TW201938200A - 抗mct1抗體及其用途 - Google Patents
抗mct1抗體及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201938200A TW201938200A TW108100587A TW108100587A TW201938200A TW 201938200 A TW201938200 A TW 201938200A TW 108100587 A TW108100587 A TW 108100587A TW 108100587 A TW108100587 A TW 108100587A TW 201938200 A TW201938200 A TW 201938200A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- antibody
- mct1
- antigen
- polypeptide
- seq
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
本發明概言之係關於抗體及其抗原結合片段,例如人類化、嵌合及人類抗體及其抗原結合片段,以及融合蛋白;含有此等抗體及其抗原結合片段以及融合蛋白之組合物,其中此等抗體及其抗原結合片段以及融合蛋白特異性結合至MCT1,例如人類或非人類MCT1,且在活體外及/或在活體內拮抗、抑制或阻斷一或多種MCT1相關之功能。本發明亦係關於該等抗MCT1抗體、抗原結合片段、融合蛋白及含有其之組合物之治療性及診斷性用途,視情況其中該等抗MCT1抗體、抗原結合片段、融合蛋白及含有其之組合物用於治療性方案中,該等治療性方案進一步包括投與其他治療劑,例如粒線體抑制劑及/或雙胍或小分子MCT1抑制劑。
Description
相關申請案
本申請案主張2018年1月4日提出申請之美國臨時案第62/613,447號、2018年6月14日提出申請之美國臨時案第62/684,870號及2018年9月25日提出申請之美國臨時案第62/736,025號及2018年11月30日提出申請之美國臨時案第62/773,630號之優先權。該等臨時申請案中之每一者之內容係以全文引用的方式併入本文中。
序列表
序列表
於2019年1月4日創建之命名為「43260.4213.txt」之檔案中之序列表大小為 xxxxxx個位元組,其係以全文引用的方式併入本文中。
本發明概言之係關於抗MCT1抗體及其抗原結合片段,例如人類化、嵌合及人類抗體及其抗原結合片段,例如拮抗性抗MCT1抗體及其抗原結合片段,及含有此等抗體及其抗原結合片段之組合物。此等抗體及抗原結合片段包括特異性結合至MCT1 (例如,在表現內源性MCT1之人類細胞或經改造以表現MCT1之重組細胞表面上表現之MCT1)且拮抗一或多種與MCT1相關之功能(例如,其促進乳酸鹽轉運之能力)之彼等抗體及抗原結合片段。本發明亦係關於融合或多特異性蛋白,其包含一或多種抗MCT1抗體結合序列,例如多特異性及雙特異性抗體。本發明進一步係關於此等抗體、抗原結合片段、融合及多特異性多肽及含有其之組合物之治療性及診斷性用途。本發明具體而言係關於該等抗體及其抗原結合片段作為預防劑或治療劑之用途,例如用於治療自體免疫、發炎、過敏、移植、GVHD、癌症及其他病狀,其中阻抑MCT1活性及/或增加TR1細胞數目/活性及/或減少T效應細胞之數目/活性在治療上係合意的。
單羧酸鹽營養物轉運蛋白SLC16A1 (MCT1)係多通道跨膜蛋白質,其負責促進關鍵代謝物(包括醣解產物)之轉運。MCT1係最大的表面膜蛋白質家族中之一者之成員,稱為溶質通道蛋白(SLC),其功能涉及跨膜轉運關鍵細胞營養物、代謝物、離子、激素及脂質。MCT1屬於SLC16轉運蛋白家族,其中之五者已顯示以促進、pH依賴性及雙向方式轉運單羧酸鹽,諸如丙酮酸鹽、乳酸鹽及酮(參考文獻34至36)。已顯示SLC16A1 (MCT1)、SLC16A7 (MCT2)、SLC16A8 (MCT3)及SLC16A3 (MCT4)全部均以1-40 mM範圍內之Km轉運單羧酸鹽(參考文獻37)。MCT1、MCT3及MCT4與含有Ig結構域之表面蛋白質CD147 (基礎免疫球蛋白(Basigin))共表現,此在許多細胞中對於適當細胞表面係關鍵的(參考文獻38、37)。除該等MCT以外,其他乳酸鹽轉運蛋白包括最近表徵之SLC16A11 (參考文獻39)及鈉依賴性SLC5A8及SLC5A12 (參考文獻40)、AQP9 (參考文獻41、42)以及在紅血球上表現之SLC4A1 (條帶3)。因此,九種非依賴性蛋白質可控制且調控乳酸至全身細胞內,細胞之間及細胞外之轉運。MCT1與T細胞及B細胞中乳酸鹽之轉運尤其相關(參考文獻43)。
免疫細胞在整個生長中經歷其代謝需求之轉變,且需要特定代謝狀態以供採用其效應功能。在發炎性疾病模型中阻斷醣解已顯示效能(參考文獻53)。舉例而言,當淋巴球在活化後被阻斷使用醣解路徑時,可預防易患疾病小鼠之狼瘡之發生(參考文獻53)。實際上,該等模型中IFNγ產生之缺乏與已顯示醣解為IFNγ之產生所需之先前報導一致(參考文獻54)。阻斷乳酸鹽之輸出會降低經由醣解路徑之通量(參考文獻55),且藉由改變Myc可使T細胞遠離效應功能(參考文獻56)。抑制MCT1功能阻斷若干種疾病動物模型中之效應T細胞活性,該等疾病動物模型包括膠原誘發之關節炎、同種異體移植物排斥及GVHD (參考文獻45、47、50、57至59)。
然而,該等路徑在非免疫細胞中之普遍存在及免疫特異性靶標之缺乏阻止治療性干預。鑒於MCT跨越許多組織之廣泛表現,擊中多種MCT之小分子方法造成特別挑戰,包括組織毒性。舉例而言,AZ3965係結合至MCT1及MCT2之小分子(參考文獻45、46)。此MCT1/2小分子抑制劑在自體免疫疾病/移植之治療中具有潛在應用(參考文獻47),但混雜之結合導致對臨床前模型中視網膜、心臟及睪丸之毒性(參考文獻48、85)。
MCT1缺陷之成年人類係健康的(參考文獻49、68)。由於酮利用及代謝之改變,因此僅在壓力(感染、饑餓)下鑑別出具有同型接合MCT1功能喪失(LOF)突變之個體。呈現酮利用缺陷之嬰兒有時會出現不耐受。隨著其年齡增長,該等各種症狀消失,此可能係由於在青春期期間骨骼肌質量之生長。具有同型接合MCT1突變之個體之異型接合家族成員無酮酸中毒史,此表明LOF突變僅在連同其他遺傳/環境因素一起時才會引起酮酸中毒(參考文獻68)。在免疫系統之外,MCT1亦在多個器官中表現,包括骨骼肌、腎臟、肝臟、睪丸、心臟及腦以及其他MCT。具有MCT1突變之個體中不存在廣泛毒性可能係由於MCT之大量冗餘所致。舉例而言,MCT1、MCT2及MCT4全部均在視網膜中表現(參考文獻69),且在MCT1缺陷個體中未觀察到視網膜缺陷,此表明功能冗餘性。此時,在MCT1缺陷個體中未觀察到明顯之免疫缺陷。另外,MCT1缺陷人類不呈現任何RBC功能障礙。
癌細胞與正常細胞之間存在代謝差異:特定而言,腫瘤細胞依賴於高需氧醣解速率而非氧化磷酸化來產生用於維持細胞功能之能量。實際上,即使具有足夠之氧氣,癌細胞相對於正常細胞醣解速率亦增強高達60倍。此對醣解之依賴性及其結果稱為「瓦博格效應(Warburg effect)」(參考文獻94、95)。惡性細胞具有高度合成代謝性且需要極高水準之營養物、ATP及構建單元來合成其生長及存活所需要之組分。使用醣解路徑提供ATP,但亦驅動乳酸鹽之產生,其係在醣解路徑結束時自丙酮酸鹽產生。腫瘤細胞產生之大量乳酸鹽需要其消耗或消除之有效方法,以防止癌細胞之細胞內酸化。
維持乳酸鹽穩態之方式之一係經由單羧酸鹽轉運蛋白。表現譜研究已確立,大多數侵襲性腫瘤類型表現顯著升高之MCT1、MCT4或二者水準(參考文獻96)。MCT1及MCT4之表現分別受兩種主要致癌性轉錄因子(MYC及缺氧誘導因子-1a (HIF-1a))之調控(參考文獻96、97),該等轉錄因子指導支持需氧醣解之關鍵蛋白質之產生顯著增加,該等關鍵蛋白質包括參與麩醯胺酸及葡萄糖之分解代謝之胺基酸轉運蛋白及酶(參考文獻98)。具有MYC參與之惡性病及缺氧腫瘤通常對目前之一線療法具有抗性,其具有高治療失敗率、再發及高患者死亡率(參考文獻99、100)。重要的是,抑制MCT1可離體殺死腫瘤細胞且在活體內引起腫瘤消退,且其功效由在癌細胞上迫使醣解表現型之劑(諸如二甲雙胍)增強(參考文獻96、100)。
MCT1通常在胰島中且特定而言在β-細胞中以極低之水準表現(參考文獻101、102)。此可能解釋該等細胞之極慢乳酸鹽攝取。運動誘發之高胰島素症(EIHI)之標誌為在劇烈身體活動後不適當之胰島素分泌,此導致低血糖症(參考文獻103)。EIHI與β-細胞中MCT1之升高表現相關,且經改造以過表現MCT1之基因轉殖小鼠部分地展示許多EIHI標誌(參考文獻104)。
如上文所述,已開發出各種小分子MCT抑制劑,但許多該等小分子抑制劑缺乏針對MCT1之特異性,從而導致脫靶毒性。儘管具有該等缺點,但已顯示小分子MCT1抑制劑可破壞腫瘤細胞代謝、增殖及存活,且在高度表現MCT1之腫瘤中活體內損害致瘤潛力(參考文獻96)。此等小分子MCT1抑制劑之抗腫瘤效應藉由共投與雙胍二甲雙胍而得以增強,認為此進一步增強腫瘤細胞對需氧醣解之依賴性且因此增加對MCT1介導之乳酸鹽外排之需求(參考文獻96)。然而,迄今尚未報導結合至表面表現之MCT1之抗體,例如結合至在表現內源性或經改造MCT1之人類或非人類細胞表面上表現之MCT1之彼等抗體。此外,據申請人所知,文獻中尚未報導功能性抗體,亦即結合至MCT1且藉此拮抗、抑制或阻斷MCT1效應之彼等功能性抗體。
本發明首次提供特異性結合至在內源性或重組MCT1表現細胞表面上表現之人類MCT1之抗體及其抗原結合片段,該等細胞例如抗體此外具有功能性(亦即,此等抗體拮抗MCT1相關功能)之人類細胞。
更具體而言,本發明提供特異性結合至人類MCT1之新穎抗體及其抗原結合片段,其拮抗MCT1相關功能,諸如抑制MCT1介導之乳酸鹽轉運。
本發明進一步提供MCT1結合融合蛋白及MCT1結合多特異性多肽,其包含一或多個MCT1結合抗體可變結構域及視情況其他部分,例如諸如另一抗原結合可變結構域、細胞介素或受體等另一多肽。
本發明進一步提供經分離之抗體或其抗原結合片段,其結合至包含在人類或非人類MCT1之細胞外結構域或區中之一或多個殘基。
本發明進一步提供結合至人類或非人類MCT1之經分離之抗體或其抗原結合片段,其(例如)在活體外及/或在活體內拮抗、抑制或阻斷一或多種MCT1相關功能。
本發明進一步提供結合至非人類MCT1 (例如,諸如小鼠或大鼠等囓齒類動物MCT1)之經分離之抗體或抗原結合片段,其(例如)在活體外及/或在活體內視情況拮抗、抑制或阻斷一或多種MCT1相關功能,例如,其視情況進一步結合至人類MCT1。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其與抗人類MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者競爭與人類或非人類MCT1之結合。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其與抗人類MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者結合至人類MCT1上之相同或重疊之抗原決定基。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其結合至人類MCT1上選自以下之抗原決定基:
(i) 包含以下殘基中之一或多者之抗原決定基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、K297、G417、I47及D418;
(ii) 包含至少三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含選自以下之殘基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(iii) 包含三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(iv) 包含三個至六個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(v) 包含殘基T41、S285及S286中之至少一者、兩者或全部三者之抗原決定基;
(vi) 包含T41之抗原決定基;
(vii) 包含S286之抗原決定基;
(viii) 包含S285之抗原決定基;
(ix) 包含H292之抗原決定基;
(x) 包含殘基T41、S285、S286、Y287、G417及D418之抗原決定基;
(xi) 包含殘基T41、S285及S286之抗原決定基;
(xii) 包含殘基T41、I47、S285、S286、G417及D418之抗原決定基,
(xiii) 包含殘基E46、K289及H292之抗原決定基;
(xiv) 包含殘基K297、Y293及H292之抗原決定基;
(xv) 包含(例如)選自囓齒類動物(例如,小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔、雞、非人類靈長類動物(例如,食蟹猴、黑猩猩、猩猩)、牛、綿羊、犬及貓之非人類MCT1之相應殘基中之一或多者之抗原決定基;
其中視情況藉由使用丙胺酸掃描來鑑別存在於該等抗原決定基中之殘基。
(i) 包含以下殘基中之一或多者之抗原決定基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、K297、G417、I47及D418;
(ii) 包含至少三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含選自以下之殘基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(iii) 包含三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(iv) 包含三個至六個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(v) 包含殘基T41、S285及S286中之至少一者、兩者或全部三者之抗原決定基;
(vi) 包含T41之抗原決定基;
(vii) 包含S286之抗原決定基;
(viii) 包含S285之抗原決定基;
(ix) 包含H292之抗原決定基;
(x) 包含殘基T41、S285、S286、Y287、G417及D418之抗原決定基;
(xi) 包含殘基T41、S285及S286之抗原決定基;
(xii) 包含殘基T41、I47、S285、S286、G417及D418之抗原決定基,
(xiii) 包含殘基E46、K289及H292之抗原決定基;
(xiv) 包含殘基K297、Y293及H292之抗原決定基;
(xv) 包含(例如)選自囓齒類動物(例如,小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔、雞、非人類靈長類動物(例如,食蟹猴、黑猩猩、猩猩)、牛、綿羊、犬及貓之非人類MCT1之相應殘基中之一或多者之抗原決定基;
其中視情況藉由使用丙胺酸掃描來鑑別存在於該等抗原決定基中之殘基。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其結合至根據技術方案7選擇之人類MCT1上之抗原決定基,其中該抗體或抗原結合片段進一步與以下殘基中之一或多者相互作用:
(i) 殘基P37、I40、K45、E48及T55中之一或多者(環1);
(ii) 殘基Q111 (環2);
(iii) 殘基Q166 (環3);
(iv) 殘基L284、E296、S298中之一或多者(環4);
(v) 殘基Y353 (環5);
(vi) 殘基Y419、T422中之一或兩者(環6);及/或
(vii) 前述之任一組合。
(i) 殘基P37、I40、K45、E48及T55中之一或多者(環1);
(ii) 殘基Q111 (環2);
(iii) 殘基Q166 (環3);
(iv) 殘基L284、E296、S298中之一或多者(環4);
(v) 殘基Y353 (環5);
(vi) 殘基Y419、T422中之一或兩者(環6);及/或
(vii) 前述之任一組合。
本發明進一步提供結合至非人類MCT1上之抗原決定基之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,該非人類MCT1視情況選自囓齒類動物(例如,小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔、鳥類(例如,雞、火雞、鵝)、非人類靈長類動物(例如,食蟹猴、黑猩猩、猩猩)、牛、綿羊、犬、貓,其中視情況非人類MCT1上之該抗原決定基包含非人類MCT1中與人類MCT1之T41、S285、S286、Y287、G417、I47及D418中之一或多者相對應殘基中之一或多者,例如其(例如)在活體外及/或在活體內拮抗、抑制或阻斷該非人類MCT1之一或多種活性中之一或多者。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其係人類、人類化、非人類靈長類動物、靈長類化、雞、囓齒類動物或嵌合的。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其(例如)在活體外及/或在活體內抑制人類MCT1介導之乳酸鹽轉運。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其結合至表現內源性MCT1之細胞及/或結合至表現重組或經改造MCT1之細胞,例如表現人類MCT1之293細胞。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群:人類或人類化單株抗體;單特異性抗體;多重特異性抗體;多特異性抗體樣多肽、人類化抗體;人類或人類化四聚體抗體;人類或人類化四價抗體;人類或人類化多特異性抗體;單鏈抗體;結構域特異性抗體;單一結構域抗體;結構域缺失抗體;scFc融合蛋白;嵌合抗體;合成抗體;重組抗體;雜交抗體;多特異性抗體、雙特異性抗體、ByTE、突變抗體;CDR移植抗體;抗體片段;Fab;F(ab′)2;Fab′片段;Fv片段;單鏈Fv (scFv)片段;Fd片段;dAb片段;雙價抗體;奈米抗體;二價奈米抗體;VHH抗體;及微小抗體。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含人類化抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者之至少1個、2個、3個、4個、5個或全部6個CDR,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義;或經分離之抗體或其抗原結合片段,其與抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者競爭與MCT1之結合或其與抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者結合相同之抗原決定基;或前述任一者之親和力成熟變異體。
本發明進一步提供經分離之人類化抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者之相同CDR,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與選自Ab1至Ab95之抗MCT1抗體或其人類化變異體中所包含之VH多肽相同之VH多肽。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與選自Ab1至Ab95之抗MCT1抗體或其人類化變異體中所包含之VL多肽相同之VL多肽。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與選自Ab1至Ab95之抗MCT1抗體或其人類化變異體中所包含之VH多肽及VL多肽一致之VH多肽及VL多肽。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者中所含之可變重鏈多肽及/或可變輕鏈多肽分別具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之可變重鏈多肽及/或可變輕鏈多肽。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含分別具有SEQ ID NO: 4-6之胺基酸序列之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3多肽及分別具有SEQ ID NO: 7-9之胺基酸序列之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3多肽。
本發明進一步提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其係源自Ab1至Ab95中之任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,視情況含有與Ab1至Ab95中之任一者相同之CDR,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義。
本發明進一步提供源自Ab1至Ab95中之任一者之親和力成熟之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其中相對於Ab1至Ab95中之任一者之6個CDR多肽中所包含之CDR殘基,至多1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12或13個CDR殘基經突變,其中視情況該親和力成熟之抗MCT1抗體以至少等於或大於其源自之抗MCT1抗體及/或(例如)在活體外及/或在活體內拮抗人類MCT1之親和力成熟抗體或抗原結合片段之親和力結合至人類MCT1,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義,視情況其中相對於Ab1至Ab95中之任一者之CDR多肽,至多1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個CDR殘基經突變或相對於Ab1至Ab95中之任一者之CDR多肽,至多1個、2個、3個或4個CDR殘基經突變或相對於Ab1至Ab95中之任一者之CDR多肽,至多1個或2個CDR殘基經突變。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗人類MCT1抗體或抗原結合片段,其進一步結合至非人類MCT1,視情況囓齒類動物、兔、雞或非人類靈長類動物MCT1。
本發明進一步提供包含SEQ ID NO: 2及3、SEQ ID NO: 12及13、SEQ ID NO: 14及15、SEQ ID NO: 16及17之VH及VL多肽之抗MCT1抗體;或包含抗體Ab5至Ab95中之任一者之VL及/或VH多肽或包含抗體Ab5至Ab95中之任一者之VL及/或VH多肽之人類化或親和力成熟變異體之抗MCT1抗體。
本發明進一步提供抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自以下胺基酸序列之可變重鏈多肽或重鏈多肽:SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153及155;及具有選自以下胺基酸序列之可變輕鏈多肽或輕鏈多肽:SEQ ID NO: 3、13、15、17、33至44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154及156。
本發明進一步提供抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有分別選自以下胺基酸序列之可變重鏈多肽及可變輕鏈多肽:SEQ ID NO: 2及3;SEQ ID NO: 12及13;SEQ ID NO: 14及15;SEQ ID NO: 16及17;SEQ ID NO: 45及46;SEQ ID NO: 47及48;SEQ ID NO: 49及50;SEQ ID NO: 51及52;SEQ ID NO: 53及54;SEQ ID NO: 55及56;SEQ ID NO: 57及58;SEQ ID NO: 59及60;SEQ ID NO: 61及62;SEQ ID NO: 63及64;SEQ ID NO: 65及66;SEQ ID NO: 67及68;SEQ ID NO: 69及70;SEQ ID NO: 71及72;SEQ ID NO: 73及74;SEQ ID NO: 75及76;SEQ ID NO: 77及78;SEQ ID NO: 79及80;SEQ ID NO: 81及82;SEQ ID NO: 83及84;SEQ ID NO: 85及86;SEQ ID NO: 87及88;SEQ ID NO: 89及90;SEQ ID NO: 91及92;SEQ ID NO: 93及94;SEQ ID NO: 95及96;SEQ ID NO: 97及98;SEQ ID NO: 99及100;SEQ ID NO: 101及102;SEQ ID NO: 103及104;SEQ ID NO: 105及106;SEQ ID NO: 107及108;SEQ ID NO: 109及110;SEQ ID NO: 111及112;SEQ ID NO: 113及114;SEQ ID NO: 115及116;SEQ ID NO: 117及118;SEQ ID NO: 119及120;SEQ ID NO: 121及122;SEQ ID NO: 123及124;SEQ ID NO: 125及126;SEQ ID NO: 127及128;SEQ ID NO: 129及130;SEQ ID NO: 131及132;SEQ ID NO: 133及134;SEQ ID NO: 135及136;SEQ ID NO: 137及138;SEQ ID NO: 139及140;SEQ ID NO: 141及142;SEQ ID NO: 143及144;SEQ ID NO: 145及146;SEQ ID NO: 147及148;SEQ ID NO: 149及150;SEQ ID NO: 151及152;SEQ ID NO: 153及154以及SEQ ID NO: 155及156。
本發明進一步提供如前述實施例中任一者之人類化及/或親和力成熟之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 3、13、15、17及33至44之胺基酸序列之VL多肽或抗體Ab5至Ab60中之任一者之VL多肽。
本發明進一步提供如前述實施例中任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 2、12、14、16及19至32之胺基酸序列之VH多肽或抗體Ab5至Ab60中之任一者之VH多肽。
本發明進一步提供如前述中任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 13、15、17及33至44之胺基酸序列之VL多肽及具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 12、14、16及19至32之胺基酸序列之VH多肽或抗體Ab5至Ab60中之任一者之VH多肽。
本發明進一步提供如前述中任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含VL多肽,該VL多肽具有與SEQ ID NO: 3、13、15、17、33至44中之任一者或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VL多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。
本發明進一步提供如前述中任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含VH多肽,該VH多肽具有與SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32中之任一者或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VH多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。
本發明進一步提供如前述中任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含VL多肽,該VL多肽具有與SEQ ID NO: 3、13、15、17、33至44中之任一者或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VL多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列;及/或VH多肽,該VH多肽具有與SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32之VH多肽或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VH多肽具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。
本發明進一步提供如前述中任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其中該重鏈CDR3序列包含18、19、20、21、22、23或24個胺基酸殘基。
本發明進一步提供如前述中任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其中該重鏈CDR3序列包含21、22、23或24個胺基酸殘基。
本發明進一步提供如前述中任一者之經分離之抗MCT1人類或抗原結合片段,其中該重鏈CDR3序列與SEQ ID NO:6一致或與其差異至多5、4、3、2或1個殘基,視情況其中該等差異(若存在)包含保守胺基酸取代或包含在包含相同長度CDR3之人類或囓齒類動物抗體之該重鏈CDR3中之相同位置處普遍存在之取代性胺基酸。
本發明進一步提供如前述中任一者之經分離之人類或人類化抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其與參考抗體競爭與MCT1之結合,其中該參考抗體係選自Ab1至Ab95。
本發明進一步提供抗人類MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體相同之可變重鏈及/或可變輕鏈CDR多肽。
本發明進一步提供抗MCT1抗體,其包含選自Ab1至Ab95之抗體之可變重鏈及/或輕鏈多肽。
本發明進一步提供如前述中任一者之人類或人類化抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈及/或輕鏈恆定區、視情況人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈及/或輕鏈恆定區,該(等)恆定區視情況經突變以損害或增強至少一種效應功能,例如其中該等效應功能包括FcR結合、補體結合、ADCC功能、FcRN結合及醣基化。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其中如經由結構比對所確定差異在於小於2.0 Å、小於1.0 Å或小於0.5 Å之平均均方根偏差(RMSD)之相應CDR中α碳之位置所指示,該抗體或其抗原結合片段之該等CDR形成與Ab1之CDR相似或相同之類似三維抗體結構。
本發明進一步提供人類化抗體或其抗原結合片段,其包含Ab1之可變重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及Ab1之可變輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)。
本發明進一步提供抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與MCT1 Ab1之VH結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL結構域。
本發明進一步提供如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含人類恆定結構域、視情況IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,其進一步視情況經修飾以增強至少一種選自醣基化、FcR結合、FcRN結合、補體結合及ADCC功能之Fc效應功能。
本發明進一步提供如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含人類IgG1恆定區,該等人類IgG1恆定區視情況經修飾以減少FcR結合及/或補體結合,進一步視情況包含E269R及/或K322A突變及/或該等人類IgG1恆定區包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
本發明進一步提供融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其包含至少一種如前述中任一者之抗MCT1抗體或抗原結合片段。
本發明進一步提供前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其減少T效應細胞活性及/或T效應細胞之數目,該等T效應細胞係例如CD3+、CD4+或CD8+ T效應細胞。
本發明進一步提供前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其增加Tr1細胞之活性及/或數目。
本發明進一步提供前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其減少T效應細胞活性及/或T效應細胞之數目,該等T效應細胞係例如CD3+、CD4+或CD8+ T效應細胞,且此外其增加Tr1細胞之活性及/或數目。
本發明進一步提供表現至少一種如前述中任一者之抗MCT1抗體或抗原結合片段、融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽之細胞,例如人類、非人類哺乳動物、酵母、細菌、兩棲動物、植物、昆蟲或爬行動物細胞或人類細胞、視情況人類免疫細胞,例如T細胞、NK細胞、單核球、調節性T細胞或巨噬細胞。
本發明進一步提供針對如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段產生之抗個體遺傳型抗體,視情況其係人類、人類化及/或親和力成熟的。
本發明進一步提供針對如上文所述之抗個體遺傳型抗體產生之抗-抗個體遺傳型抗體,其視情況結合MCT1且進一步視情況阻斷或拮抗一或多種MCT1活性。
本發明進一步提供融合蛋白,其包含如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或SEQ ID NO: 6之VH CDR3多肽或與其具有至少80%序列一致性之變異體,其直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀(adnectin)、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體,例如其中該抗體多肽或結構域包含Fc多肽或其片段,例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區或其片段。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其在結合至例如經活化T細胞或B細胞、進一步視情況人類細胞之細胞表面上之MCT1時引發以下性質中之一或多者:
(i) 抑制乳酸鹽之轉運;
(ii) 抑制溴丙酮酸鹽之轉運;
(iii) 抑制以下中之一或多者之轉運:單羧酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸、酮體、乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽、乙酸鹽、乳酸、細胞營養物、代謝物、離子、激素、脂質及酮;
(iv) 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
(v) 抑制經活化T細胞或B細胞之增殖;
(vi) 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生;
(vii) 減少T效應細胞之活性及/或數目,例如CD3+ 、CD4+ 及/或CD8+ 效應T細胞;
(viii) 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;
(ix) 抑制混合淋巴球反應中之同種異體活化;
(x) 或前述中任一者之組合。
(i) 抑制乳酸鹽之轉運;
(ii) 抑制溴丙酮酸鹽之轉運;
(iii) 抑制以下中之一或多者之轉運:單羧酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸、酮體、乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽、乙酸鹽、乳酸、細胞營養物、代謝物、離子、激素、脂質及酮;
(iv) 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
(v) 抑制經活化T細胞或B細胞之增殖;
(vi) 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生;
(vii) 減少T效應細胞之活性及/或數目,例如CD3+ 、CD4+ 及/或CD8+ 效應T細胞;
(viii) 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;
(ix) 抑制混合淋巴球反應中之同種異體活化;
(x) 或前述中任一者之組合。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或(例如)如前述實施例中任一者表現前述中任一者之細胞,其在結合至MCT1時抑制一或多種發炎性細胞介素之產生。
本發明進一步提供如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其中該一或多種發炎性細胞介素中之至少一者係選自FGF2、FLT-3L、分形趨化因子(Fractilkine)、G-CSF、GM-CSF、GRO、IFNα2、IFNγ、IL-3、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-17a、IP-10、MCP-1、MDC、MIP-1a、MIP-1b、sCD40L、TNFα及TNFβ。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其中該一或多種發炎性細胞介素中之至少一者係選自IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10及IL-6。
本發明進一步提供如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其以如經由乳酸鹽FLIPR分析所量測小於100 nM、小於50 nM或小於10 nM之Kd抑制經活化T細胞中MCT1介導之乳酸鹽轉運。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其:
(i) 如經由流式細胞術所量測,不結合至MCT2、MCT3、MCT4及/或CD147;
(ii) 不抑制MCT2、MCT3及/或MCT4轉運;
(iii) 不抑制IL-2之產生;
(iv) 不抑制單核球中之乳酸鹽轉運;
(v) 不抑制初始、靜息及/或調節性T細胞之增殖;
(vi) 不抑制RBC中之乳酸鹽轉運;
(vii) 不改變一或多種視情況選自CD25、CD54、CD69、CD95、CD98、CD147、CD154、CD278、CD279及HLA-DR/DP/DQ之T細胞活化標記物之表現。
(i) 如經由流式細胞術所量測,不結合至MCT2、MCT3、MCT4及/或CD147;
(ii) 不抑制MCT2、MCT3及/或MCT4轉運;
(iii) 不抑制IL-2之產生;
(iv) 不抑制單核球中之乳酸鹽轉運;
(v) 不抑制初始、靜息及/或調節性T細胞之增殖;
(vi) 不抑制RBC中之乳酸鹽轉運;
(vii) 不改變一或多種視情況選自CD25、CD54、CD69、CD95、CD98、CD147、CD154、CD278、CD279及HLA-DR/DP/DQ之T細胞活化標記物之表現。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區、視情況已經修飾以改變效應功能、半衰期、蛋白分解或醣基化中之至少一者之Fc區,其中視情況該Fc區含有一或多種改變或消除N-醣基化及/或O-醣基化之突變。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其以小於100 nM、小於50 nM或小於10 nM之親和力(KD)結合至人類MCT1。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或如前述實施例中任一者之表現前述中任一者之細胞,其另外具有以下修飾中之一或多者:
(i) 結合至細胞毒性劑;
(ii) 包含在雙特異性抗體中;
(iii) 包含在多特異性抗原結合蛋白中;
(iv) 結合至標記;及
(v) 結合至另一治療劑、視情況免疫抑制劑或化學治療劑。
(i) 結合至細胞毒性劑;
(ii) 包含在雙特異性抗體中;
(iii) 包含在多特異性抗原結合蛋白中;
(iv) 結合至標記;及
(v) 結合至另一治療劑、視情況免疫抑制劑或化學治療劑。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其中該標記係化學發光標記、順磁性標記、MRI對比劑、螢光標記、生物發光標記或放射性標記,或該細胞毒性劑係抑制DNA、RNA或蛋白質合成之部分;放射性核種;或核糖體抑制蛋白。
本發明進一步提供如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或如前述中任一者之表現前述中任一者之細胞,其適於治療患有以下之人類個體:自體免疫、發炎性或過敏性病狀;代謝病症(例如,糖尿病)、多囊性腎病(ADPKD)、癌症;移植接受者或EIHI或其中減少之T效應細胞數目及/或活性(例如,CD3+ T細胞、CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)及/或增加之Tr1或T抑制細胞活性及/或數目在治療上合意之任何其他病狀。
本發明進一步提供針對如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段所產生之抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段,其視情況中和其所結合之抗MCT1抗體或其抗原結合片段之一或多種生物效應。
本發明進一步提供針對如前述之抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段所產生之抗-抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段,視情況其中該抗-抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段中和其所結合之抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供使用上述抗個體遺傳型抗體監測個體中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之活體內水準或中和個體中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之活體內效應之方法。
本發明進一步提供編碼如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段之多核苷酸;含有其之表現載體;及包含該等多核苷酸或表現載體之宿主細胞、視情況人類免疫細胞,例如T細胞、B細胞或NK細胞。
本發明進一步提供醫藥組合物或診斷組合物,其包含有效量之如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段,或表現前述中任一者之細胞,例如適用於人類或非人類療法或預防者。
本發明進一步提供產生經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段之方法,其包括在容許表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養如上文所述之宿主細胞;及自培養基或宿主細胞回收該抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供醫藥組合物,其包含醫藥學上有效量之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段、抗個體遺傳型抗體、融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,例如包含醫藥稀釋劑、載劑或賦形劑之彼等醫藥組合物,且視情況其可包含另一治療劑,例如粒線體抑制劑及/或雙胍及/或另一單羧酸鹽轉運蛋白(MCT抑制劑),例如SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13或SLC16A14抑制劑或MCT1、MCT2、MCT3、MCT4、MCT5、MCT6、MCT7、MCT8、MCT9或MCT10抑制劑,其中該抑制劑可抑制前述轉運蛋白中之一或多者且進一步該抑制劑視情況包含小分子、RNAi、抗體、抗體片段或融合蛋白或其中該另一活性劑係選自二甲雙胍、苯乙雙胍(Phenformin)、阿來西定(Alexidine)、雙雙胍、丁福明(Buformim)、氯己定(Chlorohexidine)、氯丙胍(Chlorproguanil)、苯基雙胍、聚胺基丙基雙胍、聚己縮胍(Polyhexanide)、嗎啉胍(Moroxydine)、格列吡嗪(Glipizide)、格列苯脲(Glyburide)、瑞格列奈(Repaglinide)、沙格列汀(Saxagliptin)、西他列汀(Sitagliptin)、雙羥萘酸撲蟯寧(Pyrvinum Pamoate)、氯胍(Proguanil)、去氧羥四環素、阿托伐醌(Atovaquone)、卡格列淨(Canagliflozin)、格列酮(Glitazone)(例如曲格列酮(Troglitazone)、吡格列酮(Pioglitazone)、羅格列酮(Rosiglitazone))、替吉環素(Tigecycline)、噻唑化物(例如,硝唑尼特(Nitazoxanide))、柳基苯胺(例如氯生太爾(Closantel)、羥氯紮胺(Oxyclozanide)、氯硝柳胺(Niclosamide))、哌克昔林(Perhexiline)、普萘洛爾(Propronolol)、非諾貝特(Fenofibrate)、咪康唑(Miconazole)、奈法唑酮(Nefazodone)、戊烷脒(Pentamidine)、氫化可體松(Hydrocortisone)、間碘苯甲胍、氯尼達明(Lonidamine)、α生育酚琥珀酸酯(維生素E之主要形式)、碳酸酐酶、ME344 (MEI Pharma)、HIF1a抑制劑(例如柯因(Chrysin)、黑毛黴素(Chetomin)、二甲基-雙酚A、BAY84-2243)、SR13800、二甲基草醯甘胺酸(DMOG)、羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、羰基氰間氯苯腙(CCCP)、抗黴素A (Antimycin A)、寡黴素(Oligomycin)、沙利黴素(Salinomycin)、二硝基苯酚、魚藤酮(Rotenone)、苯乙雙胍、酪胺酸磷酸化抑制劑9 (Tyrphostin 9)、連環蛋白A5 (Atpenin A5)、小檗鹼(Berberine)、疊氮化物、氰化物、氧化亞氮、三氧化砷、撲蟯寧(Pyrvinium)、卡格列淨、羅格列酮、異戊巴比妥(Amobarbital)、和厚樸酚(Honokiol)、牛蒡子苷元(Arctigenin)、咖啡酸苯基酯、哌非納嗪(Perhenazine)、三氟拉嗪(Triflouroperazine)、甲基乙二醛及包含前述中任一者之組合。
本發明進一步提供用於抑制有需要之個體中T效應細胞(例如,CD3+、CD4+及/或CD8+ T效應細胞)之活性及/或數目之方法,其包括向該個體投與治療或預防有效量之如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物。
本發明進一步提供用於增加有需要之個體中T抑制細胞或Tr1細胞之活性及/或數目之方法,其包括向該個體投與治療或預防有效量之如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物。
本發明進一步提供用於抑制有需要之個體中T效應細胞(例如,CD3+、CD4+及/或CD8+ T效應細胞)之活性及/或數目且增加T抑制細胞或Tr1細胞之活性及/或數目之方法,其包括向該個體投與治療或預防有效量之如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物,例如其中該個體患有特徵在於T效應細胞(例如,CD3+、CD4+或CD8+)活性增加及/或T抑制細胞或Tr1活性降低及/或T抑制細胞或Tr1細胞數目減少之自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)。
本發明進一步提供用於預防或治療自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)或與該等病狀中之任一者相關之症狀之方法,其包括向有需要之個體投與治療或預防有效量之如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物,例如其中該自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)之特徵在於T效應細胞(例如,CD3+、CD4+或CD8+)活性增加及/或T抑制細胞或Tr1活性降低及/或T抑制細胞或Tr1細胞數目減少或視情況其中該代謝病症包含達農氏病(Danon disease)、糖尿病、杜阿爾特半乳糖血症(Duarte galactosemia)、MDP症候群、代謝性肌病、亞甲基四氫葉酸還原酶缺乏症、溫徹斯特症候群(Winchester syndrome)、柳酸敏感、X連鎖之低磷酸鹽血症、酒精性酮酸中毒、酒精臉紅反應、α-胺基己二酸及α-酮己二酸尿症、高陰離子間隙代謝性酸中毒、痛風、複食症候群、運動相關低鈉血症、胰臟炎、胰臟炎及Metab-L或視情況其中該病狀至少部分地由活化之T細胞或B細胞及/或MCT1表現細胞介導。
本發明進一步提供如前述中任一者之方法,其中投與該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白具有以下效應中之一或多者:
(i) 抑制經活化T細胞或B細胞中之乳酸鹽轉運;
(ii) 抑制經活化T細胞或B細胞中之溴丙酮酸鹽毒素之轉運;
(iii) 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
(iv) 抑制經活化T細胞之增殖;
(v) 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生及/或分泌;
(vi) 不抑制IL-2之產生及/或分泌;
(vii) 增加尿酮之產生;
(viii) 延長存活時間;
(ix) 減少移植物排斥;
(x) 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;
(xi) 增加為Treg之CD4+ T細胞之比例;
(xii) 減少IgG1+ B細胞之比例;
(xiii) 減少生發中心B細胞之比例;
(xiv) 不抑制人類RBC中之乳酸鹽轉運;
(xv) 減少T細胞活化;及
(xvi) 減少細胞毒性T細胞活性。
(i) 抑制經活化T細胞或B細胞中之乳酸鹽轉運;
(ii) 抑制經活化T細胞或B細胞中之溴丙酮酸鹽毒素之轉運;
(iii) 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
(iv) 抑制經活化T細胞之增殖;
(v) 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生及/或分泌;
(vi) 不抑制IL-2之產生及/或分泌;
(vii) 增加尿酮之產生;
(viii) 延長存活時間;
(ix) 減少移植物排斥;
(x) 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;
(xi) 增加為Treg之CD4+ T細胞之比例;
(xii) 減少IgG1+ B細胞之比例;
(xiii) 減少生發中心B細胞之比例;
(xiv) 不抑制人類RBC中之乳酸鹽轉運;
(xv) 減少T細胞活化;及
(xvi) 減少細胞毒性T細胞活性。
本發明進一步提供如前述中任一者之方法,其用於治療或預防狼瘡、移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、1型或2型糖尿病或肥胖症中之至少一者。
本發明進一步提供如前述中任一者之方法,其中治療效能係經由以下來監測:尿酮之量測、TR1細胞數目之增加、選自發炎性細胞介素、IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2、TIGIT、PD1、顆粒酶B之生物標記物之表現之降低或增加、效應T細胞及/或hCD3+細胞數目之減少、PMBC增殖之阻抑或前述中任一者之組合。
本發明進一步提供評價抗MCT1拮抗劑抗體之治療效能之方法,其包括偵測其在活體外或活體內對以下前述中任一者之效應:尿酮、TR1細胞之數目、選自發炎性細胞介素、IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2、TIGIT、PD1、顆粒酶B之生物標記物之表現、效應T細胞及/或hCD3+細胞數目之減少、PMBC增殖之阻抑或前述中任一者之組合。
本發明進一步提供如前述中任一者之方法,其用於治療癌症或預防癌症之復發,該等方法包括向有需要之個體投與治療或預防有效量之如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物,例如,其中腫瘤細胞表現MCT1或該個體係哺乳動物或該個體係選自人類、非人類靈長類動物或囓齒類動物之哺乳動物。
本發明進一步提供用於抑制經活化T細胞或B細胞或降低經活化T細胞或B細胞之活性之方法,其包括使該等活化細胞與如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞接觸。
本發明進一步提供如前述中任一者之方法,其中如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞係作為單一療法投與。
本發明進一步提供如前述中任一者之方法,其中如前述中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞係與第二治療劑組合投與,例如其中該治療劑係選自免疫抑制藥物、化學治療劑、雙胍(例如,二甲雙胍或另一抗糖尿病劑)或抗發炎劑或該另一治療劑係粒線體抑制劑及/或雙胍或該另一治療劑係選自二甲雙胍、苯乙雙胍、阿來西定、雙雙胍、丁福明、氯己定、氯丙胍、苯基雙胍、聚胺基丙基雙胍、聚己縮胍、嗎啉胍、格列吡嗪、格列苯脲、瑞格列奈、沙格列汀、西他列汀、雙羥萘酸撲蟯寧、氯胍、去氧羥四環素、阿托伐醌、卡格列淨、格列酮(例如曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮)、替吉環素、噻唑化物(例如,硝唑尼特)、柳基苯胺(例如氯生太爾、羥氯紮胺、氯硝柳胺)、哌克昔林、普萘洛爾、非諾貝特、咪康唑、奈法唑酮、戊烷脒、氫化可體松、間碘苯甲胍、氯尼達明、α生育酚琥珀酸酯(維生素E之主要形式)、碳酸酐酶、ME344 (MEI Pharma)、HIF1a抑制劑(例如柯因、黑毛黴素、二甲基-雙酚A、BAY84-2243)、SR13800、二甲基草醯甘胺酸(DMOG)、羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、羰基氰間氯苯腙(CCCP)、抗黴素A、寡黴素、沙利黴素、二硝基苯酚、魚藤酮、苯乙雙胍、酪胺酸磷酸化抑制劑9、連環蛋白A5、小檗鹼、疊氮化物、氰化物、氧化亞氮、三氧化砷、撲蟯寧、卡格列淨、羅格列酮、異戊巴比妥、和厚朴酚、牛蒡子苷元、咖啡酸苯基酯、哌非納嗪、三氟拉嗪、甲基乙二醛及包含前述中任一者之組合。
本發明進一步提供如前述中任一者之方法,其中該抗MCT1抗體、其抗原結合片段、融合蛋白或醫藥組合物係以經腸、非經腸或經表面方式投與。
本發明進一步提供用於監測利用結合至MCT1且降低MCT1介導之乳酸鹽轉運之抗體或其抗原結合片段或融合蛋白進行治療之效能之方法,其包括量測尿酮水準。
本發明進一步提供用於診斷病狀之方法,該病狀係選自自體免疫、發炎性或過敏性病狀;癌症;EIHI;多囊性腎病(ADPKD);糖尿病或其他代謝病症及/或與MCT1上調相關之病狀,該方法包括:
(i) 分離負責介導該病狀之細胞;
(ii) 使該等細胞與抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白接觸;且
(iii) 偵測結合至該等細胞之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白之水準。
(i) 分離負責介導該病狀之細胞;
(ii) 使該等細胞與抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白接觸;且
(iii) 偵測結合至該等細胞之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白之水準。
本發明進一步提供如上文所述之治療及偵測方法,其中該病狀係自體免疫病狀、發炎性病狀、移植病狀、GVHD、代謝病症(例如,糖尿病)、EIHI;多囊性腎病(ADPKD);或過敏性病狀,例如其中該病狀係自體免疫病狀、發炎性病狀、移植病狀、GVHD、代謝病症(例如,糖尿病)、多囊性腎病(ADPKD)或過敏性病狀,且該等細胞係經活化之T細胞或B細胞,或該病狀係癌症且該等細胞係腫瘤細胞,或該病狀係EIHI且該等細胞係β細胞。
本發明進一步提供如上文所述之治療及偵測方法,其中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白包含以下中之一或多者:
(i) 與選自Ab1至Ab95中之任一者之抗MCT1抗體或包含與前述抗MCT1抗體中之任一者相同之CDR之另一抗MCT1抗體競爭;
(ii) 包含與選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體相同之CDR;
(iii) 包含選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體之親和力成熟或人類化變異體;
(iv) 與包含以下之抗體競爭:與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab1至Ab59中之任一者競爭;及與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab2至Ab95中之任一者競爭;
(v) 包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)或Ab2至Ab95中之任一者之彼等序列;
(vi) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab2至Ab60中之任一者競爭;及與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab2至Ab60中之任一者競爭;
(vii) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與選自胺基酸序列SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32之VH 結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab5至Ab60中之任一者競爭;及/或
(viii) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與選自胺基酸序列SEQ ID NO: 13、15、17或33至44之VH 結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab5至Ab60中之任一者競爭;及/或
(ix) 包含至少一種肽,該至少一種肽包含與SEQ ID NO:6一致之序列或包含與其差異至多5個、4個、3個、2個或1個殘基之序列,其中該肽直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體。
(i) 與選自Ab1至Ab95中之任一者之抗MCT1抗體或包含與前述抗MCT1抗體中之任一者相同之CDR之另一抗MCT1抗體競爭;
(ii) 包含與選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體相同之CDR;
(iii) 包含選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體之親和力成熟或人類化變異體;
(iv) 與包含以下之抗體競爭:與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab1至Ab59中之任一者競爭;及與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab2至Ab95中之任一者競爭;
(v) 包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)或Ab2至Ab95中之任一者之彼等序列;
(vi) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab2至Ab60中之任一者競爭;及與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab2至Ab60中之任一者競爭;
(vii) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與選自胺基酸序列SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32之VH 結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab5至Ab60中之任一者競爭;及/或
(viii) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與選自胺基酸序列SEQ ID NO: 13、15、17或33至44之VH 結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab5至Ab60中之任一者競爭;及/或
(ix) 包含至少一種肽,該至少一種肽包含與SEQ ID NO:6一致之序列或包含與其差異至多5個、4個、3個、2個或1個殘基之序列,其中該肽直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體。
本發明提供偵測細胞表現MCT1、視情況功能性MCT1之方法,其包括測定如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體中之任一者是否結合至該細胞所表現之MCT1,例如其中該細胞係人類或非人類細胞,例如其中該細胞係自患有或疑似包含自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)之患者獲得,或其中該偵測方法用於診斷或監測疾病或疾病預後,其係使用自患有或疑似包含特徵在於細胞包含異常(增加)之MCT1表現或活性之自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)之患者獲得的細胞樣品來實施。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群:單株抗體;單特異性抗體;多重特異性抗體;人類化抗體;四聚體抗體;四價抗體;多特異性抗體;單鏈抗體;結構域特異性抗體;單一結構域抗體;結構域缺失抗體;scFc融合蛋白;嵌合抗體;合成抗體;重組抗體;雜交抗體;突變抗體;CDR移植抗體;抗體片段;Fab;F(ab′)2;Fab′片段;Fv片段;單鏈Fv (scFv)片段;Fd片段;dAb片段;多特異性抗體、雙價抗體;ByTE、二價抗體、奈米抗體;二價奈米抗體;鯊魚可變IgNAR結構域;VHH抗體;駱駝科動物抗體;及微小抗體。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係人類、人類化或嵌合抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係抗MCT1抗體,其與本文中鑑別為Ab1至Ab95之任一抗體競爭或與本文中鑑別為Ab1至Ab95之任一抗體結合至相同或重疊之抗原決定基,其中此等抗體或抗原結合片段視情況拮抗一或多種MCT1相關功能,例如其抑制MCT1介導之乳酸鹽轉運。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係抗MCT1抗體,其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或所有6個如本文中鑑別為Ab1至Ab95之任一抗MCT1抗體之CDR,其中此等抗體或抗原結合片段視情況拮抗一或多種MCT1相關功能,例如其抑制MCT1介導之乳酸鹽轉運。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含本文中鑑別為Ab1至Ab95之任一抗MCT1抗體之人類化、嵌合、scFv或親和力成熟衍生物,其中此等抗體或抗原結合片段視情況拮抗一或多種MCT1相關功能,例如其抑制MCT1介導之乳酸鹽轉運。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係融合多肽或多特異性多肽,其包含至少一個抗MCT1抗原結合結構域,該至少一個抗MCT1抗原結合結構域包含與本文中鑑別為Ab1至Ab95之任一抗MCT1抗體相同之CDR或重鏈及/或輕鏈可變區,其中此融合多肽或多特異性多肽視情況拮抗一或多種MCT1相關功能,例如其抑制MCT1介導之乳酸鹽轉運。
在一些實施例中,該抗MCT1抗體或抗原結合片段將包含含有19、20、21、22、23或24個胺基酸殘基之重鏈CDR3序列。在一些實施例中,重鏈CDR3序列包含21、22或23個胺基酸殘基。在一些實施例中,重鏈CDR3序列與SEQ ID NO:6一致或與其差異至多5個、4個、3個、2個或1個殘基。在一些實施例中,該等取代若存在則包含保守胺基酸取代或包含在人類或囓齒類動物抗體之重鏈CDR3中之相同位置處普遍存在之取代性胺基酸。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭與MCT1之結合,其中該參考抗體包含:
i. MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6),及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7, 8, 9);或
ii. 與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域。
i. MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6),及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7, 8, 9);或
ii. 與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段包含與MCT1 Ab1之VH結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL結構域。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段包含VH結構域,該VH結構域包含與本文中鑑別為Ab1至Ab95之任一抗MCT1抗體之VH結構域中所包含相同之CDR,及/或包含VL結構域,該VL結構域包含與本文中鑑別為Ab1至Ab83之任一抗MCT1抗體之VH結構域相同之CDR。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段包含VH結構域,該VH結構域與本文中鑑別為Ab1至Ab95之任一抗MCT1抗體之VH結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性,及/或包含VL結構域,該VL結構域與本文中鑑別為Ab1至Ab83之任一抗MCT1抗體之VH結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性。
在一些實施例中,該抗MCT1抗體或抗原結合片段將結合至根據本發明之抗MCT1抗體(亦即Ab1至Ab95中之任一者)所結合抗原決定基之以下殘基中之一或多者,視情況其中藉由丙胺酸掃描鑑別構成抗原決定基之該等殘基。
在一些實施例中,如經由如圖21中所示之結構比對所確定差異在於小於2.0 Å、小於1.0 Å或小於0.5 Å之平均均方根偏差(RMSD)之相應CDR中α碳之位置所指示,該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之CDR將具有與MCT1 Ab1之彼等CDR類似之三維結構。
本發明另外提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含具有選自以下胺基酸序列之可變重鏈多肽或重鏈多肽:SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153及155,及具有選自以下胺基酸序列之可變輕鏈多肽或輕鏈多肽:SEQ ID NO: 3、13、15、17、33至44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、150、152、144、146、148、150、152、154及156。
本發明具體而言提供經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含具有分別選自以下胺基酸序列之可變重鏈多肽及可變輕鏈多肽:SEQ ID NO: 2及3;SEQ ID NO: 12及13;SEQ ID NO: 14及15;SEQ ID NO: 16及17;SEQ ID NO: 45及46;SEQ ID NO: 47及48;SEQ ID NO: 49及50;SEQ ID NO: 51及52;SEQ ID NO: 53及54;SEQ ID NO: 55及56;SEQ ID NO: 57及58;SEQ ID NO: 59及60;SEQ ID NO: 61及62;SEQ ID NO: 63及64;SEQ ID NO: 65及66;SEQ ID NO: 67及68;SEQ ID NO: 69及70;SEQ ID NO: 71及72;SEQ ID NO: 73及74;SEQ ID NO: 75及76;SEQ ID NO: 77及78;SEQ ID NO: 79及80;SEQ ID NO: 81及82;SEQ ID NO: 83及84;SEQ ID NO: 85及86;SEQ ID NO: 87及88;SEQ ID NO: 89及90;SEQ ID NO: 91及92;SEQ ID NO: 93及94;SEQ ID NO: 95及96;SEQ ID NO: 97及98;SEQ ID NO: 99及100;SEQ ID NO: 101及102;SEQ ID NO: 103及104;SEQ ID NO: 105及106;SEQ ID NO: 107及108;SEQ ID NO: 109及110;SEQ ID NO: 111及112;SEQ ID NO: 113及114;SEQ ID NO: 115及116;SEQ ID NO: 117及118;SEQ ID NO: 119及120;SEQ ID NO: 121及122;SEQ ID NO: 123及124;SEQ ID NO: 125及126;SEQ ID NO: 127及128;SEQ ID NO: 129及130;SEQ ID NO: 131及132;SEQ ID NO: 133及134;SEQ ID NO: 135及136;SEQ ID NO: 137及138;SEQ ID NO: 139及140;SEQ ID NO: 141及142;SEQ ID NO: 143及144;SEQ ID NO: 145及146;SEQ ID NO: 147及148;SEQ ID NO: 149及150;SEQ ID NO: 151及152;SEQ ID NO: 153及154以及SEQ ID NO: 155及156。
本發明進一步提供經分離之抗體或其抗原結合片段,其包含與MCT1 Ab1之VH結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL結構域。
本發明亦提供融合蛋白,其包含至少一種肽,該至少一種肽包含與SEQ ID NO:6一致之序列或包含與其差異至多5個、4個、3個、2個或1個殘基之序列,其中該肽直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體。在一些實施例中,抗體多肽或結構域包含Fc多肽或其片段,例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區或其片段。在一些實施例中,該等取代若存在則包含保守胺基酸取代或包含在人類或囓齒類動物抗體之重鏈CDR3中之相同位置處普遍存在之取代性胺基酸。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白在結合至經活化T細胞或B細胞表面上之MCT1時具有以下性質中之一或多者:
i. 抑制乳酸鹽之轉運;
ii. 抑制溴丙酮酸鹽之轉運;
iii. 抑制以下中之一或多者之轉運:單羧酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸、酮體、乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽、乙酸鹽、乳酸、細胞營養物、代謝物、離子、激素、脂質及酮;
iv. 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
v. 抑制經活化T細胞或B細胞之增殖;
vi. 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生;
vii. 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;及
viii. 抑制混合淋巴球反應中之同種異體活化。
i. 抑制乳酸鹽之轉運;
ii. 抑制溴丙酮酸鹽之轉運;
iii. 抑制以下中之一或多者之轉運:單羧酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸、酮體、乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽、乙酸鹽、乳酸、細胞營養物、代謝物、離子、激素、脂質及酮;
iv. 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
v. 抑制經活化T細胞或B細胞之增殖;
vi. 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生;
vii. 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;及
viii. 抑制混合淋巴球反應中之同種異體活化。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白在結合至MCT1時抑制一或多種發炎性細胞介素之產生。在一些實施例中,該一或多種細胞介素中之至少一者(例如,發炎性細胞介素),其中此等細胞介素可包括以下中之任一者:FGF2、FLT-3L、分形趨化因子、G-CSF、GM-CSF、GRO、IFNα2、IFNγ、IL-3、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-17a、IP-10、MCP-1、MDC、MIP-1a、MIP-1b、sCD40L、TNFα及TNFβ。在一些實施例中,該一或多種發炎性細胞介素中之至少一者係選自IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10及IL-6。
在一些實施例中,如經由乳酸鹽FLIPR分析所量測,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白以小於100 nM、小於50 nM或小於10 nM之Kd抑制經活化T細胞中MCT1介導之乳酸鹽轉運。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白:
i. 如經由流式細胞術所量測,不結合至MCT2、MCT3、MCT4及/或CD147;
ii. 不抑制MCT2、MCT3及/或MCT4轉運;
iii. 不抑制IL-2之產生;
iv. 不抑制單核球中之乳酸鹽轉運;
v. 不抑制初始、靜息及/或調節性T細胞之增殖;
vi. 不抑制RBC中之乳酸鹽轉運;
vii. 不改變一或多種視情況選自CD25、CD54、CD69、CD95、CD98、CD147、CD154、CD278、CD279及HLA-DR/DP/DQ之T細胞活化標記物之表現。
i. 如經由流式細胞術所量測,不結合至MCT2、MCT3、MCT4及/或CD147;
ii. 不抑制MCT2、MCT3及/或MCT4轉運;
iii. 不抑制IL-2之產生;
iv. 不抑制單核球中之乳酸鹽轉運;
v. 不抑制初始、靜息及/或調節性T細胞之增殖;
vi. 不抑制RBC中之乳酸鹽轉運;
vii. 不改變一或多種視情況選自CD25、CD54、CD69、CD95、CD98、CD147、CD154、CD278、CD279及HLA-DR/DP/DQ之T細胞活化標記物之表現。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白包含已經修飾以改變效應功能、半衰期、蛋白分解或醣基化中之至少一者之Fc區,其中視情況該Fc區含有一或多種改變或消除N-醣基化及/或O-醣基化之突變。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白以小於100 nM、小於50 nM或小於10 nM之親和力(KD
)結合MCT1。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白另外具有以下修飾中之一或多者:
i. 結合至細胞毒性劑;
ii. 包含在雙特異性抗體中;
iii. 包含在多特異性抗原結合蛋白中;
iv. 結合至標記;及
v. 結合至另一治療劑、視情況免疫抑制劑或化學治療劑。
i. 結合至細胞毒性劑;
ii. 包含在雙特異性抗體中;
iii. 包含在多特異性抗原結合蛋白中;
iv. 結合至標記;及
v. 結合至另一治療劑、視情況免疫抑制劑或化學治療劑。
在一些實施例中,標記係化學發光標記、順磁性標記、MRI對比劑、螢光標記、生物發光標記或放射性標記。
在一些實施例中,細胞毒性劑係抑制DNA、RNA或蛋白質合成之部分;放射性核種;或核糖體抑制蛋白。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白適於治療患有自體免疫、發炎性或過敏性病狀;癌症;或EIHI之人類個體。
本發明亦提供針對如先前實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段所產生之抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段,其視情況中和其所結合之抗MCT1抗體或其抗原結合片段之一或多種生物效應。本發明進一步提供針對該抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段所產生之抗-抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段,視情況其中該抗-抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段中和其所結合之抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段。
此外,在一些實施例中,本發明係關於使用抗個體遺傳型抗體監測個體中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之活體內水準或中和個體中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之活體內效應之方法。
本發明亦提供編碼如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白之經分離之多核苷酸。另外提供包含此等多核苷酸之表現載體。本發明亦提供包含該表現載體之宿主細胞。本發明進一步係關於產生經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段之方法,其包括在容許表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養宿主細胞;且自培養基或宿主細胞回收該抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供醫藥組合物,其包含醫藥學上有效量之如前述實施例中任一者之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白或表現其之經分離之細胞,其可進一步包含醫藥稀釋劑、載劑或賦形劑。
本文亦提供用於治療或預防自體免疫、過敏性或發炎性病狀之方法,其包括向有需要之個體投與治療或預防有效量之如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白或如上文所述之醫藥組合物。
在一些實施例中,該病狀至少部分地由經活化T細胞或B細胞介導。
在一些實施例中,投與抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白具有以下效應中之一或多者:
i. 抑制經活化T細胞或B細胞中之乳酸鹽轉運;
ii. 抑制經活化T細胞或B細胞中之溴丙酮酸鹽毒素之轉運;
iii. 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
iv. 抑制經活化T細胞之增殖;
v. 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生及/或分泌;
vi. 不抑制IL-2之產生及/或分泌;
vii. 增加尿酮之產生;
viii. 延長存活時間;
ix. 減少移植物排斥;
x. 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;
xi. 增加為Treg之CD4+ T細胞之比例;
xii. 減少IgG1+ B細胞之比例;
xiii. 減少生發中心B細胞之比例;
xiv. 不抑制人類RBC中之乳酸鹽轉運;
xv. 減少T細胞活化;及
xvi. 減少細胞毒性T細胞活性。
i. 抑制經活化T細胞或B細胞中之乳酸鹽轉運;
ii. 抑制經活化T細胞或B細胞中之溴丙酮酸鹽毒素之轉運;
iii. 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖;
iv. 抑制經活化T細胞之增殖;
v. 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生及/或分泌;
vi. 不抑制IL-2之產生及/或分泌;
vii. 增加尿酮之產生;
viii. 延長存活時間;
ix. 減少移植物排斥;
x. 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性;
xi. 增加為Treg之CD4+ T細胞之比例;
xii. 減少IgG1+ B細胞之比例;
xiii. 減少生發中心B細胞之比例;
xiv. 不抑制人類RBC中之乳酸鹽轉運;
xv. 減少T細胞活化;及
xvi. 減少細胞毒性T細胞活性。
在一些實施例中,該方法用於治療或預防狼瘡。
在一些實施例中,該方法用於治療或預防移植物排斥。
在一些實施例中,該方法用於治療或預防移植物抗宿主病(GVHD)。
在一些實施例中,該方法用於治療或預防糖尿病。
在一些實施例中,該方法用於治療或預防肥胖症。
在一些實施例中,經由尿酮之量測監測治療效能。
本發明進一步提供用於治療癌症或預防癌症復發之方法,其包括向有需要之個體投與治療或預防有效量之如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白或如前述實施例之醫藥組合物。
在一些實施例中,腫瘤細胞表現MCT1。
在一些實施例中,個體係哺乳動物。在一些實施例中,哺乳動物係人類。在一些實施例中,哺乳動物係非人類靈長類動物。在一些實施例中,哺乳動物係囓齒類動物。
本發明亦提供用於抑制經活化T細胞或B細胞或降低經活化T細胞或B細胞之活性之方法,其包括使該等活化細胞與如前述實施例中任一者之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白接觸。
在一些實施例中,該抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白係作為單一療法投與。
在一些實施例中,該抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合蛋白係與第二治療劑組合投與。
在一些實施例中,該治療劑係選自免疫抑制藥物或化學治療劑。
在一些實施例中,該抗MCT1抗體、其抗原結合片段、融合蛋白或醫藥組合物係以經腸、非經腸或經表面方式投與。
本發明另外提供用於監測利用結合至MCT1且降低MCT1介導之乳酸鹽轉運之抗體或其抗原結合片段或融合蛋白進行治療之效能之方法,其包括量測尿酮水準。
在另一態樣中,本發明提供用於診斷病狀之方法,該病狀係選自自體免疫、發炎性或過敏性病狀;癌症;EIHI;及與MCT1上調相關之病狀,該方法包括:
i. 分離負責介導該病狀之細胞;
ii. 使該等細胞與抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白接觸;且
iii. 偵測結合至該等細胞之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白之水準。
i. 分離負責介導該病狀之細胞;
ii. 使該等細胞與抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白接觸;且
iii. 偵測結合至該等細胞之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白之水準。
在一些實施例中,該病狀係自體免疫、發炎性或過敏性病狀,且該等細胞係經活化之T細胞或B細胞。
在一些實施例中,該病狀係癌症,且該等細胞係腫瘤細胞。
在一些實施例中,該病狀係EIHI,且該等細胞係β細胞。
在一些實施例中,抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白:
i. 與包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)之抗體或選自Ab1至Ab95中之任一者之抗MCT1抗體競爭;
ii. 與如下抗體競爭:包含與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)或與Ab1至Ab95中之任一者之VH 結構域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域;且進一步包含與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)或Ab1至Ab95中之任一者之VL 結構域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域;
iii. 包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列 (SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9);
iv. 包含與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域;或
v. 包含至少一種肽,該至少一種肽包含與SEQ ID NO:6一致之序列或包含與其差異至多5個、4個、3個、2個或1個殘基之序列,其中該肽直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體。
i. 與包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)之抗體或選自Ab1至Ab95中之任一者之抗MCT1抗體競爭;
ii. 與如下抗體競爭:包含與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)或與Ab1至Ab95中之任一者之VH 結構域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域;且進一步包含與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)或Ab1至Ab95中之任一者之VL 結構域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域;
iii. 包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列 (SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9);
iv. 包含與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域;或
v. 包含至少一種肽,該至少一種肽包含與SEQ ID NO:6一致之序列或包含與其差異至多5個、4個、3個、2個或1個殘基之序列,其中該肽直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體。
本發明係關於結合至單羧酸鹽轉運蛋白1 (「MCT1」)之抗體及其抗原結合片段、編碼該等抗MCT1抗體及其抗原結合片段之核酸、包含該等抗MCT1抗體及其抗原結合片段之組合物及在診斷學及療法中使用該等抗MCT1抗體、抗體片段及組合物之方法。
抗體靶標:MCT1
抗體靶標:MCT1
MCT1係多通道跨膜蛋白質,其負責促進關鍵代謝物(包括醣解產物)之轉運。本申請案提供新穎抗MCT1抗體、具體而言抗人類MCT1抗體,其包括包含與本申請案中鑑別為Ab1至Ab83之任一抗體相同之CDR之彼等抗體。在本發明之前,尚未報導阻斷MCT1功能之抗MCT1抗體或抗體片段。
根據本發明,抗MCT1抗體或抗體片段與MCT1之結合將降低、阻抑、減少或以其他方式抑制MCT1功能中之至少一者。由於其涉及免疫,因此此結合及MCT1之抑制可對自體免疫(例如經活化之T細胞、B細胞及/或發炎性細胞介素表現)具有至少一種阻抑性效應。重要的是,MCT1係唯一在T細胞及B細胞上表現之免疫相關的乳酸鹽轉運蛋白。由於在效應T細胞活化期間至醣解之轉變,因此本發明之抗MCT1抗體尤其靶向經活化T細胞,由此為控制自體免疫、發炎性及過敏性病狀提供創新性及強大之機會。如實例中所展示,尤其鑒於人類中MCT1缺陷之數據,本發明之抗MCT1抗體提供對淋巴球代謝之選擇性抑制及具吸引力之安全性概況。阻斷發炎性疾病模型(例如,易患疾病小鼠中之狼瘡模型)中之淋巴球醣解預防該等模型中之IFNγ產生且提供以安全且有效之方式阻斷淋巴球醣解之本發明抗體具有作為免疫調節藥物之強大潛力之進一步證據。
阻斷或抑制MCT1功能之抗MCT1抗體可用於降低自體免疫。特定而言,該等抗體可用於阻抑不期望之人類免疫反應(諸如自體免疫、過敏性、狼瘡、GVHD、敗血症)或不期望之發炎性免疫反應。
由於特定之能量需求及對腫瘤細胞之醣解之依賴性,因此MCT1表現亦與癌症有關。因此,本發明抗體及其抗原結合片段適於癌症治療。β細胞中MCT1之過表現亦係運動誘發之高胰島素症(EIHI)之潛在原因,從而使得本發明之抗體亦可應用於EIHI之治療。
值得注意的是,雖然MCT蛋白之小分子抑制劑與臨床前模型中視網膜、心臟及睪丸之毒性相關,但MCT1缺陷之人類在該等器官中之任一者中無毒性(參考文獻49及實例),此支持本發明之MCT1特異性抗體之強安全性概況。另外,已顯示MCT1缺陷個體係健康的,且該等結論由實例中之數據支持,此顯示MCT1不參與人類RBC乳酸鹽轉運。
人類MCT1具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO:1),以標識符P53985-1保存於UniProt資料庫中:
SEQ ID NO: 1
與MCT1之結合及對MCT1功能之抑制
SEQ ID NO: 1
與MCT1之結合及對MCT1功能之抑制
本發明之抗MCT1抗體可對MCT1具有任何適宜親和力及/或親合力。親和力係指抗MCT1抗體或其他抗原結合蛋白與抗原決定基或抗原決定子之結合強度。通常,親和力係根據定義為[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]之解離常數Kd
來量測,其中[Ab-Ag]係抗體-抗原複合物之莫耳濃度,[Ab]係未結合抗體之莫耳濃度且[Ag]係未結合抗原之莫耳濃度。親和力常數Ka
定義為1/Kd
。藉由競爭性抑制、平衡透析及諸如此類測定結合肽特異性及親和力之適宜方法可參見(例如) Harlow等人,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988);Colligan等人編輯,Current Protocols in Immunology
, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993),及Muller,Meth. Enzymol.
92:589-601 (1983)。
親和力可藉由本文中別處闡述之任一方法或其在此項技術中已知之等效形式來測定。可用於測定親和力之一種方法之實例提供於Scatchard analysis of Munson & Pollard,Anal. Biochem
. 107:220 (1980)中。結合親和力亦可藉由KINEXA、平衡方法(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學分析(例如BIAcore™分析)來測定。
在本發明之另一實施例中,抗MCT1抗體及抗原結合片段(例如,人類、人類化或嵌合抗MCT1抗體或抗體片段)可以例如如藉由ELISA、生物層干涉術(「BLI」)、KINEXA或表面電漿子共振在25℃或37℃下所測定小於或等於5×10-5
M、10-5
M、5×10-6
M、10-6
M、5×10-7
M、10-7
M、5×10-8
M、10-8
M、5×10-9
M、10-9
M、5×10-10
、10-10
、5×10-11
、10-11
M、5×10-12
、10-12
M、5×10-13
M或10-13
M之結合親和力(KD
)結合至MCT1。通常,本發明所提供之抗MCT1抗體對MCT1之親和力係在約10-4
至約10-12
M (例如,約10-7
至約10-10
M)範圍內。本文之術語免疫反應通常係指抗MCT1抗體以低於約10-4
M之親和力結合至MCT1。舉例而言,在特定態樣中,本發明提供對MCT1之結合親和力(KD
)如藉由(例如) KINEXA所測定為約7×10-9
M或更小之抗MCT1抗體。
另外,本發明之抗MCT1抗體及抗原結合片段(例如,人類、人類化或嵌合抗MCT1抗體或抗體片段)可包括以小於或等於 5×10-4
s-1
、10-4
s-1
、5×10-5
s-1
或10-5
s-1
之解離速率(k解離
)結合至MCT1之抗MCT1抗體或抗體片段。
親合力係指結合蛋白與抗原之間的總相互作用之總體強度(例如,抗MCT1抗體與MCT1之間的相互作用之總強度。親和力係抗體或其他結合肽上之單一抗原結合位點與單一抗原決定基或抗原決定子之間的總非共價相互作用之強度。親合力通常受三個主要因素支配:結合蛋白對其所結合之一或多個抗原決定基或一或多個抗原決定子之固有親和力;抗體或結合蛋白及抗原之價(例如,具有三價、四價或更多價之抗MCT1抗體通常將展現高於二價抗體之對抗原之親合力水準且二價抗體對抗原之親合力將高於單價抗體,尤其在抗原中存在重複之抗原決定基之情形下);及/或相互作用組分之幾何佈置。通常藉由與用於評價親和力相同類型之技術來量測親合力。
抗MCT1抗體可基於其結合至MCT1且藉此抑制MCT1之一或多種功能之能力來表徵。此等抗MCT1抗體可以天然形式直接用作治療劑。抑制性抗MCT1抗體可部分或完全地抑制MCT1之各種功能,諸如單羧酸鹽、離子及各種其他分子(例如毒素)之轉運。在特定實施例中,本發明之抗體抑制MCT1介導之乳酸鹽轉運。可藉由任一適宜方法來量測抑制。在一態樣中,抑制反映在抑制性抗MCT1抗體使MCT1介導之乳酸鹽轉運減少至少約20%,例如至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約75%或更多(例如,約25%至100%)。當考慮抗MCT1抗體與對照相比對乳酸鹽轉運之效應(例如與來自不表現MCT1之細胞或未經該抗體阻斷之細胞的乳酸鹽轉運分析結果相比)時,可測定此態樣中之百分比減少。
抗MCT1抗體之產生
抗MCT1抗體之產生
根據本發明之抗MCT1單株抗體(mAb)及抗原結合片段潛在地可藉由不同方法來產生,該等方法諸如單株抗體方法,例如Kohler及Milstein (1975)Nature
256:495之標準體細胞雜交技術。亦可採用潛在地用於產生單株抗體之其他技術,例如B淋巴球之病毒或致癌性轉型。
用於製備雜交瘤之較佳動物系統係鼠類系統。小鼠中之雜交瘤產生係已充分確立之程序。分離融合用免疫脾細胞之免疫方案及技術為此項技術中已知。亦已知融合伴侶(例如,鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。本發明之嵌合或人類化抗體可基於如上文所述製備之鼠類單株抗體之序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可自所關注之鼠類雜交瘤獲得,且使用標準分子生物學技術進行改造以含有非鼠類(例如,人類)免疫球蛋白序列。舉例而言,為產生嵌合抗體,可使用此項技術中已知之方法將鼠類可變區連接至人類恆定區(參見例如頒予Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體,可使用此項技術中已知之方法將鼠類CDR區插入至人類框架中(參見例如頒予Winter之美國專利第5,225,539號及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號;第5,585,089號;第5,693,762號及第6,180,370號)。
根據本發明之至少一些實施例,抗體係人類單株抗體。可使用攜載人類免疫系統而非小鼠系統之部分之基因轉殖或轉染色體小鼠(例如HuMAb小鼠™、KM小鼠™)來產生針對MCT1之此等人類單株抗體(參見例如Lonberg等人,(1994)Nature
368(6474): 856-859)。因此,小鼠展現降低之小鼠IgM或K表現,且因應於免疫,所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgG K單株(Lonberg, N.等人,(1994),上文文獻;綜述於Lonberg, N. (1994) Handbook ofExperimental Pharmacology
113:49-101;Lonberg, N.及Huszar, D. (1995)Intern. Rev. Immunol.
13: 65-93,及Harding, F.及Lonberg, N. (1995)Ann. N. Y. Acad. Sci.
764:536-546)中。在另一實施例中,根據本發明之至少一些實施例之人類抗體可使用在轉殖基因及轉染色體上攜載人類免疫球蛋白序列之小鼠(諸如攜載人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)產生。此等小鼠(在本文中稱為「KM小鼠™」)詳細闡述於頒予Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
此外,此項技術中可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性基因轉殖動物系統,且可使用其來產生根據本發明之至少一些實施例之抗MCT1抗體。舉例而言,可使用稱為Xenomouse (Abgenix, Inc.)之替代性基因轉殖系統;此等小鼠闡述於(例如)頒予Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號;第6,075,181號;第6,114,598號;第6, 150,584號及第6,162,963號中。
此外,此項技術中可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統,且可使用其來產生根據本發明之至少一些實施例之抗MCT1抗體。舉例而言,可使用攜載人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體二者之小鼠(稱為「TC小鼠」);此等小鼠闡述於Tomizuka等人,(2000)Proc. Natl. Acad Sci.
USA 97:722-727 '中。此外,此項技術中已闡述攜載人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛(Kuroiwa等人,(2002)Nature Biotechnology
20:889-894),且可使用其來產生根據本發明之至少一些實施例之抗MCT1抗體。
根據本發明之至少一些實施例之人類單株抗體亦可使用用於篩選人類免疫球蛋白基因文庫之噬菌體展示方法來製備。用於分離人類抗體之此等噬菌體展示方法在此項技術中已確立。參見例如:頒予Ladner等人之美國專利第5,223,409號;第5,403,484號;及第5,571,698號;頒予Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號;頒予McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號;及頒予Griffiths等人之美國專利第5,885,793號;第6,521,404號;第6,544,731號;第6,555,313號;第6,582,915號及第6,593,081號。
根據本發明之至少一些實施例之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備,其中人類免疫細胞已經重構,從而使得可在免疫時產生人類抗體反應。此等小鼠闡述於(例如)頒予Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
在一些實施例中,使用人類Ig小鼠來產生根據本發明之人類抗MCT1抗體,例如藉由利用MCT1抗原及/或重組MCT1或MCT1融合蛋白之經純化或經富集製劑對此等小鼠實施免疫,如Lonberg, N.等人(1994)Nature
368(6474): 856-859;Fishwild, D.等人(1996)Nature Biotechnology
14: 845-851;及PCT公開案WO 98/24884及WO 01/14424所闡述。較佳地,小鼠在第一次輸注時為6至16週齡。舉例而言,可使用MCT1抗原之經純化或重組製劑(劑量範圍為5 μg-500 μg)以腹膜內方式對人類Ig小鼠實施免疫。
一般而言,基因轉殖小鼠在以腹膜內(IP)方式利用於完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)中之抗原初始免疫時有反應,之後每隔一週利用於不完全弗氏佐劑中之抗原實施IP免疫(直至總計6次)。然而,發現除弗氏佐劑以外之佐劑亦有效。另外,發現全細胞在不存在佐劑下具有高度免疫原性。可在免疫方案之進程內監測免疫反應,其中藉由眶後採血獲得血漿樣品。可藉由ELISA篩選血漿,且可使用具有充足抗MCT1人類免疫球蛋白效價之小鼠進行融合。可在處死及去除脾之前3天以靜脈內方式用抗原對小鼠加強免疫。預計對於每次免疫可能需要實施2至3次融合。對於每一抗原通常對介於6至24隻之間的小鼠實施免疫。
在某些實施例中,可使用來自免疫小鼠之經分離且融合至適當永生化細胞株(諸如小鼠骨髓瘤細胞株)之脾細胞及/或淋巴結細胞來生成產生根據本發明之人類單株抗MCT1抗體之雜交瘤。所得雜交瘤可經篩選用於產生抗原特異性抗體。
在某些實施例中,根據本發明之抗MCT1抗體可在宿主細胞轉染瘤中使用(例如)如此項技術中所眾所周知之重組DNA技術及基因轉染方法之組合來產生(例如,Morrison, S. (1985)Science
229: 1202)。舉例而言,為表現抗體或其抗體片段,可藉由標準分子生物學技術(例如,使用表現相關抗體之雜交瘤之PCR擴增或cDNA選殖)獲得編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA,且可將DNA插入至表現載體中,從而使得該等基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此背景下,術語「可操作地連接」意欲意指將抗體基因連接至載體中,從而使得該載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因轉錄及轉譯之期望功能。表現載體及表現控制序列經選擇與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入至單獨載體中,或更通常將兩種基因插入至同一表現載體中。藉由標準方法將抗體基因插入至表現載體中(例如,將抗體基因片段上之互補限制位點與載體連接,或若不存在限制位點,則利用鈍端連接)。可使用本文所述抗體之輕鏈及重鏈可變區藉由將其插入至已編碼期望同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中來產生任何抗體同型之全長抗體基因,從而使得VH
區段可操作地連接至載體內之CH區段,且VL
區段可操作地連接至載體內之CL區段。另外或或者,重組表現載體可編碼促進自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中,從而使得信號肽框內連接至抗體鏈基因之胺基末端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即,來自非免疫球蛋白之信號肽)。
在一些情況下,拮抗性抗MCT1抗體可藉由利用在其表面上表現完整MCT1蛋白、MCT1片段、MCT1融合蛋白或MCT1多聚體之類病毒顆粒(VLPS
)及視情況另一佐劑對動物(例如,非人類哺乳動物、非人類靈長類動物、鳥類或兩棲動物;例如,食蟹猴、囓齒類動物、兔、天竺鼠、牛、馬、犬、貓、雞、青蛙)實施免疫來獲得。此項技術中已知使用表現抗原作為免疫原之VLP以產生對在VLP表面上所表現抗原之細胞性或體液性(抗體)免疫反應。(參見例如美國專利第10,138,277號;第10,130,696號;第10,125,175號;第10,086,056號;第10,080,796號;第10,072,058號;第10,046,026號;第10,040,830號;第9,969,986號;第9,957,300號;第9,833,504號;第9,803,189號;第9,637,532號;第9,566,327號;第9,617,321號;第9,585,954號;第9,518,096號;第9,517,261號;第9,381,239號;第9,481,875號;第9213027號;第9,296,792號;第9,216,229號;第8,980,275號;第8,889,144號;第8,852,604號;第8728985號;第8,691,209號;第8,680,244號;第8,574,590號;第8,529,906號;第8,324,149號;第8,377,691號;第8,158,130號;第7,959,928號;第7,875,450號;第7,641,896號;第7,494,656號;第7,479,280號;第7,320,793號;第7,264,810號;第7229624號;第7,138,252號;第6,991,795號;第6,964,769號;第6,534,064號及第5,667,782號等,該等專利係以全文引用的方式併入本文中)。
抗MCT1抗體之表現
抗MCT1抗體之表現
適宜宿主細胞通常包括任何細胞,其中可使用易於獲得之技術及材料重組產生本發明抗MCT1抗體及其抗原結合片段。舉例而言,本發明之抗MCT1抗體及其抗原結合片段可根據習用技術在遺傳改造宿主細胞中產生。適宜宿主細胞係可經外源性DNA轉型或轉染且於培養物中生長之彼等細胞類型,且包括細菌、真菌細胞(例如,酵母)及培養之高等真核細胞(包括多細胞性生物體之培養細胞)、具體而言培養之哺乳動物細胞,例如人類或非人類哺乳動物細胞。在例示性實施例中,該等抗體可表現於CHO細胞或HEK-293細胞中。操縱選殖DNA分子且將外源性DNA引入至多種宿主細胞中之技術由下列揭示:Sambrook等人,Molecular Cloning
:A Laboratory Manual
,第2版,Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989),及Current Protocols in Molecular Biology
,Ausubel等人編輯,New York, NY: Green and Wiley and Sons (1993)。
在一些例示性實施例中,抗體可表現於接合(mating)感受態酵母中,例如可在培養物中生長之任何單倍體、二倍體或四倍體酵母。可用於醱酵表現方法中之酵母可以單倍體、二倍體或其他多倍體形式存在。給定倍性細胞可在適當條件下以該形式增殖無限數代。二倍體細胞亦可形成孢子以形成單倍體細胞。依序接合可經由進一步接合或融合二倍體菌株產生四倍體菌株。本發明涵蓋藉由(例如)接合或球形質體融合所產生之單倍體酵母以及二倍體或其他多倍體酵母細胞之用途。舉例而言,此酵母可包括酵母菌科(Saccharomycetaceae family)之成員,其包括以下各屬:阿克斯酵母屬(Arxiozyma);阿克博酵母屬(Ascobotryozyma);固囊酵母屬(Citeromyces);徳巴利氏酵母屬(Debaryomyces);德克酵母屬(Dekkera);假囊酵母屬(Eremothecium);伊薩酵母屬(Issatchenkia);卡紮酵母屬(Kazachstania);克魯維酵母屬(Kluyveromyces);柯達酵母屬(Kodamaea);婁德酵母屬(Lodderomyces);管囊酵母屬(Pachysolen);畢赤酵母屬(Pichia);酵母菌屬(Saccharomyces);薩特酵母屬(Saturnispora);泰特拉匹酵母屬(Tetrapisispora);有孢圓酵母屬(Torulaspora);擬威爾酵母屬(Williopsis);及接合酵母菌屬(Zygosaccharomyces)。潛在可用於本發明中之其他類型之酵母包括耶羅威亞酵母屬(Yarrowia);紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium);假絲酵母屬(Candida);漢遜酵母屬(Hansenula);線黑粉酵母屬(Filobasium);鎖擲酵母屬(Sporidiobolus);布勒擲孢酵母屬(Bullera);白冬孢酵母屬(Leucosporidium)及擬線黑粉酵母屬(Filobasidella)。
將相關多肽編碼序列可操作地連接至轉錄及轉譯調控序列,該等調控序列提供多肽在期望宿主細胞(例如,酵母或哺乳動物細胞)中之表現。該等載體組件可包括(但不限於)以下中之一或多者:增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。亦可包括用於分泌多肽之序列,例如信號序列及諸如此類。視情況存在複製起點(例如,酵母複製起點),此乃因表現載體通常整合至宿主細胞基因體中。在本發明之一個實施例中,將相關多肽可操作地連接或融合至提供該多肽自酵母二倍體細胞之最佳化分泌之序列。
啟動子係位於結構基因之起始密碼子上游(5') (通常在約100 bp至1000 bp內)之未轉錄序列,其控制其所可操作地連接之特定核酸序列之轉錄及轉譯。此等啟動子分為若干類:誘導型、組成型及抑制型啟動子(因應於不存在阻遏劑而增加轉錄水準)。誘導型啟動子可在其控制下因應於培養條件之一些變化(例如,營養物之存在或不存在或溫度變化)引發自DNA之轉錄水準增加。啟動子片段亦可用作將表現載體同源重組且整合至宿主細胞之相同位點(例如,酵母或哺乳動物細胞基因體)中之位點;或者,可使用可選標記物作為同源重組位點。
相關抗MCT1抗體多肽不僅可以重組方式直接產生,且亦可作為與異源多肽之融合多肽以重組方式來產生,該異源多肽例如為信號序列或在成熟蛋白質或多肽之N末端具有特異性裂解位點之其他多肽。一般而言,信號序列可為載體之組件,或其可為插入至載體中之多肽編碼序列之一部分。例如,所選擇之異源信號序列係經由宿主細胞(例如,哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞)內可用之標準路徑中之一者識別且處理之序列。另外,該等信號肽序列可經改造以在表現系統中提供增強之分泌。相關分泌信號亦包括哺乳動物及酵母信號序列,其對於所分泌之蛋白質可係異源的,或對於所分泌之蛋白質可係天然序列。信號序列包括前肽(pre-peptide)序列,且在一些情況下可包括原肽(propeptide)序列。許多此等信號序列為此項技術中所已知,包括在免疫球蛋白鏈上所發現之信號序列,例如K28前原毒素序列、PHA-E、FACE、人類MCP-1、人類血清白蛋白信號序列、人類Ig重鏈、人類Ig輕鏈及諸如此類。舉例而言,參見Hashimoto等人,Protein Eng.
, 11 (2):75 (1998);及Kobayashi等人,Therapeutic Apheresis
, 2(4):257 (1998)。
可藉由將轉錄活化子序列插入至載體中來增加轉錄。該等活化子係作用於啟動子以增加其轉錄之DNA的順式作用元件,通常為約10 bp至300 bp。轉錄增強子具有定向及位置相對獨立性,已發現其在轉錄單元之5'及3'處、位於內含子內以及編碼序列本身內。增強子可在編碼序列之5'或3'位置處剪接至表現載體中,但(例如)位於啟動子之5'位點處。
用於真核宿主細胞中之表現載體亦可含有終止轉錄及穩定mRNA所需之序列。在真核生物或病毒DNA或cDNA之未轉譯區中,此等序列通常可自轉譯終止密碼子之3'獲得。該等區含有在mRNA之未轉譯部分中轉錄為聚腺苷酸化片段之核苷酸區段。
含有上文所列示組件中之一或多者之適宜載體之構築採用標準連接技術或PCR/重組方法。以期望產生所需質體之形式或經由重組方法裂解、調節且重新連接經分離之質體或DNA片段。對於為確認所構築質體中之正確序列之分析,使用連接混合物來轉型宿主細胞,且在適當時藉由抗生素抗性(例如胺苄青黴素或吉歐黴素(Zeocin))選擇成功之轉型體。製備來自轉型體之質體,藉由限制性內核酸酶消化進行分析,及/或測序。
作為片段限制及連接之替代方案,可使用基於特異性連接(「att」)位點及重組酶之重組方法將DNA序列插入至載體中。此等方法闡述於(例如) Landy,Ann. Rev. Biochem.
, 58: 913-949 (1989)中;且為熟習此項技術者所已知。此等方法利用分子間DNA重組,該分子間DNA重組係由λ及大腸桿菌編碼之重組蛋白質之混合物介導。重組在相互作用DNA分子上之att位點之間發生。關於att位點之闡述,參見Weisberg及Landy,Site-Specific Recombination in Phage Lambda,Lambda II
,第211-250頁,Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1983)。將重組位點兩側之DNA區段交換,使得在重組之後,att位點係包含由每一親代載體所提供序列之雜交序列。重組可在任一拓撲學之DNA之間發生。
可藉由以下將att位點引入至所關注之序列中:將所關注之序列連接至適當載體中;經由使用特異性引子產生含有att B位點之PCR產物;產生選殖至含有att位點之適當載體中之cDNA文庫;及諸如此類。
如本文所用,摺疊係指多肽及蛋白質之三維結構,其中胺基酸殘基之間的相互作用用以穩定結構。雖然非共價相互作用在確定結構中係重要的,但通常所關注之蛋白質將具有由兩個半胱胺酸殘基形成之分子內及/或分子間共價二硫鍵。對於天然蛋白質及多肽或其衍生物及變異體而言,適當摺疊通常係產生最佳生物活性之佈置,且可藉由針對活性(例如配位體結合、酶活性等)之分析便捷地監測。
在一些情況下,例如在期望產物具有合成起源之情形下,基於生物活性之分析將不太具有意義。此等分子之適當摺疊可基於物理性質、能量考慮因素、建模研究及諸如此類來確定。
表現宿主可藉由引入編碼一種或多種增強摺疊及二硫鍵形成之酶(亦即摺疊酶、伴護素、蛋白質二硫化物異構酶等)之序列進一步經修飾。此等序列可使用如此項技術中已知之載體、標記物等以組成型或誘導型方式表現於酵母宿主細胞中。較佳地,經由靶向方法將序列(包括足以表現期望部分之轉錄調控元件)穩定地整合在宿主細胞基因體中。
舉例而言,真核蛋白質二硫化物異構酶(「PDI」)不僅係蛋白質半胱胺酸氧化及二硫鍵異構化之有效觸媒,且亦展現伴護蛋白活性。PDI之共表現可促進具有多個二硫鍵之活性蛋白質之產生。亦關注免疫球蛋白重鏈結合蛋白(「BIP」);親環素;及諸如此類之表現。在本發明之一個實施例中,每一單倍體親代菌株表現獨特摺疊酶,例如一種菌株可表現BIP,且另一菌株可表現PDI或其組合。
經培養之哺乳動物細胞亦係用於產生所揭示抗MCT1抗體及其抗原結合片段之較佳例示性宿主。如所提及,CHO細胞尤其適於表現抗體。此項技術中已知許多用於在哺乳動物細胞中製造單株抗體之程序。(參見Galfre, G.及Milstein, C,Methods Enzym.
, 73:3-46, 1981;Basalp等人,Turk.J. Biol
, 24: 189-196, 2000;Wurm, F.M.,Nat. Biotechnol
, 22: 1393-1398, 2004;及Li等人,mAbs
, 2(5):466-477, 2010)。如下文所進一步詳細提及,哺乳動物單株抗體製造方案中所採用之常見宿主細胞株包括(但不限於)人類胚胎視網膜母細胞株PER.C6®
(Crucell N.V., Leiden, The Netherlands)、NSO鼠類骨髓瘤細胞(Medical Research Council, London, UK)、CV1猴腎細胞株、293人類胚腎細胞株、BHK幼小倉鼠腎細胞株、VERO非洲綠猴腎細胞株、人類子宮頸癌細胞株HELA、MDCK犬腎細胞、BRL水牛鼠肝細胞、W138人類肺細胞、HepG2人類肝細胞、MMT小鼠乳房腫瘤細胞、TRI細胞、MRC5細胞、Fs4細胞、骨髓瘤或淋巴瘤細胞或中國倉鼠(灰倉鼠(Cricetulus griseus))卵巢(CHO)細胞及諸如此類。此項技術中已知之CHO細胞之許多不同亞純系或亞細胞株可用於產生重組單株抗體且針對產生重組單株抗體進行最佳化,諸如DP12 (CHO Kl dhfr-)細胞株。NSO細胞係不分泌Ig、不合成輕鏈之NS-1細胞之亞純系,其對氮雜鳥嘌呤具有抗性。其他中國倉鼠及CHO細胞可商業購得(來自ATCC等),包括CHO-DXB11 (CHO-DUKX)、CHO-pro3、CHO-DG44、CHO 1-15、CHO DP-12、Lec2、M1WT3、Lec8、pgsA-745及諸如此類,所有該等細胞均經遺傳改變以針對各種參數對細胞株進行最佳化。單株抗體通常使用分批進料方法來製造,其中單株抗體鏈在哺乳動物細胞株中表現且在生物反應器中分泌至組織培養基中。向生物反應器連續供應培養基(或進料)以使重組蛋白質表現最大化。然後自所收集之培養基純化重組單株抗體。在一些情況下,需要額外步驟以經由還原二硫鍵等來重新組裝抗體。此等產生方法可在單批次或更多批次中擴大至10,000 L。經由使用此等細胞株及方法,現已常規獲得多達20 pg/細胞/天,從而提供高達10 g/L或更多之效價,在10 kL至25 kL之生物反應器中總計達到15 kg至100 kg。(Li等人,2010)。下文提供此產生方法之各種細節,包括將編碼抗體之多核苷酸選殖至表現載體中、利用該等表現載體轉染細胞、選擇經轉染細胞且自該等細胞表現並純化重組單株抗體。
為在哺乳動物細胞中重組產生抗MCT1抗體或抗原結合片段,通常將編碼該抗體或其片段之核酸插入至可複製載體中以用於進一步選殖(DNA之擴增)或用於表現。編碼該抗體之DNA可使用習用程序容易地分離或合成(例如,藉由使用能夠特異性結合至編碼該抗體之重鏈及輕鏈的DNA之寡核苷酸探針)。載體組件通常包括(但不限於)以下中之一或多者:信號序列、複製起點、一或多種標記物基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。啟動子、終止子、可選標記物、載體及其他元件之選擇係此項技術中一般技術水準內之常規設計問題。許多此等元件為此項技術中所已知且可經由供應商獲得。
本發明之抗體不僅可以重組方式直接產生,且亦可作為與異源多肽之融合多肽以重組方式來產生,該異源多肽例如為信號序列或在成熟蛋白質或多肽之N末端具有特異性裂解位點之其他多肽。例如,所選擇之同源或異源信號序列係由宿主細胞識別且處理(亦即,由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中,可獲得哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列(例如單純疱疹gD信號)。
此等表現載體及選殖載體通常將含有使載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製之核酸序列。通常,在選殖載體中,此序列係使載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製者,且其包括複製起點或自主複製序列。此等序列對於多種細菌、酵母及病毒係眾所周知的,例如來自質體pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏(Gram)陰性細菌,2μ質體起點適用於酵母,且各種病毒起點(猿猴病毒40 (「SV40」)、多瘤、腺病毒、水皰性口炎病毒(「VSV」)或牛乳頭瘤病毒(「BPV」)可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。通常,哺乳動物表現載體不需要複製起點組件(通常可使用SV40起點,僅係由於其含有早期啟動子)。
該等載體通常亦將含有選擇基因,亦稱為可選標記物。典型選擇基因編碼具有以下性質之蛋白質:(a) 賦予對抗生素或其他毒素(例如,胺苄青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)、胺甲蝶呤或四環素)之抗性,(b) 補足營養缺陷型不足,或(c) 供給無法自複合培養基中獲得之關鍵營養物,例如編碼桿菌(Bacilli)之D-丙胺酸消旋酶之基因。
選擇方案之一個實例利用藥物使宿主細胞之生長停滯。通常使用藥物選擇來選擇外源DNA已插入其中之經培養哺乳動物細胞。此等細胞通常稱為「轉染子」。在選擇劑存在下培養且能夠將所關注之基因傳遞至其子代之細胞稱為「穩定轉染子」。此優勢選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)及潮黴素(hygromycin)。例示性可選標記物係編碼對抗生素新黴素之抗性之基因。選擇係在新黴素型藥物(諸如G-418或諸如此類)之存在下實施。經異源基因成功轉型之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白質,且因此可在選擇方案中存活。
亦可使用選擇系統來增加所關注之基因之表現水準,此過程稱為「擴增」。轉染子之擴增通常藉由在低水準之選擇劑存在下培養細胞,且接著增加選擇劑之量以選擇產生高水準之導入基因產物之細胞來進行。哺乳動物細胞之例示性適宜可選標記物係使得能鑑別能夠吸收抗體核酸之細胞之彼等標記物,諸如二氫葉酸還原酶(「DHFR」)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II (例如,靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。
舉例而言,哺乳動物細胞之可擴增可選標記物係二氫葉酸還原酶,其賦予對胺甲喋呤之抗性。亦可使用其他抗藥性基因(例如潮黴素抗性、多重抗藥性、嘌呤黴素乙醯基轉移酶)。首先藉由在含有胺甲喋呤(「MTX」,亦即DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉型體來鑑別經DHFR選擇基因轉型之細胞。當採用野生型DHFR時,適當宿主細胞係DHFR活性缺陷之中國倉鼠卵巢(「CHO」)細胞株。
或者,經編碼抗體、野生型DHFR蛋白及另一可選擇標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(「APH」))之DNA序列轉型或共轉型之宿主細胞(具體而言含有內源性DHFR之野生型宿主)可藉由在含有針對該可選標記物之選擇劑(諸如胺基糖苷抗生素,例如康黴素(kanamycin)、新黴素或G-418)之培養基中使細胞生長來進行選擇。參見美國專利第4,965,199號。
該等載體可包含促進編碼抗體之DNA轉錄之增強子序列。已知許多增強子序列來自哺乳動物基因(例如,珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素)。經常使用之增強子係源自真核細胞病毒者。其實例包括位於複製起點遲側(late side)上之SV40增強子(100 bp-270 bp)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點遲側上之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子(關於活化真核啟動子之增強元件,亦參見Yaniv,Nature
, 297: 17-18, 1982)。可將增強子剪接至載體中抗體編碼序列之5'或3'位置處,但例如位於啟動子之5'位點處。
表現及選殖載體通常亦將包含由宿主生物體識別且可操作地連接至抗體核酸之啟動子。對於真核生物而言,啟動子序列係已知的。事實上,所有真核基因均具有AT富集區,其位於轉錄起始位點上游大約25至30個鹼基處。在許多基因之轉錄起始點上游70至80個鹼基處發現之另一序列係CNCAAT區,其中N可為任一核苷酸。在大多數真核基因之3'端處為AATAAA序列,其可係向編碼序列之3'端添加poly A尾之信號。所有該等序列均以適宜方式插入至真核表現載體中。
在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄抗體受(例如)自以下獲得之啟動子控制:病毒基因體,該等病毒諸如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、BPV、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及大多數例如SV40;異源哺乳動物啟動子,例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子;熱休克啟動子;條件係此等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子係便捷地以SV40限制性片段形式獲得,其亦含有SV40病毒複製起點。人類巨細胞病毒之立即早期啟動子係便捷地以HindIII E限制性片段形式獲得。使用BPV作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改形式闡述於美國專利第4,601,978號中。關於在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表現人類β-干擾素cDNA,亦參見Reyes等人,Nature
, 297:598-601 (1982)。或者,可使用勞斯肉瘤(rous sarcoma)病毒長末端重複序列作為啟動子。
可使用強轉錄啟動子,諸如來自SV40、巨細胞病毒或骨髓增生性肉瘤病毒之啟動子。參見例如美國專利第4,956,288號及美國專利公開案第20030103986號。其他適宜啟動子包括來自金屬硫蛋白基因之彼等啟動子(美國專利第4,579,821號及第4,601,978號)及腺病毒主要晚期啟動子。用於哺乳動物細胞中之表現載體包括pZP-1、pZP-9及pZMP21,其分別以登錄號98669、98668及PTA-5266保存於美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection), 10801 University Blvd., Manassas, VA. USA中;及該等載體之衍生物。
用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞性生物體之有核細胞)中之表現載體通常亦將含有終止轉錄及穩定mRNA所需之序列。此等序列通常可自真核生物或病毒DNA或cDNA之5'及(偶爾)3'未轉譯區獲得。該等區含有在編碼抗體之mRNA之未轉譯部分中轉錄為聚腺苷酸化片段之核苷酸區段。一種可用轉錄終止組件係牛生長激素多聚腺苷酸化區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
用於選殖或表現本發明抗體之適宜宿主細胞包括上文所述之原核生物、酵母或高等真核生物細胞。然而,最令人關注者係脊椎動物細胞,且在培養中增殖脊椎動物細胞已成為常規程序。可用哺乳動物宿主細胞株之實例係經SV40轉型之猴腎CV1株(COS-1 (ATCC編號CRL 1650);及COS-7,ATCC CRL 1651);人類胚腎株(經亞選殖用於在懸浮培養中生長之293或293細胞(ATCC編號CRL 1573;Graham等人,J. Gen. Virol
, 36:59-72 (1977));幼小倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10,ATCC編號CRL 1632;BHK 570,ATCC編號CRL 10314);CHO細胞(CHO-K1,ATCC編號CCL 61;CHO-DG44,Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 77:4216-4220 (1980));小鼠賽特利細胞(Sertoli cell)(TM4,Mather,Biol. Reprod.
, 23:243-251 (1980));猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2);犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75);人類肝細胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳房腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等人,Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC 5細胞;FS4細胞;及人類肝細胞瘤株(Hep G2)。其他適宜細胞株為此項技術中所已知且可自公共保藏所(諸如美國模式培養物保藏所,Manassas, VA)獲得。
如上文文獻中所論述,用上述用於抗體產生之表現或選殖載體來轉型宿主細胞,且在習用營養培養基中培養,若適宜則修改該等營養培養基以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼期望序列之基因。
用於產生本發明抗體之哺乳動物宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham's F10 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、最小必需培養基(「MEM」(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO))、羅斯威爾帕克紀念學會(Roswell Park Memorial Institute)-1640培養基(「RPMI-1640」,Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)及杜貝克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(「DMEM」,Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)等市售培養基適於培養宿主細胞。另外,可使用以下文獻中所闡述之任一培養基作為宿主細胞之培養基:Ham等人,Meth. Era.
, 58:44 (1979);Barnes等人,Anal. Biochem.
, 102:255 (1980);美國專利第4,767,704號;第4,657,866號;第4,927,762號;第4,560,655號;或第5,122,469號;WO 90/03430;WO 87/00195;或美國專利複審第30,985號。可根據需要向該等培養基中之任一者補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如健他黴素(Gentamycin)藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度納入任何其他所需補充物。諸如溫度、pH及諸如此類等培養條件係先前用於所選表現用宿主細胞之彼等條件,且應為熟習此項技術者所明瞭。開發且最佳化培養基及培養條件之方法為此項技術中所已知。(參見,Gronemeyer等人,Bioengineering
, 1(4): 188-212, 2014)。
在將培養條件最佳化且選擇較佳細胞株純系之後,培養該等細胞(黏附細胞或懸浮培養物),最典型的係在生物反應器中之分批進料製程(許多模型可商業購得),其涉及利用針對出於此目的挑選且選擇之特定細胞株進行最佳化之培養基及進料對細胞培養物進行連續進料。(參見,Butler, M.,Appl. Microbiol. Biotechnol
, 68:283-291, 2005;及Kelley, B.,mAb
, l(5):443-452, 2009)。灌注系統亦係可用的,其中將培養基及進料連續供應至培養物中,同時自生物反應器取出相同體積之培養基。(Wurm,2004)。合成培養基(亦可商業購得)可用於在分批進料培養中使細胞生長,從而避免來自外來污染源之可能性,諸如在使用動物組分(諸如牛血清白蛋白等)之情形下。然而,無動物組分之水解物可商業購得以有助於提高細胞密度、培養存活率及生產力。(Li等人,2010)。為使細胞培養基最佳化,已進行許多研究,包括小心留意滾瓶中之頂隙、生長及表現階段之氧化還原電位、還原劑之存在以維持產生期間之二硫鍵等。(參見例如Hutterer等人,mAbs
, 5(4):608-613, 2013;及Mullan等人,BMC Proceed
. , 5(增刊8):第110頁, 2011)。已開發各種方法以解決在重組單株抗體產生期間有害氧化之可能性。(參見例如美國專利第8,574,869號)。可藉由連續進給營養物或作為單獨投與之量使培養細胞生長。通常在細胞生長期間藉由直接連接至校準分析儀以在線方式或藉由操作員介入以離線方式來監測各種製程參數,諸如細胞濃度、pH、溫度、CO2
、dO2、滲透重量莫耳濃度、代謝物(諸如葡萄糖、乳酸鹽、麩醯胺酸及麩胺酸鹽)之量及諸如此類。培養步驟通常亦涉及藉由此項技術中已知之用於細胞選擇之任何方式確保培養物中生長之細胞維持經轉染之重組基因。
醱酵後,亦即在達到最大細胞生長及重組蛋白質表現後,通常在培養步驟之後進行收穫步驟,藉此將細胞與培養基分離,且藉此獲得收穫之細胞培養基。(參見,Liu等人,mAbs
, 2(5):480-499, 2010)。通常,在培養之後進行各種純化步驟(涉及管柱層析及諸如此類)以將重組單株抗體自細胞組分及細胞培養基組分分離。重組單株抗體產生之此階段所需之確切純化步驟取決於蛋白質之表現位點,亦即在細胞自身之胞質液中或蛋白質分泌至細胞培養基中之通常更佳途徑。可使用此項技術中已知之技術來分離各種細胞組分,諸如差速離心技術、基於重力之細胞沈降及/或粒徑篩析層析/過濾技術(其可包括切向流微過濾或深層過濾)。(參見,Pollock等人,Biotechnol. Bioeng.
, 110:206-219, 2013及Liu等人,2010)。藉由使用連續疊盤式離心機、之後使用深層過濾器及膜過濾器進行澄清,可大規模地達成細胞組分之離心。(參見,Kelley,2009)。大多數情況下,在澄清後,由於蛋白質A對抗體Fc結構域之高親和力,故藉由蛋白質A層析對重組蛋白質進行進一步純化,且通常使用低pH/酸化溶析步驟(通常將酸化步驟與預防性病毒去活化步驟組合)來進行。亦可採用使用酸性或陽離子聚電解質之絮凝及/或沈澱步驟以將於懸浮培養物中之動物細胞與可溶性蛋白質分離。(Liu等人,mAbs
, 2(5):480-499, 2010)。最後,通常使用陰離子及陽離子交換層析、疏水相互作用層析(「HIC」)、疏水電荷感應層析(HCIC)、使用陶瓷羥磷灰石(Ca5
(PO4
)3
OH)2
之羥磷灰石層析及該等技術之組合以使重組單株抗體溶液改良。藉由使用超速離心技術可達成期望單株抗體之最終調配物及濃度。純化產率通常為70%至80%。(Kelley,2009)。
抗個體遺傳型抗體
抗個體遺傳型抗體
本發明之另一態樣係關於抗個體遺傳型抗體及抗-抗個體遺傳型抗體。抗個體遺傳型抗體係識別另一抗體(靶抗體)之決定子之抗體。通常,抗個體遺傳型抗體識別靶抗體之抗原結合位點之決定子。通常,靶抗體係單株抗體。通常藉由利用靶單株抗體對與該靶單株抗體之來源相同的物種及遺傳類型之動物(具體而言小鼠)實施免疫來製備抗個體遺傳型抗體。經免疫動物對靶單株抗體之個體遺傳型決定子產生免疫反應且產生針對靶單株抗體之個體遺傳型決定子之抗體。可使用經免疫動物之抗體產生細胞(諸如脾細胞)來產生抗個體遺傳型單株抗體。此外,亦可使用抗個體遺傳型抗體來免疫動物以產生抗-抗個體遺傳型抗體。使用標準技術,該等經免疫動物可用於產生抗-抗個體遺傳型單株抗體。抗-抗個體遺傳型抗體可與用於製備抗個體遺傳型抗體之原始靶單株抗體結合至相同之抗原決定基。抗-抗個體遺傳型抗體代表具有與原始靶單株抗體相同之抗原特異性之其他單株抗體。
若抗個體遺傳型抗體與靶抗體之結合受靶抗體之相關抗原抑制,且若抗個體遺傳型抗體以與靶抗體相同之特異性誘導抗體反應,則其模擬靶抗體之抗原。此一抗個體遺傳型抗體係「內部影像抗個體遺傳型」且能夠誘導抗體反應,如同其為原始抗原一般。(Bona及Kohler,Anti-Idiotypic Antibodies And Internal Image,Monoclonal And Anti-Idiotypic Antibodies: Probes For Receptor Structure And Function
,Venter J. C., Frasser, C. M., Lindstrom, J. (編輯),Alan R. Liss, N. Y., 1984. 第141-149頁)。已顯示併入內部影像抗個體遺傳型抗體之疫苗誘導針對病毒、細菌及寄生蟲之保護性反應(Kennedy等人,(1986)Science
, 232:220-223;McNamara等人,(1985)Science
226:1325-1326)。亦已顯示內部影像抗個體遺傳型抗體誘導對腫瘤相關抗原之免疫性(Raychauhuri等人,(1986)J. Immunol.
137:1743-1749;Raychauhuri等人,(1987)J. Immunol.
139:3902-3910;Bhattacharya-Chatterjee等人,(1987)J. Immunol.
139:1354-1360;Bhattacharya-Chatterjee等人,(1988) J. Immunol. 141:1398-1403;Herlyn, D.等人,(1989)Intern. Rev.
Immunol. 4:347-357;Chen, Z.-J等人,(1990)Cell Imm. Immunother.
Cancer 351-359;Herlyn, D.等人,(1991)In Vivo
5:615-624;Furuya等人,(1992)Anticancer Res
. 12:27-32;Mittelman A.等人,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci., USA
89:466-470;Durrant, L. G.等人,(1994)Cancer Res.
54:4837-4840;Mittelman, A.等人,(1994)Cancer Res
54:415-421;Schmitt, H.等人,(1994) Hybridoma 13:389-396;Chakrobarty, M.等人,(1995)J. Immunother.
18:95-103;Chakrobarty, M.等人,(1995)Cancer Res.
55:1525-1530;Foon, K. A.等人,(1995)Clin.Cancer Res.
1:1205-1294;Herlyn, D等人,(1995)Hybridoma
14:159-166;Sclebusch, H.等人,(1995)Hybridoma
14:167-174;Herlyn, D.等人,(1996)Cancer Immunol Immunother.
43:65-76)。
針對MCT1之抗個體遺傳型抗體可(例如)藉由利用免疫原性量之包含MCT1或其免疫原性部分之組合物(含有MCT1之至少一種抗原性抗原決定基)對動物(諸如小鼠)實施免疫來製備。該組合物亦可含有適宜佐劑及為提供免疫原性所必需之任何載劑。識別MCT1之單株抗體可自如上文所述之經免疫動物之細胞製備。接著選擇識別MCT1之抗原決定基之單株抗體,且使用其製備包含免疫原性量之抗MCT1單株抗體之組合物。通常,25 μg至200 μg劑量之純化MCT1單株於適宜佐劑中將係足夠的。
可在劑量之間以14天至30天間隔將動物免疫2至6次。通常,藉由任一適宜投與途徑(諸如腹膜內、皮下、靜脈內或該等投與途徑之組合)對動物實施免疫。可使用標準免疫分析方法在免疫期期間監測抗個體遺傳型抗體產生。可利用用作免疫原之單株抗體對具有與靶單株抗體反應之適宜抗體效價之動物實施再免疫三天,之後收穫抗體產生細胞。較佳地,使用脾細胞,但可選擇其他抗體產生細胞。如上文所述,收穫抗體產生細胞且與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤,且選擇適宜抗個體遺傳型抗體產生細胞。
藉由使用抗個體遺傳型單株抗體作為免疫原進行另一輪免疫及雜交瘤產生來產生抗-抗個體遺傳型抗體。
競爭、抗原決定基定位及結構相似性
競爭、抗原決定基定位及結構相似性
使用丙胺酸掃描可容易地確定與本文所述單株抗體結合實質上或基本上相同的抗原決定基之一或多種抗體之鑑別。另外,可評價抗體競爭之多種免疫篩選分析中之任一者。多種此等分析係常規實踐的且為此項技術中所眾所周知(參見例如1997年8月26日頒佈之美國專利第5,660,827號,其明確地以引用方式併入本文中)。將理解,實際上,確定本文所述抗體所結合之抗原決定基之方式不係為鑑別與本文所述單株抗體結合相同或實質上相同或重疊抗原決定基之抗體所需之任何方式。
舉例而言,倘若欲檢驗之測試抗體係自不同來源動物獲得或甚至具有不同Ig同型,則可採用簡單競爭分析,其中將對照抗體與測試抗體混合且接著施加至含有MCT1之樣品。基於ELISA之方案、放射免疫分析、西方墨點法(Western blotting)及使用BIACORE®
(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)分析適用於此等簡單競爭研究。
在某些實施例中,將對照抗MCT1抗體與不同量之測試抗體(例如,以約1:1、1:2、1:10或約1:100之比率)預混合一段時間,之後施加至MCT1抗原樣品。在其他實施例中,可簡單地分開添加對照及不同量之測試抗體且在暴露於MCT1抗原樣品期間混合。只要結合抗體可與游離抗體區分開(例如,藉由使用分離或洗滌技術以消除未結合抗體)且對照抗體可與測試抗體區分開(例如,藉由使用物種特異性或同型特異性二級抗體或藉由利用可偵測標記特異性地標記對照抗體),則可測定測試抗體是否降低對照抗體與MCT1抗原之結合,此指示測試抗體與對照抗MCT1抗體識別實質上相同之抗原決定基。在完全不相關抗體(不結合MCT1)存在下,(經標記)對照抗體之結合可作為對照高值。可藉由將經標記之對照抗體與相同但未經標記之對照抗體一起培育來獲得對照低值,其中將發生競爭且降低經標記抗體之結合。在測試分析中,在測試抗體存在下經標記抗體反應性之顯著降低指示測試抗體識別實質上相同之抗原決定基,亦即該測試抗體與經標記之對照抗體競爭。舉例而言,以介於約1 : 1或1 : 10與約1 : 100之間的任一測試抗體比率將對照抗體與MCT1之結合降低至少約50% (諸如至少約60%)或更多(例如,至少約70% (例如,約65%-100%))之任一測試抗體均視為與對照抗體結合實質上相同或重疊之抗原決定基或決定子之抗體。
較佳地,此測試抗體將使對照抗體與MCT1抗原之結合降低至(例如)在測試抗體不存在下所觀察到之對照抗體結合之至少約50%、至少約60%、至少約80%或至少約90% (例如,約95%)。
亦可有利地採用簡單競爭分析,其中將測試抗體以飽和濃度施加至其上固定有MCT1 (或其一部分)之表面。簡單競爭分析中之表面係(例如) BIACORE®
(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)晶片(或適於表面電漿子共振(「SPR」)分析之其他介質)。量測結合MCT1之對照抗體與MCT1塗覆表面之結合。將此至單獨對照抗體之含MCT1表面之結合與在測試抗體存在下對照抗體之結合進行比較。在測試抗體存在下,對照抗體與含MCT1表面之結合顯著降低指示測試抗體與對照抗體識別實質上相同之抗原決定基,使得測試抗體與對照抗體「競爭」。將對照抗體之結合降低至少約20%或更多、至少約40%、至少約50%、至少約70%或更多之任一測試抗體均可視為與對照抗體結合實質上相同之抗原決定基或決定子之抗體。較佳地,此測試抗體將使對照抗體與MCT1之結合降低至少約50% (例如,至少約60%、至少約70%或更多)。應瞭解,對照及測試抗體之順序可逆轉;亦即,在競爭分析中可首先使對照抗體結合至表面且接著在此之後使測試抗體與表面接觸。或者,首先使對MCT1抗原具有更大親和力之抗體結合至含MCT1之表面,此乃因預期第二抗體(假設該抗體係競爭性的)所見之結合下降將具有更大量級。此等分析之其他實例提供於(例如) Saunal及Regenmortel,J. Immunol. Methods
, 183:33-41 (1995)中,其揭示內容係以引用的方式併入本文中。
另外,可尤其使用基於西方墨點之分析來測定抗體是否與另一抗體結合MCT1上之相同或重疊抗原決定基或結合由測試抗體所結合之抗原決定基。在此分析中,製備對應於由抗體所結合抗原(亦即MCT1蛋白)之肽文庫,其包含該蛋白質之重疊部分,通常長度為10至25個、10至20個或10至15個胺基酸。合成涵蓋MCT1序列之該等不同重疊胺基酸肽且共價結合至PEPSPOTS™硝化纖維素膜(JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)。接著根據製造商之建議製備且探測墨點。
基本上,免疫印跡分析接著藉由螢光方式偵測文庫中哪些肽結合至測試抗體且藉此可鑑別抗原(亦即,MCT1)上之哪些殘基與測試抗體相互作用。(參見美國專利第7,935,340號,其係以引用的方式併入本文中)。
各種抗原決定基定位技術為此項技術中所已知。舉例而言,抗原及抗體之X射線共結晶學;NMR;SPR (例如,在25℃或37℃下);基於陣列之寡肽掃描(或「肽掃描分析」);定點誘變(例如,丙胺酸掃描);誘變定位;氫-氘交換;噬菌體展示;及有限之蛋白分解均係此項技術中眾所周知之抗原決定基定位技術(參見例如Epitope Mapping Protocols: 第二版,Methods in Molecular Biology,編輯Mike Schutkowski及Ulrich Reineke,第2版,New York, NY: Humana Press (2009),及Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology
,編輯Glenn Morris,第1版,New York, NY: Humana Press (1996),二者均係以全文引用的方式併入本文中)。
使用其中可評價抗體競爭之多種免疫篩選分析中之任一者可容易地確定與本文所述單株抗體(例如,MCT1 Ab1或其變異體)結合實質上或基本上相同的抗原決定基之一或多種抗體之鑑別。多種此等分析係常規實踐的且為此項技術中所眾所周知(參見例如1997年8月26日頒佈之美國專利第5,660,827號,其係以引用的方式併入本文中)。將理解,確定本文所述抗體所結合之抗原決定基之方式不係為鑑別與本文所述單株抗體結合相同或實質上相同的抗原決定基之抗體所需之任何方式。
舉例而言,倘若欲檢驗之測試抗體係自不同來源動物獲得或甚至具有不同Ig同型,則可採用簡單競爭分析,其中將對照抗體(例如,MCT1 Ab1或Ab1至Ab95中之任一者或例如前述抗體中任一者之片段或變異體)與測試抗體混合且接著施加至含有MCT1之樣品,其已知由MCT1 Ab1及Ab1至Ab95中之任一者結合。基於ELISA之方案、放射免疫分析、西方墨點法及BIACORE®
(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)分析(如本文實例部分中所闡述)適用於此等簡單競爭研究。
在某些實施例中,該方法包括將對照抗體與不同量之測試抗體(例如,以約1 : 1、1 : 2、1 : 10或約1 : 100之比率)預混合一段時間,之後施加至MCT1抗原樣品。在其他實施例中,可分開添加對照及不同量之測試抗體且在暴露於MCT1抗原樣品期間混合。只要結合抗體可與游離抗體區分開(例如,藉由使用分離或洗滌技術以消除未結合抗體)且對照抗體可與測試抗體區分開(例如,藉由使用物種特異性或同型特異性二級抗體或藉由利用可偵測標記特異性地標記對照抗體),則該方法可用於測定測試抗體降低對照抗體與MCT1抗原之結合,此指示測試抗體與對照抗體(例如MCT1 Ab1或Ab1至Ab95中之任一者)識別實質上相同之抗原決定基。在完全不相關抗體(不結合MCT1)存在下,(經標記)對照抗體之結合可作為對照高值。可藉由將經標記之對照抗體與相同但未經標記之對照抗體一起培育來獲得對照低值,其中將發生競爭且降低經標記抗體之結合。在測試分析中,在測試抗體存在下經標記抗體反應性之顯著降低指示測試抗體識別實質上相同之抗原決定基,亦即該測試抗體與經標記之對照抗體競爭。舉例而言,以介於約1 : 1或1 : 10與約1 : 100之間的任一對照MCT1 Ab1:測試抗體比率將MCT1 Ab1與MCT1之結合降低至少約50% (諸如至少約60%)或更多(例如,至少約70% (例如,約65%-100%))之任一測試抗體均視為與MCT1 Ab1或Ab1至Ab95中之任一者結合實質上相同的抗原決定基或決定子之抗體。較佳地,此測試抗體將使MCT1 Ab1與MCT1之結合降低至在測試抗體不存在下所觀察到之MCT1 Ab1結合之至少約50%、至少約60%、至少約80%或至少約90% (例如,約95%)。該等方法可經修改以鑑別及/或評估與其他對照抗體競爭之抗體。
亦可有利地採用簡單競爭分析,其中將測試抗體以飽和濃度施加至其上固定有MCT1之表面。簡單競爭分析中之表面(例如)具有適於OCTET®
及/或PROTEON®
之介質。量測對照抗體(例如,MCT1 Ab1或Ab2至Ab95中之任一者)與MCT1塗覆表面之結合。將此至單獨對照抗體之含MCT1表面之結合與在測試抗體存在下對照抗體之結合進行比較。在測試抗體存在下,對照抗體與含MCT1表面之結合顯著降低指示測試抗體與對照抗體識別實質上相同之抗原決定基,使得測試抗體與對照抗體「競爭」。將對照抗體(諸如MCT1 Ab1)與MCT1之結合降低至少約20%或更多、至少約40%、至少約50%、至少約70%或更多之任一測試抗體均可視為與對照抗體(例如,MCT1 Ab1)結合實質上相同之抗原決定基或決定子之抗體。較佳地,此測試抗體將使對照抗體(例如,MCT1 Ab1)與MCT1抗原之結合降低至少約50% (例如,至少約60%、至少約70%或更多)。應瞭解,對照及測試抗體之順序可逆轉;亦即,在競爭分析中可首先使對照抗體結合至表面且接著在此之後使測試抗體與表面接觸。較佳地,首先使對MCT1具有更高親和力之抗體結合至含MCT1之表面,此乃因預期第二抗體(假設該抗體係競爭性的)所見之結合下降將具有更大量級。此等分析之其他實例提供於(例如) Saunal及Regenmortel,J. Immunol. Methods
, 183:33-41 (1989)中,其揭示內容係以引用的方式併入本文中。
測定抗體、其抗原結合片段或抗體衍生物是否在上文所定義抗原決定基區中之一者內結合可以熟習此項技術者已知之方式來實施。在此等定位/表徵方法之另一實例中,抗MCT1抗體之抗原決定基區可藉由抗原決定基「足跡法」使用對MCT1蛋白中暴露之胺/羧基之化學修飾來測定。此一足跡法技術之一個具體實例係使用藉由質譜偵測之氫-氘交換(「HXMS」),其中發生受體與配位體蛋白質醯胺質子之氫/氘交換、結合及反向交換,其中參與蛋白質結合之主鏈醯胺基團經保護免於反向交換,且因此將保持氘化。此時可藉由消化性蛋白分解、快速微孔高效液相層析分離及/或電噴霧離子化質譜來鑑別相關區(參見例如Ehring H.,Analytical Biochemistry
, 267(2):252-259 (1999)及Engen, J. R.及Smith, D. L.,Anal. Chem.
, 73:256A-265A (2001))。適宜抗原決定基鑑別技術之另一實例係核磁共振抗原決定基定位(「NMR」),其中通常比較游離抗原與同抗原結合肽(諸如抗體)複合之抗原的二維NMR光譜中信號之位置。通常利用15
N選擇性地同位素標記抗原,從而使得在NMR光譜中僅看到對應於抗原之信號且無來自抗原結合肽之信號。與游離抗原之光譜相比,在複合物之光譜中,源自參與與抗原結合肽相互作用之胺基酸之抗原信號通常將改變位置,且參與結合之胺基酸可以此方式鑑別。參見例如Ernst Schering,Res. Found. Workshop
, (44): 149-67 (2004);Huang等人,J. Mol. Biol
, 281(l):61-67 (1998);及Saito及Patterson,Methods
, 9(3):516-24 (1996)。抗原決定基定位/表徵亦可使用質譜(「MS」)方法來實施(參見例如Downard,J. Mass Spectrom.
, 35(4):493-503 (2000)及Kiselar及Downard,Anal. Chem.
, 71(9): 1792-801 (1999))。
蛋白酶消化技術亦可用於抗原決定基定位及鑑別之情形中。抗原決定子相關區/序列可藉由蛋白酶消化來確定,例如藉由在37℃及pH 7-8下使用約1 :50胰蛋白酶對MCT1之比例隔夜(「o/n」)消化,之後實施質譜(「MS」)分析以用於肽鑑別。因抗MCT1抗體而保護免於胰蛋白酶裂解之肽可隨後藉由比較經受胰蛋白酶消化之樣品及與抗體一起培育且接著經受(例如)胰蛋白酶消化(藉此顯露抗體之足跡)之樣品來鑑別。其他酶(如胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶)可用於類似之抗原決定基表徵方法中。此外,在MCT1結合多肽之情形下,酶消化可提供用於分析潛在抗原決定子序列是否在MCT1之區域內之快速方法。若多肽不在表面暴露,則其很可能在免疫原性/抗原性方面不相關(關於類似技術之論述,參見例如Manca,Ann. 1st. Super. Sanita.
, 27(1): 15-9 (1991))。
定點誘變係可用於表徵結合抗原決定基之另一技術。舉例而言,在「丙胺酸掃描」定點誘變(亦稱為例如丙胺酸掃描、丙胺酸掃描誘變、丙胺酸掃描突變、組合丙胺酸掃描或丙胺酸點突變之產生)中,經由諸如直接肽或蛋白質合成、定點誘變、GENEART™誘變服務(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA U.S.A.)或散彈槍誘變等方法使蛋白質區段內之每一殘基經丙胺酸殘基(或在丙胺酸存在於野生型序列中之情形下諸如纈胺酸等另一殘基)置換。藉此使用此技術產生一系列分子之單一點突變體;所產生突變體之數目等於分子中殘基之數目,每一殘基經單一丙胺酸殘基一次一個地置換。由於丙胺酸之非龐大之化學惰性甲基官能基可模擬許多其他胺基酸可能具有之二級結構偏好,因此其通常用於置換天然(野生型)殘基。隨後,用丙胺酸置換天然殘基對丙胺酸掃描突變體及其結合搭配物之結合親和力之效應可使用諸如但不限於SPR結合實驗等方法來量測。若突變導致結合親和力顯著降低,則突變殘基很有可能參與結合。對結構抗原決定基具有特異性之單株抗體(亦即,不結合未摺疊蛋白質之抗體)可用作結合親和力實驗中之陽性對照以驗證丙胺酸置換不影響蛋白質之整體三級結構(此乃因蛋白質之整體摺疊之變化可間接地影響結合且藉此產生偽陽性結果)。參見例如Clackson及Wells,Science
, 267:383-386 (1995);Weiss等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 97(16):8950-8954 (2000);及Wells,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 93: 1-6 (1996)。
電子顯微鏡術亦可用於抗原決定基「足跡法」。舉例而言,Wang等人,Nature, 355:275-278 (1992)使用冷凍電鏡術、三維影像重建及X射線結晶學之配合應用來測定天然豇豆花葉病毒殼體表面上Fab片段之物理足跡。
用於抗原決定基評估之其他形式之「無標記」分析包括SPR (以BIACORE®
系統商業出售,GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)及反射干涉光譜法(「RifS」) (參見例如Fagerstam等人,Journal of Molecular Recognition
, 3:208-14 (1990);Nice等人,J. Chromatogr
., 646: 159-168 (1993);Leipert等人,Angew.Chem. Int. Ed.
, 37:3308-3311 (1998);Kroger等人,Biosensors and Bioelectronics
, 17:937-944 (2002))。
在一些實施例中,本發明之抗MCT1抗體可具有與另一抗MCT1抗體相同或類似之結構。在較佳實施例中,本發明之抗MCT1抗體具有與MCT1 Ab1或Ab1至Ab95中之任一者類似之結構。可經由藉助x射線結晶學、NMR或其他已知方法獲得之三維蛋白質結構之結構比對來評價結構相似性。可經由對所比較之兩種蛋白質之CDR中Cα碳之間的位置差異之分析來確定類似結構。通常,一或多個CDR中平均RMSD小於5 Å、小於4 Å、小於3 Å、小於2 Å、小於1 Å或小於0.5 Å指示類似蛋白質結構。因此,在一個實施例中,本發明之抗MCT1抗體具有採取與MCT1 Ab1之彼等結構相同結構之CDR,其中在結構比對中平均RMSD小於0.5 Å。
在另一實施例中,本發明之抗MCT1抗體可在蛋白質表面物理化學性質方面與MCT1 Ab1類似。在特定實施例中,在抗體之結合表面中,該抗體與MCT1 Ab1或Ab1至Ab95中之任一者具有相同表面電荷。在另一實施例中,其具有相同靜電位及/或疏水性。
例示性抗MCT1抗體、抗體片段及融合蛋白
例示性抗MCT1抗體、抗體片段及融合蛋白
在一個實施例中,本發明之抗體包含MCT1 Ab1之重鏈及輕鏈CDR。在一個實施例中,本發明之抗體包含SEQ ID NO:4、5、6之重鏈CDR及SEQ ID NO:7、8、9之輕鏈CDR。
在一個實施例中,本發明之抗體或抗體片段包含MCT1 Ab1或Ab2至Ab95中之任一者之VH
結構域及VL
結構域。在一個實施例中,本發明之抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:2之胺基酸序列或與Ab2至Ab95中之任一者之VH
結構域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH
結構域。在一個實施例中,本發明之抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:3之胺基酸序列或與Ab1至Ab95中之任一者之VL
結構域具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL
結構域。在一個實施例中,本發明之抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH
結構域及與SEQ ID NO:3之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL
結構域。
在一個實施例中,本發明之抗體或抗體片段包含與Ab2至Ab95中任一者之VH
結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH
結構域及與Ab1至Ab95之VL
結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL
結構域胺基酸序列,較佳地其中該等同源VH
及VL
結構域對應於同一抗體(亦即,Ab2至Ab95中之一者)之彼等結構域。
在一個實施例中,本發明之融合蛋白包含MCT1 Ab1之重鏈CDR3 (SEQ ID NO:6)或其變異體。在一個實施例中,該融合蛋白包含與SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之肽。特定而言,由於MCT1 Ab1之重鏈CDR3較大多數CDR長且明顯延伸超出MCT1 Ab1上之抗原結合表面之平面,因此預期包含具有此序列(SEQ ID NO:6)之肽或其變異體之融合蛋白可保留MCT1 Ab1之一或多種功能或結合能力。
其他修飾 抗體結合物
其他修飾 抗體結合物
在一些實施例中,本發明係關於抗體-藥物結合物(ADC),其係由連接至有效載荷藥物(通常具有細胞毒性)之抗體(或諸如單鏈可變片段(scFv)等抗體片段)組成。抗體使ADC結合至靶標癌細胞。然後ADC通常由細胞內化且將藥物釋放至細胞中。由於靶向,因此副作用較低且產生更寬廣之治療窗。親水性連接體(例如,PEG4Mal)有助於防止藥物經由MDR (多重抗藥性)轉運蛋白自抗性癌細胞泵出。
在另一態樣中,本發明係關於免疫結合物,其包含結合至治療劑(諸如細胞毒素、藥物(例如,免疫抑制劑)或放射性毒素)之抗MCT1抗體或其片段。此等結合物在本文中稱為「免疫結合物」。包括一或多種細胞毒素之免疫結合物稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如,殺死細胞)之任一劑。實例包括紫杉醇(Taxol)、細胞鬆弛素B、短桿菌素D (gramicidin D)、溴乙錠、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包括(例如)抗代謝物(例如,胺甲喋呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如,甲基二氯乙基胺、噻替派(thiotepa)、氮芥苯丁酸、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑(cisplatin))、蒽環類(例如,柔紅黴素(舊稱道諾黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如,放線菌素D (舊稱放線菌素)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素及安麯黴素(anthramycin,AMC))以及抗有絲分裂劑(例如,長春新鹼及長春鹼)。
可結合至根據本發明之至少一些實施例之抗體的治療性細胞毒素之其他實例包括倍癌黴素(duocarmycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)及奧里斯他汀(auristatin)及其衍生物。卡奇黴素抗體結合物之一實例可商業購得(Mylotarg™ Wyeth)。
使用此項技術中可用之連接體技術可將細胞毒素結合至根據本發明之至少一些實施例之抗體。已用於將細胞毒素結合至抗體之連接體類型之實例包括(但不限於)腙、硫醚、酯、二硫化物及含肽連接體。可選擇例如易於藉由溶酶體區室內之低pH裂解或易於藉由蛋白酶(諸如優先在腫瘤組織中表現之蛋白酶,諸如細胞自溶酶(例如,細胞自溶酶B、C、D))裂解之連接體。關於細胞毒素之類型、將治療劑結合至抗體之連接體及方法之進一步論述,亦參見Saito, G.等人,(2003)Adv. Drug Deliv. Rev.
55: 199-215;Trail, P. A.等人,(2003)Cancer Immunol. Immunother.
52:328-337;Payne, G. (2003)Cancer Cell
3:207-212;Allen, T. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763;Pastan, I.及Kreitman,R. J. (2002)Curr. Opin. Investig. Drugs
3: 1089-1091;Senter, P. D.及Springer, C. J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev.
53:247-264。
本發明之抗體亦可結合至放射性同位素以產生細胞毒性放射性醫藥,亦稱為放射性免疫結合物。可結合至抗體以用於診斷或治療之放射性同位素之實例包括(但不限於)碘131、銦111、釔90及鎦177。此項技術中已確立用於製備放射性免疫結合物之方法。放射性免疫結合物可商業購得,包括Zevalin®
(BiogenIDEC)及Bexxar®
(Corixa Pharmaceuticals),且可使用類似方法使用根據本發明之至少一些實施例之抗體來製備放射性免疫結合物。
根據本發明之至少一些實施例之抗人類MCT1抗體及含有其之結合物可用於調節給定生物反應,且藥物部分不應解釋為限於經典化學治療劑。舉例而言,藥物部分可係具有期望生物活性之蛋白質或多肽。此等蛋白質可包括(例如)酶促活性毒素或其活性片段,諸如相思子素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素;蛋白質,諸如腫瘤壞死因子或干擾素-γ;或生物反應調節劑,例如淋巴介質、介白素-1 (「IL-1」)、介白素-2 (「IL-2」)、介白素-6 (「IL-6」)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球群落刺激因子(「G-CSF」)或其他生長因子。
用於將此治療性部分結合至抗體之技術已眾所周知,參見例如Arnon等人,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy
」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編輯),第243-56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985);Hellstrom等人,「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery
(第2版),Robinson等人(編輯),第623-53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987);Thorpe,「Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」,Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications
,Pinchera等人(編輯),第475-506頁(1985);「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy
,Baldwin等人(編輯),第303-16頁(Academic Press 1985),及Thorpe等人,「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」,Immunol. Rev.
, 62: 119-58 (1982)。
對恆定區、Fc結構域之修飾及轉譯後修飾
對恆定區、Fc結構域之修飾及轉譯後修飾
除在框架或CDR區內製備之修飾或另一選擇,根據本發明之至少一些實施例之抗體可經改造以包括Fc區內之修飾,通常改變抗體之一或多種功能性質,諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外,根據本發明之至少一些實施例之抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分連接至該抗體)或經修飾以改變其醣基化,以再次改變抗體之一或多種功能性質。下文進一步闡述此等實施例。Fc區中殘基之編號係Kabat之EU索引編號。
在一個實施例中,CH1之鉸鏈區經修飾使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變(例如增加或減少)。此方法進一步闡述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數以(例如)促進輕鏈及重鏈組裝或增加或降低抗體之穩定性。
在另一實施例中,抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短抗體之生物半衰期。更具體而言,將一或多個胺基酸突變引入至Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中,使得該抗體具有相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合受損之葡萄球菌蛋白質A (SpA)結合。此方法進一步詳細闡述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中,抗體經修飾以增加其生物半衰期。各種方法係可能的。舉例而言,如頒予Ward之美國專利第6,277,375號中所闡述,可引入以下突變中之一或多者:T252L、T254S及T256F。或者,為增加生物半衰期,如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所闡述,可在CH1或CL區內改變抗體以含有自IgG之Fc區中CH2結構域之兩個環獲取之補救受體結合抗原決定基。
在其他實施例中,藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體之效應功能。舉例而言,一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換,使得抗體對效應配位體具有改變之親和力,但保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和力改變之效應配位體可為(例如) Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細闡述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在一些實施例中,一或多個選自胺基酸殘基329、331及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換,使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細闡述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中,改變胺基酸位置231及239內之一或多個胺基酸殘基以藉此改變抗體結合補體之能力。此方法進一步闡述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在另一實施例中,藉由修飾一或多個以下位置處之胺基酸來修飾Fc區以增加抗體對Fγ受體之親和力:238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法進一步闡述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外,已定位人類IgG1上針對FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已闡述具有改良結合之變異體(參見Shields, R. L.等人,(2001)J. Biol. Chem.
276:6591-6604)。已證明位置256、290、298、333、334及339處之特異性突變改良與FcγRIII之結合。另外,已證明以下組合突變體改良FcγRIII結合:T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。此外,諸如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S等突變改良與FcRn之結合且增加抗體循環半衰期(參見Chan CA及Carter PJ (2010)Nature Rev Immunol
10:301-316)。
在另一實施例中,抗體可經修飾以消除活體內Fab臂交換。具體而言,此過程涉及其他lgG4抗體之間的lgG4半分子(一條重鏈加上一條輕鏈)之交換,其有效地產生功能上單價之雙特異性抗體。重鏈之鉸鏈區及恆定結構域之突變可消除此交換(參見Aalberse,RC, Schuurman J., 2002,Immunology
105:9-19)。
在另一實施例中,抗體之醣基化經修飾。舉例而言,可製備無醣基化抗體(亦即,抗體缺少醣基化)。可改變醣基化以(例如)增加抗體對抗原之親和力。此等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來完成。舉例而言,可進行一或多個胺基酸取代以消除一或多個可變區框架醣基化位點,藉此消除該位點處之醣基化。此無醣基化可增加抗體對抗原之親和力。此一方法進一步詳細闡述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外或或者,可製備具有經改變類型醣基化之抗體,諸如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻醣基化抗體或具有增加之平分型GlcNac結構之抗體。已證實,此等經改變之醣基化模式增加抗體之ADCC能力。此等碳水化合物修飾可藉由(例如)在具有經改變之醣基化機構之宿主細胞中表現抗體來完成。此項技術中已闡述具有經改變醣基化機構之細胞且其可用作宿主細胞,該等宿主細胞用以表現根據本發明之至少一些實施例之重組抗體以藉此產生具有經改變醣基化之抗體。舉例而言,細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基轉移酶基因FUT8 (α (1,6)-岩藻糖基轉移酶),從而使得Ms704、Ms705及Ms709細胞株中所表現之抗體在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8細胞株係藉由使用兩個置換載體靶向破壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因所產生(參見Yamane等人之美國專利公開案第20040110704號,及Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng
87:614-22)。作為另一實例,Hanai等人之EP 1,176,195闡述具有編碼岩藻糖基轉移酶之功能破壞FUT8基因之細胞株,從而使得此一細胞株中所表現之抗體藉由降低或消除1,6鍵相關酶而展現低岩藻醣基化。Hanai等人亦闡述對於將岩藻糖添加至結合至抗體Fc區之N-乙醯基葡糖胺具有低酶活性或不具有該酶活性之細胞株,例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0 (ATCC CRL 1662)。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述將岩藻糖連接至Asn(297)連接之碳水化合物的能力降低之變異體CHO細胞株Lec13細胞,其亦產生在該宿主細胞中所表現抗體之低岩藻醣基化(亦參見Shields, R. L.等人,(2002)Biol. Chem.
277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現修飾糖蛋白之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII))之細胞株,從而使得經改造細胞株中所表現之抗體展現增加之產生增加的抗體ADCC活性之平分型GlcNac結構(亦參見Umana等人(1999)Nat. Biotech.
17: 176-180)。或者,可使用岩藻糖苷酶裂解掉抗體之岩藻糖殘基。舉例而言,岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體去除岩藻糖基殘基(Tarentino, A. L.等人(1975)Biochem.
14:5516-23)。
本發明所涵蓋之對本文抗體之另一修飾係聚乙二醇化或添加其他水溶性部分、通常聚合物,例如以增強半衰期。抗體可經聚乙二醇化以(例如)延長抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化,通常在一或多個PEG基團變為連接至抗體或抗體片段之條件下使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG) (諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。較佳地,聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來實施。如本文所用,術語「聚乙二醇」意欲涵蓋PEG之已用於衍生其他蛋白質之任一形式,諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳基氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中,欲經聚乙二醇化之抗體係無醣基化抗體。使蛋白質聚乙二醇化之方法為此項技術中所已知且可適用於根據本發明之至少一些實施例之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316,及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
核酸分子
核酸分子
本發明進一步提供核酸,其編碼根據本發明之抗MCT1抗體或其片段或結合物。該等核酸可存在於全細胞中,存在於細胞溶解物中,或以部分純化或實質上純淨之形式存在。在藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)時,核酸係「經分離」或「使得實質上純淨的」,該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中眾所周知之其他方法。參見Ausubel等人(2011)Current Protocols in Molecular Biology
, John Wiley & Sons, Inc。根據本發明之至少一些實施例之核酸可為(例如) DNA或RNA且可含有或不含內含子序列。在較佳實施例中,核酸為cDNA分子。
根據本發明之至少一些實施例之核酸可使用標準分子生物學技術來獲得。對於由雜交瘤(例如如下文進一步闡述自攜載人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠製備之雜交瘤)表現之抗體,編碼藉由雜交瘤製造之抗體的輕鏈及重鏈之cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術來獲得。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如,使用噬菌體展示技術)獲得之抗體,可自該文庫回收編碼該抗體之核酸。
一旦獲得編碼VH
及VL
區段之DNA片段,則可藉由標準重組DNA技術進一步操縱該等DNA片段以(例如)將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中,編碼VL
或VH
之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段,諸如抗體恆定區或撓性連接體。如先前所定義,術語「可操作地連接」意指連結兩個DNA片段,從而使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留在框內。
可藉由將編碼VH
之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子來將編碼VH
區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中所已知(參見例如Kabat, E. A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest
,第五版,U.S. Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號),且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區,但大多數例如係IgG1、IgG2或IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因而言,編碼VH
之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL
之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子來將編碼VL
區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中所已知(參見例如Kabat, E. A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest
,第五版,U.S. Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號),且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為卡帕(κ)或拉姆達(λ)恆定區,但大多數例如係κ恆定區。
為產生scFv基因,將編碼VH
及VL
之DNA片段可操作地連接至編碼撓性連接體(例如,編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)之另一片段,從而使得VH
及VL
序列可表現為鄰接單鏈蛋白質,其中VL
及VH
區藉由撓性連接體連結(參見例如Bird等人(1988)Science
242:423-426;Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci., USA
85:5879-5883;McCafferty等人,(1990)Nature
348:552-554)。
載體
載體
本發明亦提供其中插入本發明DNA之載體。源自反轉錄病毒之載體係達成長期基因轉移之適宜工具,此乃因其除具有靈活之基因體以外亦具有遺傳穩定性及高表現。此外,反轉錄病毒載體之臨床經驗為最佳化其使用之效能及安全性提供指導。
在簡述中,編碼抗體或其抗原結合片段之天然或合成核酸之表現通常係藉由將編碼抗體或其抗原結合片段或其部分之核酸可操作地連接至啟動子且將構築體併入至表現載體中來達成。載體可適於複製且整合於真核生物中。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及可用於調控期望核酸序列表現之啟動子。
可將核酸選殖至多種類型之載體中。舉例而言,可將核酸選殖至包括(但不限於)以下各項之載體中:質體、噬粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏粒。尤其相關之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。
此外,可向細胞提供呈病毒載體形式之表現載體。病毒載體技術為此項技術中所眾所周知,且闡述於(例如) Sambrook等人(2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Laboratory, New York),及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括(但不限於)反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言,適宜載體含有在至少一種生物體中具有功能之複製起點、啟動子序列、便捷之限制性內核酸酶位點及一或多個可選標記物(例如,WO 01/96584;WO 01/29058;及美國專利第6,326,193號)。
已開發出多種基於病毒之系統用於將基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言,反轉錄病毒為基因遞送系統提供便捷之平台。可使用此項技術中已知之技術將所選基因插入至載體中且包裝在反轉錄病毒顆粒中。接著可以活體內或離體方式將重組病毒分離且遞送至個體細胞中。多種反轉錄病毒系統為此項技術中所已知。在一些實施例中,使用腺病毒載體。多種腺病毒載體為此項技術中所已知。在一個實施例中,使用反轉錄病毒載體。
其他啟動子元件(例如增強子)調控轉錄起始之頻率。通常,該等元件位於起始位點上游之30 bp - 110 bp區域中,但近期已顯示多個啟動子亦含有位於起始位點下游之功能性元件。啟動子元件之間的間距通常較靈活,從而使得元件在相對於彼此插入或移動時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中,啟動子元件之間的間距可在活性開始下降之前增加至50 bp。端視於啟動子而定,似乎個別元件可協同或獨立地發揮活化轉錄之功能。
可使用各種啟動子序列,包括(但不限於)立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子、伸長生長因子-1α (EF-1α)、猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺失病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子以及人類基因啟動子,諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外,本發明應不限於使用組成型啟動子。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之一部分。使用誘導型啟動子提供能夠在期望此表現時啟動可操作地連接之多核苷酸序列的表現或在不期望此表現時關閉表現之分子開關。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、助孕酮啟動子及四環素啟動子。
為評價抗體、抗體之抗原結合片段或其部分之表現,欲引入至細胞中之表現載體亦可含有可選標記物基因或報導基因或二者,以促進自欲經由病毒載體轉染或感染所尋求之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中,可選標記物可攜載於DNA之單獨片段上且用於共轉染程序中。可選標記物及報導基因二者可側接有適當調控序列以使得能夠在宿主細胞中表現。可用之可選標記物包括(例如)抗生素抗性基因,諸如neo及諸如此類。
報導基因係用於鑑別潛在轉染之細胞且用於評估調控序列之功能。一般而言,報導基因係不存在於接受者生物體或組織中或不由其表現且編碼其表現由一些可容易偵測之性質(例如酶促活性)呈現之多肽的基因。報導基因之表現係在將DNA引入至接受者細胞中後在適宜時間下分析。適宜報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如,Ui-Tei等人,2000FEBS Letters
479: 79-82)。適宜表現系統眾所周知且可使用已知技術製備或以商業方式獲得。一般而言,將顯示報導基因之最高表現水準之具有最小5'側接區之構築體鑑別為啟動子。可將此等啟動子區連接至報導基因且用於評估各劑調節啟動子驅動之轉錄之能力。
轉導
轉導
此項技術中已知將基因引入至細胞中且在細胞中表現之方法。在表現載體之情形下,藉由此項技術中之任一方法可容易地將載體引入至宿主細胞(例如,哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。舉例而言,可藉由物理、化學或生物方式將表現載體轉移至宿主細胞中。
用於將多核苷酸引入至宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及諸如此類。用於產生包含載體及/或外源性核酸之細胞之方法為此項技術中所眾所周知。參見例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。用於將多核苷酸引入至宿主細胞中之較佳方法係磷酸鈣轉染。
用於將所關注之多核苷酸引入至宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體且尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入至哺乳動物(例如人類)細胞中之方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純疱疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒及諸如此類。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
用於將多核苷酸引入至宿主細胞中之化學方式包括膠質分散系統,諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統,包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之例示性膠質系統係脂質體(例如,人工膜囊泡)。
在利用非病毒遞送系統之情形下,例示性遞送媒劑係脂質體。涵蓋使用脂質調配物將核酸引入至宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中,核酸可與脂質締合。與脂質締合之核酸可囊封於脂質體之水性內部,散佈在脂質體之脂質雙層內,經由與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子連接至脂質體,包埋於脂質體中,與脂質體複合,分散在含有脂質之溶液中,與脂質混合,與脂質組合,以懸浮液形式含於脂質中,含有膠束或與其複合或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合之組合物並不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言,其可以雙層結構、膠束或「塌陷」結構存在。其亦可簡單地散佈於溶液中,可能形成大小或形狀不均勻之聚集物。脂質係可為天然或合成脂質之脂肪物質。舉例而言,脂質包括天然存在於細胞質中之脂肪小滴以及含有長鏈脂肪族烴及其衍生物之化合物類別,諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。
適於使用之脂質可自商業來源獲得。舉例而言,二肉豆蔻基磷酯醯膽鹼(「DMPC」)可自Sigma, St. Louis, Mo.獲得;磷酸二鯨蠟基酯(「DCP」)可自K & K Laboratories (Plainview, N.Y.)獲得;膽固醇(「Choi」)可自Calbiochem-Behring獲得;二肉豆蔻基磷脂醯基甘油(「DMPG」)及其他脂質可自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.)獲得。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之原液可儲存在約-20℃下。使用氯仿作為唯一溶劑,此乃因其較甲醇更容易蒸發。「脂質體」係涵蓋多種藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成之單一及多層脂質媒劑的一般術語。脂質體之特徵可在於具有磷脂雙層膜及內部水性介質之囊泡狀結構。多層脂質體具有多個由水性介質分開之脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組分在閉合結構形成之前經歷自我重排且將水及所溶解溶質包埋在脂質雙層之間(Ghosh等人,1991Glycobiology
5: 505-10)。然而,亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡狀結構不同之結構之組合物。舉例而言,脂質可呈膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋lipofectamine-核酸複合物。
無論將外源性核酸引入至宿主細胞中所使用之方法為何,抑或以其他方式使細胞暴露於本發明之抑制劑,為確認在宿主細胞中存在重組DNA序列,可實施多種分析。此等分析包括(例如)熟習此項技術者所眾所周知之「分子生物學」分析,諸如南方墨點(Southern blotting)及北方墨點(Northern blotting)、RT-PCR及PCR;「生物化學」分析,諸如偵測特定肽之存在或不存在,例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點)或藉由本文所述之分析,以鑑別屬於本發明範圍內之劑。
治療應用
治療應用
經由上述方法獲得之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或含有其之組合物可用作用於治療個體疾病、病症或病狀之藥劑。在一些實施例中,此一藥劑可用於治療自體免疫、發炎性或過敏性病狀。在一些實施例中,該藥劑可用於治療癌症。在一些實施例中,該藥劑可用於治療EIHI。
個體
個體
本文中所提及之個體可係任何活個體。在較佳實施例中,個體係哺乳動物。本文中所提及之哺乳動物可係任何哺乳動物。如本文所用,術語「哺乳動物」係指任何哺乳動物,包括(但不限於)嚙齒目(Rodentia)哺乳動物(諸如小鼠及倉鼠)及兔形目(Logomorpha)哺乳動物(諸如兔)。哺乳動物可來自食肉目(Carnivora),包括貓類(貓)及犬類(狗)。哺乳動物可來自偶蹄目(Artiodactyla)(包括牛類(牛)及豬類(豬))或奇蹄目(Perssodactyla)(包括馬類(馬))。哺乳動物可係靈長目(Primate)、猿目(Ceboid)或猴目(Simoid)(猴)或類人猿目(Anthropoid)(人類及猿)。
在一些實施例中,向其投與抗體、抗體片段或組合物之個體係靈長類動物,諸如人類。在一些實施例中,靈長類動物係猴或猿。個體可係雄性或雌性且可為任何適宜年齡,包括嬰兒、少年、青少年、成年及老年個體。在一些實例中,患者或個體係用於疾病、抗體療法及/或用於評價毒性結果之經驗證之動物模型。
在一些實施例中,個體在(例如)利用另一免疫療法及/或其他療法(包括化學療法、放射及/或造血幹細胞移植(HSCT)(例如,同種異體HSCT))治療後患有持續性或再發性疾病。在一些實施例中,儘管個體已對另一療法產生抗性,但投與有效地治療個體。在一些實施例中,個體尚未再發但確定處於再發風險下(諸如處於高再發風險),且因此預防性地投與化合物或組合物以(例如)降低再發之可能性或預防再發。
在一些實施例中,該等方法包括向個體、組織或細胞投與抗MCT1抗體、抗體片段或含有其之組合物。欲治療之個體或組織或細胞所源自之個體可係患有與MCT1之表現相關之疾病、病狀或病症者、處於其風險者或疑似患有與MCT1之表現相關之疾病、病狀或病症者。在一些實施例中,向患有欲治療之特定疾病或病狀之個體投與抗體、抗體片段或組合物。在一些實施例中,向個體(諸如患有或處於疾病或病狀風險之個體)投與抗體、抗體片段或組合物。在一些態樣中,該等方法諸如藉由縮小介導自體免疫病症之經活化T細胞或B細胞之比例來藉此治療(例如,改善)疾病或病狀之一或多種症狀。
功能活性及/或評價
功能活性及/或評價
抑制MCT1可用於下調自體免疫反應。下調可呈抑制或阻斷已在進行之自體免疫反應之形式,或可涉及防止誘導自體免疫反應。可藉由抑制MCT1介導之乳酸鹽轉運來抑制經活化免疫細胞之功能。舉例而言,MCT1 Ab1可結合至在經活化T細胞及B細胞上表現且具有免疫相關性之MCT1,藉此下調由該等細胞介導之自體免疫反應。如本文所揭示,可藉由(例如)其抑制經活化T細胞活性或增殖之能力及/或基於其在活體外或在發炎性、過敏性或自體免疫疾病模型中之免疫抑制效應來鑑別其他抗MCT1抗體。
多個此項技術所公認之細胞活化讀出可用於量測(例如)在抗MCT1抗體或其抗原結合片段存在下之細胞增殖或效應功能(例如,抗體產生、細胞介素產生、吞噬作用)。可藉由量測測試抗體使所量測之增殖或效應功能降低之能力容易地測定該抗體抑制MCT1之能力。因此,可藉由量測在不同抗原濃度下之細胞介素產生及/或增殖來測定測試抗體之免疫抑制性且阻斷自體免疫活化之能力。在一些實施例中,發炎性細胞介素之產生或分泌可用於監測本發明治療方法之效能。
在一些實施例中,本發明抗體之治療效能可藉由偵測尿酮來量測。特定而言,由於MCT1 Ab1不與囓齒類動物MCT1交叉反應,因此小鼠研究中之活體內結果可表明酮尿症可直接自人類白血球誘導,此乃因該等人類白血球係NSG小鼠中之唯一靶細胞。另外,一些所觀察到之MCT1抑制之免疫調節效應可間接地由酮之產生導致,此乃因研究已顯示增加之酮血液水準可阻抑炎性體(參考文獻67)。
在一些態樣中,本發明抗體之治療效能係藉由評價臨床結果來量測。對於自體免疫、發炎性或過敏性病狀之治療,治療效能可藉由病狀之改良來量測。舉例而言,狼瘡症狀減少、GVHD存活改良、移植物排斥降低、自體抗體濃度減少等。在治療癌症之情形下,此可包括腫瘤負荷或負載之降低、腫瘤之穩定化、無進展存活或總體存活。在治療EIHI之情形下,此臨床結果可包括身體活動後低血糖症之降低。
免疫反應之下調
免疫反應之下調
MCT1抑制可用於下調免疫反應。下調可呈抑制或阻斷已在進行之免疫反應之形式,或可涉及防止誘導免疫反應。可藉由下調免疫細胞反應或藉由誘導免疫細胞中之特異性無變應性或二者來抑制經活化免疫細胞之功能。舉例而言,抗MCT1抗體可結合至經活化T細胞上之MCT1且藉此下調免疫反應。此抗體可係單特異性或多特異性的,例如其可包含雙特異性抗體(諸如BiTE)。舉例而言,此一抗體可包含MCT1抗原結合部分及另一抗原結合部分,例如其靶向免疫細胞(例如,經活化T細胞或B細胞)上之細胞表面受體。此一抗體除包含MCT1抗原結合位點以外亦可包含結合至B細胞抗原受體、T細胞抗原受體或Fc或其他受體之結合位點,以使分子靶向特定細胞群體。選擇雙特異性抗體之此第二抗原為選擇欲靶向之細胞群體提供靈活性。如本文所揭示,可藉由其抑制T細胞或B細胞活性或增殖之能力及/或基於其在活體外或在發炎性、過敏性或自體免疫疾病模型中之免疫抑制效應來鑑別其他人類MCT1結合抗體。
可藉由共投與抗原與根據本發明之抗MCT1抗體誘導針對特定抗原之耐受性。舉例而言,可誘導對特定多肽之耐受性。可抑制對過敏原或外源多肽之免疫反應為不期望之免疫反應。舉例而言,接受因子VIII之患者經常產生針對此凝血因子之抗體。根據本發明之抗MCT1抗體與重組因子VIII之共投與可阻抑此不期望之免疫反應。
根據本發明之抗MCT1抗體可與阻斷免疫細胞上之共刺激受體之活性或拮抗免疫細胞上表現之免疫抑制受體或配位體活性之另一劑組合使用來下調免疫反應。例示性分子包括:PD-1、PDL-1促效劑、CTLA-4之可溶形式、抗B7-l抗體、抗B7-2抗體、靶向LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7H3等中之一或多者之拮抗性抗體及/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28、ICOS或VISTA中之一或多者之促效性抗體或其組合。該等部分可組合於單一組合物或化合物中,例如含有根據本發明之抗MCT1抗體且進一步包含免疫促效劑抗體之雙特異性抗體或其可包含含有根據本發明之抗MCT1抗體之融合多肽,其與另一免疫抑制多肽或其他活性劑融合。或者,該等部分可作為分開或離散實體(同時或依序)在相同或不同組合物中投與以下調個體中免疫細胞介導之免疫反應。
可與根據本發明之抗MCT1抗體組合之特定免疫抑制性分子之實例包括阻斷共刺激信號之抗體(例如,針對CD28或ICOS)、經由CTLA4激活抑制性信號之抗體及/或針對其他免疫細胞標記物之抗體(例如,針對CD40、CD40配位體或細胞介素)、融合蛋白(例如,CTLA4-Fc或PD-l-Fc)及免疫抑制藥物(例如,雷帕黴素(rapamycin)、環孢素A或FK506)。
在另一實施例中,含有根據本發明之抗MCT1抗體之雙特異性抗體可用於靶向特定細胞群體,例如使用僅在某一類型之細胞(例如,經活化T細胞或B淋巴球)上發現之標記物。藉由阻斷MCT1下調免疫反應可用於下調(例如)在組織、皮膚及器官移植、移植物抗宿主病(GVHD)或過敏或諸如全身性紅斑狼瘡、IBD、RA、牛皮癬及多發性硬化等自體免疫及發炎性疾病之情形中之免疫反應。舉例而言,阻斷MCT1功能使得組織移植中之組織破壞降低。通常,在組織移植物中,對移植物之排斥係經由免疫細胞將其識別為外源性起始,之後為破壞移植物之免疫反應。在移植之前或在移植時單獨投與抑制免疫細胞上MCT1之分子或連同另一下調劑一起投與可抑制共刺激信號之產生。此外,阻斷MCT1亦可足以使免疫細胞無應答,藉此誘導個體之耐受性。
為在一些疾病或在一些個體中達成足夠之免疫抑制或耐受性,可需要阻斷其他分子之共刺激功能。舉例而言,可期望藉由在移植之前或在移植時投與具有B7-1及B7-2中之每一者之活性的肽組合之可溶性形式或阻斷針對該等抗原之抗體(單獨地或一起於單一組合物中)來阻斷該等抗原之功能。或者,可期望阻斷MCT1且進一步抑制B7-1及/或B7-2之共刺激活性。
本發明抗MCT1抗體尤其可用於治療自體免疫疾病。許多自體免疫病症係免疫細胞不適當活化之結果,該等免疫細胞對自身組織具有反應性且其促進參與疾病病理學之細胞介素及自體抗體之產生。防止自體反應性免疫細胞之活化可降低或消除疾病症狀。投與本發明抗MCT1抗體可誘導自體反應性免疫細胞之抗原特異性耐受性,此可產生疾病之長期緩解。另外,共投與藉由破壞B7分子與共刺激受體之受體-配位體相互作用而阻斷免疫細胞共刺激之劑可用於抑制免疫細胞活化以防止可參與疾病過程之自體抗體或細胞介素之產生。
經由本發明抗MCT1抗體下調免疫反應亦可用於治療對自體組織之自體免疫攻擊。因此,可藉由抑制MCT1改善或改良由自體免疫攻擊引起或加劇之病狀(例如,心臟病、心肌梗塞或動脈粥樣硬化)。因此,藉由使用本發明抗人類MCT1抗體抑制MCT1來調節由自體免疫攻擊加劇之病狀(諸如自體免疫病症(以及諸如心臟病、心肌梗塞及動脈粥樣硬化等病狀))係在本發明之範圍內。
如先前所提及,本發明之抗MCT1抗體預防或緩和自體免疫及發炎性病症之效能可使用多種充分表徵之人類自體免疫及發炎性疾病動物模型來測定。實例包括鼠類實驗性自體免疫腦炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB雜交小鼠之全身性紅斑狼瘡、鼠類自體免疫膠原關節炎、NOD小鼠及BB大鼠之糖尿病及鼠類實驗性重症肌無力。參見Paul編輯,Fundamental Immunology
, Raven Press, New York, 1989,第840-856頁。
抑制免疫細胞活化可在治療上進一步用於治療過敏及過敏反應,例如藉由抑制IgE產生。可向過敏個體投與本發明抗MCT1抗體以抑制該個體中免疫細胞介導之過敏反應。抑制MCT1可伴隨連同適當MHC分子一起暴露於過敏原。過敏反應在本質上可為全身性或局部性的,此取決於過敏原之進入途徑及IgE在肥胖細胞或嗜鹼性球上之沈積模式。因此,藉由投與本發明抗人類MCT1抗體可局部或全身性地抑制免疫細胞介導之過敏反應。
自體免疫、發炎性或過敏性病狀之治療
自體免疫、發炎性或過敏性病狀之治療
根據本發明之抗體、抗體片段及醫藥組合物可用於抑制經活化T細胞或B細胞且治療其在治療上期望之病狀,諸如自體免疫、過敏或發炎性病狀。該等組合物將包含一定量之根據本發明之抗體或抗體片段,其有效阻抑有需要之個體之B細胞活性或T細胞活化或增殖或細胞介素表現。此等自體免疫、發炎性及過敏性病狀包括(例如)關節炎病狀,諸如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬性關節炎、牛皮癬、硬皮症、多發性硬化、狼瘡、IBD、ITP、糖尿病、GvHD、類肉瘤病、過敏性氣喘及肝炎相關肝毒性。該等抗體亦可用於抑制針對移植細胞、組織或器官(諸如組織移植物、CAR-T細胞或含有其之基因療法構築體或細胞及諸如此類)之不期望之T細胞免疫反應。
其中本發明抗體可單獨使用或與其他治療劑、尤其其他免疫抑制劑分子聯合使用之特定病狀包括獲得性免疫缺失症候群(AIDS)、獲得性脾萎縮、急性前眼色素層炎、急性瀰漫性腦脊髓炎(ADEM)、急性痛風性關節炎、急性壞死性出血性白質腦炎、急性或慢性竇炎、急性化膿性腦膜炎(或其他中樞神經系統發炎性病症)、急性重度發炎、艾迪生氏病(Addison's disease)、腎上腺炎、成年發作型糖尿病(II型糖尿病)、成年發作型特發性副甲狀腺低能症(AOIH)、無伽馬球蛋白血症、顆粒球缺乏症、脈管炎(包括血管炎、視情況大血管血管炎、視情況風濕性多肌痛及巨細胞(高安氏(Takayasu))關節炎)、過敏性病狀、過敏性接觸性皮膚炎、過敏性皮膚炎、過敏性肉芽腫性血管炎、過敏性高敏性病症、過敏性神經炎、過敏反應、斑禿、全禿、阿爾波特氏症候群(Alport's syndrome)、肺泡炎(視情況過敏性肺泡炎或纖維化性肺泡炎)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、類澱粉變性、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS;盧賈里格氏病(Lou Gehrig's disease))、嗜酸性球相關病症(視情況嗜酸性球增多症)、過敏反應、關節黏連性脊椎炎、血管擴張、抗體介導之腎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體症候群、抗磷脂質症候群(APS)、口瘡、口瘡口炎、再生不良性貧血、心律不整、動脈硬化、動脈硬化性病症、關節炎(視情況類風濕性關節炎,諸如急性關節炎或慢性類風濕性關節炎、慢性進行性關節炎(arthritis chronica progrediente)、關節炎畸形)、蛔蟲病、麴菌瘤、含嗜酸性球之肉芽腫、麴菌病、無精子發生(aspermiogenese)、氣喘(視情況細支氣管氣喘、支氣管氣喘或自體免疫氣喘)、共濟失調毛細血管擴張、共濟失調性硬化症、動脈粥樣硬化、自閉症、自體免疫性血管性水腫、自體免疫性再生不良性貧血、自體免疫性萎縮性胃炎、自體免疫性糖尿病、睪丸及卵巢之自體免疫疾病(包括自體免疫性睪丸炎及卵巢炎)、與膠原病相關之自體免疫病症、自體免疫性家族性自主神經異常、自體免疫性耳病(視情況自體免疫性內耳病(AGED))、自體免疫性內分泌疾病(包括甲狀腺炎,諸如自體免疫性甲狀腺炎)、自體免疫性腸病變症候群、自體免疫性性腺衰竭、自體免疫性聽力損失、自體免疫性溶血、自體免疫性肝炎、自體免疫性肝臟病症、自體免疫性高脂血症、自體免疫性免疫缺失、自體免疫性內耳病(AIED)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性嗜中性球減少症、自體免疫性胰臟炎、自體免疫性多內分泌腺病變、I型自體免疫性多腺性症候群、自體免疫性視網膜病變、自體免疫性血小板減少紫斑症(ATP)、自體免疫性甲狀腺病、自體免疫性蕁麻疹、自體免疫介導之胃腸疾病、軸突及神經元神經病變、巴婁病(Balo disease)、貝賽特氏病(Behcet's disease)、良性家族性及缺血再灌注損傷、良性淋巴球性血管炎、伯傑氏病(Berger's disease)(IgA腎病變)、飼鳥者肺病、失明、伯克氏病(Boeck's disease)、閉塞性細支氣管炎(非移植)伴NSIP、支氣管炎、支氣管肺炎麴菌病、布魯頓氏症候群(Bruton's syndrome)、大皰性類天疱瘡、卡普蘭氏症候群(Caplan's syndrome)、心肌病、心血管缺血、卡斯爾曼氏症候群(Castleman's syndrome)、乳糜瀉、口炎性腹瀉(麩蛋白腸病變)、腦退化、腦缺血及伴隨血管形成之疾病、查加斯病(Chagas disease)、通道病變(視情況癲癇,CNS之通道病變)、脈絡膜視網膜炎、脈絡膜炎、自體免疫性血液病症、慢性活動性肝炎或自體免疫性慢性活動性肝炎、慢性接觸性皮膚炎、慢性嗜酸性球性肺炎、慢性疲勞症候群、慢性肝炎、慢性過敏性肺炎、慢性發炎性關節炎、慢性發炎性去髓鞘型多發性神經病變(CIDP)、慢性難治性發炎、慢性黏膜皮膚念珠菌病、慢性神經病變(視情況IgM多發性神經病變或IgM介導之神經病變)、慢性阻塞性氣道疾病、慢性肺部發炎性疾病、慢性復發性多灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis))或亞急性甲狀腺炎、查格-施特勞斯症候群(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性類天疱瘡/良性黏膜性類天疱瘡、CNS發炎性病症、CNS血管炎、腹部疾病、寇甘氏症候群(Cogan's syndrome)、冷凝集素病、息肉狀結腸炎、結腸炎(諸如潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、潰瘍性結腸炎(colitis ulcerosa)、膠原性結腸炎)、涉及T細胞浸潤及慢性發炎性反應之病狀、先天性心臟傳導阻滯、先天性風疹感染、庫氏陽性貧血(Coombs positive anemia)、冠狀動脈疾病、柯薩奇病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST症候群(鈣質沈著病、雷諾氏現象(Raynaud's phenomenon))、克隆氏病(Crohn's disease)、冷凝球蛋白血症、庫興氏症候群(Cushing's syndrome)、睫狀體炎(視情況慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或富克氏睫狀體炎(Fuch's cyclitis))、囊性纖維化、細胞介素誘導之毒性、耳聾、退化性關節炎、脫髓鞘病(視情況自體免疫性脫髓鞘病、脫髓鞘性神經病變)、登革熱(dengue)、疱疹樣皮膚炎及異位性皮膚炎、皮膚炎(包括接觸性皮膚炎、皮肌炎、具有急性發炎性組分之皮膚病)、德維克氏病(Devic's disease)(視神經脊髓炎)、糖尿病性大動脈病症、糖尿病性腎病變、糖尿病性視網膜病變、布-戴二氏貧血(Diamond Blackfan anemia)、瀰漫性間質性肺纖維化、擴張性心肌病、盤狀狼瘡、涉及白血球滲出之疾病、德雷斯勒症候群(Dressler's syndrome)、杜普伊特倫攣縮(Dupuytren's contracture)、埃可病毒(echovirus)感染、濕疹(包括過敏性或異位性濕疹)、腦炎(諸如拉斯馬森氏腦炎(Rasmussen's encephalitis)及邊緣性腦炎及/或腦幹腦炎)、腦脊髓炎(視情況過敏性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis或encephalomyelitis allergica)及實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE))、動脈內增生、心內膜炎、內分泌性眼病變、子宮內膜異位症、心內膜心肌纖維化、晶狀體蛋白過敏性眼球陷沒、眼內炎、過敏性腸炎、嗜酸性球增多症-肌痛症候群、嗜酸性球性筋膜炎、流行性角膜結膜炎、獲得性大皰性表皮鬆解症(EBA)、外鞏膜、上鞏膜炎、艾司坦-巴爾病毒感染、持久性隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum)、多形性紅斑、麻風結節性紅斑、結節性紅斑、胎兒紅血球母細胞增多症、食管運動功能障礙、原發性混合冷凝球蛋白血症、篩骨、埃文氏症候群(Evan's syndrome)、實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)、因子VIII缺乏症、農夫肺症、風濕熱(febris rheumatica)、費氏症候群(Felty's syndrome)、纖維肌痛、纖維性肺泡炎、絲蟲病、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、食物中毒、前胃萎縮、巨細胞關節炎(顳關節炎)、巨細胞肝炎、巨細胞多肌痛、腎小球性腎炎、伴有及不伴腎病症候群之腎小球性腎炎(GN)(諸如慢性或急性腎小球性腎炎(例如,原發性GN))、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、痛風性關節炎、顆粒球轉輸相關症候群、肉芽腫病(包括淋巴瘤樣肉芽腫病、肉芽腫病伴多血管炎(GPA)、肉芽腫性眼色素層炎)、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、點滴狀牛皮癬、陣發性血紅素尿症(hemoglobinuria paroxysmatica)、哈-里二氏病(Hamman-Rich's disease)、橋本氏病(Hashimoto's disease)、橋本氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、血色素沈著症、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血(包括自體免疫性溶血性貧血(AIHA)、溶血性貧血、血友病A)、亨-舒二氏紫斑病(Henoch-Schönlein purpura)、妊娠疱疹、人類免疫缺失病毒(HIV)感染、痛覺過敏、伽馬免疫球蛋白過低血症、性腺低能症、副甲狀腺低能症、特發性糖尿病尿崩症、特發性面部麻痹、特發性甲狀腺功能減退症、特發性IgA腎病變、特發性膜性GN或特發性膜性腎病變、特發性腎病症候群、特發性肺纖維化、特發性口炎性腹瀉、特發性血小板減少紫斑症(ITP)、IgA腎病變、IgE介導之疾病(視情況過敏反應及過敏性或異位性鼻炎)、IgG4相關之硬化病、侷限性迴腸炎、免疫複合物性腎炎、與細胞介素及T淋巴球介導之急性及遲發性過敏性相關之免疫反應、免疫介導之GN、免疫調節性脂蛋白(包括成年或急性呼吸窘迫症候群(ARDS))、包涵體肌炎、感染性關節炎、由於抗精子抗體所致之不孕症、眼色素層全部或部分發炎、發炎性腸病(IBD)、發炎性過度增殖性皮膚病、發炎性肌病變、胰島素依賴性糖尿病(1型)、胰島炎、間質性膀胱炎、間質性肺病、間質性肺纖維化、虹膜炎、缺血性再灌注病症、關節發炎、幼年型關節炎、幼年型皮肌炎、幼年型糖尿病、幼發型(I型)糖尿病(包括小兒胰島素依賴性糖尿病(IDDM))、幼發型類風濕性關節炎、川崎症候群(Kawasaki syndrome)、乾性角膜結膜炎、錐蟲病(kypanosomiasis)、蘭伯特-伊頓症候群(Lambert-Eaton syndrome)、利什曼體病(leishmaniasis)、麻風病、白血球減少症、白血球黏著缺乏症、白血球破碎性血管炎、白血球減少症、扁平苔蘚、硬化性苔蘚、木樣結膜炎、線狀IgA皮膚病、線狀IgA病(LAD)、呂弗勒氏症候群(Loffler's syndrome)、類狼瘡性肝炎、狼瘡(包括腎炎、大腦炎、小兒、非腎性、腎外、盤狀、脫髪)、狼瘡(SLE)、播散性紅斑狼瘡、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、萊姆病、淋巴樣間質性肺炎、瘧疾、男性及女性自體免疫性不孕症、上頜中型血管炎(包括川崎病及結節性多動脈炎)、膜性(membrano或membranous)增殖性GN (MPGN)(包括I型及II型以及急進型GN、膜性GN (膜性腎病變))、美尼爾氏病(Meniere's disease)、腦膜炎、顯微鏡性結腸炎、顯微鏡性多血管炎、偏頭痛、微小病變性腎病變、混合結締組織疾病(MCTD)、傳染性單核白血球增多症、蠶蝕性角膜潰瘍(Mooren's ulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多灶性動作神經病變、多內分泌腺衰竭、多器官損傷症候群(諸如繼發於敗血症、創傷或出血之彼等症候群、多器官損傷症候群)、多發性硬化(MS)(諸如脊髓-眼MS、多發性硬化)、腮腺炎、肌肉病症、重症肌無力(諸如胸腺瘤相關之重症肌無力、重症肌無力)、心肌炎、肌炎、嗜睡病、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎及自體免疫性發炎性腸病、壞死性、皮膚性或過敏性血管炎、新生兒狼瘡症候群(NLE)、腎變性病、腎病症候群、神經疾病、視神經脊髓炎(德維克氏病)、視神經脊髓炎、神經性肌強直、嗜中性球減少症、非癌性淋巴球增多症、非肉芽腫性眼色素層炎、非惡性胸腺瘤、眼部及眼眶發炎性病症、眼部瘢痕性類天疱瘡、卵巢炎、交感神經性眼炎(ophthalmia symphatica)、眼球陣攣肌陣攣症候群(OMS)、眼球陣攣或眼球陣攣肌陣攣症候群(OMS)及感覺神經病變、視神經炎、肉芽腫性睪丸鹽、骨關節炎、復發性風濕病、胰臟炎、全部血球減少症、PANDAS (與鏈球菌(Streptococcus)相關之小兒自體免疫性神經精神異常)、伴腫瘤性小腦退化、腫瘤伴生症候群、腫瘤伴生症候群(包括神經病學腫瘤伴生症候群、視情況藍伯-伊頓肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊頓-藍伯症候群)、寄生蟲病(諸如利什曼蟲(Leishmania))、陣發性夜間血紅素尿(PNH)、帕-羅二氏症候群(Parry Romberg syndrome)、睫狀體平坦部炎(外周眼色素層炎)、帕森尼-特納症候群(Parsonnage-Turner syndrome)、小病毒感染、類天疱瘡(諸如大皰性類天疱瘡及皮膚類天疱瘡)、天疱瘡(包括尋常天疱瘡)、紅斑型天疱瘡、落葉型天疱瘡、天疱瘡黏液膜類天疱瘡、天疱瘡、消化性潰瘍、週期性麻痹、外周神經病變、靜脈周腦脊髓炎、惡性貧血(pernicious anemia、anemia perniciosa)、惡性貧血、晶狀體抗原性眼色素層炎、肺硬變症、POEMS症候群、I型、II型及III型結節性多動脈炎、原發性慢性多發性關節炎、多發性軟骨炎(例如,難治性或再發性多發性軟骨炎)、多內分泌腺自體免疫疾病、多內分泌腺衰竭、多腺性症候群(視情況自體免疫性多腺性症候群(或多腺性內分泌病症候群))、風濕性多肌痛、多發性肌炎、多發性肌炎/皮肌炎、多發性神經病變、急性多發性神經根炎、心切開術後症候群、後眼色素層炎或自體免疫性眼色素層炎、心肌梗塞後症候群、心包膜切開術後症候群、鏈球菌後腎炎、疫苗接種後症候群、早老性失智症、原發性膽汁性肝硬化、原發性甲狀腺功能減退症、原發性特發性黏液水腫、原發性淋巴球增多症(其包括單株B細胞淋巴球增多症、視情況良性單株伽馬球蛋白症及意義不明確之單株伽馬球蛋白症)、MGUS、原發性黏液水腫、原發性進行性MS (PPMS)及再發緩解性MS (RRMS)、原發性硬化性膽管炎、助孕酮性皮膚炎、進行性全身性硬化、增殖性關節炎、牛皮癬(諸如斑塊狀牛皮癬、牛皮癬、牛皮癬性關節炎)、肺泡蛋白沈積症、肺嗜酸性球增多性浸潤、純紅血球貧血或發育不全(PRCA)、純紅血球發育不全、化膿性或非化膿性竇炎、膿皰性牛皮癬及指甲牛皮癬、腎盂炎、壞疽性膿皮症、奎汶氏甲狀腺炎(Quervain's thyroiditis)、雷諾氏現象、反應性關節炎、復發性流產、血壓反應降低、反射性交感神經營養不良、難治性口炎性腹瀉、萊特爾氏病或症候群(Reiter's disease or syndrome)、再發性多發性軟骨炎、心肌或其他組織之再灌注損傷、再灌注損傷、呼吸窘迫症候群、不寧腿症候群、視網膜性自體免疫、腹膜後纖維化、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、風濕性疾病、風濕熱、風濕病、類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、德國麻疹病毒感染、塞氏症候群(Sampter's syndrome)、類肉瘤病、血吸蟲病、施密特症候群(Schmidt syndrome)、SCID及艾司坦-巴爾病毒相關疾病、鞏膜、鞏膜炎、指端硬皮症(sclerodactyl)、硬皮症(視情況全身性硬皮症)、硬化性膽管炎、散播性硬化症、硬化(諸如全身性硬化)、感音性聽力損失、血清陰性脊柱關節病、席漢氏症候群(Sheehan's syndrome)、舒爾曼氏症候群(Shulman's syndrome)、矽肺病、薛格連氏症候群(Sjögren’s syndrome)、精子及睪丸自體免疫、蝶竇炎、史蒂芬斯-強森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、僵直人(stiff-man或stiff-person)症候群、亞急性細菌性心內膜炎(SBE)、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、突發性聽力損失、蘇薩克氏症候群(Susac's syndrome)、席登罕氏舞蹈症(Sydenham's chorea)、交感性眼炎、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus (SLE)或systemic lupus erythematode)、皮膚性SLE、全身性壞死性血管炎、ANCA相關之血管炎(視情況查格-施特勞斯血管炎或症候群(CSS))、脊髓癆、高安氏動脈炎、毛細血管擴張、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、血栓閉塞性脈管炎(thromboangiitis ubiterans)、血小板減少症(包括血栓性血小板減少紫斑症(TTP)及自體免疫或免疫介導之血小板減少症(諸如特發性血小板減少紫斑症(ITP),包括慢性或急性ITP)、血小板減少紫斑症(TTP))、甲狀腺毒症、組織損傷、妥洛沙-韓特症候群(Tolosa-Hunt syndrome)、中毒性表皮壞死鬆解、中毒性休克症候群、轉輸反應、嬰兒期短暫性伽馬免疫球蛋白過低血症、橫貫性脊髓炎(transverse myelitis、traverse myelitis)、熱帶肺性嗜酸性球增多症、結核症、潰瘍性結腸炎、未分化結締組織病(UCTD)、蕁麻疹(視情況慢性過敏性蕁麻疹及慢性特發性蕁麻疹,包括慢性自體免疫性蕁麻疹)、眼色素層炎、前眼色素層炎、眼色素層視網膜炎、心瓣炎、血管功能障礙、血管炎、脊椎骨關節炎、囊泡性皮膚病、白斑病、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)(肉芽腫病伴多血管炎(GPA))、維-奧二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)或x連鎖之高IgM症候群。
應理解,本文所鑑別之疾病病狀意欲為例示性且非詳盡的。
根據至少一些實施例,如本文所述之功能在於減少MCT1介導之乳糖轉運之抗MCT1抗體、片段、其結合物或包含其之醫藥組合物可用於治療免疫系統相關疾病。
視情況,該免疫系統相關病狀包含免疫相關病狀、如本文所列舉之自體免疫疾病、狼瘡、移植排斥及移植物抗宿主病及/或用於阻斷經活化T細胞及B細胞、如本文所列舉之免疫相關疾病及/或用於免疫療法(抑制免疫刺激)。
視情況該免疫病狀係係選自自體免疫疾病、移植排斥、發炎性疾病、過敏性病狀或移植物抗宿主病。在特定實施例中,本發明之抗MCT1抗體可用於治療狼瘡。在一個實施例中,本發明之抗MCT1抗體可用於治療移植物抗宿主病(GVHD)。在另一實施例中,本發明之抗MCT1抗體可用於治療移植物排斥。在另一實施例中,本發明之抗MCT1抗體可用於治療I型糖尿病。在一個實施例中,本發明之抗MCT1抗體可用於治療II型糖尿病。在另一實施例中,本發明之抗MCT1抗體可用於治療肥胖症。
在特定實施例中,MCT1 Ab1可用於治療狼瘡。在一個實施例中,MCT1 Ab1可用於治療移植物抗宿主病(GVHD)。在另一實施例中,MCT1 Ab1可用於治療移植物排斥。在另一實施例中,MCT1 Ab1可用於治療I型糖尿病。在一個實施例中,MCT1 Ab1可用於治療II型糖尿病。在另一實施例中,MCT1 Ab1可用於治療肥胖症。同樣地,在該等實施例中之每一者中,可使用包含MCT1 Ab1之一或多個CDR之變異體或融合蛋白。
視情況,將治療與可用於治療免疫相關病狀之另一部分(例如,二甲雙胍)組合。
因此,可將使用本發明抗體對全身性紅斑狼瘡之治療與(例如)視情況如本文所述之用於治療全身性紅斑狼瘡之任何已知治療劑或方法組合。同樣,可將使用本發明抗體對GVHD之治療與(例如)視情況如本文所述之用於治療GVHD之任何已知治療劑或方法組合。可將使用根據本發明之至少一些實施例之劑對多發性硬化之治療與(例如)視情況如本文所述之用於治療多發性硬化之任何已知治療劑或方法組合。類似地,可將使用本發明抗體對類風濕性關節炎或其他關節炎病狀之治療與(例如)視情況如本文所述之用於治療類風濕性關節炎之任何已知治療劑或方法組合。另外,可將使用本發明抗體對1型糖尿病之治療與(例如)視情況如本文所述之用於治療1型糖尿病之任何已知治療劑或方法組合。可將使用本發明抗體對牛皮癬之治療與(例如)視情況如本文所述之用於治療牛皮癬之任何已知治療劑或方法組合。
在上述療法中,例如將向患有上文所提及病狀中之一者或其他自體免疫或發炎性病狀之個體投與本文所揭示之抗MCT1抗體或本發明之抗原結合片段,該抗體阻抑經活化T細胞及/或B細胞及/或參與疾病病理學之促炎性細胞介素之產生,藉此(例如)由於誘導引發T細胞耐受或延長免疫抑制之Treg而預防或改善疾病症狀且潛在地使疾病緩解延長。
如本文所列舉之根據本發明之至少一些實施例之治療劑及/或包含其之醫藥組合物可作為唯一活性成分或與免疫調節方案中之其他藥物或其他抗發炎性劑一起投與,例如用於治療或預防同種異體移植物或異種移植物急性或慢性排斥或發炎性或自體免疫病症或誘導耐受性。
癌症之治療
癌症之治療
可治療之癌症包括未血管化或尚未實質上血管化以及血管化之腫瘤。該等癌症可包含非實體腫瘤(諸如血液腫瘤,例如白血病及淋巴瘤)或可包含實體腫瘤。欲利用本發明之抗體治療之癌症類型包括(但不限於)癌瘤、胚細胞瘤及肉瘤以及某些白血病或淋巴樣惡性病、良性及惡性腫瘤以及惡性病,例如肉瘤、癌及黑色素瘤。亦包括成年腫瘤/癌症及兒科腫瘤/癌症。
血液學癌症係血液或骨髓之癌症。血液學(或血原性)癌症之實例包括白血病,包括急性白血病(諸如急性淋巴球性白血病、急性骨髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病及骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅血球性白血病)、慢性白血病(諸如慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴球性白血病)、真性多血症、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性及高級形式)、多發性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈病、骨髓發育不良症候群、毛細胞白血病及骨髓發育不良。
實體腫瘤係通常不含囊腫或液體區域之異常組織腫塊。實體腫瘤可為良性或惡性。針對形成實體腫瘤之細胞之類型對不同類型實體腫瘤進行命名(諸如肉瘤、癌及淋巴瘤)。實體腫瘤(諸如肉瘤及癌)之實例包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤恩氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性病、胰臟癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤及CNS腫瘤(諸如神經膠質瘤(諸如腦幹神經膠質瘤及混合型神經膠質瘤)、神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤)星細胞瘤、CNS淋巴瘤、胚細胞瘤、髓母細胞瘤、許旺氏細胞瘤(Schwannoma)、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦脊髓膜瘤、神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤及腦轉移)。
較佳地,本發明之抗體用於治療癌症,其中腫瘤細胞對MCT1之表現呈陽性。一般而言,可經由已知方法鑑別MCT1陽性腫瘤細胞。舉例而言,腫瘤細胞上之MCT1表現可使用本發明之抗體經由免疫螢光或流式細胞術來鑑別。或者,可經由觀察本發明抗體針對靶細胞之抑制來功能性地量測MCT1表現。
生檢係自個體移除組織及/或細胞。此移除可係自個體收集組織及/或細胞以對所移除之組織及/或細胞實施實驗。此實驗可包括確定個體是否患有及/或遭受某一病狀或疾病狀態之實驗。該病狀或疾病可係(例如)癌症。關於偵測宿主中MCT1表現腫瘤細胞之存在,包含宿主細胞之樣品可係包含全細胞、其溶解物或全細胞溶解物之一部分(例如細胞核或細胞質部分、全蛋白部分或核酸部分)之樣品。若樣品包含全細胞,則細胞可係宿主之任何細胞,例如任一器官或組織之細胞,包括血球或內皮細胞。
其他MCT1相關病狀(例如EIHI)之治療
其他MCT1相關病狀(例如EIHI)之治療
本發明之抗體及抗體片段亦可用於治療、預防或診斷涉及健康或患病細胞中之MCT1表現之任何其他病狀、病症或疾病。舉例而言,本發明亦涵蓋治療或預防個體EIHI之方法,該方法包括投與本發明之抗體或抗體片段。
投與模式
投與模式
本發明之組合物可以多種方式投與,此取決於期望局部抑或全身性治療。
一般而言,投與可為經表面、非經腸或經腸。
本發明之組合物通常適於非經腸投與。如本文所用,醫藥組合物之「非經腸投與」包括特徵在於以下之任一投與途徑:物理破壞個體之組織且經由該組織中之破口投與該醫藥組合物,由此通常使得直接投與至血流中、肌肉中或內臟中。因此,非經腸投與包括(但不限於)藉由注射組合物、藉由經由手術切口施加組合物、藉由經由穿透組織之非手術傷口施加組合物及諸如此類投與醫藥組合物。特定而言,預期非經腸投與包括(但不限於)皮下、腹膜內、肌內、胸骨內、靜脈內、動脈內、鞘內、室內、尿道內、顱內、腫瘤內、滑膜內注射或輸注;及腎透析輸注技術。在較佳實施例中,本發明組合物之非經腸投與包含皮下或腹膜內投與。
適於非經腸投與之醫藥組合物之調配物通常包含與醫藥學上可接受之載劑(諸如無菌水或無菌等滲鹽水)組合之活性成分。此等調配物可以適於推注投與或適於連續投與之形式製備、包裝或出售。可注射調配物可以單位劑型(諸如於安瓿中或於含有防腐劑之多劑量容器中)製備、包裝或出售。用於非經腸投與之調配物包括(但不限於)於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液、乳液、糊劑及諸如此類。此等調配物可進一步包含一或多種其他成分,包括(但不限於)懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用於非經腸投與之調配物之一個實施例中,以乾燥(亦即粉末或顆粒)形式提供活性成分以用於與適宜媒劑(例如無菌無熱原水)重構,之後非經腸投與重構組合物。非經腸調配物亦包括水溶液,其可含有諸如鹽、碳水化合物及緩衝劑(例如,至pH為3至9)等賦形劑,但對於一些應用,其可更適宜地調配為無菌非水溶液或調配為連同適宜媒劑(諸如無菌無熱原水)一起使用之乾燥形式。例示性非經腸投與形式包括於無菌水溶液中之溶液或懸浮液,例如丙二醇或右旋糖水溶液。若期望,則可適宜地緩衝此等劑型。可用之可非經腸投與之其他調配物包括包含呈微晶形式或於脂質體製劑中之活性成分之彼等調配物。用於非經腸投與之調配物可經調配以直接釋放及/或以改良方式釋放。以改良方式釋放之調配物包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、受控釋放、靶向釋放及程式性釋放。
術語「經口」、「經腸(enteral)」、「經腸方式(enterally)」、「經口方式」、「經腸(non-parenteral)」、「經腸方式(non-parenterally)」及諸如此類係指藉由沿消化道之途徑或模式向個體投與化合物或組合物。投與組合物之「經口」途徑之實例包括(但不限於)自口吞咽組合物之液體或固體形式、經由鼻空腸管或胃造口術管投與組合物、十二指腸內投與組合物及經直腸投與,例如使用栓劑用於消化道之下部腸道。
較佳地,包含經分離之抗MCT1抗體或抗體片段之經調配組合物適於經由注射投與。
用於經表面投與之醫藥組合物及調配物可包括經皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體、半固體、單相組合物、多相組合物(例如,水包油、油包水)、泡沫、微型海綿、脂質體、奈米乳液、氣溶膠泡沫、聚合物、富勒烯(fullerene)及粉末。可需要或期望習用醫藥載劑、水性、粉末或油性基質、增稠劑及諸如此類。
用於經口投與之組合物及調配物包括粉末或顆粒、於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、小藥囊或錠劑。可期望增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。
用於非經腸、鞘內或室內投與之組合物及調配物可包括無菌水溶液,其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜添加劑,諸如(但不限於)滲透促進劑、載體化合物(carder compound)及其他醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
本發明之醫藥組合物包括(但不限於)溶液、乳液及含有脂質體之調配物。該等組合物可自多種組分產生,該多種組分包括(但不限於)預先形成之液體、自乳化固體及自乳化半固體。
可便捷地以單位劑型呈現之本發明之醫藥調配物可根據醫藥工業中眾所周知之習用技術來製備。此等技術包括使活性成分與一或多種醫藥載劑或賦形劑締合之步驟。一般而言,調配物係藉由使活性成分與液體載劑或微細固體載劑或二者均勻且充分締合且接著(若需要)使該產物成型來製備。
本發明之組合物可調配成多種可能劑型中之任一者,諸如(但不限於)錠劑、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑、氣溶膠及灌腸劑。本發明之組合物亦可調配為於水性、非水性或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加懸浮液黏度之物質,包括(例如)羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
在本發明之一個實施例中,醫藥組合物可調配為泡沫且作為泡沫使用。醫藥泡沫包括諸如(但不限於)乳液、微乳液、乳霜、凝膠劑及脂質體等調配物。雖然在本質上基本類似,但該等調配物在組分及最終產物之稠度方面有所不同。在細胞層面上增強寡核苷酸攝取之劑亦可添加至本發明之醫藥組合物及其他組合物。舉例而言,陽離子脂質(諸如lipofectin (美國專利第5,705,188號))、陽離子甘油衍生物及多陽離子分子(諸如多離胺酸(WO 97/30731))亦增強寡核苷酸之細胞攝取。
本發明之組合物可另外含有通常見於醫藥組合物中之其他附加劑組分。因此,舉例而言,組合物可含有其他相容性、醫藥活性材料,例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗發炎劑,或可含有可用於物理調配本發明組合物之各種劑型之其他材料,諸如染料、矯味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及穩定劑。然而,此等材料在添加時不應過度地干擾本發明組合物之各組分之生物活性。可將調配物滅菌,且若期望,則與不與調配物之一或多種核酸有害地相互作用之輔助劑混合,該等輔助劑係例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、矯味劑及/或芳香族物質及諸如此類。
包含抗MCT1抗體或其抗原結合片段之調配物可包括一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。端視於(例如)抗體及投與模式而定,調配物中所包括之賦形劑將具有不同目的。通常所使用之賦形劑之實例包括(但不限於):鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其組合、穩定劑、增溶劑及表面活性劑、緩衝劑及防腐劑、張力劑、增積劑及潤滑劑。包含抗MCT1抗體之調配物通常將在不存在任何非人類組分(諸如動物血清(例如,牛血清白蛋白))下製備且培養。
調配物或組合物亦可含有一種以上活性成分,該(等)活性成分可用於利用結合分子或細胞治療之特定適應症、疾病或病狀,例如與結合分子或細胞具有互補活性之彼等活性成分,其中各別活性不有害地影響彼此。此等活性成分適宜以對預期目的有效之量以組合形式存在。因此,在一些實施例中,醫藥組合物進一步包括其他醫藥活性劑或藥物(諸如化學治療劑),例如天冬醯胺酶、白消安、卡鉑(carboplatin)、順鉑、道諾黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、胺甲喋呤、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春鹼、長春新鹼等。在一些實施例中,醫藥活性劑或藥物可包含免疫檢查點抑制劑,例如靶向PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、KIR、CD244、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、TIM3及/或A2aR之藥物。該等抑制劑之實例包括(但不限於)匹利珠單抗(pidilizumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、MDX-1105、BMS-936559、MEDI4736、MPDL3280A、MSB0010718C、曲美目單抗(tremelimumab)及伊匹單抗(ipilimumab),其可單獨投與或與其他劑(例如,GM-CSF)組合投與。
抗體可與其他治療劑組合,該等其他治療劑可在相同或不同組合物中在相同或不同時間且按任意順序投與。舉例而言,本發明抗體可以包括投與以下各項之治療方案投與:PD-1或PD-L1促效劑、CTLA4-Ig、細胞介素、細胞介素促效劑或拮抗劑或另一受體促效劑或拮抗劑。
在一些態樣中,醫藥組合物可採用定時釋放、延遲釋放及持續釋放遞送系統,從而使得組合物之遞送在欲治療部位敏化之前發生且具有足夠時間引起欲治療部位之敏化。許多類型之釋放遞送系統可獲得且已知。此等系統可避免組合物之重複投與,藉此增加對個體及醫師之便捷性。
投藥
投藥
在一些實施例中,醫藥組合物含有有效治療或預防疾病或病狀之量(諸如治療有效或預防有效量)之抗MCT1抗體或抗體片段。在一些實施例中,藉由定期評價所治療個體來監測治療性或預防性效能。對於經若干天或更久之重複投與而言,端視於病狀而定,重複治療直至疾病症狀出現期望阻抑為止。然而,可使用且可確定其他劑量方案。可藉由單次推注投與組合物、藉由多次推注投與組合物或藉由連續輸注投與組合物來遞送期望劑量。
抗體或抗體片段可以一或多個劑量投與。在一些實施例中,該等有效量之抗體可作為單次劑量投與。在一些實施例中,該等有效量之抗體可作為一次以上劑量經一段時間投與。投與之定時由管控醫師來判斷且取決於患者之臨床狀況。儘管個體需求各不相同,但針對特定疾病或病狀之給定抗體之有效量的最佳範圍之確定為熟習此項技術者所熟知。有效量意指提供治療性或預防性益處之量。所投與劑量將取決於接受者之年齡、健康狀況及體重、並行治療(若存在)之種類、治療頻率及所期望效應之性質。在一些實施例中,有效量之抗體或包含彼等抗體之組合物係以非經腸方式投與。在一些實施例中,投與可為靜脈內投與。在一些實施例中,可藉由在疾病部位內注射直接進行投與。
出於本發明之目的,所投與本發明抗體之量或劑量應足以在合理時間範圍內於個體或動物中產生治療性或預防性反應。舉例而言,本發明抗體之劑量應足以結合至抗原,或在自投與時約2小時或更久(例如,約12小時至約24小時或更多小時)之時間段內偵測、治療或預防疾病。在某些實施例中,該時間段可甚至更長。劑量將取決於特定抗體之效能及動物(例如,人類)之病狀以及欲治療動物(例如,人類)之體重。
可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分之量將端視於所治療之個體及具體投與模式而變。可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分之量通常將為產生治療效應之組合物的量。通常,以100%計,此量將在約0.01%至約99%之活性成分範圍內,例如約0.1%至約70%、大多數例如約1%至約30%之活性成分與醫藥學上可接受之載劑之組合。
對劑量方案進行調整以提供最佳期望反應(例如,治療反應)。舉例而言,可投與單次推注,可隨時間投與若干個分次劑量或可根據治療狀況之緊急程度所指示按比例降低或增加劑量。尤其有利的係將非經腸組合物調配成劑量單位形式以便於投與及劑量均勻性。如本文所用之劑量單位形式係指適於作為單位劑量供欲治療個體使用之物理離散單元;每一單元含有預定量之活性化合物,此預定量經計算與所需醫藥載劑一起產生期望治療效應。根據本發明之至少一些實施例之劑量單位形式之規格依賴於且直接取決於以下因素:(a) 活性化合物之獨特特性及欲達成之特定治療效應,及(b) 複合此一活性化合物以治療個體敏感性之技術中所固有之限制條件。
對於本文所揭示之抗MCT1抗體或其抗原結合片段之投與,劑量係在約0.0001 mg/kg至100 mg/kg、且更通常0.01 mg/kg至5 mg/kg宿主體重範圍內。舉例而言,劑量可為0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1 mg/kg-10 mg/kg範圍內。例示性治療方案需要每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每3至6個月一次投與。根據本發明之至少一些實施例之本文所揭示抗體之較佳劑量方案包括經由靜脈內投與1 mg/kg體重或3 mg/kg體重,其中本文所揭示抗體係使用以下投藥時間表中之一者給予:(i) 每四週共六個劑量,接著每三個月;(ii) 每三週;(iii) 3 mg/kg體重一次,之後每三週1 mg/kg體重。
在一些方法中,同時投與兩種或更多種具有不同結合特異性之單株抗體,在該情形下所投與之每一本文所揭示抗體之劑量係在所指示範圍內。本文所揭示抗體通常投與多次。單一劑量之間的間隔可為(例如)每天、每週、每月、每三個月或每年。間隔亦可如藉由量測患者之針對靶抗原之抗體血液水準所指示而不規則。在一些方法中,對劑量進行調整以達成約1 μg/ml-1000 µg/ml且在一些方法中約25 μg/ml-300 µg/ml之血漿抗體濃度。
或者,治療劑可作為持續釋放調配物來投與,在該情形下需要較不頻繁之投與。劑量及頻率端視於治療劑在患者中之半衰期而變化。一般而言,人類抗體顯示最長半衰期,其次為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。融合蛋白之半衰期可廣泛變化。投與劑量及頻率可端視於治療為預防性抑或治療性而變化。在預防性應用中,以相對較不頻繁之間隔經較長時間段投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中,有時需要相對較短間隔之相對較高之劑量直至疾病進展減輕或終止為止,且例如直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善為止。此後,可向患者投與預防性方案。
可改變本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量水準,以獲得對於特定患者、組合物及投與模式有效達成期望治療反應而對患者無毒性之活性成分量。所選劑量水準將端視於多種藥物動力學因素而定,該等因素包括所用本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康情況及先前病史及已為醫學領域中所眾所周知之類似因素。
在一些實施例中,抗體係作為組合治療之一部分投與,諸如與另一治療性干預(諸如另一抗體或經改造細胞或受體或劑(諸如細胞毒性或治療劑))同時或以任一順序依序投與。在一些實施例中,使抗體與一或多種其他治療劑共投與或連同另一治療性干預一起同時或以任一順序依序共投與。在一些情形下,使抗體與在時間上充分接近之另一療法共投與,從而使得該等抗體增強一或多種其他治療劑之效應或反之亦然。在一些實施例中,抗體係在一或多種其他治療劑之前投與。在一些實施例中,抗體係在一或多種其他治療劑之後投與。
變化形式
變化形式
本發明之範圍內包括本文所述本發明抗體之功能部分。術語「功能部分」在涉及抗體使用時係指本發明抗體之任一部分或片段,該部分或片段保留產生該部分之抗體(親代抗體)之生物活性。功能部分涵蓋(例如)與親代抗體相比在類似程度、相同程度或更高程度上保留識別靶細胞或偵測、治療或預防疾病之能力的抗體之彼等部分。參照親代抗體,功能部分可構成(例如)親代抗體之約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多。
功能部分可在該部分之胺基或羧基末端處或在兩個末端處包含其他胺基酸,該等其他胺基酸並未發現於親代抗體之胺基酸序列中。期望地,其他胺基酸並不干擾功能部分之生物功能,例如識別靶細胞、偵測癌症、治療或預防癌症等。更期望地,與親代抗體之生物活性相比,其他胺基酸增強生物活性。
本發明之範圍內包括本文所述本發明抗體之功能變異體。如本文所用之術語「功能變異體」係指與親代抗體具有實質性或顯著序列一致性或類似性之抗體、多肽或蛋白質,該功能變異體保留產生該變異體之抗體之生物活性。功能變異體涵蓋(例如)與親代抗體相比在類似程度、相同程度或更高程度上保留識別靶細胞能力之本文所述抗體(親代抗體)之彼等變異體。參照親代抗體,功能變異體在胺基酸序列上可與親代抗體(例如)至少約30%、50%、75%、80%、90%、98%或更高程度一致。
功能變異體可(例如)包含具有至少一個保守胺基酸取代之親代抗體之胺基酸序列。或者或另外,功能變異體可包含具有至少一個非保守胺基酸取代之親代抗體之胺基酸序列。在此情形中,非保守胺基酸取代較佳不干擾或抑制功能變異體之生物活性。非保守胺基酸取代可增強功能變異體之生物活性,從而使得與親代抗體相比,功能變異體之生物活性增加。
本發明抗體之胺基酸取代係(例如)保守胺基酸取代。保守胺基酸取代為此項技術中所已知,且包括其中具有某些物理及/或化學性質之一種胺基酸交換為具有相同或相似化學或物理性質之另一胺基酸之胺基酸取代。舉例而言,保守胺基酸取代可為酸性/帶負電荷之極性胺基酸取代另一酸性/帶負電荷之極性胺基酸(例如,Asp或Glu)、具有非極性側鏈之胺基酸取代另一具有非極性側鏈之胺基酸(例如,Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、鹼性/帶正電荷之極性胺基酸取代另一鹼性/帶正電荷之極性胺基酸(例如Lys、His、Arg等)、具有極性側鏈之不帶電胺基酸取代另一具有極性側鏈之不帶電胺基酸(例如,Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β具支側鏈之胺基酸取代另一具有β具支側鏈之胺基酸(例如,Ile、Thr及Val)、具有芳香族側鏈之胺基酸取代另一具有芳香族側鏈之胺基酸(例如,His、Phe、Trp及Tyr)等。
此外,可基於載體設計自序列添加或去除胺基酸。
抗體可基本上由指定胺基酸序列或本文所述之序列組成,從而使得其他組分(例如,其他胺基酸)不會實質上改變功能變異體之生物活性。
本發明實施例之抗體(包括功能部分及功能變異體)可具有任一長度,亦即可包含任一數量之胺基酸,條件係該等抗體(或其功能部分或功能變異體)保留其生物活性(例如能夠特異性結合至抗原、偵測哺乳動物中之患病細胞或治療或預防哺乳動物之疾病等)。舉例而言,抗體之長度可為約50至約5000個胺基酸,諸如長度為50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個胺基酸。
本發明實施例之抗體(包括本發明之功能部分及功能變異體)可包含合成胺基酸來代替一或多種天然胺基酸。此等合成胺基酸為此項技術中所已知,且包括(例如)胺基環己烷甲酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯基胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-羥脯胺酸及反式-4-羥脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、4-羧基苯丙胺酸、β-苯基絲胺酸-β-羥基苯丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-苄基-N'-甲基-離胺酸、N',N'-二苄基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷甲酸、α-胺基環己烷甲酸、α-胺基環庚烷甲酸、α-(2-胺基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸及α-第三丁基甘胺酸。
本發明實施例之抗體(包括功能部分及功能變異體)可經由(例如)二硫橋發生醣基化、醯胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-醯化、環化,或轉化成酸加成鹽及/或視情況發生二聚合或聚合或結合。
本發明實施例之抗體(包括其功能部分及功能變異體)可藉由此項技術中已知之方法來獲得。該等抗體可藉由製備多肽或蛋白質之任一適宜方法來製得。重新合成多肽及蛋白質之適宜方法闡述於諸如以下等參考文獻中:Chan等人,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis
, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000;Peptide and Protein Drug Analysis
,編輯Reid, R.,Marcel Dekker, Inc., 2000;Epitope Mapping
,編輯Westwood等人,Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001;及美國專利第5,449,752號。此外,可使用標準重組方法使用本文所述核酸重組產生多肽及蛋白質。參見例如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual
,第3版,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001;及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology
, Greene Publishing Associates及John Wiley & Sons, N Y, 1994。此外,一些本發明之抗體(包括其功能部分及功能變異體)可自諸如植物、細菌、昆蟲、哺乳動物(例如,大鼠、人類等)之來源分離及/或純化。分離及純化方法為此項技術中所眾所周知。或者,本文所述之抗體(包括其功能部分及功能變異體)可由公司商業合成。就此而言,本發明抗體可為合成的、重組的、經分離及/或經純化的。
可藉由修飾VH
及/或VL
序列或其所連接之一或多個恆定區使用本文所揭示之具有VH
及VL
序列之抗體來產生新的變異體抗體。因此,使用本發明之變異體抗體之結構特徵來產生結構上相關之變異體抗體,該等結構上相關之變異體抗體保留本發明抗體之至少一種功能性質(諸如結合至MCT1)。舉例而言,一種抗MCT1變異體抗體(例如,Ab1至Ab95中之一者或其突變)之一或多個CDR區可與已知框架區及/或其他CDR重組組合,以產生如本文所論述之其他經重組改造之本發明之抗MCT1抗體(例如,結合至MCT1之抗體)。用於改造方法之起始材料可係本文所提供VH
及/或VL
序列中之一或多者或其一或多個CDR區。為產生經改造之抗體,實際上無需製備(亦即,表現為蛋白質)具有本文所提供VH
及/或VL
序列中之一或多者或其一或多個CDR區之抗體。而是,使用該(等)序列中所含之資訊作為起始材料以產生源自一或多種原始序列之一或多種「第二代」序列,且接著製備該(等)「第二代」序列且表現為蛋白質。可使用標準分子生物學技術來製備且表現經改變之抗體序列。
由一或多種經改變之抗體序列編碼之抗體可保留由本文所提供之方法產生且具有本文所提供序列之抗MCT1抗體之一種、一些或全部功能性質,該等功能性質包括以特定或更小之KD
水準結合至變異體MCT1或變異體MCT1結合物及/或調節免疫細胞活性及/或選擇性地結合至期望靶細胞(例如活性T細胞或B細胞)。可使用此項技術中可用及/或本文所述之標準分析來評價經改變抗體之功能性質。
突變可與抗MCT1抗體編碼序列之全部或一部分一起隨機或選擇性地引入,且可針對結合活性及/或其他期望功能性質來篩選所得經修飾抗MCT1抗體。
定義
定義
除非另有定義,否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之彼等含義。儘管與本文所述之彼等方法及材料類似或等效之方法及材料可用於本發明中或測試本發明,但本文闡述適宜方法及材料。該等材料、方法及實例僅具有說明性,且不意欲具有限制性。與本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學相關利用之命名及其實驗室程序及技術為此項技術中所眾所周知且常用之彼等命名及其實驗室程序及技術。可針對化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者治療使用標準技術。
如本文所用,「5'帽」(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7
G帽)係在轉錄起始後不久即添加至真核信使RNA之「前面」或5'端之經修飾鳥嘌呤核苷酸。5'帽係由連接至第一個轉錄核苷酸之末端基團組成。其存在對於核糖體之識別及針對RNA酶之保護至關重要。帽添加與轉錄偶合且以共轉錄方式發生,從而使得其相互影響。轉錄起始後不久,所合成mRNA之5'端藉由與RNA聚合酶締合之帽合成複合物結合。此酶促複合物催化為mRNA加帽所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應進行。加帽部分可經修飾以調節mRNA之功能,諸如其穩定性或轉譯效率。
如本文說明及貫穿以下申請專利範圍中所用,除非上下文另外明確指明,否則「一(a、an)」及「該」之含義包括複數個指示物。
如本文所用,「過敏性疾病」泛指涉及過敏反應之疾病。更具體而言,「過敏性疾病」定義為已鑑別出其過敏原之疾病,其中在暴露於該過敏原與發生病理變化之間存在強相關性,且其中已證明該病理變化具有免疫機制。在本文中,免疫機制意指白血球顯示對過敏原刺激之免疫反應。
術語「同種異體」或「供體源」係指源自與材料欲引入之個體同一物種之不同動物之任何材料。當一或多個基因座處之基因不同時,認為兩個或更多個個體互為同種異體。在一些態樣中,來自同一物種之個體之同種異體材料可在遺傳學上足夠不同以在抗原上相互作用。
如本文所用,「胺基酸」泛指天然及合成胺基酸以及以類似於天然胺基酸之方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係由遺傳密碼所編碼之彼等胺基酸,以及經稍後修飾之彼等胺基酸(例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷絲胺酸)。胺基酸類似物係指具有與天然胺基酸相同之基本化學結構(亦即,α碳結合至氫、羧基、胺基)及R基團之化合物(例如,高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶)。類似物可具有經修飾之R基團(例如,正白胺酸)或經修飾之肽主鏈,但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構,但以類似於天然胺基酸之方式起作用之化合物。
如本文所用,術語「抗體」係指與抗原特異性結合之免疫球蛋白分子。在一態樣中,抗原係MCT1。抗體可係源自天然來源或源自重組來源之完整免疫球蛋白,且可係完整免疫球蛋白之免疫反應性部分。該術語係以最廣泛意義使用且包括多株及單株抗體,包括完整抗體及功能性(抗原結合)抗體片段(包括片段抗原結合(Fab)片段、F(ab')2
片段、Fab'片段、Fv片段、重組IgG (rIgG)片段)、單鏈抗體片段(包括單鏈可變片段(scFv))、ByTE、多特異性抗體多肽、雙價抗體及單一結構域抗體(例如,sdAb、sdFv、奈米抗體)片段。該術語涵蓋免疫球蛋白之經遺傳改造及/或以其他方式修飾之形式,諸如內抗體、肽體、嵌合抗體、全人類抗體、人類化抗體及異源結合抗體、多特異性抗體(例如,雙特異性抗體、雙價抗體、三價抗體及四價抗體、串聯二-scFv及串聯三-scFv)。除非另有說明,否則術語「抗體」應進一步理解為涵蓋其功能性抗體片段。該術語亦涵蓋完整或全長抗體,包括任一類別或亞類之抗體,包括IgG及其亞類IgM、IgE、IgA及IgD。
術語「抗原結合片段」或「抗體片段」係指完整抗體之一部分且係指完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括(但不限於)片段抗原結合(Fab)片段、F(ab')2
片段、Fab'片段、Fv片段、重組IgG (rIgG)片段、單鏈抗體片段(包括單鏈可變片段(scFv))、單一結構域抗體(例如,sdAb、sdFv、奈米抗體)片段、雙價抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。此外,儘管Fv片段之兩個結構域(VL
及VH
)係由單獨基因編碼,但可使用重組方法藉由合成連接體使該兩個結構域連結在一起,該合成連接體使該兩個結構域能夠製備為其中VL
與VH
區配對以形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv (scFv)。參見例如Bird等人(1988)Science
242: 423-426;Huston等人(1988)Proc Natl. Acad. Sci. USA
85: 5879-5883;及Osbourn等人(1998)Nat. Biotechnol.
16: 778。單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內。特定scFv之任何VH
及VL
序列可連接至人類免疫球蛋白恆定區cDNA或基因體序列,以產生編碼完整IgG分子或其他同型之表現載體。VH
及VL
亦可用於使用蛋白質化學或重組DNA技術產生免疫球蛋白之Fab、Fv或其他片段。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式,諸如雙價抗體。雙價抗體係二價、雙特異性抗體,其中VH
及VL
結構域表現於單一多肽鏈上,但所用連接體過短而使同一鏈上之兩個結構域之間無法配對,藉此迫使該等結構域與另一鏈上之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。參見例如Holliger等人(1993)Proc Natl. Acad. Sci. USA
90: 6444-6448;Poljak等人(1994)Structure 2
: 1121-1123。此外,抗體或其抗原結合部分(抗原結合片段、抗體片段、抗體部分)可為較大免疫黏著分子之一部分,其係藉由將抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽共價或非共價締合來形成。免疫黏著分子之實例包括使用鏈黴抗生物素蛋白核心區來製造四聚scFv分子(Kipriyanov等人(1995) Hum.Antibodies Hybridomas
6: 93-101),及使用半胱胺酸殘基、標記物肽及C末端多組胺酸標籤來製造二價且生物素化之scFv分子。Kipriyanov等人(1994)Mol. Immunol
. 31: 1047-1058。諸如Fab及F(ab')2片段等抗體部分可使用習用技術自全抗體製備,諸如全抗體之分別木瓜酶或胃蛋白酶消化。此外,抗體、抗體部分及免疫黏著分子可使用如本文所述之標準重組DNA技術來獲得。抗體可為多株、單株、異種、同種異體、同基因的或其經修飾形式,例如人類化、嵌合、雙特異性或多特異性抗體。
如本文所用,「抗體重鏈」係指以其天然構形存在於所有抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較大者。
如本文所用,「抗體輕鏈」係指以其天然構形存在於所有抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。κ及λ輕鏈係指兩種主要之抗體輕鏈同型。如本文所用,術語「合成抗體」意指使用重組DNA技術產生之抗體,例如由如本文所述之噬菌體表現之抗體。該術語亦應解釋為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子產生且該DNA分子表現抗體蛋白質或指定該抗體之胺基酸序列的抗體,其中DNA或胺基酸序列已使用此項技術中可用且眾所周知之合成DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引發免疫反應之分子,例如在(體液性)自體免疫情形下之自體抗原或在移植情形下之同種異體抗原或在過敏性病狀情形下之過敏原。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或二者均有。熟習此項技術者將理解,包括幾乎所有蛋白質或肽在內之任何大分子均可用作抗原。此外,抗原可源自重組或基因體DNA。熟習此項技術者將理解,包含編碼引發免疫反應之蛋白質之核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因此編碼「抗原」(在該術語用於本文中時)。此外,熟習此項技術者將理解,抗原無需僅由基因之全長核苷酸序列編碼。容易地明瞭,本發明包括(但不限於)使用一個以上基因之部分核苷酸序列及該等核苷酸序列係以各種組合排列以編碼引發期望免疫反應之多肽。此外,熟習此項技術者將理解抗原完全不必由「基因」編碼。容易地明瞭,抗原可產生、合成或可源自生物樣品,或可為除多肽外之大分子。此一生物樣品可包括(但不限於)組織樣品、腫瘤樣品、細胞或含有其他生物組分之流體。在一態樣中,抗原係MCT1。
如本文所用,「自體免疫」或「自體免疫疾病或病狀」泛指源於且針對個體自身組織之疾病或病症或其共分離或表現或其引起之病狀。在本文中,自體免疫病狀包括發炎性或過敏性病狀,例如特徵在於針對潛在地與組織破壞相關之自體抗原之宿主免疫反應之慢性疾病,諸如類風濕性關節炎。
術語「自體」係指源自同一個體且後來再引入該個體中之任何材料。
「AZ3965」在本文中用於共同地指AZ3965及其具有相同結合親和力、PK及MCT1/2選擇性之類似物。(參考文獻50)
術語「結合」係指兩個分子之間的具吸引力之相互作用,其產生其中分子彼此緊密靠近之穩定締合。分子結合之結果有時為分子複合物之形成,其中將組分保持在一起之吸引力通常係非共價的,且因此通常在能量上弱於共價鍵。
如本文所用,「癌症」泛指特徵在於異常及不受控之細胞分裂,從而引起惡性生長或腫瘤(例如,不受調控之細胞生長)之任何贅瘤性疾病(無論其為侵襲性抑或轉移性)。如本文所用,術語「癌症」或「癌性」應理解為涵蓋特徵在於異常及不受控之細胞分裂,從而引起惡性生長或腫瘤之任何贅瘤性疾病(無論其為侵襲性、非侵襲性或轉移性),其非限制性實例闡述於本文中。此包括通常特徵在於不受調控之細胞生長之哺乳動物之任何生理病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。此等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric cancer或stomach cancer)(包括胃腸癌)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer或renal cancer)、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及各種類型之頭頸癌以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL);小淋巴球性(SL) NHL;中級/濾泡性NHL;中級瀰漫性NHL;高級免疫母細胞性NHL;高級淋巴母細胞性NHL;高級非裂解小細胞NHL;巨大疾病NHL;外套細胞淋巴瘤;AIDS相關淋巴瘤;及瓦登斯特隆巨球蛋白血症);慢性淋巴球性白血病(CLL);急性淋巴母細胞性白血病(ALL);毛細胞白血病;慢性骨髓母細胞性白血病;多發性骨髓瘤及移植後淋巴增殖性病症(PTLD)。適於藉由本發明治療之其他癌症包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴樣惡性病。適於由本發明治療之癌性病狀包括表現MCT1之癌症。
如本文所用,「互補決定區」、「超變區」或「CDR」泛指在抗體之輕鏈或重鏈可變區中所發現之超變或互補決定區(CDR)中之一或多者。參見Kabat等人(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health
, Bethesda, Md。該等表述包括如Kabat等人(1983) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept. of Health and Human Services所定義之超變區或抗體3維結構中之超變環。Chothia及Lesk (1987)J. Mol. Biol.
196: 901-917。每一鏈中之CDR藉由框架區保持緊密靠近,且與來自另一鏈之CDR一起促成抗原結合位點之形成。在CDR內,存在描述為選擇性決定區(SDR)之選擇胺基酸,其代表CDR在抗體-抗原相互作用中使用之關鍵接觸殘基。(KashmiriMethods
36: 25-34(2005))。
如本文關於抗體所用之術語「競爭」意指第一抗體或其抗原結合片段(或部分)以足夠類似於第二抗體或其抗原結合部分之結合的方式結合至抗原決定基,使得與在不存在第二抗體下第一抗體之結合相比,在第二抗體存在下第一抗體與其同源抗原決定基之結合結果可偵測地降低。其中在第一抗體存在下第二抗體與其抗原決定基之結合亦可偵測地降低之替代方案可係(但無需)如此。亦即,第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合,而第二抗體不抑制第一抗體與其各別抗原決定基之結合。然而,倘若每一抗體可偵測地抑制另一抗體與其同源抗原決定基或配位體之結合(不管抑制至相同、更大或更小程度),則認為該等抗體彼此「交叉競爭」結合其各別抗原決定基。本發明涵蓋競爭及交叉競爭抗體二者。與藉由此競爭或交叉競爭發生之機制(例如,立體阻礙、構形變化或結合至共同抗原決定基或其部分)無關,熟習此項技術者應瞭解,基於本文提供之教示,本文涵蓋此等競爭及/或交叉競爭抗體且其可用於本文所揭示之方法。在一些實施例中,本發明之抗體可與MCT1 Ab1競爭或交叉競爭與MCT1之結合。
已知術語「互補決定區」及「CDR」(與「超變區」或「HVR」同義)在此項技術中係指抗體可變區內胺基酸之非鄰接序列,其賦予抗原特異性及/或結合親和力。一般而言,在每一重鏈可變區中存在三個CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3),且在每一輕鏈可變區中存在三個CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。已知「框架區」及「FR」在此項技術中係指重鏈及輕鏈可變區之非CDR部分。一般而言,在每一全長重鏈可變區中存在四個FR (FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4),且在每一全長輕鏈可變區中存在四個FR (FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4)。
術語「細胞介素」係指參與細胞信號傳導之一大類小蛋白質。通常,其釋放對其周圍細胞之行為具有一些效應。細胞介素可作為免疫調節劑參與自分泌信號傳導、旁分泌信號傳導及/或內分泌信號傳導。細胞介素包括趨化介素、干擾素、介白素、淋巴介質及腫瘤壞死因子。細胞介素係由寬廣範圍之細胞產生,該等細胞包括免疫細胞,如巨噬細胞、B淋巴球、T淋巴球及肥胖細胞,以及內皮細胞、纖維母細胞及各種基質細胞。「趨化介素」係通常參與介導趨化性之細胞介素家族。
片語「與MCT1之表現相關之疾病」包括(但不限於)與MCT1之表現相關之疾病或與表現MCT1之細胞相關之病狀,包括(例如)諸如狼瘡等自體免疫疾病;或與表現MCT1之細胞相關之癌性或非癌性適應症。
如本文所用,術語「EC50
」係指測試化合物(例如抗MCT1抗體或其抗原結合片段)在分析中產生50%之其最大反應或效應之劑量。
「有效量」或「有效治療量」係指足以預防或治療個體疾病、病狀或病症之劑量。有效用於治療性或預防性應用之量將取決於(例如)所治療疾病或病症之階段及嚴重程度、患者之年齡、體重及一般健康狀況以及開處醫師之判斷。劑量大小亦可藉由以下因素來確定:所選活性劑、投與方法、投與時刻及頻率、可伴隨投與特定活性劑之任何不良副作用之存在、性質及程度以及期望生理效應。熟習此項技術者將瞭解,各種疾病或病症可需要涉及多次投與之延長治療,可能在每次或各輪投與中使用本發明抗體。
「抗原決定基」或「結合位點」係抗原上與抗原結合肽(諸如抗體)特異性結合之區域或區。蛋白質抗原決定基可包含直接參與結合之胺基酸殘基(亦稱為抗原決定基之免疫優勢組分)及不直接參與結合之其他胺基酸殘基(諸如由特異性抗原結合肽有效封阻之胺基酸殘基)(換言之,胺基酸殘基係在特異性抗原結合肽之「足跡」內)。本文術語抗原決定基包括在特異性結合至抗MCT1抗體之MCT1之任一特定區中之兩種類型之胺基酸結合位點。MCT1可包含多個不同抗原決定基,該等抗原決定基可包括(但不限於) (1) 線性肽抗原決定子;(2) 構形抗原決定子,其由成熟MCT1構形中位置彼此靠近之一或多個非鄰接胺基酸組成;及(3) 轉譯後抗原決定子,其全部或部分地由共價連接至MCT1蛋白之分子結構(諸如碳水化合物基團)組成。特定而言,術語「抗原決定基」包括蛋白質或肽(例如,MCT1)中之特定殘基,其參與如藉由已知且公認之方法(諸如丙胺酸掃描技術)所測定之抗體與此蛋白質或肽之結合。此等方法例示於本文中。
在本文中,「表現載體」係指含有促進在靶標宿主細胞內操縱外源蛋白質表現之元件之DNA載體,該靶標宿主細胞係(例如)細菌、昆蟲、酵母、植物、兩棲動物、爬行動物、鳥類或哺乳動物細胞及最通常酵母或哺乳動物細胞(例如CHO細胞)。便捷地,首先在細菌宿主(例如大腸桿菌(E. coli))中實施序列之操縱及轉型用DNA之產生,且通常載體將包括促進此等操縱之序列,包括細菌複製起點及適當細菌選擇標記物。選擇標記物編碼在選擇性培養基中生長之經轉型宿主細胞存活或生長所需之蛋白質。未經含有選擇基因之載體轉型之宿主細胞將不能在該培養基中存活。典型選擇基因編碼如下蛋白質:(a) 賦予對抗生素或其他毒素之抗性;(b) 補充營養缺陷型缺陷;或(c) 供應自複合培養基無法獲得之關鍵營養物。用於使酵母轉型之例示性載體及方法闡述於(例如) Burke, D.、Dawson, D.及Stearns, T.,Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual, Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)中。用於本發明方法中之表現載體可包括酵母或哺乳動物特異性序列,包括用於鑑別經轉型宿主菌株之可選擇營養缺陷型或藥物標記物。藥物標記物可進一步用於擴增酵母宿主細胞中載體之拷貝數。
術語「表現」及「產生」在本文中以同義使用,且係指基因產物之生物合成。該等術語涵蓋將基因轉錄成RNA。該等術語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽,且進一步涵蓋所有天然轉錄後及轉譯後修飾。抗體或抗原結合片段之表現/產生可在細胞之細胞質內,及/或至細胞外環境(諸如細胞培養之生長培養基)中。
術語「Fc受體」及「FcR」闡述結合至抗體Fc區之受體。較佳FcR係天然序列人類FcR。此外,較佳FcR係結合IgG抗體者(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體,包括該等受體之等位基因變異體及選擇式剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化型受體」)及FcγRIIB(「抑制型受體」),其具有主要在其細胞質結構域上有所不同之類似胺基酸序列。FcR綜述於Ravetch及Kinet,Ann. Rev. Immunol
. 9:457-92 (1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34 (1994);及de Haas等人,J. Lab. Clin. Med.
126:330-41 (1995)中。「FcR」亦包括新生受體FcRn,其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J. Immunol.
, 117:587 (1976);及Kim等人,J. Immunol.
, 24:249 (1994)),且其主要功能為調節及/或延長循環中抗體之半衰期。就所揭示之抗MCT1抗體係無醣基化抗體而言,作為表現系統及/或序列之結果,預期本發明抗體結合FcRn受體,但不結合(或最小程度地結合) Fcγ受體。
術語「Fc區」用於界定免疫球蛋白重鏈之C末端區。「Fc區」可係天然序列Fc區或變異體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可有所變化,但通常將人類IgG重鏈Fc區界定為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基末端。Fc區中殘基之編號係如Kabat中之EU索引之編號。Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest
,第5版,Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)。免疫球蛋白之Fc區通常包含兩個恆定結構域CH2及CH3。
表述「框架區」或「FR」係指在抗體輕鏈及重鏈可變區內之框架區中之一或多者(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest
,第4版,Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987))。該等表述包括插入在抗體輕鏈及重鏈可變區內之CDR之間的彼等胺基酸序列區。
「功能Fc區」具有天然序列Fc區之至少一種效應功能。例示性「效應功能」包括C1q結合;補體依賴性細胞毒性(「CDC」);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(「ADCC」);吞噬作用;下調細胞表面受體(例如B細胞受體(「BCR」))等。此等效應功能通常需要Fc區與結合結構域(例如抗體可變結構域)組合,且可使用此項技術中已知用於評估此等抗體效應功能之各種分析來評價。「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。「變異體Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區不同、但仍保留天然序列Fc區之至少一種效應功能之胺基酸序列。較佳地,變異體Fc區與天然序列Fc區相比或與親代多肽之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代,例如天然序列Fc區或親代多肽之Fc區中之約1個至約10個胺基酸取代及例如約1個至約5個胺基酸取代。本文中變異體Fc區將(例如)與天然序列Fc區及/或與親代多肽之Fc區具有至少約80%序列一致性且與其具有大多數例如至少約90%序列一致性,與其具有大多數例如至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。
如本文所用,「移植物抗宿主病」(GVHD)係指同種異體骨髓移植或造血幹細胞移植之常見併發症,其中所移植骨髓中之功能性免疫細胞將接受者識別為「外源」且產生對宿主組織之免疫反應。根據1959比林漢姆準則(Billingham Criteria),發生GVHD必須滿足三個準則:1) 投與具有活力及功能性免疫細胞之免疫勝任移植物;2) 接受者在免疫上組織不相容;3) 接受者係免疫受損的且因此不能破壞移植細胞或使移植細胞去活化。在臨床上,將移植物抗宿主病分成急性及慢性形式。該疾病之急性或暴發性形式(aGVHD)通常在移植後前100天內觀察到,且由於相關之發病率及死亡率而對移植之有效性構成重大挑戰。移植物抗宿主病之慢性形式(cGVHD)通常在100天之後發生。中度至重度cGVHD情況之出現對長期存活產生不利影響。骨髓移植後,作為污染物或有意引入至宿主中之存在於移植物中之T細胞在感知宿主組織作為抗原性外來物之後攻擊移植接受者之組織。該等T細胞產生過量之細胞介素,包括TNFα及γ干擾素(IFNγ)。眾多種宿主抗原可起始移植物抗宿主病,其中為人類白血球抗原(HLA)。然而,即使在HLA相同之兄弟姐妹為供體時,亦可發生移植物抗宿主病。典型地,急性移植物抗宿主病之特徵在於對肝臟、皮膚及黏膜以及胃腸道之選擇性損害。其他研究顯示,移植物抗宿主病靶向包括免疫系統(諸如骨髓及胸腺)自身及呈特發性肺炎形式之肺在內之器官。慢性移植物抗宿主病亦攻擊以上器官,但在其長期過程中亦可對結締組織及外分泌腺造成損害。
如本文所用,「宿主細胞」泛指已將本發明之核酸分子(諸如本發明之重組表現載體)引入至其中之細胞。宿主細胞可係原核細胞(例如,大腸桿菌)或真核細胞,諸如酵母、昆蟲(例如,SF9)、兩棲動物或哺乳動物細胞(諸如CHO、HeLa、HEK-293),例如經培養細胞、外植體及活體內細胞。術語「宿主細胞」及「重組宿主細胞」在本文中可互換使用。應理解,此等術語不僅係指特定個體細胞,且亦係指此一細胞之子代或潛在子代。由於因突變或環境影響可使接續世代發生某些改變,故子代實際上可能與親細胞不同但卻仍包括於如本文所使用術語之範圍內。
如本文所用,「人類抗體」意指具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列之胺基酸序列及/或使用如熟習此項技術者所已知或本文所揭示之用於製備人類抗體之技術中之任一者製得之抗體。人類抗體之此定義包括包含至少一種人類重鏈多肽或至少一種人類輕鏈多肽之抗體。一種此實例係包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來產生。在一個實施例中,人類抗體係選自噬菌體文庫,其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人,Nature Biotechnology
, 14:309-314, 1996;Sheets等人,Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 95:6157-6162, 1998;Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol.
, 227:381, 1991;Marks等人,J. Mol. Biol.
, 222:581, 1991)。人類抗體亦可藉由對動物實施免疫製得,已向該等動物中以基因轉殖方式引入人類免疫球蛋白基因座代替內源性基因座,例如其中內源性免疫球蛋白基因經部分或完全去活化之小鼠。此方法闡述於美國專利第5,545,807號;第5,545,806號;第5,569,825號;第5,625,126號;第5,633,425號;及第5,661,016號中。或者,人類抗體可藉由使產生針對靶抗原之抗體之人類B淋巴球(此等B淋巴球可自個體或自cDNA之單一細胞選殖回收,或可在活體外經免疫)無限增殖來製備。參見例如Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy
, Alan R. Liss,第77頁,1985;Boerner等人,J. Immunol.
, 147 (1):86-95, 1991;及美國專利第5,750,373號。
「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性之抗體,其具有框架區及CDR區二者均源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。在一個實施例中,人類單株抗體由雜交瘤產生,該雜交瘤包括自基因轉殖非人類動物(例如基因轉殖小鼠)獲得之B細胞,該B細胞具有與永生化細胞融合之包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因體。此包括全人類單株抗體及其結合物及變異體,例如其結合至諸如治療劑或診斷劑等效應劑。
如本文所用,「人類化抗體」廣泛地包括由非人類細胞製得之抗體,該非人類細胞具有已經改變以更密切類似於將由人類細胞製得之抗體之可變區及恆定區。舉例而言,藉由改變非人類抗體胺基酸序列以併入見於人類生殖系免疫球蛋白序列中之胺基酸。本發明之人類化抗體可包括(例如)在CDR中不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如,藉由活體外隨機誘變或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。如本文所用,術語「人類化抗體」亦包括已接枝至人類框架序列上之其中CDR序列源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)生殖系之抗體。如本文所用,術語「人類化抗體」亦包括人類化且親和力成熟之親和力成熟抗體,例如以增強該抗體與MCT1或另一靶抗原之結合。
如本文所用,術語「IC50
」係指測試化合物(例如,抗MCT1抗體或其抗原結合片段)在生物化學分析中產生50%抑制之劑量。
「發炎性病症」、「發炎性病狀」及/或「發炎」在本文中可互換使用,其泛指慢性或急性發炎性疾病,且明確地包括發炎性自體免疫疾病及發炎性過敏性病狀。該等病狀包括(例如)特徵在於對有害刺激(諸如病原體、受損細胞或刺激物)之免疫反應失調之發炎性異常。發炎性病症為眾多種人類疾病之基礎。在發炎過程中具有病原學起源之非免疫疾病具有包括癌症、動脈粥樣硬化及缺血性心臟病。與發炎相關之病症之實例包括:慢性前列腺炎、腎小球性腎炎、過敏性、骨盆腔發炎性疾病、再灌注損傷、類肉瘤病、血管炎、間質性膀胱炎、低補體血症性蕁麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶症候群、鞏膜炎、巨噬細胞活化症候群、貝賽特氏症候群、PAPA症候群、布勞氏症候群(Blau's Syndrome)、痛風、成年及幼年型斯提耳氏病(Still's disease)、cryropyrin病變(cryropyrinopathy)、穆-韋二氏症候群(Muckle-Wells syndrome)、家族性冷誘發之自體發炎性症候群、新生兒發作型多系統發炎性疾病、家族性地中海熱、慢性嬰兒神經、皮膚及關節症候群、全身性幼年型特發性關節炎、高IgD症候群、施尼茨勒氏症候群(Schnitzler's syndrome)、TNF受體相關之週期性症候群(TRAPSP)、牙齦炎、齒根骨膜炎、肝炎、硬化、胰臟炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛風、痛風性關節炎及選自由牛皮癬、異位性皮膚炎、濕疹、酒渣、蕁麻疹及痤瘡組成之群之發炎性皮膚病症。
如本文所用,術語「抑制劑」係指結合至靶標且使其在生物學上無活性或活性較少之化合物。在特定實施例中,該化合物係抗MCT1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,經由對MCT1介導之乳酸鹽轉運之抑制來量測該化合物之抑制性效應。
「經分離」生物組分(諸如經分離之抗體或細胞或載體或蛋白質或核酸)係指已實質上自其環境或該組分所天然存在於其中之生物體細胞中之其他生物組分(例如其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質及細胞器)分離或純化出之組分。已「經分離」之核酸及蛋白質包括藉由標準純化方法純化之核酸及蛋白質。該術語亦囊括藉由重組技術以及化學合成製備之核酸及蛋白質。經分離之核酸或蛋白質可以實質上純化之形式存在,或可存在於非天然環境(例如宿主細胞)中。
如本文所用,「經分離抗體」意欲指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體之抗體(例如,特異性結合MCT1之經分離抗體實質上不含特異性結合除MCT1以外之抗原之抗體)。此外,經分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
如本文所用,「標記」或「可偵測部分」泛指可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理方式偵測之組合物。
如本文所用,「狼瘡」意欲包括所有類型之狼瘡。下文論述4種類型之狼瘡。如本文所用,「狼瘡樣病狀」意欲包括具有與狼瘡類似症狀(諸如腎臟發炎、蛋白尿增加及脾腫大)之發炎性病狀。「全身性紅斑狼瘡」或(「SLE」)係狼瘡之最常見形式,其可為中度或重度且可影響主要器官系統。此係大多數人將「狼瘡」相關聯之病狀。其係不明原因之可導致腎臟發炎之自體免疫病狀(稱為狼瘡性腎炎),其可影響身體自血液過濾廢物之能力,且或若嚴重則可導致需要透析或腎移植之腎損害。此外,SLE可導致肺中血壓增加(稱為肺高血壓),其可引起呼吸困難。此外,SLE可引起神經系統及腦之發炎,此可造成記憶問題、困惑、頭痛及中風。此外,SLE可導致腦血管發炎,此可造成高熱、癲癇發作及行為改變。此外,SLE可導致動脈之硬化或冠狀動脈疾病(冠狀動脈壁上沈積物之積聚),其可導致心臟病發作。本文中「皮膚狼瘡」係指僅影響皮膚之狼瘡病狀。存在三種類型之影響皮膚之狼瘡:慢性皮膚型紅斑狼瘡(CCLE) (亦稱為盤狀紅斑狼瘡[DLE])、亞急性皮膚型紅斑狼瘡(SCLE)及腫脹性狼瘡。皮膚型紅斑狼瘡或盤狀紅斑狼瘡可引起多種類型之皮疹及病灶(瘡瘍),最常見者(稱為盤狀皮疹)呈凸起、鱗片狀及紅色,但不發癢。皮疹區域看起來像圓盤或圓圈。皮膚型狼瘡之另一常見實例係面頰及跨越鼻樑上之皮疹,稱為蝴蝶皮疹。其他皮疹或瘡瘍可出現在面部、頸部或頭皮(曝露於日光或螢光燈之皮膚區域)上,或出現於口中、鼻中或陰道中。脫髮及皮膚色素或顏色之變化亦為皮膚型狼瘡之症狀。大約10%患有皮膚型狼瘡之人將發生全身性狼瘡。然而,有可能該等人已患有全身性狼瘡,其中皮膚皮疹為其主要症狀。「藥物誘發型紅斑狼瘡」係由某些可在不患有SLE之人中引起狼瘡樣症狀之藥物所引起之病狀。通常,此形式之狼瘡係暫時的且通常在停止藥劑之幾個月時間內消退。已知誘發狼瘡樣症狀之藥劑包括血壓藥劑肼苯噠嗪(hydralazine)及甲基多巴(methyldopa)、稱為普魯卡因胺(procainamide)之心臟藥劑及稱為D-青黴胺之藥物(其在金屬中毒之情形下使用)。藥物誘發型狼瘡之其他原因包括米諾四環素(minocycline)(用於治療痤瘡)、異菸酸肼(針對結核症之治療)及抗TN F (用於治療類風濕性關節炎)。藥物誘發型狼瘡之症狀與全身性狼瘡之彼等症狀類似,然而不同於SLE,其很少影響主要器官。新生兒狼瘡不係狼瘡之真正形式。其係影響患有狼瘡女性之嬰兒之罕見病狀,且係由來自母親之抗體作用於子宮內之嬰兒所引起。在出生時,嬰兒可具有皮膚皮疹、肝臟問題或低血球計數,但該等症狀通常在幾個月後完全消失而不具有持久效應。一些患有新生兒狼瘡之嬰兒亦可具有嚴重心臟缺陷。
「MCT1」係質子偶合之單羧酸鹽轉運蛋白。MCT1係多通道跨膜蛋白質,其負責促進關鍵代謝物(包括醣解產物)之轉運。其催化多種單羧酸鹽跨質膜之快速轉運,該等單羧酸鹽諸如乳酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸及酮體乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽及乙酸鹽。端視於組織及情況而定,MCT1介導乳酸及酮體之輸入或輸出。MCT1係最大的表面膜蛋白質家族中之一者之成員,稱為溶質通道蛋白(SLC),其功能涉及跨膜轉運關鍵細胞營養物、代謝物、離子、激素及脂質。MCT1屬於SLC16轉運蛋白家族,其中之五者已顯示以促進、pH依賴性及雙向方式轉運單羧酸鹽,諸如丙酮酸鹽、乳酸鹽及酮。MCT1亦可稱為以下名稱中之任一者:單羧酸鹽轉運蛋白1、SLC16A1、HHF7、MCT、MCT1、MCT1D、溶質載劑家族16成員1。在人類中,其係由SLC16A1基因編碼。
「MCT2」係質子偶合之單羧酸鹽轉運蛋白。其催化多種單羧酸鹽跨質膜之快速轉運,該等單羧酸鹽諸如乳酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸及酮體乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽及乙酸鹽。其亦起高親和力丙酮酸鹽轉運蛋白之作用。MCT2亦可稱為以下名稱中之任一者:單羧酸鹽轉運蛋白2、SLC16A7、MCT2、溶質載劑家族16成員7。在人類中,其係由SLC16A7
基因編碼。
「MCT3」係質子偶合之單羧酸鹽轉運蛋白。其催化多種單羧酸鹽跨質膜之快速轉運,該等單羧酸鹽諸如乳酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸及酮體乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽及乙酸鹽。其亦起高親和力丙酮酸鹽轉運蛋白之作用。MCT3之表現侷限於視網膜色素上皮及脈絡叢上皮中,在此其位於基底膜上,與在頂膜上發現之MCT1相反。MCT3亦可稱為以下名稱中之任一者:單羧酸鹽轉運蛋白3、SLC16A8、MCT3、REMP、溶質載劑家族16成員8。在人類中,其係由SLC16A8
基因編碼。
「MCT4」係質子偶合之單羧酸鹽轉運蛋白。MCT4亦可稱為以下名稱中之任一者:單羧酸鹽轉運蛋白4、SLC16A3、MCT 3、MCT 4、MCT-3、MCT-4、MCT3、MCT4、溶質載劑家族16成員3。在人類中,其係由SLC16A3
基因編碼。
「多特異性抗體」或「多特異性抗原結合蛋白」係指具有2個或更多個抗原結合區之多肽或抗體。此包括雙特異性抗體。該等抗原結合區可結合至不同抗原或結合至相同抗原之不同抗原決定基。
術語「核酸」及「多核苷酸」係指為直鏈或具支鏈、單股或雙股或其雜合體之RNA或DNA。該術語亦涵蓋RNA/DNA雜合體。以下為多核苷酸之非限制性實例:基因或基因片段、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、具支鏈多核苷酸、質體、載體、任一序列之經分離DNA、任一序列之經分離RNA、核酸探針及引子。多核苷酸可包含經修飾核苷酸(諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物)、尿嘧啶、其他糖及連接基團(諸如氟核糖及硫醇鹽)及核苷酸支鏈。核苷酸之序列可在聚合後藉由諸如與標記組分結合來進一步修飾。此定義中所包括之其他類型之修飾係加帽、用類似物取代天然核苷酸中之一或多者及引入使多核苷酸與蛋白質、金屬離子、標記組分、其他多核苷酸或固體支撐物連接之結構。多核苷酸可藉由化學合成獲得或源自微生物。術語「基因」廣泛地用於指多核苷酸中與生物功能相關之任一區段。因此,基因包括內含子及外顯子(如在基因體序列中),或僅包括編碼序列(如在cDNA中)及/或其表現所需之調控序列。舉例而言,基因亦係指表現mRNA或功能性RNA或編碼特定蛋白質且包括調控序列之核酸片段。
在將核酸置於與另一核酸序列之功能性關係中時,該核酸經「可操作地連接」。舉例而言,若信號序列之DNA表現為參與多肽分泌之前體蛋白,則其可操作地連接至該多肽之DNA;若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄,則其可操作地連接至該序列。通常,「可操作地連接」意指所連接之DNA序列係鄰接的,且在分泌前導序列之情形下係鄰接的且位於閱讀框中。然而,增強子無需鄰接。連接係藉由在便捷限制位點處連接或替代地經由熟習此項技術者所熟悉之PCR/重組方法(GATEWAY11技術;Invitrogen, Carlsbad California)來完成。若不存在此等位點,則根據習用實踐使用合成寡核苷酸銜接體或連接體。
「醫藥學上可接受之載劑」或「賦形劑」係指在調配及/或允許儲存期間習用用於醫藥組合物中之化合物或材料。
「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用且泛指具有任一長度之胺基酸殘基聚合物,與修飾(例如,磷酸化或醣基化)無關。該等術語亦適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應天然胺基酸之類似物或模擬物之胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應天然胺基酸之人工化學模擬物之胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。可(例如)藉由添加碳水化合物殘基以形成糖蛋白來修飾多肽。術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」明確地包括糖蛋白以及非糖蛋白。
如本文所用,術語「啟動子」定義為由細胞之合成機構或所引入合成機構識別之為起始多核苷酸序列之特定轉錄所需之DNA序列。
如本文所用,「預防有效量」泛指在化合物投與患者用於預防疾病或預防疾病復發時足以實現針對該疾病或復發之此預防之量。預防有效量可係有效預防徵象及/或症狀之發生率之量。「預防有效量」可端視於疾病及其嚴重程度及欲治療患者之年齡、體重、病史、病狀之傾向性、先存病狀而變化。
如本文所用,「重組體」泛指產物,例如細胞或核酸、蛋白質或載體,指示該細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質經修飾,或該細胞係源自經如此修飾之細胞。因此,舉例而言,重組細胞表現在細胞之天然(非重組)形式中未發現之基因或表現以其他方式異常表現、下表現或根本不表現之天然基因。
如本文所用,術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體,諸如(a) 自對人類免疫球蛋白基因基因轉殖或轉染色體之動物(例如,小鼠)或自其製備之雜交瘤分離之抗體,(b) 自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞、例如自轉染瘤分離之抗體,(c) 自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體,及(d) 藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組人類抗體具有其中框架區及CDR區源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而,在某些實施例中,可使此等重組人類抗體經歷活體外誘變(或者,在使用人類Ig序列之基因轉殖動物時,經歷活體內體細胞誘變),且因此重組抗體之VH
及VL
區之胺基酸序列儘管衍生自人類生殖系VH
及VL
序列且與其相關,但其係可不天然存在於人類活體內抗體生殖系譜內之序列。
本文中之「可選標記物」係指基因或基因片段,其(例如)經由轉型事件賦予接受該基因之細胞生長表現型(物理生長特性)。可選標記物容許該細胞在其中不接受該選擇標記基因之細胞不能生長之條件下在選擇性生長培養基中存活且生長。可選標記物基因通常分為若干種類型,包括陽性可選標記物基因,諸如賦予細胞對抗生素或其他藥物抗性之基因、當兩個溫度敏感性(「ts」)突變體雜交或ts突變體經轉型時之溫度;陰性可選標記物基因,諸如賦予細胞能夠在不具有特定營養物之培養基中生長之生物合成基因,該特定營養物為不具有該生物合成基因之所有細胞所需,或經誘變之生物合成基因,其使得不具有野生型基因之細胞無法進行細胞生長;及諸如此類。適宜標記物包括(但不限於):ZEO;G418;LYS3;MET1;MET3a;ADE1;ADE3;URA3;及諸如此類。
在本文療法或診斷情形下之「個體(subject)」或「患者」或「個體(individual)」包括任一人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物,例如哺乳動物及非哺乳動物,諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等,亦即,適宜根據本發明進行治療之任一者包括(但不限於)鳥類及哺乳動物個體,且係(例如)哺乳動物。需要根據本發明進行治療之任一哺乳動物個體係適宜的。兩種性別且處於任一發育階段(亦即,新生兒、嬰兒、幼年、青少年及成人)之人類個體均可根據本發明進行治療。出於獸醫學目的且出於藥物篩選及藥物開發目的,本發明亦可在動物個體、具體而言諸如小鼠、大鼠、狗、貓、牛、山羊、綿羊及馬等哺乳動物個體上實施。「個體(subject)」可與「個體(individual)」及「患者」互換使用。
片語抗體(例如,第一抗體)與另一抗體(例如,第二抗體)結合「實質上」或「至少部分上」相同之抗原決定基意味著該第一抗體之抗原決定基結合位點包含至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多構成該第二抗體之抗原決定基結合位點之抗原上之胺基酸殘基。同樣,第一抗體與第二抗體結合實質上或部分上相同或重疊之抗原決定基意味著如上文所述該第一及該第二抗體競爭與抗原之結合。因此,術語與單株抗體「結合至實質上相同之抗原決定基或決定子」意味著抗體與該抗體「競爭」。片語與相關抗體「結合至相同或重疊之抗原決定基或決定子」意味著抗體與該相關抗體「競爭」該相關抗體所特異性結合之MCT1上之至少一個(例如,至少2個、至少3個、至少4個、至少5個)或所有殘基。使用丙胺酸掃描可容易地確定與本文所述單株抗體結合實質上或基本上相同的抗原決定基之一或多種抗體之鑑別。另外,可評價抗體競爭之多種免疫篩選分析中之任一者。多種此等分析係常規實踐的且為此項技術中所眾所周知(參見例如1997年8月26日頒佈之美國專利第5,660,827號,其明確地以引用方式併入本文中)。將理解,實際上,確定本文所述抗體所結合之抗原決定基之方式不係為鑑別與本文所述單株抗體結合相同或實質上相同或重疊抗原決定基之抗體所需之任何方式。
術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源性核酸轉移或引入至宿主細胞中之過程。「經轉染」或「經轉型」或「經轉導」細胞係經外源性核酸轉染、轉型或轉導之細胞。該細胞包括原代個體細胞及其子代。
如本文所用,「療法」、「治療性」、「治療(treating或treatment)」泛指治療疾病、停止或降低該疾病或其臨床症狀之發展及/或減輕該疾病,從而引起該疾病或其臨床症狀之消退。療法涵蓋對疾病、疾病之徵象及/或症狀之預防、治療、補救、降低、緩和及/或使其緩解。療法涵蓋對具有進行中之疾病徵象及/或症狀(例如,發炎、疼痛)之患者之徵象及/或症狀之緩和。療法亦涵蓋「預防」。出於療法目的,術語「降低」泛指徵象及/或症狀之臨床顯著降低。療法包括治療再發或復發性徵象及/或症狀(例如,發炎、疼痛)。療法涵蓋(但不限於)排除徵象及/或症狀在任何時間之出現以及降低現有徵象及/或症狀及消除現有徵象及/或症狀。療法包括治療慢性疾病(「維持」)及急性疾病。舉例而言,治療包括治療徵象及/或症狀(例如,發炎、疼痛)或預防其再發或復發。
如本文所用,「Treg細胞」(有時亦稱為抑制T細胞或誘導型Treg細胞或iTreg)係指調節免疫系統且維持對自體抗原之耐受性且可消除自體免疫疾病之T細胞亞群。Foxp3+
CD4+
CD25+
調節性T細胞(Treg)對在正常條件下維持外周耐受性係至關重要的。
本文中術語「Tr1細胞」係指調節性T細胞之特定類型或群體(亦即,包含表現高水準IL-10之CD4+
Foxp3−
細胞之1型調節性T細胞(Tr1)),其通常基於其CD49b及LAG-3表現在科學文獻中予以表徵。該等細胞之特徵進一步在於其能夠在不存在IL-4及IL-17下分泌IL-10、TGF-β及顆粒酶(Gz) B。據報導,Tr1細胞控制免疫反應之主要機制包含分泌IL-10及TGF-β以及經由GzB殺死骨髓細胞。在HLA不匹配之胎肝造血幹細胞移植後產生耐受性之患者外周血中首次觀察到Tr1細胞,據報導,其在若干種免疫介導疾病中調節發炎性及效應T細胞反應。該等細胞可以Ag特異性方式在活體外產生且擴增,此使得在治療患有自體免疫病狀(諸如1型糖尿病及多發性硬化)之患者之細胞療法中評估其之潛在臨床用途。
如本文所用,「可變區」或「VR」泛指抗體中每對輕鏈及重鏈內直接參與抗體與抗原結合之結構域。每一重鏈在一端具有可變結構域(VH
),之後為多個恆定結構域。每一輕鏈在一端具有可變結構域(VL
)且在其另一端具有恆定結構域;輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域對齊,且輕鏈可變結構域與重鏈之可變結構域對齊。
「載體」係其中可操作地插入核酸區段以引起該區段之複製或表現之複製子(諸如質體、噬菌體、黏粒或病毒)。載體可含有一或多種其他序列,諸如(但不限於)調控序列(例如,啟動子、增強子)、選擇標記物及多聚腺苷酸化信號。用於使眾多種宿主細胞轉型之載體為熟習此項技術者所眾所周知。其包括(但不限於)質體、噬粒、黏粒、桿狀病毒、桿狀病毒穿梭質體(bacmid)、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)以及其他細菌、酵母及病毒載體。本文所述之載體可整合至宿主基因體中或獨立地維持在細胞或細胞核中。
術語「異種」係指源自不同物種動物之移植物。
已對本發明進行闡述,提供以下實例以進一步展示本發明及其固有優點。提供以下實例以說明而非限制所主張之本發明。
實例 實例1:MCT在T細胞上之差異表現 材料及方法
實例 實例1:MCT在T細胞上之差異表現 材料及方法
使用可商業購得之SM化合物AZ3965 (MedChem Express, NJ)及其相關類似物以幫助揭示免疫細胞中MCT1路徑之獨特生物學。為清晰起見,吾人將AZ396及其具有相同結合親和力、PK及MCT1/2選擇性之類似物統稱為「AZ3965」。
量測在來自兩種不同供體之未受刺激及受刺激之白血球中之MCT1、MCT2、MCT4及BSG (CD147)表現。對於「受刺激」條件,使細胞經CD3/CD28活化3天。測試AZ3965對受刺激細胞增殖之抑制。
結果
結果
MCT1促進代謝物(包括醣解產物)之轉移,其在經活化T/B細胞中更為重要(圖1)。兩種供體之MCT1、MCT2、MCT4及BSG (CD147)之表現水準示於圖2中,其展示經活化T細胞上調MCT1 (以及圖13B)但不上調MCT2;靜息或經活化T細胞均不表現高水準之MCT2;且在個體中,經活化T細胞中之MCT4表現係可變的。AZ3965抑制分析(圖2上所指示之結果)顯示在具有高MCT4表現(0.59 nM)對低MCT4表現(0.43 nM)之個體中,阻抑T細胞增殖之IC50
不可區分。該等結果展示,MCT4對經活化T細胞中之乳酸鹽轉運無顯著貢獻,且MCT1特異性靶向即使在MCT4存在下亦將抑制T細胞功能。
其他數據顯示,在經CD3/CD28活化後,小鼠MCT4缺陷T細胞與WT T細胞相同。
實例2:使用AZ3965抑制劑驗證針對發炎/自體免疫病症在活體外及活體內靶向MCT1之可行性
活體外
實例2:使用AZ3965抑制劑驗證針對發炎/自體免疫病症在活體外及活體內靶向MCT1之可行性
活體外
對乳酸鹽轉運之效應。
使用乳酸鹽FLIPR分析以顯示AZ3965抑制人類T細胞(CD4+
及CD8+
二者)、B細胞淋巴瘤(Daudi)及PBMC中之乳酸鹽轉運,但不抑制單核球中之乳酸鹽轉運(圖3)。AZ3965將受影響細胞中之乳酸鹽轉運抑制高達80%,但不影響單核球中之轉運,此對於保護治療個體中之先天免疫反應係重要的。
人類 T 細胞增殖
。在人類T細胞增殖分析中,MCT1抑制劑投與以0.54 nM之IC50
降低T細胞增殖(圖4)。
人類混合淋巴球反應 (MLR) 。
在人類MLR分析中,MCT1抑制劑投與以1.34 nM之IC50
降低T細胞增殖(圖5)。
T 細胞細胞介素分泌。
使T細胞在活體外經CD3/CD28活化5天。隨後AZ3965投與抑制以下細胞介素之分泌:IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10及IL-6 (圖6)。
活化標記物
。利用100 nM小分子MCT1抑制劑將CD3/CD28活化T細胞處理4天或未處理4天(未處理對照)。將該等條件與陰性(抗體未染色)對照進行比較。經由流式細胞術染色評價超過200種CD標記物。如在TCR刺激後藉由流式細胞術染色所觀察,MCT1抑制不阻止細胞表面標記物之T細胞表現(例如,CD25、CD44、CD69、CD4、CD8、LFA,I/II類等;參見圖7A至圖7J),惟表面PD1及CTLA4之表現略有增加。AZ3965處理淋巴球對細胞活力亦無影響。
活體內
活體內
GVHD 阻抑及 Treg 頻率增加。
將人類PBMC轉移至GVHD鼠類模型中之免疫缺陷NSG小鼠。AZ3965投與在異種GVHD期間以優於JAK抑制劑CP-690550之方式延長小鼠存活且降低GVHD發病率直至停藥(圖8)。在此異種GVHD實驗之第20天,自2 mg/kg (2.5% Treg)至50 mg/kg (10%)觀察到調節性T (Treg)細胞CD4+
T細胞百分比之AZ3965劑量依賴性增加(圖9)。在此模型中,Treg在轉移至淋巴球減少環境中後通常不會存活較長時間,此部分地係由於發炎性微環境所致(參考文獻60至62)。在另一GVHD實驗中,如藉由CFSE標記之T細胞增殖所量測,AZ3965使小鼠GVHD減弱(BALB/c -> C57BL/6)。
移植物排斥。
在小鼠同種異體移植物分析中,25 mg/kg化合物投與降低移植物排斥(圖10)。
對 B 細胞 IgG1 反應之抑制。
如經由對綿羊RBC之IgG1反應所量測,AZ3965投與(2.5 mpk/天)亦抑制B細胞免疫球蛋白產生(圖11A)。此投與亦將生發中心B細胞之比例降低大約30% (圖11B)。
尿酮增加。
與人類中MCT1之損失一致(參考文獻49),投用AZ3965之小鼠顯示出可量測但非不利之尿酮增加而無相關之酮酸中毒。
結論
結論
該等研究說明MCT1抑制在降低T細胞及B細胞反應二者中之效能,此特徵對於諸如狼瘡等自體免疫疾病中之治療性靶向係重要的。因此,MCT1係用於控制發炎之可行藥物靶標,其抑制顯示對先天性免疫無效應,但對適應性/體液性免疫具有深遠效應。
實例3:抗人類MCT1抗體之開發及結合表徵
實例3:抗人類MCT1抗體之開發及結合表徵
MCT1 Ab1 mAb 選擇
。MCT1 Ab1係大鼠抗人類MCT1單株抗體,其係在使用MCT1表現及MCT1剔除(KO)細胞株進行基於細胞之囓齒類動物免疫及結合篩選後選擇的。
結合親和力及 MCT1 交叉反應性。
動力學排除分析(KinExA)分析揭示,MCT1 Ab1以6.3 nM之Kd結合人類MCT1。MCT1 Ab1亦與食蟹猴(cynomolgus、cyno)及兔MCT1具有高度交叉反應性,但與囓齒類動物MCT1無交叉反應性(圖12A至圖12D)。
結合特異性。
如藉由RT-PCR所量測,HEK-293 WT細胞僅表現MCT1/CD147且不表現其他MCT。為量測本發明抗體之結合特異性,可使用HEK-293 MCT1/CD147雙KO細胞株作為陰性對照。此外,改造此雙KO細胞株以表現個別轉運蛋白(MCT1、MCT2、MCT3、MCT4、CD147)。使用流式細胞術,可經由偵測帶Flag標籤之蛋白質量測該等經改造細胞株對於每一蛋白質之表現且經由表面染色量測該等經改造細胞株對於抗MCT1抗體之結合。
MCT1 Ab1 與經活化 T 細胞之結合。
MCT1 Ab1特異性結合至MCT1,且在第3天確認人類CD3/CD28活化T細胞上之細胞表面表現增加(圖13B),但在靜息初始T細胞上顯示低至無染色(圖13A)。此結合確認圖2中所呈現之表現數據且確認基於mRNA分析之預測。
結論
結論
MCT1 Ab1係高度特異性大鼠抗人類MCT1抗體。
實例4:對抗MCT1抗體之MCT1抑制之活體外表徵
實例4:對抗MCT1抗體之MCT1抑制之活體外表徵
乳酸鹽轉運之抑制。
使用FLIPR Tetra®
及pH敏感性染料BCECF進行之基於細胞之乳酸鹽轉運分析(參考文獻63至65)證明,MCT1 Ab1可以劑量依賴性方式(Kd = 7.6 nM)阻斷經活化T細胞中之乳酸鹽轉運(圖14)。
溴丙酮酸鹽毒性之抑制
。由於MCT1係抗癌毒素溴丙酮酸鹽之活體外效能所必需之唯一轉運蛋白(參考文獻66),因此開發第二種基於細胞之功能性分析以量測使用濃度為150 μM之此毒素對細胞之活體外殺傷。在此分析中,如藉由使用ATPlite (Kd = 1.2 nM)保護細胞免於死亡所量測,觀察到溴丙酮酸鹽毒性之劑量依賴性抑制(圖15)。
T 細胞增殖、發炎性細胞介素產生及同種異體活化之抑制。
MCT1 Ab1以1.3 nM之EC50
抑制CD3/CD28刺激培養物中T細胞之增殖(圖16)。在刺激後第3天,亦可測試相對於對照,本發明之抗MCT1抗體或抗體片段抑制受刺激T細胞中產生發炎性細胞介素之能力。MCT1 Ab1A因經CD3/CD28活化,MCT1 Ab1在人類混合淋巴球反應中使同種異體活化抑制50-60% (參見例如圖17)。
實例5:抗MCT1抗體投與之活體內免疫調節效應
實例5:抗MCT1抗體投與之活體內免疫調節效應
保護免於致死 GVHD 。
可利用每週一次藥物或對照投與且n = 8隻小鼠/組來進行3週異種GVHD研究(使用人類PBMC -> NSG小鼠)。對於各種劑量之抗MCT1抗體,在整個測試時期每天均可觀察到MCT1 Ab1對免於致死GVHD之保護。在投與兩個劑量之MCT1 Ab1抗MCT1抗體或對照之後,可在第14天量測由絕對淋巴球計數(ALC)及發炎性細胞介素指示之T細胞群體。觀察到血液CD4+
T細胞擴增之降低及發炎性細胞介素之降低。若該等數據指示低劑量下之高功效,則在一些實施例中,MCT1 Ab1抗MCT1抗體或抗體片段可作為用於自體免疫疾病之治療劑以皮下方式投與。
尿酮增加。
可在異種GVHD研究之第4天在三個實驗中量測酮尿,且可分析劑量依賴性。MCT1 Ab1此一藥物誘導之酮增加可提供接近於靶控MCT1抑制之藥效學(PD)生物標記物以用於臨床研究。
此外,初步代謝體學發現顯示,在MCT1 Ab1處理之人類T細胞中,ATP及NADH之產生改良且氧化代謝及存活率增加。
實例6:利用抗MCT1特異性抗體靶向人類MCT1之安全性
實例6:利用抗MCT1特異性抗體靶向人類MCT1之安全性
MCT1 不在人類 RBC 上表現。
在對照條件及僅二級抗體條件下,使用MCT1 Ab1染色食蟹猴RBC及人類RBC (20名供體)。結果清晰地顯示,MCT1不在人類RBC上表現,此與以高水準表現MCT1之食蟹猴RBC形成鮮明對比(圖18A)。MCT1亦在兔RBC上表現,但不在大鼠或小獵犬RBC上表現(圖18B)。
MCT1 Ab1 及 AZ3965 不影響人類 RBC 乳酸鹽轉運。
在10 mM乳酸鹽存在下,使用基於FLIPR之轉運分析(參考文獻1、2),使用MCT1 Ab1及AZ3965抑制純化人類RBC中之MCT1乳酸鹽轉運。在乳酸鹽存在下,將乳酸鹽轉運水準與無乳酸鹽對照條件及無抑制劑條件進行比較。結果指示,人類RBC中之乳酸鹽轉運不受AZ3965或MCT1 Ab1處理影響(圖19),此確認MCT1或MCT2均不為RBC中之乳酸鹽轉運所必需的。
條件性 MCT1 KO 小鼠品系確認 MCT1 抑制之有限毒性
。為評估毒物學問題,開發條件性MCT1 KO小鼠品系。該等小鼠在出生後在所有組織中使用他莫昔芬來誘導缺失兩個MCT1等位基因,且在缺失後4個月未發現嚴重之不良發現。在精子形成之前觀察到精細胞退化,但認為此損失係可逆的,此乃因此精子產生階段係醣解的(參考文獻82),且實際上係一類新穎可逆避孕藥之靶標(參考文獻83、84)。在免疫學上,小鼠在支持正常造血之免疫區室細胞結構中不顯示變化。然而,與所觀察到之SM及mAb抑制劑對淋巴球增殖及活化之影響一致,如藉由OTII (OVA特異性基因轉殖TCR) T細胞轉移研究所量測,在所有組織中使MCT1條件性缺陷之小鼠顯示抗原特異性免疫反應之顯著降低,而對T細胞記憶具有極小影響。因此,在該等研究及MCT1缺陷個體中所提出之有限毒性問題(參考文獻49)為特異性抗MCT1 mAb將具有強大的免疫調節活性而無毒性或具有有限毒性提供證據。
結論
結論
利用抗MCT1 mAb靶向人類中之MCT1係安全的。現有數據強烈地指示良好安全性概況。MCT1缺陷之成年人類係健康的(參考文獻49、68);在MCT1缺陷個體中尚未觀察到明顯免疫缺陷;且MCT1缺陷之成年人類此外未受神經損害(參考文獻49),此表明在MCT1失去後人腦中之效應缺乏。具有MCT1突變之個體中不存在廣泛毒性可能係由於MCT之大量冗餘所致。
另外,吾人之數據確認MCT1不係人類紅血球(RBC)上之主要乳酸鹽轉運蛋白,且MCT1缺陷人類不呈現任何RBC功能障礙。
實例7:利用抗MCT1抗體經由B細胞抑制治療狼瘡
實例7:利用抗MCT1抗體經由B細胞抑制治療狼瘡
極大地增加 MCT1 在狼瘡患者漿細胞上之表現。
利用MCT1 Ab1使來自狼瘡患者及健康患者之漿細胞染色,且經由流式細胞術進行量測。圖20顯示健康B細胞對狼瘡B細胞MCT1表現之例示性流式細胞術資料,此揭示患病細胞之MCT1表現顯著增加。
結論
結論
關於B細胞(參與狼瘡發病機理之關鍵適應性免疫細胞),結果顯示MCT1在狼瘡患者漿細胞上顯著更高地表現(圖20)。因此,抗MCT1抗體不僅靶向效應細胞代謝,且亦有可能在狼瘡患者之所有致病性淋巴球中如此。
實例8:抗MCT1抗體之人類化及選擇
人類化
實例8:抗MCT1抗體之人類化及選擇
人類化
抗MCT1抗體MCT1 Ab1係大鼠/人類嵌合體。MCT1 Ab1之人類化與免疫原性測試(亦稱為「去免疫化」)(參考文獻87)一起實施。將人類化及去免疫化組合,藉此在遞送低免疫原性譜的同時保留功能、親和力及特異性。去除T細胞抗原決定基使免疫原性之風險最小化且因此容許患者接受整個療程。該方法將對結合結構域之仔細分析、適當人類序列區段之選擇及電腦工具之應用組合,以產生所提出之人類化抗體序列,從而產生一組人類化抗體。基於親和力選擇三種抗體。
對該三種mAb之評估包括使用EpiScreen™技術之免疫原性評價,該技術使用來自>20名健康志願者供體之血液樣品之時程樹突細胞:T細胞共培養分析。免疫原性(表示為陽性反應者%)係以具有已知臨床免疫原性之各種臨床級生物製劑之資料庫為基準。目標為陽性反應者<10%。
將該三種mAb連同作為對照之MCT1 Ab1一起轉化成全IgG形式。在IgG1上選擇「沈默」之Fc結構域。將已知之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)沈默突變(諸如ala/ala)添加至Fc結構域降低潛在毒性,同時保留MCT1抗發炎性效能。該等mAb以各自200 mg之規模表現且純化,且使用此材料來選擇單一主要候選物。
親和力量測
親和力量測
對經改造以表現MCT1 (但不表現其他MCT)之CD147-/- HEK-293細胞使用基於細胞之分析,且使用Sapidyne之基於免疫感測器之動力學排除分析(KinExa)來量測親和力。由於已知CD147影響MCT1表面表現(參考文獻88),因此亦在具有及不具CD147之CD147-/- MCT1-/-細胞中引入MCT1 cDNA以估計此搭配物蛋白對MCT1 Ab1結合親和力之效應。
活體外功能測試
活體外功能測試
使用典型T細胞活化分析對MAb進行排序。藉由自人類PBMC負向選擇分離CD4+
T細胞,且接著與該三種人類化MCT1 mAb中之每一者或同型對照一起於冰上培育30分鐘。將T細胞及抗體置於經抗CD3/CD28塗覆之96孔平底板上且培養72小時,之後收集上清液以藉由Luminex分析細胞介素產生。單獨地,將氚化胸苷(3H)添加至培養物中8小時以藉由3H併入量測增殖。
使用獨特供體在三個獨立實驗中測試mAb以確認活性。以半對數稀釋(0.01 → 30 μg/ml)測試每一抗體,且計算IC50
值以確定哪種抗體最強效(在最低濃度下具有最高效能)。
非人類靈長類動物(NHP)交叉反應性
非人類靈長類動物(NHP)交叉反應性
經由使用抗CD3純系SP34及驅動食蟹猴(cynomolgus monkey、cyno)中強效T細胞增殖之CD28,使用與人類T細胞活化分析相同之分析來篩選相關tox物種(食蟹猴)中之功能活性之保留。自World Wide Primates (Florida)獲得來自食蟹猴之全血,且經由負向選擇來分離T細胞。使T細胞與抗體一起培育且在CD3塗覆板上培養72小時。利用非人類靈長類動物(NHP)特異性Luminex分析來分析細胞介素產生,且藉由3H併入來量測增殖。將IC50
評分與人類進行比較。
活體內功能測試
活體內功能測試
異種GVHD係藉由將異種人類T細胞過繼性轉移至受輻照小鼠宿主中所介導之全身性疾病。以各種劑量測試MCT1 Ab1以測定T細胞擴增之減少且降低異種GVHD之NSG模型中之細胞介素水準。另外測試該三種mAb中之每一者連同MCT1 Ab1及對照IgG1以確認活體內功能性。在兩個重複實驗中使用8隻小鼠/組,其中在人類PBMC轉移時以及轉移後第2天及第4天投與10 mpk、3 mpk、1 mpk或0.3 mpk之每一抗體。在第14天,抽取小鼠之血液,且分別藉由流式細胞術及Luminex分析來測定絕對淋巴球計數(ALC)及細胞介素水準。追蹤每一小鼠之體重,且處死任何損失超過其初始體重20%之小鼠。利用將每一抗MCT1抗體與對照進行比較之統計對數秩測試產生每一實驗之卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)曲線。
其他修飾
其他修飾
如所述之人類化通常維持結合、特異性及功效而不增加免疫原性。為進一步改良該等特徵,可引入CDR周圍之回復突變以增加結合及功效。或者,可藉由維持CDR附近之序列且藉由突變消除可變結構域中之任何預測之免疫原性T細胞抗原決定基來使抗體人類化。可引入FcRn結合突變以改良抗體半衰期。
人類化抗體之特性
人類化抗體之特性
本發明之一些人類化抗體具有:
a. MCT1特異性結合,如藉由與僅表現MCT1之HEK-293細胞之結合所指示。
b. 與食蟹猴之交叉反應性,其功效為活體外CD3/CD28分析中人類T細胞之>90%。
c. 在>20名健康志願者供體中,<10%之陽性反應者具有免疫原性。
d. 在異種GVHD模型中活體內功效之確認。
結論
a. MCT1特異性結合,如藉由與僅表現MCT1之HEK-293細胞之結合所指示。
b. 與食蟹猴之交叉反應性,其功效為活體外CD3/CD28分析中人類T細胞之>90%。
c. 在>20名健康志願者供體中,<10%之陽性反應者具有免疫原性。
d. 在異種GVHD模型中活體內功效之確認。
結論
藉由滿足以上準則且藉由使用活體外CD3/CD28分析對IC50
值進行分級選擇人類化mAb抗MCT1 Ab4,其中抗MCT1 Ab4具有高功效及低變異性(在實驗內及實驗之間)。人類化抗MCT1抗體Ab4以及Ab3及Ab2 (所有均衍生自ab1)之人類化可變重鏈及可變輕鏈序列含於申請專利範圍之前之序列表中。
實例9:親和力成熟
實例9:親和力成熟
藉由使用噬菌體展示技術使人類化抗體MCT1 Ab4親和力成熟。
將抗體轉化成單鏈Fv (scFv)形式(可溶或連接至M13噬菌體),且測試與在人類化期間所使用之MCT1+
HEK-293細胞株之結合以確保可變結構域與所選擇之形式相容,且確立基線。為達成此scFv形式,經由15個胺基酸之連接體連接編碼可變重鏈(VH
)及輕鏈(VL
)結構域之基因(參考文獻89)。接著,鑑別起始抗體CDR內之特定胺基酸且靶向以用於隨機化誘變。另外,可故意或隨機地使特定框架殘基突變。所得突變體用於產生呈現於M13噬菌體表面上之scFv噬菌體展示文庫(具有大約1×108
個成員)。實施使用MCT1+
細胞株之三輪選擇,其係藉由在每一輪中降低抗原濃度以鑑別親和力成熟scFv來進行。
對親和力成熟scFv進行測序,且選擇<10種獨特scFv並放大以進行可溶性表現及IMAC純化。基於親和力選擇三種scFv且轉化成沈默IgG形式。
藉由(a) 活體外T細胞分析中之IC50
功效及(b) 異種GVHD模型中之活體內功能對該三者進行分級。該分級併入功效及變異性二者,其中理想候選物具有高功效及低變異性。分級最佳之mAb指定為MCT1 Ab5.01,其他者指定為MCT1 Ab5.02及MCT1 Ab5.03。
可實施額外輪之親和力成熟。Ab1之例示性人類化、親和力成熟變異體(亦即,Ab5-Ab60)之序列可參見本文申請專利範圍之前之序列表。
結論
結論
對於最佳化之皮下投與,本發明之親和力成熟人類化抗體可具有<2 mg/kg之功效。所關注之抗體(亦即MCT1 Ab1)之異種GVHD數據可用於確定在低劑量下之效能。
實例10:抗MCT1抗體之物理化學評價
實例10:抗MCT1抗體之物理化學評價
評價MCT1 Ab5.01之適宜強勁性、溶解性及穩定性。具體而言針對以下對其進行測試:(a) 升高溫度下之物理化學穩定性;(b) 溶解性;及(c)在典型製造製程設置中所見之物理及低pH壓力。
在具有不同緩衝劑、pH及賦形劑之四種調配物中實施物理化學穩定性評價。使該等調配物中之每一者在升高溫度(40℃)下受壓高達4週,且接著評價(a) 聚集成二聚體或高分子量物質之傾向(藉由SEC-HPLC、cGE及吸光度);及(b) 因異構化、去醯胺及/或氧化所致之任何潛在降解(如藉由iCE藉由電荷變異體之改變所觀察到)。
為評估皮下投與之適宜性,在兩種單獨之調配物中以150 mg/mL製備MCT1 Ab5.01。利用與4週穩定性評價所用之測試組相同之測試組來分析該等樣品,之後進行如上之分析評價。
使用強制降解之物理及化學手段進行之壓力研究評價MCT1 Ab5.01在多次凍融、攪動及低pH條件下對降解之敏感性。低pH研究模擬在抗體製造期間通常用於使潛在病毒去活化之條件。
此外,使用CHO-DG44 DHFR微型庫製造2.5克經純化抗體。藉由SDS-PAGE、SEC-HPLC分析材料之純度,藉由LAL分析內毒素且藉由流式細胞術分析結合。
在一些實施例中,本發明之抗體可具有:
a. 在4週穩定性研究期間,最小(<10%)之聚集、純度損失及電荷變異體變化
b. 在強直降解壓力研究中最小(<5%)之相同特性之變化
c. >100 mg/mL之溶解度
實例11:細胞株開發
a. 在4週穩定性研究期間,最小(<10%)之聚集、純度損失及電荷變異體變化
b. 在強直降解壓力研究中最小(<5%)之相同特性之變化
c. >100 mg/mL之溶解度
實例11:細胞株開發
開發高表現細胞株以使得能夠使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株cGMP商業製造MCT1 Ab5.01。
產生序列用於密碼子最佳化、基因合成及插入至表現載體中。製備總計6種不同的密碼子最佳化之變異體且藉由先導蛋白(pilot protein)產生(< 1 mg)確認。使用該6種抗體變異體序列轉染宿主細胞株(CHO-M),且產生穩定庫。選擇該等穩定庫中之一者且重新轉染以增強細胞株生產力。在兩個選殖步驟之後,將10-12個最高效價純系擴增且冷凍保存為研究細胞庫(Research Cell Bank,RCB)。在分批進料培養中實施對純系之進一步評價,且基於效價及生產力選擇三種優勢純系。為確認純系穩定性,藉由將細胞株連續傳代高達60代來實施表現型穩定性研究,其中監測抗體產生及生產力。在如上文所述確認活體外功效及活體內功能之後,選擇最高效價純系。為確認產物品質,評價經純化抗體之聚集及片段化(藉由SEC-HPLC)及電荷異質性(藉由icIEF)。在最高表現子上實施使用RP-UPLC MS/MS之肽圖譜分析以確認預期之胺基酸序列。
在一些實施例中,本發明之純系可產生至少1 g/L。可重複轉染優勢純系以增加mAb基因之拷貝數。
實例12:生物標記物發現及疾病關聯性
藥效學(PD)生物標記物發現
實例12:生物標記物發現及疾病關聯性
藥效學(PD)生物標記物發現
酮可用作PD生物標記物。該等代謝物:(a)在尿液或血液中易於量測;(b) 可藉由抗MCT1抗體投與誘導;及(c)在作用機制(MOA)中發揮合理作用,自身顯示顯著之免疫調節劑功能(參考文獻67)。MCT1 Ab5.01進一步用於活體外T細胞/B細胞分析(兩種細胞類型均參與狼瘡)及活體內分析中以在PD生物標記物上擴增。
代謝物。
使用代謝體學研究以評價大約12,000種小分子實體(包括內源性化合物、異生物質及其代謝物)之相對濃度曲線以及超過1,100種脂質物質之完全定量量測。自異種GVHD模型(MCT1 Ab5.01及對照處理)分離血漿及人類細胞,以及來自活體外T細胞及B細胞分析之細胞。對於異種GVHD而言,以10名不同健康供體、1個劑量及血液收集之各個時間點來運行實驗。對於活體外研究而言,利用MCT1 Ab5.01或對照來處理來自10名健康志願者(分別經抗CD3/CD28或CD40L/IL4刺激)或10名狼瘡患者(不經進一步刺激)之人類T細胞及B細胞。利用基於質譜之代謝體學,使用全球代謝體學及脂質體學技術進行分析以鑑別且量測每一樣品中所存在之分析物。生物化學變化分析包括代謝路徑分析以指示每一分析中之額外MOA,且使用後續MS分析對新穎代謝物進行去捲積。
細胞介素
。可使用來自Luminex研究之數據來比較嵌合MCT1 Ab1及對照處理之白血球以產生若干種細胞介素作為推定之生物標記物,包括(例如) IFNγ及IL10。亦使用MCT1 Ab5.01來確定細胞介素生物標記物。比較來自異種GVHD模型及活體外T細胞及B細胞分析之經處理與未經處理細胞群體之間的差異。利用5種不同供體來運行異種GVHD實驗,利用至少2種MCT1 Ab5.01劑量來處理動物,且在4個不同時間點收集血漿。對與臨床終點(移植物接受或排斥延遲)之相關性進行評分且鑑別其他細胞介素生物標記物。
轉錄本
。使用藉由RNA-seq之轉錄體學以鑑別與在異種GVHD模型(10名健康供體)及使用健康志願者(分別經抗CD3/CD28或CD40L/IL-4刺激)或狼瘡患者(不經進一步刺激)之活體外T細胞及B細胞分析中之細胞上的MCT1 Ab5.01處理有關之差異表現基因及路徑。使細胞糰粒在Illumina儀器上經受RNA分離、富含聚(A)之文庫製備及末端配對測序。原始數據係以fastq格式遞送,且生物資訊學係使用可公開獲得之差異表現管線(STAR aligner及來自R/Bioconductor之DESeq2)來實施。如下文所闡述跨越活體內及活體外系統二者驗證差異表現之轉錄本。
人類 T 細胞及 T/B 細胞分析
。除上文所述之T細胞及PBMC分析以外,亦在共培養系統中量測對T細胞及B細胞之效應。藉由負向選擇自人類PBMC分離T細胞,且在經抗CD3/CD28塗覆之96孔平底板上與CD19純化B細胞一起共培養5天。收集上清液以量測Ig產生(IgM及總IgG)以及B細胞活化標記物(CD80、CD83、CD86、II類MHC及細胞內Ig)。在培養起始時,以一系列濃度(0.1 μg/mL至10 μg/mL)添加MCT1 mAb或同型對照。為量測對B細胞活化之直接效應,使CD19純化B細胞與促效性CD40L (100 ng/ml大CD40L,Enzo Life Sciences)、IL-2 (50 U/mL)及IL-4 (400 U/mL)一起培養。經5天時期評價B細胞增殖、活化及Ig產生。在培養起始時添加MCT1 Ab5.01或對照。
PD生物標記物選擇及確認
PD生物標記物選擇及確認
尿酮可係強候選生物標記物。亦檢查其他試樣(血清/血漿/細胞),且分析以鑑別改變之分子組分(例如,丙酮、乙醯乙酸、β-羥基丁酸及/或更廣泛之類別,諸如環狀、飽和或不飽和酮)。此係在代謝體學部分中完成,其中藉由RNA-seq及/或流式細胞術或磷酸流式細胞術(PhosFlow cytometry)發現潛在相應的(或新的)基因/蛋白質變化。基於與病理學終點之相關性選擇PD生物標記物。亦可使用諸如NSG-SGM3小鼠(重構人類幹細胞)及/或人類-MCT1敲入小鼠等其他模型來確認來自異種GVHD之數據。
SGM3 小鼠 ( 重構幹細胞 )
。NOD/scid/IL2受體γ剔除小鼠(NSG)係用於植入人類血球、具體而言使用CD34+
造血幹細胞長期植入之標準小鼠品系。此植入在血液中產生大量人類淋巴球及數目顯著較少之骨髓細胞。最近,一組人類細胞介素基因已整合至此模型中(steel因子、GM-CSF及IL-3,稱為「SGM3」)。SGM3模型支持高水準之淋巴球以及高水準之人類骨髓細胞二者,從而提供更完全之人類血球植入。
人類 MCT1 敲入 (KI) 小鼠
。產生KI/KO小鼠模型,其中人類SLC16A1 (MCT1) cDNA在外顯子1處敲入,其具有防止小鼠基因表現之終止停止,由此產生小鼠SLC16A1基因之KO。此模型提供容許MCT1 Ab5.01結合內源性MCT1靶標之囓齒類動物品系。使用此小鼠品系實施其他狼瘡相關研究,諸如將來自MCT1 KI小鼠之CD8耗乏脾細胞轉移至(B6 × DBA)F1小鼠中,其接近在人類狼瘡中所觀察到之許多表現型(B細胞活化、抗ds DNA抗體、腎小球性腎炎、干擾素-α基因印記) (參考文獻90、91)。在一些實施例中,本發明之抗MCT1 mAb可阻抑該等狼瘡樣表現型中之多種表現型。
MCT1健康對照及患者樣品之人類狼瘡疾病關聯性
MCT1健康對照及患者樣品之人類狼瘡疾病關聯性
小鼠及人類中之數據表明,MCT1表現在慢性發炎部位增加。舉例而言,與健康供體相比,狼瘡患者外周血中人類漿細胞之MCT1之細胞表面表現顯著增加(圖20)。使用MCT1 Ab5.01及譜系分析,在來自狼瘡患者之細胞中研究MCT1表現。對至少3名健康志願者及3名狼瘡患者實施研究。
測定健康及狼瘡細胞中之 MCT1 表現。
為測定來自健康供體及來自狼瘡患者之血白血球中MCT1之組成型表現,經由針對MCT1 (MCT1 Ab5.01)、CD45、CD16、CD56、CD14、CD138、CD8、CD19、CD4及CD3之流式染色來表徵各種免疫群體(包括T細胞、B細胞及NK細胞)。抗Ki67及Cell Trace Violet在此處及下文中用於細胞增殖。
量測 MCT1 Ab5.01 對 T/B 細胞增殖之抑制
。為確定MCT1 Ab5.01是否抑制T細胞及B細胞增殖,分別用抗CD3/CD28珠粒+ IL-2或大CD40L + IL-4 + IL-2刺激經純化之T細胞或B細胞。使用CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RA、CD127及CD25鑑別T細胞之各種細胞亞群體,且使用CD19、CD20、CD38、CD27、IgD及IgG鑑別B細胞之各種細胞亞群體。使用結合MCT1上之細胞內抗原決定基之市售抗體(該等抗體不與MCT1 Ab5.01競爭)偵測MCT1。
MCT1 Ab5.01 抑制狼瘡中之淋巴球增殖
。使用來自狼瘡患者之PBMC實施MCT1 Ab5.01對淋巴球增殖之抑制。經由針對MCT1 (市售)、CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RA、CD127、CD25及CD56或單獨地CD19、CD20、CD38、CD27及IgG之染色鑑別各種T細胞及B細胞群體。
鑒於圖20中所呈現之數據,MCT1表現可與疾病嚴重程度、類型及/或進展階段相關。評估其他患者且研究其他細胞類型。
實例13:食蟹猴中之非GLP Tox/PK/PD。
實例13:食蟹猴中之非GLP Tox/PK/PD。
測試材料之製造。
產生6克MCT1 Ab5.01且分析材料之純度(SDS-PAGE、SEC-HPLC)及內毒素水準(LAL)。
非 GLP Tox/PK/PD
。如表1中所彙總,實施食蟹猴中之4階段研究,包括劑量遞增靶標介導之藥物處置(TMDD)研究,之後為重複劑量毒性、單次劑量PK及PD/TDAR研究。可實施睪丸及視網膜之生物分佈及組織分析。
表1. NHP研究設計
表1. NHP研究設計
研究 1
-靶標介導之藥物處置(TMDD)之劑量遞增評估。儘管MCT1不存在於人類紅血球(RBC)上,但其存在於食蟹猴之RBC上(圖18A)。因此,對2隻動物實施第一次食蟹猴研究以確定克服RBC沈降所需之劑量,且估計在不存在RBC (食蟹猴中但非人類血液中之較大TMDD靶標)下之準確PK及毒性。在抗體結合RBC之NHP研究中,引起短暫性貧血並不罕見(參考文獻92)。在此貧血狀態期間,對動物重複投藥且將MCT1 Ab5.01之血清水準與針對典型抗體所預測之PK進行比較。接受增加劑量之MCT1 Ab5.01及免疫分型/受體佔有率分析之食蟹猴將提示在後續食蟹猴研究中去除所有MCT1結合RBC之最佳劑量。基於早期研究選擇此分析之時間點(參考文獻92)。此容許評估接近於MCT1 Ab5.01與人類中白血球結合之劑量。
TMDD評價鑑別容許在食蟹猴中進行合理、可達成之投藥以用於其他研究之劑量。由於MCT1在食蟹猴而非人類RBC上之不尋常表現,因此在實施毒性及PK研究之前首先對食蟹猴RBC區室中之任一TMDD實施評價。此係在監測貧血的同時藉由量測MCT1 Ab5.01之血清水準且將該等值與典型抗體之預測PK進行比較來達成。
研究 2
-毒性。對於毒性測試,對3隻動物以低劑量實施先導性2週研究,該低劑量估計為1 mpk,其高於此藥物之最小預期生物效應水準(MABEL)。在此之後,對4隻動物檢查>10倍高之劑量以量測毒性。若調配物容許,則可選擇更大之劑量,諸如50 mpk。抽血時間表:第1天投藥前、投藥後10 min、1小時及24小時、緊接下次投藥之前及釋放或屍檢時。每天進行臨床量測及健康觀察且每週彙總。在標準時間點評估血液學、凝血、血清化學、胰島素、生物標記物及受體佔有率。對以較高劑量處理之動物進行屍檢,且使用組織病理學分析組織。
在食蟹猴中測定MCT1 Ab5.01之NOAEL (無可觀察到之不良效應水準)。NOAEL係基於標準毒物學準則,或若其未在毒性研究中觀察到,則調配之最高劑量水準用作NOAEL。在一些實施例中,本發明之抗MCT1抗體不產生顯著毒性且不刺激顯著發炎性細胞介素釋放。
研究 3
- PK。為測定MCT1 Ab5.01之清除,在第1天投藥前、投藥後10 min、1小時、24小時及168小時以及3週及4週在1個劑量後自3隻食蟹猴收集血液樣品以用於PK分析。藉由ELISA測定血清PK,且檢查數據之線性、C最大、AUC、CL及Vd以及終末t1/2測定。亦評價抗藥物抗體(ADA)反應。夾心ELISA ADA分析所需之抗MCT1 Ab5.01抗體工具係在使用如所述之MCT1 Ab5.01對食蟹猴(CRL)進行超免疫後產生的(參考文獻93)。使用合格之ADA分析比較來自投藥前及投藥後4週之血清。
本發明之抗體可具有大約20天之對人類IgG之正常PK。若PK較短,則探索已知之FcRn結合突變以改良mAb半衰期。
研究 4
- PD/TDAR。為評估MCT1 Ab5.01之免疫調節效應,在兩個劑量水準下實施T細胞依賴性抗體反應(TDAR)。總計8隻動物(每一劑量2隻雄性、2隻雌性)以靜脈內方式接受單次劑量之MCT1 Ab5.01。其他4隻動物(2隻雄性、2隻雌性)接受陰性對照。在第0天利用KLH及MCT1 Ab5.01對動物進行免疫。在研究起始之前及第7天、第10天、第14天、第21天及第28天收集血液樣品,且藉由ELISA分析抗KLH效價。在一些實施例中,本發明之抗MCT1抗體使該等效價抑制介於25%-90%之間。
本發明之抗體可具有支持皮下(SC)投與之功效。具有人類白血球之NSG模型在1 mpk下顯示效應且SC之目標為≤2 mpk。在異種GVHD中,MCT1 Ab1之MABEL為約1 mpk。TDAR用於在人類中為MCT1 Ab5.01提供更準確之MABEL。
實例14:臨床前及臨床項目規劃
實例14:臨床前及臨床項目規劃
上文所述之實驗提供關於MOA、效能及安全性之廣泛數據集。
使用抗MCT1抗體(包括針對狼瘡之彼等抗體)開發治療劑係基於關於MCT1 Ab5.01在非人類靈長類動物中及人類組織中之效應之彙總數據。將實施健康志願者之1期單次遞增劑量試驗及狼瘡患者之多次遞增劑量試驗。第二項研究計劃將包括多劑量安慰劑對照隨機化組件以評價治療患有活動性(非腎)全身性疾病之狼瘡患者之臨床效能。
實例15:活體外MCT1功能分析:溴丙酮酸鹽敏感性
實例15:活體外MCT1功能分析:溴丙酮酸鹽敏感性
利用抗MCT1抗體或小分子MCT1抑制劑將HEK293T細胞在37℃下預處理1小時。接著使細胞與25 μM至500 μM濃度範圍內之細胞毒性試劑3-溴丙酮酸鹽(3-BrPy)一起培育2至6小時。使用市售存活率套組(ATPlite, PerkinElmer)在96孔板中量化來自瀕死細胞之ATP且使用發光量測存活率。ATP產生之降低指示抗體之功能性。陽性對照抗體係人類化之前之小鼠或嵌合抗體。陰性對照細胞株係MCT1/CD147雙剔除293T細胞。
使用此分析,可鑑別功能性(亦即拮抗性)抗MCT1抗體。
實例16:非人類靈長類動物中之活體內研究確證抗MCT1抗體之治療效能及安全性
實例16:非人類靈長類動物中之活體內研究確證抗MCT1抗體之治療效能及安全性
據報導,不表現MCT1之人類(無效突變體)不展現主要毒性。與無MCT1表現相關之唯一已知異常包含誘導之酮酸中毒,其僅在青春期前患者中觀察到,且在較老之個體中未觀察到。尚未報導明顯免疫表現型。此外,基於MCT1對免疫之效應,發明者推測該等個體甚至可對免於發生自體免疫疾病或自體免疫具有一些保護。
為進一步確證抗MCT1抗體對人類療法之安全性及效能,吾人向食蟹猴投與50 mpk劑量之抗人類MCT1抗體。如此實例中所揭示且藉由本文所引用之圖確證,30天後未觀察到毒性。
如圖22中所示,當MCT1參與各種功能時,存在避免淋巴系統外之毒性之冗餘路徑。相比之下,MCT1在淋巴樣系統(B細胞、T細胞)中具有唯一轉運蛋白路徑,其使本發明拮抗性抗MCT1抗體具有阻斷此轉運蛋白路徑及其在淋巴樣系統中之相關活性之效能。
如圖23中所示,食蟹猴紅血球(RBC)表現高水準之MCT1。基於此,吾人測試拮抗性抗MCT1抗體在食蟹猴中之效應,且尤其觀察在抗MCT1抗體投藥後對RBC之任何效應。此外,吾人測定食蟹猴是否可耐受治療有效劑量之抗體。
如藉由圖24中之結果所證實,食蟹猴耐受50 mpk Ab1之重複投藥,且儘管在投藥後RBC質量存在初始降低,但此在短時間後消退。該等結果指示,拮抗性抗MCT1抗體在靈長類動物中應係安全且有效的。
如圖25中所進一步顯示,在食蟹猴中所觀察到之PK數據雖然係初步的,但進一步指示抗MCT1抗體具有充分暴露,且結果指示在Ab1劑量率>
5 mpk時,RBC沈降係飽和的。
此外,進一步觀察到在投與抗MCT1抗體後30天,在良好暴露下未觀察到顯著之生命毒性,具體而言在以50 mpk投與4週劑量之拮抗性抗MCT1抗體(Ab1)之後。特定而言,在吾人使用H&E評價之所有器官(心臟、肌肉、睪丸及眼睛)中未發現不利之組織學發現。
實例17:小鼠條件性KO毒物學評價
實例17:小鼠條件性KO毒物學評價
為進一步評價拮抗性抗MCT1抗體作為治療劑之潛在安全性及效能,吾人研究在小鼠中條件性剔除MCT1之效應。
如圖26中所示,吾人評估他莫昔芬誘導型MCT1剔除小鼠中之靶組織(肌肉、睪丸及眼睛)。發現吾人所研究之所有器官(睪丸除外)均係正常的,無基因型相關之變化。如圖27中所示,MCT1剔除小鼠動物具有較小之睪丸且顯微鏡發現指示一些精細胞退化。
如圖28中所進一步顯示,相對於對照管家基因(HPRT)之表現,MCT1 KO表現型在所分析之各種靶組織(亦即,胸腺、脾、淋巴結、睪丸及視網膜)中賦予強勁之他莫昔芬誘導型MCT1表現減弱。圖29進一步顯示在剔除小鼠中所觀察到之睪丸中之表現型變化。如所示,在所有MCT1剔除小鼠之睪丸中均觀察到精細胞退化(缺乏末期精細胞及精母細胞、管狀細胞結構減少、空泡形成及細胞碎片)。圖30進一步比較WT及MCT1 KO小鼠中之睪丸組織學,且顯示相對於野生型,剔除小鼠中精細胞退化增加。
實例18:先前報導之抗MCT1抗體不顯示拮抗活性
實例18:先前報導之抗MCT1抗體不顯示拮抗活性
存在據稱與MCT1結合之多種市售抗體。基於申請人對該等抗體之篩選,無抗體結合至細胞表面表現之MCT1,且此外就本發明者所知,該等市售抗MCT1抗體均不調節或阻斷MCT1之效應。
圖31彙總不同市售抗MCT1抗體之該等結果。該圖含有使用所有Abcam市售抗MCT1抗體(單株抗體及多株抗體)之MFI (上圖,流式細胞術,活細胞之細胞結合)及溴丙酮酸鹽功能性分析結果(下圖,RLU)。(目錄號列示於該圖中)。
如自該等結果可見,該等市售抗MCT1抗體不結合至MCT1表現細胞,且因此不引發對MCT1相關活性之效應。相比之下,本發明抗MCT1抗體在該等相同分析中結合至MCT1細胞表面表現之MCT1 (在不同細胞上),且有力地阻斷MCT1之轉運蛋白功能(亦即,其轉運溴丙酮酸鹽之能力)。本發明者迄今所測試之每種其他市售抗MCT1抗體觀察到類似結果(未示出)。
實例19:例示性抗MCT1抗體(Ab1)之人類化
實例19:例示性抗MCT1抗體(Ab1)之人類化
使用已知方法對前述實例中所用之大鼠抗MCT1抗體(Ab1或INX310)之可變重鏈及輕鏈多肽進行人類化以提供用於人類療法之人類化抗MCT1抗體。例示性人類化重鏈及輕鏈示於下文中。在所繪示之序列中,可變重鏈或輕鏈多肽加下劃線,且與其相關之恆定區(IgG1恆定區)為粗體。例示性序列包含Fc沈默之人類IgG1/κ主鏈(人類IgG1) (Uniprot P01857),其經修飾以含有消除C1q及FcR結合之突變(E269R/K322A突變)。可變區加下劃線,且恆定區為粗體。所繪示之例示性人類化輕鏈及重鏈序列中未顯示信號序列。
人類化重鏈
>aMCT1_人類化_VH1_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH2_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH3_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH4_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH_AmbCons_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH_AmbMod_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH_AmbAgg_hIgG1_INX沈默_HC
人類化輕鏈
>aMCT1_人類化_VL1_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL2_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL3_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL4_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL_AmbCons_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL_AmbMod_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL_AmbAgg_hκ_LC
人類化重鏈
>aMCT1_人類化_VH1_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH2_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH3_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH4_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH_AmbCons_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH_AmbMod_hIgG1_INX沈默_HC
>aMCT1_人類化_VH_AmbAgg_hIgG1_INX沈默_HC
人類化輕鏈
>aMCT1_人類化_VL1_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL2_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL3_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL4_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL_AmbCons_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL_AmbMod_hκ_LC
>aMCT1_人類化_VL_AmbAgg_hκ_LC
根據本發明之例示性人類化抗MCT1抗體進一步陳述於下文中。該等例示性人類化抗體包含共同輕鏈。序列中之粗體殘基係預測CDR (使用IMGT DomainGapAlign鑑別)。
大鼠抗MCT1抗體(Ab1或INX310)
>大鼠抗MCT1 Ab _VH
>大鼠抗MCT1 Ab _VL
人類化抗MCT1抗體1 (Ab2或INX352)
>人類化抗MCT1抗體1_VH
>人類化抗MCT1抗體1、2及3_VL
人類化抗MCT1抗體2 (Ab3或INX356)
>人類化抗MCT1抗體2_VH
>人類化抗MCT1抗體1、2及3_VL
人類化抗MCT1抗體3 (Ab4或INX364)
>人類化抗MCT1抗體3 _VH
>人類化抗MCT1抗體1、2及3 _VL
沈默IgG1 (恆定)
· E269R/K322A
>IgG1_INX_沈默
實例20:親和力成熟之人類化抗MCT1抗體
大鼠抗MCT1抗體(Ab1或INX310)
>大鼠抗MCT1 Ab _VH
>大鼠抗MCT1 Ab _VL
人類化抗MCT1抗體1 (Ab2或INX352)
>人類化抗MCT1抗體1_VH
>人類化抗MCT1抗體1、2及3_VL
人類化抗MCT1抗體2 (Ab3或INX356)
>人類化抗MCT1抗體2_VH
>人類化抗MCT1抗體1、2及3_VL
人類化抗MCT1抗體3 (Ab4或INX364)
>人類化抗MCT1抗體3 _VH
>人類化抗MCT1抗體1、2及3 _VL
沈默IgG1 (恆定)
· E269R/K322A
>IgG1_INX_沈默
實例20:親和力成熟之人類化抗MCT1抗體
對前述實例中所揭示之大鼠抗MCT1抗體(Ab1或INX310)之可變重鏈及輕鏈多肽進行人類化及親和力成熟以提供適於人類療法之人類化、親和力成熟之抗MCT1抗體。該等抗體以高親和力結合至人類MCT1,且在人類個體中應實質上為非免疫原性的。該等人類化及親和力成熟之抗MCT1抗體(Ab5-Ab60)之VH
及VL
序列含於緊接在本申請案之申請專利範圍之前的序列表中。如同Ab1 (INX310),該等抗體可用於在活體外或活體內拮抗MCT1之效應,且基於其增加之親和力,其應較Ab1 (INX310)更強效。圖32含有比較在溴丙酮酸鹽功能性分析中根據本發明之不同抗MCT1抗體(亦即,INX420、INX356、INX364、INX444及INX453)之拮抗活性之實驗結果。
圖33及圖34含有比較本文所揭示之不同抗MCT1抗體之可變重鏈及可變輕鏈區序列之比對。具體而言,該等圖分別比對Ab1 (INX310)、衍生自其之3種人類化抗體(亦即Ab2 (INX352)、Ab3 (INX356)及Ab4 (INX364))與源自Ab1之人類化親和力成熟之抗MCT1抗體(亦即Ab23 (INX420)、Ab47 (INX444)及Ab56 (INX453))之VH
及VL
序列。該等比對中之加框區顯示框架殘基之序列差異。CDR為粗體,且顯示與親代抗體Ab1及其人類化變異體(亦即Ab2 (INX352)、Ab3 (INX356)及Ab4 (INX364))之CDR相比,該等親和力成熟抗體中之CDR變化。
實例21:其他高親和力功能性抗MCT1抗體之分離
實例21:其他高親和力功能性抗MCT1抗體之分離
在雞中產生其他抗人類MCT1抗體。利用在其表面上表現人類MCT1蛋白之重組細胞對雞進行免疫,以潛在地引發功能性抗人類MCT1結合抗體之產生。自該等動物獲得血清且篩選抗MCT1結合抗體。接著選殖編碼該等抗體之核酸且在宿主細胞中表現。此等方法分離出超過100種推定人類MCT1結合抗體,包括抗人類MCT1抗體Ab61直至Ab95,其具有含於在申請專利範圍之前的序列表中之序列。
進一步篩選該等抗體以鑑別特異性結合至表現MCT1之293細胞之彼等抗體。圖35A顯示抗MCT1抗體與MCT+
293細胞之結合,該等抗體之一些序列含於申請專利範圍之前之序列表中。該等抗體在序列表中鑑別為抗MCT1抗體Ab61直至Ab95並且藉由替代命名法(「LM-XXX」或「MCT」指定)鑑別,一些抗MCT1抗體藉由該命名法在圖35A及圖35B中鑑別。自圖35A中之結合結果可見,許多該等抗體以與Ab1 (INX310)相當之親和力結合至表現MCT1之293細胞。
在功能性分析中進一步篩選展示特異性結合至在293細胞表面上表現之人類MCT1之相同抗MCT1抗體,該等分析篩選在先前所述之溴丙酮酸鹽毒素轉運分析中阻斷或拮抗MCT1效應之彼等MCT1結合抗體。如圖35B中所進一步顯示,該等功能性篩選方法展示許多該等抗人類MCT1抗體在此分析中具有功能性,亦即如藉由ATP-lite所量測,其提供免於細胞死亡之保護。該等其他抗人類MCT1抗體與Ab1及衍生自其之其人類化及親和力成熟變異體(在本文中鑑別為Ab2至Ab60)之序列相比具有序列多樣性,亦即該等其他抗MCT1抗體均不包含與Ab1至Ab60相同之CDR。
該35種其他抗人類MCT1抗體(稱為Ab61至Ab95)之序列可參見在本申請案之申請專利範圍之前的序列表。該序列表含有重鏈及輕鏈CDR、可變重鏈及輕鏈多肽、重鏈及輕鏈多肽之胺基酸序列,且進一步含有編碼該35種抗人類MCT1抗體中之每一者之核酸序列。基於其與Ab1相當之與人類MCT1之結合親和力及其在溴丙酮酸鹽毒素分析中之功能活性,預期許多該等抗體可用於開發其他治療性抗MCT1抗體,例如藉由人類化及/或親和力成熟。
所得抗體將以高親和力結合至人類MCT1,且此外在人類個體中應實質上為非免疫原性的。如同Ab1 (INX310)及衍生自其之人類化或親和力成熟變異體(Ab2至Ab60),源自Ab61至Ab95之人類化及/或親和力成熟之抗MCT1抗體可潛在地用於在活體外或活體內拮抗MCT1之效應,且可潛在地用於治療疾病,諸如發炎性、自體免疫及過敏性病狀、癌症、移植及GVHD以及其中在治療上期望TR1細胞增加及/或T效應細胞減少或MCT1活性降低之其他病狀。
此外,預期本文所揭示之人類化或人類化親和力成熟重鏈及輕鏈多肽之不同組合可經組合以產生其他功能性(拮抗性)抗MCT1抗體。此外,本文所揭示之例示性人類化或人類化親和力成熟重鏈及輕鏈多肽中之任一者可進一步經人類化,或可藉由已知人類化方法自Ab1 (INX310)或Ab2至Ab95中之任一者衍生含有其他人類化可變重鏈及輕鏈多肽之其他人類化抗MCT1抗體以獲得適於人類療法之其他人類化抗MCT1抗體。此外,該等人類化序列可進一步經親和力成熟以獲得結合親和力增加之抗MCT1抗體。此外,該等人類化或親和力成熟抗體多肽可併入至多特異性結合多肽中,該等多特異性結合多肽可具有不同形式,諸如雙特異性抗體、BsAb、雙重可變結構域-IgG (DVD-Ig)雙價抗體以及其他眾所周知之多特異性抗體形式。
該等人類化重鏈及輕鏈多肽可進一步與不同人類IgG恆定結構域締合,該等不同人類IgG恆定結構域係例如人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4恆定結構域或結構域或其片段。若期望,則該等恆定區可經修飾以損害或增強至少一種效應功能,諸如FcR結合,例如FcγR (IgG)、FcεRI (IgE)、FcαRI (IgA)、FcμR (IgM)及FcδR (IgD)結合、補體結合、ADCC活性、CDC活性、FcRN結合及諸如此類。例示性「效應功能」包括(但不限於) Clq結合;補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;下調細胞表面受體(例如,B細胞受體;BCR)及諸如此類。此等效應功能通常需要Fc區與結合結構域(例如,抗體可變結構域)組合,且可使用此項技術中已知用於評估此等抗體效應功能之各種分析來評價。
例示性人類化及人類化親和力成熟序列意欲為例示性的,此乃因其他人類化或親和力成熟方法可用於衍生源自Ab1或本文所揭示之其他抗MCT1抗體之替代性人類化重鏈及輕鏈多肽,其可用於產生用於人類或動物療法中之人類化抗MCT1抗體。本發明尤其囊括包含與Ab1至Ab95中之任一者相同CDR之任何抗MCT1抗體。
實例22:根據本發明之不同抗MCT1抗體之功效
實例22:根據本發明之不同抗MCT1抗體之功效
在測定根據本發明之兩種抗MCT1抗體(亦即,INX420及INX310)在不同抗體濃度下對CD4+
及CD8+
T細胞增殖之效應之分析中比較此等抗體之功效。如圖36A至圖36D中所示,兩種抗體均抑制CD4+
及CD8+
T細胞之增殖。在該兩種抗體中,親和力成熟抗體INX420更強效地抑制CD4+
及CD8+
T細胞之增殖,且在該等功能性分析中具有單數位nM功效。
該等結果展示,如同親代抗體Ab1,藉由使Ab1親和力成熟得到之此抗MCT1抗體與根據本發明之另一抗MCT1抗體(Ab1)相比強效地阻抑CD4+及CD8+
T細胞之增殖。
實例23:抗MCT1抗體對Tr1細胞之活體外效應
實例23:抗MCT1抗體對Tr1細胞之活體外效應
在活體外分析中進一步評估根據本發明之抗MCT1抗體以評價其對Tr1細胞之效應。用於產生Tr1細胞之方法及使用Tr1細胞之分析闡述於下文中。
Tr1細胞之活體外產生及Tr1功能性分析
Tr1細胞之活體外產生及Tr1功能性分析
使用新鮮總hPBMC之CD3/CD28刺激(+INX420)在活體外產生Tr1細胞,且使用下文所述之方法及材料,利用抗MCT1抗體在活體外在功能性分析中測試該等細胞。
試劑
1. 96孔組織培養平底板(Falcon,目錄號353072)
2. 50 mL試劑儲器(Costar,目錄號4870)
3. PBS (Corning,目錄號21-040-CV)
4. 培養基- RPMI 1640 (HyClone,目錄號SH30096.01)。10%人類血清、1×青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸、10 mM HEPES
5. 用於Jurkat之培養基- RPMI 1640 (HyClone,目錄號SH30096.01)。10% FBS、1×青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸、10 mM Hepes
6. 抗CD3 -純系OKT3 (Bio X Cell. 目錄號BE0001-2)
7. 抗CD28 -純系15E8 (Miltenyi Biotec,目錄號130-093-375)
8. 血球分離錐血
9. Histopaque 1077
10. INX420批號17069-8129269
11. Versene 1× (Gibco,目錄號15040-066)
第-1天/第0天:利用抗CD3塗覆板
1. 於PBS中將原液OKT3稀釋至1 μg/ml
2. 向96孔平底板之每一孔添加100 μl 1 μg/ml OKT3
3. 在4℃下培育隔夜或在37℃下培育1 h
第0天:刺激新鮮人類PBMC
1. 自臍帶血製備新鮮PBMC
• 在無菌條件下將血液轉移至50 ml falcon且用PBS稀釋至30 ml
• 在經稀釋之血液下方緩慢層鋪13 ml Histopaque 1077
• 在室溫下以850×g離心20 min,溫和加速(1/5或3/9)且鬆開制動器
• 自血漿/聚蔗糖界面收集單核細胞且重新懸浮於50 ml PBS中,以400×g離心5 min
• 對細胞(1:10稀釋)進行計數且以200 K/100 μl (2*106 /ml)製備hPBMC
2. 於RPMI中將OKT3塗覆板洗滌2次
• 自板去除PBS
• 立即向孔中添加200 μl RPMI
• 去除培養基且向孔中添加200 μl RPMI
3. 取OKT3塗覆板且去除剩餘RPMI。藉由在無菌紗布覆蓋之紙巾上將板吸乾確保去除任何剩餘之培養基
4. 於RPMI中以2×製備所有試劑及mAb,每孔添加100 μl
5. 以於100 μl中200 k添加細胞且在37℃/5% CO2 下培育長達7天。
若細胞培養超過7天,則用含有10× mAb (CD28, INX420)之20 μl培養基補充培養物
Tr1表現型分型
試劑
1. 96孔組織培養平底板(Falcon,目錄號353072)
2. 50 mL試劑儲器(Costar,目錄號4870)
3. PBS (Corning,目錄號21-040-CV)
4. 培養基- RPMI 1640 (HyClone,目錄號SH30096.01)。10%人類血清、1×青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸、10 mM HEPES
5. 用於Jurkat之培養基- RPMI 1640 (HyClone,目錄號SH30096.01)。10% FBS、1×青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸、10 mM Hepes
6. 抗CD3 -純系OKT3 (Bio X Cell. 目錄號BE0001-2)
7. 抗CD28 -純系15E8 (Miltenyi Biotec,目錄號130-093-375)
8. 血球分離錐血
9. Histopaque 1077
10. INX420批號17069-8129269
11. Versene 1× (Gibco,目錄號15040-066)
1. 於PBS中將原液OKT3稀釋至1 μg/ml
2. 向96孔平底板之每一孔添加100 μl 1 μg/ml OKT3
3. 在4℃下培育隔夜或在37℃下培育1 h
第0天:刺激新鮮人類PBMC
1. 自臍帶血製備新鮮PBMC
• 在無菌條件下將血液轉移至50 ml falcon且用PBS稀釋至30 ml
• 在經稀釋之血液下方緩慢層鋪13 ml Histopaque 1077
• 在室溫下以850×g離心20 min,溫和加速(1/5或3/9)且鬆開制動器
• 自血漿/聚蔗糖界面收集單核細胞且重新懸浮於50 ml PBS中,以400×g離心5 min
• 對細胞(1:10稀釋)進行計數且以200 K/100 μl (2*106 /ml)製備hPBMC
2. 於RPMI中將OKT3塗覆板洗滌2次
• 自板去除PBS
• 立即向孔中添加200 μl RPMI
• 去除培養基且向孔中添加200 μl RPMI
3. 取OKT3塗覆板且去除剩餘RPMI。藉由在無菌紗布覆蓋之紙巾上將板吸乾確保去除任何剩餘之培養基
4. 於RPMI中以2×製備所有試劑及mAb,每孔添加100 μl
5. 以於100 μl中200 k添加細胞且在37℃/5% CO2 下培育長達7天。
若細胞培養超過7天,則用含有10× mAb (CD28, INX420)之20 μl培養基補充培養物
Tr1表現型分型
如下對源自用根據本發明之抗MCT1抗體處理之動物血清之Tr1細胞進行表現型分型:
材料及方法:
- 使用100 μl總血液進行分析
- 使用染色-1洗滌方案對血液進行染色以容許利用下文之Ab組套(panel)進行絕對細胞計數,之後為FACS溶解緩衝液1× (BD Bioscience,編號349202);使全血與10×抗體(如下所示)一起培育且在30 min後,遵循製造商說明書,使血液在較大體積之1×溶解緩衝液中溶解(至少6次);或首先用ACK使血液溶解(10 min),於PBS中洗滌且用抗體混合物染色,正如下表中所描述。
下文為流動組套(用於血液ALC)
FACS
FACS (用於人類Tr1表現型分型)
材料及方法:
- 使用100 μl總血液進行分析
- 使用染色-1洗滌方案對血液進行染色以容許利用下文之Ab組套(panel)進行絕對細胞計數,之後為FACS溶解緩衝液1× (BD Bioscience,編號349202);使全血與10×抗體(如下所示)一起培育且在30 min後,遵循製造商說明書,使血液在較大體積之1×溶解緩衝液中溶解(至少6次);或首先用ACK使血液溶解(10 min),於PBS中洗滌且用抗體混合物染色,正如下表中所描述。
下文為流動組套(用於血液ALC)
FACS
另外使用下文所陳述之流動抗體進行在推定Tr1細胞表面上表現之標記物之表面表徵。
另外使用下文所陳述之流動抗體進行由推定Tr1細胞在細胞內表現之標記物之細胞內表徵。
第7天:收集細胞用於FACS及阻抑分析
1. 自200 μl培養基(池孔)收集細胞
2. 藉由每孔添加150 μl無菌Versene自板解離剩餘細胞,在37℃下培育10 min,與先前所收集之培養基合併
3. 在室溫下在振盪(400 rpm)下於50 μl抗體混合物(用於Tr1純度檢查之組套)中將細胞染色30 min或進行阻抑分析
使用所產生之Tr1細胞進行活體外分析
1. 自200 μl培養基(池孔)收集細胞
2. 藉由每孔添加150 μl無菌Versene自板解離剩餘細胞,在37℃下培育10 min,與先前所收集之培養基合併
3. 在室溫下在振盪(400 rpm)下於50 μl抗體混合物(用於Tr1純度檢查之組套)中將細胞染色30 min或進行阻抑分析
使用所產生之Tr1細胞進行活體外分析
根據本發明之抗MCT1抗體之效應可使用如上文所述在分析(例如,下文所陳述之分析)中產生之T1r1細胞在活體外分析中進行評估。
1. 存活率%
2. TIGIT+ PD1+ 細胞之數目及%
3. 利用人類CD3+ (或TIGIT+ PD1+ )細胞之阻抑分析
4. 第6天/第7天:阻抑新鮮人類PBMC或T細胞(包括Jurkat)之增殖
1. 存活率%
2. TIGIT+ PD1+ 細胞之數目及%
3. 利用人類CD3+ (或TIGIT+ PD1+ )細胞之阻抑分析
4. 第6天/第7天:阻抑新鮮人類PBMC或T細胞(包括Jurkat)之增殖
可用於該等分析中之例示性試劑及材料闡述於下文中。
試劑及材料
• CD3/CD28 Dynabeads (Life Technologies,目錄號11131D)
• Cell Trace Violet (Invitrogen,編號C34557)
• 反應細胞:PBMC、T細胞、Jurkat細胞
結果
試劑及材料
• CD3/CD28 Dynabeads (Life Technologies,目錄號11131D)
• Cell Trace Violet (Invitrogen,編號C34557)
• 反應細胞:PBMC、T細胞、Jurkat細胞
如圖37A至圖37D中之結果所顯示,在CD3/CD28刺激後,利用例示性抗MCT1抗體INX420活體外處理PMBC使得PD1+
TIGIT+
細胞之數目大幅增加。此外,所觀察到之結果與小分子MCT1抑制劑在相同活體外分析中所引發之彼等結果相當。
如圖38中之結果所另外顯示,該等活體外實驗進一步揭示,作為利用同一例示性抗MCT1抗體INX420處理之結果而產生之PD1+
TIGIIT+
Tr1細胞強效地阻抑PMBC之增殖。
如圖39中之活體外實驗(該等實驗評估在抗MCT1抗體及IL-10拮抗劑存在下PMBC之增殖)結果所進一步顯示,證實利用IL-10拮抗劑(例如抗IL10RB)阻斷IL-10信號傳導並不干擾Tr1介導之對PMBC增殖之阻抑,此係由利用抗MCT1抗體處理所引起。
前述實驗結果具有臨床意義,此乃因在多種自體免疫及發炎性疾病(臨床前及臨床模型中)中已展示Tr1細胞頻率/功能及其數目之缺陷,此指示產生IL-10之Tr1細胞與疾病保護有關且使得Tr1細胞活體內增加之藥物在治療/預防T細胞介導之疾病(例如,自體免疫及發炎性病狀)以及同種異體移植中具有潛在應用。
實例24:抗MCT1抗體在異種GvHD分析中之效應
實例24:抗MCT1抗體在異種GvHD分析中之效應
進一步在GVHD之活體內模型(亦即,異種GvHD模型)中評估根據本發明之例示性抗MCT1抗體(亦即,INX420、INX413及INX310)。
異種GvHD模型:
異種GvHD模型:
在此GvHD動物模型中,利用亞致死輻照(250拉德)處理雄性NSG小鼠,且之後該等小鼠接受2.5×106
個新鮮人類PBMC (第0天)。將第一劑抗人類MCT1與細胞組合且靜脈內注射。後續處理時間表為每週一次(第7天、第14天及第21天,IP)。抗MCT1 (INX420或其他抗MCT1)及人類IgG1對照二者均係以10 mg/Kg (或按照指定)投用。
對於再攻擊實驗,經抗MCT1先前治療(第0天、第7天、第14天、第21天)之NSG小鼠接受第二劑相同供體之2.5×106
個先前冷凍人類PBMC (第42天)。在無其他抗體治療之情形下監測該等小鼠之存活及重量減輕,且與接受相同供體PBMC之新的NSG小鼠同類群組進行比較。
絕對淋巴球計數(ALC)。
絕對淋巴球計數(ALC)。
使用100 μl總血液進行分析:使用染色-1洗滌方案對血液進行染色以容許利用下文之Ab組套進行絕對細胞計數,之後為FACS溶解緩衝液1× (BD Bioscience,編號349202);使全血與10×抗體(如下所示)一起培育且在30 min後,遵循製造商說明書,使血液在較大體積之1×溶解緩衝液中溶解(至少6次);或首先用ACK使血液溶解(10 min),於PBS中洗滌且用抗體混合物染色,正如下表中所描述。
離體阻抑實驗
離體阻抑實驗
在第67天或其他指定日期處死人類化NSG小鼠(經抗MCT1治療),自脾製備單細胞懸浮液,之後進行基於珠粒之hCD3+細胞富集。在經典抗CD3/抗CD28刺激(dynabeads,Life Technologies,編號11131D)條件下,使經分離之細胞與不同供體之新鮮人類PBMC一起或不與其一起平鋪72至96小時,之後用氚化胸苷脈衝16小時以評價增殖。
表:抗體混合物
表:抗體混合物
或者,根據Cell Trace™ Violet染料稀釋液之減少來量測對新鮮PBMC增殖之阻抑。為此目的,利用Cell Trace™ Violet細胞增殖套組對反應PBMC進行細胞標記,以用於流式細胞術(C34557,Thermo Fisher)。接著使反應PBMC與不同量之Tr1細胞一起共培養96小時。Tr1細胞定義為TIGIT+PD1+細胞,使用磁性珠粒技術(Miltenyi Biotech)進行分離。
離體Tr1存活
離體Tr1存活
在第32天或其他指定日期處死人類化NSG小鼠(經抗MCT1治療),自脾製備單細胞懸浮液,之後進行基於珠粒之hCD3+細胞富集。將經分離之細胞與分析物(參見上表)一起平鋪以獲得Tr1存活:
結果
結果
如圖40A至圖40D及圖41A至圖41C中之結果所顯示,該等實驗揭示,與經對照抗體治療之NSG小鼠相比,在異種GvHD模型中利用根據本發明之例示性抗MCT1抗體(亦即,INX420、INX413及INX310)進行治療使得CD3+
、CD4+
及CD8+
效應T細胞之數目顯著減少。此外,該兩種抗MCT1抗體均引發Tr1細胞數目之顯著增加。
此外,如圖42A至圖42B中之實驗結果所顯示,當該等動物在第42天用來自相同供體之供體PMBC再攻擊時,該等相同例示性測試之抗MCT1抗體在異種GvHD模型中進一步引發長期保護及耐受性。
如圖43及圖44中所含之生物標記物結合結果所進一步顯示,TIGIT及PD1係Tr1細胞之推定生物標記物,此乃因該等生物標記物在異種GvHD模型中超過75%之人類T細胞上表現。如圖45中之實驗結果所進一步顯示,Tr1細胞表現高水準之顆粒酶B,但不表現FOXP3或Blimp1。
圖46A至圖46C中之實驗進一步展示,在第14天,該等NSG小鼠含有多個效應細胞且進一步顯示例示性抗MCT1抗體(INX420)阻抑hCD3+
細胞之增殖。圖47A至圖47B中之實驗結果亦顯示,Tr1細胞強效地阻抑hCD3+
細胞及總PMBC之增殖。
圖48示意性地顯示異種GvHD模型中Tr1細胞產生之動力學。具體而言,該圖顯示抗MCT1抗體減少T效應期。圖49A至圖49B顯示離體Tr1存活因子。圖49B進一步顯示,殺死靶細胞不係Tr1細胞引發此阻抑之機制,且Tr1細胞在與靶細胞一起共培養時存活,但若個別培養則死亡。圖49A中所示之實驗結果揭示,抗TIGIT及PVR配位體不改良離體Tr1存活。相比之下,如圖49A中所進一步顯示,IL-2、IL-7及IL-15以劑量依賴性方式延長離體Tr1存活,其中Tr1細胞存活率增加至約75%。
實例25:小分子MCT1拮抗劑對酮病之效應
實例25:小分子MCT1拮抗劑對酮病之效應
基於MCT1抑制劑對酮病之效應,進一步進行實驗以評價其對安全性之效應。如圖50A至50B中之實驗結果所顯示,小分子MCT1抑制劑(SMi)使由饑餓8至24小時觸發之酮病加劇;在饑餓時,SMi驅動之酮病繼續發生低血糖症且SMi治療加劇饑餓驅動之酮病及低血糖症。
相比之下,圖51A至圖51B中之實驗結果顯示,在存在及不存在SMi下,饑餓24小時不觸發酮酸中毒。相反,本發明者僅在高劑量之SMi下觀察到僅輕微之饑餓依賴性pH降低(自7.3至7.1)及輕微之額外降低(約0.05)。
實例26:藉由丙胺酸掃描實驗對功能性抗MCT1抗體之抗原決定基表徵
實例26:藉由丙胺酸掃描實驗對功能性抗MCT1抗體之抗原決定基表徵
進一步進行丙胺酸掃描實驗以鑑別構成由本發明之功能性抗MCT1抗體所結合之一或多種抗原決定基之MCT1殘基。具體而言,由4種例示性功能性抗人類MCT1抗體(INX444、INX420、LM183及LM186)所結合之抗原決定基在靶蛋白MCT1之模型結構上可視化。選擇該4種抗體以代表本文中所鑑別之彼等抗體。特定而言,該等抗體中之2者係小鼠抗人類MCT1抗體INX310 (Ab1)之親和力成熟變異體,且另2者係雞抗人類MCT1抗體。該等抗體中之全部4者均為功能性抗體,亦即全部均阻斷人類MCT1功能。
藉由高通量流式細胞術一式兩份測定每一測試Fab與所構築之丙胺酸掃描文庫中每一突變純系之結合。對於每一點,自原始數據減去背景螢光,接著將其正規化為與WT靶蛋白之Fab反應性。對於每一突變純系,繪製隨表現(由對照反應性表示)而變之平均結合值之圖。為鑑別初步之主要關鍵純系,應用>70%之WT與對照MAb或Fab結合及<15%之WT與測試Fab結合之臨限值。次要純系不滿足設定臨限值,但其降低之結合活性及與關鍵殘基之接近度進一步表明突變殘基可係抗體之一部分。
下表含有所鑑別之用於使源自所有4種所測試抗人類MCT1抗體之一或多個Fab與靶標(人類MCT1蛋白)結合之關鍵殘基。關鍵殘基係其中其突變使得與特定抗體之反應性最低之彼等殘基。經驗證之關鍵殘基代表側鏈對抗體-抗原決定基相互作用作出最高能量貢獻之胺基酸(Bogan, A.A.及Thorn, K.S. (1998). 「Anatomy of hot spots in protein interfaces」.J. Mol. Biol.
280, 1-9.;Lo Conte, L.、Chothia, C.及Janin, J. (1999). The atomic structure of protein-protein recognition sites.J. Mol. Biol
. 285, 2177-2198., 1999);因此,該等殘基可能係結合抗原決定基之主要能量貢獻者。
下表進一步含有所鑑別之關鍵殘基之平均結合反應性(及範圍),該等關鍵殘基構成該4種相同抗體之MCT1抗原決定基。Fab結合之關鍵殘基(以紅色標出)係其突變對於與測試Fab結合為陰性但對於與對照Fab結合為陽性之殘基。鑑別出不滿足臨限值指南之其他次要殘基(以藍色標出),但其降低之結合活性及與關鍵殘基之接近度表明其可能係抗體抗原決定基之一部分。
參與該4種例示性功能性抗人類MCT1抗體(INX444、INX420、LM183及LM186)之結合之關鍵殘基及次要殘基進一步在靶標MCT1蛋白之模型結構上可視化。圖52顯示如藉由丙胺酸掃描所鑑別之構成該4種不同抗體之預測抗MCT1抗原決定基之殘基。可看出,構成所有該4種抗體之抗原決定基之殘基包含在人類MCT1之同一細胞外區中,此表明本文所揭示之多種或全部功能性抗人類MCT1抗體可能結合至人類MCT1上之相同或重疊之抗原決定基。圖53及圖54進一步定位由所測試之4種例示性抗MCT1抗體結合之特定人類MCT1殘基。
基於抗原決定基分析,本發明至少囊括任一經分離之抗體或其抗原結合片段,其結合至人類MCT1上選自以下之抗原決定基:
(x) 包含以下殘基中之一或多者之抗原決定基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、K297、G417、I47及D418;
(xi) 包含至少三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含選自以下之殘基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(xii) 包含三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(xiii) 包含三個至六個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(xiv) 包含殘基T41、S285及S286中之至少一者、兩者或全部三者之抗原決定基;
(xv) 包含T41之抗原決定基;
(xvi) 包含S286之抗原決定基;
(xvii) 包含S285之抗原決定基;
(xviii) 包含H292之抗原決定基;
(xix) 包含殘基T41、S285、S286、Y287、G417及D418之抗原決定基;
(xx) 包含殘基T41、S285及S286之抗原決定基;
(xxi) 包含殘基T41、I47、S285、S286、G417及D418之抗原決定基,
(xxii) 包含殘基E46、K289及H292之抗原決定基;
(xxiii) 包含殘基K297、Y293及H292之抗原決定基;
(xxiv) 包含選自囓齒類動物(例如,小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔、雞、非人類靈長類動物(例如,食蟹猴、黑猩猩、猩猩)、牛、綿羊、犬、貓之非人類MCT1之相應殘基中之一或多者之抗原決定基;
其中視情況藉由使用丙胺酸掃描來鑑別存在於該等抗原決定基中之殘基。
(x) 包含以下殘基中之一或多者之抗原決定基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、K297、G417、I47及D418;
(xi) 包含至少三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含選自以下之殘基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(xii) 包含三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(xiii) 包含三個至六個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418;
(xiv) 包含殘基T41、S285及S286中之至少一者、兩者或全部三者之抗原決定基;
(xv) 包含T41之抗原決定基;
(xvi) 包含S286之抗原決定基;
(xvii) 包含S285之抗原決定基;
(xviii) 包含H292之抗原決定基;
(xix) 包含殘基T41、S285、S286、Y287、G417及D418之抗原決定基;
(xx) 包含殘基T41、S285及S286之抗原決定基;
(xxi) 包含殘基T41、I47、S285、S286、G417及D418之抗原決定基,
(xxii) 包含殘基E46、K289及H292之抗原決定基;
(xxiii) 包含殘基K297、Y293及H292之抗原決定基;
(xxiv) 包含選自囓齒類動物(例如,小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔、雞、非人類靈長類動物(例如,食蟹猴、黑猩猩、猩猩)、牛、綿羊、犬、貓之非人類MCT1之相應殘基中之一或多者之抗原決定基;
其中視情況藉由使用丙胺酸掃描來鑑別存在於該等抗原決定基中之殘基。
基於相同之抗原決定基分析,本發明至少進一步囊括結合至如上文所述之人類MCT1上之抗原決定基之任何經分離之抗體或其抗原結合片段,如上文所述之人類MCT1上之抗原決定基可進一步包含包括在人類MCT1之環1至6中之以下人類MCT1殘基或包括在非人類MCT1 (例如,囓齒類動物或非人類靈長類動物MCT1)之環1至6區中之相應殘基中之任一者:
(i) 殘基P37、I40、K45、E48及T55中之一或多者(環1);
(ii) 殘基Q111 (環2);
(iii) 殘基Q166 (環3);
(iv) 殘基L284、E296、S298中之一或多者(環4);
(v) 殘基Y353 (環5);
(vi) 殘基Y419、T422中之一或兩者(環6);及/或
(vii) 前述之任一組合。
實例27:抗人類MCT1抗體(INX444)與小鼠MCT1之結合
(i) 殘基P37、I40、K45、E48及T55中之一或多者(環1);
(ii) 殘基Q111 (環2);
(iii) 殘基Q166 (環3);
(iv) 殘基L284、E296、S298中之一或多者(環4);
(v) 殘基Y353 (環5);
(vi) 殘基Y419、T422中之一或兩者(環6);及/或
(vii) 前述之任一組合。
實例27:抗人類MCT1抗體(INX444)與小鼠MCT1之結合
至少一種本文所揭示之功能性抗人類MCT1抗體(INX444)亦結合至小鼠MCT1。此將進一步指示,本發明抗人類MCT1抗體在人類MCT1蛋白上與其相互作用之人類MCT1中之區或抗原決定基或殘基有可能在不同物種(例如,人類及鼠類及可能諸如非人類靈長類動物等其他物種)之MCT1蛋白中係保守的。
此外,結合至小鼠MCT1之此抗人類MCT1抗體進一步展示保護表現小鼠MCT1之轉染子免受溴丙酮酸鹽之毒性效應。具體而言,如圖55中所示,此相同抗體當在2種不同Ab濃度(低10 μg/ml;高100 μg/ml)下測試時保護表現小鼠MCT1之轉染子免受溴丙酮酸鹽之毒性效應,此類似於陽性對照AZ3965 (小分子MCT1抑制劑,綠色)。
相比之下,在相同實驗中所測試之另2種功能性抗人類MCT1抗體(亦即,INX420及INX438)不阻斷小鼠MCT1功能(基線)。(注意,在150 μM溴丙酮酸鹽下,單獨之培養基對照不會達到零,此乃因轉染子細胞在此溴丙酮酸鹽濃度下未被完全殺死)。
此結果進一步確證,本發明抗人類MCT1抗體在人類MCT1蛋白上與其相互作用之功能性抗原決定基或殘基有可能在不同物種之MCT1蛋白中係保守的,此表明本發明抗人類MCT1抗體可用於競爭性結合分析中以篩選其他功能性抗MCT1抗體,亦即拮抗、抑制或阻斷人類MCT1之一或多種活性之彼等抗體或拮抗、抑制或阻斷其直向同源物(例如,囓齒類動物或非人類靈長類動物MCT1蛋白)之一或多種活性之彼等抗體。
參考文獻 此列表中之參考文獻係以引用方式併入,且在上文說明書中係藉由參考文獻編號引用。
MCT1及抗MCT1抗體序列 人類MCT1胺基酸序列
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH1_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 20
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 21
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH2_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 22
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 23
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH3_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 24
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 25
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH4_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 26
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 27
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
>aMCT1_人類化_VH_AmbCons_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 28
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO:29
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH_AmbMod_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 30
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 31
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH_AmbAgg_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 32
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 33
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL1_hκ_LC
SEQ ID NO: 34
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 35
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL3_hκ_LC
SEQ ID NO: 36
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO:37
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
>aMCT1_人類化_VL4_hκ_LC
SEQ ID NO:38
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 39
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL_AmbCons_hκ_LC
SEQ ID NO: 40
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 41
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL_AmbMod_hκ_LC
SEQ ID NO: 42
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 43
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL_AmbAgg_hκ_LC
SEQ ID NO: 44
參考文獻 此列表中之參考文獻係以引用方式併入,且在上文說明書中係藉由參考文獻編號引用。
MCT1及抗MCT1抗體序列 人類MCT1胺基酸序列
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH1_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 20
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 21
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH2_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 22
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 23
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH3_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 24
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 25
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH4_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 26
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 27
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
>aMCT1_人類化_VH_AmbCons_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 28
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO:29
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH_AmbMod_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 30
人類化Ab1 (INX310)可變重鏈多肽
SEQ ID NO: 31
人類化Ab1 (INX310)重鏈多肽
aMCT1_人類化_VH_AmbAgg_hIgG1_INX沈默_HC
SEQ ID NO: 32
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 33
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL1_hκ_LC
SEQ ID NO: 34
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 35
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL3_hκ_LC
SEQ ID NO: 36
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO:37
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
>aMCT1_人類化_VL4_hκ_LC
SEQ ID NO:38
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 39
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL_AmbCons_hκ_LC
SEQ ID NO: 40
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 41
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL_AmbMod_hκ_LC
SEQ ID NO: 42
人類化Ab1 (INX310)可變輕鏈多肽
SEQ ID NO: 43
人類化Ab1 (INX310)輕鏈多肽
aMCT1_人類化_VL_AmbAgg_hκ_LC
SEQ ID NO: 44
圖1圖解說明白血球之代謝狀態與不同免疫性質相關(參考文獻33)。靜息、記憶及Treg細胞依賴於氧化磷酸化(Oxphos) (左圖),而效應T細胞增殖及效應功能在很大程度上依賴於抗原活化後之醣解(右圖)。
圖2顯示CD3/CD28活化誘導更高之MCT1及MCT4表現,且AZ3965抑制增殖之IC50
值在MCT4之高(供體1)或低(供體2)表現水準存在下不發生變化(S =刺激3天;NS =未受刺激;BSG =基礎免疫球蛋白/CD147)。對於供體1,自左至右,條形圖對應於未受刺激之MCT2、MCT4及BSG之表現,之後為受刺激之MCT1、MCT2、MCT4及BSG之表現。注意:供體1在未受刺激之細胞中不表現MCT1。對於供體2,自左至右,條形圖對應於未受刺激之MCT1、MCT2、MCT4及BSG之表現,之後為受刺激之MCT1、MCT2、MCT4及BSG之表現。
圖3含有AZ3965之乳酸鹽FLIPR分析之結果。AZ3965抑制人類CD4+
T細胞(CD4)、CD8+
T細胞(CD8)、B細胞淋巴瘤細胞(Daudi)及外周血單核細胞(PBMC)中之乳酸鹽轉運,但不抑制單核球(Mono)中之乳酸鹽轉運。在100 nM AZ3965下,自頂部至底部,曲線對應於Daudi、CD4、CD8、PBMC及Mono。
圖4含有小分子MCT1抑制劑之人類T細胞增殖分析之結果。MCT1抑制以0.54 nM之IC50
導致T細胞增殖之抑制。
圖5含有小分子MCT1抑制劑之人類混合淋巴球反應(MLR)分析之結果。在此MLR分析中,T細胞增殖以1.34 nM之IC50
受抑制。
圖6顯示在AZ3965投與後,活體外T細胞細胞介素分泌之抑制。在藥物投與之前,T細胞經CD3/CD28活化5天。圖中之紅色區域(較高表現)已用黑色虛線勾勒出輪廓。所有其他區域均為藍色(較低表現)。陰影強度亦指示表現。AZ3965抑制IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10及IL-6之分泌,但不抑制IL-2之分泌。
圖7A至圖7J顯示如與未染色之對照相比,在用100 nM小分子MCT1抑制劑處理4天後或無處理之經活化T細胞上各種T細胞表面標記物之表現。在每一圖中,抗體非染色對照係最左側之峰。在每一圖中,處理與未處理條件之間的染色無顯著差異。在所有圖中,未處理條件係略高之曲線,圖7H除外,在圖7H中處理條件曲線略高。此處顯示以下細胞表面標記物之結果:CD25 (圖7A);CD54 (圖7B);CD69 (圖7C);CD95 (圖7D);CD98 (圖7E);CD147 (圖7F);CD154 (圖7G);CD278 (圖7H);CD279 (圖7I);及HLA-DR、DP、DQ (圖7J)。
圖8顯示AZ3965之異種GVHD分析之結果。AZ3965阻斷GVHD發病率直至停藥,且優於JAK抑制劑。
圖9顯示在AZ3965投藥期期間,異種GVHD實驗(圖8)之組織Treg頻率之劑量依賴性增加。
圖10顯示MCT1小分子抑制劑對移植物排斥之效應。在視覺上且在第10天之移植物分析中,25 mg/kg化合物投與2×/天降低移植物排斥。
圖11A至圖11B顯示在暴露於綿羊RBC之小鼠中,AZ3965投與降低IgG1 B細胞及生發中心B細胞比例。圖11A顯示2.5 mpk投與AZ3965減少IgG1 B細胞,且圖11B顯示相同劑量減少生發中心B細胞。
圖12A至圖12D顯示如經由對與不同物種PBMC表面上之MCT1結合之流式細胞術量測所評價的MCT1 Ab1之交叉反應性。圖12A顯示MCT1 Ab1結合至人類PBMC表面上之MCT1,且其在甚至更大程度上結合至受刺激細胞。圖12B顯示MCT1 Ab1結合至食蟹猴MCT1。圖12C顯示MCT1 Ab1結合至兔MCT1。圖12D顯示MCT1 Ab1不結合至大鼠MCT1。
圖13A至圖13B顯示MCT1 Ab1結合至經活化T細胞。MCT1 Ab1不使初始細胞染色(圖13A),但在第3天使CD3/CD28活化細胞表面染色(圖13B)。圖13A中僅有之染色對應於細胞核染色,此確認初始T細胞之存在。
圖14顯示MCT1 Ab1在活體外抑制經活化T細胞中乳酸鹽之MCT1轉運。大鼠Ig對照及緩衝液對照曲線顯示與對照相比無變化,而MCT1 Ab1與對照相比以7.6 nM之Kd減少乳酸鹽轉運(右手側之底部曲線)。
圖15顯示如使用ATPlite藉由MCT1 Ab1保護免於細胞死亡(Kd = 1.2 nM)所量測,MCT1 Ab1抑制溴丙酮酸鹽毒素之轉運。
圖16含有T細胞增殖分析之結果,其中MCT1 Ab1以1.3 nM之EC50
抑制T細胞增殖。
圖17顯示在人類混合淋巴球反應中,MCT1 Ab1以劑量依賴性方式抑制同種異體活化。
圖18A至圖18B顯示來自五種不同物種之RBC表面上之MCT1表現。在圖18A中,與缺乏表現之純化人類RBC (20個供體,左圖)相比,純化食蟹猴RBC之MCT1 Ab1染色(右圖)顯示MCT1在質膜上之表現。在左圖中,僅二級Ab條件、對照條件及MCT1 Ab1染色條件均未顯示MCT1染色。在圖18B中,染色顯示兔RBC表面上之MCT1表現(左圖),但在大鼠(中圖)或小獵犬(右圖) RBC表面上則不顯示表現。
圖19顯示人類RBC不需要MCT1用於乳酸鹽轉運。使用基於FLIPR之轉運分析,MCT1 Ab1或AZ3965對MCT1之抑制均不阻斷純化人類RBC中之乳酸鹽轉運(參考文獻1、2)。無=無抑制劑。
圖20含有狼瘡B細胞之流式細胞術分析結果。來自一名健康及兩名狼瘡患者之B細胞群體之例示性MCT1染色指示狼瘡患者之MCT1染色顯著增加。
圖21含有MCT1 Ab1 Fab之晶體結構之示意圖,在本申請案中保存為43260_4200-MCT1_Ab1.pdb。在該影像中,可看到VH
CDR3延伸超出抗原結合表面之其餘部分。
圖22示意性地顯示當MCT1參與各種功能時,存在避免淋巴系統外毒性之冗餘路徑,但該MCT1在淋巴樣系統(例如,B細胞、T細胞)中具有唯一之轉運蛋白路徑。
圖23顯示食蟹猴紅血球(RBC)表現高水準之MCT1。
圖24含有指示食蟹猴耐受以50 mpk重複投用抗MCT1抗體(Ab1)之實驗。
圖25含有在食蟹猴中觀察到之PK數據,其表明所投與之抗MCT1抗體(Ab1)具有良好結合,且結果進一步指示在Ab1劑量率>
5 mpk時RBC沈降飽和。
圖26含有在他莫昔芬(tamoxifen)誘導型MCT1剔除小鼠中評估靶組織(肌肉、睪丸及眼睛)之實驗。
圖27顯示MCT1剔除小鼠動物具有較小之睪丸且顯微鏡發現指示一些精細胞退化。
圖28顯示相對於對照管家基因(HPRT)之表現,MCT1 KO表現型在所分析之各種靶組織(亦即,胸腺、脾、淋巴結、睪丸及視網膜)中賦予強勁之他莫昔芬誘導型MCT1表現減弱。
圖29顯示在剔除小鼠中所觀察到之睪丸表現型變化。如所示,在所有MCT1剔除小鼠之睪丸中均觀察到精細胞退化(缺乏末期精細胞及精母細胞、管狀細胞結構減少、空泡形成及細胞碎片)。
圖30進一步比較WT及MCT1 KO小鼠中之睪丸組織學,且顯示相對於野生型,剔除小鼠中精細胞退化增加。
圖31彙總比較不同市售抗MCT1抗體之結合及功能結果。該圖含有使用Abcam出售之所有抗MCT1抗體(單株抗體及多株抗體)之MFI (上圖,流式細胞術,活細胞之細胞結合)及溴丙酮酸鹽功能性分析結果(下圖,RLU)。(目錄號列示於該圖中)。
圖32含有基於本文所揭示之不同抗MCT1抗體(亦即,INX420、INX444、INX356、INX352及INX453)在溴丙酮酸鹽分析中之阻斷MCT1轉運蛋白活性之相對能力,偵測其拮抗劑活性之實驗結果。
圖33含有對本文所揭示之不同抗MCT1抗體(亦即,INX420、INX444、INX356、INX352及INX453)之可變重鏈區之比對。
圖34含有對本文所揭示之不同抗MCT1抗體(亦即,INX420、INX444、INX356、INX352及INX453)之可變輕鏈區之比對。
圖35A及圖35B分別顯示本文所揭示之抗MCT1與MCT1+
293細胞之結合及其在溴丙酮酸鹽毒素轉運分析中之相對功能性。
圖36A至圖36D含有比較本文所揭示之兩種抗MCT1抗體(亦即INX310及INX420)關於其抑制CD4+
及CD8+
T細胞增殖之相對能力之實驗數據。
圖37A至圖37D含有顯示本文所揭示之抗MCT1抗體(亦即INX420)與小分子MCT1抑制劑化合物相比增加活體外PD1+
TIGIT+
細胞頻率之實驗數據。
圖38A至圖38B含有顯示PD1+
TIGIT+
Tr1細胞阻抑PMBC增殖之實驗數據。
圖39含有顯示利用IL-10拮抗劑(抗IL-10RB)阻斷IL-10信號傳導不影響本文所揭示之抗MCT1抗體(亦即INX420)對PMBC增殖之阻抑之實驗數據。
圖40A至圖40D含有顯示與利用對照抗體治療之異種GvHD動物相比,利用本文所揭示之抗MCT1抗體(亦即,INX420及INX310)治療異種GvHD動物使得CD3+
、CD4+
及CD8+
效應T細胞之數目顯著減少且使Tr1細胞增加之實驗數據。
圖41A至圖41C含有顯示與利用對照抗體治療之異種GvHD動物相比,利用本文所揭示之抗MCT1抗體(亦即,INX420、INX413及INX310)治療異種GvHD動物使得CD3+
、CD4+
及CD8+
效應T細胞之數目顯著減少之實驗數據。
圖42A至圖42B含有顯示以下之實驗結果:與利用對照抗體治療之動物相比,在異種GvHD動物模型中投與抗MCT1抗體(亦即,INX420及INX310)產生延長之存活、長期保護及耐受誘導。
圖43含有生物標記物表現數據,其顯示TIGIT及PD1在異種GvHD動物模型中之大量(75%)人類T細胞上表現且構成Tr1細胞之推定生物標記物。
圖44A至圖44B含有生物標記物表現數據,其顯示TIGIT及PD1構成Tr1細胞之推定生物標記物且表現該等標記物之推定Tr1細胞阻抑T效應細胞之增殖。
圖45A至圖45C含有生物標記物表現數據,其顯示Tr1細胞表現高水準之顆粒酶B但不表現FOXP3或Blimp1。
圖46A至圖46C含有顯示以下之實驗結果:與利用對照抗體治療之動物相比,利用抗MCT1抗體(INX420)治療之NSG小鼠包含減少數目之hCD3+
T效應細胞。
圖47A至圖47B含有顯示以下之實驗結果:Tr1細胞在CD23/CD28刺激之後阻抑hCD3+
T效應細胞及PMBC之增殖。
圖48示意性地繪示異種GvHD動物模型中Tr1產生之動力學,且顯示利用抗MCT1抗體治療阻抑效應期之增殖。
圖49A至圖49B含有與利用各種抗體、細胞介素及配位體離體培養Tr1細胞有關之實驗數據。所觀察到之結果指示,抗TIGIT及PVR配位體並不增強存活。相比之下,利用IL-2、IL-17及IL-15處理以劑量依賴性方式實質上增加Tr1細胞之離體存活(高達約75%存活)。
圖50A至圖50B含有顯示以下之實驗數據:基於血酮及葡萄糖水準,在饑餓條件下8至24小時後,小分子MCT1抑制劑對酮病之效應。
圖51A至圖51B含有顯示以下之實驗數據:與在不存在小分子MCT1抑制劑下之饑餓相比,在饑餓24小時後小分子MCT1抑制劑不觸發酮酸中毒且僅引發pH之極低降低(約0.05)。
圖52A至圖52D顯示人類MCT1之殘基,其構成如由丙胺酸掃描確定之由本發明之4種例示性抗人類MCT1抗體所結合之預測抗原決定基。結果顯示,由所有4種抗體結合之抗原決定基包含人類MCT1之相同細胞外區及人類MCT1之實質上相同之殘基。
圖53及圖54進一步定位人類MCT1之特定殘基,其構成如由丙胺酸掃描確定之由本發明之4種抗人類MCT1抗體結合之預測抗原決定基。再次,該等結果顯示由所有4種抗體結合之抗原決定基包含人類MCT1之相同細胞外區及人類MCT1之實質上相同之殘基。
圖55含有指示進一步結合小鼠MCT1之本發明之抗人類MCT1抗體保護表現小鼠MCT1之轉染子免受溴丙酮酸鹽之毒性效應之實驗結果。
Claims (122)
- 一種經分離之抗體或其抗原結合片段,其結合至包含在人類或非人類MCT1之細胞外結構域或區中之一或多個殘基。
- 一種結合至人類或非人類MCT1之經分離之抗體或其抗原結合片段,其例如在活體外及/或在活體內拮抗、抑制或阻斷一或多種MCT1相關功能。
- 一種結合至非人類MCT1 (例如,諸如小鼠或大鼠等囓齒類動物MCT1)之經分離之抗體或抗原結合片段,其例如在活體外及/或在活體內視情況拮抗、抑制或阻斷一或多種MCT1相關功能。
- 如申請專利範圍第3項之經分離之抗體或抗原結合片段,其進一步結合至人類MCT1。
- 一種經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其與抗人類MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者競爭與人類或非人類MCT1之結合。
- 一種經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其與抗人類MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者結合至人類MCT1上之相同或重疊之抗原決定基。
- 一種經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其結合至人類MCT1上選自以下之抗原決定基: (i) 包含以下殘基中之一或多者之抗原決定基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、K297、G417、I47及D418; (ii) 包含至少三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含選自以下之殘基:T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418; (iii) 包含三個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之至少一者、兩者或全部三者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418; (iv) 包含三個至六個殘基之抗原決定基,其中該等殘基中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者包含T41、E46、S285、S286、Y287、K289、H292、Y293、G417、I47及D418; (v) 包含殘基T41、S285及S286中之至少一者、兩者或全部三者之抗原決定基; (vi) 包含T41之抗原決定基; (vii) 包含S286之抗原決定基; (viii) 包含S285之抗原決定基; (ix) 包含H292之抗原決定基; (x) 包含殘基T41、S285、S286、Y287、G417及D418之抗原決定基; (xi) 包含殘基T41、S285及S286之抗原決定基; (xii) 包含殘基T41、I47、S285、S286、G417及D418之抗原決定基, (xiii) 包含殘基E46、K289及H292之抗原決定基; (xiv) 包含殘基K297、Y293及H292之抗原決定基; (xv) 包含例如選自囓齒類動物(例如,小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔、雞、非人類靈長類動物(例如,食蟹猴、黑猩猩、猩猩)、牛、綿羊、犬及貓之非人類MCT1之相應殘基中之一或多者之抗原決定基; 其中視情況藉由使用丙胺酸掃描來鑑別存在於該抗原決定基中之殘基。
- 如申請專利範圍第7項之結合至人類MCT1上之所選抗原決定基之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段進一步與以下殘基中之一或多者相互作用: (i) 殘基P37、I40、K45、E48及T55中之一或多者(環1); (ii) 殘基Q111 (環2); (iii) 殘基Q166 (環3); (iv) 殘基L284、E296、S298中之一或多者(環4); (v) 殘基Y353 (環5); (vi) 殘基Y419、T422中之一或兩者(環6);及/或 (vii) 前述之任一組合。
- 一種經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其結合至非人類MCT1上之抗原決定基,該非人類MCT1視情況選自囓齒類動物(例如,小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔、鳥類(例如,雞、火雞、鵝)、非人類靈長類動物(例如,食蟹猴、黑猩猩、猩猩)、牛、綿羊、犬、貓,其中視情況非人類MCT1上之該抗原決定基包含非人類MCT1中與人類MCT1之T41、S285、S286、Y287、G417、I47及D418中之一或多者相對應殘基中之一或多者。
- 如申請專利範圍第8項或第9項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其例如在活體外及/或在活體內拮抗、抑制或阻斷該非人類MCT1之一或多種活性中之一或多者。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其係人類、人類化、非人類靈長類動物、靈長類化、雞、囓齒類動物或嵌合的。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其例如在活體外及/或在活體內抑制人類MCT1介導之乳酸鹽轉運。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其結合至表現內源性MCT1之細胞及/或結合至表現重組或經改造MCT1之細胞,例如表現人類MCT1之293細胞。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群:人類或人類化單株抗體;單特異性抗體;多重特異性抗體;多特異性抗體樣多肽、人類化抗體;人類或人類化四聚體抗體;人類或人類化四價抗體;人類或人類化多特異性抗體;單鏈抗體;結構域特異性抗體;單一結構域抗體;結構域缺失抗體;scFc融合蛋白;嵌合抗體;合成抗體;重組抗體;雜交抗體;多特異性抗體、雙特異性抗體、ByTE、突變抗體;CDR移植抗體;抗體片段;Fab;F(ab′)2;Fab′片段;Fv片段;單鏈Fv (scFv)片段;Fd片段;dAb片段;雙價抗體;奈米抗體;二價奈米抗體;VH H抗體;及微小抗體。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其係人類化抗體或其抗原結合片段。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者之至少1個、2個、3個、4個、5個或全部6個CDR,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義;或經分離之抗體或其抗原結合片段,其與抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者競爭與MCT1之結合或其與抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者結合相同之抗原決定基;或前述任一者之親和力成熟變異體。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者之相同CDR,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含與選自Ab1至Ab95之抗MCT1抗體或其人類化變異體中所包含之VH 多肽相同之VH 多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含與選自Ab1至Ab95之抗MCT1抗體或其人類化變異體中所包含之VL 多肽相同之VL 多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含與選自Ab1至Ab95之抗MCT1抗體或其人類化變異體中所包含之VH 多肽及VL 多肽一致之VH 多肽及VL 多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含與抗MCT1抗體Ab1至Ab95中之任一者中所含之可變重鏈多肽及/或可變輕鏈多肽分別具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之可變重鏈多肽及/或可變輕鏈多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含分別具有SEQ ID NO: 4-6之胺基酸序列之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3多肽及分別具有SEQ ID NO: 7-9之胺基酸序列之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3多肽。
- 一種源自Ab1至Ab95中之任一者之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其視情況含有與Ab1至Ab95中之任一者相同之CDR,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義。
- 一種源自Ab1至Ab95中之任一者之親和力成熟之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其中相對於Ab1至Ab95中之任一者之6個CDR多肽中所包含之CDR殘基,至多1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12或13個CDR殘基經突變,其中視情況該親和力成熟之抗MCT1抗體以至少等於或大於其源自之該抗MCT1抗體及/或例如在活體外及/或在活體內拮抗人類MCT1之親和力成熟抗體或抗原結合片段之親和力結合至人類MCT1,其中視情況該等CDR係根據Kabat或根據Chothia及Lesk來定義。
- 如申請專利範圍第24項之親和力成熟之抗MCT1抗體或抗原結合片段(antigen binding fragment或antigen-binding fragment),其中相對於Ab1至Ab95中之任一者之該等CDR多肽,至多1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個CDR殘基經突變。
- 如申請專利範圍第24項之親和力成熟之抗MCT1抗體或抗原結合片段(antigen binding fragment或antigen-binding fragment),其中相對於Ab1至Ab95中之任一者之該等CDR多肽,至多1個、2個、3個或4個CDR殘基經突變。
- 如申請專利範圍第24項之親和力成熟之抗MCT1抗體或抗原結合片段(antigen binding fragment或antigen-binding fragment),其中相對於Ab1至Ab95中之任一者之該等CDR多肽,至多1個或2個CDR殘基經突變。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗人類MCT1抗體或抗原結合片段,其進一步結合至非人類MCT1,視情況囓齒類動物、兔、雞或非人類靈長類動物MCT1。
- 一種包含SEQ ID NO: 2及3、SEQ ID NO: 12及13、SEQ ID NO: 14及15、SEQ ID NO: 16及17之VH及VL多肽之抗MCT1抗體;或包含抗體Ab5至Ab95中之任一者之VL 及/或VH 多肽或包含抗體Ab5至Ab95中之任一者之VL 及/或VH 多肽之人類化或親和力成熟變異體之抗MCT1抗體。
- 一種抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自以下之胺基酸序列之可變重鏈多肽或重鏈多肽:SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153及155;及具有選自以下之胺基酸序列之可變輕鏈多肽或輕鏈多肽:SEQ ID NO: 3、13、15、17、33至44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154及156。
- 一種抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含分別具有選自以下之胺基酸序列之可變重鏈多肽及可變輕鏈多肽:SEQ ID NO: 2及3;SEQ ID NO: 12及13;SEQ ID NO: 14及15;SEQ ID NO: 16及17;SEQ ID NO: 45及46;SEQ ID NO: 47及48;SEQ ID NO: 49及50;SEQ ID NO: 51及52;SEQ ID NO: 53及54;SEQ ID NO: 55及56;SEQ ID NO: 57及58;SEQ ID NO: 59及60;SEQ ID NO: 61及62;SEQ ID NO: 63及64;SEQ ID NO: 65及66;SEQ ID NO: 67及68;SEQ ID NO: 69及70;SEQ ID NO: 71及72;SEQ ID NO: 73及74;SEQ ID NO: 75及76;SEQ ID NO: 77及78;SEQ ID NO: 79及80;SEQ ID NO: 81及82;SEQ ID NO: 83及84;SEQ ID NO: 85及86;SEQ ID NO: 87及88;SEQ ID NO: 89及90;SEQ ID NO: 91及92;SEQ ID NO: 93及94;SEQ ID NO: 95及96;SEQ ID NO: 97及98;SEQ ID NO: 99及100;SEQ ID NO: 101及102;SEQ ID NO: 103及104;SEQ ID NO: 105及106;SEQ ID NO: 107及108;SEQ ID NO: 109及110;SEQ ID NO: 111及112;SEQ ID NO: 113及114;SEQ ID NO: 115及116;SEQ ID NO: 117及118;SEQ ID NO: 119及120;SEQ ID NO: 121及122;SEQ ID NO: 123及124;SEQ ID NO: 125及126;SEQ ID NO: 127及128;SEQ ID NO: 129及130;SEQ ID NO: 131及132;SEQ ID NO: 133及134;SEQ ID NO: 135及136;SEQ ID NO: 137及138;SEQ ID NO: 139及140;SEQ ID NO: 141及142;SEQ ID NO: 143及144;SEQ ID NO: 145及146;SEQ ID NO: 147及148;SEQ ID NO: 149及150;SEQ ID NO: 151及152;SEQ ID NO: 153及154以及SEQ ID NO: 155及156。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 3、13、15、17及33至44之胺基酸序列之VL 多肽或抗體Ab5至Ab60中之任一者之VL 多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 2、12、14、16及19至32之胺基酸序列之VH 多肽或抗體Ab5至Ab60中之任一者之VH 多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 13、15、17及33至44之胺基酸序列之VL 多肽及具有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 12、14、16及19至32之胺基酸序列之VH多肽或抗體Ab5至Ab60中之任一者之VH多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含VL 多肽,該VL 多肽具有與SEQ ID NO: 3、13、15、17、33至44中之任一者或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VL 多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含VH 多肽,該VH 多肽具有與SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32中之任一者或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VH 多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其包含VL 多肽,該VL 多肽具有與SEQ ID NO: 3、13、15、17、33至44中之任一者或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VL 多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列;及/或VH 多肽,該VH 多肽具有與SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32之VH多肽或與抗體Ab5至Ab95中之任一者中所包含之VH 多肽具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其中該重鏈CDR3序列包含18、19、20、21、22、23或24個胺基酸殘基。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類化抗MCT1抗體或抗原結合片段,其中該重鏈CDR3序列包含21、22、23或24個胺基酸殘基。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或抗原結合片段,其中該重鏈CDR3序列與SEQ ID NO:6一致或與其差異至多5、4、3、2或1個殘基,視情況其中該等差異(若存在)包含保守胺基酸取代或包含在包含相同長度CDR3之人類或囓齒類動物抗體之該重鏈CDR3中之相同位置處普遍存在之取代性胺基酸。
- 如前述申請專利範圍中任一項之經分離之人類或人類化抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其與參考抗體競爭與MCT1之結合,其中該參考抗體係選自Ab1至Ab95。
- 一種抗人類MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與Ab1至Ab95中之任一者相同之CDR及/或包含與選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體相同之可變重鏈及/或可變輕鏈CDR多肽。
- 一種抗MCT1抗體,其包含選自Ab1至Ab95之抗體之可變重鏈及/或輕鏈多肽。
- 如前述申請專利範圍中任一項之人類或人類化抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈及/或輕鏈恆定區,視情況人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈及/或輕鏈恆定區,該(等)恆定區視情況經突變以損害或增強至少一種效應功能。
- 如申請專利範圍第44項之抗MCT1抗體,其中該等效應功能包括FcR結合、補體結合、ADCC功能、FcRN結合及醣基化。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其中如經由結構比對所確定差異在於小於2.0 Å、小於1.0 Å或小於0.5 Å之平均均方根偏差(RMSD)之相應CDR中α碳之位置所指示,該抗體或其抗原結合片段之該等CDR形成與Ab1之CDR相似或相同之類似三維抗體結構。
- 一種人類化抗體或其抗原結合片段,其包含Ab1之可變重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及Ab1之可變輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)。
- 一種抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域;且包含與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含人類恆定結構域、視情況IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,其進一步視情況經修飾以增強至少一種選自醣基化、FcR結合、FcRN結合、補體結合及ADCC功能之Fc效應功能。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段,其包含人類IgG1恆定區,該等人類IgG1恆定區視情況經修飾以減少FcR結合及/或補體結合,進一步視情況包含E269R及/或K322A突變及/或該等人類IgG1恆定區包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
- 一種融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其包含至少一種如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或抗原結合片段。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體、融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其減少T效應細胞活性及/或T效應細胞之數目,該等T效應細胞係例如CD3+ 、CD4+ 或CD8+ T效應細胞。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體、融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其增加Tr1細胞之活性及/或數目。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體、融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,其減少T效應細胞活性及/或T效應細胞之數目,該等T效應細胞係例如CD3+ 、CD4+ 或CD8+ T效應細胞,且此外其增加Tr1細胞之活性及/或數目。
- 一種細胞,其表現至少一種如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或抗原結合片段、融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽。
- 如申請專利範圍第55項之細胞,其包含人類、非人類哺乳動物、酵母、細菌、兩棲動物、植物、昆蟲或爬行動物細胞。
- 如申請專利範圍第55項之細胞,其包含人類細胞,視情況人類免疫細胞,例如T細胞、NK細胞、單核球、調節性T細胞或巨噬細胞。
- 一種針對如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段產生之抗個體遺傳型抗體,視情況其係人類、人類化及/或親和力成熟的。
- 一種針對如申請專利範圍第58項之抗個體遺傳型抗體產生之抗-抗個體遺傳型抗體,其結合MCT1。
- 如申請專利範圍第59項之抗-抗個體遺傳型抗體,其阻斷或拮抗一或多種MCT1活性。
- 一種融合蛋白,其包含如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或SEQ ID NO: 6之VH CDR3多肽或與其具有至少80%序列一致性之變異體,其直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀(adnectin)、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體。
- 如申請專利範圍第61項之融合蛋白,其中該抗體多肽或結構域包含Fc多肽或其片段,例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區或其片段。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或如前述申請專利範圍中任一項之表現前述中任一者之細胞,其在結合至例如經活化T細胞或B細胞、進一步視情況人類細胞之細胞之表面上之MCT1時引發以下性質中之一或多者: (i) 抑制乳酸鹽之轉運; (ii) 抑制溴丙酮酸鹽之轉運; (iii) 抑制以下中之一或多者之轉運:單羧酸鹽、丙酮酸鹽、自白胺酸、纈胺酸及異白胺酸衍生之具支鏈含氧酸、酮體、乙醯乙酸鹽、β-羥基丁酸鹽、乙酸鹽、乳酸、細胞營養物、代謝物、離子、激素、脂質及酮; (iv) 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖; (v) 抑制經活化T細胞或B細胞之增殖; (vi) 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生; (vii) 減少T效應細胞之活性及/或數目,例如CD3+ 、CD4+ 及/或CD8+ 效應T細胞; (viii) 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性; (ix) 抑制混合淋巴球反應中之同種異體活化; (x) 或前述中任一者之組合。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或例如如前述申請專利範圍中任一項之表現前述中任一者之細胞,其在結合至MCT1時抑制一或多種發炎性細胞介素之產生。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或如申請專利範圍第64項之表現前述中任一者之細胞,其中該一或多種發炎性細胞介素中之至少一者係選自FGF2、FLT-3L、分形趨化因子、G-CSF、GM-CSF、GRO、IFNα2、IFNγ、IL-3、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-17a、IP-10、MCP-1、MDC、MIP-1a、MIP-1b、sCD40L、TNFα及TNFβ。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或如申請專利範圍第64項或第65項之表現前述中任一者之細胞,其中該一或多種發炎性細胞介素中之至少一者係選自IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10及IL-6。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其以如經由乳酸鹽FLIPR分析所量測小於100 nM、小於50 nM或小於10 nM之Kd抑制經活化T細胞中MCT1介導之乳酸鹽轉運。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其: (i) 如經由流式細胞術所量測,不結合至MCT2、MCT3、MCT4及/或CD147; (ii) 不抑制MCT2、MCT3及/或MCT4轉運; (iii) 不抑制IL-2之產生; (iv) 不抑制單核球中之乳酸鹽轉運; (v) 不抑制初始、靜息及/或調節性T細胞之增殖; (vi) 不抑制RBC中之乳酸鹽轉運; (vii) 不改變一或多種視情況選自CD25、CD54、CD69、CD95、CD98、CD147、CD154、CD278、CD279及HLA-DR/DP/DQ之T細胞活化標記物之表現。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區、視情況已經修飾以改變效應功能、半衰期、蛋白分解或醣基化中之至少一者之Fc區,其中視情況該Fc區含有一或多種改變或消除N-醣基化及/或O-醣基化之突變。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其以小於100 nM、小於50 nM或小於10 nM之親和力(KD )結合至人類MCT1。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其另外具有以下修飾中之一或多者: (i) 結合至細胞毒性劑; (ii) 包含在雙特異性抗體中; (iii) 包含在多特異性抗原結合蛋白中; (iv) 結合至標記;及 (v) 結合至另一治療劑、視情況免疫抑制劑或化學治療劑。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其中該標記係化學發光標記、順磁性標記、MRI對比劑、螢光標記、生物發光標記或放射性標記,或該細胞毒性劑係抑制DNA、RNA或蛋白質合成之部分;放射性核種;或核糖體抑制蛋白。
- 如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞,其適於治療患有以下之人類個體:自體免疫、發炎性或過敏性病狀;代謝病症(例如,糖尿病)、多囊性腎病(ADPKD)、癌症;移植接受者或EIHI或其中減少之T效應細胞數目及/或活性(例如,CD3+ T細胞、CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)及/或增加之Tr1或T抑制細胞活性及/或數目在治療上合意之任何其他病狀。
- 一種針對如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段產生之抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段,其視情況中和其所結合之該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之一或多種生物效應。
- 一種針對如申請專利範圍第74項之抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段產生之抗-抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段,視情況其中該抗-抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段中和其所結合之該抗個體遺傳型抗體或其抗原結合片段。
- 一種使用如申請專利範圍第74項之抗個體遺傳型抗體監測個體中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之活體內水準或中和個體中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段之活體內效應之方法。
- 一種多核苷酸,其編碼如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段。
- 一種表現載體,其包含如申請專利範圍第77項之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如申請專利範圍第77項之多核苷酸或如申請專利範圍第78項之表現載體,其視情況為人類免疫細胞,例如T細胞、B細胞或NK細胞。
- 一種醫藥組合物或診斷組合物,其包含有效量之如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段或抗-抗MCT1抗體或抗原結合片段,或表現前述中任一者之細胞。
- 如申請專利範圍第80項之醫藥組合物,其適用於人類或非人類療法或預防。
- 一種產生經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段之方法,其包括在容許表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養如申請專利範圍第79項之宿主細胞;及自該培養基或宿主細胞回收該抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組合物,其包含醫藥學上有效量之如前述申請專利範圍中任一項之經分離之抗MCT1抗體或其抗原結合片段、抗個體遺傳型抗體、融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽,或表現前述中任一者之細胞。
- 如申請專利範圍第83項之醫藥組合物,其進一步包含醫藥稀釋劑、載劑或賦形劑。
- 如申請專利範圍第83項或第84項之醫藥組合物,其包括另一治療劑。
- 如申請專利範圍第85項之醫藥組合物,其中該另一治療劑係粒線體抑制劑及/或雙胍及/或另一單羧酸鹽轉運蛋白(MCT抑制劑),例如SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13或SLC16A14抑制劑或MCT1、MCT2、MCT3、MCT4、MCT5、MCT6、MCT7、MCT8、MCT9或MCT10抑制劑,其中該抑制劑可抑制前述轉運蛋白中之一或多者且進一步該抑制劑視情況包含小分子、RNAi、抗體、抗體片段或融合蛋白。
- 如申請專利範圍第85項或第86項之醫藥組合物,其中該另一活性劑係選自二甲雙胍、苯乙雙胍(Phenformin)、阿來西定(Alexidine)、雙雙胍、丁福明(Buformim)、氯己定(Chlorohexidine)、氯丙胍(Chlorproguanil)、苯基雙胍、聚胺基丙基雙胍、聚己縮胍(Polyhexanide)、嗎啉胍(Moroxydine)、格列吡嗪(Glipizide)、格列苯脲(Glyburide)、瑞格列奈(Repaglinide)、沙格列汀(Saxagliptin)、西他列汀(Sitagliptin)、雙羥萘酸撲蟯寧(Pyrvinum Pamoate)、氯胍(Proguanil)、去氧羥四環素、阿托伐醌(Atovaquone)、卡格列淨(Canagliflozin)、格列酮(Glitazone)(例如曲格列酮(Troglitazone)、吡格列酮(Pioglitazone)、羅格列酮(Rosiglitazone))、替吉環素(Tigecycline)、噻唑化物(例如,硝唑尼特(Nitazoxanide))、柳基苯胺(例如氯生太爾(Closantel)、羥氯紮胺(Oxyclozanide)、氯硝柳胺(Niclosamide))、哌克昔林(Perhexiline)、普萘洛爾(Propronolol)、非諾貝特(Fenofibrate)、咪康唑(Miconazole)、奈法唑酮(Nefazodone)、戊烷脒(Pentamidine)、氫化可體松(Hydrocortisone)、間碘苯甲胍、氯尼達明(Lonidamine)、α生育酚琥珀酸酯(維生素E之主要形式)、碳酸酐酶、ME344 (MEI Pharma)、HIF1a抑制劑(例如柯因(Chrysin)、黑毛黴素(Chetomin)、二甲基-雙酚A、BAY84-2243)、SR13800、二甲基草醯甘胺酸(DMOG)、羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、羰基氰間氯苯腙(CCCP)、抗黴素A (Antimycin A)、寡黴素(Oligomycin)、沙利黴素(Salinomycin)、二硝基苯酚、魚藤酮(Rotenone)、苯乙雙胍、酪胺酸磷酸化抑制劑9 (Tyrphostin 9)、連環蛋白A5 (Atpenin A5)、小檗鹼(Berberine)、疊氮化物、氰化物、氧化亞氮、三氧化砷、撲蟯寧(Pyrvinium)、卡格列淨、羅格列酮、異戊巴比妥(Amobarbital)、和厚樸酚(Honokiol)、牛蒡子苷元(Arctigenin)、咖啡酸苯基酯、哌非納嗪(Perhenazine)、三氟拉嗪(Triflouroperazine)、甲基乙二醛及包含前述中任一者之組合。
- 一種用於抑制有需要之個體中T效應細胞例如CD3+、CD4+及/或CD8+ T效應細胞之活性及/或數目之方法,其包括向該個體投與治療或預防有效量之如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物。
- 一種用於增加有需要之個體中T抑制細胞或Tr1細胞之活性及/或數目之方法,其包括向該個體投與治療或預防有效量之如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物。
- 一種用於抑制有需要之個體中T效應細胞例如CD3+ 、CD4+ 及/或CD8+ T效應細胞之活性及/或數目且增加T抑制細胞或Tr1細胞之活性及/或數目之方法,其包括向該個體投與治療或預防有效量之如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物。
- 如申請專利範圍第88項至第90項之方法,其中該個體患有特徵在於例如CD3+ 、CD4+ 或CD8+ 之T效應細胞活性增加及/或T抑制細胞或Tr1活性降低及/或T抑制細胞或Tr1細胞數目減少之自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)。
- 一種用於預防或治療自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)或與該等病狀中之任一者相關之症狀之方法,其包括向有需要之個體投與治療或預防有效量之如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物。
- 如申請專利範圍第92項之方法,其中自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)之特徵在於例如CD3+ 、CD4+ 或CD8+ 之T效應細胞活性增加及/或T抑制細胞或Tr1活性降低及/或T抑制細胞或Tr1細胞數目減少。
- 如申請專利範圍第92項、第93項或第94項之方法,其中該代謝病症包含達農氏病(Danon disease)、糖尿病、杜阿爾特半乳糖血症(Duarte galactosemia)、MDP症候群、代謝性肌病、亞甲基四氫葉酸還原酶缺乏症、溫徹斯特症候群(Winchester syndrome)、柳酸敏感、X連鎖之低磷酸鹽血症、酒精性酮酸中毒、酒精臉紅反應、α-胺基己二酸及α-酮己二酸尿症、高陰離子間隙代謝性酸中毒、痛風、複食症候群、運動相關低鈉血症、胰臟炎、泛脂肪組織炎及Metab-L。
- 如申請專利範圍第88項至第94項之方法,其中該病狀至少部分地由經活化T細胞或B細胞及/或MCT1表現細胞介導。
- 如申請專利範圍第88項至第95項中任一項之方法,其中投與該抗體或其抗原結合片段或融合蛋白具有以下效應中之一或多者: (i) 抑制經活化T細胞或B細胞中之乳酸鹽轉運; (ii) 抑制經活化T細胞或B細胞中之溴丙酮酸鹽毒素之轉運; (iii) 抑制CD3/CD28刺激T細胞之增殖; (iv) 抑制經活化T細胞之增殖; (v) 抑制一或多種發炎性細胞介素之產生及/或分泌; (vi) 不抑制IL-2之產生及/或分泌; (vii) 增加尿酮之產生; (viii) 延長存活時間; (ix) 減少移植物排斥; (x) 增加調節性T (Treg)細胞之比例或活性; (xi) 增加為Treg之CD4+ T細胞之比例; (xii) 減少IgG1+ B細胞之比例; (xiii) 減少生發中心B細胞之比例; (xiv) 不抑制人類RBC中之乳酸鹽轉運; (xv) 減少T細胞活化;及 (xvi) 減少細胞毒性T細胞活性。
- 如申請專利範圍第88項至第96項中任一項之方法,其用於治療或預防狼瘡、移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、1型或2型糖尿病或肥胖症中之至少一者。
- 如申請專利範圍第88項至第97項中任一項之方法,其中治療效能係經由以下來監測:尿酮之量測、TR1細胞數目之增加、選自發炎性細胞介素、IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2、TIGIT、PD1、顆粒酶B之生物標記物之表現之降低或增加、效應T細胞及/或hCD3+ 細胞數目之減少、PMBC增殖之阻抑或前述中任一者之組合。
- 一種評價抗MCT1拮抗劑抗體之治療效能之方法,其包括偵測其在活體外或活體內對以下前述中任一者之效應:尿酮、TR1細胞之數目、選自發炎性細胞介素、IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2、TIGIT、PD1、顆粒酶B之生物標記物之表現、效應T細胞及/或hCD3+ 細胞數目之減少、PMBC增殖之阻抑或前述中任一者之組合。
- 一種用於治療癌症或預防癌症復發之方法,其包括向有需要之個體投與治療或預防有效量之如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞或含有治療或預防有效量之前述中任一者之醫藥組合物。
- 如申請專利範圍第100項之方法,其中腫瘤細胞表現MCT1。
- 如申請專利範圍第88項至第101項中任一項之方法,其中該個體係哺乳動物。
- 如申請專利範圍第102項之方法,其中該哺乳動物係人類、非人類靈長類動物或囓齒類動物。
- 一種用於抑制經活化T細胞或B細胞或降低經活化T細胞或B細胞之活性之方法,其包括使該等活化細胞與如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞接觸。
- 如申請專利範圍第88項至第104項中任一項之方法,其中如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞係作為單一療法投與。
- 如申請專利範圍第88項至第105項中任一項之方法,其中如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或融合多肽、嵌合抗原受體(CAR)、多特異性抗原結合多肽或多特異性或雙特異性抗體多肽或表現前述中至少一者之細胞係與第二治療劑組合投與。
- 如申請專利範圍第106項之方法,其中該治療劑係選自免疫抑制藥物、化學治療劑、雙胍例如二甲雙胍或另一抗糖尿病劑、或抗發炎劑。
- 如申請專利範圍第106項之方法,其中該另一治療劑係粒線體抑制劑及/或雙胍。
- 如申請專利範圍第106項至第108項中任一項之方法,其中該另一治療劑係選自二甲雙胍、苯乙雙胍、阿來西定、雙雙胍、丁福明、氯己定、氯丙胍、苯基雙胍、聚胺基丙基雙胍、聚己縮胍、嗎啉胍、格列吡嗪、格列苯脲、瑞格列奈、沙格列汀、西他列汀、雙羥萘酸撲蟯寧、氯胍、去氧羥四環素、阿托伐醌、卡格列淨、格列酮(例如曲格列酮 、吡格列酮、羅格列酮)、替吉環素、噻唑化物(例如,硝唑尼特)、柳基苯胺(例如氯生太爾、羥氯紮胺、氯硝柳胺)、哌克昔林、普萘洛爾、非諾貝特、咪康唑、奈法唑酮、戊烷脒、氫化可體松、間碘苯甲胍、氯尼達明、α生育酚琥珀酸酯(維生素E之主要形式)、碳酸酐酶、ME344 (MEI Pharma)、HIF1a抑制劑(例如柯因、黑毛黴素、二甲基-雙酚A、BAY84-2243)、SR13800、二甲基草醯甘胺酸(DMOG)、羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、羰基氰間氯苯腙(CCCP)、抗黴素A、寡黴素、沙利黴素、二硝基苯酚、魚藤酮、苯乙雙胍、酪胺酸磷酸化抑制劑9、連環蛋白A5、小檗鹼、疊氮化物、氰化物、氧化亞氮、三氧化砷、撲蟯寧、卡格列淨、羅格列酮、異戊巴比妥、和厚朴酚、牛蒡子苷元、咖啡酸苯基酯、哌非納嗪、三氟拉嗪、甲基乙二醛及包含前述中任一者之組合。
- 如申請專利範圍第88項至第109項中任一項之方法,其中該抗體、其抗原結合片段、融合蛋白或醫藥組合物係以經腸、非經腸或經表面方式投與。
- 一種用於監測利用結合至MCT1且降低MCT1介導之乳酸鹽轉運之抗體或其抗原結合片段或融合蛋白進行治療之效能之方法,其包括量測尿酮水準。
- 一種用於診斷病狀之方法,該病狀係選自自體免疫、發炎性或過敏性病狀;癌症;EIHI;多囊性腎病(ADPKD);糖尿病或其他代謝病症及/或與MCT1上調相關之病狀,該方法包括: (i) 分離負責介導該病狀之細胞; (ii) 使該等細胞與抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白接觸;且 (iii) 偵測結合至該等細胞之抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白之水準。
- 如申請專利範圍第111項或第112項之方法,其中該病狀係自體免疫病狀、發炎性病狀、移植病狀、GVHD、代謝病症(例如,糖尿病)、EIHI;多囊性腎病(ADPKD);或過敏性病狀。
- 如申請專利範圍第112項之方法,其中該病狀係自體免疫病狀、發炎性病狀、移植病狀、GVHD、代謝病症(例如,糖尿病)、多囊性腎病(ADPKD)或過敏性病狀,且該等細胞係經活化之T細胞或B細胞。
- 如申請專利範圍第112項之方法,其中該病狀係癌症且該等細胞係腫瘤細胞。
- 如申請專利範圍第112項之方法,其中該病狀係EIHI且該等細胞係β細胞。
- 如申請專利範圍第88項至第116項中任一項之方法,其中該抗MCT1抗體或其抗原結合片段或MCT1結合融合蛋白包含以下中之一或多者: (i) 與選自Ab1至Ab95中之任一者之抗MCT1抗體或包含與前述抗MCT1抗體中之任一者相同之CDR之另一抗MCT1抗體競爭; (ii) 包含與選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體相同之CDR; (iii) 包含選自Ab1至Ab95之抗人類MCT1抗體之親和力成熟或人類化變異體; (iv) 與包含以下之抗體競爭:與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab1至Ab59中之任一者競爭;及與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab2至Ab95中之任一者競爭; (v) 包含MCT1 Ab1之重鏈CDR序列(SEQ ID NO: 4、5、6)及MCT1 Ab1之輕鏈CDR序列(SEQ ID NO: 7、8、9)或Ab2至Ab95中之任一者之序列; (vi) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與MCT1 Ab1之VH 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab2至Ab60中之任一者競爭;及與MCT1 Ab1之VL 結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 3)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab2至Ab60中之任一者競爭; (vii) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與選自胺基酸序列SEQ ID NO: 2、12、14、16、19至32之VH 結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VH 結構域或與Ab5至Ab60中之任一者競爭;及/或 (viii) 與包含以下之抗體競爭,或其自身包含以下:與選自胺基酸序列SEQ ID NO: 13、15、17或33至44之VH 結構域之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致性之VL 結構域或與Ab5至Ab60中之任一者競爭;及/或 (ix) 包含至少一種肽,該至少一種肽包含與SEQ ID NO:6一致之序列或包含與其差異至多5個、4個、3個、2個或1個殘基之序列,其中該肽直接或間接地連接至另一多肽,例如抗體多肽或抗體結構域、血清白蛋白、人類或其他靈長類動物血清白蛋白、阿德耐汀、親和體、DARPin、抗運載蛋白、二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)、XTEN分子、rPEG分子或前述中任一者之片段或變異體。
- 一種偵測細胞表現MCT1、視情況功能性MCT1之方法,其包括測定如前述申請專利範圍中任一項之抗MCT1抗體中之任一者是否結合至該細胞所表現之MCT1。
- 如申請專利範圍第118項之方法,其中該細胞係非人類細胞。
- 如申請專利範圍第118項之方法,其中該細胞係非人類細胞。
- 如申請專利範圍第118項之方法,其中該細胞係自患有或疑似包含自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)之患者獲得。
- 如申請專利範圍第118項之方法,其中該偵測方法用於診斷或監測疾病或疾病預後,其係使用自患有或疑似包含特徵在於細胞包含異常(增加)之MCT1表現或活性之自體免疫病狀、過敏性病狀、發炎性病狀、代謝病症、癌症、移植接受者、細胞療法接受者、EIHI病狀、多囊性腎病(ADPKD)之患者獲得的細胞樣品來實施。
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862614081P | 2018-01-05 | 2018-01-05 | |
US62/614,081 | 2018-01-05 | ||
US201862703223P | 2018-07-25 | 2018-07-25 | |
US62/703,223 | 2018-07-25 | ||
US201862717289P | 2018-08-10 | 2018-08-10 | |
US62/717,289 | 2018-08-10 | ||
US201862719364P | 2018-08-17 | 2018-08-17 | |
US62/719,364 | 2018-08-17 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201938200A true TW201938200A (zh) | 2019-10-01 |
TWI751398B TWI751398B (zh) | 2022-01-01 |
Family
ID=67144294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW108100587A TWI751398B (zh) | 2018-01-05 | 2019-01-07 | 抗mct1抗體及其用途 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190263931A1 (zh) |
EP (1) | EP3735427A4 (zh) |
JP (2) | JP2021509822A (zh) |
KR (1) | KR20200106498A (zh) |
CN (1) | CN111757893A (zh) |
AU (2) | AU2019205489A1 (zh) |
BR (1) | BR112020013314A2 (zh) |
CA (1) | CA3087259A1 (zh) |
IL (1) | IL275826A (zh) |
MX (1) | MX2020007033A (zh) |
TW (1) | TWI751398B (zh) |
WO (1) | WO2019136300A2 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI745906B (zh) * | 2020-03-27 | 2021-11-11 | 國立臺灣大學 | 烯丙胍聚合物及其製備方法與應用 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3154522A1 (en) | 2019-10-15 | 2021-04-22 | Christopher Carl Frye | Recombinantly engineered, lipase/esterase-deficient mammalian cell lines |
AU2021246922A1 (en) * | 2020-03-30 | 2022-10-20 | Crystal Bioscience Inc. | Anti-GIPR antibody and methods of use thereof |
US20220062336A1 (en) * | 2020-08-31 | 2022-03-03 | The Johns Hopkins University | Method for accelerating nerve regeneration |
WO2023003907A1 (en) * | 2021-07-19 | 2023-01-26 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Cellular therapies for cancer by inhibition of monocarboxylate transporter 11 |
TW202330602A (zh) * | 2021-09-14 | 2023-08-01 | 美商伊穆諾米塔博立森發展公司 | 人類單羧酸鹽轉運蛋白1抗體及其用途 |
CN114181945B (zh) * | 2021-12-17 | 2023-10-31 | 中山大学附属第一医院 | tRNA m7G修饰、WDR4、METTL1在机体发育的功能和应用 |
CN117430697A (zh) * | 2022-07-21 | 2024-01-23 | 佰舟生物科技(苏州)有限公司 | 抗mct1抗体及其用途 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040132813A1 (en) * | 2001-05-30 | 2004-07-08 | Brooks George A. | Glycerol-lactate esters for use as an energy supplement during exercise and recovery |
US20040072746A1 (en) * | 2001-10-16 | 2004-04-15 | Michael Sullivan | Inhibitors of monocarboxylate transport |
CA2474159A1 (en) * | 2002-01-23 | 2003-05-21 | Carl R. Merril | Method for determining sensitivity to a bacteriophage |
WO2005056606A2 (en) * | 2003-12-03 | 2005-06-23 | Xencor, Inc | Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor |
US7740856B2 (en) * | 2005-12-20 | 2010-06-22 | Isu Abxis Co., Ltd. | Effect of BST2 on inflammation |
US20080206239A1 (en) * | 2005-02-03 | 2008-08-28 | Antitope Limited | Human Antibodies And Proteins |
JP2011511638A (ja) * | 2008-02-07 | 2011-04-14 | シェーリング コーポレイション | 抗tslpr抗体の設計製作 |
EP3338799B1 (en) * | 2008-11-25 | 2021-04-07 | Vitaeris Inc. | Antibodies to il-6 and use thereof |
GB0904214D0 (en) * | 2009-03-11 | 2009-04-22 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
US20140255301A1 (en) * | 2010-11-29 | 2014-09-11 | Mark Chen | Methods for detecting neurodegenerative diseases or disorders |
US20140193436A1 (en) * | 2011-06-24 | 2014-07-10 | Centrose, Llc | Extracellular targeted drug conjugates |
CN106999576B (zh) * | 2014-09-08 | 2021-09-03 | 国立癌症研究中心 | 癌细胞特异性抗体、抗癌剂、及癌症的检查方法 |
GB201418626D0 (en) * | 2014-10-20 | 2014-12-03 | Univ London Queen Mary | Method |
WO2016090347A1 (en) * | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Immunext, Inc. | Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators |
CN113912724A (zh) * | 2015-09-25 | 2022-01-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗tigit抗体和使用方法 |
-
2019
- 2019-01-04 AU AU2019205489A patent/AU2019205489A1/en not_active Abandoned
- 2019-01-04 MX MX2020007033A patent/MX2020007033A/es unknown
- 2019-01-04 BR BR112020013314-0A patent/BR112020013314A2/pt unknown
- 2019-01-04 JP JP2020557123A patent/JP2021509822A/ja active Pending
- 2019-01-04 KR KR1020207019338A patent/KR20200106498A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-01-04 WO PCT/US2019/012415 patent/WO2019136300A2/en unknown
- 2019-01-04 CN CN201980007427.5A patent/CN111757893A/zh active Pending
- 2019-01-04 CA CA3087259A patent/CA3087259A1/en active Pending
- 2019-01-04 US US16/240,499 patent/US20190263931A1/en active Pending
- 2019-01-04 EP EP19735729.6A patent/EP3735427A4/en active Pending
- 2019-01-07 TW TW108100587A patent/TWI751398B/zh active
-
2020
- 2020-07-02 IL IL275826A patent/IL275826A/en unknown
-
2022
- 2022-08-10 JP JP2022127690A patent/JP2022160650A/ja active Pending
- 2022-08-11 AU AU2022215229A patent/AU2022215229A1/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI745906B (zh) * | 2020-03-27 | 2021-11-11 | 國立臺灣大學 | 烯丙胍聚合物及其製備方法與應用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20200106498A (ko) | 2020-09-14 |
JP2021509822A (ja) | 2021-04-08 |
CA3087259A1 (en) | 2019-07-11 |
JP2022160650A (ja) | 2022-10-19 |
WO2019136300A2 (en) | 2019-07-11 |
EP3735427A2 (en) | 2020-11-11 |
CN111757893A (zh) | 2020-10-09 |
BR112020013314A2 (pt) | 2020-12-01 |
WO2019136300A3 (en) | 2019-09-26 |
IL275826A (en) | 2020-08-31 |
AU2022215229A1 (en) | 2022-10-06 |
EP3735427A4 (en) | 2021-09-15 |
AU2019205489A1 (en) | 2020-06-25 |
TWI751398B (zh) | 2022-01-01 |
US20190263931A1 (en) | 2019-08-29 |
MX2020007033A (es) | 2021-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102564248B1 (ko) | 항-인간 vista 항체 및 이의 용도 | |
US11529399B2 (en) | Anti-ICOS agonist antibodies and uses thereof | |
US20200199228A1 (en) | Kir3dl2 binding agents | |
TWI751398B (zh) | 抗mct1抗體及其用途 | |
WO2020098734A1 (zh) | 抗tigit抗体及其用途 | |
IL296673A (en) | Anti-ccr8 antibodies for cancer treatment | |
JP2017101042A (ja) | B7−h1およびpd−1に結合する抗体およびその他の分子 | |
JP2018522541A (ja) | 抗cll−1抗体及び使用方法 | |
US20230340114A1 (en) | Novel anti-lilrb4 antibodies and derivative products | |
TW201825115A (zh) | 抗人類cd52免疫球蛋白 | |
RU2650756C2 (ru) | Антитела к h7cr | |
AU2020378335A1 (en) | Anti-TIGIT antibodies and uses thereof | |
BR112020006860A2 (pt) | composição para depleção de células t citotóxicas | |
TW202413420A (zh) | 抗人類vista抗體及其用途 |