CN114181945B - tRNA m7G修饰、WDR4、METTL1在机体发育的功能和应用 - Google Patents

tRNA m7G修饰、WDR4、METTL1在机体发育的功能和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法，包括步骤检测WDR4点突变的小鼠的肾脏，获得不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量，给予小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白，获得小鼠样本，检测小鼠样本的肾脏，获得小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量，根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证tRNA改性蛋白的效果。本发明提供了治疗机体发育异常等方面疾病的方法，该方法包括给予个体WDR4正常基因的表达，使得个体表现出METTL1蛋白水平、m7G修饰tRNA表达水平和修饰水平恢复，个体功能明显改善，自动地识别肾脏显微照片，建立统一的tRNA m7G修饰WDR4、METTL1基因表达水平的验证流程。

Description

tRNA m7G修饰、WDR4、METTL1在机体发育的功能和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域、医学领域、图像处理技术领域，具体涉及tRNA m7G修饰、WDR4、METTL1在机体发育的功能和应用，本发明还涉及突变的WDR4基因、以及该变异位点的tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法和检测试剂盒。
本发明关于诊断和治疗机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面的作用和应用。此外，本发明还涉及含m7G修饰tRNA及其衍生物、WDR4、METTL1基因及其编码产物在孕前和产前的诊断筛查方法，以及m7G修饰tRNA及其衍生物、WDR4、METTL1基因及其编码产物用于制备提高智力、记忆力以及运动协调能力、生殖能力和改善肾功能等方面药物和保健品的用途。
背景技术
转运RNA(tRNA)是机体蛋白翻译过程中的重要参与因子。成熟的tRNA含有丰富的修饰碱基，这些修饰对于tRNA正确折叠，维持tRNA结构稳定性和功能具有重要作用。tRNAm7G修饰发生在tRNA第46位碱基，在哺乳动物中由METTL1甲基转移酶和WDR4组成的蛋白复合物催化产生。然而tRNA m7G修饰在哺乳动物中的功能鲜有报道。临床上报道了一些发育异常病例包括先天性小头畸形、小头侏儒症、Galloway-Mowat综合症等患者携带WDR4基因突变，但WDR4基因以及tRNA m7G修饰在其中的功能和作用并不清楚，目前也没有相应的治疗措施和有效药物。本发明涉及哺乳动物m7G修饰tRNA及其衍生物，tRNA m7G修饰相关基因WDR4和METTL1基因及其编码产物在诊断和治疗机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面的作用和应用。此外，本发明还涉及含m7G修饰tRNA及其衍生物、WDR4、METTL1基因及其编码产物在孕前和产前的诊断筛查方法，以及m7G修饰tRNA及其衍生物、WDR4、METTL1基因及其编码产物用于制备提高智力、记忆力以及运动协调能力、生殖能力和改善肾功能等方面药物和保健品的用途。
发明内容
本发明提供一个突变的WDR4基因，所述突变的WDR4基因与野生型WDR4基因的差异在于1个突变，并且所述突变的WDR4基因导致机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种的发生；所述突变为人WDR4基因转录本NM_033661.4c.509G突变为T，所述突变位点区的野生型WDR4基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述突变为小鼠WDR4基因转录本NM_021322.2c.664G突变为T，所述突变位点区的野生型WDR4基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，本发明提供了一种载体，所述载体包含上述的突变的WDR4基因。
优选地，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的突变的WDR4基因或上述的载体。
优选地，本发明还提供上述突变的WDR4基因或上述的载体或上述的宿主细胞在产生机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调疾病动物模型中的应用。
优选地，本发明还提供上述突变的WDR4基因或上述的载体或上述的宿主细胞在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于产生机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种疾病疾病动物模型。
优选地，本发明提供一种用于诊断机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种疾病疾病的诊断剂，所述诊断剂包含能够特异性扩增WDR4基因的引物。
进一步地，所述WDR4基因突变为WDR4基因NM_033661.4c.509G>T突变，所述突变位点区的野生型WDR4基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，所述诊断剂通过PCR、Southern印迹法、DNA序列分析、原位杂交进行突变的检测。
进一步地，本发明提供一种诊断剂在制备用于检测WDR4基因的突变和/或用于诊断机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种疾病疾病的试剂盒中的应用。
针对tRNA m7G修饰在哺乳动物中的功能不明的问题，本发明的主要目的在于明确tRNA m7G修饰及其相关修饰基因WDR4、METTL1在哺乳动物机体发育、功能行使方面的作用，并公开涉及tRNA m7G修饰及其相关修饰基因WDR4、METTL1在治疗神经系统、泌尿系统和生殖系统的应用。
本发明明确了WDR4基因突变可导致小鼠发育异常，该小鼠表现出生长发育迟缓，脑畸形，学习认知障碍，共济失调，肾脏损伤，生殖功能丧失等，其分子机制是由于WDR4突变导致METTL1蛋白水平异常，tRNA m7G修饰和表达水平异常，蛋白翻译紊乱导致。基于此，本发明提供了一种对个体进行机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面的早期筛查、诊断方法，其步骤如下：
tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，检测WDR4点突变的小鼠的肾脏，获得不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量；
步骤2，给予小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白，获得小鼠样本；
步骤3，检测小鼠样本的肾脏，获得小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量。
进一步地，步骤1中，检测WDR4点突变的小鼠的肾脏，获得不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：
检测WDR4点突变的小鼠的肾脏，获得不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：
制备基因不正常的小鼠肾脏石蜡切片，对肾脏石蜡切片染色，扫描染色后的肾脏石蜡切片获得肾脏图片，根据肾脏图片计算小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量。
进一步地，步骤2中，给予小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白，获得小鼠样本的子步骤为：利用AAV-PHeB嗜神经病毒构建野生型WDR4表达载体(OE)，对照载体为Vec，给予WDR4点突变的小鼠注射相应的病毒，每只小鼠注射病毒量为2.5×1011v.g.。
进一步地，步骤3和步骤1中，检测小鼠样本的肾脏，获得小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：制备小鼠肾脏石蜡切片，对肾脏石蜡切片染色，扫描染色后的肾脏石蜡切片获得肾脏图片，根据肾脏图片计算小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量。
其中，制备小鼠肾脏石蜡切片，对肾脏石蜡切片染色，扫描染色后的肾脏石蜡切片获得肾脏图片的子步骤为：
步骤3.1，取3月龄的小鼠，小鼠经过量麻醉处死后，解剖小鼠后取出肾脏，4％多聚甲醛固定肾脏48h，然后经酒精梯度、二甲苯脱水，石蜡包埋，制得石蜡切片；
步骤3.2，把石蜡切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，蒸馏水清洗，加入阿利新蓝染色液染色5min，蒸馏水洗3次，切片后加入过碘酸溶液氧化1min，放入希夫试剂浸染3min，移除希夫试剂，流水冲洗，苏木素染色液10s，盐酸酒精分化30s，流水冲洗30min，切片经逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，在显微镜下对切片拍照获得肾脏图片；显微镜的放大倍数为200x～400x；
所述显微镜为具有明场拍照功能的普通光学显微镜、全内反射荧光显微镜、紫外光显微镜、扫描电子显微镜等中任意一种。
进一步地，获得小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：
步骤4.1.1，对肾脏图片进行降噪和灰度化预处理；
步骤4.1.2，通过边缘检测算子对预处理后的肾脏图片进行边缘检测，边缘检测得到的边缘曲线将预处理后的肾脏图片分为多个封闭区域，所有封闭区域记为区域集合CH；对预处理后的肾脏图片进行圆检测，获得圆集合CR；
定义一个空集合作为第一组织集合TSA，定义一个空集合作为第二组织集合TSC，步骤4.1.3，使区域集合CH中封闭区域面积大于第一面积阈值的封闭区域放入第一组织集合TSA，使区域集合CH中封闭区域面积小于第二面积阈值的封闭区域放入第二组织集合TSC；其中，第一面积阈值的计算方法为：
A(CH)avg+MINA(CH)×δ×exp(len(CH)/len(CR))；
第二面积阈值的计算方法为：
A(CH)avg-MINA(CH)×δ×exp(len(TSA)/len(CR))；
式中，A(CH)avg为获取区域集合CH中所有封闭区域的平均面积大小，MINA(CH)为获取区域集合CH中封闭区域面积的最小值；exp()为以自然对数为底的指数函数，δ为面积修正系数，δ＝1.2；
使区域集合CH中灰度值大于第一灰度阈值的封闭区域记为第三组织集合TSD，第一灰度阈值为(G1max-Gmin×len(TSA)/len(TSC))，len()表示获取集合中元素的数量，G1max为第二组织集合TSC中所有封闭区域的灰度值的最大值，Gmin为区域集合CH中所有封闭区域的灰度值的最小值；(其中，封闭区域的灰度值为封闭区域内所有像素点灰度值的平均值)；
步骤4.1.4，初始化变量i＝1，i∈[1,len(TSA)]，第二组织集合TSC与第三组织集合TSD重合的封闭区域记为第四组织集合TSE；
步骤4.1.5，在第一组织集合TSA中第i个封闭区域TSAi中，获取第四组织集合TSE中全部包含于第一组织集合TSA中第i个封闭区域TSAi中的封闭区域，即如果第四组织集合TSE中的一个封闭区域的边缘与封闭区域TSAi没有的边缘没有交点，则把此封闭区域放入集合TSAW中；使i的值增加1重新开始步骤4.1.5直到i＞len(TSA)，跳转步骤4.1.6；
步骤4.1.6，把步骤4.1.5中的被放进集合TSAW中的封闭区域从第四组织集合TSE中剔除；初始化变量j的值为1，j∈[1,len(TSE)]，len()表示获取集合中元素的数量；跳转步骤4.1.7；使BP＝len(TSC)；
步骤4.1.7，如果封闭区域TSEj与任意TSA集合中的封闭区域没有交点或者和圆集合CR中任意圆没有交点，如果j＜len(TSE)则使j的值增加1，重新开始步骤4.1.7否则跳转步骤4.1.10；TSEj为TSE中第j个元素；
如果封闭区域TSCj与TSA集合中的封闭区域有交点或和圆集合CR中任意圆有交点，跳转步骤4.1.8；TSCj为第二组织集合TSC第j个元素；
步骤4.1.8，取封闭区域TSCj与TSA集合中的封闭区域或圆集合CR中的圆的交点，如果交点数量大于2，取各交点中与封闭区域TSCj的几何中心点最近的2个交点作为基准点A1和A2，如果交点数量为2，取2个交点作为基准点A1和A2，跳转步骤4.1.9，如果交点数量为1，如果j＜len(TSC)则使j的值增加1，重新开始步骤4.1.7，否则跳转步骤4.1.10，
步骤4.1.9，判断基准点A1和A2是否符合第一条件，如果符合第一条件，跳转步骤4.1.91，否则跳转步骤4.1.92；
其中，第一条件为：sqrt(R1+OA1)≤D(A1,A2)≤∑R(TSAW)/(8.5×len(TSAW))；或者第一条件为：sqrt(R1+OA2)≤D(A1,A2)≤∑R(TSAW)/(8.5×len(TSAW))；
其中，sqrt(R1+OA1)为获取封闭区域TSCj与第一组织集合TSA中相交的封闭区域的周长或圆集合CR中有相交的圆的周长，如果上述相交的封闭区域或圆有多个，取面积或周长最大的封闭区域或圆，所述周长加上OA1的和，取所述和的平方根为sqrt(R1+OA1)的值，sqrt(R1+OA2)为获取封闭区域TSCj与第一组织集合TSA中相交的封闭区域的周长或圆集合CR中有相交的圆的周长，如果上述相交的封闭区域或圆有多个，取面积或周长最大的封闭区域或圆，所述周长加上OA1的和，取所述和的平方根为sqrt(R1+OA2)的值，D(A1,A2)为基准点A1到基准点A2的欧氏距离，OA1和OA2分别指封闭区域TSCj的几何中心点O到基准点A1和A2的欧氏距离，∑R(TSAW)为获得集合TSAW中所有封闭区域的周长的和，len()表示获取集合中元素的数量；
步骤4.1.91，构建折线A1-O-A2，折线把获取封闭区域TSCj分成2部分，把与相交的第一组织集合TSA中相交的封闭区域或圆集合CR中有相交的圆的部分，并入对应与TSCj相交的第一组织集合TSA中相交的封闭区域或圆集合CR中有相交的圆中，令BP的值减1，如果j＜len(TSC)则使j的值增加1，重新开始(跳转)步骤4.1.7，否则跳转步骤4.1.10；
其中，O为封闭区域TSCj的几何中心点；
步骤4.1.92，如果sqrt(R1+OA1)＞D(A1,A2)或者sqrt(R1+OA2)＞D(A1,A2)，把封闭区域TSCj并入对应与TSCj相交的第一组织集合TSA中相交的封闭区域或圆集合CR中有相交的圆中，令BP的值减1，如果j＜len(TSC)则使j的值增加1，重新开始步骤4.1.7，否则跳转步骤4.1.10；
步骤4.1.10，输出abs(A(TSA)-A(CR))的值为肾小球系膜区域大小，BP的值为肾小球的数量；abs()为取绝对值的函数,A()函数为取集合中所有元素面积之和。
进一步地，tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法，还包括步骤4，根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证tRNA改性蛋白的效果。
进一步地，tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法，还包括步骤4，根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证tRNA改性蛋白的效果。
进一步地，在步骤4中，根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证tRNA改性蛋白的效果的步骤具体为：
对比不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量，与给予小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量，施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球系膜区域比不正常小鼠的肾小球系膜区域小20％，或者，施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球的数量比不正常小鼠的肾小球的数量多30％，表示m7G修饰tRNA及其衍生物，tRNA m7G修饰相关基因WDR4和METTL1基因及其编码产物在诊断和治疗机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面有作用。
优选地，在步骤4中，根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证tRNA改性蛋白的效果的步骤具体为：
记不正常小鼠的肾小球系膜区域大小为AC1，小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球系膜区域大小为AC2，不正常小鼠的肾小球的数量为BP1，小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球的数量为BP2，如果AC2≤0.8×AC1和/或BP2≥1.3×BP1则表示m7G修饰tRNA及其衍生物，tRNA m7G修饰相关基因WDR4和METTL1基因及其编码产物在诊断和治疗机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面有作用。
tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统，所述系统包括：
图像获取模块：用于获取肾脏图片；
图像处理模块：用于处理肾脏图片，输出小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量；
数据处理模块：根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白的功能。
第三方面，本发明提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现本发明第一方面提供的所述方法的步骤。
第四方面，本发明提供一种电子设备，包括：存储器，其上存储有计算机程序；处理器，用于执行所述存储器中的所述计算机程序，以实现本发明提供的所述方法的步骤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
自动地识别肾脏显微照片，建立统一的tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证流程。
本发明提供了治疗机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面疾病的方法，该方法包括给予个体WDR4正常基因的表达，使得个体表现出METTL1蛋白水平、m7G修饰tRNA表达水平和修饰水平恢复，神经系统和运动功能明显改善。
附图说明
图1为本发明提供的tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法的流程图；
图2为本发明一个实施例的tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统结构示意框图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详尽说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围内的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
本发明提供一个突变的WDR4基因，所述突变的WDR4基因与野生型WDR4基因的差异在于1个突变，并且所述突变的WDR4基因导致机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种的发生；所述突变为人WDR4基因转录本NM_033661.4c.509G突变为T，所述突变位点区的野生型WDR4基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述突变为小鼠WDR4基因转录本NM_021322.2c.664G突变为T，所述突变位点区的野生型WDR4基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，本发明提供了一种载体，所述载体包含上述的突变的WDR4基因。
优选地，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的突变的WDR4基因或上述的载体。
优选地，本发明还提供上述突变的WDR4基因或上述的载体或上述的宿主细胞在产生机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调疾病动物模型中的应用。
优选地，本发明还提供上述突变的WDR4基因或上述的载体或上述的宿主细胞在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于产生机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调疾病动物模型。
优选地，本发明提供一种用于诊断机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调疾病的诊断剂，所述诊断剂包含能够特异性扩增WDR4基因突变的引物。
进一步地，所述WDR4基因突变为WDR4基NM_033661.4c.509G>T突变，所述突变位点区的野生型WDR4基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，所述诊断剂通过PCR、Southern印迹法、DNA序列分析、原位杂交进行突变的检测。
进一步地，本发明提供一种诊断剂在制备用于检测WDR4基因的突变和/或用于诊断机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调疾病的试剂盒中的应用。
以下示例性地说明本发明提供的tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法。
如图1所示为tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法的流程图，下面结合图1来阐述根据本发明的实施方式的tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，检测WDR4点突变的小鼠的肾脏，获得不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量；
步骤2，给予小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白，获得小鼠样本；
步骤3，检测小鼠样本的肾脏，获得小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量；
步骤4，根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证tRNA改性蛋白的效果。
进一步地，步骤1中，检测WDR4点突变的小鼠的肾脏，获得不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：
检测WDR4点突变的小鼠的肾脏，获得不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：
制备基因不正常的小鼠肾脏石蜡切片，对肾脏石蜡切片染色，扫描染色后的肾脏石蜡切片获得肾脏图片，根据肾脏图片计算小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量。
进一步地，步骤2中，给予小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白，获得小鼠样本的子步骤为：利用AAV-PHeB嗜神经病毒构建野生型WDR4表达载体(OE)，对照载体为Vec，给予WDR4点突变的小鼠注射相应的病毒，每只小鼠注射病毒量为2.5×1011v.g.。
进一步地，步骤3中，检测小鼠样本的肾脏，获得小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：制备小鼠肾脏石蜡切片，对肾脏石蜡切片染色，扫描染色后的肾脏石蜡切片获得肾脏图片，根据肾脏图片计算小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量。
其中，制备小鼠肾脏石蜡切片，对肾脏石蜡切片染色，扫描染色后的肾脏石蜡切片获得肾脏图片的子步骤为：
步骤3.1，取3月龄的小鼠，小鼠经过量麻醉处死后，解剖小鼠后取出肾脏，4％多聚甲醛固定肾脏48h，然后经酒精梯度、二甲苯脱水，石蜡包埋，制得石蜡切片；
步骤3.2，把石蜡切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，蒸馏水清洗，加入阿利新蓝染色液染色5min，蒸馏水洗3次，切片后加入过碘酸溶液氧化1min，放入希夫试剂浸染3min，移除希夫试剂，流水冲洗，苏木素染色液10s，盐酸酒精分化30s，流水冲洗30min，切片经逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，在显微镜下拍照获得肾脏图片；显微镜的放大倍数为200x～400x；
所述显微镜为具有明场拍照功能的普通光学显微镜、全内反射荧光显微镜、紫外光显微镜等中任意一种。
进一步地，获得小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量的子步骤为：
步骤4.1.1，对肾脏图片进行降噪和灰度化预处理；
步骤4.1.2，通过边缘检测算子对预处理后的肾脏图片进行边缘检测，边缘检测得到的边缘曲线将预处理后的肾脏图片分为多个封闭区域，所有封闭区域记为区域集合CH；对预处理后的肾脏图片进行圆检测，获得圆集合CR；
步骤4.1.3，使区域集合CH中封闭区域面积大于第一面积阈值的封闭区域放入第一组织集合TSA，使区域集合CH中封闭区域面积小于第二面积阈值的封闭区域放入第二组织集合TSC；其中，第一面积阈值的计算方法为：
A(CH)avg+MINA(CH)×δ×exp(len(CH)/len(CR))；
第二面积阈值的计算方法为：
A(CH)avg-MINA(CH)×δ×exp(len(TSA)/len(CR))；
式中，A(CH)avg为获取区域集合CH中所有封闭区域的平均面积大小，MINA(CH)为获取区域集合CH中封闭区域面积的最小值；exp()为以自然对数为底的指数函数，δ为面积修正系数，δ＝1.2；
使区域集合CH中灰度值大于第一灰度阈值的封闭区域记为第三组织集合TSD，第一灰度阈值为(G1max-Gmin×len(TSA)/len(TSC))，len()表示获取集合中元素的数量，G1max为第二组织集合TSC中所有封闭区域的灰度值的最大值，Gmin为区域集合CH中所有封闭区域的灰度值的最小值；
步骤4.1.4，初始化变量i＝1，i∈[1,len(TSA)]，第二组织集合TSC与第三组织集合TSD重合的封闭区域记为第四组织集合TSE；
步骤4.1.5，在第一组织集合TSA中第i个封闭区域TSAi中，获取第四组织集合TSE中全部包含于第一组织集合TSA中第i个封闭区域TSAi中的封闭区域，即第四组织集合TSE中的一个封闭区域的边缘与封闭区域TSAi没有的边缘没有交点，把此封闭区域放入集合TSAW中；使i的值增加1重新开始步骤4.1.5直到i＞len(TSA)，跳转步骤4.1.6；
步骤4.1.6，把步骤4.1.5中的被放进集合TSAW中的封闭区域从第四组织集合TSE中剔除；初始化变量j的值为1，j∈[1,len(TSE)]，len()表示获取集合中元素的数量；跳转步骤4.1.7；使BP＝len(TSC)；
步骤4.1.7，如果封闭区域TSEj与任意TSA集合中的封闭区域和圆集合CR中任意圆没有交点，如果j＜len(TSE)则使j的值增加1，重新开始步骤4.1.7否则跳转步骤4.1.10；
如果封闭区域TSCj与TSA集合中的封闭区域或圆集合CR中任意圆有交点，跳转步骤4.1.8；
步骤4.1.8，取封闭区域TSCj与TSA集合中的封闭区域或圆集合CR中的圆的交点，如果交点数量大于2，取交点中与封闭区域TSCj的几何中心点最近的2个交点作为基准点A1和A2，如果交点数量为2，取2个交点作为基准点A1和A2，跳转步骤4.1.9，如果交点数量为1，如果j＜len(TSC)则使j的值增加1，跳转步骤4.1.7，否则跳转步骤4.1.10，
步骤4.1.9，判断基准点A1和A2是否符合第一条件，如果符合第一条件，跳转步骤4.1.91，否则跳转步骤4.1.92；
第一条件：sqrt(R1+OA1)≤D(A1,A2)≤∑R(TSAW)/(8.5×len(TSAW))；
或者sqrt(R1+OA2)≤D(A1,A2)≤∑R(TSAW)/(8.5×len(TSAW))；
其中，sqrt(R1+OA1)为获取封闭区域TSCj与第一组织集合TSA中相交的封闭区域的周长或圆集合CR中有相交的圆的周长，如果上述相交的封闭区域或圆有多个，取面积或周长最大的封闭区域或圆，所述周长加上OA1的和，取所述和的平方根为sqrt(R1+OA1)的值，sqrt(R1+OA2)为获取封闭区域TSCj与第一组织集合TSA中相交的封闭区域的周长或圆集合CR中有相交的圆的周长，如果上述相交的封闭区域或圆有多个，取面积或周长最大的封闭区域或圆，所述周长加上OA1的和，取所述和的平方根为sqrt(R1+OA2)的值，D(A1,A2)为基准点A1到基准点A2的欧氏距离，OA1和OA2分别指封闭区域TSCj的几何中心点O到基准点A1和A2的欧氏距离，∑R(TSAW)为获得集合TSAW中所有封闭区域的周长的和，len()表示获取集合中元素的数量；
步骤4.1.91，构建折线A1-O-A2，折线把获取封闭区域TSCj分成2部分，把与相交的第一组织集合TSA中相交的封闭区域或圆集合CR中有相交的圆的部分，并入对应与TSCj相交的第一组织集合TSA中相交的封闭区域或圆集合CR中有相交的圆中，将BP的值减1，如果j＜len(TSC)则使j的值增加1，重新开始步骤4.1.7，否则跳转步骤4.1.10；
其中，O为封闭区域TSCj的几何中心点；
步骤4.1.92，如果sqrt(R1+OA1)＞D(A1,A2)或者sqrt(R1+OA2)＞D(A1,A2)，把封闭区域TSCj并入对应与TSCj相交的第一组织集合TSA中相交的封闭区域或圆集合CR中有相交的圆中，将BP的值减1，如果j＜len(TSC)则使j的值增加1，重新开始步骤4.1.7，否则跳转步骤4.1.10；
步骤4.1.10，输出abs(A(TSA)-A(CR))的值为肾小球系膜区域大小，BP的值为肾小球的数量；abs()为取绝对值的函数,A()函数为取集合中所有元素面积之和，例如A(TSA)为取集合TSA中所有区域面积之和。
进一步地，步骤4中，根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证tRNA改性蛋白的效果的步骤具体为：
对比不正常小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量，与给予小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量，施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球系膜区域比不正常小鼠的肾小球系膜区域小20％，以及施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球的数量比不正常小鼠的肾小球的数量多30％，表示m7G修饰tRNA及其衍生物，tRNAm7G修饰相关基因WDR4和METTL1基因及其编码产物在诊断和治疗机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面有作用。优选地，记不正常小鼠的肾小球系膜区域大小为A1，小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球系膜区域大小为A2，不正常小鼠的肾小球的数量为BP1，小鼠施用正常的m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白后小鼠的肾小球的数量为BP2，如果A2≤0.8×A1和BP2≥1.3×BP1则表示m7G修饰tRNA及其衍生物，tRNA m7G修饰相关基因WDR4和METTL1基因及其编码产物在诊断和治疗机体发育异常(包括神经系统、泌尿系统和生殖系统等)、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍、记忆力下降等方面有作用。
如图2所示是本发明一个实施例的tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统结构示意框图。
tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统，所述系统包括：
图像获取模块：用于获取肾脏图片；
图像处理模块：用于处理肾脏图片，输出小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量；
数据处理模块：根据小鼠样本的肾小球系膜区域大小与肾小球的数量验证m7G修饰tRNA或WDR4、METTL1基因或蛋白的功能。
实施案例1：WDR4基因对小鼠生长及神经系统发育、智力和运动协调能力的影响
一、构建WDR4突变转基因小鼠
根据临床上发现的其中一个WDR4突变类型，构建WDR4突变转基因小鼠。通过比对人和小鼠的基因序列，利用CRISPR/Cas9技术把小鼠WDR4基因的第644位碱基G突变T，蛋白质相对应的第215位氨基酸Arg突变为Leu，构建成为WDR4点突变基因敲入模式小鼠。
二、WDR4突变转基因小鼠表型和脑组织结构观察
正常饲养小鼠，观察比较WT组和Homo组小鼠外观大小。分别取出生后35天和56天小鼠，解剖脑组织，比较脑组织外观大小。
三、平衡木实验
平衡木实验设备为一根长1米，宽2.5cm的木条，在平衡木的一端设有一个小黑盒，里面放置动物垫料和饲料作为吸引动物的因素。实验共需3天，day1-2为学习阶段，day3为测试阶段。
(1)day1，开始前每只动物放到黑盒里面，盖上盖子，让其待在里面30s，然后把动物取出来放到离黑盒30cm左右距离，平横木动物一端打开噪音作为动物厌恶因素让其走向黑盒，一旦动物进入黑盒，马上关闭噪音，让动物在盒子里待30s左右。重复2次。
(2)开始正式实验。取出小鼠放置在平衡木的一端，另一端放置小黑盒。打开噪音器，记录动物通过平衡木进入黑盒所用的时间。一旦动物进入黑盒，马上关闭噪音。
(3)每只动物实验每天3次，每次间隔5min。
(4)连续3天重复步骤(2)、(3)。第三天记录的数据用于统计分析小鼠运动协调平衡能力。
四、转棒实验：
实验设备为小鼠转棒仪。实验共需3天，day1-2为学习阶段，day3为测试阶段。
(1)实验参数设置为开始速度0rpm/min，实验时间5min，转棒仪均匀加速，最终速度为40rpm/min。
(2)将小鼠放置在转棒仪上，让其稳定30s。启动转棒仪，记录小鼠掉落时间。
(3)每只动物每天实验3次，每次间隔时间30min。
(4)day3记录数据用于统计分析。
五、巴恩斯迷宫实验
本实验所用的巴恩斯迷宫是一个直径92cm，沿周长具有20个等距间隔的孔(孔直径5cm，孔间距7.5cm)并高出地面105cm的白色圆形平台。实验分为空间学习阶段(day1-day4)和Probe Trial阶段(day5)。实验方法如下：
(1)在空间学习阶段，开始实验前，在巴恩斯迷宫四周东南西北四个方向分别放置不同的物体作为空间标记，实验过程中注意不要移动标记位置。选择一个孔标记为target，在孔下方放置小黑盒，小鼠可以通过孔进入小黑盒躲避。与target相隔180°对应的孔标记为opposite。除了target以外，其他所有孔下方没有任何物品。
(2)day1实验前准备，用酒精喷洒清洁迷宫和小黑盒，擦干。在迷宫中心位置放置一个直径10cm的两段镂空的圆形桶，取出小鼠放入其中，使其在里面停留10s。拿起圆形桶，开启噪音器(85dB)，将小鼠轻轻引导至小黑盒，关闭噪音器，让小鼠在黑盒中停留60s后，取出。每只动物安排此步骤实验一次。
(3)day1开始正式实验，将小鼠放置在迷宫中心位置圆桶内10s，拿起圆形桶，打开动物行为学分析软件，记录小鼠探索每个孔的次数、时间、活动路程等参数。开启噪音器，让小鼠活动自由探索。一旦小鼠找到target并进入小黑盒，立刻关闭噪音器，停止记录。让小鼠在黑盒中停留60s后，取出，放入事先准备好的其他饲养笼内。最长探索时间为3min，若小鼠在3min内没有找到target，则轻轻将小鼠引导至小黑盒，完成后续实验。
(4)用酒精喷洒清洁迷宫和小黑盒，擦干，取出下一只动物进行实验。
(5)每只动物每天重复步骤(3)4次，每次间隔15min，重复4天。
(6)day5为Probe Trial实验。此时将target下方小黑盒取走，所有孔一致。用酒精喷洒清洁迷宫。将小鼠放置在迷宫中心位置圆通内10s，拿起圆形桶，打开动物行为学分析软件，开启噪音器，记录小鼠90s内探索每个孔的次数、时间、活动路程等参数。
(7)每只动物实验结束，用酒精喷洒清洁迷宫，擦干，安排下一只动物实验。
(8)每只动物重复步骤(6)4次，每次间隔15min。
六、实验结果
野生型小鼠标记为WT组，携带WDR4点突变杂合子小鼠为Het组，携带WDR4点突变纯合子小鼠为Homo组。实验结果发现，Homo组小鼠生长发育严重迟滞，小鼠体型显著小于WT组。通过解剖小鼠脑组织发现，Homo组小鼠全脑包括大脑和小脑明显小于WT组，脑神经系统发育缺陷。平衡木实验和转棒实验显示小鼠的运动协调平衡能力严重受损。巴恩斯迷宫实验结果显示，WT和Het组小鼠在学习训练的4天时间中，Total errors、Total time均呈现出下降趋势，表明小鼠逐渐学习并记忆了target的位置，且WT和Het组小鼠上述指标显著低于Homo组小鼠，说明Homo小鼠空间学习认知能力降低。在第5天的Probe Trial测试实验中，WT组小鼠探索的孔次数明显集中在target及其附近孔，探索远离target的孔次数明显减少，表明小鼠24h后仍然保留了对target的空间位置的记忆，Homo组小鼠则没有这种探索趋势，说明，Homo小鼠空间学习认知能力和记忆受损。以上结果表明，tRNA m7G修饰相关基因WDR4突变是导致先天性小鼠机体发育、神经系统发育异常的致病基因。
实施案例2：WDR4突变导致小鼠肾脏损伤
一、制备小鼠肾脏石蜡切片
取3月龄小鼠，过量麻醉处死后，解剖小鼠，取出肾脏，4％多聚甲醛固定48h，然后经酒精梯度、二甲苯脱水，石蜡包埋，制作石蜡切片。
二、过碘酸-雪夫染色液
石蜡切片经常规二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，蒸馏水清洗后，加入阿利新蓝染色液染色5min，蒸馏水洗3次。切片加入过碘酸溶液氧化1min，然后放入Schiff Reagent浸染3min。倾去Schiff Reagent，流水冲洗。苏木素染色液10s。盐酸酒精分化30s，流水冲洗30min。切片经逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，拍照。
三、Masson染色
石蜡切片经常规二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，蒸馏水清洗后，用配制好的Weigert铁苏木素染色液染色5min-10min。盐酸酒精分化液分化30s，流水冲洗。Masson蓝化液返蓝，蒸馏水洗1min。然后用丽春红品红染色液染色5min。期间按蒸馏水:弱酸溶液＝2:1比例配置弱酸工作液，然后用弱酸工作液洗涤切片1min。磷钼酸溶液洗涤切片1min。切片再用配置好的弱酸工作液洗1min。之后切片直接放入苯胺蓝染色液中染色1min。用配置好的弱酸工作液洗1min。95％乙醇快速脱水5s。无水乙醇脱水3次，每次5s。二甲苯透明，中性树胶封固，拍照。
四、实验结果
过碘酸-雪夫染色液Homo小鼠肾小球的系膜细胞增生和系膜基质显著增多，毛细血管狭窄，部分肾小管萎缩。Masson染色Homo小鼠肾小球可见纤维化，肾小球硬化。以上结果表明，WDR4突变导致小鼠肾脏损伤。
实施案例3：WDR4基因对小鼠生殖能力的影响
一、实验方法
将育龄雄性小鼠和雌性小鼠按1:2的比例合笼繁育。合笼小鼠性别、基因型设置为以下3组：Het雄性小鼠和Het雌性小鼠(组1)，Homo雄性小鼠和WT雌性小鼠(组2)，WT雄性小鼠和Homo雌性小鼠(组3)。每组笼数为3笼，SPF级条件正常饲养繁育3个月，统计每组小鼠产仔次数、每次产仔数量以及后代基因型。
二、实验结果
组1产仔共5窝，每窝产仔数量为5～11只，后代基因型数量为WT 12只，Het 25只和Homo 5只，WT:Het:Homo＝0.96:2:0.2。组2产仔1窝，共5只；组3无繁育后代。以上结果表明，WDR4基因对雄性小鼠和雌性小鼠的生殖能力具有重要作用，其突变严重抑制了小鼠生育能力。
实施案例4：WDR4突变通过干扰METTL1蛋白水平、tRNA m7G修饰，引起细胞蛋白翻译异常，导致小鼠机体发育和功能异常
一、Western Blot
(1)组织蛋白提取：解剖小鼠组织后，取米粒大小的组织，加入RIPA细胞裂解液(含1mM PMSF，1X蛋白酶抑制剂cocktail)200μL，加入研磨珠，采用组织研磨器60Hz研磨1min，冰上裂解20min，12000rpm离心3min，取上清。BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。按1：4的比例加入5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后，95℃加热变性5min。处理后的蛋白样品于-80℃保存。
(2)采用常规SDS-PAGE电泳分离蛋白样品。用80V电泳30min，待溴酚蓝染料指示带从浓缩胶进入分离胶后，改用100V电泳约60min，直到溴酚蓝染料指示带处于距离胶底部1cm左右位置。
(3)转膜：先将PVDF膜浸于甲醇中激活1min，然后再将滤纸、凝胶、PVDF膜浸泡在1x转膜液中，将聚丙烯酰胺凝胶置于负极，PVDF膜置于正极，制成三明治转膜夹。转膜条件为4℃，100V，90min。
(4)封闭：转膜完毕后，取出PVDF膜，置于5％的脱脂牛奶，室温孵育1h。
(5)孵育一抗：弃封闭液，用1xTBST漂洗PVDF膜两次；根据抗体说明书配制相应浓度的一抗稀释液，加入到膜上，4℃摇床过夜。
(6)；孵育二抗：TBST漂洗PVDF膜10min×3次，加入相同属性的二抗稀释液，室温孵育1.5h。
(7)漂洗二抗：TBST漂洗10min×3次
(8)ECL发光液显影：根据试剂说明书将放光液A液和B液1:1混合，避光使用。将PVDF膜放入ECL化学发光液中反应30s，然后用天能化学发光成像系统显影。
二、组织免疫化学染色
小鼠出生8周后，处死小鼠，解剖脑组织，4％多聚甲醛固定后，脱水，石蜡包埋，制作石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡，酒精梯度水化后，采用EDTA抗原修复液高压修复3min，自然冷却后，PBS洗涤3次，每次5min。3％双氧水处理10min，PBS洗涤3次，每次5min。加入METTL1抗体4℃孵育过夜。第二天切片复温后，PBS洗涤3次，每次5min。加入HRP标记兔鼠二抗混合液，室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min。DAB显色10s，自来水终止显色。苏木素染色10s，蒸馏水洗涤后，盐酸酒精分化30s，流水冲洗30min。按常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，拍照。
三、Northern-Western Blot检测WDR4突变小鼠组织tRNA m7G修饰水平的变化(1)采用trizol提取小鼠脑组织和肾组织的总RNA。
(2)配制15％的尿素-PAGE胶。
称取尿素10.5g，加入30％丙烯酰胺12.5ml，10×TBE 2.5ml，用DEPC水定容至25ml，在摇床上溶解约10min，直至尿素全部溶解。随后放在冰上备用(降温，防止加入促凝剂后凝胶太快；冰上放置不超过30min，放置尿素晶体析出)。
(3)将玻璃板按Western Blot配胶一样安装好。在步骤(2)配好的溶液中加入125μL 10％APS和25μL TEMED，迅速充分混匀，转移至玻璃板中。1.5mm厚玻璃板一块大约需要10ml溶液。立即插上梳子，避免产生气泡；室温静置1h至凝胶。
(4)配制上样体系
每个孔RNA上样量为2ug，上样体积为20μL。样品体系配制如下，可按比例扩增：500ng/μL RNA原液4μL RNA原液+6μL DEPC水+10μL RNA loading buffer，得到20μL上样RNA体系。混匀后，95℃5min变性，迅速放置冰上冷却，离心，放至冰上等待加样。
(5)电泳
用DEPC水稀释10xTBE溶液，配成1XTBE电泳液。安装电泳装置，导入1xTBE电泳液，用枪头冲洗每个上样孔。上样，100V恒压电泳2h，此时溴酚蓝指示带跑至距离胶板底部1cm。
(6)转膜
用DEPC水稀释10xTBE溶液，配成0.5XTBE电泳液。剪裁合适大小的尼龙膜，三明治夹组装和Western Blot一样。转膜槽中倒入0.5XTBE转膜液，冰浴转膜，30V恒压转膜，2h。
(7)紫外交联
打开三明治夹，注意使膜的RNA与胶相贴的一面朝上，放至滤纸上，然后放入紫外交联仪，设置交联参数Energy2400，开始交联。目的是使RNA与膜结合得更紧密。
(8)封闭
交联完后迅速将尼龙膜放入牛奶封闭液(2.5g脱脂奶粉in50ml TBST)室温封闭1h。
(9)一抗孵育
弃封闭液，用1xTBST漂洗PVDF膜两次，加入m7G抗体稀释液(1:5000in 5％BSA，5％BSA：2.5g BSA in 50ml TBST)，4℃摇床过夜。
(10)二抗孵育
尼龙膜用TBST清洗，10min×3次加入anti-mouse HRP标记二抗(1：5000)，室温孵育1.5h；
(11)漂洗二抗：TBST漂洗10min×3次；
(12)ECL发光液显影：根据试剂说明书将放光液A液和B液1:1混合，避光使用。将PVDF膜放入ECL化学发光液中反应30s，然后用化学发光成像系统显影。四、采用Northernblot检测WDR4突变小鼠组织tRNA表达水平的变化
(1)总RNA提取，尿素-PAGE胶的配制，上样体系的配制，电泳与转膜条件与Northern-Western Blot一样。
(2)紫外交联
转膜结束后，取出尼龙膜，稍微晾干，放入紫外交联仪中，正反两面各交联3min。
(3)杂交
交联结束后，将尼龙膜放置50ml离心管底部，加入10mL的杂交缓冲液，杂交炉中37℃预杂交至少30min。取10μL 1uM探针至PCR仪中，95℃变性1min，立即冰上冷却；将变性的探针转移至预杂交完毕后的杂交缓冲液中，在37℃杂交炉中杂交过夜；
(4)清洗
弃杂交液，加入10ml Low Stringent Buffer，37℃杂交炉中清洗2次，每次15min；弃Low Stringent Buffer，加入10ml High Stringent Buffer，37℃杂交炉中清洗2次，每次5min；弃High Stringent Buffer，加入10mL Washing Buffer，37℃杂交炉中清洗1次，10min；
(5)封闭
弃Washing Buffer，加入10mL Blocking Buffer，室温封闭3h；
(6)抗体孵育
弃封闭液，加入10mL DIG-AP抗体稀释液，室温孵育1.5h。DIG-AP抗体按1:15000比例稀释使用。
(7)洗膜
回收DIG-AP抗体稀释液。尼龙膜用DIG Washing Buffer清洗4次，每次15min。弃DIG Washing Buffer，加入Development Buffer清洗5min。
(8)发光检测
准备曝光底物：CSPD按照1:100的比例加至Development Buffer，37℃加热5min。将曝光底物加至尼龙膜上，37℃避光反应5～15min，用化学发光成像系统显影。五、TRAC-seq检测小鼠脑组织m7G修饰tRNA种类及其表达量的变化(1)纯化wt-AlkB和AlkB-D135S酶
①将pET30a-AlkB质粒和pET30a-AlkB-D135S质粒分别转化到BL21(DE3)感受态细菌中，然后将其接种到含100ug/ml卡那霉素的固体LB培养基上，37℃过夜培养过夜。次日挑取单克隆菌落接种到2mL含有卡那霉素的液体培养基中，37℃，180rpm摇床过夜；
②将培养过夜的2mL菌液加入500mL菌液中扩大培养，37℃，180rpm摇床培养约3h，当菌液稍见浑浊，测量菌液OD600值，一般为OD600＝0.4～0.6的时候，向菌液中加入IPTG，使其终浓度为200uM，20℃，180rpm摇床过夜培养。
③次日，5000g离心15min，尽量弃去上清后，收集菌体。向细菌沉淀中加入15mL预冷的细菌裂解液，用枪头吹打混匀重悬细菌；
④超声破碎细菌将细菌悬液置于冰上，超声破碎机破碎细菌。超声破碎细菌1min，停1min，共10次。
⑤将细菌裂解溶液分装至EP管中，4℃，25000g，离心1h；离心后将上清转移到新的15ml离心管中备用。
⑥取1ml 50％(vol/vol)Ni-NTA Agarose放入1.5ml EP管中，1000rpm离心3min，弃上清，用裂解液重悬Agarose，洗涤Agarose。1000rpm离心3min，弃上清。重复此步骤3次。最后将清洗干净的Agarose加入步骤e)中的细菌裂解溶液中，4℃摇床孵育3h。
⑦将步骤f)的细菌裂解溶液1000rpm离心5min，弃上清，加入20ml预冷的lowimidazole buffer清洗Agarose，1000rpm离心5min，弃上清。重复此步骤3次。
⑧向Agarose沉淀加入1ml elution buffer，4℃摇床孵育30min，1000rpm离心5min，收集上清液。重复此步骤2次。最后将收集到的上清液汇合为一份纯化蛋白液。
⑨透析
将h)获得的纯化蛋白液放入透析柱中。透析柱放入预冷的BC100 low saltbuffer中，4℃搅拌透析过夜，获得低盐纯化蛋白液。
⑩收集透析后的蛋白液，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白纯度。-80℃保存蛋白液。
(2)提取small RNAs(<200nt)
①采用Trizol提取细胞总RNA，再用mirVanaTM miRNA分离试剂盒提取样品中的small RNAs，步骤如下：
②取40μL总RNA样本(约50～100ug)，加入200μL(5倍体积)Lysis/BindingBuffer，充分混匀，然后加入24μL miRNA Homogenate Additive buffer，混匀后冰浴10min。
③加入88μL无水乙醇，颠倒数次混匀溶液，然后转移溶液到过滤柱中，5000xg离心1min，收集滤液。
④在滤液中加入235μL无水乙醇，颠倒混匀。然后转移到新的过滤柱中，5000xg离心1min，弃滤液。
⑤向过滤柱中加入700μL miRNA Wash Solution1，5000xg离心1min，弃滤液；
⑥向过滤柱中加入500μL Wash Solution 2/3，5000xg离心1min，弃滤液。重复此步骤2次。再次5000xg离心2min，弃滤液。
⑦5000xg离心1min，以充分去除过滤柱中的液体。
⑧将过滤柱转移至新的RNase Free EP管中；向吸附膜中间部位悬空滴加30μL95℃预热的DEPC水溶解RNA，静置5min，10000g离心1min；收集RNA滤液，即为small RNAs。
⑨采用微量紫外分光光度计测量RNA浓度，-80℃保存RNA。
(3)ALKB和AlkB-D135S酶处理small RNAs去甲基化：
①按下表配制small RNAs去甲基化体系，混匀后室温孵育2.5h：
②孵育完毕后加入5μL 0.5M EDTA终止反应；
③用Oligo Clean&ConcentratorTM试剂盒回收RNA：
④向步骤3)b)RNA反应液中加入210μL Oligo Binding Buffer，混匀后，再加入800μL无水乙醇，混匀后转移到吸附柱Zymo-SpinTM Column，10000g离心30s，弃滤液。在吸附柱中加入750μL DNA Wash Buffer，10000g离心30s，弃滤液；10000g继续离心1min，以除尽滤液。将吸附柱放入新的RNase Fress EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入18μL DEPC水，静置5min，10000g离心30s，收集去甲基化RNAs滤液。取9μL去甲基化RNAs滤液用于下一步实验，剩余至少6μL去甲基化RNAs溶液于-80℃保存；
(4)NaBH4/Aniline介导small RNAs在m7G修饰位点发生还原和剪切
①按下表配制还原反应体系，溶液混匀后置于冰上
②向上述反应体系中加入50μL新鲜配制的0.2M NaBH4/0.5M Tris pH8.2溶液，充分混匀，冰上避光孵育30min。
③采用Oligo Clean&ConcentratorTM试剂盒回收RNA，实验步骤同上。最后用30μLDEPC水溶解获得还原RNA；
④按40μL DEPC水：30μL冰乙酸：10μL苯胺配制剪切反应液，充分混匀后，取80μL剪切反应液加入30μL还原RNA溶液中，混匀后，室温避光孵育2h。
⑤采用Oligo Clean&ConcentratorTM试剂盒回收还原剪切RNA，实验步骤同上。最后用8μL DEPC水溶解获得还原剪切RNA。-80℃保存；
(5)small RNAs文库构建与测序：
去甲基化RNA和还原剪切RNA的文库构建采用NEBNext Multiplex Small RNALibrary Prep Set试剂盒进行。实验步骤如下：
①连接3′SR Adaptor
3′SR Adaptor for Illumina用DEPC水1:1稀释，然后向PCR管中加入6μL RNA样品和1μL稀释后的3′SR Adaptor for Illumina，充分混匀，放入PCR仪中，70℃孵育2min，立即转移至冰上。继续加入10μL 3′Ligation Reaction Buffer(2x)和3μL 3′Ligation EnzymeMix，充分混匀，放入PCR仪中，25℃孵育1h；
②杂交逆转录引物
孵育完毕后，在PCR管中继续加入4.5μL DEPC水和1μL SR RT Primer forIllumina，充分混匀后转入PCR仪中，反应程序如下：75℃5min，37℃15min，25℃15min，4℃保存。
③连接5′SR Adaptor
5′SR Adaptor for Illumina用DEPC水1:1稀释；向上一步的反应体系中加入1μL稀释后的5′SR Adaptor for Illumina，1μL 5′Ligation Reaction Buffer(10x)和2.5μL5′Ligation Enzyme Mix，充分混匀后放入PCR仪中，25℃孵育1h。
④逆转录反应
上述反应结束后，向反应体系中加入8μL First Strand Synthesis ReactionBuffer，1μL Murine RNase Inhibitor和1μL ProtoScript IIReverse Transcriptase，充分混匀后转入PCR仪中，50℃孵育60min。
⑤PCR扩增
上述反应结束后，向反应体系中加入50μL LongAmp Taq 2x Master Mix，2.5μLSR Primer for Illumina，2.5μL Index(X)Primer和5μL DEPC水，该试剂盒共含有12种Index Primer，每个样本分别使用一种Index Primer；充分混匀反应体系，放入PCR仪中，按下列程序进行PCR扩增：
⑥用QIAquick PCR Purification Kit试剂盒纯化PCR产物
PCR扩增产物中加入5倍体积的Buffer PB，充分混匀后，将溶液转移到QIAquick吸附柱中，吸附柱放入2mL收集管，13000rpm离心60s，弃滤液。向吸附柱中加入750μL BufferPE，重新放回收集管；13000rpm离心60s，弃滤液，继续13000rpm离心1min，使得滤液完全去除。将吸附柱转移至新的1.5mL EP管中，在吸附膜中间位置加入30μL DEPC水溶解DNA，静置5min后，13000rpm离心60s；微量紫外分光光度计测量DNA浓度，DNA样品用于高通量测序，分析小鼠脑组织m7G修饰tRNA种类及其表达量的变化。
六、小鼠脑部Puromycin Intake实验
(1)小鼠全身麻醉，剪开头部皮肤，暴露头骨。
(2)将小鼠固定在脑立体定位仪上，微量注射器固定在进样臂上，移动X、Y、Z三个方向的定位轴，将微量注射剂针头定位于小鼠前卤，自前卤向后0.3mm，矢状缝右侧1mm，即为侧脑室体表定位。
(3)采用磨骨钻小心磨去侧脑室体表定位点的头骨。
(4)根据小鼠平均脑量，按40nmol嘌呤霉素/g脑重量的比例，用微量进样针吸取一定体积的嘌呤霉素，进样针在侧脑室体表定位点往下0.3mm即为侧脑室，按2μL/5min的速度缓慢注射，注射完毕后留针2min，然后每分钟退针1mm。
(5)退针后，保持动物在一个安静温暖的环境待30min，然后处死动物，解剖脑组织，提取组织蛋白用于SDS-PAGE和Western Blot。
七、RNC seq
(1)小鼠过量麻醉处死后，从小鼠头部剪开皮肤，剥离头骨，将整个脑组织取出，立即放入预冷的保护液(含有0.3mg/ml放线菌酮，50mM MgCl2的PBS溶液)清洗血迹，擦干，称量重量。
(2)将组织转移到EP管中，加入研磨珠，按照50mg组织/1ml Cell Lysis Buffer(1％Triton X-100，20mM HEPES-KOH(pH 7.4)，15mM MgCl2，200mM KCl，100ug/mlCycloheximide and 2mM Dithiothreitol)的比例，加入Cell Lysis Buffer，然后用组织匀浆器60Hz研磨1min，放在冰上裂解10min。16200g 4℃离心10min。(3)配制30％蔗糖溶液，加入超高速离心管中，每管约11.5ml，置于冰上预冷。
(4)离心结束后，用移液枪吸取细胞裂解液上清300μL转移至新的1.5ml EP管中，加入1ml Trizol，混匀，用于提取总RNA，样品标记为input；再吸取1ml细胞裂解液上清转移至超高速离心管的30％蔗糖溶液上方，严格配平后，4℃，32000rpm，超速离心5h。
(5)离心结束后，倒去蔗糖溶液(尽可能倒干净)，此时核糖体-新生肽链复合物沉淀于管底。向超速离心管中加入1mL Trizol，混匀，用于提取RNC RNA，样品标记为RNC；以上RNA样品用于RNA测序。
(6)数据分析
计算各组样品的翻译效率(TE)。TE＝RNC RNA FPKM/input RNA FPKM。翻译效率改变＝处理组TE/对照组TE，比值≤0.667分为TE down基因，比值≥1.5为TE up基因结合TRACSeq结果分析TE up、TE down基因中m7G tRNA识别密码子频率。采用WEBbased GEne SeTAnaLysis Toolkit对TE down基因集进行通路富集等分析。
八、免疫共沉淀实验
以pFLAG-CMV2质粒作为载体，构建了WDR4野生型基因(WDR4-WT)和WDR4突变型基因(WDR4-Mut)的表达载体。转染细胞后，载体所表达的外源WDR4蛋白带有Flag标签。
(1)293T细胞传代至6cm细胞培养皿，每个皿接种细胞数保持一致。待细胞生长密度达到60％-70％作用，采用Lipofectamine 2000转染试剂将WDR4-WT和WDR4-Mut分别转染到293T细胞。
(2)转染48h后，弃去培养基，PBS轻轻洗涤细胞2次，加入1000ul含有蛋白酶抑制剂的RIPA弱蛋白质裂解缓冲液，在冰上裂解30分钟。
(3)收集细胞裂解液，4℃，13000rpm离心15分钟。
(4)离心期间，准备M2 anti-FLAG beads。取两份30ul M2 anti-FLAG beads分别放入两个1.5ml EP管，加入1ml蛋白裂解缓冲液，上下颠倒几次，1000rpm离心2分钟，弃去蛋白裂解缓冲液。重复此步骤3次。
(5)将离心后的上清液采用微量紫外分光光度计测量蛋白浓度，用蛋白裂解缓冲液将两份细胞裂解液蛋白浓度调整至一致。保留100ul细胞裂解液作为input，取800ul细胞裂解液分别转移到步骤(4)准备的M2 anti-FLAG beads EP管中，上下颠倒几次，使M2anti-FLAG beads重悬在细胞裂解液中，然后将EP管在4℃缓慢翻转过夜。
(6)将含有M2 anti-FLAG beads的细胞裂解液1000rpm离心2分钟，弃去上清。加入1ml蛋白裂解缓冲液洗涤M2 anti-FLAG beads，上下颠倒数次，1000rpm离心2分钟，弃去上清。重复此步骤3次。
(7)将50ul 1.25×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入M2 anti-FLAG beads中，在95度下孵育5分钟，冰上冷却，然后1000rpm离心2分钟，将上清转移到新的EP管中，标记为IP样品。
(8)Western Blot检测WDR4(anti-Flag)和METTL1的含量。
九、实验结果
WDR4突变小鼠脑、肾组织中tRNA m7G修饰甲基转移酶METTL1的蛋白水平异常降低。IHC结果同样证实了METTL1蛋白水平在WDR4突变小鼠脑组织各个部位均明显降低。免疫共沉淀实验结果显示，本发明所述的WDR4基因NM_033661.4c.509G>T突变，干扰了WDR4蛋白和METTL1蛋白的相互作用，导致METTL1蛋白稳定性降低。WDR4突变Homo小鼠脑和肾组织中tRNA m7G修饰水平显著降低，且已知携带m7G修饰的tRNA ValAAC、ProAGG、LysCTT的表达水平明显下降。TRAC seq实验显示，Homo组小鼠脑组织中m7G修饰tRNA的表达量明显低于WT组。Homo组小鼠脑组织及胚胎神经干细胞(NSC)Puromycin摄入量明显低于WT组，表明Homo组小鼠组织细胞整体蛋白翻译速率降低。利用RNC seq鉴定出来一批翻译效率(TE)发生改变的基因，比较分析基因携带的m7G tRNA识别的密码子频率发现，相比于翻译效率不变(others)或者TE up基因，TE down的基因往往携带更高频率的m7G tRNA识别的密码子。对TE down基因进行富集分析发现，这些基因参与基因沉默、神经肽信号、免疫应答等生物学过程，并富集在性激素合成、5-羟色胺降解、5-羟色胺2型受体介导的信号通路、神经突触小泡运输等信号通路。结果表明，WDR4突变通过干扰WDR4蛋白和METTL1蛋白的相互作用，降低METTL1稳定性和tRNA m7G修饰，引起细胞蛋白翻译异常，导致小鼠机体发育和神经系统、生殖系统等功能异常。
实施案例5：恢复WDR4、METTL1、tRNA m7G修饰改善小鼠脑神经系统发育和功能
一、恢复野生型WDR4基因表达利用AAV-PHeB嗜神经病毒构建野生型WDR4表达载体(OE)，对照载体为Vec。实验分组为WT、Homo、Homo+Vec、Homo+OE组，每组6只小鼠。通过尾静脉注射，给出生后21天的Homo+Vec、Homo+OE组小鼠注射相应的病毒，每只小鼠注射病毒量为2.5×1011v.g.。
二、行为学实验
采用平衡木实验和转棒实验检测小鼠运动平衡能力，方法同实施案例1。
三、HE染色
AAV病毒注射8周后，处死小鼠，解剖脑组织，4％多聚甲醛固定后，脱水，石蜡包埋，制作石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡，酒精梯度水化后，采用伊红染色液染色15s，蒸馏水洗涤后，苏木素染色10s，盐酸酒精分化30s，蒸馏水洗涤3次，95％乙醇快速脱水5s。无水乙醇脱水3次，每次5s。二甲苯透明，中性树胶封固，拍照。
四、组织免疫化学染色
AAV病毒注射8周后，处死小鼠，解剖脑组织，4％多聚甲醛固定后，脱水，石蜡包埋，制作石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡，酒精梯度水化后，采用EDTA抗原修复液高压修复3min，自然冷却后，PBS洗涤3次，每次5min。3％双氧水处理10min，PBS洗涤3次，每次5min。加入METTL1抗体4℃孵育过夜。第二天切片复温后，PBS洗涤3次，每次5min。加入HRP标记兔鼠二抗混合液，室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min。DAB显色10s，自来水终止显色。苏木素染色10s，蒸馏水洗涤后，盐酸酒精分化30s，流水冲洗30min。按常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，拍照。
五、Western Blot
详细方法参见实施案例4。
六、Northern-Western Blot和Northern blot
详细方法参见实施案例4。
七、实验结果
AAV-PHeB病毒携带GFP基因，AAV-PHeB病毒成功感染脑组织细胞并表达携带的基因。恢复野生型WDR4基因表达后，WDR4-OE组Homo小鼠脑重量显著回升，通过平衡木所需时长显著缩短，停留在转棒仪上的时间显著延长，表明小鼠运动平衡能力显著得到显著改善。脑组织石蜡切片HE染色显示，WDR4-OE组Homo小鼠脑结构大小得到明显恢复，脑组织中METTL1的表达水平、tRNA m7G修饰水平和表达水平显著恢复。
所述基于tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统可以运行于桌上型计算机、笔记本、掌上电脑及云端服务器等计算设备中。所述tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统，可运行的系统可包括，但不仅限于，处理器、存储器。本领域技术人员可以理解，所述例子仅仅是tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统的示例，并不构成对tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统的限定，可以包括比例子更多或更少的部件，或者组合某些部件，或者不同的部件，例如所述tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统还可以包括输入输出设备、网络接入设备、总线等。
所称处理器可以是中央处理单元(Central Processing Unit，CPU)，还可以是其他通用处理器、数字信号处理器(Digital Signal Processor，DSP)、专用集成电路(Application Specific Integrated Circuit，ASIC)、现场可编程门阵列(Field-Programmable Gate Array，FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件等。通用处理器可以是微处理器或者该处理器也可以是任何常规的处理器等，所述处理器是所述tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统运行系统的控制中心，利用各种接口和线路连接整个tRNAm7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统可运行系统的各个部分。
所述存储器可用于存储所述计算机程序和/或模块，所述处理器通过运行或执行存储在所述存储器内的计算机程序和/或模块，以及调用存储在存储器内的数据，实现所述tRNA m7G修饰相关基因WDR4、METTL1基因、转录本和/或蛋白产物、m7G修饰tRNA表达水平的验证系统的各种功能。所述存储器可主要包括存储程序区和存储数据区，其中，存储程序区可存储操作系统、至少一个功能所需的应用程序(比如声音播放功能、图像播放功能等)等；存储数据区可存储根据手机的使用所创建的数据(比如音频数据、电话本等)。此外，存储器可以包括高速随机存取存储器，还可以包括非易失性存储器，例如硬盘、内存、插接式硬盘，智能存储卡(Smart Media Card，SMC)，安全数字(Secure Digital，SD)卡，闪存卡(FlashCard)、至少一个磁盘存储器件、闪存器件、或其他易失性固态存储器件。
尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 中山大学附属第一医院
<120> tRNA m7 G修饰、WDR4、METTL1在机体发育的功能和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1239
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggcgggct ctgtgggact ggcgttgtgc gggcagacgt tggtggtgcg gggcggcagc 60
cgattcctgg ccacctccat agcaagcagt gatgatgaca gcctcttcat ctatgactgc 120
agtgctgcag aaaagaagtc acaagaaaat aaaggggagg acgcgccctt ggaccagggg 180
agcggtgcga ttctggcgtc caccttctcc aagtctggca gctattttgc tttaaccgat 240
gacagtaagc gtctgattct tttccgtaca aaaccatggc aatgtctgag tgtcaggacc 300
gtggcaagga ggtgtacagc cctgactttc atagcctcgg aggagaaggt cttggtggcc 360
gacaagtctg gagacgtcta ctccttttcg gtgctggagc cacacgggtg tggccgtcta 420
gagctggggc acctgtctat gctgttagat gtggctgtga gtcctgatga ccgcttcatc 480
ctcactgccg accgggacga gaagatccta gtcagctggg ccgcggcgcc ccatagcatc 540
gagtccttct gcttggggca cacagagttt gtgagccgta tctccgtggt gccaactcag 600
cccgggctgc ttctgtcctc ctctggggac ggcaccctga ggctctggga gtacaggagc 660
ggccgccagc tgcactgctg tcacctggcc agtctgcagg agctggtgga cccccaggcc 720
ccccagaagt ttgccgcgtc caggattgca ttctggtgcc aggagaactg cgtggcgctc 780
ctgtgcgacg gcactcctgt ggtctacatc ttccagctgg acgcccgcag acagcagttg 840
gtgtacaggc agcagctggc gttccagcac caagtgtggg acgtggcttt cgaggagacc 900
caggggctgt gggtgctcca ggactgccag gaagcccccc tggtgctcta caggcctgtg 960
ggcgaccagt ggcagtctgt tcctgagagc accgtgttaa agaaagtctc tggtgttctt 1020
cgtgggaact gggccatgct ggaaggctct gccggcgcag acgccagctt cagcagtctc 1080
tacaaggcca cgttcgacaa cgtgacctcc tacctgaaga agaaagagga gagactgcag 1140
cagcagctag agaagaagca gcggcgccgg agtcccccgc ctgggcccga cgggcatgcc 1200
aagaagatga gaccggggga ggcgacgcta agttgctga 1239
<210> 2
<211> 1371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgagactac gccctgcgcg catgctcctg gacggcacgc cgttcgcgcg gcgccgagtg 60
acatcactga caagcgccaa caggaagggc gcagcgcgtc gcacgtgtcc ggaggcggcg 120
ggcgggccca tggcgagctc tgcggggctg gcactgtgcg cccagacgct ggtggtgcga 180
ggaggcagcc ggttcctagc cttctccact acgggcagtg atgatgactg tgtcttcaca 240
tacgactgca gtactgcaga gaagaaggcc acgccagaag ataaagggga ggacggacag 300
cccgcagaca cagggagtga ctcgattctg gcgtccacct tctccaagtc tggccgctat 360
tttgctttaa cagatgacag taagcgtctg attcttttcc gtacaaaacc atggcaatgt 420
ctgagtgtca ggatggtggt gcggaggtgc accgccctga ccttcacagc ctcagaggac 480
cgagtcttgg tggctgacaa gtctggagac gtctactcct tttcggtgct ggagccagat 540
ggatgtggca ggctggagct tgggcacctc tccatgctgc tagacgtggc tgtgagtcct 600
gatgaccagt ttgtgcttac tgcagaccgg gatgagaaga tcctggtcag ctgggctgct 660
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<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccatggcaat gtctgagtgt cag 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agaatgcaat cctggacgcg g 21

Claims (3)

1.一种载体，其特征在于，所述载体包含突变的WDR4基因，所述突变的WDR4基因与野生型WDR4基因的差异在于1个碱基突变，所述突变的WDR4基因导致机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种的发生；所述突变为WDR4基因转录本NM_021322.2 c.644G突变为T，所述突变WDR4基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求1中所述载体中的突变的WDR4基因或如权利要求1所述的载体。
3.如权利要求1中所述载体中的突变的WDR4基因或如权利要求1所述的载体或如权利要求2所述的宿主细胞在产生机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种的疾病动物模型中的应用，或在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于产生机体发育异常、脑萎缩、运动共济失调、智力障碍或记忆力下降中任意一种疾病动物模型。
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Mutation in WDR4 impairs tRNA m7G46 methylation and causes a distinct form of microcephalic primordial dwarfism;Ranad Shaheen等;《Genome Biology》;第16卷(第210期);摘要，第4页左栏第1段，右栏第2段，第8页左栏第3段 *

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