果
克隆號 ka (1/Ms) kd(1/s) KD(M)
H2-39E2D11 3.13E+05 1.80E-04 5.76E-10
H-46A5A4 2.19E+05 1.78E-04 8.11E-10
H2-45E4D7 2.35E+05 5.78E-05 2.46E-10
實施例19：小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體與同家族蛋白DLL1及DLL4的結合實驗
將抗原蛋白human DLL1（SinoBiological，貨號11635-H08H）或human DLL4 （SinoBiological，貨號10171-H08H）溶解在1×PBS中，濃度為1μg/mL。然後將抗原加到高親和力ELISA板中（Biolegend，貨號423501），100μL/孔，4℃放置過夜。用PBST洗滌抗原，300μL/孔，洗三遍。用1% BSA(在PBST中)封閉抗原，200μL/孔，37℃孵育1.5小時。
用1%BSA（在PBS中）稀釋待測抗體，起始濃度為100nM，10倍往下稀釋7個濃度。PBST洗滌板子，300μL/孔，洗三遍。將稀釋好的抗體加入到ELISA板中，100μL/孔，常溫孵育2小時。用PBST洗滌抗體，300μL/孔，洗三遍。用1%BSA（在PBST中）稀釋二抗（用於DLL4的山羊抗人IgG Fc (HRP), 1:20000稀釋；用於DLL1的HRP山羊抗鼠IgG(H+L)，1:10000稀釋）。將稀釋好的二抗加入到ELISA板中，100μL/孔，常溫孵育1小時。PBST洗滌板子，300μL/孔，洗6遍。配置顯色液（TMA與TMB 1:1混合），將顯色液加入到板中，100μL/孔，避光孵育5分鐘。加入50μL ELISA終止液到板中，搖勻。
在envision上讀取OD450，用OD450在GraphPad上作圖求EC50值。結果如圖7所示，顯示所測抗體與同家族蛋白DLL1及DLL4均無非特異結合。
實施例20：製備小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體的變體
經過對本發明的抗體進行翻譯後修飾（PTM）分析，發現H2-39E2D11的輕鏈可變區中存在1個脫醯胺位點，對第99位氨基酸進行單個位元點的定點突變，製備三個H2-39E2D11的突變體：分別是H2-39E2D11-NA，H2-39E2D11-QS和H2-39E2D11-AS。上述三個變體的可變區氨基酸序列如表15所示。
表15：H2-39E2D11人源化抗體變體的氨基酸序列
克隆號   重鏈可變區（VH） 輕鏈可變區（VL） LCDR3
H2-39E2D11-NA SEQ ID NO 46 54 112
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNAWPLTFGGGTKLEIK QQTNAWPLT
H2-39E2D11-QS SEQ ID NO 46 55 113
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTQSWPLTFGGGTKLEIK QQTQSWPLT
H2-39E2D11-AS SEQ ID NO 46 56 114
氨基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTASWPLTFGGGTKLEIK QQTASWPLT
參照實施例5所述，製備上述3個變體，經哺乳動物細胞系瞬轉表達後，使用SHP-77細胞進行親和力檢測，結果參見圖8，顯示變體能夠在細胞水準的結合不發生明顯變化的情況下去除翻譯後修飾風險。使用人DLL3抗原蛋白進行親和力檢測結果參見表16。
表16A：H2-39E2D11人源化抗體變體與人DLL3抗原蛋白的親和力測定結果
克隆號 ka (1/Ms) kd(1/s) KD(M)
H2-39E2D11 1.81E+05 1.34E-04 7.39E-10
H2-39E2D11-NA 2.47E+05 1.20E-04 4.84E-10
H2-39E2D11-QS 1.71E+05 3.91E-05 2.29E-10
H2-39E2D11-AS 2.06E+05 3.62E-04 1.76E-09
表16B：H2-39E2D11人源化抗體變體與食蟹猴DLL3抗原蛋白的親和力測定結果
克隆號 ka (1/Ms) kd(1/s) KD(M)
H2-39E2D11 2.21E+05 3.16E-05 1.43E-10
H2-39E2D11-NA 2.33E+05 8.09E-05 3.46E-10
H2-39E2D11-QS 1.98E+05 8.59E-05 4.34E-10
H2-39E2D11-AS 2.62E+05 4.27E-04 1.63E-09
上文所述的本發明的實施方案僅為示例性的，任何本領域技術人員都可以認識到或者可以確定無數的特定化合物、材料和操作的等價物，而不需要進行超出常規的試驗。所有這些等價物都是在本發明範圍之內的，並且被請求項所包含。
無
圖1A顯示了本發明的駱駝來源的抗DLL3嵌合抗體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合情況。 圖1B顯示了本發明的駱駝來源的抗DLL3嵌合抗體與表達DLL3細胞（HEK293-cyno DLL3）的結合情況。 圖2A顯示了本發明的駱駝來源的抗DLL3人源化抗體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合情況。 圖2B顯示了本發明的駱駝來源的抗DLL3人源化抗體與表達DLL3細胞（HEK293-cyno DLL3）的結合情況。 圖3A顯示了本發明的駱駝來源的抗DLL3人源化抗體與同家族蛋白DLL1的結合情況。 圖3B顯示了本發明的駱駝來源的抗DLL3人源化抗體與同家族蛋白DLL4的結合情況。 圖4顯示了本發明的駱駝來源的hDLL3-3-1人源化抗體變體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合情況。 圖5A顯示了本發明的小鼠雜交瘤來源的抗DLL3嵌合抗體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合情況。 圖5B顯示了本發明的小鼠雜交瘤來源的抗DLL3嵌合抗體與表達DLL3細胞（HEK293-cyno DLL3）的結合情況。 圖6顯示了本發明的小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合情況。 圖7A顯示了本發明的小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體與同家族蛋白DLL1的結合情況。 圖7B顯示了本發明的小鼠雜交瘤來源的抗DLL3人源化抗體與同家族蛋白DLL4的結合情況。 圖8顯示了本發明的小鼠雜交瘤來源的H2-39E2D11人源化抗體變體與表達DLL3細胞（SHP-77）的結合情況
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Claims (14)

  1. 一種DLL3結合分子或其抗原結合片段，其特徵在於：所述DLL3結合分子或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH），所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分別為： (a) SEQ ID NO：6、7和8；或 (b) SEQ ID NO：9、10和11；或 (c) SEQ ID NO：12、13和14；或 (d) SEQ ID NO：15、16和17；或 (e) SEQ ID NO：18、19和20；或 (f) SEQ ID NO：6、7和110；或 (g) SEQ ID NO：6、7和111； 優選地，所述重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：1-5、21-29任一的氨基酸序列，或者包含與SEQ ID NO：1-5、21-29任一具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
  2. 一種DLL3結合分子或其抗原結合片段，其特徵在於：所述DLL3結合分子或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分別為： (a) SEQ ID NO：57、58、59、60、61和62；或 (b) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和68；或 (c) SEQ ID NO：69、70、71、66、67和68；或 (d) SEQ ID NO：72、73、74、75、76和77；或 (e) SEQ ID NO：78、79、80、81、82和83；或 (f) SEQ ID NO：84、85、86、87、88和89；或 (g) SEQ ID NO：84、85、86、90、91和92；或 (h) SEQ ID NO：93、94、95、96、97和98；或 (i) SEQ ID NO：99、100、101、75、76和77；或 (j) SEQ ID NO：72、73、74、102、103和104；或 (k) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和112；或 (l) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和113；或 (m) SEQ ID NO：63、64、65、66、67和114； 優選地，所述重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一的氨基酸序列，或者包含與SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或 所述輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一的氨基酸序列，或者包含與SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列； 更優選地，所述重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含選自以下組的序列： (1) SEQ ID NO：30和31；或 (2) SEQ ID NO：32和33；或 (3) SEQ ID NO：34和33；或 (4) SEQ ID NO：35和36；或 (5) SEQ ID NO：37和38；或 (6) SEQ ID NO：39和40；或 (7) SEQ ID NO：39和41；或 (8) SEQ ID NO：42和43；或 (9) SEQ ID NO：44和36；或 (10) SEQ ID NO：35和45；或 (11) SEQ ID NO：46和47；或 (12) SEQ ID NO：46和48；或 (13) SEQ ID NO：49和50；或 (14) SEQ ID NO：51和52；或 (15) SEQ ID NO：51和53；或 (16) SEQ ID NO：46和54；或 (17) SEQ ID NO：46和55；或 (18) SEQ ID NO：46和56。
  3. 如前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段，其還具有以下特徵的一種或多種： (i) 其還包含重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區；優選地，所述重鏈恒定區包含Fc；更優選地，Fc來源於鼠或人；更優選地，Fc的序列是天然的或經過修飾的； (ii) 所述DLL3結合分子或其抗原結合片段為單克隆抗體、雙特異性結合分子、多特異性結合分子、人源化抗體、嵌合抗體、改型抗體、全人源抗體、全長抗體、重鏈抗體、納米抗體、Fab、Fv、scFv、F(ab’)2、線性抗體或單結構域抗體；和/或 (iii) 其為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。
  4. 一種偶聯物，其特徵在於：將前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段與捕獲標記物或檢測標記物偶聯形成；優選地，所述檢測標記物包括放射性核素、發光物質、有色物質或酶。
  5. 一種抗體藥物偶聯物，其特徵在於：將前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段與其他生物活性分子偶聯形成；優選地，所述其他生物活性分子為小分子藥物；優選地，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段與所述其他生物活性分子通過接頭連接。
  6. 編碼前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段的核酸，或者包含所述核酸的重組載體，或者包含所述核酸或所述重組載體的宿主細胞；優選地，所述宿主細胞為原核細胞（優選大腸桿菌），或者真核細胞（優選哺乳動物細胞或酵母；進一步優選地，所述哺乳動物細胞為CHO細胞或HEK293細胞）。
  7. 製備前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段的方法，所述方法包括：在適合的條件下培養請求項6所述的宿主細胞，並從所述細胞中純化獲得表達產物。
  8. 前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段在製備治療或緩解腫瘤的藥物中的用途；優選地，所述藥物靶向DLL3異常表達的腫瘤細胞；優選地所述腫瘤選自：小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌。
  9. 前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段在製備檢測試劑或診斷試劑中的用途；優選地，所述檢測試劑用於檢測DLL3的表達；所述診斷試劑用於診斷腫瘤；優選地，所述腫瘤選自：小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌。
  10. 一種檢測樣品中DLL3表達的方法，所述方法包括： （1）將樣品與前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段接觸； （2）檢測所述DLL3結合分子或其抗原結合片段與DLL3的複合物的形成；任選地，所述DLL3結合分子或其抗原結合片段是被可檢測地標記的。
  11. 一種藥物組合物，其包含有效量的前述任一請求項所述的DLL3結合分子或其抗原結合片段、或者包含有效量的請求項5所述的抗體藥物偶聯物、或者包含有效量的請求項6所述的核酸或者重組載體或者宿主細胞；優選地，其還包含藥學上可接受的載體；優選地，其還包含一種或多種額外的其他治療劑。
  12. 一種藥盒或試劑盒，其包括容器，以及位於容器中的如請求項11所述的藥物組合物。
  13. 一種誘導表達DLL3的細胞死亡的方法，所述方法包括使所述細胞與請求項11所述的藥物組合物接觸，所述表達DLL3的細胞是腫瘤細胞；優選地，所述腫瘤細胞是選自以下腫瘤的細胞：小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌。
  14. 一種治療受試者中與表達DLL3相關的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用如請求項11任一所述的藥物組合物和/或如請求項12所述的藥盒或試劑盒；優選地，所述疾病是腫瘤；小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、神經內分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直腸癌以及上述腫瘤的轉移癌；更優選地，還包括向所述受試者給予額外的治療劑。
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