TW202413420A - 抗人類vista抗體及其用途 - Google Patents

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TW202413420A
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麥可 莫利
傑 羅斯泰恩
多弗 皮齊尼克
琳達 席德
葛登 鮑爾斯
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麥可 莫利
傑 羅斯泰恩
多弗 皮齊尼克
琳達 席德
葛登 鮑爾斯
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Abstract

本發明提供拮抗性及促效性抗人類VISTA抗體及抗體片段。該等拮抗劑抗體及抗體片段可用於抑制或阻斷VISTA對T細胞免疫之抑止作用且由此促進T細胞免疫。該等促效劑抗體及抗體片段可用於加強或增強或模擬VISTA對T細胞免疫之抑止作用且由此抑止T細胞免疫。該等拮抗劑抗體及抗體片段尤其適用於治療癌症及感染性病況。該等促效劑抗體及抗體片段尤其適用於治療自體免疫、過敏、發炎性病況、GVHD、敗血症及移植受者。本發明亦提供用於識別該等促效劑之篩檢分析。

Description

抗人類VISTA抗體及其用途
本申請主張2016年4月15日申請之美國臨時申請案第62/323,193號、2016年5月31日申請之美國臨時申請案第62/343,355號、2016年8月9日申請之美國臨時申請案第62/372,362號、2016年9月9日申請之美國臨時申請案第62/385,627號、2016年11月22日申請之美國臨時申請案第62/425,184號、2016年7月19日申請之美國臨時申請案第62/363,929號、2016年7月21日申請之美國臨時申請案第62/365,085號、2016年9月9日申請之美國臨時申請案第62/385,805號、2016年7月19日申請之美國臨時申請案第62/363,931號、2016年7月21日申請之美國臨時申請案第62/365,102號、2016年9月9日申請之美國臨時申請案第62/385,871號、2016年7月19日申請之美國臨時申請案第62/363,917號、2016年7月21日申請之美國臨時申請案第62/365,081號、2016年9月9日申請之美國臨時申請案第62/385,888號、2016年7月19日申請之美國臨時申請案第62/364,073號、2016年7月21日申請之美國臨時申請案第62/365,166號、2016年9月9日申請之美國臨時申請案第62/385,893號、2016年7月19日申請之美國臨時申請案第62/363,925號、2016年7月21日申請之美國臨時申請案第62/365,087號、2016年9月9日申請之美國臨時申請案第62/385,785號、2016年10月11日申請之美國臨時申請案第62/406,632號之優先權，其各自及全部均以引用之方式併入本文中。本申請案係關於2017年4月14申請之PCT申請案PCT/US2017/027800，「ANTI-HUMAN VISTA ANTIBODIES AND USE THEREOF」(代理人案號43260.2214)，其以引用之方式併入且亦主張其優先權。
本發明係關於識別新穎抗人類VISTA抗體及抗體片段，亦即抗人類VISTA (T細胞活化之含V區免疫球蛋白抑制因子(1))、(「VISTA」)抗體及抗體片段。更特定言之，本申請提供新穎人類VISTA促效劑，亦即刺激或促進人類VISTA對免疫性，尤其對T細胞免疫之抑止作用的抗人類VISTA抗體及抗體片段。又，本發明係關於該等促效劑增強或模擬VISTA對免疫性之抑止作用，諸如其對CD4 +或CD8 +T細胞增殖、CD4 +或CD8 +T細胞活化之抑止作用及其對產生免疫細胞激素(尤其促炎性細胞激素)之抑止作用的用途。本發明亦係關於該等促效性抗體及抗體片段作為預防劑或治療劑之特定用途，尤其在治療其中預防或抑制T細胞免疫及表現促炎性細胞激素具有治療益處之病況(諸如自體免疫、炎症、過敏性病症、敗血症、GVHD)中或在緩解某些病況(諸如癌症)之發炎性副作用中。
本申請亦提供新穎拮抗劑，亦即拮抗或抑制人類VISTA對免疫性之抑止作用，尤其VISTA對T細胞免疫之作用的抗人類VISTA抗體及抗體片段。又，本發明係關於該等新穎拮抗劑阻斷或抑制VISA對免疫性之抑止作用，亦即其對CD4 +或CD8 +T細胞增殖、CD4 +或CD8 +T細胞活化及產生免疫細胞激素之抑止作用的用途。又，本發明亦係關於該等拮抗性抗體及抗體片段作為預防劑或治療劑之特定用途，尤其在治療其中促進T細胞免疫具有治療益處之病況中，諸如在治療癌症及感染性疾病中。
已證明免疫負性檢查點調節子(NCR)路徑在治療人類免疫相關疾病中係特殊臨床標靶。使用單株抗體(mAb)阻斷兩種NCR (CTLA-4及PD-1)以增強腫瘤免疫性正使對癌症之治療發生變革，且已確定該等路徑作為人類疾病中之臨床有效標靶。觸發NCR路徑之可溶形式之NCR配位體亦已作為免疫抑止藥物進入臨床用以治療自體免疫(亦即，用於類風濕性關節炎之AMP-110/B7-H4-Ig)。
VISTA (參見參考文獻1)係一種NCR配位體，其最接近之譜系關係為PD-L1。VISTA與PD-L1具有同源性，但展示侷限於造血室之獨特表現圖案。特定言之，VISTA在CD11b 高骨髓細胞上組成性且高度地表現，而在CD4 +及CD8 +T細胞上以較低之水準表現。如同PD-L1，VISTA係一種極度抑止免疫性之配位體(參考文獻1)，且如同PD-L1，阻斷VISTA使得治療免疫性在臨床前腫瘤模型中發展成癌症(參見參考文獻2)。然而，阻斷VISTA增強免疫性，尤其CD8 +及CD4 +介導之T細胞免疫，用VISTA之細胞外域之可溶性Ig融合蛋白(VISTA-Ig)治療抑止免疫性且已證實阻止多種鼠科模型之自體免疫性疾病之發展。
明確之科學證據已證實，VISTA係一種誘發極度T細胞抑止作用之配位體。不同團體(包括Dartmouth College及Jannsen)已報導多種拮抗性抗人類VISTA抗體。該等抗體適用於治療病況，其中需要抑止VISTA對T細胞免疫之免疫抑止作用，諸如癌症及感染。然而，就發明人之知識而言，先前尚無確認刺激人類VISTA之作用的抗人類VISTA抗體或抗體片段。該等促效性抗人類VISTA抗體及抗體片段將有利於治療其中需要抑止免疫性，尤其T細胞免疫之病況及/或其中VISTA表現異常下調之病況。
本發明之一目標在於提供特異性地結合至人類VISTA及其變異體之新穎抗體及抗體片段，例如特異性地結合至人類VISTA且促進或模擬人類VISTA對免疫性之作用的嵌合、人類、人源化或多特異性抗人類VISTA抗體。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段結合至與圖4中所示之具有CDR與可變重鏈及輕鏈多肽之抗人類VISTA抗體中之任一者相同或重疊之抗原決定基。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至T細胞活化之人類V結構域Ig抑制因子(人類VISTA)之抗原結合區之經分離之抗體或其抗體片段，其中該抗體或抗體片段刺激或促進VISTA對免疫性之一或多種作用，例如包含人類IgG2恆定區或人類IgG2 Fc區，視情況其中人類IgG2恆定區或Fc區結合至包括人類CD32A之Fcγ受體及/或含有包含結合至Fcγ受體之天然人類IgG2之人類IgG2恆定區或Fc區及/或結合至包括hFcγRI(CD64)、FcγRIIA或hFcγRIIB、(CD32或CD32A)及FcγRIIIA (CD16A)或FcγRIIIB (CD16B)中一或多者之FcγR的IgG2。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段結合至包括由具有圖4之序列之任何抗人類VISTA抗體所結合之抗原決定基或與該抗原決定基重疊之VISTA抗原決定基。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段結合包含LLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH殘基之抗原決定基之一或多個殘基或與該等殘基相互作用。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段結合包含79EVQTCSERRPIR90、48NVTLTCRLLGPV60、153HHHSEHRVHGAM164、52LTCRLLGPV60、56LLGPVDKGHDVTFYK70、113LAQRHGLESASDHHG127、93TFQDLHLHHGGHQAA107、146CLVVEIRHHHSEH158、53TCRLLGPVDKG63及/或123SDHHG127中一或多個殘基之抗原決定基之一或多個殘基或與該等殘基相互作用。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段結合包含79EVQTCSERRPIR90之一或多個殘基之抗原決定基的一或多個殘基或與該等殘基相互作用。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段促進或增強人類VISTA對免疫性之至少一種作用，例如其對T細胞免疫、活化單核細胞、誘導T細胞增殖中任一或多者之抑止作用；誘導或抑止細胞激素表現、增加單核細胞之存活、誘導在表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及誘導在表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區，其中該抗體或抗體片段包含與具有圖4中所示之CDR與可變重鏈及輕鏈多肽之抗人類VISTA抗體中之任一者具有相同CDR多肽的可變重鏈及輕鏈序列，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或片段之抗體，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段包含與選自VSTB49-VSTB116中任一者之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽具有至少90%序列一致性之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區，其中該促效性抗體或抗體片段包含與選自VSTB49-VSTB116中任一者之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽具有至少95%序列一致性之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段包含與選自VSTB49-VSTB116中任一者之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽具有至少96-99%序列一致性之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中該促效性抗體或抗體片段包含與選自VSTB49-VSTB116之一之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽相同之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區的拮抗性抗體或其抗體片段，其拮抗或阻斷人類VISTA對免疫性之至少一種作用。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其刺激或促進人類VISTA對免疫性之至少一種作用。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其包含人類恆定域。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其包含選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之人類恆定域，其視情況例如藉由刪除、取代或添加突變或前述任意組合進行修飾。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其中抗體片段包含Fab、F(ab')2或scFv抗體片段或為Fab、F(ab')2或scFv抗體片段。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之拮抗性抗體或其抗體片段，其阻斷或抑止人類VISTA對免疫性之至少一種作用，例如選自其對T細胞免疫、活化單核細胞或T細胞增殖之抑止作用；誘發或抑止細胞激素表現、增加單核細胞之存活率、抑止表現VISTA之細胞之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及抑止表現VISTA之細胞之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其促進或增強人類VISTA對免疫性之至少一種作用，例如選自其對T細胞免疫、活化單核細胞、抑止T細胞增殖之抑止作用；誘發或抑止細胞激素表現、增加單核細胞之存活率、抑止表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及抑止表現VISTA之細胞之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其包含人類IgG2恆定區或Fc區。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其促進或增強人類VISTA對免疫性之抑止作用，例如其對T細胞免疫、單核細胞活化、T細胞增殖中任一或多者之作用；細胞激素表現、單核細胞存活、表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其抑制T細胞免疫及/或促炎性細胞激素表現。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其為包含人類Fc區(例如人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4或前述任意者之嵌合體)的人類、人源化或嵌合抗體。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其為嵌合、人類或人源化的。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其包含潛在地可能經突變之人類IgG2恆定域或Fc區。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其包含人類IgG2恆定域或其片段或hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中該抗體之整個或實質上整個鉸鏈及CH1結構域以及視情況整個或實質上整個輕鏈恆定區已由相應整個或實質上整個輕鏈以及hIgG2之鉸鏈及CH1結構域(「H2區」或「H2結構域」)置換。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其(i)包含IgG2 Fc區，其中位於127位之重鏈半胱胺酸殘基及位於214位之輕鏈半胱胺酸殘基(其中編號係根據Kabat)各自或兩者均經刪除或改變為不同之胺基酸殘基，導致所得經修飾抗體之促效特性相對於其中該等殘基無變化之抗體而言增加；(ii)位於該抗體之H2區中之214位之半胱胺酸殘基經突變或經另一胺基酸取代及/或位於重鏈之127位、232位或233位之一或多個半胱胺酸殘基經刪除或經另一胺基酸取代；(iii)其包含人類IgG2恆定域，其中至少一個半胱胺酸殘基經刪除或改變為另一胺基酸；(iv)其與人類VISTA上與VSTB95相同之抗原決定基競爭或與其結合(圖4中所示之可變重鏈及輕鏈序列)。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其： (i) 包含SEQ ID NO:100、101及102之V HCDR及SEQ ID NO:103、104及105之V LCDR； (ii) 包含SEQ ID NO:110、111及112之V HCDR及SEQ ID NO:113、114及115之V LCDR； (iii) 包含SEQ ID NO:120、121及122之V HCDR及SEQ ID NO:123、124及125之V LCDR； (iv) 包含SEQ ID NO:130、131及132之V HCDR及SEQ ID NO:133、134及135之V LCDR； (v) 包含SEQ ID NO:140、141及142之V HCDR及SEQ ID NO:143、144及145之V LCDR； (vi) 包含SEQ ID NO:150、151及152之V HCDR及SEQ ID NO:153、154及155之V LCDR； (vii) 包含SEQ ID NO:160、161及162之V HCDR及SEQ ID NO:163、164及165之V LCDR； (viii) 包含SEQ ID NO:170、171及172之V HCDR及SEQ ID NO:173、174及175之V LCDR； (ix) 包含SEQ ID NO:180、181及182之V HCDR及SEQ ID NO:183、184及185之V LCDR； (x) 包含SEQ ID NO:190、191及192之V HCDR及SEQ ID NO:193、194及195之V LCDR； (xi) 包含SEQ ID NO:200、201及202之V HCDR及SEQ ID NO:203、204及205之V LCDR； (xii) 包含SEQ ID NO:210、211及212之V HCDR及SEQ ID NO:213、214及215之V LCDR； (xiii) 包含SEQ ID NO:220、221及222之V HCDR及SEQ ID NO:223、224及225之V LCDR； (xiv) 包含SEQ ID NO:230、231及232之V HCDR及SEQ ID NO:233、234及235之V LCDR； (xv) 包含SEQ ID NO:240、241及242之V HCDR及SEQ ID NO:243、244及245之V LCDR； (xvi) 包含SEQ ID NO:250、251及252之V HCDR及SEQ ID NO:253、254及255之V LCDR； (xvii) 包含SEQ ID NO:260、261及262之V HCDR及SEQ ID NO:263、264及265之V LCDR； (xviii) 包含SEQ ID NO:270、271及272之V HCDR及SEQ ID NO:273、274及275之V LCDR； (xix) 包含SEQ ID NO:280、281及282之V HCDR及SEQ ID NO:283、284及285之V LCDR； (xx) 包含SEQ ID NO:290、291及292之V HCDR及SEQ ID NO:293、294及295之V LCDR； (xxi) 包含SEQ ID NO:300、301及302之V HCDR及SEQ ID NO:303、304及305之V LCDR； (xxii)包含SEQ ID NO:310、311及312之V HCDR及SEQ ID NO:313、314及315之V LCDR； (xxiii) 包含SEQ ID NO:320、321及322之V HCDR及SEQ ID NO:323、324及325之V LCDR； (xxiv) 包含SEQ ID NO:330、331及332之V HCDR及SEQ ID NO:333、334及335之V LCDR； (xxv) 包含SEQ ID NO:340、341及342之V HCDR及SEQ ID NO:343、344及345之V LCDR； (xxvi) 包含SEQ ID NO:350、351及352之V HCDR及SEQ ID NO:353、354及355之V LCDR； (xxvii) 包含SEQ ID NO:360、361及362之V HCDR及SEQ ID NO:363、364及365之V LCDR； (xxviii) 包含SEQ ID NO:370、371及372之V HCDR及SEQ ID NO:373、374及375之V LCDR； (xxix) 包含SEQ ID NO:380、381及382之V HCDR及SEQ ID NO:383、384及385之V LCDR； (xxx) 包含SEQ ID NO:390、391及392之V HCDR及SEQ ID NO:393、394及395之V LCDR； (xxxi) 包含SEQ ID NO:400、401及402之V HCDR及SEQ ID NO:403、404及405之V LCDR； (xxxii) 包含SEQ ID NO:410、411及412之V HCDR及SEQ ID NO:413、414及415之V LCDR； (xxxiii) 包含SEQ ID NO:420、421及422之V HCDR及SEQ ID NO:423、424及425之V LCDR； (xxxiv) 包含SEQ ID NO:430、431及432之V HCDR及SEQ ID NO:433、434及435之V LCDR； (xxxv) 包含SEQ ID NO:440、441及442之V HCDR及SEQ ID NO:443、444及445之V LCDR； (xxxvi) 包含SEQ ID NO:450、451及452之V HCDR及SEQ ID NO:453、454及455之V LCDR； (xxxvii) 包含SEQ ID NO:460、461及462之V HCDR及SEQ ID NO:463、464及465之V LCDR； (xxxviii) 包含SEQ ID NO:470、471及472之V HCDR及SEQ ID NO:473、474及475之V LCDR； (xxxix) 包含SEQ ID NO:480、481及482之V HCDR及SEQ ID NO:483、484及485之V LCDR； (xl) 包含SEQ ID NO:490、491及492之V HCDR及SEQ ID NO:493、494及495之VL CDR多肽； (xli) 包含SEQ ID NO:500、501及502之V HCDR及SEQ ID NO:503、504及505之VL CDR多肽； (xlii) 包含SEQ ID NO:510、511及512之V HCDR及SEQ ID NO:513、514及515之VL CDR多肽； (xliii) 包含SEQ ID NO:520、521及522之V HCDR及SEQ ID NO:523、524及525之VL CDR多肽； (xliv) 包含SEQ ID NO:530、531及532之V HCDR及SEQ ID NO:533、534及535之VL CDR多肽； (xlv) 包含SEQ ID NO:540、541及542之V HCDR及SEQ ID NO:543、544及545之VL CDR多肽； (xlvi) 包含SEQ ID NO:550、551及552之V HCDR及SEQ ID NO:553、554及555之VL CDR多肽； (xlvii) 包含SEQ ID NO:560、561及562之V HCDR及SEQ ID NO:563、564及565之V LCDR； (xlviii) 包含SEQ ID NO:570、571及572之V HCDR及SEQ ID NO:573、574及575之V LCDR； (xlix) 包含SEQ ID NO:580、581及582之V HCDR及SEQ ID NO:583、584及585之V LCDR； (l) 包含SEQ ID NO:590、591及592之V HCDR及SEQ ID NO:593、594及595之V LCDR； (li) 包含SEQ ID NO:600、601及602之V HCDR及SEQ ID NO:603、604及605之V LCDR； (lii) 包含SEQ ID NO:610、611及612之V HCDR及SEQ ID NO:613、614及615之V LCDR； (liii) 包含SEQ ID NO:620、621及622之V HCDR及SEQ ID NO:623、624及625之V LCDR； (liv) 包含SEQ ID NO:630、631及632之V HCDR及SEQ ID NO:633、634及635之V LCDR； (lv) 包含SEQ ID NO:640、641及642之V HCDR及SEQ ID NO:643、644及645之V LCDR； (lvi) 包含SEQ ID NO:650、651及652之V HCDR及SEQ ID NO:653、654及655之V LCDR； (lvii) 包含SEQ ID NO:660、661及662之V HCDR及SEQ ID NO:663、664及665之V LCDR； (lviii) 包含SEQ ID NO:670、671及672之V HCDR及SEQ ID NO:673、674及675之V LCDR； (lix) 包含SEQ ID NO:680、681及682之V HCDR及SEQ ID NO:683、684及685之V LCDR； (lx) 包含SEQ ID NO:690、691及692之V HCDR及SEQ ID NO:693、694及695之V LCDR； (lxi) 包含SEQ ID NO:700、701及702之V HCDR及SEQ ID NO:703、704及705之V LCDR； (lxii) 包含SEQ ID NO:710、711及712之V HCDR及SEQ ID NO:713、714及715之V LCDR； (lxiii) 包含SEQ ID NO:720、721及722之V HCDR及SEQ ID NO:723、724及725之V LCDR； (lxiv) 包含SEQ ID NO:730、731及732之V HCDR及SEQ ID NO:733、734及735之V LCDR； (lxv) 包含SEQ ID NO:740、741及742之V HCDR及SEQ ID NO:743、744及745之V LCDR； (lxvi) 包含SEQ ID NO:750、751及752之V HCDR及SEQ ID NO:753、754及755之V LCDR； (lxvii) 包含SEQ ID NO:760、761及762之V HCDR及SEQ ID NO:763、764及765之V LCDR； (lxviii) 包含SEQ ID NO:770、771及772之V HCDR及SEQ ID NO:773、774及775之V LCDR； (lxix) 包含SEQ ID NO:780、781及782之V HCDR及SEQ ID NO:783、784及785之V LCDR； (lxx) 包含SEQ ID NO:790、791及792之V HCDR及SEQ ID NO:793、794及795之V LCDR； (lxxi) 包含SEQ ID NO:800、801及802之V HCDR及SEQ ID NO:803、804及805之V LCDR； (lxxii) 包含SEQ ID NO:810、811及812之V HCDR及SEQ ID NO: 813、814及815之V LCDR。
本發明之一目標在於提供根據前述任一者之VISTA促效劑，其： (i) 包含SEQ ID NO:106之V H多肽及SEQ ID NO:108之V L多肽； (ii) 包含SEQ ID NO:116之V H多肽及SEQ ID NO:118之V L多肽； (iii) 包含SEQ ID NO:126之V H多肽及SEQ ID NO:128之V L多肽； (iv) 包含SEQ ID NO:136之V H多肽及SEQ ID NO:138之V L多肽； (v) 包含SEQ ID NO:146之V H多肽及SEQ ID NO:148之V L多肽； (vi) 包含SEQ ID NO:156之V H多肽及SEQ ID NO:158之V L多肽； (vii) 包含SEQ ID NO:166之V H多肽及SEQ ID NO:168之V L多肽； (viii) 包含SEQ ID NO:176之V H多肽及SEQ ID NO:178之V L多肽； (ix) 包含SEQ ID NO:186之V H多肽及SEQ ID NO:188之V L多肽； (x) 包含SEQ ID NO:196之V H多肽及SEQ ID NO:198之V L多肽； (xi) 包含SEQ ID NO:206之V H多肽及SEQ ID NO:208之V L多肽； (xii) 包含SEQ ID NO:216之V H多肽及SEQ ID NO:218之V L多肽； (xiii) 包含SEQ ID NO:226之V H多肽及SEQ ID NO:228之V L多肽； (xiv) 包含SEQ ID NO:236之V H多肽及SEQ ID NO:238之V L多肽； (xv) 包含SEQ ID NO:246之V H多肽及SEQ ID NO:248之V L多肽； (xvi) 包含SEQ ID NO:256之V H多肽及SEQ ID NO:258之V L多肽； (xvii) 包含SEQ ID NO:266之V H多肽及SEQ ID NO:268之V L多肽； (xviii) 包含SEQ ID NO:276之V H多肽及SEQ ID NO:278之V L多肽； (xix) 包含SEQ ID NO:286之V H多肽及SEQ ID NO:288之V L多肽； (xx) 包含SEQ ID NO:296之V H多肽及SEQ ID NO:298之V L多肽； (xxi) 包含SEQ ID NO:306之V H多肽及SEQ ID NO:308之V L多肽； (xxii) 包含SEQ ID NO:316之V H多肽及SEQ ID NO:318之V L多肽； (xxiii) 包含SEQ ID NO:326之V H多肽及SEQ ID NO:328之V L多肽； (xxiv) 包含SEQ ID NO:336之V H多肽及SEQ ID NO:338之V L多肽； (xxv) 包含SEQ ID NO:346之V H多肽及SEQ ID NO:348之V L多肽； (xxvi) 包含SEQ ID NO:356之V H多肽及SEQ ID NO:358之V L多肽； (xxvii) 包含SEQ ID NO:366之V H多肽及SEQ ID NO:368之V L多肽； (xxviii) 包含SEQ ID NO:376之V H多肽及SEQ ID NO:378之V L多肽； (xxix) 包含SEQ ID NO:386之V H多肽及SEQ ID NO:388之V L多肽； (xxx) 包含SEQ ID NO:396之V H多肽及SEQ ID NO:398之V L多肽； (xxxi) 包含SEQ ID NO:406之V H多肽及SEQ ID NO:408之V L多肽； (xxxii) 包含SEQ ID NO:416之V H多肽及SEQ ID NO:418之V L多肽； (xxxiii) 包含SEQ ID NO:426之V H多肽及SEQ ID NO:428之V L多肽； (xxxiv) 包含SEQ ID NO:436之V H多肽及SEQ ID NO:438之V L多肽； (xxxv) 包含SEQ ID NO:446之V H多肽及SEQ ID NO:448之V L多肽； (xxxvi) 包含SEQ ID NO:456之V H多肽及SEQ ID NO:458之V L多肽； (xxxvii) 包含SEQ ID NO:466之V H多肽及SEQ ID NO:468之V L多肽； (xxxviii) 包含SEQ ID NO:476之V H多肽及SEQ ID NO:478之V L多肽； (xxxix) 包含SEQ ID NO:486之V H多肽及SEQ ID NO:488之V L多肽； (xl) 包含SEQ ID NO:496之V H多肽及SEQ ID NO:498之V L多肽； (xli) 包含SEQ ID NO:506之V H多肽及SEQ ID NO:508之V L多肽； (xlii) 包含SEQ ID NO:516之V H多肽及SEQ ID NO:518之V L多肽； (xliii) 包含SEQ ID NO:526之V H多肽及SEQ ID NO:528之V L多肽； (xliv) 包含SEQ ID NO:536之V H多肽及SEQ ID NO:533、534及535之V L多肽； (xlv) 包含SEQ ID NO:546之V H多肽及SEQ ID NO:548之V L多肽； (xlvi) 包含SEQ ID NO:556之V H多肽及SEQ ID NO:558之V L多肽； (xlvii) 包含SEQ ID NO:566之V H多肽及SEQ ID NO:568之V L多肽； (xlviii) 包含SEQ ID NO:576之V H多肽及SEQ ID NO:578之V L多肽； (xlix) 包含SEQ ID NO:586之V H多肽及SEQ ID NO:588之V L多肽； (l) 包含SEQ ID NO:596之V H多肽及SEQ ID NO:598之V L多肽； (li) 包含SEQ ID NO:606之V H多肽及SEQ ID NO:608之V L多肽； (lii) 包含SEQ ID NO:616之V H多肽及SEQ ID NO:618之V L多肽； (liii) 包含SEQ ID NO:626之V H多肽及SEQ ID NO:628之V L多肽； (liv) 包含SEQ ID NO:636之V H多肽及SEQ ID NO:638之V L多肽； (lv) 包含SEQ ID NO:646之V H多肽及SEQ ID NO:648之V L多肽； (lvi) 包含SEQ ID NO:656之V H多肽及SEQ ID NO:658之V L多肽； (lvii) 包含SEQ ID NO:666之V H多肽及SEQ ID NO:668之V L多肽； (lviii) 包含SEQ ID NO:676之V H多肽及SEQ ID NO:678之V L多肽； (lix) 包含SEQ ID NO:686之V H多肽及SEQ ID NO:688之V L多肽； (lx) 包含SEQ ID NO:696之V H多肽及SEQ ID NO:698之V L多肽； (lxi) 包含SEQ ID NO:706之V H多肽及SEQ ID NO:708之V L多肽； (lxii) 包含SEQ ID NO:716之V H多肽及SEQ ID NO:718之V L多肽； (lxiii) 包含SEQ ID NO:726之V H多肽及SEQ ID NO:728之V L多肽； (lxiv) 包含SEQ ID NO:736之V H多肽及SEQ ID NO:738之V L多肽； (lxv) 包含SEQ ID NO:746之V H多肽及SEQ ID NO:748之V L多肽； (lxvi) 包含SEQ ID NO:756之V H多肽及SEQ ID NO:758之V L多肽； (lxvii) 包含SEQ ID NO:766之V H多肽及SEQ ID NO:768之V L多肽； (lxviii) 包含SEQ ID NO:776之V H多肽及SEQ ID NO:778之V L多肽； (lxix) 包含SEQ ID NO:786之V H多肽及SEQ ID NO:788之V L多肽； (lxx) 包含SEQ ID NO:796之V H多肽及SEQ ID NO:798之V L多肽； (lxxi) 包含SEQ ID NO:806之V H多肽及SEQ ID NO:808之V L多肽；及 (lxxii) 包含SEQ ID NO:816之V H多肽及SEQ ID NO: 818之V L多肽。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其包含人類IgG2恆定域，其中視情況至少一個半胱胺酸殘基經刪除或改變為另一胺基酸。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段，其介導以下免疫抑制作用中之任一者或至少一者之組合：(i)減少免疫反應，(ii)減少T細胞活化，(iii)降低細胞毒性T細胞活性，(iv)降低天然殺手(NK)細胞活性，(v)降低T細胞活性，(vi)減少促炎性細胞激素分泌，(vii)減少IL-2分泌；(viii)減少干擾素-γ產生，(ix)減少Th1反應，(x)減少Th2反應，(xi)增加調節性T細胞之細胞數量及/或活性，(xii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者，(xiii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬細胞，(xiv)增加M2巨噬細胞活性，(xv)增加N2嗜中性白血球，(xvi)增加N2嗜中性白血球活性，(xvii)增加對T細胞活化之抑制作用，(xviii)增加對CTL活化之抑制作用，(xix)增加對NK細胞活化之抑制作用，(xx)增加T細胞損耗，(xxi)減少T細胞反應，(xxii)降低細胞毒性細胞之活性，(xxiii)減少抗原特異性記憶反應，(xxiv)抑制細胞凋亡或細胞溶解，(xxv)減少對細胞之細胞毒性或細胞生長抑制作用，(xxvi)減少細胞之直接殺死，(xxvii)降低Thl7活性，及/或(xxviii)減少補體依賴性細胞毒性及/或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性，其限制條件在於該抗-VISTA抗體或抗原結合片段可引發與(i)-(xxviii)中之一或多者相反之作用且視情況用於治療自體免疫、過敏、發炎、移植或敗血症。
本發明之一特定目標在於提供一種醫藥性或診斷性組合物，其包含根據前述任一者之包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之促效性抗體或其抗體片段。
本發明之一特定目標在於提供一種治療及/或診斷方法，或含有至少一種根據前述請求項中任一者之拮抗性抗體或抗體片段的組合物用於診斷或治療用途之用途，該方法或用途包括向有需要之受檢者投與至少一種包含治療或診斷有效量之至少一種根據前述任一者之拮抗性抗體或抗體片段之劑量或組合物，例如癌症或感染性病症，視情況其中該癌症為血癌或實性瘤，例如由包含骨髓細胞、T細胞或骨髓細胞與T細胞之組合之腫瘤基質包圍之腫瘤或選自白血病、淋巴瘤、脊髓發育不良症候群或骨髓瘤、肺癌或其組合之癌症，或包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性骨髓(骨髓性)白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)；毛細胞白血病、T細胞幼淋巴細胞白血病、大顆粒淋巴細胞白血病或成人T細胞白血病之白血病。
本發明之一特定目標在於提供一種治療及/或診斷方法或含有至少一種根據前述請求項中任一者之促效性抗體或抗體片段之組合物用於診斷或治療用途之用途，該方法或用途包括向有需要之受檢者投與至少一種包含治療或診斷有效量之至少一種根據前述任一者之促效性抗體或抗體片段或根據前述任一者之含有其之組合物之劑量或組合物。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之任何促效性抗體或抗體片段用於經活體外及/或活體內實現以下免疫抑制作用中之任一者或至少一者之組合的方法或用途：(i)減少免疫反應，(ii)減少T細胞活化，(iii)降低細胞毒性T細胞活性，(iv)降低天然殺手(NK)細胞活性，(v)降低T細胞活性，(vi)減少促炎性細胞激素分泌，(vii)減少IL-2分泌；(viii)減少干擾素-γ產生，(ix)減少Th1反應，(x)減少Th2反應，(xi)增加調節性T細胞之細胞數量及/或活性，(xii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者，(xiii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬細胞，(xiv)增加M2巨噬細胞活性，(xv)增加N2嗜中性白血球，(xvi)增加N2嗜中性白血球活性，(xvii)增加對T細胞活化之抑制作用，(xviii)增加對CTL活化之抑制作用，(xix)增加對NK細胞活化之抑制作用，(xx)增加T細胞損耗，(xxi)減少T細胞反應，(xxii)降低細胞毒性細胞之活性，(xxiii)減少抗原特異性記憶反應，(xxiv)抑制細胞凋亡或細胞溶解，(xxv)減少對細胞之細胞毒性或細胞生長抑制作用，(xxvi)減少細胞之直接殺死，(xxvii)降低Thl7活性及/或(xxviii)減少補體依賴性細胞毒性及/或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性，其限制條件在於該抗-VISTA抗體或抗原結合片段可引發與(i)-(xxviii)中之一或多者相反之作用且視情況用於治療自體免疫、過敏、發炎、移植或敗血症。
本發明之一特定目標在於提供根據前述任一者之任何促效性抗體或抗體片段用於治療或預防過敏、自體免疫、移植、基因治療、發炎、癌症、GVHD或敗血症或用於治療或預防人類受檢者中與前述任一者相關之發炎、自體免疫或過敏性副作用的方法或用途。
根據前述任一者之抗-VISTA抗體或抗原結合片段或組合物或方法或用途進一步包含另一種免疫調節性抗體或融合蛋白，其選自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中一或多者之免疫抑制性抗體或融合蛋白及/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中一或多者之促效性抗體或融合蛋白。
前述任一者之方法或用途包括在治療之前、同時及/或之後藉由個體之細胞或在體液中分析VISTA蛋白。
前述任一者之方法或用途包括分析造血細胞上之VISTA水準。
前述任一者之方法或用途包括分析選自骨髓譜系細胞及/或淋巴細胞、單核細胞或嗜中性白血球、T細胞、B細胞、天然殺手(NK)細胞或天然殺手T (NKT)細胞中任一或多者之造血細胞上的VISTA水準。
前述任一者之方法或用途，其中該促效劑抗人類VISTA抗體或片段包含與選自VSTB49-VSTB116之抗體相同之CDR及視情況可突變之人類IgG2 Fc區，或其中該IgG2恆定區或Fc區保持天然FcR結合及/或保持結合CD32A之能力。
前述任一者之抗體、組合物、方法或用途，其中如藉由表面電漿共振在37℃下所確定，該抗人類VISTA抗體或片段對人類VISTA具有50M或50M以下之親和力或KD。
前述任一者之抗體、組合物、方法或用途，其中如藉由表面電漿共振在37℃下所確定，抗人類VISTA抗體或片段對人類VISTA具有1nM或1nM以下之親和力或KD。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之經分離的拮抗性及促效性抗人類VISTA抗體及促效性抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含具有具有圖4中所示序列之抗人類VISTA抗體中任一者之CDR多肽的可變重鏈及輕鏈序列，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之經分離的拮抗性及促效性抗人類VISTA抗體及促效性抗體片段，其中該等抗體或抗體片段包含具有選自VSTB49-VSTB116之抗人類VISTA抗體之CDR多肽的可變重鏈及輕鏈序列，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗性抗人類VISTA抗體或抗人類VISTA抗體片段，則該抗人類VISTA抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之另一特定目標在於提供包含選自VSTB49-VSTB116之抗人類VISTA抗體之CDR之經分離的拮抗性及促效性抗體及抗體片段，其包含與VSTB49-VSTB116之可變重鏈及輕鏈多肽序列具有至少90%、95%或96-99%之序列一致性之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗性抗人類VISTA抗體或片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之另一特定目標在於提供包含與VSTB49-VSTB116中任一者相同之CDR之經分離的拮抗性及促效性抗體或抗體片段，其包含與VSTB49-VSTB116之可變重鏈及輕鏈多肽序列相同之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗性抗人類VISTA抗體或片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之另一特定目標在於提供包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區之經分離的拮抗性或促效性嵌合、人類、人源化、多特異性(例如雙特異性)抗人類VISTA抗體或抗體片段，其包含具有包含圖4中所揭示之CDR及可變重鏈及輕鏈多肽之抗人類VISTA抗體中任一者之CDR多肽的可變重鏈及輕鏈序列，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗性抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。
本發明之另一特定目標在於提供新穎之免疫抑止劑，亦即抗人類VISTA抗體及抗體片段，例如含有人類IgG2恆定域或IgG2 Fc區之彼等抗體及抗體片段，視情況其中人類IgG2恆定域或IgG2 Fc區之FcR結合能力與野生型人類IgG2恆定域或IgG2 Fc區相比保持或增強，其刺激、引發或模擬人類VISTA對免疫性之作用，例如其對T細胞活性、分化及增殖之抑止作用及其對促炎性細胞激素表現之抑止作用。
本發明之另一特定目標在於提供新穎之拮抗劑，亦即新穎之抗人類VISTA抗體及抗體片段，其拮抗或阻斷人類VISTA對免疫性之作用，尤其為其對T細胞活性、分化及增殖之抑止作用及其對促炎性細胞激素表現之抑止作用。
本發明之另一特定目標在於提供新穎之免疫抑止抗體及抗體片段，其增強或模擬VISTA對T細胞免疫之抑止作用，亦即其抑止CD4 +或CD8 +T細胞增殖、CD4 +或CD8 +T細胞活化及其對產生免疫細胞激素(尤其為促炎性細胞激素，諸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α及/或GM-CSF(顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子))之抑止作用，及其對表現趨化因子或化學引誘劑(諸如KC (角質細胞化學引誘劑)或MIP-2 (巨噬細胞發炎蛋白2))之促進作用。
本發明之另一特定目標在於提供新穎之抗體及抗體片段，其阻斷或減少VISTA對T細胞免疫之抑止作用，亦即其增強CD4 +或CD8 +T細胞增殖、CD4 +或CD8 +T細胞活化及其對產生促炎性免疫細胞激素(尤其為促炎性細胞激素，諸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α及/或GM-CSF(顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子))之抑止作用，及其對表現趨化因子或化學引誘劑(諸如KC (角質細胞化學引誘劑)或MIP-2 (巨噬細胞發炎蛋白2))之促進作用。
本發明之另一特定目標在於提供具有特定抗原決定基特異性或與特異性抗人類VISTA抗體競爭結合至人類VISTA之新穎免疫抑止性或促效性抗人類VISTA抗體及抗體片段。
本發明之另一特定目標在於提供具有特定抗原決定基特異性或與特異性抗人類VISTA抗體競爭結合至人類VISTA之新穎免疫抑止性或促效性抗人類VISTA抗體及抗體片段，該等特異性抗人類VISTA抗體刺激(增強、引發或模擬)VISTA對免疫性之抑止作用(例如其對T細胞免疫(亦即CD4 +或CD8 +T細胞增殖、CD4 +或CD8 +T細胞活化)之抑止作用)及/或抑止產生促炎性免疫細胞激素(諸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α及/或GM-CSF(顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子))及其對表現趨化因子或化學引誘劑(諸如KC (角質細胞化學引誘劑)或MIP-2 (巨噬細胞發炎蛋白2))之促進作用。
又，本發明亦係關於該等促效性抗人類VISTA抗體及抗體片段作為預防劑或治療劑，尤其在治療病況中及/或在治療移植或細胞療法受者(例如CAR-T受者)中或在緩解某些病況(諸如癌症)之發炎性副作用中之特定用途，其中預防或抑制或減少免疫反應在治療上係有利的，且更特定而言其中預防或抑制或減少T細胞免疫(或更特定而言為CD4 +或CD8 +介導之T細胞免疫)在治療上係有益的，諸如自體免疫、發炎、過敏病症、敗血症、GVHD。
又，本發明係關於新穎拮抗性抗人類VISTA抗體及抗體片段作為預防劑或治療劑，尤其在治療病況中之用途，其中需要促進免疫性，例如T細胞免疫或CD4 +或CD8 +介導之T細胞免疫在治療上係有益的，諸如癌症及感染性疾病。
本發明之另一特定目標在於提供根據本發明之促效劑或拮抗劑抗人類VISTA抗體，其附著有可偵測之標記、連接子或治療性部分。
本發明之另一特定目標在於提供一種診斷性或治療性組合物，其包含診斷或治療有效量之根據本發明之促效劑或拮抗劑抗人類VISTA抗體，例如適用於人類治療之含有與具有圖4中所示序列之任何抗體相同之CDR之組合物，諸如可靜脈內、皮下或肌肉內投藥之組合物。
本發明之另一特定目標在於提供一種診斷或治療方法，其使用根據本發明之促效劑抗體聯合另一種免疫促效劑，例如PD-1或PD-L1促效劑，例如其中PD-1或PD-L1促效劑選自抗-PD-1抗體或抗體片段、抗-PD-L1抗體或抗體片段、可為單價或多聚體之PD-L1多肽或其片段、可為單價或多聚體之PD-1多肽或其片段、或包含以上任一者之複合物或融合蛋白。
本發明之另一特定目標在於提供診斷或治療方法，其使用根據本發明之拮抗劑抗體聯合另一種免疫拮抗劑，例如PD-1或PD-L1拮抗劑，例如其中PD-1或PD-L1促效劑選自拮抗劑抗-PD-1抗體或抗體片段、拮抗劑抗-PD-L1抗體或抗體片段。
本發明之另一特定目標在於提供使免疫細胞經活體外或活體內與根據本發明之拮抗劑或促效劑抗體(例如人類免疫細胞)接觸之方法，例如其中將接觸之細胞注入人類受檢者體內，諸如患有癌症或感染性疾病之受檢者或患有發炎性、過敏性或自體免疫病況之受檢者。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之相同含義。儘管在本發明中或在本發明之測試中可使用與本文所述之彼等類似或等效之方法及材料，但本文中描述合適之方法及材料。該等材料、方法及實例僅為說明性的，而非意欲限制。結合本文中所述之分析化學、合成有機化學及醫學與醫藥化學所用之術語及其實驗室程序及技術係此項技術中熟知且常用之彼等。可使用標準技術進行化學合成、化學分析、醫藥學製備、調配及傳遞以及治療患者。
如本文說明書及下文整個申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指出，否則「一(a/an)」及「該」之含義包括複數個提及物。
如本文所用之「活化受體」廣泛地係指結合抗原、複合抗原(例如在MHC分子之情形下)、Ig-融合蛋白、配位體或抗體之免疫細胞受體。活化受體包括(但不限於)T細胞受體(TCR)、B細胞受體(BCR)、細胞激素受體、LPS受體、互補受體及Fc受體。例如，T細胞受體存在於T細胞上且與CD3分子相關。T細胞受體在MHC分子之情形下受抗原刺激(以及受多株T細胞活化試劑刺激)。經由TCR之T細胞活化導致多種變化，例如蛋白磷酸化、膜脂質變化、離子流、環狀核苷酸改變、RNA轉錄變化、蛋白合成變化及細胞體積變化。例如，T細胞受體存在於T細胞上且與CD3分子相關。T細胞受體在MHC分子之情形下受抗原刺激(以及受多株T細胞活化試劑刺激)。經由TCR之T細胞活化導致多種變化，例如蛋白磷酸化、膜脂質變化、離子流、環狀核苷酸改變、RNA轉錄變化、蛋白合成變化及細胞體積變化。
如本文所用之「佐劑」係指用於刺激免疫系統且增加對疫苗之反應而對本身無任何特異性抗原作用之藥劑。
「促效劑」在本文中係指增強或模擬特異性分子對免疫性之作用的分子，通常為抗體或融合蛋白。在本申請中，此通常將係指增強或模擬人類VISTA對免疫性之作用的抗人類VISTA促效劑抗體及抗體片段，尤其VISTA對T細胞免疫(CD4+及/或CD8+ T細胞免疫)、促炎性細胞激素表現之抑止作用及其對特異性趨化因子及化學引誘劑之表現的作用。
「有助於診斷」或「有助於偵測」疾病在本文中意謂單獨或結合一或多個其他標記偵測特定標記多肽或經表現之RNA的表現水準來評估受檢者是否具有具備特定疾病病況或特定疾病病況發作之特徵的細胞或受檢者是否包含免疫功能障礙，諸如以VISTA表現為特徵之免疫抑止或以具有VISTA水準降低之細胞為特徵之異常免疫上調，諸如在自體免疫、發炎或過敏性反應期間，例如在患有慢性及非慢性疾病之個體中。
如本文所用之「過敏性疾病」廣泛地係指包含過敏性反應之疾病。更特定言之，「過敏性疾病」定義為識別到過敏原之疾病，其中在暴露於過敏原與病理變化發作之間存在強烈之相關性且其中已證明病理變化具有免疫學機制。本文中，免疫學機制意謂白血球對過敏原刺激展示免疫反應。
如本文所用之「胺基酸」廣泛地係指天然產生及合成之胺基酸，以及以與天然產生之胺基酸類似之方式發揮作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然產生之胺基酸為由遺傳密碼編碼之彼等胺基酸以及後來經修飾之彼等胺基酸(例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸)。胺基酸類似物係指與天然產生之胺基酸具有相同之基礎化學結構(亦即碳結合氫、羧基、胺基)及R基(例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶)之化合物。類似物可具有經修飾之R基(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然產生之胺基酸相同之基礎化學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之通用化學結構不同之結構，但以與天然產生之胺基酸類似之方式發揮作用的化合物。
如本文所用之「無能」或「耐受性」或「延長之抗原-特異性T細胞抑止」或「延長之免疫抑止」廣泛地係指對活化受體介導之刺激的折射性。折射性通常為抗原特異性的且在停止暴露於耐受抗原後仍持續。例如，在T細胞中無能(與無反應性相反)之特徵在於缺乏細胞激素產生，例如IL-2。當T細胞暴露於抗原且在不存在第二信號(共刺激信號)之情形下接收第一信號(T細胞受體或CD-3介導之信號)時，發生T細胞無能。在該等條件下，使細胞再暴露於相同抗原(即使在共刺激分子存在下發生再暴露)導致無法產生細胞激素，且因此無法增殖。然而，無能T細胞可增加對無關抗原之反應，且若與細胞激素(例如IL-2)一起培養，則可增殖。例如，如藉由ELISA或藉由使用指示劑細胞株之增殖分析所量測缺少T淋巴細胞產生IL-2，亦可觀測到T細胞無能。或者，可使用報導體基因構築體。例如，無能T細胞無法引發在5' IL-2基因強化子控制下由異源啟動子或由可在強化子中發現之API序列之多聚體誘發IL-2基因轉錄(Kang等人(1992) Science 257: 1134)。調節共刺激信號導致對免疫細胞之效應功能之調節。
「拮抗劑」在本文中係指阻斷或減少特異性分子對免疫性之作用的分子，通常為抗體或融合蛋白。通常在本申請中，此將係指阻斷或減少人類VISTA對免疫性之作用的抗人類VISTA拮抗劑抗體及抗體片段，尤其VISTA對T細胞免疫(CD4 +及/或CD8+ T細胞免疫)、促炎性細胞激素之表現的抑止作用及VISTA對特異性趨化因子及化學引誘劑之表現的作用。
如本文所用之「抗體」廣泛地係指抗體之「抗原結合部分」(亦可與「抗體部分」、「抗原結合片段」、「抗體片段」互換使用)以及完整之抗體分子。如本文所用之術語「抗原結合部分」係指保留特異性地結合抗原之能力之抗體的一或多個片段(例如VISTA或其特異性部分))。如本文提及之術語「抗體」包括完整多株及單株抗體及其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或單鏈以及雙特異性及多特異性抗體，例如結合至多個抗原或多個抗原抗原決定基之彼等抗體。「抗體」係指包含由雙硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之糖蛋白或其抗原結合部分。每個重鏈包含至少一個重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，C H1、Cm及Cm-每個輕鏈包含至少一個輕鏈可變區(本文中縮寫為V L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域CL-V H及V L區可進一步再分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間穿插有更保守之區域，稱為框架區(FR)。每個VH及VL包含三個CDR及四個FR，依以下次序自胺基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子結合，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。更一般來說，術語「抗體」欲包括含有任何多肽鏈之分子結構，其特異性形狀與抗原決定基相符且識別抗原決定基，其中一或多種非共價結合相互作用使分子結構與抗原決定基之間的複合物穩定。原型抗體分子為免疫球蛋白，且來自所有來源(例如人類、囓齒動物、兔、奶牛、綿羊、豬、狗、其他哺乳動物、小雞、其他禽類等)之所有類型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)被認為係「抗體」。
抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來執行。術語抗體之「抗原結合部分」中所涵蓋之抗原結合片段之非限制性實例包括(a) Fab片段，其為由V L、V H、C L及C H1結構域組成之單價片段；(b) F(ab') 2片段，其為包含在鉸鏈區由二硫鍵連接之兩個Fab片段之二價片段；(c) Fd片段，其由V H及C H1結構域組成；(d) Fv片段，其為由抗體之單臂之VL及VH結構域組成；(e) dAb片段(Ward等人(1989) Nature341 : 544-546)，其由V H結構域組成；及(f)經分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域V L及V H由單獨基因編碼，但其可使用重組方法由合成性連接子接合，該合成性連接子使其成為其中V L與V H區配對形成單價分子之單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv (scFv))。參見例如Bird等人(1988) Science242: 423-426；Huston等人(1988) Proc Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883；及Osbourn等人(1998) Nat. Biotechnol. 16: 778。單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內。特異性scFv之任何V H及V L序列均可連接成人類免疫球蛋白恆定區cDNA或基因體序列，從而產生編碼完整IgG分子或其他同型之表現載體。VH及V L亦可用於使用蛋白化學或重組DNA技術產生免疫球蛋白之Fab、Fv或其他片段。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中V H及V L結構域在單一多肽鏈上表現，但使用太短而無法使同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接子，由此迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。參見例如Holliger等人(1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2: 1121-1123。更進一步地，抗體或其抗原結合部分(抗原結合片段、抗體片段、抗體部分)可為藉由抗體或抗體部分與一或多個其他蛋白或肽共價或非共價締合所形成之較大免疫黏附性分子之部分。免疫黏附性分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區形成四聚體scFv分子(Kipriyanov等人(1995) Hum. Antibodies Hybridomas6: 93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C末端聚組胺酸標籤形成二價且經生物素標記之scFv分子。Kipriyanov等人(1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058。抗體部分，諸如Fab及F(ab') 2片段，可使用習知技術，諸如分別以番木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體而由完整抗體來製備。此外，抗體、抗體部分及免疫黏附性分子可如本文中所述使用標準重組DNA技術來獲得。抗體可為多株、單株、異種基因、同種異體、同種基因或其修飾形式，例如人源化、嵌合、雙特異性或多特異性抗體。
「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性地結合至抗原之抗體」互換使用且係指特異性地結合抗原之免疫球蛋白或其片段。
如本文所用之「抗原」廣泛地係指能夠由抗體結合之分子或分子部分，該抗體另外能夠誘發動物產生能夠結合至該抗原之抗原決定基之抗體。抗原可具有一個抗原決定基或具有一個以上抗原決定基。本文中提及之特異性反應表明該抗原將以高度選擇性之方式與其相應抗體反應，而不與可能由其他抗原引起之多個其他抗體反應。在對於所關注之特定抗原所需之增強免疫反應之情形下，抗原包括(但不限於)；例示為對其可引發保護性免疫反應之感染性疾病抗原。
如本文所用之「抗原呈現細胞」廣泛地係指專職性抗原呈現細胞(例如B淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞及郎格罕細胞(Langerhans cell))以及其他抗原呈現細胞(例如角質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、纖維母細胞及寡樹突膠細胞)。
如本文所用之「反義核酸分子」廣泛地係指與「正義」核酸*互補之核苷酸序列，該「正義」核酸*編碼與mRNA序列互補或與基因之編碼鏈互補之蛋白(例如與雙鏈cDNA分子之編碼鏈互補)。因此，反義核酸分子可與正義核酸分子氫鍵結。
如本文所用之「細胞凋亡」廣泛地係指可使用此項技術中已知之技術來表徵之漸進式細胞死亡。凋亡性細胞死亡可藉由在細胞分裂中達到頂點之細胞收縮、膜起泡及染色質凝集來表徵。經歷細胞凋亡之細胞亦展示核小體間DNA裂解之特徵性圖案。
如本文所用之「自體免疫」或「自體免疫性疾病或病況」廣泛地係指由個體自身組織或其共分離或表現產生及針對個體自身組織或其共分離或表現之疾病或病症或由此產生的病況，且包括該等病況。本文中，自體免疫病況包括發炎性或過敏性病況，例如以針對潛在地與組織破壞相關之自身抗原之宿主免疫反應為特徵之慢性疾病，諸如類風濕性關節炎。
如本文所用之「B細胞受體(BCR)」廣泛地係指在B細胞上發現之膜Ig (mIg)與其他跨膜多肽(例如IgA.及Ig)之間的複合物。藉由寡聚體或多聚體抗原交聯受體分子觸發mlg之信號轉導功能。B細胞亦可由抗-免疫球蛋白抗體活化。經BCR活化後，B細胞中發生多種變化，包括酪胺酸磷酸化。
如本文所用之「癌症」廣泛地係指任何贅生性疾病(無論侵襲性或轉移性)，其特徵在於異常且不受控之細胞分裂，導致惡性生長或腫瘤(例如細胞生長失調)。如本文所用之術語「癌症」或「癌性」應理解為涵蓋任何贅生性疾病(無論侵襲性、非侵襲性或轉移性)，其特徵在於異常且不受控之細胞分裂，導致惡性生長或腫瘤，其非限制性實例在本文中有述。此包括哺乳動物中通常以細胞生長失調為特徵之任何生理學病況。癌症之實例在操作實例中例示。其他癌症包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃腸癌)、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer)或腎癌(renal cancer)、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及各種類型之頭頸癌以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞(SL) NHL；中級/濾泡NHL；中級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小非核裂細胞NHL；巨塊病變NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenström’s Macroglobulinemia))；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞白血病；多發性骨髓瘤及移植後淋巴增殖性病症(PTLD)。適合由本發明治療之其他癌症包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性腫瘤。該等癌症之更特定實例包括結腸直腸癌、膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及各種類型之頭頸癌以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞(SL) NHL；中級/濾泡NHL；中級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小非核裂細胞NHL；巨塊病變NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞性白血病；及移植後淋巴增殖性病症(PTLD)以及與斑痣性錯構瘤病、水腫(諸如與腦腫瘤相關之水腫)及梅格斯症候群(Meigs' syndrome)相關之異常血管增殖。癌症較佳選自以下疾病組成之群：結腸直腸癌、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰臟癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、類癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。在一例示性實施例中，癌症為早期或晚期(包括轉移性)膀胱癌、卵巢癌或黑素瘤。在另一實施例中，癌症為結腸直腸癌。適合於本發明治療之癌性病況包括表現或不表現VISTA之癌症且進一步包括非轉移性或非侵襲性以及侵襲性或轉移性癌症，其中由免疫、基質或患病細胞表現VISTA抑止抗腫瘤反應及抗侵襲性免疫反應。本發明之方法尤其適用於治療帶血管腫瘤。根據本發明之癌症包括表現或不表現VISTA之癌症且進一步包括非轉移性或非侵襲性以及侵襲性或轉移性癌症，其中由免疫、基質或患病細胞表現VISTA抑止抗腫瘤反應及抗侵襲性免疫反應，及以帶血管腫瘤為特徵之彼等癌症。
如本文所用之「嵌合抗體」廣泛地係指其中恆定區或其部分經改變、替代或交換以使得抗原結合位點(可變區)與不同或改變類別、效應功能及/或種類之恆定區連接的抗體分子，或對嵌合抗體賦予新特性之完全不同之分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物，可變區或其部分經改變、替代或與具有不同或改變之抗原特異性的可變區交換。
如本文所用之「編碼區」廣泛地係指包含轉譯為胺基酸殘基之密碼子的核苷酸序列區域，而術語「非編碼區」係指未轉譯為胺基酸之核苷酸序列區域(例如5'及3'非轉譯區)。
如本文所用之「保守修飾變異體」適用於胺基酸及核酸序列，且對於特定核酸序列而言，廣泛地係指保守修飾變異體，係指編碼相同或基本上相同之胺基酸序列的彼等核酸，或其中該核酸不編碼胺基酸序列，基本上相同之序列。由於遺傳密碼之簡併，大量功能等同之核酸編碼任何給定之蛋白。「靜默變化」為一類保守修飾之核酸變化。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦描述該核酸之每種可能之靜默變化。熟習此項技術者將意識到，核酸中之每個密碼子(除AUG (其通常為甲硫胺酸之唯一密碼子)及TGG (其通常為色胺酸之唯一密碼子)以外)可經修飾以產生功能等同之分子。
如本文所用之「互補決定區」、「高變區」或「CDR」廣泛地係指在抗體之輕鏈或重鏈之可變區中發現之高變區或互補決定區(CDR)中之一或多者。參見Kabat等人(1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health, Bethesda, Md。該等表現包括如由Kabat等人(1983) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept. of Health and Human Services定義之高變區或抗體之3維結構中之高變環。Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917。每個鏈中之CDR由框架區保持緊密接近，且藉由另一鏈之CDR而有助於形成抗原結合位點。在CDR中選擇已描述為選擇性決定區(SDR)之胺基酸，其代表由CDR用於抗體-抗原相互作用中之關鍵接觸殘基(Kashmiri Methods36: 25-34(2005))。
如本文所用之「對照量」廣泛地係指可為與測試量之標記相比為任何量或量範圍之標記。例如，對照量之標記可為在患有特定疾病或病況之患者或未患該疾病或病況之人中的標記量。對照量可為絕對量(例如微克/ml)或相對量(例如相對信號強度)。
如本文所用之「共刺激受體」廣泛地係指將共刺激信號傳輸至免疫細胞(例如CD28或ICOS)之受體。如本文所用之術語「抑制性受體」包括將負信號傳輸至免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)之受體。
如本文所用之「共刺激」廣泛地係指共刺激分子提供誘發增殖或效應功能之第二非活化受體介導之信號(「共刺激信號」)之能力。例如，共刺激信號可導致細胞激素分泌(例如在已接收T細胞受體介導之信號之T細胞中)。已接收細胞受體介導之信號(例如，經由活化受體)之免疫細胞在本文中可稱為「活化免疫細胞」。關於T細胞，共刺激信號傳輸至T細胞包涵不受環孢素A抑制之信號轉導途徑。另外，共刺激信號可誘發T細胞中之細胞激素分泌(例如IL-2及/或IL-10)及/或可防止誘發對抗原之無反應性、誘發無能或誘發T細胞中之細胞死亡。
「共刺激多肽」或「共刺激分子」在本文中係指在與T細胞上之細胞表面分子相互作用之後調節T細胞反應之多肽。
如本文所用之「共刺激信號轉導」為由抗原呈現細胞上之共刺激多肽與其在T細胞上之受體在抗原特異性T細胞反應期間之相互作用所產生之信號轉導活性。不希望受單一假設限制，咸信抗原特異性T細胞反應由兩種信號介導：1) T細胞受體(TCR)與在MHC情形下呈現之抗原性肽嚙合(信號1)，及2)由不同共刺激受體/配位體對之間接觸所傳遞之第二抗原非依賴性信號(信號2)。不希望受單一假設限制，此「第二信號」對於確定T細胞反應之類型(活化或抑制)以及該反應之強度及持續時間而言係重要的，且由來自共刺激分子(諸如B7家族之蛋白)之正信號及負信號來調節。
「B7」多肽在本文中意思是共刺激T細胞之B7蛋白家族之成員，包括(但不限於) B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-Hl、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3及其生物活性片段及/或變異體。代表性生物活性片段包括共刺激T細胞之胞外域或胞外域之片段。
如本文所用之「細胞質結構域」廣泛地係指延伸至細胞之細胞質中之蛋白部分。
如本文所用之「診斷性」廣泛地係指識別病理學病況之存在或性質。診斷方法之區別在於其敏感性及特異性。診斷分析之「敏感性」為測試陽性之患病個體之百分比(「真陽性」之百分比)。分析未偵測到之患病個體為「假陰性」。未患病且在分析中測試陰性之受檢者稱為「真陰性」。診斷分析之「特異性」為1減去假陽性率，其中「假陽性率」定義為測試陽性之未患病個體之比例。儘管特定診斷方法可能不提供對病況之明確診斷，但若該方法提供有助於診斷之陽性指示，則其滿足要求。
如本文所用之「診斷」或「有助於診斷」廣泛地係指對疾病或症狀進行分類，及/或確定個體患疾病病況之可能性(例如基於不存在或存在VISTA表現及/或藉由免疫、基質及/或假定患病細胞增加或減少表現)；確定疾病之嚴重性、監控疾病進程、預測疾病結果及/或恢復前景。術語「偵測」亦可視情況涵蓋任何上述情形。在一些實施例中，根據本發明之診斷疾病可受到確定本發明之聚核苷酸或多肽在由受檢者獲得之生物樣品中之水準的影響，其中所確定之水準可與患病之傾向性或是否存在疾病相關。應注意，「由受檢者獲得之生物樣品」亦可視情況包含尚未自受檢者物理移除之樣品。
如本文所用之「有效量」廣泛地係指在投與患者以用於治療疾病時足以實現對疾病之該種治療的化合物、抗體、抗原或細胞之量。有效量可為有效防治量及/或有效預防量。有效量可為有效減少徵象/症狀之量，有效預防徵象/症狀發生、減小發生徵象/症狀之嚴重性、消除徵象/症狀發生、減緩發生徵象/症狀之發展及/或影響對發生徵象/症狀之防治的量。「有效量」可視疾病及其嚴重性以及待治療之患者的年齡、體重、醫學史、易感性及先前已存在之病況而變化。對於本發明之目的而言，術語「有效量」與「治療有效量」同義。
如本文所用之「胞外域」或「ECD」廣泛地係指自細胞表面延伸之蛋白部分。
如本文所用之「表現載體」廣泛地係指用於在包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞之任何細胞中構成性地或誘導性地活體外或活體內表現本發明之核酸序列之目的的任何重組表現系統。該術語包括線性或環形表現系統。該術語包括保持游離體或整合至宿主細胞基因體中之表現系統。表現系統可具有自我複製或不自我複製之能力，亦即僅在細胞中驅使瞬時表現。該術語包括僅含有重組核酸轉錄所需之最小要素之重組表現序列盒。
如本文所用之「家族」廣泛地係指本發明之多肽及核酸分子，其欲意謂具有共同之結構域或基元且具有如本文定義之足夠之胺基酸或核苷酸序列同源性之兩個或兩個以上多肽或核酸分子。家族成員可為天然或非天然產生且可來自相同或不同之物種。例如，家族可含有人類來源之第一多肽以及人類來源之其他不同多肽，或者可含有非人類來源之同系物(例如猴多肽)。家族成員亦可具有共同之功能特徵。
如本文所用之「Fc受體」(FcR)廣泛地係指免疫球蛋白分子(Ig)之Fc部分之細胞表面受體。在參與免疫反應之多種細胞上均發現Fc受體。迄今已確認之人類FcR為識別IgG (指定為FcγR)、IgE (FceRI)、IgA (FcaR)及聚合IgM/A (FcεμR)之彼等FcR。在以下細胞類型中發現有FcR：FceRI (肥大細胞)、FceRII (多種白血球)、FcaR (嗜中性白血球)及FcμR (腺上皮，肝細胞)。(Hogg Immunol. Today 9: 185-86 (1988))。廣泛研究之FcγR在細胞免疫防禦中係主要的，且負責刺激在自體免疫性疾病之發病機制中所涉及之發炎調節子及水解酶之釋放。(Unkeless, Annu. Rev. Immunol. 6: 251-87 (1988))。FcγR在效應細胞與分泌Ig之淋巴細胞之間提供重要聯繫，因為巨噬細胞/單核細胞、多形核白血球及天然殺手(NK)細胞FcγR為要素賦予由IgG介導之特異性識別。人類白血球對於IgG具有至少三種不同類型之FcγR：hFcγRI(CD64)(發現於單核細胞/巨噬細胞上)、hFcγRIIA或hFcγRIIB (CD32或CD32A)(發現於單核細胞、嗜中性白血球、嗜酸性白血球、血小板、可能的B細胞及K562細胞株上)及FcγRIIIA (CD16A)或FcγRIIIB(CD16B)(發現於NK細胞、嗜中性白血球、嗜酸性白血球及巨噬細胞上)。
如本文所用之「框架區」或「FR」廣泛地係指抗體之輕鏈及重鏈之可變區內的框架區中之一或多者。參見Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological InterestNational Institutes of Health, Bethesda, Md (1987)。該等表現包括插入抗體之輕鏈及重鏈之可變區內的CDR之間之彼等胺基酸序列區。
如本文所用之「異源」廣泛地係指核酸之部分表明核酸包含兩個或兩個以上在彼此之間本身存在之相同關係中未發現之子序列。例如，核酸通常經重組產生，具有兩個或兩個以上來自無關基因之序列排列成用以形成新功能核酸(例如，啟動子來自一種來源且編碼區來自另一來源)。類似地，異源蛋白表明蛋白包含兩個或兩個以上在彼此之間本身存在之相同關係中未發現之子序列(例如融合蛋白)。
如本文所用之「高親和力」廣泛地係指對於標靶抗原或受體而言具有至少10 -6M，更佳10 -7M，甚至更佳至少10 -8M且甚至更佳至少10 -9M、10 -10M、10 -11M或10 -12M之KD的抗體或融合蛋白。IgG抗體或融合蛋白之「高親和力」在本文中係指對於標靶抗原或受體而言具有10 -6M或10 -6M以下，更佳10 -7M或10 -7M以下，較佳10 -8M或10 -8M以下，更佳10 -9M或10 -9M以下且甚至更佳10 -10M、10 -11M或10 -12M或10 -12M以下之KD的抗體。尤其對於抗體而言，「高親和力」結合對於不同抗體同型而言可不同。例如，對於IgM同型而言之「高親和力」結合係指具有10 -7M或10 -7M以下、更佳10 -8M或10 -8M以下之K D的抗體。
如本文所用之「同源性」廣泛地係指核酸序列與參考核酸序列之間或多肽序列與參考多肽序列之間之類似程度。同源性可為部分或完全的。完全同源性表明核酸或胺基酸序列係相同的。部分同源性核酸或胺基酸序列係與參考核酸或胺基酸序列不相同之核酸或胺基酸序列。同源程度可藉由例如使用國家生物技術信息中心(NCBI)使用默認參數之BlastP軟體進行序列對比來確定。術語「序列一致性」可與「同源性」互換使用。
如本文所用之「宿主細胞」廣泛地係指其中引入有本發明之核酸分子，諸如本發明之重組表現載體之細胞。宿主細胞可為原核細胞(例如大腸桿菌(E. coli))或真核細胞，諸如酵母、昆蟲(例如SF9)、兩棲動物或哺乳動物細胞，諸如CHO、HeLa、HEK-293，例如培養細胞、移植物及活體內細胞。術語「宿主細胞」與「重組宿主細胞」在本文中可互換使用。應瞭解，該等術語不僅係指特定目標細胞，而且係指該細胞之後代或潛在之後代。由於因突變或環境影響可能在下一代中發生某些修飾，但後代實際上並不與親本細胞相同，但仍包括在如本文所用術語之範疇內。
「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性之抗體，其具有其中框架及CDR區源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。在一實施例中，人類單株抗體由融合瘤產生，該融合瘤包括由具有包含與永生化細胞融合之人類重鏈轉基因及輕鏈轉基因之基因體的轉基因非人類動物(例如轉基因小鼠)獲得之B細胞。此包括完全人類單株抗體及其結合物及變異體，例如其與諸如治療劑或診斷劑之效應劑結合。
如本文所用之「人源化抗體」廣泛地係指包括由具有可變區及恆定區之非人類細胞製得之抗體，其已改變為將由人類細胞製得之更密切類似之抗體。例如，藉由改變非人類抗體胺基酸序列從而合併在人類生殖系免疫球蛋白序列中發現之胺基酸。本發明之人源化抗體可包括未經人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)，例如在CDR中。如本文所用之術語「人源化抗體」亦包括其中源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已移植至人類框架序列上之抗體。
如本文所用之「雜交「廣泛地係指互補(包括部分互補)聚核苷酸鏈在該等鏈彼此反平行排列時藉由在互補核苷酸之間形成氫鍵而發生之物理相互作用。
如本文所用之「IgV結構域」及「IgC結構域」廣泛地係指Ig超家族成員結構域。該等結構域對應於具有稱為Ig摺疊之獨特摺疊圖案之結構單元。Ig摺疊包含兩個β薄片之夾層，其各自由5至10個胺基酸之反平行β鏈組成，在大部分(但並非所有)結構域中之兩個薄片之間具有保守之雙硫鍵。Ig、TCR及MHC分子之IgC結構域共用相同類型之序列模式，且在Ig超家族中稱為CI組。其他IgC結構域屬於其他組。IgV結構域亦共用序列模式且稱為V組結構域。IgV結構域比C-結構域長且形成另一對β鏈。
如本文所用之「免疫細胞」廣泛地係指具有造血來源且在免疫反應中發揮作用之細胞。免疫細胞包括(但不限於)淋巴細胞，諸如B細胞及T細胞；天然殺手細胞；樹突細胞及骨髓細胞，諸如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性白血球、肥大細胞、嗜鹼細胞及顆粒球。
如本文所用之「免疫分析」廣泛地係指使用抗體特異性地結合抗原之分析。免疫分析之特徵可在於使用特定抗體之特異性結合特性來分離、標靶及/或定量抗原。
如本文所用之「免疫相關疾病(或病症或病況)」應理解為涵蓋選自包括(但不限於)以下之群的任何疾病病症或病況：與移植物移植排斥反應相關之自體免疫性疾病、發炎性病症及免疫病症，該移植物移植排斥反應諸如器官移植、同種異體幹細胞移植、自體幹細胞移植、骨髓移植及移植物抗宿主疾病之急性及慢性排斥反應。
如本文所用之「免疫反應」廣泛地係指受T細胞共刺激調節影響之T細胞介導及/或B細胞介導之免疫反應。例示性免疫反應包括B細胞反應(例如抗體產生)、T細胞反應(例如細胞激素產生及細胞之細胞毒性)及細胞激素反應性細胞(例如巨噬細胞)之活化。如本文所用之關於免疫反應之術語「下調」包括消減任一或多種免疫反應，而關於免疫反應之術語「上調」包括增加任一或多種免疫反應。將瞭解，上調一種類型之免疫反應可能導致另一種類型之免疫反應相應下調。例如，上調某些細胞激素(例如IL-10)之產生可導致細胞免疫反應下調。
「免疫(Immunologic/immunological/immune)」反應在本文中係指針對接受患者體內之肽的體液(抗體介導)及/或細胞(由抗原特異性T細胞或其分泌產物介導)反應之發展。該反應可為藉由投與免疫原所誘發之主動反應或藉由投與抗體或預致敏T細胞所誘發之被動反應。不希望受單一假定限制，藉由呈現與II類或I類MHC分子締合之多肽抗原決定基分別來活化抗原-特異性CD4 +T輔助細胞及/或CD8 +細胞毒性T細胞來引發細胞免疫反應。反應亦可包涵活化單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、嗜鹼細胞、樹突細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞、嗜酸性白血球，活化或募集嗜中性白血球或先天免疫之其他組分。可藉由增殖分析(CD4 +T細胞)或CTL (細胞毒性T淋巴細胞)分析來確定是否存在細胞介導之免疫反應。體液及細胞反應對免疫原之保護或治療作用的相對貢獻可藉由單獨地自免疫同基因型動物分離抗體及T細胞且量測第二受檢者體內之保護或治療作用來辨別。
「免疫原性劑」或「免疫原」係在視情況結合佐劑投與至哺乳動物時能夠誘發針對其本身之免疫反應的部分。
在本文中可互換使用之「發炎性病症」、「發炎性病況」及/或「發炎」廣泛地係指慢性或急性發炎性疾病，且明確包括發炎性自體免疫性疾病及發炎性過敏性病況。舉例而言，該等病況包括以對有害刺激(諸如病原體、受損細胞或刺激物)之免疫反應失調為特徵之發炎性異常狀況。發炎性病症引起多種人類疾病。在發炎過程中具有病因起源之非免疫疾病包括癌症、動脈粥樣硬化及缺血性心臟病。與發炎相關之病症實例包括：慢性前列腺炎、絲球體腎炎、過敏、骨盆發炎性疾病、再灌注損傷、類肉瘤病、血管炎、間質性膀胱炎、正常補體血症性蕁麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶症候群、鞏膜炎、巨噬細胞活化症候群、貝賽特氏症候群(Behçet’s Syndrome)、PAPA症候群、布勞氏症候群(Blau's Syndrome)、痛風、成人及青少年斯蒂爾氏病(adult and juvenile Still's disease)、冷吡琳病(cryropyrinopathy)、穆克勒-威爾斯症候群(Muckle-Wells syndrome)、家族性寒冷誘發之自體發炎性症候群、新生兒發病多系統發炎性疾病、家族性地中海熱、慢性嬰兒神經系統、皮膚及關節症候群、全身性青少年特發性關節炎、超IgD症候群、施尼茨勒氏症候群(Schnitzler's syndrome)、TNF受體相關週期性症候群(TRAPSP)、齒齦炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰臟炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛風、痛風性關節炎及發炎性皮膚病，選自牛皮癬、異位性皮膚炎、濕疹、酒渣、蕁麻疹及痤瘡組成之群。
如本文所用之「抑制信號」廣泛地係指經由免疫細胞上之抑制性受體分子傳輸之信號。信號經由活化受體(例如經由TCR、CD3、BCR或Fc分子)拮抗信號且例如可導致對以下之抑制作用：第二信使產生；增殖；或免疫細胞中之效應功能，例如減少吞噬作用、抗體產生或細胞之細胞毒性，或導致免疫細胞無法產生介體(例如細胞激素(例如IL-2)及/或過敏反應之介體)；或發生無能。
如本文所用之「經分離」廣泛地係指自其天然產生之初始環境移除之材料，且因此藉由手工自其天然環境發生改變且包括「重組」多肽。經分離之材料可為例如在載體系統中所包括之外源性核酸、在宿主細胞內所含之外源性核酸或已自其初始環境移除且因此手工發生改變之任何材料(例如「經分離之抗體」)。例如，如本文所用之「經分離」或「經純化」廣泛地係指實質上不含細胞材料或來自生物學物質所源自之細胞或組織來源的其他污染性蛋白，或當化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學品之蛋白、DNA、抗體、RNA或其生物活性部分。如本文所用之術語「經分離」係指在不同於化合物天然產生之環境的環境中之所關注化合物(例如聚核苷酸或多肽)，例如諸如藉由將肽濃縮至其在自然界不存在之濃度而自其天然環境分離。「經分離」包括在實質上富集所關注化合物及/或其中所關注化合物部分或實質上經純化之樣品中之化合物。
如本文所用之「經分離抗體」欲係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體(例如，特異性地結合VISTA之經分離抗體)，實質上不含特異性地結合除VISTA以外之抗原之抗體的抗體。此外，經分離之抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
「同型」在本文中係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如IgM或IgG1)。
如本文所用之「K-assoc」或「Ka」廣泛地係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「Kdiss」或「Kd」係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。
如本文所用之術語「K D」欲係指由Kd與Ka之比率(亦即Kd/Ka)獲得且表述為莫耳濃度(M)之解離常數。抗體之K D值可使用此項技術中確定之方法來測定，諸如電漿共振(BIAcore ®)、ELISA及KINEXA。用於測定抗體之K D之較佳方法係藉由使用表面電漿共振，較佳使用生物感應器系統，諸如BIAcore ®系統或藉由ELISA。該等方法通常在25℃或37℃下起作用。當藉由表面電漿共振測定時，用於治療用途之抗體在25℃或37℃下通常將具有50 nM或50 nM以下，或更通常為1nM或1nM以下之K D。
如本文所用之「標記」或「可偵測部分」廣泛地係指藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理方式可偵測之組合物。
如本文所用之「低嚴格性」、「中等嚴格性」、「高嚴格性」或「極高嚴格性條件」廣泛地係指用於核酸雜交及洗滌之條件。用於進行雜交反應之指引可見於Ausubel等人, Short Protocols in Molecular Biology(第5版) John Wiley & Sons, NY (2002)中。例示性之特異性雜交條件包括(但不限於)：(1)低嚴格性雜交條件，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在約45℃下，繼而至少在50℃下在0. 2XSSC，0.1% SDS中洗滌兩次。(對於低嚴格性條件而言，洗滌溫度可增加至55℃)；(2)中等嚴格性雜交條件，在6XSSC中在約45℃下，繼而在60℃下在0.2XSSC、0.1% SDS中洗滌一或多次；(3)高嚴格性雜交條件，在6XSSC中在約45℃下，繼而在65℃下在0.2XSSC、0.1% SDS中洗滌一或多次；及(4)極高嚴格性雜交條件為0.5M磷酸鈉、7% SDS，在65℃下，繼而在65℃下在0.2XSSC及1% SDS中洗滌一或多次。
如本文所用之「哺乳動物」廣泛地係指哺乳類之任何及所有溫血脊椎動物，包括人類，其特徵在於皮膚上覆有毛髮且在雌性中具有產奶乳腺用於哺育幼仔。哺乳動物之實例包括(但不限於)羊駝、犰狳、水豚、貓、駱駝、黑猩猩、南美栗鼠、牛、狗、山羊、大猩猩、倉鼠、馬、人類、狐猴、美洲駝、小鼠、非人類靈長類動物、豬、大鼠、綿羊、鼩鼱、松鼠、貘及田鼠。哺乳動物包括(但不限於)牛科、犬科、馬科、貓科、鼠科、綿羊、豬科、靈長類及囓齒類。哺乳動物亦包括在由位於華盛頓(Washington D. C)之美國國立自然歷史博物館史密森尼學會(National Museum of Natural History, Smithsonian Institution)維持之世界哺乳動物物種上所列之任何及所有彼等哺乳動物。
「多特異性抗體」係指具有2個或2個以上抗原結合區之抗體。此包括雙特異性抗體。該等抗原結合區可結合至不同抗原或相同抗原之不同抗原決定基。
如本文所用之「天然產生之核酸分子」廣泛地係指具有天然存在之核苷酸序列之RNA或DNA分子(例如編碼天然蛋白)。
如本文所用之「核酸」或「核酸序列」廣泛地係指單鏈或雙鏈形式之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，亦即寡核苷酸。該術語亦涵蓋具有合成骨架之核酸樣結構。除非另外指示，否則特定核酸序列亦暗示涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列以及明確指示之序列。術語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸及聚核苷酸可互換使用。
如本文所用之「可操作性地連接」廣泛地係指當兩個DNA片段連接時使得由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框。
如本文所用之「互補位」廣泛地係指識別抗原之抗體部分(例如抗體之抗原結合位點)。互補位可為抗體之Fv區的小區域(例如15至22個胺基酸)且可含有抗體重鏈及輕鏈之部分。參見Goldsby等人，Antigens (第3章) Immunology (第5版) New York: W. H. Freeman and Company, 第57至75頁。
「患者」或「受檢者」或「受者」、「個體」或「受治療個體」在本文中可互換使用，且廣泛地係指需要治療來緩解疾病狀態或預防疾病狀態發生或復發之任何動物。又，如本文所用之「患者」廣泛地係指具有風險因素、疾病史、易感性、症狀及徵象，先前已診斷、存在風險或為疾病患者群體之成員的任何動物。患者可為臨床患者，諸如人類，或獸醫患者，諸如陪伴、家養、家畜、外來或動物園動物。
「多肽」、「肽」及「蛋白」可互換使用且廣泛地係指任何長度之胺基酸殘基之聚合物，而與修飾無關(例如磷酸化或糖基化)。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然產生之胺基酸之類似物或模擬物之胺基酸聚合物以及適用於天然產生之胺基酸聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然產生之胺基酸之人工化學模擬物之胺基酸聚合物以及適用於天然產生之胺基酸聚合物及非天然產生之胺基酸聚合物。多肽可經修飾，例如藉由加成碳水化合物殘基以形成糖蛋白。術語「多肽」、「肽」及「蛋白」明確地包括糖蛋白以及非糖蛋白。
如本文所用之「啟動子」廣泛地係指引導核酸轉錄之核酸序列陣列。如本文所用之啟動子包括接近轉錄起始位點之必要核酸序列，諸如在聚合酶II型啟動子之情形下為TATA元件。啟動子亦視情況包括遠端強化子或抑制子元件，其可位於距轉錄起始位點多達數千個鹼基對處。「構成性」啟動子為在大多數環境及發育條件下具有活性之啟動子。「誘導性」啟動子為在環境或發育調節下具有活性之啟動子。
如本文所用之「預防有效量」廣泛地係指在投與患者用以預防疾病或預防疾病復發時足以實現對疾病或復發之該種預防作用的化合物之量。預防有效量可為有效預防發生徵象及/或症狀之量。「預防有效量」可視疾病及其嚴重性及待治療患者之年齡、體重、醫學史、對病況之易感性及先前已存在之病況而變化。
「預防性疫苗」及/或「預防性疫苗接種」係指用於預防與諸如癌症或傳染性病況之疾病相關之疾病或症狀的疫苗。
如本文所用之「預防」廣泛地係指其中徵象及/或症狀在患者中不存在、處於緩解期或先前在患者中存在之治療過程。預防包括防止疾病在對患者進行疾病治療後發生。另外，預防包括治療可能發生疾病之患者，尤其對疾病易感之患者(例如，存在風險因素或存在發生疾病風險之患者群體的成員)。
如本文所用之關於產物之「重組」廣泛地係指例如細胞或核酸、蛋白或載體之產物，表明該細胞、核酸、蛋白或載體已藉由引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白而經修飾，或細胞源自經如此修飾之細胞。因此，舉例而言，重組細胞表現在天然(非重組)形式之細胞中未發現之基因或表現經異常表現、表現不足或完全未表現之天然基因。
如本文所用之術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如(a)自對於人類免疫球蛋白基因或由其製備之融合瘤而言轉基因或轉染色體之動物(例如小鼠)分離之抗體(下文進一步描述)，(b)自經轉型用以表現人類抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體，(c)自重組之組合人類抗體庫分離之抗體，及(d)藉由包涵將人類免疫球蛋白基因序列拼接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有可變區，其中框架區及CDR區源自人類生殖系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外突變(或當使用對於人類Ig序列而言為轉基因之動物時，為活體內體細胞突變)，且因此重組抗體之V H及V L區之胺基酸序列為儘管源自人類生殖系VH及VL序列且與其相關，但在活體內人類抗體生殖系譜系中並不天然存在之序列。
如本文所用之「信號序列」或「信號肽」廣泛地係指在分泌型且膜結合之多肽之N末端出現且含有大量疏水性胺基酸殘基之含有約15個或15個以上胺基酸之肽。例如，信號序列含有至少約10至30個胺基酸殘基、較佳約15至25個胺基酸殘基、更佳約18至20個胺基酸殘基且甚至更佳約19個胺基酸殘基，且具有至少約35-65%、較佳約38-50%且更佳約40-45%之疏水性胺基酸殘基(例如纈胺酸、白胺酸、異白胺酸或苯丙胺酸)。「信號序列」(此項技術中亦稱為「信號肽」)用以將含有該序列之多肽引導至脂質雙層且暗自裂解。
如本文所用之「特異性地(或選擇性地)結合」至抗體或「特異性地(或選擇性地)與……具有免疫反應性」或「特異性地相互作用或結合」廣泛地係指蛋白或肽(其他抗原決定基)，在一些實施例中係指決定在蛋白或其他生物體之異源群體中存在蛋白之結合反應。例如，在指定之免疫分析條件下，指定之抗體比背景(非特異性信號)至少大兩倍地結合至特定蛋白且實質上並未顯著量地結合至樣品中存在之其他蛋白。特異性或選擇性反應通常將為背景信號或雜訊之至少兩倍，且更通常為大於約10倍至100倍之背景。
如本文所用之「特異性地可雜交」及「互補」廣泛地係指核酸可藉由傳統之沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非傳統類型而與另一核酸序列形成氫鍵。核酸分子與其互補序列之結合自由能足以允許核酸進行其相關功能，例如RNAi活性。此項技術中熟知對核酸分子之結合自由能的測定。(參見例如Turner等人 CSH Symp. Quant. Biol. LII: 123-33 (1987)；Frier等人 PNAS83: 9373-77 1986)；Turner等人 J. Am. Chem. Soc. 109:3783-85 (1987))。互補百分比指示可與第二核酸序列形成氫鍵(例如沃森-克里克鹼基配對)之核酸分子中連續殘基的百分比(例如10個中約至少5個、6個、7個、8個、9個、10個，即約至少50%、60%、70%、80%、90%及100%互補，包括在內)。「完美互補」或100%互補廣泛地係指核酸序列中之所有連續殘基與第二核酸序列中相同數目之連續殘基氫鍵結。
「實質性互補」係指展示約至少90%互補性之聚核苷酸鏈，除了被選擇為非互補之聚核苷酸鏈區域(諸如懸垂物)以外。特異性結合需要足夠程度之互補性以避免寡聚體化合物與非標靶序列在需要特異性結合之條件下(亦即在活體內分析或治療性處理情形下之生理學條件下或在活體外分析情形下在進行分析之條件下)之非特異性結合。非標靶序列通常可存在至少5個核苷酸不同。
如本文所用之疾病之「徵象」廣泛地係指指示疾病、在患者檢查中可發現之任何異常；與作為疾病主觀適應症之症狀相反的疾病之客觀適應症。
如本文所用之「固體支撐物」、「支撐物」及「基質」廣泛地係指提供另一材料可附接之固體或半固體結構的任何材料，包括(但不限於)光滑支撐物(例如金屬、玻璃、塑料、矽及陶瓷表面)以及紋理化及多孔材料。
如本文所用之VISTA之「可溶性胞外域(ECD)」或「胞外域」或「可溶性VISTA蛋白/分子」意謂非細胞表面結合之VISTA分子或其任何部分，包括(但不限於)：VISTA融合蛋白或VISTA ECD-Ig融合蛋白(其中VISTA之胞外域或其片段與免疫球蛋白(Ig)部分融合，使得融合分子可溶)或其片段及衍生物；VISTA之胞外域與一部分生物活性或化學活性蛋白融合或接合之蛋白，諸如乳頭瘤病毒E7基因產物、黑素瘤相關抗原p97或HIV env蛋白或其片段及衍生物；雜合(嵌合)融合蛋白(諸如VISTA-Ig)或其片段及衍生物。該等融合蛋白在下文中更詳細描述。
「可溶性VISTA蛋白/分子」在本文中亦包括跨膜結構域經移除以使得蛋白可溶之VISTA分子或其片段及衍生物；其片段、部分或衍生物及可溶性VISTA突變體分子。在根據本發明之至少一些實施例之方法中使用之可溶性VISTA分子可包括或不包括信號(前導)肽序列。
在本文中關於治療或診斷之上下文中，「受檢者」或「患者」或「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、奶牛、小雞、兩棲動物、爬行動物等，亦即適合根據本發明治療之任一者，包括(但不限於)禽類及哺乳動物受檢者且較佳為哺乳動物。需要根據本發明治療之任何哺乳動物受檢者均為合適的。根據本發明可治療兩種性別且處於任何發育階段之人類受檢者(亦即新生兒、嬰兒、青少年、青春期及成人)。本發明亦可在動物受檢者，尤其哺乳動物受檢者中進行，諸如小鼠、大鼠、狗、貓、牛、山羊、綿羊及馬，以用於獸醫學目的且用於藥物篩檢及藥物研發目的。「受檢者」與「個體」及「患者」可互換使用。
如本文所用之「實質上不含化學前驅體或其他化學品」廣泛地係指VISTA蛋白製劑，其中蛋白自蛋白合成中所包涵之化學前驅體或其他化學品中分離。在一實施例中，語言表述「實質上不含化學前驅體或其他化學品」包括具有小於約30% (以乾重量計)化學前驅體或非VISTA化學品、更佳小於約20%化學前驅體或非VISTA化學品、又更佳小於約10%化學前驅體或非VISTA化學品且最佳小於約5%化學前驅體或非VISTA化學品之VISTA蛋白製劑。
如本文所用之疾病之「症狀」廣泛地係指患者所經歷且指示疾病之任何病態現象或偏離正常之結構、功能或感覺。
如本文所用之「T細胞」廣泛地係指CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。術語T細胞亦包括T輔助1型T細胞及T輔助2型T細胞。
如本文所用之「治療(Therapy/therapeutic/treating/treatment)」廣泛地係指治療疾病、阻止或減少疾病或其臨床症狀之發展及/或緩解疾病，致使疾病或其臨床症狀消退。治療涵蓋預防、治療、補救、減少、緩解及/或減輕疾病、徵象及/或疾病之症狀。治療涵蓋緩解正持續疾病徵象及/或症狀(例如發炎、疼痛)之患者的徵象及/或症。治療亦涵蓋「預防」。用於治療目的之術語「減少」廣泛地係指臨床上顯著減少徵象及/或症狀。治療包括治療反覆或復發之徵象及/或症狀(例如發炎、疼痛)。治療涵蓋(但不限於)任意次數地排除徵象及/或症狀外觀以及減少現有的徵象及/或症狀及消除現有的徵象及/或症狀。治療包括治療慢性疾病(「維持」)及急性疾病。例如，治療包括治療或預防徵象及/或症狀(例如發炎、疼痛)的反覆或復發。
如本文所用之「Treg細胞」(有時亦稱為抑制因子T細胞或誘導性Treg細胞或iTreg)係指調節免疫系統且維持對自身抗原之耐受性且可終止自體免疫性疾病之T細胞亞群。Foxp3 +CD4 +CD25 +調節性T細胞(Treg)對於在正常條件下維持外周耐受係重要的。
如本文所用之「跨膜結構域」廣泛地係指橫跨質膜之長度為約15個胺基酸殘基之胺基酸序列。跨膜結構域更佳包括約至少20、25、30、35、40或45個胺基酸殘基且橫跨質膜。跨膜結構域富集疏水性殘基且通常具有a-螺旋結構。在一實施例中，跨膜結構域之至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或95%以上之胺基酸為疏水性的，例如白胺酸、異白胺酸、酪胺酸或色胺酸。跨膜結構域例如在Zagotta等人 Annu. Rev. Neurosci. 19:235-263 (1996)中描述。
如本文所用之「轉基因動物」廣泛地係指非人類動物，較佳為哺乳動物，更佳為小鼠，其中動物之一或多個細胞包括「轉基因」。術語「轉基因」係指整合至產生轉基因動物之細胞基因體中及保留在成熟動物基因體中例如用於引導經編碼之基因產物在轉基因動物之一或多種細胞類型或組織中表現的外源性DNA。
如本文所用之「無反應性」廣泛地係指免疫細胞對刺激，例如及對經由活化受體或細胞激素之刺激的折射性。無反應性例如可因暴露於免疫抑止劑或高劑量之抗原而發生。
如本文所用之「可變區」或「VR」廣泛地係指在抗體與抗原之結合中直接涉及之抗體中的每一對輕鏈及重鏈中的結構域。每個重鏈一端具有可變結構域(V H)，之後為多個恆定域。每個輕鏈一端具有可變結構域(V L)且另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準且輕鏈可變結構域與重鏈之可變結構域對準。
如本文所用之「載體」廣泛地係指能夠運輸其所連接之另一核酸分子的核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指其中可接合其他DNA區段之圓形雙鏈DNA環。另一種類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合至病毒基因體中。某些載體能夠在其引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製來源之細菌載體及附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)在引入宿主細胞時整合至宿主細胞之基因體中，且由此與宿主基因體一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作性地連接之基因的表現。載體在本文中稱為「重組表現載體」或簡稱為「表現載體」。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常為質體之形式。在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用，因為質體係最常用形式之載體。然而，本發明欲包括該等其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)，其發揮等效功能。該等技術及程序通常根據此項技術中熟知且如在本說明書通篇中所引用及論述之各種通用及更具體之參考文獻中所述之習知方法來進行。參見例如Sambrook等人 Molec. Cloning: Lab. Manual[第3版] Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)。標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養與轉型(例如電穿孔、脂轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明或如此項技術中通常實施或如本文中所述來進行。
儘管已定義本申請案中所用之某些術語及短語，下文進一步描述本發明所涵蓋之抗-VISTA抗體及抗原結合抗體片段及其產生方法及用途。
本發明係關於包含結合至T細胞活化之V結構域Ig抑制因子(VISTA)之抗原結合區的抗體及抗體片段。VISTA為負性抑止免疫反應之檢查點調節因子。參見Wang等人, 「VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses,」 J. Exp. Med., 208(3) 577-92 (2011)。此蛋白在正常人類嗜中性白血球、單核細胞及T細胞子集上表現。另外，食蟹猴細胞以與正常人類細胞類似之模式表現VISTA。VISTA亦在例如癌症患者之外周血液細胞中表現。
根據本發明，拮抗劑抗-VISTA抗體或抗體片段與VISTA之結合將拮抗VISTA對免疫性之至少一種作用，由此抑止VISTA對免疫性之抑止作用，例如T細胞免疫及/或細胞激素表現。相比而言，根據本發明，促效劑抗-VISTA抗體或抗體片段與VISTA之結合將刺激、引發或模擬VISTA對免疫性之至少一種作用，由此促進VISTA對免疫性之至少一種抑止作用，例如抑止T細胞免疫或抑止特異性促炎性細胞激素之表現或其對某些化學引誘劑及趨化因子之表現的促進作用。
該等抗體片段包括例如Fab、F(ab') 2及scFv抗體片段。該等抗體或抗體片段可包含抗體恆定區或其片段或變異體。該等抗體及抗體片段包括結合至在造血及其他細胞(例如骨髓細胞及/或淋巴細胞、單核細胞、嗜中性白血球、T細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞、腫瘤細胞)上及/或在腫瘤微環境(TME)中表現之VISTA蛋白的彼等抗體及抗體片段。腫瘤微環境係腫瘤之細胞環境。其可包括周圍免疫細胞、纖維母細胞、血管、其他細胞、信號轉導分子及細胞外基質。
阻斷或抑制VISTA之作用的抗體可用於增強人類免疫反應，尤其對惡性腫瘤及感染之免疫反應。相比而言，刺激VISTA(諸如可溶性VISTA)之分子(例如VISTA-Ig)及本發明之促效劑抗人類VISTA抗體及片段可用於抑止不需要之人類免疫反應(諸如自體免疫、過敏性、GVHD、敗血症)或不利之發炎免疫反應。
本申請提供新穎拮抗劑及促效劑抗人類VISTA抗體，包括包含與具有圖4中所示序列之任何抗人類VISTA抗體相同之CDR的彼等抗體。儘管在本發明之前，文獻中已報導多種拮抗劑抗人類VISTA抗體，但尚未報導促效性抗人類VISTA抗體或抗體片段。
如下文之實驗性實例中所揭示，本發明人初始產生了2種源自鼠科抗人類VISTA抗體(具有圖4中之序列之1E8)之嵌合抗人類VISTA抗體，其分別含有未經修飾之IgG2人類恆定區或IgG2恆定區，其中位於κ鏈之127位之半胱胺酸殘基變為絲胺酸殘基。如本文引用之實例及圖中所示，發現兩種抗體均刺激或模擬VISTA對免疫性之抑止作用，此至少係基於(i)其減少某些促炎性細胞激素(諸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-17、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及腫瘤壞死因子-α (TNF-α))之表現以及減少某些趨化因子或化學引誘劑(諸如KC (角質細胞衍生之趨化因子)或MIP-2 (巨噬細胞發炎性蛋白-2))之表現；(ii)抑止GVHD模型中之T細胞活性；及(iii)抑止CD3驅使之T細胞反應的能力。
另外，在分離該2種促效劑抗體之後，使用類似方法已獲得另外10種含有人類IgG2恆定區或Fc區之嵌合促效劑抗人類VISTA抗體。該等抗體源自在本文中稱為GG8、VSTB95 (INX903)、VSTB103 (INX904)、VSTB53 (INX905)、VSTB92(INX908)、VSTB50(INX900)、VSTB56(INX901)、VSTB63(INX902)、VSTB54(INX906)及VSTB66(INX907)(具有圖4中之序列)之抗體。
特定而言，該等嵌合抗人類VISTA抗體具有圖4中所示之可變序列及人類IgG2恆定區。如下文彙總表1及2中所報導，當藉由使用抗體分箱(antibody binning)評估時，發現該等抗人類VISTA抗體結合至2種不同之抗原決定基組，指定為組1及組2。如圖4中所示，對應於組2之抗原決定基包括在人類VISTA中存在之2種不同肽(亦即NLTLLDSGL及VQTGKDAPSNC)中之殘基。
如下文表1及2中所示，發現該等12種不同之抗人類VISTA抗體在至少一種免疫抑止模型具有免疫抑止性且多種抗體在若干種免疫抑止模型中具有免疫抑止性。特定而言，INX905、INX908、INX901、INX902及INX906在2種不同之分析格式中展示免疫抑止性。儘管所有該等抗體均具有免疫抑止性且似乎引發、促進或刺激VISTA之免疫抑止作用，但INX901、INX902及INX906及INX908似乎最具免疫抑止性。
又，包含含有圖4中所示之其他抗-VISTA抗體之可變序列的人類IgG2恆定域之其他嵌合抗人類VISTA抗體將根據其免疫抑止特性及其刺激或模擬人類VISTA之免疫抑止及其他作用之能力來進行篩檢。基於迄今獲得之結果，此篩檢應識別其他促效劑抗人類VISTA抗體，尤其結合相同抗原決定基之彼等抗體。另外，根據本發明之促效劑抗人類VISTA抗體已證實在多種自體免疫及發炎性動物疾病模型中有效(免疫抑止)，包括關節炎、狼瘡或SLE、GVHD、發炎性腸病(IBD)或結腸炎、慢性及急性感染性疾病或肝毒性及牛皮癬動物模型。基於以上內容，本發明之抗人類VISTA促效劑抗體應適用於治療性及預防性地治療自體免疫、過敏性及發炎性病況。
如所示，具有圖4中所示序列之嵌合IgG2抗人類VISTA抗體已展示在不同免疫抑止模型中具有免疫抑止性。此外，該等抗體以特異性之免疫調節方式引發該等免疫抑止作用，而非藉由實現損耗特異性類型之T細胞或藉由一般而言之損耗T細胞。
如實例中進一步所示，鉸鏈區中含有突變之嵌合IgG2促效性抗人類VISTA抗體對免疫性引發實質上相同之抑止作用，亦即IgG2恆定區內之突變在測試實驗條件下似乎並未引發對抑止作用的增強。相反，IgG2A與IgG2 B兩種形式及其混合物引發相同之免疫抑止作用。另外，基於實例中揭示之實驗，似乎FcγR結合可有助於本發明之抗人類VISTA抗體之促效劑特性。特定而言，發現包涵靜默IgG2恆定區消除了所測試促效劑抗體之免疫抑止特性。基於該等結果，假定一或多個FcγR可影響該等抗體之促效性特性且特定而言假定在本發明之促效劑抗體之促效劑特性中可能涉及FcγRIIA (CD32或CD32A)或FcγRIIB (CD32B)結合。
使用該等相同方法，預期可獲得其他促效劑抗人類VISTA IgG2抗體，例如源自具有圖4中所示序列之抗人類VISTA抗體之其他抗體。如所提及，迄今已獲得12種促效劑抗人類VISTA抗體，包括具有圖4中所含序列之彼等抗體。基於該等結果，預期可產生其他促效性抗人類VISTA抗體且展示免疫抑止性。亦預期可產生結合至相同或重疊抗原決定基及/或與含有圖4中所示序列之任何抗體競爭之其他促效性抗人類VISTA抗體。在例示性實施例中，該等抗體將結合至對應於組1或組2抗體之抗原決定基或將與該等抗體競爭結合至人類VISTA。
此項技術中已知用於識別抗體所結合之特異性抗原決定基之方法。在操作實例中，申請人揭示對由根據本發明之多種抗-VISTA抗體所結合之抗原決定基的說明。因此，在例示性實施例中，根據本發明之促效劑抗人類VISTA抗體將包含A形式、B形式或上述之混合物的IgG2恆定區或其片段。在例示性實施例中，該等抗體將結合至一或多個FcγR，例如其將結合至與完整或野生型人類IgG2 Fc區相同之FcγR。在其他例示性實施例中，抗體將結合至CD32 (CD32A及/或CD32B)。此可藉由使用結合至CD32 (CD32A及/或CD32B)之野生型或經修飾IgG2恆定區來實現。此外，促效劑抗體可經修飾以合併另一多肽，諸如結合至FcγR (諸如CD32A及/或CD32B)之另一Fc多肽或抗原結合區。
本發明之促效劑抗人類VISTA抗體中所含之IgG2 Fc或恆定區視情況可經修飾，例如用以改變效應功能，例如用以改變FcR結合、FcRN結合、補體結合、糖基化及其類似功能。特定而言，本發明之促效劑抗人類VISTA抗體中所含之IgG2 Fc或恆定區視情況可藉由轉化位於27位之半胱胺酸或進一步視情況藉由將例如鉸鏈區中之另一半胱胺酸殘基或其他殘基轉化為另一胺基酸(例如絲胺酸)來進行修飾。下文揭示其他可能之Fc修飾。
該等VISTA促效劑抗體可用於治療或預防疾病病況或用於治療或減少、緩解在治療或預防病況中與其相關之病理學作用(例如發炎)，其中抑止T細胞免疫或表現促炎性細胞激素及/或增加趨化因子及化學引誘劑之表現在治療或預防上均係有益的。該等病況特定而言包括自體免疫、過敏、發炎性病症、敗血症、GVHD及用於抑制針對移植細胞、組織或器官之非吾人所樂見之T細胞免疫反應，諸如CAR-T細胞或基因療法構築體或其所含之細胞。
如所提及，可使用根據本發明之促效劑抗人類VISTA抗體治療性或預防性地治療之例示性病況包括自體免疫病況、過敏性病況、發炎性病況、GVHD、移植及敗血症。如所提及，根據本發明之促效劑抗人類VISTA抗體已展示治療有效且在多種動物疾病模型中具有免疫抑止性，該等動物疾病模型包括關節炎、發炎性腸病(IBD)、狼瘡、GVHD、慢性急性感染/肝毒性及牛皮癬疾病模型。因此，本發明之抗體應良好適用於治療病況，其中抑止免疫性，尤其T細胞免疫在治療上係需要的。 A. 促效性或拮抗性抗人類VISTA抗體及片段在治療及診斷中之用途
根據本發明之含有促效劑之組合物可用於抑制T細胞免疫及用於治療此組合物在其中治療有利之病況，諸如自體免疫性、過敏性或發炎性病況。該等組合物將包含在有需要之受檢者體內有效抑止T細胞活化或增殖或VISTA之細胞激素表現或其他作用之量的根據本發明之促效劑抗體或抗體片段。該等自體免疫、發炎性及過敏性病況包括例如關節炎病況，諸如RA、牛皮癬性關節炎、牛皮癬、硬皮病、多發性硬化、狼瘡、IBD、ITP、糖尿病、GVHD、類肉瘤病、過敏性哮喘、肝炎相關之肝毒性，且用於抑制針對移植細胞、組織或器官之非吾人所樂見之T細胞免疫反應，諸如CAR-T細胞或基因療法構築體或其所含之細胞及其類似物。
本發明之抗體可單獨或與其他治療劑(尤其其他免疫抑止劑分子)組合用於其中之特定病況包括後天性免疫缺失症(AIDS)、後天性脾萎縮、急性前部葡萄膜炎、急性播散性腦脊髓炎(ADEM)、急性痛風性關節炎、急性壞死性出血性白質腦炎、急性或慢性鼻竇炎、急性化膿性腦膜炎(或其他中樞神經系統發炎性病症)、急性嚴重發炎、阿狄森氏病(Addison's disease)、腎上腺炎、成人發作型糖尿病(II型糖尿病)、成人發作型特發性副甲狀腺低能症(AOIH)、無γ球蛋白血症、無顆粒白血球增多症、血管炎(包括血管炎，視情況為大血管血管炎，視情況為風濕性多肌痛及巨細胞(高安氏(Takayasu's))關節炎)、過敏性病況、過敏性接觸性皮炎、過敏性皮炎、過敏性肉芽腫血管炎、過敏性過敏病症、過敏性神經炎、過敏性反應、斑禿、全禿、奧爾波特氏症候群(Alport's syndrome)、肺泡炎(視情況為過敏性肺泡炎或纖維性肺泡炎)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、類澱粉變性病、肌萎縮性側索硬化(ALS；盧伽雷氏病(Lou Gehrig's disease))、嗜酸性粒細胞相關病症(視情況為嗜酸性粒細胞增多症)、過敏性反應、強直性脊椎炎、血管擴張、抗體介導之腎炎、抗-GBM/抗TBM腎炎、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體症候群、抗磷脂質症候群(APS)、口瘡、口瘡口炎、再生不良性貧血、心律不整、動脈硬化、動脈硬化性病症、關節炎(視情況為類風濕性關節炎，諸如急性關節炎或慢性類風濕性關節炎)、慢性進行性關節炎(arthritis chronica progrediente)、變形性關節炎、蛔蟲病、麯黴瘤、含有嗜酸性白血球之肉芽腫瘤、麯黴病、無精子產生症(aspermiogenegenese)、哮喘(視情況為細支氣管哮喘、支氣管性哮喘或自體免疫哮喘)、毛細血管擴張性失調、共濟失調硬化症、動脈粥樣硬化、自閉症、自體免疫血管性水腫、自體免疫再生不良性貧血、自體免疫萎縮性胃炎、自體免疫糖尿病、睪丸及卵巢之自體免疫疾病(包括自體免疫睪丸炎及卵巢炎)、與膠原病相關之自體免疫病症、自體免疫自主神經障礙、自體免疫耳病(視情況為自體免疫內耳病(AGED))、自體免疫內分泌疾病(包括甲狀腺炎，諸如自體免疫甲狀腺炎)、自體免疫腸病症候群、自體免疫性腺衰竭、自體免疫聽覺損失、自體免疫溶血反應、自體免疫肝炎、自體免疫肝病、自體免疫高脂血症、自體免疫免疫缺乏、自體免疫內耳病(AIED)、自體免疫心肌炎、自體免疫嗜中性球減少症、自體免疫胰臟炎、自體免疫多內分泌病變、自體免疫I型多腺性症候群、自體免疫視網膜病變、自體免疫血小板減少性紫癜(ATP)、自體免疫甲狀腺疾病、自體免疫蕁麻疹、自體免疫介導之胃腸疾病、軸突及神經元神經病、巴洛病(Balo disease)、貝賽特氏病(Behçet’s disease)、良性家族性及缺血性再灌注損傷、良性淋巴細胞血管炎、伯格氏病(Berger's disease)(IgA腎病變)、養鳥人肺、失明、伯克氏病(Boeck's disease)、閉塞性細支氣管炎(非移植)相應的NSIP、支氣管炎、支氣管肺麴菌病、布魯頓氏症候群(Bruton's syndrome)、大皰性類天疱瘡、卡普蘭氏症候群(Caplan's syndrome)、心肌症、心血管缺血、卡斯特曼氏症候群(Castleman's syndrome)、乳糜瀉、口炎性腹瀉(麩質性腸病)、小腦變性、腦缺血及伴隨有血管形成之疾病、查加斯病(Chagas disease)、通道病(視情況為癲癇、CNS之通道病)、脈絡膜視網膜炎、脈絡膜炎、自體免疫血液病、慢性活動性肝炎或自體免疫慢性活動性肝炎、慢性接觸性皮炎、慢性嗜酸細胞性肺炎、慢性疲勞症候群、慢性肝炎、慢性過敏性肺炎、慢性發炎性關節炎、慢性發炎性脫髓鞘性多發性神經病(CIDP)、慢性難治性發炎、慢性皮膚黏膜念珠菌病、慢性神經病、視情況IgM多發性神經病或IgM介導之神經病、慢性阻塞性氣道疾病、慢性肺發炎性疾病、慢性復發性多灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis))或亞急性甲狀腺炎、查格-施特勞斯症候群(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性類天疱瘡/良性黏膜類天疱瘡、CNS發炎性病症、CNS血管炎、乳糜瀉、科幹症候群(Cogan's syndrome)、冷凝集素病、息肉狀結腸炎、結腸炎(諸如潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis))、潰瘍性結腸炎(colitis ulcerosa)、膠原性結腸炎、涉及T細胞浸潤及慢性發炎反應之病況、先天性心臟傳導阻滯、先天性風疹感染、庫姆氏試驗陽性貧血(Coombs positive anemia)、冠狀動脈疾病、柯薩奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST症候群(鈣質沈著、雷諾現象(Raynaud's phenomenon))、克羅恩氏病(Crohn's disease)、冷凝球蛋白血症、庫欣氏症候群(Cushing's syndrome)、睫狀體炎(視情況為慢性睫狀體炎、異時性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或富克斯睫狀體炎(Fuch's cyclitis)、囊腫性纖維化、細胞激素誘發之毒性、失聰、退化性關節炎、脫髓鞘病(視情況為自體免疫脫髓鞘病、脫髓鞘神經病)、登革病、疱疹樣皮炎及異位性皮炎、皮炎(包括接觸性皮炎)、皮肌炎、伴有急性發炎組分之皮膚病、德維克氏病(Devic's disease)(視神經脊髓炎)、糖尿病性大動脈病症、糖尿病性腎病變、糖尿病性視網膜病變、先天性純紅細胞再生障礙性貧血(Diamond Blackfan anemia)、瀰漫性間質性肺纖維化、擴張型心肌症、盤狀狼瘡、涉及白血球滲出之疾病、卓斯勒症候群(Dressler's syndrome)、掌腱膜攣縮症(Dupuytren's contracture)、埃可病毒感染、濕疹(包括過敏性或異位性濕疹)、腦炎(諸如拉斯姆森氏腦炎(Rasmussen's encephalitis)及邊緣及/或腦幹腦炎)、腦脊髓炎(視情況為過敏性腦脊髓炎或腦脊髓炎過敏及實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE))、動脈內增生症、心內膜炎、內分泌性眼病、子宮內膜異位症、心內膜心肌纖維化、晶狀體過敏性眼內炎(endophthalmia phacoanaphylactica)、眼內炎、過敏性腸炎、嗜酸性粒細胞增多-肌痛症候群、嗜酸性筋膜炎、流行性角膜結膜炎、後天性水皰性表皮鬆解症(EBA)、外鞏膜、表層鞏膜炎、艾伯斯坦-巴爾病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、持久性隆起紅斑、多形性紅斑、麻風結節性紅斑、結節性紅斑、胎兒紅血球母細胞增多症、食道運動功能障礙、特發性混合型冷球蛋白血症、篩骨、伊文氏症候群(Evan's syndrome)、實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)、因子VIII缺失症、農夫肺、發燒肌痛症、費爾蒂症候群(Felty's syndrome)、纖維肌痛、纖維性肺泡炎、絲蟲病、局灶節段性腎小球硬化症(FSGS)、食物中毒、前額、胃萎縮、巨細胞關節炎(顳關節炎)、巨細胞肝炎、巨細胞多肌痛、腎小球腎炎、絲球體腎炎(GN)(其伴有及不伴有腎病症候群，諸如慢性或急性絲球體腎炎(例如原發性GN))、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、痛風性關節炎、顆粒球輸血相關症候群、肉芽腫病(包括淋巴瘤樣肉芽腫病、伴有多血管炎之肉芽腫病(GPA)、肉芽腫葡萄膜炎)、格里夫氏病(Grave's disease)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、滴狀牛皮癬、血紅蛋白尿症發作(hemoglobinuria paroxysmatica)、黑曼氏病(Hamman-Rich's disease)、橋本氏病、橋本氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、血色素沈著症、溶血性貧血或免疫溶血性貧血(包括自體免疫溶血性貧血(AIHA))、溶血性貧血、血友病A、亨-舒氏紫癜(Henoch-Schönlein purpura)、妊娠疱疹、人類免疫缺乏病毒(HIV)感染、痛覺過敏、低伽瑪球蛋白血症、性腺功能低下症、副甲狀腺低能症、特發性尿崩症、特發性面癱、特發性甲狀腺低能症、特發性IgA腎病變、特發性膜質GN或特發性膜質腎病變、特發性腎臟症候群、特發性肺纖維化、特發性口炎性腹瀉、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病變、IgE介導之疾病(視情況為過敏性反應及過敏性或異位性鼻炎)、IgG4相關硬化病、區域性迴腸炎、免疫複合型腎炎、與由細胞激素及T-淋巴細胞介導之急性及延遲過敏相關之免疫反應、免疫介導之GN、免疫調節脂蛋白(包括成人或急性呼吸窘迫症候群(ARDS))、包涵體肌炎、感染性關節炎、由於抗精子抗體引起之不孕症、整個或部分葡萄膜發炎、發炎性腸病(IBD)、發炎性過度增殖皮膚病、發炎性肌病、胰島素依賴性糖尿病(1型)、胰島炎、間質性膀胱炎、間質性肺病、間質性肺纖維化、虹膜炎、缺血性再灌注症、關節發炎、青少年關節炎、青少年皮肌炎、青少年糖尿病、青少年發作型(I型)糖尿病(包括小兒胰島素依賴性糖尿病(IDDM))、青少年發作型類風濕性關節炎、川崎症候群(Kawasaki syndrome)、乾性角膜結膜炎、錐蟲病(kypanosomiasis)、蘭伯特-伊頓症候群(Lambert-Eaton syndrome)、利什曼病(leishmaniasis)、麻風病、白細胞減少症、白細胞黏附缺陷症、白細胞破裂性血管炎、白血球減少症、扁平苔蘚、硬化性苔蘚、木樣結膜炎、線性IgA皮膚病、線性IgA病(LAD)、呂弗勒氏症候群(Loffler's syndrome)、狼瘡樣肝炎、狼瘡(包括腎炎、腦炎、兒科、非腎性、腎外、盤狀、禿頭症)、狼瘡(SLE)、播散性紅斑狼瘡、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、萊姆病(Lyme disease)、淋巴樣間質性肺炎、瘧疾、雄性及雌性自體免疫性不育症、上頜骨、中血管炎(包括川崎氏病及結節性多動脈炎)、膜-或膜質增殖性GN (MPGN)(包括I型及II型以及快速進行性GN)、膜質GN (膜質腎病變)、美尼爾氏病(Meniere's disease)、腦膜炎、顯微鏡結腸炎、顯微鏡多血管炎、偏頭痛、微小病變性腎病、混合性結締組織病(MCTD)、傳染性單核細胞增多症、蠶食性角膜潰瘍(Mooren's ulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多灶性運動神經病、多發性內分泌不足、多器官損傷症候群(諸如敗血症、外傷或出血繼發之彼等多器官損傷症候群)、多器官損傷症候群、多發性硬化(MS)(諸如脊髓-眼睛MS)、多發性硬化、流行性腮腺炎、肌肉失常、重症肌無力(諸如胸腺瘤相關重症肌無力)、重症肌無力、心肌炎、肌炎、發作性睡病、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎及自體免疫發炎性腸病、壞死性、皮膚性或過敏性血管炎、新生兒狼瘡症候群(NLE)、腎病、腎病症候群、神經病、視神經脊髓炎(德維克病(Devic's))、視神經脊髓炎、神經性肌強直、嗜中性球減少症、非癌性淋巴球增多症、非肉芽腫葡萄膜炎、非惡性胸腺瘤、眼睛及眼眶發炎性病症、眼部疤痕性類天疱瘡、卵巢炎、交感性眼炎、斜視性眼陣攣-肌陣攣症候群(OMS)、斜視性眼陣攣或斜視性眼陣攣肌陣攣症候群(OMS)及感覺神經病、視神經炎或肉芽腫性唇炎、骨關節炎、復發性風濕病、胰臟炎、全血細胞減少症、PANDAS (與鏈球菌相關之小兒科自體免疫神經精神病)、副贅生性小腦變性、副贅生性症候群、副贅生性症候群(包括神經系統副贅生性症候群，視情況為蘭伯特-伊頓肌無力症候群或伊頓-蘭伯特症候群)、寄生蟲病(諸如利什曼原蟲病(Leishmania))、陣發性夜間血紅素尿(PNH)、帕-羅二氏症候群(Parry Romberg syndrome)、睫狀體平坦部炎(外周葡萄膜炎)、帕爾森-特納症候群(Parsonnage-Turner syndrome)、細小病毒感染、類天疱瘡(諸如大皰性類天疱瘡及皮膚類天疱瘡)、天疱瘡(包括尋常天疱瘡)、紅斑性天疱瘡、落葉性天疱瘡、天疱瘡黏液-膜類天疱瘡、天疱瘡、消化性潰瘍、週期性麻痹、外周神經病、靜脈周圍腦脊髓炎、惡性貧血(pernicious anemia/anemia perniciosa)、惡性貧血、晶狀體抗原性葡萄膜炎、肝硬變、POEMS症候群、結節性多動脈炎(I型、II型及III型)、原發性慢性多關節炎、多軟骨炎(例如難治性或復發性多軟骨炎)、多內分泌自體免疫性疾病、多內分泌不足、多腺體症候群(視情況為自體免疫多腺體症候群(或多腺體內分泌病變症候群)、風濕性多肌痛、多肌炎、多肌炎/皮肌炎、多發性神經病、急性多發性神經根炎(polyradiculitis acuta)、賁門切開術後症候群、後葡萄膜炎或自體免疫葡萄膜炎、心肌梗塞後症候群、心包切開術後症候群、鏈球菌感染後腎炎、疫苗接種後症候群、早老性癡呆、原發性膽汁性肝硬化、原發性甲狀腺低能症、原發性特發性黏液腺瘤、原發性淋巴球增多症(其包括單株B細胞淋巴球增多症，視情況為良性單株丙種球蛋白症及意義未定之單株丙種球蛋白症)、MGUS、原發性黏液腺瘤、原發進行型MS (PPMS)及復發緩解型MS (RRMS)、原發性硬化性膽管炎、孕酮性皮炎、進行性全身性硬化、增殖性關節炎、牛皮癬(諸如斑塊狀牛皮癬)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、肺泡蛋白沈積症、肺浸潤嗜酸性粒細胞增多症、純紅細胞性貧血或發育不全(PRCA)、純紅細胞性發育不全、化膿性或非化膿性鼻竇炎、膿皰性牛皮癬及指甲之牛皮癬、腎盂炎、壞疽性膿皮病、奎爾萬氏甲狀腺炎(Quervain's)、雷諾現象、反應性關節炎、復發性流產、血壓反應降低、交感神經反射障礙症、難治性口炎性腹瀉、瑞特病或症候群(Reiter's disease or syndrome)、復發性多軟骨炎、心肌或其他組織之再灌注損傷、再灌注損傷、呼吸窘迫症候群、不寧腿症候群、視網膜自體免疫、腹膜後纖維化、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、風濕性疾病、風濕熱、風濕病、類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、風疹病毒感染、桑普特氏症候群(Sampter's syndrome)、類肉瘤病、血吸蟲病、施密特症候群(Schmidt syndrome)、SCID及艾伯斯坦-巴爾病毒相關疾病、鞏膜、鞏膜炎、指趾硬皮病、硬皮病(視情況為全身性硬皮病)、硬化性膽管炎、播散性硬化、硬化症(諸如全身性硬化症)、感覺神經聽覺損失、血液反應陰性脊柱關節病、席漢氏症候群(Sheehan's syndrome)、舒曼氏症候群(Shulman's syndrome)、矽肺病、修格連氏症候群(Sjögren’s syndrome)、精液及睪丸自體免疫、蝶竇炎、史蒂芬斯-強森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、僵人(stiff-man或stiff-person)症候群、亞急性細菌心內膜炎(SBE)、亞急性皮膚紅斑狼瘡、突發性聽覺損失、蘇薩克氏症候群(Susac's syndrome)、西德納姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、交感性眼炎(sympathetic ophthalmia)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)或全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematodes)、皮膚SLE、全身性壞死性血管炎、ANCA相關血管炎(視情況為查格-施特勞斯血管炎或症候群(CSS))、脊髓癆、高安動脈炎(Takayasu's arteritis)、毛細管擴張、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少症(包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)及自體免疫或免疫介導之血小板減少症，諸如特發性血小板減少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP、血小板減少性紫癜(TTP))、甲狀腺中毒症、組織損傷、托洛薩-亨特症候群(Tolosa-Hunt syndrome)、中毒性表皮壞死溶解、中毒性休克症候群、輸血反應、嬰兒短暫性低伽瑪球蛋白血症、橫貫性脊髓炎(transverse myelitis/traverse myelitis)、熱帶肺嗜酸性粒細胞增多症、肺結核、潰瘍性結腸炎、未分化之結締組織疾病(UCTD)、蕁麻疹(視情況為慢性過敏性蕁麻疹及慢性特發性蕁麻疹，包括慢性自體免疫蕁麻疹)、葡萄膜炎、前部葡萄膜炎、葡萄膜視網膜炎、心瓣炎、血管功能障礙、血管炎、椎骨關節炎、囊皰性皮膚病、白癜風、韋格納肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)(伴有多血管炎之肉芽腫病(GPA))、維斯科特-奧爾德里奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)或x連鎖高IgM症候群。
相比而言，根據本發明之含有VISTA拮抗劑抗體之組合物可用於促進T細胞免疫及治療此組合物在其中治療有利之病況，諸如癌症及感染性病況，諸如病毒、細菌、酵母、真菌、原蟲及寄生蟲感染。該等組合物將包含在有需要之受檢者體內有效促進T細胞活化或增殖或VISTA之細胞激素表現或其他作用之量的根據本發明之拮抗劑。該等癌症病況包括例如血癌及實性瘤，諸如白血病、淋巴瘤、脊髓發育不良症候群、髓瘤、肺癌及本文確認之其他癌症。
應瞭解，本文確認之疾病病況欲為例示性而非詳盡的。
本發明之促效劑及拮抗劑可與可在相同或不同時間在相同或不同組合物中投與之其他治療劑組合。例如，本發明之促效劑可在包括投與PD-1或PD-L1促效劑、CTLA4-Ig、細胞激素、細胞激素促效劑或拮抗劑或另一受體促效劑或拮抗劑之治療方案中投與。 免疫反應之下調
上調或增強VISTA多肽之抑制功能可用於下調免疫反應。下調可為抑制或阻斷已在發展中之免疫反應的形式，或可涵蓋預防誘發免疫反應。可藉由下調免疫細胞反應或藉由在免疫細胞中誘發特異性無能或通過此兩種方式來抑制活化免疫細胞之功能。例如，VISTA促效劑抗體可結合至在各種免疫細胞上表現之VISTA多肽且由此下調免疫反應。此促效劑抗體可為單特異性或多特異性的，例如其可包含雙特異性抗體，諸如BiTE。例如，該種抗體可包含VISTA抗原結合部分及另一抗原結合部分，例如標靶免疫細胞(例如T細胞、B細胞或骨髓細胞)上之細胞表面受體之抗原結合部分。除包含VISTA抗原結合位點以外，該種抗體可包含結合至B細胞抗原受體、T細胞抗原受體或Fc或其他受體之結合位點，從而使分子靶向特異性細胞群體。對於雙特異性抗體而言選擇此第二抗原為選擇待標靶之細胞群體提供了靈活性。促進或模擬VISTA活性之VISTA促效劑抗體可增強VISTA與其天然結合伴侶之相互作用。如本文中所揭示，其他人類VISTA活化或促效劑抗體可藉由其抑制T細胞活性或增殖之能力及/或基於其活體外免疫抑止作用或發炎性、過敏性或自體免疫疾病模型來識別。
可採用多種此項技術中識別之細胞活化讀數來量測例如在活化劑存在下之細胞增殖或效應功能(例如抗體產生、細胞激素產生、吞噬作用)。測試抗體刺激或促進人類VISTA之作用且由此阻斷此活化作用之能力可易於藉由量測該藥劑影響被量測之增殖或效應功能減少的能力來確定。因此，可藉由量測不同濃度抗原下之細胞激素產生及/或增殖來確定測試抗體具有免疫抑止性及阻斷免疫活化之能力。
可藉由共同投與抗原與根據本發明之VISTA促效劑抗體來誘發針對特異性抗原之耐受性。例如，可誘發特異性多肽對過敏原或外來多肽之免疫反應的耐受性，對其不利之免疫反應可受到抑制。例如，接受因子VIII之患者常產生針對此凝集因子之抗體。共同投與根據本發明之刺激或模擬VISTA活性或與其天然結合伴侶之相互作用的VISTA促效劑抗體與重組因子VIII可抑止此不利之免疫反應。
根據本發明之VISTA促效劑抗體可與阻斷共刺激受體對免疫細胞之活性或促效另一種免疫抑止性受體或在免疫細胞上表現之配位體之活性的另一種藥劑組合使用來下調免疫反應。例示性分子包括：PD-1、PDL-1促效劑、可溶形式之CTLA-4、抗-B7-1抗體、抗-B7-2抗體、靶向LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7H3等中之一或多者之拮抗性抗體及/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中之一或多者之促效性抗體或其組合。該等部分可組合於單一組合物或化合物中，例如含有根據本發明之VISTA促效劑抗體且進一步包含另一種免疫促效劑抗體之雙特異性抗體，或其可包含含有與另一種免疫抑止性多肽或其他活性劑融合之根據本發明之VISTA促效劑抗體的融合多肽。或者，該等部分可在相同或不同組合物中以單獨或離散之實體(同時或相繼)投與來下調受檢者中由免疫細胞介導之免疫反應。
可與根據本發明之VISTA促效劑抗體組合之特異性免疫抑制分子之實例包括阻斷共刺激信號(例如針對CD28或ICOS)之抗體、經由CTLA4活化抑制信號之抗體及/或針對其他免疫細胞標記(例如針對CD40、CD40配位體或細胞激素)、融合蛋白(例如CTLA4-Fc或PD-1-Fc)及免疫抑止性藥物(例如雷帕黴素(rapamycin)、環孢素A或FK506)之抗體。
在另一實施例中，含有根據本發明之VISTA促效劑抗體之雙特異性抗體適用於靶向特異性細胞群體，例如使用僅在某些類型細胞(例如B淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞或郎格罕細胞)上發現之標記。藉由活化VISTA活性或VISTA-免疫細胞相互作用下調免疫反應(且因此刺激VISTA之負信號轉導功能)適用於例如在組織、皮膚及器官移植、在移植物抗宿主疾病(GVHD)或過敏症或在諸如全身性紅斑狼瘡、IBD、RA、牛皮癬及多發性硬化之自體免疫及發炎性疾病之情形中下調免疫反應。例如，阻斷免疫細胞功能導致組織移植中之組織破壞減少。通常在組織移植中，經由其被免疫細胞識別為外來者而引起移植之排斥反應，繼而為破壞移植之免疫反應。在移植之前或在移植時單獨或與另一種下調劑組合向免疫細胞投與促進VISTA之活性或VISTA與其天然結合伴侶之相互作用的分子可抑制產生共刺激信號。此外，促進VISTA活性亦可足以為免疫細胞提供能量，由此在受檢者體內誘發耐受性。
為了在某些疾病或某些受檢者中實現足夠之免疫抑止或耐受性，有必要阻斷其他分子之共刺激功能。例如，可能需要藉由在移植之前或在移植時投與可溶形式之肽組合來阻斷B7-1及B7-2之功能，其中該肽組合具有該等抗原或阻斷抗體各自針對該等抗原之活性(單獨或一起在單一組合物中)。或者，可能需要促進VISTA之抑制活性且進一步抑制B7-1及/或B7-2之共刺激活性。
本發明之抗人類VISTA促效劑抗體尤其適用於治療自體免疫疾病。許多自體免疫病症係針對自身組織具有反應性且促進產生在疾病病理中涉及之細胞激素及自身抗體的免疫細胞不當活化之結果。防止自身反應性免疫細胞活化可減少或消除疾病症狀。投與本發明之促進VISTA活性或VISTA與其天然結合伴侶之相互作用的抗人類VISTA促效劑抗體可誘發自身反應性免疫細胞之抗原特異性耐受性，此可導致對疾病之長期緩解。另外，共同投與藉由破壞B7分子之受體-配位體相互作用來阻斷免疫細胞共刺激之藥劑與共刺激受體可適用於抑制免疫細胞活化，從而防止產生在疾病過程中可能涉及之自身抗體或細胞激素。
經由使用本發明之抗人類VISTA促效劑抗體刺激VISTA活性或VISTA與其天然結合伴侶之相互作用來下調免疫反應亦可適用於治療對自體組織之自體免疫侵襲。因此，由自體免疫侵襲(例如心臟病、心肌梗塞或動脈粥樣硬化)引起或惡化之病況可藉由增加VISTA活性或VISTA與其天然結合伴侶之結合來改善或改良。因此，藉由使用本發明之抗人類VISTA促效劑抗體刺激VISTA活性或VISTA與其反受體之相互作用來調節由自體免疫侵襲惡化之病況，諸如自體免疫病症(以及諸如心臟病、心肌梗塞及動脈粥樣硬化之病況)在本發明之範疇內。
如前文提及，根據本發明之促效劑抗人類VISTA抗體用於預防或緩解自體免疫及發炎性病症之功效可使用人類自體免疫及發炎性疾病之多種良好表徵之動物模型來確定。實例包括鼠科實驗性自體免疫腦炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB雜合小鼠中之全身性紅斑狼瘡、鼠科自體免疫膠原蛋白關節炎、NOD小鼠及BB大鼠中之糖尿病及鼠科實驗性重症肌無力。參見Paul編， Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989，第840至856頁。
抑制免疫細胞活化在治療上進一步適用於治療過敏症及過敏性反應，例如藉由抑制IgE產生。本發明之促進或模擬VISTA活性或VISTA與其天然結合伴侶之相互作用的抗人類VISTA促效劑抗體可投與至過敏受檢者以抑制受檢者體內由免疫細胞介導之過敏性反應。刺激VISTA活性或與其天然結合伴侶之相互作用可伴隨暴露於過敏原以及適當之MHC分子。視過敏原之進入途徑及IgE在肥大細胞或嗜鹼細胞上之沈積模式而定，過敏性反應本質上可為全身性或局部性的。因此，可藉由投與本發明之抗人類VISTA促效劑抗體局部或全身性地抑制免疫細胞介導之過敏性反應。 選擇結合至相同抗原決定基之抗-VISTA抗體
在某些實施例中，根據本發明之促效性抗-VISTA抗體具備所需之功能特性，諸如調節免疫刺激及相關功能。如圖4中所示及操作實例中所揭示，已闡明根據本發明之多種抗人類VISTA促效劑抗體之抗原決定基特異性。由於已發現展示結合至相同抗原決定基之多種抗體具有免疫抑止性，因此預期可識別結合至相同或重疊抗原決定基之其他VISTA促效劑抗體，亦即其將與例示性VISTA促效劑抗體所結合之人類VISTA多肽之胺基酸殘基中之一或多者相互作用。可選擇具有相同抗原決定基特異性之其他抗體及/或具有與所需抗體交叉競爭結合至VISTA抗原之能力的彼等抗體。例如，可使用包含完整VISTA多肽(例如，15聚體)之重疊肽庫或構成含有VISTA之所需抗原決定基之一部分的重疊肽庫來確定所需抗體之抗原決定基特異性，且結合至庫中之相同肽或其一或多個殘基之抗體被確定為結合相同之線性或構形抗原決定基。在實例中，使用可用於識別線性及構形抗原決定基之Pepscan ®方法來確定抗原決定基特異性。 根據本發明之促效劑抗體之修飾
另外或作為對框架或CDR區內進行之修飾的替代方式，根據本發明之至少一些實施例之抗體可經工程化以在Fc區內包括修飾，通常用以改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞之細胞毒性。此外，根據本發明之至少一些實施例之抗體可經化學修飾(例如一或多個化學部分可連接至抗體)或經修飾以改變其糖基化，再次改變抗體之一或多種功能特性。下文進一步描述該等實施例。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引的編號。
在一實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數量發生改變，例如增加或減少。此方法由Bodmer等人在美國專利第5,677,425號中進一步描述。CHI之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數量發生改變從而例如便於輕鏈及重鏈之組裝或增加或減小抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區發生突變以減小抗體之生物半衰期。更特定言之，向Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中引入一或多個胺基酸突變以使得抗體相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合而言具有受損之葡萄球菌蛋白A (SpA)結合。此方法由Ward等人在美國專利第6,165,745號中進一步詳細描述。
在另一實施例中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。各種方法均可能。例如，可引入以下突變中之一或多者：如Ward在美國專利第6,277,375號中所述之T252L、T254S及T256F。或者，為增加生物半衰期，如Presta等人在美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述，可改變CHI或CL區中之抗體以含有來自IgG之Fc區之CH2結構域之兩個環的補救受體結合抗原決定基。
又在其他實施例中，藉由以不同之胺基酸殘基取代至少一個胺基酸殘基使Fc區發生改變從而改變抗體之效應功能。例如，選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多個胺基酸可經不同之胺基酸殘基取代以使得抗體對效應配位體具有改變之親和力且保留親本抗體之抗原結合能力。親和力發生改變之效應配位體例如可為Fc受體或補體之Cl組分。此方法由Winter等人在美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中進一步詳細描述。
在另一實例中，選自胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸可經不同之胺基酸殘基取代以使得抗體具有改變之C1q結合及/或減少或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法由Idusogie等人在美國專利第6,194,551號中進一步詳細描述。
在另一實例中，胺基酸位置231及239中之一或多個胺基酸殘基可發生改變，從而改變抗體固定補體之能力。此方法由Bodmer等人在PCT公開案WO 94/29351中進一步描述。
在又一實例中，藉由修飾以下位置處之一或多個胺基酸來修飾Fc區從而增加抗體對Fγ受體之親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法由Presta在PCT公開案WO 00/42072中進一步描述。此外，已定位人類IgGl上關於FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已描述結合改良之變異體(參見Shields, R. L.等人(2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604)。256、290、298、333、334及339位置處之特異性突變展示改良與FcγRIII之結合。另外，以下組合突變體展示改良FcγRIII結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。此外，諸如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S之突變改良與FcRn之結合且增加抗體循環半衰期(參見Chan CA及Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol10:301-316)。
在又一實施例中，抗體可經修飾以消除活體內Fab臂交換。特定而言，此過程涵蓋其他IgG4抗體之間之IgG4半分子交換(一個重鏈加一個輕鏈)，其有效產生功能單價之b特異性抗體。對重鏈之鉸鏈區及恆定域之突變可消除此交換(參見Aalberse, RC, Schuurman J., 2002, Immunology105:9-19)。
在又一實施例中，抗體之糖基化經修飾。例如，可產生無糖基化之抗體(亦即，抗體缺少糖基化)。糖基化可發生改變以例如增加抗體對抗原之親和力。該等碳水化合物修飾例如可藉由改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來實現。例如，可進行一或多個胺基酸取代，導致消除一或多個可變區框架糖基化位點，從而消除此位點處之糖基化。該無糖基化作用可增加抗體對抗原之親和力。該方法由Co等人在美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中進一步詳細描述。
另外或或者，可產生具有改變類型糖基化之抗體，諸如岩藻糖基殘基之量減少之次岩藻糖基化抗體或平分GlcNac結構增加之抗體。該等改變之糖基化模式已證實增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾例如可藉由在具有改變之糖基化機制之宿主細胞中表現抗體來實現。具有改變之糖基化機制之細胞已在此項技術中描述且可用作在其中表現根據本發明之至少一些實施例之重組抗體從而產生具有改變之糖基化之抗體的宿主細胞。例如，細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺少岩藻糖基轉移酶基因FUT8 (一種(1,6)岩藻糖基轉移酶)，使得在Ms704、Ms705及Ms709細胞株中表現之抗體在其碳水化合物上缺少岩藻糖。藉由使用兩個置換型載體靶向破壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因來產生Ms704、Ms705及Ms709 FUT8細胞株(參見Yamane等人及Yamane-Ohnuki等人之美國專利公開案第20040110704號(2004) Biotechnol Bioeng87:614-22)。作為另一實例，Hanai等人之EP 1,176,195描述一種具有功能破壞FUT8基因之細胞株，其編碼岩藻糖基轉移酶，從而使得在該細胞株中表現之抗體藉由減少或消除1,6鍵相關酶而展示次岩藻糖基化作用。Hanai等人亦描述對於岩藻糖與結合至抗體之Fc區之N-乙醯基葡糖胺加成具有低酶活性或不具有酶活性之細胞株，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0 (ATCC CRL 1662)。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異體CHO細胞株、Lecl3細胞，其使岩藻糖附接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力減小，亦導致在此宿主細胞中表現之抗體之次岩藻糖基化作用(亦參見Shields, R. L.等人(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程化以表現修飾糖蛋白之糖基轉移酶(例如P(l,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III (GnTIII))的細胞株，以使得在工程化之細胞株中表現之抗體展示增加之平分GlcNac結構，此導致抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人(1999) Nat. Biotech. 17: 176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶裂解抗體之岩藻糖殘基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體移除岩藻糖基殘基(Tarentino, A. L.等人(1975) Biochem.14:5516-23)。
本發明涵蓋之本文中對抗體之另一種修飾為聚乙二醇化或加成其他水溶性部分(通常為聚合物)，例如用以增強半衰期。抗體可經聚乙二醇化以例如增加抗體之生物學(例如血清)半衰期。為了使抗體聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段之條件下反應。聚乙二醇化較佳經由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所用之術語「聚乙二醇」欲涵蓋已用於衍生其他蛋白之任何形式之PEG，諸如單(Ci-Cio)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，欲經聚乙二醇化之抗體為非糖基化抗體。用於聚乙二醇化蛋白之方法在此項技術中已知且可適用於根據本發明之至少一些實施例之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。 工程化抗體之方法
在某些實施例中，根據本發明之具有V H及V L序列之促效劑抗-VISTA抗體可藉由修飾V H及/或V L序列或與其連接之恆定區而分別用於產生新的抗-VISTA抗體。因此，在根據本發明之至少一些實施例之另一態樣中，根據本發明之至少一些實施例之抗-VISTA抗體之結構特徵用於產生保留根據本發明之至少一些實施例之抗體之至少一種功能特性(諸如結合至人類VISTA)的結構相關抗-VISTA抗體。例如，如上文論述，一種VISTA抗體或其突變之一或多個CDR區可與已知框架區及/或其他CDR重組組合以產生根據本發明之至少一些實施例之其他重組工程化抗-VISTA抗體。其他類型之修飾包括前述部分中所述之彼等修飾。用於工程化方法之起始材料為本文提供之V H及/或V L序列中之一或多者或其一或多個CDR區。為了產生工程化之抗體，不必要實際上製備(亦即，表現為蛋白)具有本文提供之V H及/或V L序列中之一或多者或其一或多個CDR區之抗體。相反，序列中所含之資訊用作起始材料來產生源自初始序列之「第二代」序列，且隨後製備該等「第二代」序列並表現為蛋白。
可使用標準分子生物技術來製備及表現經改變之抗體序列。由改變之抗體序列編碼之抗-VISTA抗體較佳為分別保留由本文之方法產生且具有本文提供之序列的抗-VISTA抗體之一種、一些或所有功能特性之抗體，該等功能特性包括以特異性K D水準或低於此K D水準結合至VISTA抗原及/或調節免疫反應及/或選擇性地結合至例如表現VISTA抗原之所需標靶細胞。
可使用此項技術中可得及/或在本文中描述之標準分析來評估經改變抗體之功能特性。在根據本發明之至少一些實施例之工程化抗體之方法的某些實施例中，突變可隨機或選擇性地連同所有或部分抗-VISTA抗體編碼序列一起引入，且可根據結合活性及/或其他所需之功能特性來篩檢所得經修飾之抗-VISTA抗體。
此項技術中已描述突變方法。例如，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變、合成性接合組裝或其組合來產生及篩檢抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用計算機篩檢方法最優化抗體之理化特性之方法。 編碼抗體之核酸分子
本發明進一步提供編碼根據本發明之抗-VISTA抗體或其片段或結合物之核酸。該等核酸可存在於完整細胞中、細胞溶解物中或經部分純化或實質上純之形式中。當藉由標準技術，包括此項技術中熟知之鹼/SDS處理、CsCl分帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及其他技術進行純化以除去其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白)時，核酸為「經分離」或「致使成為實質上純的」。參見F. Ausubel等人編. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing及Wiley Interscience, New York。根據本發明之至少一些實施例之核酸例如可為DNA或RNA，且可含有或不含內含子序列。在一較佳實施例中，核酸為cDNA分子。
可使用標準分子生物技術獲得根據本發明之至少一些實施例之核酸。對於由融合瘤(例如，如下文進一步描述由帶有人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠製備之融合瘤)表現之抗體而言，可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼由融合瘤製得之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA。對於由免疫球蛋白基因庫獲得之抗體而言(例如使用噬菌體呈現技術)，可自該庫回收編碼抗體之核酸。
一經獲得編碼V H及V L區段之DNA片段，即可藉由標準重組DNA技術進一步操作該等DNA片段，例如用以將可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、轉化為Fab片段基因或轉化為scFv基因。在該等操作中，V L-或V H-編碼DNA片段可操作性地連接至編碼另一蛋白之另一DNA片段。諸如抗體恆定區或可撓性連接子。如上文定義，「可操作性地連接」意謂兩個DNA片段接合以使得由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框。
可藉由將編碼V H之DNA可操作性地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子來將編碼V H區之經分離的DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見例如Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號)且可藉由標準PCR擴增獲得包含該等區域之DNA片段。重鏈恆定區可為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgGl、IgG2或IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因而言，編碼VH之DNA可經可操作性地連接至僅編碼重鏈C H1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼V L之DNA可操作性地連接至編碼輕鏈恆定區之另一DNA分子來將編碼V L區之經分離的DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)，人類輕鏈恆定區基因之C L-序列在此項技術中已知(參見例如Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號)且可藉由標準PCR擴增獲得包含該等區域之DNA片段。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳為κ恆定區。
為產生scFv基因，將編碼V H及V L之DNA片段可操作性地連接至編碼可撓性連接子之另一片段(例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)以使得V H及V L序列可表現為連續單鏈蛋白，其中V L與V H區經可撓性連接子接合(參見例如Bird等人(1988) Science242:423-426；Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA85:5879-5883；McCafferty等人，(1990) Nature348:552-554)。 抗-VISTA單株抗體之產生
根據本發明之抗VISTA單株抗體(mAb)及抗原結合片段可藉由各種技術而產生，包括習知之單株抗體方法，例如Kohler及Milstein之標準體細胞雜交技術(1975) Nature256:495。儘管體細胞雜交程序係較佳的，但原則上可採用用於產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒性或致癌性轉型。
一種用於製備融合瘤之較佳動物系統為鼠科系統。在小鼠中產生融合瘤係一種極為完善之程序。此項技術中已知用於分離免疫脾細胞以供融合之免疫實驗方案及技術。亦已知融合伴侶(例如鼠科骨髓瘤細胞)及融合程序。可基於如上文所述製備之鼠科單株抗體之序列來製備本發明之嵌合或人源化抗體。可使用標準分子生物技術由所關注之鼠科融合瘤獲得編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA且經工程化以含有非鼠科(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠科可變區連接至人類恆定區(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人源化抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠科CDR區插入人類框架中(參見例如Winter之美國專利第5,225,539號及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
根據本發明之至少一些實施例，抗體為人類單株抗體。針對VISTA之該等人類單株抗體可使用攜帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉基因或轉染色體小鼠來產生。該等轉基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb Mouse ™及KM Mouse ™之小鼠且在本文中總稱為「人類Ig小鼠」。HuMAb Mouse ™(Medarex Inc.)含有編碼未重排之人類重μ及γ及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微基因座，以及使內源性μ及κ鏈基因座失活之標靶突變(參見例如Lonberg等人(1994) Nature368(6474): 856-859)。因此，小鼠展現對小鼠IgM或κ之表現減少且對免疫作出響應，所引入之人類重鏈及輕鏈轉基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力之人類IgG κ單株(Lonberg, N.等人(1994)，上文；在Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101；Lonberg, N.及Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93及Harding, F.及Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546)中綜述。HuMab Mouse ®之製備及用途以及該小鼠所攜帶之基因體修飾在Taylor, L.等人(1992) Nucleic Acids Research20:6287-6295；Chen, J.等人(1993) International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:3720-3724；Choi等人(1993) Nature Genetics4: 117-123；Chen, J.等人(1993) EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon等人(1994) J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L.等人(1994) International Immunology6:579-591；及Fishwild, D.等人(1996) Nature Biotechnology14: 845-851中進一步描述，其所有內容均以全文引用之方式特定地併入本文中。進一步參見美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號，全部屬於Lonberg及Kay；Surani等人之美國專利第5,545,807號；PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號，全部屬於Lonberg及Kay；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在另一實施例中，可使用在轉基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如攜帶人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠產生根據本發明之至少一些實施例之人類抗體。在本文中稱為「KM mice ™」之該等小鼠在Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中詳細描述。
又進一步地，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉基因動物系統在此項技術中可得且可用於產生根據本發明之至少一些實施例之抗-VISTA抗體。例如，可使用稱為Xenomouse (Abgenix, Inc.)之替代性轉基因系統；該等小鼠例如在Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6, 150,584號及第6,162,963號中描述。
此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統在此項技術中可得且可用於產生根據本發明之至少一些實施例之抗-VISTA抗體。例如，可使用攜帶有人類重鏈轉染色體與人類輕鏈轉染色體之小鼠，稱為「TC小鼠」；該等小鼠在Tomizuka等人(2000) Proc. Natl. Acad Sci. USA97:722-727中描述。此外，在此項技術中已描述攜帶有人類重鏈及輕鏈轉染色體之奶牛(Kuroiwa等人(2002) Nature Biotechnology20:889-894)且其可用於產生根據本發明之至少一些實施例之抗-VISTA抗體。
根據本發明之至少一些實施例之人類單株抗體亦可使用用於篩檢人類免疫球蛋白基因庫之噬菌體呈現方法來製備。此項技術中已確定用於分離人類抗體之該等噬菌體呈現方法。參見例如：Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
根據本發明之至少一些實施例之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備，在該等小鼠中已重新構成人類免疫細胞以使得經免疫後可產生人類抗體反應。該等小鼠例如在Wilson等人中美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中描述。 人類Ig小鼠之免疫
在一些實施例中，如由Lonberg, N.等人(1994) Nature368(6474): 856-859；Fishwild, D.等人(1996) Nature Biotechnology14: 845-851；以及PCT公開案WO 98/24884及WO 01/14424所述，人類Ig小鼠用於例如藉由以VISTA抗原及/或重組VISTA或VISTA融合蛋白之純化或富集製劑使該等小鼠免疫來產生根據本發明之人類抗VISTA抗體。在第一次輸注後，小鼠較佳為6至16週齡。例如，VISTA抗原之純化或重組製劑(劑量範圍為0.5至500 μg)可用於經腹膜內免疫人類Ig小鼠。
一般而言，當初始以完整弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)中之抗原經腹膜內(IP)免疫，繼而每隔一週以非完整弗氏佐劑中之抗原IP免疫(至多總計6次)時，轉基因小鼠作出反應。然而，發現除弗氏佐劑以外之佐劑亦有效。另外，發現完整細胞在不存在佐劑時具有高度免疫原性。在免疫實驗方案過程中可由眶後出血獲得之血漿樣品來操控免疫反應。可藉由ELISA (如下文所述)來篩檢血漿且具有足夠效價之抗-VISTA人類免疫球蛋白之小鼠可用於融合。在犧牲及移除脾臟之前3天，可對小鼠經靜脈內補強抗原。預期對於每次免疫而言可能需要進行2至3次融合。對於每種抗原而言，通常免疫6隻至24隻之間的小鼠。通常使用HCo7及HCol2兩種菌株。另外，HCo7及HCol2兩種轉基因可一起育種至具有兩種不同人類重鏈轉基因(HCo7/HCo 12)之單個小鼠中。或者或另外，可使用KM Mouse ™菌株。在一例示性實施例中，該等小鼠將經工程化以選擇性地產生人類IgG2抗體。 產生人類單株抗體之融合瘤的產生
在某些實施例中，產生根據本發明之人類單株抗-VISTA抗體之融合瘤可使用脾細胞來產生及/或來自免疫小鼠之淋巴結細胞可經分離且與適當之永生化細胞株(諸如小鼠骨髓瘤細胞株)融合。可關於抗原特異性抗體之產生來篩檢所得融合瘤。例如，來自免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液可與六分之一數量之P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1580)及50% PEG融合。將細胞以約2×10 5塗在平底微量滴定盤中，繼而在含有20%胎純系血清、18%「653」調節培養基、5%奧利金(origen，IGEN)、4 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉、5 mM HEPES、0.055 mM 2-巰基乙醇、50單位/ml盤尼西林(penicillin)、50 mg/ml鏈黴素(streptomycin)、50 mg/ml慶大黴素(gentamycin)及IX HAT (Sigma；在融合後24小時添加HAT)之選擇性培養基中培育兩週。約兩週後，可在其中以HT替代HAT之培養基中培養細胞。隨後對於人類單株IgM及IgG抗體而言，可藉由ELISA篩檢個別孔。一旦發生大量融合瘤生長，則通常可在10至14天後觀測培養基。分泌抗體之融合瘤可經再塗覆、再次篩檢且若對於人類IgG仍為陽性，則可藉由限制稀釋將單株抗體次選殖至少兩次。隨後可活體外培養穩定之次純系以在組織培養基中產生小量抗體以供表徵。
為純化人類單株抗體，可使選擇之融合瘤在2公升旋轉燒瓶中生長以用於單株抗體純化。上清液可經過濾且濃縮，之後以蛋白A-瓊脂糖進行親和層析(Pharmacia, Piscataway, N.J.)。藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查經溶離之IgG以確保純度。緩衝溶液可交換至PBS中且可藉由使用1.43消光係數之OD280來確定濃度。單株抗體可經等分試樣且儲存在-80℃下。 產生單株抗體之轉染瘤的產生
在某些實施例中，例如可使用如此項技術中熟知之重組DNA技術與基因轉染方法之組合(例如Morrison, S. (1985) Science229: 1202)，在宿主細胞轉染瘤中產生根據本發明之抗-VISTA抗體。例如，為表現抗體或其抗體片段，可藉由標準分子生物技術(例如使用表現所關注抗體之融合瘤進行PCR擴增或cDNA選殖)獲得編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA，且DNA可插入表現載體中以使得基因可操作性地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此上下文中，術語「可操作性地連接」欲意謂抗體基因接合至載體中以使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。選擇與所使用之表現宿主細胞相容之表現載體及表現控制序列。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入單獨之載體中，或更通常地，兩個基因插入同一表現載體中。藉由標準方法將抗體基因插入表現載體中(例如，抗體基因片段及載體上之互補限制位點之接合，或若不存在限制位點，則為平端接合)。本文中所述之抗體之輕鏈及重鏈可變區可藉由將其插入已編碼所需同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中而用於產生任何抗體同型之全長抗體基因，以使得V H區段可操作性地連接至載體內之C H區段且V L區段可操作性地連接至載體內之C L區段。另外或或者，重組表現載體可編碼促進自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。抗體鏈基因可經選殖至載體中以使得信號肽框內連接至抗體鏈基因之胺基末端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。 結合至抗原之抗體的表徵
在某些實施例中，藉由已知之抗體結合分析技術(諸如ELISA)來確定根據本發明之促效性抗-VISTA抗體之結合特異性。在一例示性ELISA中，對微量滴定盤塗以純化抗原，此處為在PBS中0.25μg/ml之VISTA，且隨後以在PBS中5%之牛血清白蛋白阻斷。向每個孔中添加抗體稀釋液(例如來自免疫小鼠之血漿稀釋液)且在37℃下培育1至2小時。以PBS/吐溫(Tween)洗滌培養盤且隨後在37℃下以與鹼性磷酸酶結合之二級試劑(例如對於人類抗體而言為山羊-抗人類IgG Fc-特異性多株試劑)培育1小時。洗滌之後，以pNPP受質(1 mg/ml)使培養盤顯影且以405至650之OD進行分析。產生最高效價之小鼠較佳將用於融合。
如上文所述之ELISA分析亦可用於篩檢與VISTA免疫原展示正反應性之融合瘤。次選殖以高親合力結合至VISTA之融合瘤且進一步表徵。可選擇保持親本細胞之反應性(藉由ELISA)的來自每種融合瘤之一個純系以用於製造儲存在-140℃下之5至10個小瓶細胞庫且用於抗體純化。
為純化抗-VISTA抗體，可使選擇之融合瘤在2公升之旋轉燒瓶中生長以用於單株抗體純化。上清液可經過濾且濃縮，之後以蛋白A-瓊脂糖進行親和層析(Pharmacia, Piscataway, N.J.)。藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查經溶離之IgG以確保純度。緩衝溶液可交換至PBS中且可藉由使用1.43消光係數之OD280來確定濃度。單株抗體可經等分試樣且儲存在-80℃下。
為確定選擇之抗-VISTA單株抗體是否結合至獨特之抗原決定基，可使用市售試劑(Pierce, Rockford, Il.)來生物素化每種抗體。可如上文所述使用經VISTA塗佈之ELISA培養盤進行使用未標記單株抗體及生物素化單株抗體之競爭研究。可由鏈黴親和素-鹼性磷酸酶探針來偵測生物素化之mAb結合。
為確定純化抗體之同型，可使用對特定同型之抗體具有特異性之試劑(例如IgG2)來進行同型ELISA。例如，為確定人類單株抗體之同型，可在4℃下以^g/ml之抗人類免疫球蛋白隔夜塗佈微量滴定盤之孔。在以1% BSA阻斷之後，使培養盤與1 μg/ml或1 μg/ml以下之測試單株抗體或經純化之同型對照物在周圍溫度下反應一至兩小時。隨後可使各孔與人類IgG1或人類IgM-特異性鹼性磷酸酶結合之探針反應。如上文所述使培養盤顯影並進行分析。
可藉由西方墨點法進一步分別測試抗VISTA人類IgG與VISTA抗原之反應性。簡而言之，可製備VISTA抗原且使其經受十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳之後，將經分離之抗原轉移至硝基纖維素膜，以10%胎牛血清阻斷且以待測試之單株抗體進行探測。可使用抗人類IgG鹼性磷酸酶來偵測人類IgG結合且以BCIP/NBT受質錠劑進行顯影(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)。
在另一態樣中，本發明之特徵在於由連接至有效載荷藥物(常為細胞毒性)之抗體(或抗體片段，諸如單鏈可變片段(scFv))組成之抗體-藥物結合物(ADC)。抗體導致ADC結合至標靶癌細胞。隨後常由細胞內化ADC且將藥物釋放至細胞中。由於標靶，副作用較低且產生更寬之治療窗。親水性連接子(例如PEG4Mal)有助於防止經由MDR (多藥耐藥性)轉運體將藥物抽出抗癌性細胞。
在另一態樣中，本發明之特徵在於與治療劑(諸如細胞毒素、藥物(例如免疫抑止劑)或放射性毒素)結合之包含抗-VISTA抗體或其片段之免疫結合物。該等結合物在本文中稱為「免疫結合物」。包括一或多種細胞毒素之免疫結合物稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺死細胞)之任何藥劑。實例包括紫杉酚(Taxol)、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽毒素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、1-脫氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包括例如抗代謝物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(環磷醯胺)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II)(DDP) 順鉑)、蒽環黴素(例如道諾黴素(原名為道諾黴素(daunomycin))及阿黴素)、抗生素(例如放線菌素D(dactinomycin)(原名為放線菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光輝黴素及安麯黴素(anthramycin)(AMC))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。
可與根據本發明之至少一些實施例之抗體結合之治療性細胞毒素的其他實例包括倍癌黴素(duocarmycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)及澳瑞他汀(auristatin)及其衍生物。卡奇黴素抗體結合物之實例為市售的(Mylotarg ™Wyeth)。
可使用此項技術中可得之連接子技術使細胞毒素與根據本發明之至少一些實施例之抗體結合。已用於使細胞毒素與抗體結合之連接子類型的實例包括(但不限於)含有腙、硫醚、酯、二硫化物及肽之連接子。可選擇例如易於由溶酶體隔室內之低pH裂解或易於由蛋白酶(諸如在腫瘤組織中優先表現之蛋白酶，諸如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D))裂解之連接子。關於細胞毒素類型、連接子及用於使治療劑與抗體結合之方法的進一步論述，亦參見Saito, G.等人(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215；Trail, P. A.等人(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne, G. (2003) Cancer Cell3:207-212；Allen, T. M. (2002) Nat. Rev. Cancer2:750-763；Pastan, I.及Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091；Senter, P. D.及Springer, C. J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。
本發明之抗體亦可結合至放射性同位素以產生細胞毒性放射性藥物，亦稱為放射免疫結合物。可與抗體結合用於診斷或治療用途之放射性同位素之實例包括(但不限於)碘131、銦111、釔90及鑥177。此項技術中確定用於製備放射免疫結合物之方法。放射免疫結合物係市售的，包括Zevalin ®(BiogenlDEC)及Bexxar ®。(Corixa Pharmaceuticals)及類似方法可使用根據本發明之至少一些實施例之抗體而用於製備放射免疫結合物。
根據本發明之至少一些實施例之促效劑抗人類VISTA抗體及含有其之結合物可用於改質給定之生物學反應，且藥物部分不理解為侷限於經典之化學治療劑。例如，藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白或多肽。該等蛋白可包括例如酶促活性毒素或其活性片段，諸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，諸如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應改質劑，諸如淋巴激素, 介白素-1 (「IL-1」)、介白素-2 (「IL-2」)、介白素-6 (「IL-6」)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球群落刺激因子(「G-CSF」)或其他生長因子。
用於使該治療部分與抗體結合之技術係熟知的，參見例如Arnon等人, 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, 在 Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中, Reisfeld等人(編), 第243至56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等人, 「Antibodies For Drug Delivery」, 在 Controlled Drug Delivery(第2版) 中，Robinson等人(編)，第623至53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, 「Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, 在 Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera等人(編), 第475至506頁(1985)；」Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, 在 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中，Baldwin等人(編), 第303至16頁(Academic Press 1985)及Thorpe等人, 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)。 雙特異性分子
根據至少一些實施例，本發明亦涵蓋多特異性抗VISTA促效劑抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在另一態樣中，本發明之特徵在於根據本發明之至少一些實施例之包含抗-VISTA抗體或其片段之雙特異性分子。根據本發明之至少一些實施例之抗體或其抗原結合部分可衍生或連接至另一功能性分子，例如另一肽或蛋白(例如受體之另一抗體或配位體)以產生結合至至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。根據本發明之至少一些實施例之抗體實際上可衍生或連接至一個以上之其他功能性分子以產生結合至兩個以上不同結合位點及/或標靶分子之多特異性分子；如本文所用之術語「雙特異性分子」亦欲涵蓋該等多特異性分子。為產生根據本發明之至少一些實施例之雙特異性分子，抗體可功能性地連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，以便產生雙特異性分子。在某些實施例中，雙特異性抗體之結合特異性之一係關於VISTA且其他係關於任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至VISTA之兩個不同的抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑局部化至表現VISTA之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
根據本發明之至少一些實施例之雙特異性抗體為同時結合至具有不同結構之兩個標靶的抗體。根據本發明之至少一些實施例之雙特異性抗體(bsAb)及雙特異性抗體片段(bsFab)具有特異性地結合至B細胞抗原或抗原決定基之至少一種臂及特異性地結合可標靶結合物之至少一種其他臂。
根據至少一些實施例，本發明亦涵蓋融合抗體蛋白，其係重組產生之抗原結合分子，其中連接兩個或兩個以上具有相同或不同特異性之不同單鏈抗體或抗體片段區段。可使用分子工程化產生各種雙特異性融合抗體蛋白。在一種形式中，雙特異性融合抗體蛋白為單價的，例如由對一種抗原具有單一結合位點之片段及對第二抗原具有單一結合位點之Fab片段組成。在另一種形式中，雙特異性融合抗體蛋白為二價的，例如由對於一種抗原具有兩個結合位點之IgG及對於第二抗原具有兩個結合位點之兩個scFv組成。
本發明進一步涵蓋具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程化抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576A1)及包含結合至VISTA以及另一不同抗原之抗原結合位點之「雙作用FAb」或「DAF」抗體(參見例如US 2008/0069820)。因此，本發明包括雙特異性分子，其包含至少一種對於VISTA之第一結合特異性及對於第二標靶抗原決定基之第二結合特異性。根據本發明之至少一些實施例，第二標靶抗原決定基為Fc受體，例如人類FcγRI (CD64)或人類FcαR受體(CD89)。因此，本發明包括能夠夠分別結合至FcγR、FcαR或FcsR表現效應細胞(例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))且結合至表現VISTA之標靶細胞的雙特異性分子。該等雙特異性分子將VISTA表現細胞標靶至效應細胞且觸發Fc受體介導之效應細胞活性，諸如VISTA表現細胞之吞噬作用、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、細胞激素釋放或超氧化物陰離子之產生。
根據本發明之至少一些實施例，其中雙特異性分子為多特異性的，除抗-Fc結合特異性以外，分子可進一步包括第三結合特異性。在一實施例中，第三結合特異性為抗增強因子(EF)部分，例如結合至在細胞毒性活性中所涉及之表面蛋白且由此增加針對標靶細胞之免疫反應的分子。
「抗增強因子部分」可為結合至給定分子(例如抗原或受體)且由此導致結合決定子對Fc受體或標靶細胞抗原之效應增強的抗體、功能性抗體片段或配位體。「抗增強因子部分」可結合Fc受體或標靶細胞抗原。或者，抗增強因子部分可結合至不同於第一及第二結合特異性所結合之實體的實體。例如，抗增強因子部分可結合細胞毒性T細胞(例如經由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或導致針對標靶細胞之免疫反應增加之其他免疫細胞)。
根據本發明之至少一些實施例，雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所述，抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體，其內容以引用之方式明確併入本文中。
在一實施例中，由單株抗體提供對Fcγ受體之結合特異性，其結合不受人類免疫球蛋白G (IgG)阻斷。如本文所用之術語「IgG受體」係指位於染色體1上之八個γ-鏈基因中之任一者。該等基因編碼總計十二種跨膜或可溶性受體同功異型物，其分組為三類Fcγ受體：FcγRI (CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII (CD16)。在一較佳實施例中，Fcγ受體為人類高親和力FcγRI。人類FcγRI為72 kDa分子，其對於單聚體IgG展示高親和力。某些較佳抗-Fcγ單株抗體之產生及表徵由Fanger等人在PCT公開案WO 88/00052及美國專利第4,954,617號中描述，其教示以引用的方式完整併入本文中。該等抗體在不同於受體之Fey結合位點之位點處結合至FcγRI、FcγRII或FcγRIII之抗原決定基，且因此其結合實質上不受生理學水準之IgG阻斷。已知之抗-FcγRI抗體包括mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62及mAb 197。融合瘤產生之mAb 32可購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC入藏登記號HB9469。在其他實施例中，抗-Fcγ受體抗體為人源化形式之單株抗體22 (H22)。H22抗體之產生及表徵在Graziano, R.F.等人(1995) J. Immunol.155 (10): 4996-5002及PCT公開案WO 94/10332中描述。H22抗體產生之細胞株以名稱HA022CLI寄存在美國典型培養物保藏中心且具有入藏登記號CRL 11177。
又在其他實施例中，由結合至人類IgA受體(例如Fc-α受體(Fc αRI(CD89)))之抗體提供對Fc受體之結合特異性，其結合較佳不受人類免疫球蛋白A (IgA)阻斷。術語「IgA受體」欲包括位於染色體19上之一種a-基因(FcαRI)的基因產物。已知此基因編碼55至10 kDa之若干種替代性拼接之跨膜同功異型物。FcαRI (CD89)在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及嗜中性顆粒球上原構性地表現，但在非效應細胞群體上並未原構性地表現。Fc αRI對於IgA1與IgA2兩者而言具有中等親和力(約5×10 -7M -1)，其在暴露於細胞激素(諸如G-CSF或GM-CSF)時增加(Morton, H. C.等人(1996) Critical Reviews in Immunology16:423-440)。已描述四種識別為A3、A59、A62及A77之FcαRI-特異性單株抗體，其結合位於IgA配位體結合域以外之FcαRI (Monteiro, R. C.等人(1992) J. Immunol. 148: 1764)。
儘管人類單株抗體較佳，但在根據本發明之至少一些實施例之雙特異性分子中可採用之其他抗體為鼠科、嵌合及人源化單株抗體。可使用此項技術中已知之方法，藉由使構成性結合特異性(例如抗-FcR及抗VISTA結合特異性)結合來製備本發明之雙特異性分子。例如，每個雙特異性分子之結合特異性可單獨產生且隨後彼此結合。當結合特異性為蛋白或肽時，各種偶合劑或交聯劑均可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二醯亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基-二硫基丙酸酯(SPDP)及磺基琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-l-甲酸酯(磺基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人(1984) J. Exp. Med. 160: 1686；Liu, M A等人(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:8648)。其他方法包括在Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132；Brennan等人(1985) Science229:81-83)及Glennie等人(1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)中所述之彼等方法。較佳之結合劑為SATA及磺基-SMCC，兩者均可購自Pierce Chemical Co. (Rockford, Il.)。當結合部分為抗體時，其可經由兩個重鏈之C末端鉸鏈區之氫硫基鍵結來結合。在一特定較佳實施例中，鉸鏈區經修飾以在結合之前含有奇數個氫硫基殘基，較佳為一個。
或者，兩種結合特異性可在相同載體中編碼且在相同宿主細胞中表現及組裝。當雙特異性分子為mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab')2或配位體XFab融合蛋白時，此方法尤其適用。根據本發明之至少一些實施例之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及結合決定子之單鏈分子或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法例如在美國專利第5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中描述。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性位點之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello, Nature305: 537 (1983))、WO 93/08829及Traunecker等人, EMBO J.10: 3655 (1991))及「杵臼(knob-in-hole)」工程化(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由工程化靜電轉向作用以製備抗體Fc-異質二聚體分子(WO 2009/089004A1)；受控Fab-臂交換(參見Labrijn等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA110(13):5145-50 (2013))；交聯兩種或兩種以上抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人, Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人, J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992))；使用「雙功能抗體」技術用於製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人, J. Immunol., 152:5368 (1994))；及如例如Tutt等人 J. Immunol. 147: 60 (1991)中所述製備三特異性抗體來製備。
例如可藉由酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來確認雙特異性分子與其特異性標靶之結合。該等分析各自通常藉由採用對所關注複合物具有特異性之標記試劑(例如抗體)來偵測是否存在受到特定關注之蛋白-抗體複合物。例如，FcR-抗體複合物可使用例如識別且特異性地結合至抗體-FcR複合物之酶聯結抗體或抗體片段來偵測。或者，可使用各種其他免疫分析中之任一者來偵測複合物。例如，抗體可經放射性標記且用於放射性免疫分析(RIA)中(參見例如Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986，其以引用之方式併入本文中)。放射性同位素可藉由諸如使用γ計數器或閃爍計數器或藉由自動放射攝影術之方式來偵測。 拮抗劑抗體及含有其之醫藥組合物之用途 癌症免疫療法
與旨在抑制對於腫瘤生長及發展而言重要之分子途徑及/或耗盡腫瘤細胞之腫瘤標靶治療不同，癌症免疫療法之目標在於刺激患者自身之免疫系統以消除癌細胞，提供長期之腫瘤破壞。各種方式可用於癌症免疫療法中，尤其治療癌症疫苗以誘發腫瘤特異性T細胞反應及免疫刺激性抗體(亦即抑制性受體之拮抗劑=免疫檢查點)從而移除免疫抑止途徑。
標靶療法或習知抗癌療法之臨床反應隨著癌細胞產生抗性及腫瘤發生復發而傾向於暫時的。然而，過去數年臨床上使用癌症免疫療法已表明此類型之療法可具有持久之臨床反應，表明對長期存活具有劇烈影響。然而，儘管反應係長期的，但僅少量患者響應(與習知或標靶治療相反，其中大量患者響應，但反應係暫時的)。
在臨床上偵測到腫瘤時，已藉由獲得免疫耐受及免疫抑止特性且經由各種機制及各種免疫細胞產生免疫抑止性腫瘤微環境來回避免疫防禦系統。因此，在癌症免疫療法中，愈加明確的係對於臨床功效而言需要組合療法。
需要組合方法且預期增加受益於免疫療法之患者的數量及擴大具有反應性之癌症的數量及類型、使檢查點藥劑之潛在癌症適應症擴大至超過目前展示作為單一療法之免疫檢查點阻斷功效的初始適應症。免疫調節方法之組合欲使結果最大化且克服大多數腫瘤對單一方法之耐受性機制。因此，傳統上認為係非免疫原性之腫瘤可能變成免疫原性且對免疫療法作出響應，儘管共同投與經設計用以增加患者之抗腫瘤免疫反應的促免疫原性療法。下文詳述可能之引發劑。
組合療法之功效劇烈增加所潛在之科學基本原理主張作為單一療法之免疫檢查點阻斷將僅在路徑阻斷時預先存在『未釋放』之強烈抗腫瘤免疫反應時誘發腫瘤消退。根據本發明之至少一些實施例，VISTA特異性抗體、抗體片段、結合物及包含其之組合物用於經組合療法中之癌症免疫療法來治療所有類型之癌症。
如本文所用之術語「治療」係指治療性治療及防治性或預防性措施，在此實例中係關於治療癌症之發炎性副作用；然而，亦如下文中所述，亦提供使用抗體及醫藥組合物用於治療感染性疾病、敗血症及/或自體免疫病況及/或用於抑制基因治療後之不良免疫活化。需要治療之彼等包括已患癌症之彼等以及將要預防癌症之彼等。因此，本文中待治療之哺乳動物可已診斷患有癌症或可傾向於患癌或對癌症易感。如本文所用之術語「治療」係指預防、延遲發作、治癒、逆轉、減弱、緩解、最小化、抑止、停止上述癌性疾病、病症或病況之不利作用或穩定其可辨別之症狀。亦包括管理如上文所述之癌症。「管理」意謂減小疾病之嚴重性、減少疾病發作之頻率、減少該等發作之持續時間、減小該等發作之嚴重性、減緩/減少癌細胞生長或增殖、減緩至少一種症狀之發展、改善至少一種可量測之物理參數及其類似物。例如，免疫刺激性抗-VISTA抗體應促進針對標靶細胞(例如癌細胞、受感染細胞或病原體細胞)之T細胞或NK或細胞激素免疫性，且由此藉由消耗疾病病況中所涉及之細胞來治療癌症或感染性疾病。促效性抗-VISTA抗體應減少T細胞或NK活性及/或在某些免疫疾病(諸如自體免疫、發炎或過敏性病況)之疾病病理學中所涉及之促炎性細胞激素的分泌，且由此治療或緩解與該等病況相關之疾病病理及組織破壞(例如，與類風濕性關節炎病況相關之關節破壞)。
用於治療目的之「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家養及農場動物以及動物園、運動或寵物動物，諸如狗、馬、貓、奶牛等。哺乳動物較佳為人類。哺乳動物較佳為經診斷患有上文所述疾病、病症或病況之一的人類，或者有至少一種癌症傾向之人類。
「治療有效量」係指有效治療哺乳動物之疾病或病症的根據本發明之藥劑之量。本發明之治療劑可單獨或作為醫藥組合物之部分提供給受檢者，該等治療劑在該醫藥組合物中係與醫藥學上可接受之載劑混合。
根據本發明之至少一些實施例，如本文所述之抗-VISTA抗體、片段、其結合物及/或包含其之醫藥組合物亦可在組合療法中投與，亦即與其他加強藥劑及/或其他治療組合。根據至少一些實施例，抗-VISTA抗體可與此項技術中已知之標準癌症治療護理中之任一者組合使用(例如在http://www.cancer.gov/cancertopics中可見)。
例如，組合療法可包括抗-VISTA抗體、片段、其結合物及/或包含其之醫藥組合物，其與如本文所述之至少一種其他治療劑或免疫調節劑、其他化合物或免疫療法或免疫刺激策略組合。
拮抗性抗-VISTA抗體可與靶向免疫檢查點之促效性抗體組合使用，包括抗CTLA4 mAb，諸如伊匹單抗(ipilimumab)、曲美力單抗(tremelimumab)；抗PD-1，諸如納武單抗(nivolumab)、BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538、AMP224、CT-011、MK-3475，抗-PDL-1拮抗劑，諸如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A；抗LAG-3，諸如IMP-321)、抗-TIM-3、抗-BTLA、抗-B7-H4、抗-B7-H3；靶向免疫刺激性蛋白之促效性抗體，包括抗CD40 mAb，諸如CP-870、893、魯卡木單抗(lucatumumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)；抗CD137 mAb，諸如BMS-663513、烏瑞魯單抗(urelumab)、PF-05082566；抗OX40 mAb，諸如抗OX40；抗GITR mAb，諸如TRX518；抗CD27 mAb，諸如CDX-1127；及抗-ICOS mAb。
細胞激素為允許免疫系統之細胞彼此相通以對標靶抗原產生協調、強烈但具有自限性之反應的分子信使。基於細胞激素之治療具體為直接嘗試刺激患者自身之免疫系統來排斥癌症。過去二十年對於利用免疫系統根除癌症日益增長之關注伴隨著高度努力表徵細胞激素且利用其巨大之信號轉導網路來研究癌症治療。細胞激素直接刺激腫瘤位點之免疫效應細胞及基質細胞且增強細胞毒性效應細胞識別腫瘤細胞。許多動物腫瘤模型研究已表明細胞激素具有廣泛之抗腫瘤活性且此已轉化為用於癌症治療之多種基於細胞激素的方法中(Lee及Margolin 2011, Cancers3(4):3856-93 )。許多細胞激素在臨床前或臨床發展中作為用於癌症免疫療法之潛在抗腫瘤免疫反應藥劑，尤其包括：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18及IL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNα (干擾素α)、IFNβ及IFNγ。
拮抗劑抗-VISTA抗體及含有其之醫藥組合物亦可結合其他化合物或免疫療法一起投與。例如，組合療法可包括與至少一種其他治療劑或免疫調節劑或免疫刺激策略組合之本發明之化合物，包括(但不限於)腫瘤疫苗、授受性T細胞療法、Treg損耗、抗體(例如貝伐珠單抗(bevacizumab)、愛必妥(Erbitux))、肽、肽體、小分子、化療劑(諸如細胞毒性及細胞增殖抑制劑，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、順鉑(cisplatin)、長春瑞濱(vinorelbine)、多烯紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、替莫唑胺(temozolomide)、伊立替康(irinotecan)、5FU、卡鉑(carboplatin))、免疫修飾劑(諸如干擾素及介白素)、免疫刺激抗體、生長激素或其他細胞激素、葉酸、維生素、礦物質、芳香酶抑制劑、RNAi、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑等。
根據至少一些實施例，免疫細胞(較佳為T細胞)可活體內或離體接觸本發明之治療劑來調節免疫反應。與治療劑接觸之T細胞可為表現T細胞受體(包括α/β及γ/δ T細胞受體)之任何細胞。T細胞包括表現CD3之所有細胞，包括亦表現CD4及CDS之T細胞子集。T細胞包括未處理及記憶細胞以及效應細胞，諸如CTL。T細胞亦包括諸如Th1、Tel、Th2、Th2、Th3、Thl7、Th22、Treg及Trl細胞之細胞。T細胞亦包括NKT細胞及類似獨特類別之T細胞譜系。 促效性抗-VISTA抗體及含有其之醫藥組合物用於治療自體免疫性疾病之用途
根據至少一些實施例，如本文所述充當VISTA刺激性治療劑之抗-VISTA抗體、片段、其結合物或包含其之醫藥組合物可用於治療免疫系統相關疾病。
免疫系統相關病況視情況包含免疫相關病況、如本文引用之自體免疫性疾病、移植排斥反應及移植物抗宿主疾病及/或用於阻斷或促進VISTA介導之免疫刺激、如本文引用之免疫相關疾病及/或用於免疫療法(促進或抑制免疫刺激)。
免疫病況視情況選自自體免疫性疾病、移植排斥反應、發炎性疾病、過敏性病況或移植物抗宿主疾病。治療視情況與另一種適用於治療免疫相關病況之部分組合。
因此，使用根據本發明之至少一些實施例之藥劑治療多發性硬化可例如與視情況如本文所述之用於治療多發性硬化之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療類風濕性關節炎或其他關節炎病況可例如與視情況如本文所述之用於治療類風濕性關節炎之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療IBD可例如與視情況如本文所述之用於治療IBD之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療牛皮癬可例如與視情況如本文所述之用於治療牛皮癬之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療1型糖尿病可例如與視情況如本文所述之用於治療1型糖尿病之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療葡萄膜炎可例如與視情況如本文所述之用於治療葡萄膜炎之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療牛皮癬可例如與視情況如本文所述之用於治療牛皮癬之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療修格連氏症候群可例如與視情況如本文所述之用於治療修格連氏症候群之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療全身性紅斑狼瘡可例如與視情況如本文所述之用於治療全身性紅斑狼瘡之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療GVHD可例如與視情況如本文所述之用於治療GVHD之任何已知治療劑或方法組合。
因此，使用本發明之促效劑抗體治療慢性或急性感染及/或與其相關之肝毒性(例如肝炎)可例如與視情況如本文所述之用於治療慢性或急性感染及/或與其相關之肝毒性之任何已知治療劑或方法組合。
在上述治療中，較佳對患有上述或其他自體免疫或發炎性病況之一之受檢者投與本文中揭示之免疫抑制抗-VISTA抗體或根據本發明之抗原結合片段，該抗體模擬或刺激至少一種VISTA介導之對免疫性之作用，例如其抑止細胞毒性T細胞或NK活性及/或產生在疾病病理學中所涉及之促炎性細胞激素，由此預防或緩解疾病症狀且可能導致長期之病情緩解，例如由於誘導引發T細胞耐受性或延長之免疫抑止作用的Treg。
根據本發明之至少一些實施例，如本文中引用之治療劑及/或包含其之醫藥組合物可作為單獨活性成分投與或與免疫調節方案中之其他藥物或其他消炎劑一起投與，例如用於治療或預防同種異體或異種移植物急性或慢性排斥反應或發炎性或自體免疫性病症或誘發耐受性。 促效性抗-VISTA抗體及含有其之醫藥組合物用於治療敗血症之用途
根據至少一些實施例，如本文所述之VISTA抗體、片段、其結合物及/或醫藥組合物可用於治療敗血症。敗血症係一種可能威脅生命之感染併發症。敗血症代表在針對感染之初始宿主反應不當擴增且失調時發生對宿主有害的一種複雜的臨床症候群。敗血症中之初始過度發炎性階段(『細胞激素風暴』)之後為免疫抑止狀態(Hotchkiss等人2013 Lancet Infect. Dis. 13:260-268)。免疫性受損之此後期階段(亦稱為『免疫麻痹』)表現為無法明確初始感染、再活化病毒(諸如HSV及巨細胞病毒)且發生新的次級感染，其生物體常並非尤其對免疫活性患者具有毒性。大多數敗血症患者在初始遭遇過度發炎後如今仍可存活，僅在緊接之數日或數週存在敗血症誘發之多器官功能障礙之加護病房中死亡。敗血症誘發之免疫抑止日益被認為係該等易危患者中之主要的免疫功能障礙。病原體清除率在原發性感染後受損及/或對繼發性感染之易感性導致與敗血症相關之高發病率及死亡率。
根據本發明之至少一些實施例，提供如本文中引用之治療劑及/或包含其之醫藥組合物與已知治療劑之組合有效用於治療敗血症之用途。
根據本發明之至少一些實施例，提供如本文中引用之治療劑及/或包含其之醫藥組合物之組合可與用於敗血症之標準護理或新穎治療組合、與在敗血症之初始過度發炎階段阻斷細胞激素風暴之治療組合及/或與具有免疫刺激性作用之療法組合來克服敗血症誘發之免疫抑止階段。
用於敗血症之標準護理治療組合，如「International Guidelines for Management of Severe Sepsis and Septic Shock」(Dellinger等人2013 Intensive Care Med39: 165-228)所推薦，其中一些在下文中描述。 1. 針對所有可能之病原體(細菌及/或真菌-當診斷出敗血症時，即開始治療，但未識別到特異性病原體)具有活性之廣譜抗生素-實例為頭孢噻肟(Cefotaxime)(Claforan ®)、替卡西林(Ticarcillin)及克拉維酸(clavulanate)(Timentin ®)、哌拉西林(Piperacillin)及他唑巴坦(tazobactam)(Zosyn ®)、亞胺培南(Imipenem)及西司他丁(cilastatin)(Primaxin ®)、美羅培南(Meropenem)(Merrem ®)、克林黴素(Clindamycin)(Cleocin)、甲硝唑(Metronidazole)(Flagyl ®)、頭孢曲松(Ceftriaxone)(Rocephin ®)、環丙沙星(Ciprofloxacin)(Cipro ®)、頭孢吡肟(Cefepime)(Maxipime ®)、左氧氟沙星(Levofloxacin)(Levaquin ®)、萬古黴素(Vancomycin)或所列藥物之任意組合。 2. 血管加壓劑：實例為去甲腎上腺素、多巴胺(Dopamine)、腎上腺素、血管加壓素 3. 類固醇：實例：氫化可的松(Hydrocortisone)、地塞米松(Dexamethasone)或氟氫可的松(Fludrocortisone)、靜脈內或其他影響肌收縮力之治療：實例為用於患有心肌功能障礙之敗血症患者之多巴酚丁胺(Dobutamine) 4. 重組人類活化蛋白C (rhAPC)，諸如除栓素α (drotrecogin α) (活化型)(DrotAA)。 5. 額外減少局部及全身性發炎之β-阻斷劑。 6. 代謝干預，諸如丙酮酸鹽、琥珀酸鹽或高劑量胰島素取代。 抗-VISTA抗體及含有其之醫藥組合物用於減少在基因或細胞治療或移植後之不利免疫活化的用途
如本文所用之術語「基因療法」涵蓋任何類型之基因療法、載體介導之基因療法、基因轉移、病毒介導之基因轉移且進一步涵蓋某些細胞療法，例如CAR T及CAR NK細胞療法。根據本發明之至少一些實施例，如本文所述之標靶VISTA且對免疫反應具有抑制活性之促效劑VISTA抗體、片段、其結合物及/或醫藥組合物可用作用於減少在用於治療各種遺傳性疾病之基因或細胞治療後之不利免疫活化的治療劑。不希望受單一假設限制，該等抗體對免疫反應具有類似VISTA之抑制活性及/或視情況藉由抑制病原體T細胞及/或NK細胞來增強VISTA免疫抑制活性。
用於治療遺傳性疾病之多種基因治療產品目前處於臨床試驗中。最近之研究記載了使用基因治療載體成功治療了若干種遺傳性疾病。基因治療策略之特徵在於3種重要因素：待轉移之基因、基因將引入其中之標靶組織及用於促進基因進入標靶組織之載體(基因運載工具)。大多數基因治療臨床試驗已採用病毒載體作為極有效之運載工具，包括逆轉錄病毒、豆狀病毒、腺病毒、腺相關病毒、假型病毒及單純疱疹病毒。然而，人類免疫系統與基因治療載體之所有組分之間之相互作用似乎代表對長久治療功效之主要限制之一。人類研究已證實對於病毒載體之宿主免疫反應的可能性較高。導致形成中和抗體及/或由細胞毒性細胞破壞轉導細胞的對於病毒或轉基因產物本身之該等免疫反應可極大地干擾治療功效(Seregin及Amalfitano 2010 Viruses2:2013；Mingozzi and High 2013 Blood 122:23；Masat等人2013 Discov Med. 15:379)。因此，規避免疫反應及促進轉基因治療性蛋白之長期表現的研發策略係基因治療在臨床中成功的主要挑戰之一。
影響針對病毒載體編碼之轉基因蛋白之免疫反應的因素包括投藥途徑、載體劑量、轉基因蛋白之免疫原性、宿主之發炎狀態及衣殼血清型。該等因素被認為藉由觸發先天免疫性、細胞激素產生、APC成熟、抗原呈現且最終對功能性效應子引發天然T淋巴細胞而影響免疫原性(Mingozzi及High 2013 Blood122:23)。因此，出現藉由干擾該等機制抑制免疫活化之觀點旨在誘發短期免疫抑止、避免在投與載體後引發早期免疫及促進長期耐受性。
作為在基因治療後，尤其在多次注射後抑制不利免疫活化之策略，在動物模型中測試藉由在載體運載時靶向免疫反應之兩個非冗餘檢查點的免疫調節療法。在滴注至小鼠或猴之肺中之腺病毒載體上研究載體介導之免疫反應證實以抗-CD40L抗體短暫治療導致抑止腺病毒誘發之免疫反應；因此，應對動物再次投與腺病毒載體。由此Ab短期治療導致對免疫功能之長期作用且使對腺病毒特異性體液反應之抑制延長至超過Ab作用不再顯著之時間，表明阻斷此共刺激路徑之治療潛能作為一種免疫調節方案以供可投與基因轉移載體(Scaria等人1997 Gene Ther. 4: 611；Chirmule等人 2000 J. Virol. 74: 3345)。其他研究證實在投與初級載體時共同投與CTLA4-Ig及抗-CD40L Ab減小對載體之免疫反應、延長長期腺病毒介導之基因表現且使得即使在不再存在該等藥劑之免疫抑止作用之後仍可使二級腺病毒介導基因轉移，表明由短暫免疫抑止療法可能獲得持久性以及二級腺病毒介導之基因轉移(Kay等人1997 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.94:4686)。在另一研究中，類似地投與CTLA4-Ig及抗-CD40L Ab消除形成針對載體之中和Ab且使得可基因轉移表現，其限制條件在於在每次基因轉移注射期間投與治療(Lorain等人2008 Molecular Therapy16:541)。此外，向小鼠投與CTLA4-Ig (即使單次投藥)導致在早期時間點抑止免疫反應且延長轉基因表現(Adriouch等人2011 Front. Microbiol. 2: 199)。然而，僅CTLA4-Ig不足以永久性地消除針對轉基因產物之免疫反應。以CTLA4-Ig及PD-L1或PDL-2靶向兩個免疫檢查點之組合治療導致在較晚之時間點協同性地改良轉基因耐受性，藉由可能靶向免疫調節之兩種非冗餘機制，導致長期轉基因持續性及表現(Adriouch等人2011 Front. Microbiol. 2: 199)。
根據本發明之至少一些實施例，本發明之促效劑可用於克服免疫反應對基因治療之限制，可用於減少在單獨或與其他活性物之基因療法後不利之免疫活化作用。目前之方法包括排除具有針對傳遞載體之抗體的患者、投與高劑量載體、使用空的衣殼吸附抗載體抗體以允許後續載體轉導、重複血漿交換(血漿去除法)循環以吸附免疫球蛋白及減少抗載體抗體效價。
試圖克服該等限制之新穎方法可分為兩大類：選擇性地修飾Ad載體本身及預先免疫調節宿主(Seregin及Amalfitano 2010 Viruses2:2013)。第一類包含若干種創造性策略，包括：(1) Ad-衣殼呈現特異性抑制劑或配位體；(2)共價修飾完整之Ad載體衣殼部分；(3)使用組織特異性啟動子及局部投藥途徑；(4)使用基因體修飾之Ad；及(5)研發嵌合或替代性血清型Ad。
第二類方法包括使用免疫抑止藥物或特異性化合物來阻斷重要免疫路徑，其已知由病毒載體誘發。已在臨床前研究中測試免疫抑止性藥劑且展示有效預防或根除對轉移載體及轉基因產物之免疫反應。該等藥劑包括普通免疫抑止劑，諸如環孢素A；環磷醯胺；FK506；糖皮質激素或類固醇，諸如地塞米松；TLR9阻斷劑，諸如TLR9拮抗劑寡核苷酸ODN-2088；具有抗-TNF-a抗體或TNFR-Ig抗體之TNF-a阻斷劑、Erk及其他信號轉導抑制劑，諸如U0126。在臨床環境中，投與糖皮質激素已由將表現人類因子IX轉基因之腺病毒相關病毒(AAV)載體經肝基因轉移至嚴重血友病B患者而成功用於鈍化針對病毒衣殼之T細胞反應(Nathwani等人2011 N. Engl. J. Med. 365:2357)。
與先前使用傾向於「全面地」且非特異性地免疫抑止宿主之藥物的方法相反，已研發出更具選擇性之免疫抑止方法。該等方法包括使用對諸如CD40與CD154之間、ICOS與ICOSL之間、CD28與CD80或CD86 (包括CTLA4-Ig)之間、NKG2D與NKG2D配位體之間、LFA-1與ICAM之間、LFA-3與CD2之間、4-1BB與4-1BBL之間、OX40與OX40L之間、GITR與GITRL之陽性共刺激相互作用提供阻礙之藥劑及刺激諸如CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-1、TEVI-3、KIRs及B7-H4與B7-H3之受體之陰性共刺激受體的藥劑。在臨床前或臨床移植研究中已使用該等藥劑中之一些(Pilat等人2011 Sem. Immunol. 23:293)。
在上述基因或細胞療法中或在治療移植適應症中，較佳將向已接受或欲接受細胞或基因療法之受檢者或向移植組織或器官投與本文所揭示之免疫抑制性抗-VISTA抗體或根據本發明之抗原結合片段，該抗體增強、刺激或模擬至少一種VISTA介導之對免疫性之作用，例如其對細胞毒性T細胞或NK活性之抑制作用及/或其對產生促炎性細胞激素之抑制作用，或其對Treg之刺激作用，從而防止或減少針對療法中所用之細胞或基因的宿主免疫反應或針對移植細胞、器官或組織之不利免疫反應。治療較佳將引發延長之針對移植或灌注細胞、組織或器官之免疫耐受性。在某些情形下，例如在含有免疫細胞之移植細胞、組織或器官之情形下，本文揭示之免疫抑制性抗-VISTA抗體或抗原結合片段可在輸注或移植之前與細胞、組織或器官接觸，及/或可能與移植受者之免疫細胞接觸以耐受免疫細胞且可能預防不利之免疫反應或GVHD免疫反應。 醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如醫藥組合物，其含有根據本發明之抗人類VISTA抗體之一或組合及視情況另一種免疫抑止劑或其他活性劑。因此，本發明之特徵在於一種包含治療有效量之根據本發明至少一些實施例之抗人類VISTA抗體的醫藥組合物。特定而言，本發明之特徵在於一種包含治療有效[免疫抑止]量之至少一種根據本發明之促效劑抗人類VISTA抗體或抗體片段的醫藥組合物。
根據本發明之至少一些實施例之醫藥組合物[亦即，在本文所揭示之VISTA拮抗劑抗體之情形下]可用於治療癌症，其中癌症係非轉移性、侵襲性或轉移性的及/或用於治療免疫相關病症、自體免疫、過敏、GVHD、發炎或與感染性病症及/或敗血症相關之肝毒性[亦即，在本文所揭示之VISTA促效劑抗體之情形下]。「治療」係指治療性處理及預防性或防治性措施。需要治療之彼等包括已患病症之彼等以及將要預防病症之彼等。因此，本文中待治療之哺乳動物可已診斷患有病症或可傾向於患病或對該病症易感。用於治療目的之「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家養及農場動物以及動物園、運動或寵物動物，諸如狗、馬、貓、奶牛等。哺乳動物較佳為人類。
術語「治療有效量」係指有效治療哺乳動物之疾病或病症的根據本發明之藥劑之量。本發明之治療劑可單獨或作為醫藥組合物之部分提供給受檢者，該等治療劑在該醫藥組合物中係與醫藥學上可接受之載劑混合。在多種情形下，根據本發明之促效劑或拮抗劑抗-VISTA抗體將與其他免疫治療劑或適用於治療特定病況之其他治療劑組合使用。
若組合物之投與可為接受患者所耐受，則稱其為「醫藥學上可接受之載劑」。如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗料、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑及其類似物。載劑較佳適合靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。
該等組合物包括無菌水、緩衝生理食鹽水(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH及離子強度及視情況之添加劑，諸如清潔劑及增溶劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如硫柳汞(Thimersol)、苄醇)及增積物質(例如乳糖、甘露糖醇)。如下文詳述，亦可使用非水性溶劑或媒劑。
在根據本發明之至少一些實施例之醫藥組合物中可採用之合適含水及不含水載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其合適之混合物，植物油(諸如橄欖油)及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。例如可藉由使用塗佈材料(諸如卵磷脂)、藉由維持在分散液情形下所需之粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。視投藥途徑而定，特異性地結合VISTA蛋白或雙特異性分子中任一者之活性化合物(亦即含有相同及/或不同天然骨架之單株或多株抗體及抗原結合片段及結合物)可在一種材料中經塗佈以保護化合物免受酸及可使化合物失活之其他天然條件的作用。根據本發明之至少一些實施例之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保持親本化合物所需之生物學活性且未賦予任何不利之毒理性作用的鹽(參見例如Berge, S. M.等人(1977) J. Pharm. Sci.66: 1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物)以及衍生自無毒有機酸(諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物)之彼等鹽。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及衍生自無毒有機胺(諸如Ν,Ν'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物)之彼等鹽。
根據本發明之至少一些實施例之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
該等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由上文之殺菌程序或藉由包涵各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止存在微生物。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包涵延遲吸附之藥劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)導致可注射醫藥形式之吸附延長。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌注射溶液或分散液之無菌粉末。此項技術中已知該等介質及藥劑用於醫藥學活性物質之用途。除了任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容以外，預期其在根據本發明之至少一些實施例之醫藥組合物中之用途。補充之活性化合物亦可併入組合物中。
治療組合物在製造及儲存條件下通常必須係無菌且穩定的。組合物可經調配為適合高藥物濃度之溶液、微乳液、脂質體或其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散液介質。例如可藉由使用塗層(諸如卵磷脂)、在分散液之情形下藉由維持所需之粒度或藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。在多種情形中，較佳在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇，諸如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸附之藥劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)導致可注射組合之吸附延長。可藉由視需要在具有上述成分之一或其組合之適當溶劑中併入所需量之活性化合物，繼而無菌微過濾來製備無菌注射溶液。通常藉由向含有鹼性分散介質及來自上文所述彼等之所需其他成分的無菌媒劑中併入活性化合物來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液之無菌粉末之情形下，較佳之製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性成分加上來自其先前之無菌過濾溶液之任何其他所需成分之粉末。
可藉由視需要在具有上述成分之一或其組合之適當溶劑中併入所需量之活性化合物，繼而無菌微過濾來製備無菌注射溶液。通常藉由向含有鹼性分散介質及來自上文所述彼等之所需其他成分的無菌媒劑中併入活性化合物來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液之無菌粉末之情形下，較佳之製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性成分加上來自其先前之無菌過濾溶液之任何其他所需成分之粉末。
本發明之組合物可使用此項技術中已知之各種方法中之一或多者經由一或多種投藥途徑來投與。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或模式將視所需之結果而變化。對於根據本發明之至少一些實施例之治療劑而言，較佳之投藥途徑包括靜脈內傳遞(例如注射或輸注)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊髓、經口、經腸、直腸、肺部(例如吸入)、經鼻、局部(包括經皮、經頰及舌下)、膀胱內、玻璃體內、腹膜內、陰道、大腦傳遞(例如腦室內、大腦內及對流增強擴散)、CNS傳遞(例如鞘內、髓周及脊髓內)或非經腸(包括皮下、肌肉內、靜脈內及皮內)、透黏膜(例如舌下投藥)、投藥或經由植入或其他非經腸投藥途徑投與，例如藉由注射或輸注或其他傳遞途徑及/或此項技術中已知之投藥形式。如本文所用之短語「非經腸投藥」意謂除經腸及局部投藥以外之投藥模式，通常藉由注射且包括(不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊髓內、硬膜上及胸骨內注射及輸注。在一特定實施例中，根據本發明之至少一些實施例之蛋白、治療劑或醫藥組合物可經腹膜內或靜脈內投與。
或者，根據本發明之VISTA特異性抗體可經由非腸胃外途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部。
活性化合物可由保護化合物以免快速釋放之載劑來製備，諸如受控釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備該等調配物之多種方法係專利的或通常為熟習此項技術者所知。參見例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
治療組合物可由此項技術中已知之醫學裝置來投與。例如，在一較佳實施例中，根據本發明之至少一些實施例之治療組合物可由針管皮下注射裝置來投與，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中揭示之裝置。適用於本發明中之熟知植入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示一種用於以受控速率分配藥物之植入式微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其揭示一種用於經皮膚投與藥物之治療裝置；美國專利第4,447,233號，其揭示一種用於以精確之輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示一種用於連續藥物傳遞之變流量植入式輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭示一種具有多腔隔室之滲透性藥物傳遞系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示一種滲透性藥物傳遞系統。該等專利以引用之方式併入本文中。熟習此項技術者已知多種其他該等植入物、傳遞系統及模組。
在某些實施例中，抗-VISTA抗體可經調配以確保在活體內適當分佈。例如，血-腦障壁(BBB)排除多種高親水性化合物。為確保根據本發明之至少一些實施例之治療性化合物穿過BBB (若需要)，其例如可在脂質體中調配。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。脂質體可包含一或多個選擇性地輸送至特異性細胞或器官中之部分，因此增強靶向藥物傳遞(參見例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685)。例示性靶向部分包括葉酸鹽或生物素(參見例如Low等人之美國專利第5,416,016號)；甘露糖(Umezawa等人，(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038)；抗體(P. G. Bloeman等人(1995) FEBS Lett. 357: 140；M. Owais等人(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180)；界面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人(1995) Am. J Physiol. 1233: 134)；pl20 (Schreier等人(1994) J. Biol. Chem. 269:9090)；亦參見K. Keinanen；M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123；J. J. Killion；及I. J. Fidler (1994) Immunomethods4:273。
在又一實施方案中，本發明之免疫結合物可藉由將化合物(例如治療劑、標記、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑止劑等)連接至本文揭示之抗體而用於將該等化合物靶向具有VISTA細胞表面受體之細胞。因此，本發明亦提供離體或活體內定位表現VISTA之細胞的方法(例如由可偵測之標記，諸如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子)。或者，免疫結合物可藉由將細胞毒素或放射性毒素靶向VISTA抗原而用於殺死具有VISTA細胞表面受體之細胞。
如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」包括在生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗細菌及抗真菌劑、等張劑及吸附延遲劑及其類似物。載劑較佳適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即含有VISTA抗原之胞外域、抗體、免疫結合物、替代性骨架及/或雙特異性分子之可溶性多肽結合物)可塗佈在材料中來保護化合物免受酸及其他可能使化合物失活之天然條件的作用。根據本發明之至少一些實施例之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保留親本化合物之所需生物活性且不賦予任何不利之毒理作用的鹽(參見例如Berge, S. M.等人(1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物)以及衍生自無毒有機酸(諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物)之彼等鹽。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及衍生自無毒有機胺(諸如Ν,Ν'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物)之彼等鹽。
根據本發明之至少一些實施例之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。在根據本發明之至少一些實施例之醫藥組合物中可採用之合適水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其合適之混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。例如可藉由使用塗佈材料(諸如卵磷脂)、在分散液之情形下藉由維持所需之粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。
該等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由上文之殺菌程序及藉由包涵各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物)來確保防止存在微生物。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包涵延遲吸附之藥劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)導致可注射醫藥形式之吸附延長。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌注射溶液或分散液之無菌粉末。此項技術中已知該等介質及藥劑用於醫藥學活性物質之用途。除了任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容以外，預期其在根據本發明之至少一些實施例之醫藥組合物中之用途。補充之活性化合物亦可併入組合物中。
治療組合物在製造及儲存條件下通常必須係無菌且穩定的。組合物可經調配為適合高藥物濃度之溶液、微乳液、脂質體或其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散液介質。例如可藉由使用塗層(諸如卵磷脂)、在分散液之情形下藉由維持所需之粒度或藉由使用界面活性劑來維持適當之流動性。在多種情形中，較佳在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇，諸如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸附之藥劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)導致可注射組合之吸附延長。可藉由視需要在具有上述成分之一或其組合之適當溶劑中併入所需量之活性化合物，繼而無菌微過濾來製備無菌注射溶液。通常藉由向含有鹼性分散介質及來自上文所述彼等之所需其他成分的無菌媒劑中併入活性化合物來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液之無菌粉末之情形下，較佳之製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性成分加上來自其先前之無菌過濾溶液之任何其他所需成分之粉末。
可藉由視需要在具有上述成分之一或其組合之適當溶劑中併入所需量之活性化合物，繼而無菌微過濾來製備無菌注射溶液。通常藉由向含有鹼性分散介質及來自上文所述彼等之所需其他成分的無菌媒劑中併入活性化合物來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液之無菌粉末之情形下，較佳之製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性成分加上來自其先前之無菌過濾溶液之任何其他所需成分之粉末。
可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分的量將視受治療之受檢者及特定投藥模式而變化。可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分的量通常將為產生治療作用之組合物的量。通常在百分之百中，此量將在約0.01%至約99%活性成分、較佳約0.1%至約70%，最佳約1%至約30%活性成分與醫藥學上可接受之載劑組合之範圍內。
調整劑量方案以提供最佳之所需反應(例如，治療反應)。例如，如治療情形之緊急狀態所示，可投與單次推注、可隨時間投與若干次分開給藥或按比例減少或增加劑量。尤其有利的係將非經腸組合物調配為單位劑型以便於投藥及劑量之均一性。如本文所用之單位劑型係指適合以單位劑型用於待治療之受檢者之物理離散單元；每個單元含有經計算與所需之醫藥學載劑結合產生所需治療作用之預定量之活性化合物。根據本發明之至少一些實施例之單位劑型之規格由(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療作用及(b)此項技術中關於混配該活性化合物以用於治療個體敏感性所固有之限制所指示且直接取決於此。
對於投與本文所揭示之VISTA抗體而言，劑量在約0.0001至100 mg/kg且更通常0.01至5 mg/kg宿主體重之範圍內。例如，劑量可為0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg之範圍內。例示性之治療方案必需每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每3至6個月一次來投藥。對於根據本發明之至少一些實施例之本文中揭示之抗體而言，較佳給藥方案包括1 mg/kg體重或3 mg/kg體重經由靜脈內投藥，其中本文中揭示之抗體使用以下給藥時程之一來給藥：(i)每四週一次，六次給藥，隨後每三個月給藥一次；(ii)每三個月給藥一次；(iii) 3 mg/kg體重給藥一次，繼而1 mg/kg體重每三週給藥1次。
在一些方法中，同時投與兩種或兩種以上具有不同結合特異性之單株抗體，在此情形下所投與之本文揭示之每種抗體之劑量在所示範圍內。通常在多種情形下投與本文揭示之抗體。單次給藥之間之間隔例如可為每天、每週、每月、每三個月或每年。如藉由量測患者體內針對標靶抗原之抗體的血液水準所示，間隔亦可為不規則的。在一些方法中，調整劑量以達成約1-1000 μg/ml之血漿抗體濃度，且在一些方法中為約25-300 μg/ml。
或者，治療劑可作為持續釋放調配物投與，在此情形下需要較少頻率之投藥。劑量及頻率視治療劑在患者體內之半衰期而變化。一般而言，人類抗體展示最長之半衰期，繼而為人源化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。融合蛋白之半衰期可廣泛變化。投藥劑量及頻率可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，經長時間以相對不經常之間隔投與相對低之劑量。某些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較短間隔之相對高劑量，直至減少或終止疾病進程且較佳直至患者展示對疾病症狀之部分或完全緩解。此後可對患者投與預防性方案。
本發明之醫藥組合物中之活性成分之實際劑量水準可變化以獲得對於特定患者、組合物及投藥模式而言有效達成所需治療反應而對患者無毒之量的活性成分。選擇之劑量水準將取決於多種藥物動力學因素，包括本發明所採用特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所採用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料，經治療患者之年齡、性別、體重、病況、一般健康狀況及先前之醫藥史及其在醫學領域中熟知之類似因素。
儘管已描述本發明，但提供以下實例來進一步說明本發明及其固有之優勢。 實例 實例1： 使用分析篩檢免疫抑止性抗-小鼠VISTA Ab
本發明人研發各種分析來篩檢假定之促效性抗-小鼠VISTA抗體。如圖1中所示，活體外及活體內篩檢分析用於識別免疫抑止性抗-VISTA mAb。在圖1A中之實驗中，在所示mAb存在下歷時72小時將經純化之T細胞塗在抗-CD3之頂上。藉由H3合併來量測增殖。在圖1B中之實驗中，在所示抗體存在下歷時6天藉由ISQ脈衝式APC刺激純化之DO11.10 T細胞。經由使用CTV稀釋染料來量測增殖。在圖1C中之實驗中，藉由將C57BL/6細胞轉移至經輻射之BALB/c受者中誘發GVHD。在轉移後第0天、第2天及第4天對小鼠經腹膜內(I.P.)注射200 μg抗體並分析存活率。在圖1D中之實驗中，在投與ConA (15 mpk)之前3小時，以10 mpk所示抗體處理小鼠，且在電漿中藉由Luminex以6分析IL-2。
更特定而言，在第一分析中，分離CD4 +T細胞且以Ab1、Ab2或Ab3培育，之後添加至抗-CD3塗佈之培養盤中。培養3天後，以氚化胸苷脈衝細胞，其藉由使細胞增殖而併入。應注意，Ab1與Ab2兩者均誘發對T細胞之增殖速率的顯著降低，而Ab3無用(圖1)。在相反以抗原脈衝APC刺激轉基因T細胞之類似分析中，藉由增殖染料稀釋量測T細胞活化。與抗-CD3分析類似，Ab1抑止約50%之抗原特異性T細胞增殖(圖1B)。該等資料表明Ab3 mAb阻斷mVISTA功能(亦即，增強免疫反應)，而Ab1及Ab3刺激mVISTA功能且下調重要之免疫反應。
吾人亦確定使用活體內動物模型是否可辨別Ab3與Ab1，尤其在GVHD及ConA肝炎模型中。經對照抗體(Ham Ig)處理之患有GVHD之小鼠患有進行性疾病且如預期在移植後4週需要處以安樂死(圖1C)。經Ab3處理之小鼠亦對GVHD易感，且實際上大多數小鼠先於對照處理組死亡，表明Ab3可使疾病惡化。相反，所有經Ab1處理之小鼠未展示明顯之GVHD症狀且幾乎所有均保持健康至少40天。尤其在該等實驗中，經對照抗體(Ham Ig)處理之患有GVHD之小鼠患有進行性疾病且如預期在移植後4週需要處以安樂死(圖1C)。經Ab3處理之小鼠亦對GVHD易感，且實際上大多數小鼠先於對照處理組死亡，表明Ab3可使疾病惡化。相反，所有經Ab1處理之小鼠未展示明顯之GVHD症狀且幾乎所有均保持健康至少40天。
在ConA模型中，發明人測試是否每種VISTA抗體均影響良好表徵之對ConA之T細胞細胞激素反應。應注意，Ab1誘發減少之血漿細胞激素水準之IL-2，但Ab3並未如此(圖1D)。特定而言，在ConA模型中，發明人進一步測試是否每種VISTA抗體均影響良好表徵之對ConA之T細胞細胞激素反應。應注意，Ab1誘發減少之血漿細胞激素水準之IL-2，但Ab3並未如此(圖1D)。
因此，該等結果表明抗-VISTA mAb (Ab1與Ab2)具有免疫抑止性且亦已證實該等免疫抑止性抗小鼠VISTA抗體可區別於發炎免疫抑止性抗小鼠VISTA抗體(Ab3)。如圖1中所示，Ab1在多種發炎模型中係有效的(免疫抑止性)，該等模型包括GVHD、NZB/W F1狼瘡樣絲球體腎炎、伴刀豆球蛋白A (ConA)誘發之肝炎、膠原蛋白抗體誘發之關節炎(CAIA)及咪喹莫特誘發之牛皮癬。在每種該等疾病中，在疾病進程期間投與Ab1極大地減少病狀及/或死亡率。列舉之每種模型對用於疾病進展之T細胞均具有獨特要求。GVHD及ConA兩者均由Th1 T細胞反應來驅使。 實例2： 識別在不同自體免疫疾病模型中抑止自體免疫之抗-VISTA Ab
在圖2A-F中之實驗中，再次比較不同抗-小鼠VISTA Ab在不同疾病模型中之作用。在圖2A中之實驗中，自25週開始每週3次以Ab1或Ham Ig (200 μg)處理NZB/W F1小鼠，直至實驗結束。「X」表示對照處理組全部犧牲時之時間點。在圖2B中之實驗中，在投與15 mg/kg (mpk) ConA之前3小時以200 μg抗體處理小鼠且追蹤存活率歷時80小時。在圖2C中之實驗中，相繼以膠原蛋白II mAb、繼而以LPS處理小鼠且藉由量測腳爪腫脹來量測關節炎。在該等實驗中，每隔一天投與3次Ab1及Ham-Ig (200 μg)。在圖2D中之實驗中，每天向小鼠耳朵塗覆咪喹莫特。在第14天，每隔一天投與Ab1或Ham-Ig (200 μg)且以測徑規量測耳朵厚度。在相同圖2E-F中之實驗中，每天向小鼠背部塗覆咪喹莫特。在第9天，對小鼠施以安樂死且對皮膚進行切片並染色以供由IHC進行CD3表現。
如圖2A-F中所示，在每個該等實驗模型中，在特定疾病之進程期間投與Ab1極大地減少病狀及/或死亡率。列舉之每種模型對用於疾病進展之T細胞均具有獨特要求。GVHD及ConA兩者均由Th1 T細胞反應來驅使。
咪喹莫特誘發之牛皮癬係一種IL-17/23驅使之疾病，其中T細胞被募集至皮膚之真皮層中。Ab1使真皮中之CD3 +細胞數量劇烈減少(圖2E及F)，但對脾臟之T細胞群體無影響(資料未展示)，表明此抗-小鼠VISTA Ab優先抑止發炎病變處之免疫性。
NZB/W F1狼瘡係一種具有來自B細胞、T細胞及骨髓細胞之貢獻因素的多因素疾病。在此模型中，治療性投與Ab1降低蛋白尿水準，表明對腎臟之損害減少。最後，CAIA不包涵適應免疫性，相反由巨噬細胞及顆粒球驅使。抗-VISTA在此模型中之抑止作用亦可影響骨髓隔室。因此，抑止VISTA mAb似乎介導對T細胞及先天免疫隔室之作用。
因此，如圖1及圖2中所示，單株倉鼠抗-小鼠VISTA Abs Ab1及AB2誘發對T細胞之增殖速率的顯著降低，而Ab3無用(圖1)。在以抗原脈衝APC刺激轉基因T細胞之類似分析中，藉由增殖染料稀釋量測T細胞活化。與抗-CD3分析類似，Ab1抑止約50%之抗原特異性T細胞增殖(圖1B)。該等資料表明Ab1及Ab2刺激VISTA功能且由此下調重要之免疫反應。
特定而言，Ab1 (一種倉鼠抗小鼠VISTA抗體)在多種發炎模型中有效，該等模型包括GVHD、NZB/W F1狼瘡樣絲球體腎炎、伴刀豆球蛋白A (ConA)誘發之肝炎、膠原蛋白抗體誘發之關節炎(CAIA)及咪喹莫特誘發之牛皮癬(圖1及2)。在每種該等疾病中，在疾病進程期間投與Ab1極大地減少病狀及/或死亡率。列舉之每種模型對用於疾病進展之T細胞均具有獨特要求。GVHD及ConA兩者均由Th1 T細胞反應來驅使。如上所述，咪喹莫特誘發之牛皮癬係一種IL-17/23驅使之疾病，其中T細胞被募集至皮膚之真皮層中。因此，Ab1在此特定自體免疫模型中之抑止作用表明此抗體亦可影響骨髓隔室。因此，該等免疫抑止抗-小鼠VISTA mAb似乎介導對T細胞及先天免疫隔室之作用。 實例3： 研發人類VISTA敲入小鼠以用於篩檢促效性抗人類VISTA Ab
先前之實例係關於促效性抗-小鼠VISTA Ab之分離及表徵。文獻中迄今為止尚未報導促效性抗人類VISTA Ab。儘管如此，本發明之受讓人及其他組已識別極多之拮抗性抗人類VISTA抗體。因此，在本發明之前，尚不確定是否將識別促效性抗人類VISTA抗體。
該等抗體將高度有益，因為目前尚無獲得批准之人類治療劑採用NCR之天然功能來抑止免疫反應。儘管Orencia (CTLA4-Ig)係有效的，但其僅藉由阻斷CD28-B7相互作用及路徑來起作用，且不藉由刺激下調路徑來運作。如下文實例中所示之2種不同促效性抗-VISTA mAb之有效免疫抑止作用所說明，此路徑之參與可證明係對管理不同人類自體免疫性疾病之一次革命。此外，抗-VISTA對適應性及先天性自體免疫效應機制之免疫抑止性作用使其不同於多種其他消炎劑。
關於上文，假定在篩檢促效性抗人類VISTA Ab中所需且必要之試劑為人類VISTA敲入小鼠。本發明之受讓人已產生人類VISTA敲入小鼠(「hV-KI小鼠」)。該等hV-KI小鼠表現人類VISTA代替小鼠VISTA。特定而言，如圖3中所示，將CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、Treg (CD4 +FoxP3 +)及單核細胞、CD11b +、Ly6C +、Ly6G -自WT及VISTA KI小鼠之淋巴結分離且以分別針對小鼠或人類蛋白之αVISTA抗體染色。hV-KI之表現模式與在WT小鼠中可見之相同，因為CD4 +及CD8 +T細胞、調節性T細胞及單核細胞在兩個菌株之間均表現一致量之表面蛋白(參見圖3)。
另外，hV-KI小鼠未發生在VISTA KO小鼠中觀測之發炎性疾病之任何徵象，表明hVISTA在小鼠免疫系統中具有完全功能(治療未展示)。因此，此小鼠模型可用於不同分析以供篩檢免疫抑止性mAb。 實例4： 假定促效性抗人類VISTA抗體之合成
圖4中含有不同抗人類VISTA抗體之序列。該等抗體特異性地結合至人類VISTA(例如VSTB49-VSTB116)且具備VISTA拮抗劑特性，亦即當呈IgG1格式時，該等抗體抑制VISTA對免疫性之抑止作用，例如當抗體包含野生型之IgG1 Fc區時，亦即未經修飾。
圖4中識別之抗體尤其為1E8。此鼠科抗人類VISTA抗體包含下文列舉之可變重鏈及輕鏈鏈多肽且由發明人轉化為兩種人類嵌合形式。在本文中稱為INX800之第一嵌合抗體藉由將人類IgG2重鏈及輕鏈恆定區多肽連接至1E8可變重鏈及輕鏈鏈多肽來獲得。在此第一嵌合抗體中，IgG2恆定區內無胺基酸殘基經修飾。
在本文中稱為INX801之第二嵌合抗體類似地藉由將人類IgG2重鏈及輕鏈恆定區多肽連接至1E8可變重鏈及輕鏈鏈多肽來獲得。在此第二嵌合抗體中，位於人類IgG2κ鏈中127位之半胱胺酸殘基經轉化為絲胺酸。另外，IgG2恆定區內無胺基酸殘基經修飾。 IE8 V H多肽 EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEVYPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALYYCARGRGDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:57) IE8 V L多肽 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLSWYHQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQNFWSTPFTFGSGTKLEIKR.(SEQ ID NO:58) 實例5： 在ConA動物模型中評估假定促效性抗人類VISTA抗體
在伴刀豆球蛋白A肝炎模型中比較嵌合IgG2抗體與對照抗體兩者之作用。在此活體內模型中，在投與伴刀豆球蛋白A之前3小時，對不同動物預先給藥10 mg/kg之嵌合IgG2抗體(INX800或INX801)或對照抗體。在投與抗體後3小時，隨後以12 mg/kg對小鼠給藥ConA。隨後在ConA給藥後6小時，藉由心臟穿刺對該等動物及對照物採血。所有動物表現良好，無明顯發病率或死亡率。
隨後分析血液之細胞激素表現。特定而言，使用由使用習知方法自所收集之血液樣品獲得之血漿及習知用於細胞激素分析之細胞激素測試套組來運行32-plex。如圖5中所示，與對照動物相比，若干種促炎性細胞激素在經投與INX800或INX801抗體之動物中之表現受到顯著抑止。特定而言，與對照物相比，在經INX800或INX801處理之動物中之GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17及TNF-α水準全部顯著較低。該等細胞激素之[減少]表現在經INX800或INX801處理之動物中實質上相同。
又，與對照物相比，在經INX800或INX801處理之動物中，某些趨化因子(角質細胞衍生之趨化因子或「KC」)及巨噬細胞發炎蛋白2 (MIP-2)之表現實質上增加。又，該等蛋白之[增加]表現在經INX800或INX801處理之動物中實質上相同。基於該等結果，INX800及INX801兩者似乎為有效之VISTA促效劑，因為其似乎引發與VISTA對各種發炎細胞激素之表現所引發之類似的免疫抑止作用。 實例6： 在移植物抗宿主疾病(GVHD)動物模型中評估假定促效性抗人類VISTA抗體
與未經處理之動物或經無關抗體處理之對照物相比，亦在移植物抗宿主疾病(GVHD)動物模型中比較相同假定促效性抗人類VISTA抗體、INX800及INX801之作用。在此動物模型中，將T細胞授受性地轉移至受輻射宿主中且量測體重作為疾病之讀數。基於GVHD疾病進程，必須對所有對照小鼠(8/8)施以安樂死。該等動物研究之結果展示於圖6中。如所示，經INX800或INX801 [0/8]處理之小鼠無一需要被處以安樂死，因為GVHD由於經INX800或INX801抗體治療而相當程度地受到抑制。基於該等結果，INX800及INX801因其似乎有效地抑止GVHD免疫反應而似乎均為有效之VISTA促效劑。 實例7： 假定促效性抗人類VISTA抗體對CD3驅使之T細胞免疫反應的作用
相同促效性抗人類VISTA抗體、INX800及INX801之作用亦關於其抑止CD3驅使之T細胞免疫反應的潛能來進行比較。在該等實驗中，以OKT3 (2.5 μg/ml)塗佈培養盤。將T細胞以抗體預培育30分鐘。隨後向經OKT3塗佈之培養盤中添加經抗體處理之T細胞且將T細胞在該等培養盤上培養72小時。作為抗體對CD3驅使之T細胞免疫反應之可能作用的讀數，使用氚合併方法(一種良好接受之用於偵測T細胞增殖之方法)來確定T細胞增殖。如圖7中所示，與對照T細胞培養物相比，在經INX800或INX801抗體處理之經培養T細胞中之T細胞增殖在相當程度上減少。 實例8： 假定促效性抗人類VISTA抗體對特異性T細胞群體及T細胞總數量之作用
亦進行實驗來比較相同抗人類VISTA抗體(INX800及INX801)對特異性T細胞數量以及T細胞總數的可能作用。進行該等實驗以評估所觀測本發明之抗人類VISTA抗體對細胞激素及T細胞之作用是否可有助於細胞損耗(非特異性作用)而非抗體基於其促進特異性VISTA介導之對免疫性之免疫抑止作用而引發免疫抑止作用。
兩種促效性抗人類VISTA抗體(INX800及INX801)對特異性T細胞群體數量或T細胞之總數無顯著作用。此外，INX800與INX801抗體兩者之結果實質上相同。例示性實驗之結果在圖8中。
基於以上內容，所觀測之INX800及INX801之促效性作用似乎並不有助於細胞損耗。相反，該兩種抗體似乎基於其促進特異性VISTA介導之對免疫性之免疫抑止作用而引發對T細胞活化/增殖、GVHD免疫反應及促炎性細胞激素表現之免疫抑止作用。 實例9： 概述不同促效性抗人類VISTA Ab在不同免疫模型中之作用
如下文表1及2中所示，評估具有圖4中之序列的不同抗人類VISTA抗體之促效性或免疫抑止作用。迄今為止，12種不同之嵌合抗人類VISTA抗體已展示免疫抑止性。迄今獲得之一些結果概述於表中。1箱中之抗體全部競爭結合至人類VISTA，但2箱中之抗體並未競爭VISTA結合。相反，2箱中之抗人類VISTA抗體全部競爭彼此結合至人類VISTA，而1箱中之抗體並非如此。
表2中標記為「無結果」之抗體在同一分析中引發不同作用(包括免疫抑止作用)或出於其他原因而引發不明確之結果。如表1及2中所示，總計已分離12種在MLR分析或ConA分析及/或其他活體外及活體內分析或自體免疫、發炎或GVHD疾病模型中具有免疫抑止性且模擬或刺激人類VISTA之免疫抑止作用的抗人類VISTA抗體。基於該等結果，預期可藉由包括具有相同或不同VISTA抗原決定基特異性之彼等類似方法來獲得其他抗人類VISTA抗體。
又，圖9中之實驗比較了不同抗人類VISTA抗體在ConA分析中及對選擇之促炎性細胞激素及發炎標記(亦即IL-2、ɣ干擾素及IL-12p70)之表現的作用。 表1 (人類或人源化抗人類VISTA抗體)
mAb ID 抗原決定基組 來源 第1次分析MLR增殖，作為IgG1 Kd，M 狀態 抑止作用，作為IgG2在MLR及/或ConA Hep分析中 第2次分析 MLR增殖，作為IgG1
INX903|VSTB95 1 HFA Hybr (His) ++ 1.26E-10 經測試用於免疫抑止 +
INX904|VSTB103 1 原始噬菌體 - 6.36E-10 經測試用於免疫抑止 +/- 是
INX905|VSTB53 1 HFA Hybr (Fc) ++ 2.64E-11 經測試用於免疫抑止 ++
INX908|VSTB92 1 HFA Hybr (Fc) ++ 9.34E-11 **經測試用於免疫抑止 ++
INX900|VSTB50 2 HFA Hybr (Fc) ++ 6.32E-10 經測試用於免疫抑止 +/-
INX901|VSTB56 2 HFA Hybr (Fc) +/- 2.35E-11 經測試用於免疫抑止 ++ 是
INX902|VSTB63 2 HFA Hybr (Fc) +/- 8.30E-10 經測試用於免疫抑止 ++ 是
INX906|VSTB54 2 HFA Hybr (Fc) +/- 2.53E-11 經測試用於免疫抑止 ++
INX907|VSTB66 2 HFA Hybr (Fc) +/- 8.06E-11 經測試用於免疫抑止 + 是
INX909|VSTB67 1 HFA Hybr (Fc) +/- 6.29E-11 待測試
INX913|VSTB85 1 HFA Hybr (InterFAD) ++ 3.78E-11 待測試
INX914|VSTB97 1 原始噬菌體 +/- 7.68E-10 待測試
INX915|VSTB106 1 噬菌體，ILM +/- 1.67E-10 待測試
INX916|VSTB107 1 噬菌體，ILM ++ 8.90E-11 待測試
INX917|VSTB110 1 噬菌體，ILM +/- 2.02E-10 待測試
INX918|VSTB113 1 噬菌體，ILM ++ 4.33E-11 待測試
INX919|VSTB115 1 噬菌體，ILM +/- 1.45E-10 待測試 是
INX910|VSTB73 2 HFA Hybr (His) +/- 2.26E-09 待測試 是
INX911|VSTB76 2 HFA Hybr (His) +/- 1.31E-09 待測試
INX912|VSTB84 2 HFA Hybr (InterFAD) + 2.03E-09 待測試
VSTB100 1 原始噬菌體 +/- 1.48E-09
VSTB101 1 原始噬菌體 +/- 3.18E-09
VSTB102 1 原始噬菌體 +/- 2.98E-09
VSTB104 1 原始噬菌體 + 6.75E-10
VSTB105 1 噬菌體，ILM + 1.15E-10
VSTB108 1 噬菌體，ILM + 4.94E-10
VSTB109 1 噬菌體，ILM +/- 1.02E-10
VSTB111 1 噬菌體，ILM ++ 1.71E-10
VSTB112 1 噬菌體，ILM ++ 1.56E-10
VSTB114 1 噬菌體，ILM ++ 1.52E-10
VSTB116 1 噬菌體，ILM ++ 2.13E-10
VSTB49 1 HFA Hybr (Fc) + 5.07E-10
VSTB51 1 HFA Hybr (Fc) ++ 1.04E-10
VSTB59 1 HFA Hybr (Fc) + 1.06E-10
VSTB65 1 HFA Hybr (Fc) ++ 1.08E-09
VSTB70 1 HFA Hybr (His) +/- 2.23E-09
VSTB81 1 HFA Hybr (InterFAD) +/- 3.12E-10
VSTB98 1 原始噬菌體 + 2.28E-09
VSTB99 1 原始噬菌體 +/- 1.54E-09
VSTB60 2 HFA Hybr (Fc) + 3.56E-10
VSTB78 2 HFA Hybr (InterFAD) ++ 1.13E-09
VSTB74 4 HFA Hybr (His) - 5.62E-10
表2 (鼠科抗人類VISTA抗體)
抗體 箱 抑止性? MLR增殖 Kd，M
1E8* 1 是 ++ NT
GG8 1 是 ++ NT
GA1 2 無結果 _ NT
*以2種不同之IgG2形式展示為免疫抑止性。 實例10： 藉由B細胞抗原決定基定位確定抗人類VISTA抗體之抗原決定基
使用專利方法，採用使用人類VISTA片段之定製肽陣列確定某些假定促效性抗人類VISTA抗體之抗原決定基特異性[ProArray Ultra ™]。基本上藉由以ProArray Ultra ™肽微陣列培育抗體樣品，繼而以螢光標記之二級抗體培育來進行對肽-抗體結合之測定。若乾洗滌步驟之後，乾燥ProArray Ultra ™陣列且使用高解析度螢光微陣列掃描進行掃描。
所有肽(下文列舉)均單獨合成且隨後使用Pro免疫之專利技術結合至ProArray Ultra ™載片表面。此最優化方法確保肽以接近模擬相應蛋白區之特性的方式呈現於陣列上，規避游離肽本身固有之物理化學改變且製成相容之組合肽及蛋白陣列平台。將測試分析物(肽及蛋白)以離散點及適當之gal文件分配至ProArray Ultra ™載片上，使得所得之陣列特徵再與寄存之分析物精確對準。
藉由以ProArray Ultra ™載片培育抗體樣品(由客戶提供)，繼而以螢光標記之二級抗體培育來確定肽-抗體結合。最終之培育及洗滌步驟之後，乾燥微陣列且在高解析度微陣列掃描系統中進行掃描。
在掃描螢光標記之ProArray Ultra ™載片之後，掃描器記錄使用影像分析軟體評估之影像—使得可對經掃描微陣列載片上與每個螢光點相關之螢光強度水準進行解釋及定量。肽微陣列係基於由人類VISTA多肽序列合成之重疊肽庫。基於序列15聚體微陣列肽，使用ProImmune之ProArray Ultra™技術產生12個胺基酸重疊。所合成之肽之詳情列舉於表3 (下文)中。『位置』係指衍生肽之多肽序列中的起始及末端胺基酸。將合成之肽以24個相同之子陣列固定至ProArray Ultra™載片上，每個子陣列以一式六份之點包含測試肽及對照特徵。肽展示於下表3中。
表3： ProArray Ultra ™肽詳情   
肽ID 位置 序列
1 1-15 FKVATPYSLYVCPEG (SEQ ID NO:7)   
2 4-18 ATPYSLYVCPEGQNV (SEQ ID NO:8)   
3 7-21 YSLYVCPEGQNVTLT (SEQ ID NO:9)   
4 10-24 YVCPEGQNVTLTCRL (SEQ ID NO:10)   
5 13-27 PEGQNVTLTCRLLGP (SEQ ID NO:11)   
6 16-30 QNVTLTCRLLGPVDK(SEQ ID NO:12)   
7 19-33 TLTCRLLGPVDKGHD (SEQ ID NO:13)   
8 22-36 CRLLGPVDKGHDVTF (SEQ ID NO:14)   
9 25-39 LGPVDKGHDVTFYKT (SEQ ID NO:15)   
10 28-42 VDKGHDVTFYKTWYR (SEQ ID NO:16)   
11 31-45 GHDVTFYKTWYRSSR (SEQ ID NO:17)   
12 34-48 VTFYKTWYRSSRGEV (SEQ ID NO:18)   
13 37-51 YKTWYRSSRGEVQTC (SEQ ID NO:19)   
14 40-54 WYRSSRGEVQTCSER (SEQ ID NO:20)   
15 43-57 SSRGEVQTCSERRPI (SEQ ID NO:21)   
16 46-60 GEVQTCSERRPIRNL (SEQ ID NO:22)   
17 49-63 QTCSERRPIRNLTFQ (SEQ ID NO:23)   
18 52-66 SERRPIRNLTFQDLH (SEQ ID NO:24)   
19 55-69 RPIRNLTFQDLHLHH (SEQ ID NO:25)   
20 58-72 RNLTFQDLHLHHGGH (SEQ ID NO:26)   
21 61-75 TFQDLHLHHGGHQAA (SEQ ID NO:27)   
22 64-78 DLHLHHGGHQAANTS (SEQ ID NO:28)   
23 67-81 LHHGGHQAANTSHDL (SEQ ID NO:29)   
24 70-84 GGHQAANTSHDLAQR (SEQ ID NO:30)   
25 73-87 QAANTSHDLAQRHGL (SEQ ID NO:31)   
26 76-90 NTSHDLAQRHGLESA (SEQ ID NO:32)   
27 79-93 HDLAQRHGLESASDH (SEQ ID NO:33)   
28 82-96 AQRHGLESASDHHGN (SEQ ID NO:34)   
29 85-99 HGLESASDHHGNFSI (SEQ ID NO:35)   
30 88-102 ESASDHHGNFSITMR (SEQ ID NO:36)   
31 91-105 SDHHGNFSITMRNLT (SEQ ID NO:37)   
32 94-108 HGNFSITMRNLTLLD (SEQ ID NO:38)   
33 97-111 FSITMRNLTLLDSGL (SEQ ID NO:39)   
34 100-114 TMRNLTLLDSGLYCC (SEQ ID NO:40)   
35 103-117 NLTLLDSGLYCCLVV (SEQ ID NO:41)   
36 106-120 LLDSGLYCCLVVEIR (SEQ ID NO:42)   
37 109-123 SGLYCCLVVEIRHHH (SEQ ID NO:43)   
38 112-126 YCCLVVEIRHHHSEH (SEQ ID NO:44)   
39 115-129 LVVEIRHHHSEHRVH (SEQ ID NO:45)   
40 118-132 EIRHHHSEHRVHGAM (SEQ ID NO:46)   
41 121-135 HHHSEHRVHGAMELQ (SEQ ID NO:47)   
42 124-138 SEHRVHGAMELQVQT (SEQ ID NO:48)   
43 127-141 RVHGAMELQVQTGKD (SEQ ID NO:49)   
44 130-144 GAMELQVQTGKDAPS (SEQ ID NO:50)   
45 133-147 ELQVQTGKDAPSNCV (SEQ ID NO:51)   
46 136-150 VQTGKDAPSNCVVYP (SEQ ID NO:52)   
47 139-153 GKDAPSNCVVYPSSS (SEQ ID NO:53)   
48 142-156 APSNCVVYPSSSQDS (SEQ ID NO:54)   
49 145-159 NCVVYPSSSQDSENI (SEQ ID NO:55)   
50 148-162 VYPSSSQDSENITAA (SEQ ID NO:56)
圖4中概述使用特定抗人類VISTA抗體進行此抗原決定基分析之結果。 實例11： 抗原決定基分箱分析
另外，如下文所述，藉由將具有圖4中所示序列之某些抗人類VISTA抗體基於其結合特徵置於不同之抗原決定基「箱」中來表徵該等抗體之抗原決定基結合特性。
方法：使用ProteOn XPR36系統(BioRad)來進行抗原決定基分箱。使用製造商關於胺偶合化學之說明對ProteOn GLC晶片(BioRad, 目錄號176-5011)塗佈兩組6種單株抗體(mAb)(BioRad，目錄號176-2410)。將競爭性mAb在室溫下以人類VISTA (25 nM最終濃度)過量(250 nM最終濃度)預培育4小時且在塗佈有經塗佈mAb面板之晶片上一次運行6個，締合時間為4分鐘，繼而解離5分鐘。每次運行後，以100 nM磷酸使晶片再生。
資料分析涉及由配位體對所有傳感圖分組且應用對準嚮導，其自動進行X軸及Y軸對準且移除偽差。隨後對資料進行Interspot校正。
非競爭性mAb定義為具有與Al信號相同或＞ Al信號之結合信號(僅結合至人類VISTA)。競爭性mAb定義為具有«Al信號之結合信號{亦即，僅結合至人類VISTA)。例如，與VISTA複合之VSTB49及VSTB51不結合至塗佈在晶片上之VSTB85，且因此對於VISTA上與VSTB85相同之結合位點分類為競爭性的。圖4中概述特定抗人類VISTA抗體之此分箱分析的結果。 實例12： 使用氫/氘(H D)交換研究對抗-VISTA抗體進行抗原決定基定位
如以上實例中所述，可藉由諸如丙胺酸掃描及氫/氘(H D)交換及重疊肽陣列之各種方法來識別抗-VISTA抗體之抗體抗原決定基。下文描述另一種用於識別假定促效性抗人類VISTA抗體之抗原決定基之例示性方式。
為識別對於人類VISTA上之VSTB50、60、95及112之抗原決定基，使用相應Fab進行溶液氫/氘交換-質譜分析(HDX-MS)。對於H/D交換而言，用於分析Fab擾動之程序類似於前文所述(Hamuro等人, J. Biomol. Techniques14:171-182, 2003；Horn等人, Biochemistry 45:8488-8498, 2006)，其中進行一些修改。使用Pierce Fab製備套組(Thermo Scientific，目錄號44985)，藉由番木瓜蛋白酶消化及蛋白A捕獲而由IgG來製備Fab。人類VISTA蛋白序列含有六個N連接糖基化位點。為改良序列覆蓋，以PNGase F使蛋白去糖基化。將去糖基化之VISTA蛋白在氘化水溶液中培育預定時間，導致在可交換之氫原子處併入氘。將氘化VISTA蛋白在4℃下在46氧化氘(D20)中與VSTB50、VSTB60、VSTB95或VSTB112之Fab複合30 sec、2 min、10 min及60 min。藉由低pH使交換反應中止且以胃蛋白酶消化蛋白。由LC-MS上之質量偏移來監控識別肽時之氘水準。作為參考對照，類似地處理VISTA蛋白，除了不與Fab分子複合以外。與Fab結合之區係指相對受保護以免交換且因此與參考VISTA蛋白相比含有較高比例之氘的彼等位點。約94%之蛋白可定位至特異性肽。
定位VISTA與VSTB50/VSTB60及VSTB95/VSTB112之溶液HDX-MS擾動圖且識別兩組抗原決定基。抗-VISTA VSTB50與VSTB60識別相同之抗原決定基；VSTB95結合至VISTA上與VSTB112不同之另一抗原決定基區。抗-VISTA VSTB50與60共用相同之抗原決定基，其包含區段103 NLTLLDSGL111(SEQ ID NO:59)及136VQTGKDAPSNC146 (SEQ ID NO:60)。抗-VISTA VSTB95及VSTB112似乎標靶類似之抗原決定基，包含區段27PVDKGHDVTF36(SEQ ID NO:61)及54RRPIRDLTFQDL65(SEQ ID NO:62)。該等HDX-MS結果為具有圖4中識別之序列之例示性抗-VISTA抗體提供肽水準之抗原決定基。該兩組抗原決定基無重疊之抗原決定基區域。該等結果與前述競爭分箱資料之一致之處在於其彼此不競爭。又，如本文所述分析之各種抗人類VISTA抗體之抗原決定基分析結果概述於圖4中。 實例13： 關於識別促效劑抗人類VISTA抗體之分析
如本文中所揭示，吾人已識別十二種促效性抗人類VISTA抗體，且一旦由其他抗體在前述免疫模型中進行或重複其他證實之實驗，則應具備其他抗體。圖4中由「VSTB」名稱識別之抗體為完全人類高親和力食蟹猴交叉反應性抗-VISTA抗體(庫親和力範圍對於人類而言為298-24 pM且對於食蟹猴而言為443-26 pM)，其係基於如本文所述成功分離多種促效性抗人類抗體應引起識別其他促效性抗人類VISTA抗體，尤其結合至抗原決定基組1或2之其他抗體。下文描述該等方法。 活體外功能性篩檢
直接CD4介導：在此方法中，藉由自hV-KI脾細胞負性選擇來分離CD4 +T細胞。隨後在冰上各自以50 VISTA mAb (20 μg/ml)或同型對照物培育1×10 5個T細胞30分鐘。隨後將T細胞及抗體置於抗-CD3塗佈之96孔平底培養盤上且培養72小時。72小時時間點時，將歷時8小時向培養物中添加氚化胸苷以藉由併入H3來量測增殖。使用此分析，吾人在技術上一式三份之單一實驗中可篩檢所有50種mAb。每種抗體將經三次獨立實驗測試來證明活性。與同型對照物相比在統計學顯著之程度上減少增殖之MAb將識別為「抑止性」的。隨後將在相同分析中再次測試在初始篩檢中識別之所有抑止性mAb，從而產生劑量-反應曲線。將在半對數稀釋(30 μg/ml→0.01 μg/ml)下測試每種抗體且對於增殖而言將計算IC50值。在hV-KI分析中被識別為抑止性之所有抗體在初級人類T細胞上將得以確認，且根據IC50分值分級以用於增殖。
NHP交叉反應性分析：在此分析中，吾人將在相關弓形蟲物種(食蟹猴(下文中稱為非人類靈長類動物或「NHP」))中經由關於小鼠及人類所述之相同CD3介導之增殖分析，經由使用驅使有效T細胞增殖之CD3純系SP34來篩檢功能活性。來自NHP之全血將由World Wide Primates (Florida, USA)獲得，且將經由磁性分離來分離T細胞。將T細胞以抗體培育且在CD3塗佈之培養盤上培養72小時。藉由併入氚來量測增殖且對於每種抗體而言將產生IC50分值。 使用活體內動物模型進行功能性篩檢 1. 在伴刀豆球蛋白A誘發之肝炎動物模型中測試根據本發明之VISTA促效劑抗體。
自體免疫肝炎(AIH)係一種慢性發炎性肝病，其特徵在於喪失自身耐受性而導致針對肝臟之B及T細胞反應。ConA模型代表最佳之表徵體系用於理解AIH之發病機制。ConA為結合至在肝臟中富集之特異性糖部分之凝集素。由ConA修飾該等糖殘基經由與肝巨噬細胞表現之經修飾MHC結構相互作用而導致快速CD4 +T細胞活化。發生強烈、但短暫之細胞激素產生，大部分規範T細胞細胞激素(IL-2、IL-3、IFNγ及TNFα)在4至6小時內達到峰值血漿水準。應注意，可藉由損耗CD4+ T細胞來阻斷ConA誘發之發炎。具有hV-KI小鼠之ConA模型可用於證明根據本發明之促效性抗-VISTA mAb之抑止活性。對小鼠稱重且在注射15 mpk ConA之前以10 mpk之抗-VISTA抗體或適當之同型對照物處理3小時。經I.P.投與抗-VISTA mAb且經由尾靜脈在該等小鼠中注射ConA。在投與ConA後之6小時時間點，使小鼠安樂死且收集血液。隨後藉由用於32種細胞激素之多重分析來分析血漿部分之血漿細胞激素。每種抗體在獨立實驗中測試兩次來確認活性。對於32複合物中之每種細胞激素而言，將進行單因素ANOVA，由Dunnett之事後測試來比較每種抗-VISTA抗體與同型對照物。基於細胞激素抑止功效(多少細胞激素受到抑止)及可變性(每次實驗中之抑止及實驗之間之抑止的一致性如何)來對經測試之抗-VISTA mAb進行分級。額外強調抑止規範地與T細胞活化相關之細胞激素的mAb。
如在同日申請及上文之相關PCT申請案中所揭示，在ConA模型中篩檢根據本發明之若干種抗人類VISTA抗體且在其中有效(免疫抑止性)，亦即其抑止ConA誘發之細胞激素產生及促進存活，且特定而言抑止在T細胞活化中涉及之細胞激素(包括IL-2)之表現。特定而言，發明人測試INX800、INX801及INX903及INX904以及促效劑抗-鼠科VISTA抗體且在ConA肝炎模型中全部有效(免疫抑止性)。因此，根據本發明之促效劑抗人類VISTA抗體應適用於治療/預防與某些慢性及急性感染性病況(諸如肝炎)相關之發炎及肝毒性。 2. 在移植物抗宿主疾病動物模型中測試根據本發明之VISTA促效劑抗體
GVHD係一種由同種異體T細胞授受性轉移至輻射宿主中所介導之全身性疾病。在GVHD之發病機制中存在關鍵之五個重要步驟；1)損害宿主，最常見為先於T細胞轉移之輻射作用形式；2)宿主及供體APC對同種異體T細胞之活化；3) T細胞在淋巴結及脾臟中之擴張；4)運輸至外周位點，諸如皮膚、消化道、肝臟及肺；及5)損害由T細胞驅使且亦募集骨髓細胞之宿主。在某些模型中，諸如F1→親本菌株，隨著小鼠發生抗核mAb及免疫複合物介導之腎小球腎炎，發生慢性GVHD，其為一種合適之狼瘡模型。應注意，自供體T細胞遺傳性地損耗VISTA導致比在接受WT T細胞之小鼠中可見者更具侵襲性形式之GHVD。
此分析可用於識別促效性抗人類VISTA候選物之促效作用並進行分級。此分析亦可用於證明根據本發明之促效劑抗體可用於治療或預防GVHD。在此模型中，BALB/c小鼠受到致命輻射且對其給與來自hV-KI小鼠之同種異體骨髓及脾臟T細胞以誘發GVHD；其中一組不接受T細胞作為陰性對照。接受同種異體T細胞之小鼠分為對照Ig組及治療組。在單次實驗中將使用至多四種獨特之VISTA mAb，每組八隻小鼠，且將進行兩次重複實驗。在T細胞轉移時以及在轉移後第2天及第4天投與10 mpk或另一劑量之抗體。追蹤每隻小鼠之體重，且其初始起始體重損失20%以上之任何小鼠均將被處死。每次實驗均產生Kaplan Meier曲線，以對數等級統計學測試比較每種抗-VISTA抗體與對照物。若所有四種VISTA mAb完全保護以防GVHD，則將在GVHD模型中運行劑量反應分析，其中各組以10、3、1及0.3 mpk抗體進行處理。對於每種抗體計算LD50值。
如在同日申請及上文之相關申請案中所揭示，在此動物模型中評估根據本發明值多種促效劑抗人類VISTA抗體。該等測試抗體在此模型中全部有效(免疫抑止性)，亦即其減少疾病之症狀、減緩疾病進展、減少疾病相關之重量損失且促進存活。特定而言，評估INX800、INX801、INX901、INX902、INX903及INX904中之每一者且在此動物模型中證實緩解或預防疾病症狀。又，使用A及B形式之INX901確定A或B形式在GVHD動物模型中同等有效。 3. 在發炎腸病之動物模型中測試根據本發明之VISTA促效劑抗體。
發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎因宿主免疫反應、遺傳易感性、環境因素及腸腔內容物之間不完全確定且複雜之相互作用而產生。近來基因體間之締合研究報導免疫細胞調節基因與IBD易感性之間之關聯性。先天性與適應性免疫細胞固有基因在該等研究中具有代表性，表明該等細胞群體在IBD發病機制中之重要作用。目前存在50種以上之人類IBD動物模型。儘管無一種模型完美地擬表型人類IBD，但許多都適用於研究人類疾病之各種態樣，包括疾病發作及發展以及傷口癒合反應。
在一種良好確定之IBD模型中，由授受性地轉移至T及B細胞缺陷型受者小鼠中之同基因型脾臟CD4 +CD45RB hiT細胞引發腸道發炎。CD4+ CD45RBhi T細胞群體主要含有能夠誘發慢性小腸及結腸發炎之經預致敏活化之天然T細胞。此方法使得研究者可修改重要實驗變數(包括先天性及適應性免疫細胞群體)來答覆與疾病發病機理相關之生物相關問題。另外，此方法提供精確引發疾病發作及良好表徵之實驗時程，從而使得可對小鼠體內之疾病進程的臨床特徵進行動態研究。由此方法誘發之腸道發炎與人類IBD共有許多特徵，包括慢性大腸及小腸穿壁性發炎(此係由諸如TNF及IL-12之細胞激素所驅使之發病機理)及全身性症狀(諸如消瘦)。因此，其係用於研究人類IBD發病機理之理想模型系統。
如在同日申請之相關PCT申請案中所揭示，測試根據本發明之促效性抗人類VISTA抗體(INX901)且展示在此IBD模型中有效。特定而言，證實此促效劑抗體抑止細胞激素水準且有效預防或抑制(i)結腸炎相關之體重減輕，(ii)與結腸炎進展相關之體重減輕，(iii)結腸縮短，(iv)發炎性浸潤物募集至結腸中及(v)發生結腸炎。因此，根據本發明之促效劑VISTA抗體可用於治療IBD及相關發炎與腸病況。 4. 在狼瘡動物模型中測試根據本發明之VISTA促效劑抗體
狼瘡係一種自體免疫或發炎性病況，其症狀包括腎發炎、蛋白尿增加及脾腫大。存在4種類型之狼瘡，其中全身性紅斑狼瘡或(「SLE」)為最常見之形式。此疾病可為輕度或重度的且可影響主要器官系統。狼瘡係一種未知原因之自體免疫病況，其可導致腎臟發炎——稱為狼瘡腎炎——其可影響身體自血液中過濾廢物之能力，及/或若嚴重則可導致需要透析或腎移植之腎損傷。SLE亦可導致肺中之血壓增加——稱為肺高血壓——其可導致呼吸困難。其他SLE可導致神經系統及大腦發炎，其可導致記憶問題、混亂、頭痛及中風。其他SLE可導致大腦血管發炎，其可導致高熱、癲癇發作及行為變化。SLE亦可導致動脈硬化或冠狀動脈疾病—冠狀動脈壁上積聚沈積物—可導致心臟病發作。
如在同日申請之相關PCT申請案中所揭示，測試根據本發明之促效性抗人類VISTA抗體(INX903、INX901、INX901-A及INX901-B)及抗鼠科VISTA抗體且展示在不同狼瘡模型中有效，包括MRL/lpr狼瘡模型、NZBWF-1狼瘡模型及B6D2F模型。B6D2F模型為鼠科模型，其中藉由將人類VISTA敲入DDE1 CD8損耗脾細胞(供體)轉移至B6D2F1宿主(受者)中誘發SLE。在此模型中，供體CD4 T細胞多株活化驅使同源宿主B細胞活化、擴張及其產生導致腎病之自身抗體。損耗轉移至B6D2F1模型之B6 CD8之狼瘡樣特徵包括：(1)免疫複合絲球體腎炎；(2)抗核ab；(3)抗-dsDNA ab；及(4)抗-RBC ab (庫姆斯陽性)。另外，此模型滿足腎病嚴重性中之基於性別的差異。
在3種不同狼瘡模型中，證實促效性抗人類及鼠科VISTA抗體有效且減少狼瘡疾病發展之發生率、減少疾病進展、降低蛋白尿水準、抑制腎炎及腎損害、減少T細胞活化及積聚、減少B細胞活化及積聚以及抑制自身抗體產生。特定而言，INX903、INX901、INX901-A及INX901-B展示(i)減少T細胞增殖及活化，(ii)減少同源B細胞活化(MHCII表現)及積聚，減少脾腫大、減少抗-dsDNA IgG自身抗體產生及減少I型干擾素特徵。該等免疫抑止作用亦不受抗體之人類IgG2恆定區為A或B形式影響。因此，根據本發明之促效劑VISTA抗體可用於治療狼瘡及相關發炎及自體免疫病況。 5. 在牛皮癬動物模型中測試VISTA促效劑抗體 咪喹莫特(IMQD)誘發之牛皮癬模型
使用咪喹莫特(IMQD)誘發之牛皮癬模型評估抗-VISTA抗體治療牛皮癬之能力。咪喹莫特(IMQD)係一種含有TLR7/8促效劑之市售乳霜，其廣泛用於皮膚病況，諸如病毒感染及黑素瘤。歷時多日向皮膚塗覆IMQD導致表皮經由角質細胞增殖而增厚。另外，發生免疫浸潤至真皮層中，存在T細胞及骨髓細胞群體。反覆投與IMQD產生與在牛皮癬患者中觀測之類似的皮膚病變。IL-17及IL-23被認為係對IMQD之免疫反應中所涉及的主要細胞激素。
如在同日申請之相關PCT申請案中所揭示，測試促效性抗- VISTA抗體且展示在此牛皮癬模型中有效。特定而言，此抗體減少浸潤經咪喹莫特治療之皮膚的CD3 +T細胞之數量。基於觀測結果，VISTA促效劑抗體可用於治療或預防牛皮癬及其他T細胞介導之自體免疫或發炎性皮膚病況。 6. 在關節炎動物模型中測試VISTA促效劑抗體
可在不同動物模型中測試抗-VISTA抗體治療關節炎之免疫抑止作用。如在同日申請之相關PCT申請案中所揭示，測試促效性抗-鼠科及抗人類VISTA抗體且展示在良好接受之關節炎模型(亦即膠原蛋白誘發之關節炎或CIA模型)中有效。INX800、INX901、INX902及INX903以及倉鼠抗-鼠科抗-VISTA抗體全部在此關節炎模型中進行測試。藉由隨時間量測受影響關節中之發炎性腫脹來評估疾病發展。進行臨床計分，每個腫脹趾判定為1分，腫脹足墊5分且腫脹手腕或腳踝5分(Charles River Labs計分系統)，其加在一起給出每種動物60之最大分值。
如在此PCT申請案中所示，該等抗體各自減少關節炎疾病且INX901及INX902顯著地減少疾病範疇。基於該等結果，抗人類VISTA促效劑抗體可用於治療或預防類風濕性關節炎及其他發炎或自體免疫病況。 實例14：在不同活體外及活體內模型中評估人類IgG2骨架對α-人類VISTA抗體INX901促效劑/免疫-抑止活性之作用
天然人類IgG2骨架上之抗體以藉由在重鏈鉸鏈、CH1及輕鏈中存在之半胱胺酸之間的雙硫鍵改組產生之同功異型物混合物形式存在(Zhang, A.，(2015), 「Conformational difference in human IgG2 disulfide isoforms revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry」, Biochemistry, 54(10), 1956-1962；圖10)。基於Dillon等人, 「Optimization of a reversed-phase high-performance liquid chromatography/mass spectrometry method for characterizing recombinant antibody heterogeneity and stability」, J Chromatography A, 1120(1), 112-120研發之方法，藉由RP-HPLC (圖10)來評估該等同功異型物。最優化方法使用相對於Dillon (id)中而言較淺且較高之有機移動相B內容物。接近根據Dillon (id)中報導之條件，但與交換回DPBS中之緩衝液及在富集反應後採用之內毒素移除程序組合來製備自INX901富集之單獨的A及B形式(圖11)。
在製備該等實驗之過程中，觀察到比預期更快且以比預期更低之殘餘氧化還原試劑濃度發生A富集形式之逆轉。利用快速旋轉，因此採用似乎很大程度上防止此逆轉的基於尺寸排阻之脫鹽程序。如圖10中之(A)版面中所示，二硫化物改組導致同功異型物A及B以及A/B之轉變(由Zhang, A.等人, 2015再現)。(B)同功異型物由RP-HPLC可辨別(來自Zhang, A.等人, 2015之圖)。(C)關於INX901觀測之RP-HPLC層析圖。
下文描述發明人最優化之用於偵測IgG2同功異型物之RP-HPLC方法。在圖11中：(黑線，頂部)層析圖展示定義B形式之主要最左側峰。(紅線，底部)層析圖展示定義A形式之主要最右側峰。 用於同功異型物偵測之最優化RP-HPLC方法 移動相A製備(在水中0.1%之v/v TFA)： 1. 在1.0 L刻度量筒中量測1.0 L Milli-Q水 2. 使用1 mL玻璃漢密爾頓注射器(Hamilton syringe)向該1 L水中添加1.0 mL TFA 3. 將該溶液轉移至1 L瓶中，充分混合。 4. 製備2週後期滿。 移動相B製備(70% v/v IPA、20% v/v ACN、9.9% v/v 水、0.1% v/v TFA)： 1. 向1.0 L刻度量筒中量測700 mL IPA 2. 向250 mL刻度量筒中量測200 mL ACN且轉移至含有700 mL IPA之1.0 L刻度量筒中 3. 向含有700 mL IPA及200 mL ACN之1.0 L刻度量筒中添加Milli-Q水直至液體達到1.0 L標記 4. 使用1 mL玻璃漢密爾頓注射器向該1 L水中添加1.0 mL TFA 5. 將該溶液轉移至1 L瓶中，充分混合。 6. 製備2週後期滿。 RP-HPLC層析條件 1. 管柱A (大孔)：Zorbax 300SB-C8，5μm，2.1×150mm，＜＜OR＞＞ 2. 管柱B (窄孔)：Zorbax 300SB-C8，3.5μm，1×50mm 3. 移動相A：在水中0.1% v/v TFA 4. 移動相B：70% v/v IPA、20% v/v ACN、9.9% v/v水、0.1% v/v TFA 5. 流動速率：管柱A為0.5 mL/min或管柱B為0.25 mL/min 6. 管柱隔室：75.0 ±1.0℃ 7. 偵測：214 nm 8. RP-HPLC移動相梯度(下表)
時間(min) 移動相B%
0 15
2 26
34 36
35 75
36 15
40 15
INX901二硫化物同功異型物富集方法 B形式富集 1. 向無內毒素之無熱原管中添加： 2.1 mL之INX901 (5.66 mg/mL) 792.6 μL 1 M Tris pH 8.0 495.4 μL無內毒素水 另外396.3無內毒素水 237.8 μL之100 mM半胱胺酸 39.6 μL之100 mM胱胺 2. 指形渦流(輕微)，隨後在2-8℃下加蓋放置24小時 3. 在室溫下將Pall microsep旋轉濃縮器在0.3M NaOH中浸泡2小時，隨後以10X DPBS沖洗3次，隨後以無內毒素水沖洗3次。使用之前在BSC中風乾 4. 根據供應商關於使0.5 mL內毒素移除管柱再生之說明，對於步驟3選擇使用0.2N NaOH/95%乙醇(在室溫下2小時)；使用1 X DPBS作為最終之平衡緩衝液 5. 在單獨之PALL microsep (如上文製備)中濃縮約4,020 μL反應(來自步驟2) 6. 以2,500 X G濃縮35 min至小於0.4 mL ( ≥10X)，隨後以4 mL 1X DPBS再稀釋，再重複2次 7. 以2,500 X G濃縮15 min至低於2 mL，隨後再添加1X DPBS至2 mL 8. 添加全部2 mL之緩衝液交換樣品至再生、經旋轉乾燥、底部加蓋之內毒素移除管柱中，頂部緊密加蓋、顛倒置於室溫下——約每20分鐘再顛倒3次，隨後將樣品旋轉至無熱原管中(根據供應商之說明，以500 X G歷時1 min)，置於2-8℃下 A形式富集 1. 向無內毒素之無熱原管中添加： 1750 μL INX901 (6.2 mg/mL) 370 μL無內毒素水 700 μL 1M Tris pH8.0 435 μL 8M GdCl 210 μL 0.1 M半胱胺酸HCl (由1 M儲備液新鮮製備) 35 μL 0.1 M 胱胺-2HCl (由1 M儲備液新鮮製備) (最終體積3500 μL) 2. 指形渦流(輕微)，隨後在2-8℃下加蓋放置24小時 3. 根據供應商說明製備#7-2 mL Zeba旋轉管柱(Thermo P/N 89890)，平衡至1 X杜貝卡氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中。 4. 將500 μL上述反應混合物負載至#7之每一者上且以1000 X G旋轉2分鐘(亦根據供應商說明)，收集至清潔之無熱原管中。 5. 放置於脫熱原之PALL microsep中，總計旋轉1小時10分鐘，以約5 mg/mL濃縮至約1.7 mL 6. 向上述全部約1.7 mL添加至根據供應商說明製備之一個0.5 mL內毒素移除旋轉管柱(Thermo P/N 88274)中(包括在室溫下在0.2 M NaOH中隔夜)，平衡至1 X DPBS中。在室溫下靜置約1小時，隨後在4℃下再放置約1小時，兩種情形下均每約15分鐘顛倒一次加蓋之管。 7. 藉由以500 X G旋轉1分鐘回收製劑(亦根據供應商說明)。 8. 回收體積：在4.61 mg/mL時為約1.3 mL (所有濃度均基於NanoDrop之內置IgG消光係數0.73) IgG2 A-及B-鎖定變異體
特異性取代IgG2之胺基酸序列能夠防止二硫化物改組且視突變而定將導致A樣或B樣之鎖定構形(Martinez等人，(2008). 「Disulfide connectivity of human immunoglobulin G2 structural isoforms」, Biochemistry, 47(28), 7496-7508；Allen等人，(2009), 「Interchain disulfide bonding in human IgG2 antibodies probed by site-directed mutagenesis」, Biochemistry, 48(17), 3755-3766)。
因此，發明人設計具有C233S (A-鎖定)或C127S (B-鎖定)突變(Eu編號)之INX901及INX908變異體以與White等人，(2015),「Conformation of the human immunoglobulin G2 hinge imparts superagonistic properties to immunostimulatory anticancer antibodies」, Cancer Cell, 27(1), 138-148所用之IgG2變異體匹配。下文列舉恆定重鏈序列。 IgG2 C233S (A-鎖定) IgG2 C127S (B-鎖定) 靜默Fc變異體
發明人藉由在IgG1骨架：L234A/L235A/G237A/P238A/H268A/A330S/P331S上引入以下點突變來設計具有靜默Fc區之INX901及INX908變異體(McCarthy等人，(2015)美國專利申請案14/818864. Washington, DC: U.S)。在一種類型之變異體(INX901Si及INX908Si)中，重鏈恆定區之CH1/鉸鏈區為天然IgG1，其不支持天然IgG2之二硫化物改組(圖12，中間)。在第二種類型之變異體(INX901HSi及INX908HSi)中，CH1/鉸鏈區為天然IgG2，其支持二硫化物改組(White, A. L.等人, 2015)(圖12，底部)。下文列舉兩種類型變異體之恆定重鏈序列。 具有靜默Fc之IgG1 (INX901Si及INX908Si) IgG2 CH1/鉸鏈+IgG1靜默Fc (INX901HSi及INX908HSi)
圖12中之實驗比較INX901 Fc-靜默變異體關於二硫化物改組之免疫特性。(頂部) IgG2骨架上之INX901展示A、A/B及B同功異型物之預期混合物。(中間)靜默IgG1骨架上之INX901Si以單一同功異型物之形式存在。(底部) INX901HSi具備具有來自IgG2之CH1/鉸鏈的IgG1靜默Fc區，其使得二硫化物改組等同於天然IgG2。該等結果表明，FcR結合似乎影響本發明之抗體之促效劑特性。 實例15： INX901及INX908在各種Ig骨架中用於確定鉸鏈及Fc區之需要的功能
吾人進行研究來評估抗人類VISTA抗體INX901及INX908之重鏈之CH1/鉸鏈及Fc區之功能性需要。在其初始狀態下，兩種分子均位於天然人類IgG2骨架上，且因此為構形上不同之同功異型物的混合物，導致二硫化物改組。對於該等研究而言，選擇高細胞密度混合之淋巴細胞反應(MLR)作為先前資料，表明此分析為INX901及INX908之功能性提供強大之讀數。對INX901及/或INX908進行以下修飾來研究特異性同功異型物是否負責以下功能：向A或B同功異型物生物化學偏斜，遺傳修飾將構形「鎖定」為A或B形式，及嵌合分子，其中Fc為靜默的且CH1/鉸鏈區來自IgG1(其中未發生二硫化物改組)或IgG2(其允許天然二硫化物改組)，
分析結果表明，INX901及INX908無論為A形式、B形式或表徵天然IgG2之形式混合物，均保留功能。另外，INX901與INX908兩者之功能均需要活性Fc區。
MLR係一種標準免疫分析，其取決於MHC I級及II級錯配來驅使同種異體T細胞反應。自兩個錯配個體分離外周血液單核細胞，一起培育且由於該等錯配，產生增殖及細胞激素。先前已報導高細胞密度條件(HCD)(意謂以＞1×10 7個細胞/ml培養)來闡明抗體之活體外促效性功能。吾人先前之資料表明，INX901及INX908兩者在MLR中之HCD條件下均可抑止TNFα之表現。
在對於IgG2二硫化物同功異型物進行遺傳或生物化學修飾及/或每種抗體進行Fc靜默後，使用HCD MLR分析來評估INX901及INX908之功能。在運行MLR之前，經由ELISA確認每種抗體結合重組VISTA。將INX901送至Elion, LLC (Louisville, CO)，在此將其以氧化還原劑修飾為主要為A形式(INX901 A偏斜)或B形式(INX901 B偏斜)。如先前實例中所述，藉由RP-HPLC來確認偏斜(圖11)。將每種抗體以及親本INX901在HCD MLR中經劑量反應稀釋，且藉由Luminex量測細胞激素產生。先前資料表明，TNFα及/或IL-2為親本INX901抗體之抗體功能的有力讀數。在兩個單獨之MLR中，TNFα及IL-2兩者與IgG2對照物相比均由INX901親本、INX901 A偏斜及INX901 B偏斜而減少(圖13)。
為證明來自圖13之資料，由突變製得INX901之其他變異體以產生A形式或B形式之鎖定變異體。另外，由完全靜默Fc區製得嵌合形式之INX901來測試Fc結構域之功能。INX901 Si為完全靜默之IgG1抗體。INX901 HSi具有完全靜默之IgG1 Fc，但亦具備使得可進行二硫化物改組之IgG2 CH1/鉸鏈區，此與天然IgG2難以區分。在運行MLR之前，經由ELISA確認每種抗體結合重組VISTA。經證明來自生物化學偏斜之資料，A鎖定及B鎖定形式之INX901能夠減少產生IL-2及TNFα (圖14)。相比而言，Si及HSi形式之INX901無法減少產生IL-2及TNFα (圖14)。
為證明來自圖14之資料，對INX908抗體進行相同突變以產生A形式或B形式之鎖定變異體。另外，由完全靜默Fc區製得嵌合形式之INX908來測試Fc結構域之功能。INX908 Si為完全靜默之IgG1抗體。INX908 HSi具有完全靜默之IgG1 Fc，但含有IgG2 CH1/鉸鏈區。在運行MLR之前，經由ELISA確認每種抗體結合重組VISTA。經證明INX901變異體之資料，A鎖定及B鎖定形式之INX908能夠減少IL-2及TNFα之產生(圖15)。相比而言，Si及HSi形式之INX908無法減少IL-2及TNFα之產生(圖15)。 實例15： 使用PEPPSCAN方法不連續抗原決定基定位促效劑抗體
Pepscan使用肽陣列來確定線性及不連續之抗原決定基。此方法係為多個研究者及公司所接受用作某些抗體抗原決定基之方法。圖16示意性地描述用於識別由根據本發明之各種促效劑抗人類VISTA抗體所結合之線性及不連續抗原決定基之Pepscan ®技術。 CLIPS技術之原理
CLIPS技術在結構上將肽固定至確定之三維結構中。此導致功能性模擬即使最複雜之結合位點。CLIPS技術目前常用於將肽庫定形為單環、雙環或三環結構以及薄片及螺旋形摺疊。在CLIPS骨架之溴基與半胱胺酸之硫醇側鏈之間發生CLIPS反應。在適度條件下，反應係快速且特異性的。使用此簡潔之化學方式，將天然蛋白序列轉型為具有一系列結構之CLIPS構築體。 詳細之組合CLIPS庫篩檢
CLIPS庫篩檢由使用組合矩陣設計將靶蛋白轉化為具有多達10,000個重疊肽構築體之庫開始。在固體載劑上合成線性肽之矩陣，其隨後成形為空間上確定之CLIPS構築體。代表正確構形之不連續抗原決定基之兩個部分的構築體以高親和力結合抗體，對其進行偵測及定量。呈現不完整抗原決定基之構築體以較低親和力結合抗體，而不含抗原決定基之構築體完全不結合。在迭代性篩檢中使用親和力資訊來詳細定義抗原決定基之序列及構形。下文概述此抗原決定基分析之結果。 抗體 INX901 、 INX902 、 INX904 、 INX906 、 INX907 、 INX908
當在適度嚴格條件下測試時，抗體INX901、INX902、INX904、INX906、INX907、INX908強烈地結合線性及構形抗原決定基模擬物。結合肽含有核心序列 48NVTLTCRLLGPV 60(SEQ ID NO:67)、 79EVQTCSERRPIR 90(SEQ ID NO:68)、 123SDHHGNFS 130(SEQ ID NO:69)及 153HHHSEH 158(SEQ ID NO:70)，其中肽段 79EVQTCSERRPIR 90(SEQ ID NO:68)為抗原決定基之主要部分。
由線性抗原決定基模擬物記錄之另一資料分析使得吾人可識別對於結合INX 904、INX906、INX907及INX908而言重要之殘基，因為某些位置之雙重Ala突變體明顯地減小信號強度。特定而言，取代 48NVTLTCRLLGPV 60(SEQ ID NO:71)中之殘基CR影響INX906、INX907及INX908之結合。取代 79EVQTCSERRPIR 90(SEQ ID NO:68)中之殘基TC亦明顯地影響INX904及INX907之結合。 抗體 INX800
當在適度嚴格條件下測試時，抗體INX800並未可偵測地結合線性及受簡單限制之抗原決定基模擬物，但展示可偵測地結合不連續之抗原決定基模擬物。由不連續之抗原決定基模擬物獲得之資料分析表明，抗體INX800識別具有核心序列 53TCRLLGPVDKG 63(SEQ ID NO:72)、101HGGHQAA 107(SEQ ID NO:73)、 121SASDHHGNFS 130(SEQ ID NO:74)及 153HHHSEHRVHGAM 164(SEQ ID NO:75)之不連續抗原決定基，其中序列 153HHHSEHRVHGAM 164(SEQ ID NO:75)代表重要識別位點。 抗體 INX803 及 INX804
當在高度嚴格條件下測試時，抗體INX803及INX804不結合陣列上存在之任何肽。當在適度嚴格條件下測試時，兩種抗體結合不連續之抗原決定基模擬物。對結合概況之累積分析表明，兩種抗體類似地識別肽段 52LTCRLLGPV 60(SEQ ID NO:77)、 79EVQTCSERRPIR 90(SEQ ID NO:78)、 98HLHHGGHQAA 107(SEQ ID NO:79)、 123SDHHGNFS 130(SEQ ID NO:80)、 153HHHSEHRVHGAM 164(SEQ ID NO:75)，其中區域 52LTCRLLGPV 60(SEQ ID NO:77)為重要識別位點。 抗體 INX900
當在高度嚴格條件下測試時，抗體INX900極弱地結合具有核心序列 79EVQTCSERRPIR 90(SEQ ID NO:68)之線性抗原決定基模擬物。關於不連續之抗原決定基模擬物觀測到顯著較高之結合，其除了序列 79EVQTCSERRPIR 90(SEQ ID NO:68)以外還含有核心序列 56LLGPVDKGHDVTFYK 70(SEQ ID NO:82)、 113LAQRHGLESASDHHG 127(SEQ ID NO:83)、 153HHHSEHRVHGAM 164(SEQ ID NO:75)。 抗體 INX903
當在高度嚴格條件下測試時，抗體INX903不結合線性抗原決定基模擬物，但較弱地結合構形抗原決定基模擬物。對記錄之強度概況的分析表明，抗體識別由核心序列 79EVQTCSERR 87(SEQ ID NO:85)、 93TFQDLHLHHGGHQAA 107(SEQ ID NO:86)、 146CLVVEIRHHHSEH 158(SEQ ID NO:87)組成之不連續抗原決定基，其中序列 79EVQTCSERR 87(SEQ ID NO:85)為抗原決定基之核心。 抗體 INX905
當在高度嚴格條件下測試時，抗體INX905結合具有核心序列 79EVQTCSERRP 88(SEQ ID NO:88)之線性肽。由雙重Ala突變體獲取之資料表明， 79EVQTCSERRP 88(SEQ ID NO:88)中之基元RR對於識別很關鍵。由不連續之抗原決定基模擬物記錄之強度概況表明，添加肽序列 53TCRLLGPVDKG 63(SEQ ID NO:89)、 123SDHHG 127(SEQ ID NO:90)及 153HHHSEHRVHGAM 164(SEQ ID NO:75)增強抗體之結合。圖17展示大多數促效劑抗人類VISTA抗體結合至相同之核心序列。圖18亦概述抗原決定基結果。圖19展示由根據本發明之例示性促效劑抗人類VISTA抗體所結合之抗原決定基且識別在結合中所涉及之重要殘基。
由上述討論，將可理解，本發明可以多種形式來體現，包含但不限於下列： 範例1：一種經分離之抗體或其抗體片段，其包含特異性地結合至T細胞活化之人類V結構域Ig抑制因子(人類VISTA)之抗原結合區，其中該抗體或抗體片段刺激或促進VISTA對免疫性之一或多種作用。 範例2：如範例1之經分離之抗體，其包含人類IgG2恆定區或人類IgG2 Fc區。 範例3：如範例2之經分離之抗體，其中該人類IgG2恆定區或Fc區結合至包括人類CD32A之Fcγ受體。 範例4：如範例2之經分離之抗體，其中該IgG2恆定區或Fc區包含結合至Fcγ受體之天然人類IgG2。 範例5：如範例4之經分離之抗體，其中該等FcγR包括hFcγRI(CD64)、FcγRIIA或hFcγRIIB、(CD32或CD32A)及FcγRIIIA (CD16A)或FcγRIIIB (CD16B)中之一或多者。 範例6：如範例1至5中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其與包括由具有圖4之序列之抗人類VISTA抗體中的任一者結合之抗原決定基或與該抗原決定基重疊之VISTA抗原決定基競爭或結合至該VISTA抗原決定基。 範例7：如範例1至6中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其結合包含LLDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVH之殘基之抗原決定基的一或多個殘基或與該等殘基相互作用。 範例8：如範例1至6中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其結合包含 79EVQTCSERRPIR 90、 48NVTLTCRLLGPV 60、 153HHHSEHRVHGAM 164、 52LTCRLLGPV 60、 56LLGPVDKGHDVTFYK 70、 113LAQRHGLESASDHHG 127、 153HHHSEHRVHGAM 164、 93TFQDLHLHHGGHQAA 107、 146CLVVEIRHHHSEH158、 53TCRLLGPVDKG 63、 123SDHHG 127及/或 153HHHSEHRVHGAM 164中之一或多個殘基之抗原決定基的一或多個殘基或與該等殘基相互作用。 範例9：如範例1至6中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其結合包含 79EVQTCSERRPIR 90之一或多個殘基之抗原決定基的一或多個殘基或與該等殘基相互作用。 範例10：如範例1至9中任一項之促效劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，其促進或增強人類VISTA對免疫性之至少一種作用，例如其對T細胞免疫、單核細胞活化、誘發T細胞增殖中任一或多者之抑止作用；誘發或抑止細胞激素表現、增加單核細胞之存活率、在表現VISTA之細胞中誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及在表現VISTA之細胞中誘發抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。 範例11：一種經分離之促效性或拮抗性抗人類VISTA抗體或其抗體片段，其包含特異性地結合至人類VISTA之抗原結合區，其中該抗體或抗體片段包含具有與具有圖4中所示之該CDR及可變重鏈及輕鏈多肽之該等抗人類VISTA抗體中任一者相同之CDR多肽的可變重鏈及輕鏈序列，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。 範例12：如範例11之經分離之抗體或抗體片段，其包含與選自VSTB49-VSTB116之抗體相同之CDR，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。 範例13：如範例11或12之經分離之抗體或抗體片段，其包含與選自VSTB49-VSTB116中任一者之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽具有至少90%序列一致性之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其該等可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。 範例14：如範例11或12之經分離之抗體或抗體片段，其包含與選自VSTB49-VSTB116中任一者之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽具有至少95%序列一致性之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其該等可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。 範例15：如範例11或12之經分離之抗體或抗體片段，其包含與選自VSTB49-VSTB116中任一者之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽具有至少96-99%序列一致性之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其該等可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。 範例16：如範例11或12之經分離之抗體或抗體片段，其包含與選自VSTB49-VSTB116之一之抗人類VISTA抗體之彼等可變重鏈及/或可變輕鏈多肽相同之可變重鏈及/或可變輕鏈多肽，其中其該等可變重鏈及輕鏈多肽序列在圖4中展示，其限制條件在於若該抗體或片段包含拮抗劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，則該抗體或抗體片段不包含與VSTB112、VSTB116、VSTB95、VSTB50、VSTB53或VSTB60中任一者相同之CDR。 範例17：如前述範例中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其拮抗或阻斷人類VISTA對免疫性之至少一種作用。 範例18：如前述範例中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其刺激或阻斷人類VISTA對免疫性之至少一種作用。 範例19：如前述範例中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其包含人類恆定域。 範例20：如前述範例中任一項之經分離之抗體或抗體片段，其包含選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之人類恆定域，其視情況例如藉由刪除、取代或添加突變或前述任意組合進行修飾。 範例21：如前述範例中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體片段包含Fab、F(ab') 2或scFv抗體片段或為Fab、F(ab') 2或scFv抗體片段。 範例22：如前述範例中任一項之拮抗性抗人類VISTA抗體或抗體片段，其阻斷或抑止人類VISTA對免疫性之至少一種作用，例如選自其對T細胞免疫、單核細胞活化或T細胞增殖之抑止作用；誘發或抑止細胞激素表現、增加單核細胞之存活率、抑止表現VISTA之細胞之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及抑止表現VISTA之細胞之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。 範例23：如前述範例中任一項之促效性抗人類VISTA抗體或抗體片段，其促進或增強人類VISTA對免疫性之至少一種作用，例如選自其對T細胞免疫、單核細胞活化、抑止T細胞增殖之抑止作用；誘發或抑止細胞激素表現、增加單核細胞之存活率、抑止在表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及抑止表現VISTA之細胞之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。 範例24：如範例23之促效劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，其包含人類IgG2恆定區或Fc區。 範例25：如範例23或24之促效劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，其促進或增強人類VISTA對免疫性之抑止作用，例如其對T細胞免疫、單核細胞活化、T細胞增殖中任一或多者之作用；細胞激素表現、單核細胞存活、在表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及在表現VISTA之細胞中之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。 範例26：如範例23至25中任一項之促效劑抗人類VISTA抗體或抗體片段，其抑制T細胞免疫及/或促炎性細胞激素表現。 範例27：如前述範例中任一項之促效劑抗體或抗體片段，其為包含人類Fc區，例如人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4或前述任一者之嵌合體的人類、人源化或嵌合抗體。 範例28：如前述範例中任一項之促效劑抗體，其為嵌合、人類或人源化的。 範例29：如前述範例中任一項之抗體，其包含可能可突變之人類IgG2恆定域或Fc區。 範例30：如前述範例中任一項之促效劑抗體，其包含人類IgG2恆定域或其片段或hIgG1、hIgG3、hIgG4、IgA、IgD、IgE或IgM，其中該抗體之整個或實質上整個鉸鏈及CH1結構域及視情況整個或實質上整個輕鏈恆定區經hIgG2之相應整個或實質上整個輕鏈與該鉸鏈及C H1結構域(「H2區」或「H2結構域」)置換。 範例31：如前述範例中任一項之促效劑抗體，其(i)包含IgG2 Fc區，其中位於127位之重鏈半胱胺酸殘基及位於214位之輕鏈半胱胺酸殘基(其中編號係根據Kabat)任一者或兩者均經刪除或改變為不同之胺基酸殘基，導致所得經修飾抗體之促效特性相對於其中該等殘基無變化之抗體而言增加；(ii)位於該抗體之H2區中之214位之半胱胺酸殘基經突變或經另一胺基酸取代及/或位於該重鏈之127位、232位或233位之半胱胺酸殘基中之一或多者經刪除或經另一胺基酸取代；(iii)其包含人類IgG2恆定域，其中至少一個半胱胺酸殘基經刪除或改變為另一胺基酸，(iv)其與人類VISTA上與VSTB95相同之抗原決定基競爭或結合至該抗原決定基(圖4中所示之可變重鏈及輕鏈序列)。 範例32：如前述範例中任一項之抗體或抗體片段，其： (i) 包含SEQ ID NO:100、101及102之V HCDR及SEQ ID NO:103、104及105之V LCDR； (ii) 包含SEQ ID NO:110、111及112之V HCDR及SEQ ID NO:113、114及115之V LCDR； (iii) 包含SEQ ID NO:120、121及122之V HCDR及SEQ ID NO:123、124及125之V LCDR； (iv) 包含SEQ ID NO:130、131及132之V HCDR及SEQ ID NO:133、134及135之V LCDR； (v) 包含SEQ ID NO:140、141及142之V HCDR及SEQ ID NO:143、144及145之V LCDR； (vi) 包含SEQ ID NO:150、151及152之V HCDR及SEQ ID NO:153、154及155之V LCDR； (vii) 包含SEQ ID NO:160、161及162之V HCDR及SEQ ID NO:163、164及165之V LCDR； (viii) 包含SEQ ID NO:170、171及172之V HCDR及SEQ ID NO:173、174及175之V LCDR； (ix) 包含SEQ ID NO:180、181及182之V HCDR及SEQ ID NO:183、184及185之V LCDR； (x) 包含SEQ ID NO:190、191及192之V HCDR及SEQ ID NO:193、194及195之V LCDR； (xi) 包含SEQ ID NO:200、201及202之V HCDR及SEQ ID NO:203、204及205之V LCDR； (xii) 包含SEQ ID NO:210、211及212之V HCDR及SEQ ID NO:213、214及215之V LCDR； (xiii) 包含SEQ ID NO:220、221及222之V HCDR及SEQ ID NO:223、224及225之V LCDR； (xiv) 包含SEQ ID NO:230、231及232之V HCDR及SEQ ID NO:233、234及235之V LCDR； (xv) 包含SEQ ID NO:240、241及242之V HCDR及SEQ ID NO:243、244及245之V LCDR； (xvi) 包含SEQ ID NO:250、251及252之V HCDR及SEQ ID NO:253、254及255之V LCDR； (xvii) 包含SEQ ID NO:260、261及262之V HCDR及SEQ ID NO:263、264及265之V LCDR； (xviii) 包含SEQ ID NO:270、271及272之V HCDR及SEQ ID NO:273、274及275之V LCDR； (xix) 包含SEQ ID NO:280、281及282之V HCDR及SEQ ID NO:283、284及285之V LCDR； (xx) 包含SEQ ID NO:290、291及292之V HCDR及SEQ ID NO:293、294及295之V LCDR； (xxi) 包含SEQ ID NO:300、301及302之V HCDR及SEQ ID NO:303、304及305之V LCDR； (xxii) 包含SEQ ID NO:310、311及312之V HCDR及SEQ ID NO:313、314及315之V LCDR； (xxiii) 包含SEQ ID NO:320、321及322之V HCDR及SEQ ID NO:323、324及325之V LCDR； (xxiv) 包含SEQ ID NO:330、331及332之V HCDR及SEQ ID NO:333、334及335之V LCDR； (xxv) 包含SEQ ID NO:340、341及342之V HCDR及SEQ ID NO:343、344及345之V LCDR； 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包含SEQ ID NO:640、641及642之V HCDR及SEQ ID NO:643、644及645之V LCDR； (lvi) 包含SEQ ID NO:650、651及652之V HCDR及SEQ ID NO:653、654及655之V LCDR； (lvii) 包含SEQ ID NO:660、661及662之V HCDR及SEQ ID NO:663、664及665之V LCDR； (lviii) 包含SEQ ID NO:670、671及672之V HCDR及SEQ ID NO:673、674及675之V LCDR； (lix) 包含SEQ ID NO:680、681及682之V HCDR及SEQ ID NO:683、684及685之V LCDR； (lx) 包含SEQ ID NO:690、691及692之V HCDR及SEQ ID NO:693、694及695之V LCDR； (lxi) 包含SEQ ID NO:700、701及702之V HCDR及SEQ ID NO:703、704及705之V LCDR； (lxii) 包含SEQ ID NO:710、711及712之V HCDR及SEQ ID NO:713、714及715之V LCDR； (lxiii) 包含SEQ ID NO:720、721及722之V HCDR及SEQ ID NO:723、724及725之V LCDR； (lxiv) 包含SEQ ID NO:730、731及732之V HCDR及SEQ ID NO:733、734及735之V LCDR； (lxv) 包含SEQ ID NO:740、741及742之V HCDR及SEQ ID NO:743、744及745之V LCDR； (lxvi) 包含SEQ ID NO:750、751及752之V HCDR及SEQ ID NO:753、754及755之V LCDR； (lxvii) 包含SEQ ID NO:760、761及762之V HCDR及SEQ ID NO:763、764及765之V LCDR； (lxviii) 包含SEQ ID NO:770、771及772之V HCDR及SEQ ID NO:773、774及775之V LCDR； (lxix) 包含SEQ ID NO:780、781及782之V HCDR及SEQ ID 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包含SEQ ID NO:656之V H多肽及SEQ ID NO:658之V L多肽； (lvii) 包含SEQ ID NO:666之V H多肽及SEQ ID NO:668之V L多肽； (lviii) 包含SEQ ID NO:676之V H多肽及SEQ ID NO:678之V L多肽； (lix) 包含SEQ ID NO:686之V H多肽及SEQ ID NO:688之V L多肽； (lx) 包含SEQ ID NO:696之V H多肽及SEQ ID NO:698之V L多肽； (lxi) 包含SEQ ID NO:706之V H多肽及SEQ ID NO:708之V L多肽； (lxii) 包含SEQ ID NO:716之V H多肽及SEQ ID NO:718之V L多肽； (lxiii) 包含SEQ ID NO:726之V H多肽及SEQ ID NO:728之V L多肽； (lxiv) 包含SEQ ID NO:736之V H多肽及SEQ ID NO:738之V L多肽； (lxv) 包含SEQ ID NO:746之V H多肽及SEQ ID NO:748之V L多肽； (lxvi) 包含SEQ ID NO:756之V H多肽及SEQ ID NO:758之V L多肽； (lxvii) 包含SEQ ID NO:766之V H多肽及SEQ ID NO:768之V L多肽； (lxviii) 包含SEQ ID NO:776之V H多肽及SEQ ID NO:778之V L多肽； (lxix) 包含SEQ ID NO:786之V H多肽及SEQ ID NO:788之V L多肽； (lxx) 包含SEQ ID NO:796之V H多肽及SEQ ID NO:798之V L多肽； (lxxi) 包含SEQ ID NO:806之V H多肽及SEQ ID NO:808之V L多肽；及 (lxxii) 包含SEQ ID NO:816之V H多肽及SEQ ID NO: 818之V L多肽。 範例34：如範例32或33之抗體，其包含人類IgG2恆定域，其中視情況至少一個半胱胺酸殘基經刪除或改變為另一胺基酸。 範例35：如前述範例中任一項之促效性抗人類VISTA抗體或抗體片段，其介導以下免疫抑制作用中之任一者或至少一者之組合：(i)減少免疫反應，(ii)減少T細胞活化，(iii)降低細胞毒性T細胞活性，(iv)降低天然殺手(NK)細胞活性，(v)降低T細胞活性，(vi)減少促炎性細胞激素分泌，(vii)減少IL-2分泌；(viii)減少干擾素-γ產生，(ix)減少Th1反應，(x)減少Th2反應，(xi)增加調節性T細胞之細胞數量及/或活性，(xii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者，(xiii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬細胞，(xiv)增加M2巨噬細胞活性，(xv)增加N2嗜中性白血球，(xvi)增加N2嗜中性白血球活性，(xvii)增加對T細胞活化之抑制作用，(xviii)增加對CTL活化之抑制作用，(xix)增加對NK細胞活化之抑制作用，(xx)增加T細胞損耗，(xxi)減少T細胞反應，(xxii)降低細胞毒性細胞之活性，(xxiii)減少抗原特異性記憶反應，(xxiv)抑制細胞凋亡或細胞溶解，(xxv)減少對細胞之細胞毒性或細胞生長抑制作用，(xxvi)減少細胞之直接殺死，(xxvii)降低Thl7活性，及/或(xxviii)減少補體依賴性細胞毒性及/或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性，其限制條件在於該抗-VISTA抗體或抗原結合片段可引發與(i)-(xxviii)中之一或多者相反之作用且視情況用於治療自體免疫、過敏、發炎、移植或敗血症。 範例36：一種醫藥學或診斷組合物，其包含至少一種如前述範例中任一項之拮抗性或促效性抗體或抗體片段。 範例37：一種治療及/或診斷方法，或含有至少一種如前述範例中任一項之拮抗性抗體或抗體片段之組合物用於診斷或治療用途之用途，該方法或用途包括向有需要之受檢者投與至少一種包含治療或診斷有效量之至少一種如前述範例中任一項之拮抗性抗體或抗體片段或如前述範例中任一項之含有其之組合物之劑量或組合物。 範例38：如範例37之方法，其係用於治療癌症或感染性病症。 範例39：如範例38之方法，其中該癌症為血癌或實性瘤，例如由包含骨髓細胞、T細胞或骨髓細胞與T細胞之組合之腫瘤基質包圍之腫瘤。 範例40：如範例38之方法，其係用於治療選自白血病、淋巴瘤、脊髓發育不良症候群或骨髓瘤、肺癌或其組合之癌症。 範例41：如範例40之方法，其中該白血病包含急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性骨髓(骨髓性)白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)；毛細胞白血病、T細胞幼淋巴細胞白血病、大顆粒淋巴細胞白血病或成人T細胞白血病。 範例42：一種治療及/或診斷方法，或含有至少一種如前述範例中任一項之促效性抗體或抗體片段之組合物用於診斷或治療用途之用途，該方法或用途包括向有需要之受檢者投與至少一種包含治療或診斷有效量之至少一種如前述範例中任一項之促效性抗體或抗體片段或如前述範例中任一項之含有其之組合物之劑量或組合物。 範例43：一種如前述範例中任一項之任何促效性抗體或抗體片段用於經活體外及/或活體內實現以下免疫抑制作用中之任一者或至少一者之組合之方法或用途：(i)減少免疫反應，(ii)減少T細胞活化，(iii)降低細胞毒性T細胞活性，(iv)降低天然殺手(NK)細胞活性，(v)降低T細胞活性，(vi)減少促炎性細胞激素分泌，(vii)減少IL-2分泌；(viii)減少干擾素-γ產生，(ix)減少Th1反應，(x)減少Th2反應，(xi)增加調節性T細胞之細胞數量及/或活性，(xii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者，(xiii)增加調節性細胞活性及/或髓源性抑制細胞(MDSC)、iMC、間質基質細胞、表現TIE2之單核細胞中之一或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬細胞，(xiv)增加M2巨噬細胞活性，(xv)增加N2嗜中性白血球，(xvi)增加N2嗜中性白血球活性，(xvii)增加對T細胞活化之抑制作用，(xviii)增加對CTL活化之抑制作用，(xix)增加對NK細胞活化之抑制作用，(xx)增加T細胞損耗，(xxi)減少T細胞反應，(xxii)降低細胞毒性細胞之活性，(xxiii)減少抗原特異性記憶反應，(xxiv)抑制細胞凋亡或細胞溶解，(xxv)減少對細胞之細胞毒性或細胞生長抑制作用，(xxvi)減少細胞之直接殺死，(xxvii)降低Thl7活性及/或(xxviii)減少補體依賴性細胞毒性及/或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性，其限制條件在於該抗-VISTA抗體或抗原結合片段可引發與(i)-(xxviii)中之一或多者相反之作用且視情況用於治療自體免疫、過敏、發炎、移植或敗血症。 範例44：如範例37至43中任一項之方法或用途，其係用於治療或預防過敏、自體免疫、移植、基因治療、發炎、癌症、GVHD或敗血症或用以治療或預防人類受檢者中與前述任一者相關之發炎、自體免疫或過敏性副作用。 範例45：如前述範例中任一項之抗-VISTA抗體或抗原結合片段或組合物或方法或用途，其進一步包含另一種免疫調節性抗體或融合蛋白，該免疫調節性抗體或融合蛋白選自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中之一或多者之免疫抑制性抗體或融合蛋白及/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中之一或多者之促效性抗體或融合蛋白。 範例46：如前述範例中任一項之方法或用途，其包括在治療之前、同時及/或之後藉由個體之細胞或在體液中分析VISTA蛋白。 範例47：如前述範例中任一項之方法或用途，其包括分析造血細胞上之VISTA水準。 範例48：如前述範例中任一項之方法或用途，其包括分析造血細胞上之VISTA水準，該等造血細胞選自骨髓譜系細胞及/或淋巴細胞、單核細胞或嗜中性白血球、T細胞、B細胞、天然殺手(NK)細胞或天然殺手T (NKT)細胞中之任一或多者。 範例49：如前述範例中任一項之方法或用途，其中該促效劑抗人類VISTA抗體或片段包含與選自VSTB49-VSTB116之抗體相同之CDR及視情況可突變之人類IgG2 Fc區。 範例50：如範例49之方法或用途，其中該IgG2恆定區或Fc區保持天然FcR結合及/或結合CD32A之能力。 範例51：如前述範例中任一項之抗體、組合物、方法或用途，其中如藉由表面電漿共振在37℃下所確定，該抗人類VISTA抗體或片段對人類VISTA具有50M或50M以下之親和力或K D。 範例52：如前述範例中任一項之抗體、組合物、方法或用途，其中如藉由表面電漿共振在37℃下所確定，該抗人類VISTA抗體或片段對人類VISTA具有1nM或1nM以下之親和力或K D。 本申請案中引用之參考文獻 以下參考文獻及本申請案中引用之其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。 1    Dong, C., Juedes, A. 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PubMed PMID: 19177065 序列表 SEQ ID NO:1：智人VISTA (替用名稱：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)胺基酸序列 SEQ ID NO:2：小家鼠VISTA胺基酸序列 SEQ ID NO:3：小家鼠VISTA胺基酸序列 SEQ ID NO:4：智人VISTA (替用名稱：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)核酸序列 SEQ ID NO:5：智人VISTA (替用名稱：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)編碼核酸序列 SEQ ID NO:6：小家鼠VISTA編碼核酸序列
圖1A-D。此圖展示可用於識別抑止性VISTA mAb之活體外及活體內篩檢分析。A)在所示mAb存在下，歷時72小時將純化之T細胞塗於抗-CD3頂部。藉由H3合併量測增殖。B)在所示抗體存在下，歷時6天藉由ISQ脈衝式APC刺激純化之DO11.10 T細胞。經由使用CTV稀釋染料量測增殖。C)藉由將C57BL/6細胞轉移至經輻射之BALB/c受者中誘發GVHD。在轉移後第0天、第2天及第4天對小鼠經腹膜內(I.P.)注射200 μg抗體並分析存活率。D)在投與ConA (15 mpk)之前3小時，以10 mpk所示抗體處理小鼠，且在電漿中藉由Luminex以6分析IL-2。
圖2A-F。此圖展示促效劑VISTA抗體在多個自體免疫性疾病模型中具免疫抑止性。A)自25週開始，每週3次以8G8或Ham Ig (200 μg)處理NZB/W F1小鼠直至實驗結束。「X」表示對照處理組已全部犧牲時之時間點。B)在投與15 mg/kg (mpk) ConA之前3小時，以200 μg抗體處理小鼠，且歷時80小時追蹤存活率。C)相繼以膠原蛋白II mAb、繼而以LPS處理小鼠且藉由量測腳爪腫脹來量測關節炎。每隔一天投與3次8G8及Ham-Ig(200 μg)。D)每天向小鼠耳朵塗覆咪喹莫特(Imiquimod)。在第14天，每隔一天投與8G8或Ham-Ig (200 μg)且以測徑規量測耳朵厚度。E、F)每天向小鼠後背塗覆咪喹莫特。在第9天，對小鼠施以安樂死且切割皮膚並染色以藉由IHC進行CD3表現。
圖3。此圖展示VISTA在WT及hV-KI小鼠中之表現。自WT及VISTA KI小鼠之淋巴結分離CD4+ T細胞、CD8 +T細胞、Treg (CD4 +FoxP3 +)及單核細胞、CD11b +、Ly6C +、Ly6G -且以分別針對小鼠或人類蛋白之αVISTA抗體進行染色。
圖4含有不同抗人類VISTA抗體之序列，包括INX800、INX801及INX900-INX919之彼等序列。
圖5展示例示性抗人類VISTA抗體(亦即INX800及INX801)在ConA肝炎模型中之作用，此評估其對於表現不同細胞激素、趨化因子及化學引誘劑之作用。
圖6展示例示性抗人類VISTA抗體(亦即INX800及INX801)在活體內移植物抗宿主疾病(GVHD)動物模型中之作用。
圖7展示例示性促效性抗人類VISTA抗體(亦即INX800或INX801)對於CD3驅使之T細胞免疫反應之作用。
圖8展示例示性促效性抗人類VISTA抗體(亦即INX800或INX801)對特異性T細胞群體數量或對總T細胞數量之作用。
圖9比較例示性抗人類VISTA抗體在ConA分析中及對表現選擇促炎性細胞激素及發炎標記(亦即IL-2、γ干擾素及IL-12p70)之作用。
圖10A-C：展示不同IgG2同功異型物。(A)二硫化物改組產生同功異型物A及B，以及A/B之轉變(來自Zhang, A.等人, 2015之圖)。(B)同功異型物可由RP-HPLC來辨別。(C)關於INX901觀測之RP-HPLC層析圖。
圖11：展示IgG2 A或B同功異型物之化學富集。(黑線，頂部)層析圖展示定義B形式之最左側主峰。(紅線，底部)層析圖展示定義A形式之右側主峰。
圖12：相對於二硫化物改組而言比較INX901 Fc-靜默變異體。(頂部) IgG2骨架上之INX901展示A、A/B及B同功異型物之預期混合物。(中間)靜默IgG1骨架上之INX901Si以單一同功異型物之形式存在。(底部) INX901HSi具備具有來自IgG2之CH1/鉸鏈的IgG1靜默Fc區，這使得二硫化物改組等同於天然IgG2。
圖13。生物化學偏斜之INX901形式仍可減少MLR中之細胞激素產生。在72小時時間點藉由Luminex分析來分析來自兩個單獨MLR之上清液的細胞激素產生。INX901親本、A偏斜及B偏斜均以劑量依賴性之方式減少TNFα及IL-2之產生。
圖14。遺傳鎖定之INX901形式仍可減少MLR中之細胞激素產生，但Fc靜默變異體不能。在72小時時間點藉由Luminex分析來分析來自每次MLR之上清液的細胞激素產生。INX901親本、A鎖及B鎖均以劑量依賴性之方式減少TNFα及IL-2之產生。含有使Fc結構域靜默之突變的Si及HSi變異體並不持續地抑止細胞激素產生。
圖15。遺傳學上鎖定之INX908形式仍可減少MLR中之細胞激素產生，但Fc靜默變異體不能。在72小時時間點藉由Luminex分析來分析來自每次MLR之上清液的細胞激素產生。INX908親本、A鎖及B鎖均以劑量依賴性之方式減少TNFα及IL-2之產生。含有使Fc結構域靜默之突變的Si及HSi變異體並不持續地抑止細胞激素產生。
圖16。此圖示意性地描述用於識別由促效劑抗人類VISTA抗體所結合之線性及不連續之抗原決定基的Pepscan ®技術。
圖17：此圖展示促效劑抗人類VISTA抗體結合至相同之核心序列。
圖18：此圖概述對根據本發明之不同抗人類VISTA抗體之抗原決定基分析。
圖19：此圖展示由促效劑抗人類VISTA抗體結合之抗原決定基且進一步識別結合中所包涵之重要殘基。
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Claims (9)

  1. 一種經分離的或重組的人類或人源化抗體，其包含特異性地結合至T細胞活化之人類V結構域Ig抑制因子(人類VISTA)之抗原結合區，其中該抗體拮抗或阻斷在促炎性細胞激素表現上或在T細胞增殖上的VISTA之免疫抑制作用，且其中該抗體包含除結合至CD32A或CD32之一人類IgG2 Fc區以外的一人類IgG Fc或恆定區或該抗體缺少Fc或恆定區，其中該經分離的或重組的人類或人源化抗體： (i) 包含SEQ ID NO:170、171及172之V HCDR及SEQ ID NO:173、174及175之V LCDR； (ii) 包含SEQ ID NO:180、181及182之V HCDR及SEQ ID NO:183、184及185之V LCDR； (iii) 包含SEQ ID NO:190、191及192之V HCDR及SEQ ID NO:193、194及195之V LCDR； (iv) 包含SEQ ID NO:200、201及202之V HCDR及SEQ ID NO:203、204及205之V LCDR； (v) 包含SEQ ID NO:210、211及212之V HCDR及SEQ ID NO:213、214及215之V LCDR； (vi) 包含SEQ ID NO:220、221及222之V HCDR及SEQ ID NO:223、224及225之V LCDR； (vii) 包含SEQ ID NO:230、231及232之V HCDR及SEQ ID NO:233、234及235之V LCDR； (viii) 包含SEQ ID NO:240、241及242之V HCDR及SEQ ID NO:243、244及245之V LCDR； (ix) 包含SEQ ID NO:250、251及252之V HCDR及SEQ ID NO:253、254及255之V LCDR； (x) 包含SEQ ID NO:260、261及262之V HCDR及SEQ ID NO:263、264及265之V LCDR； (xi) 包含SEQ ID NO:270、271及272之V HCDR及SEQ ID NO:273、274及275之V LCDR； (xii) 包含SEQ ID NO:280、281及282之V HCDR及SEQ ID NO:283、284及285之V LCDR； (xiii) 包含SEQ ID NO:290、291及292之V HCDR及SEQ ID NO:293、294及295之V LCDR； (xiv) 包含SEQ ID NO:300、301及302之V HCDR及SEQ ID NO:303、304及305之V LCDR； (xv) 包含SEQ ID NO:310、311及312之V HCDR及SEQ ID NO:313、314及315之V LCDR； (xvi) 包含SEQ ID NO:330、331及332之V HCDR及SEQ ID NO:333、334及335之V LCDR； (xvii) 包含SEQ ID NO:350、351及352之V HCDR及SEQ ID NO:353、354及355之V LCDR； (xviii) 包含SEQ ID NO:360、361及362之V HCDR及SEQ ID NO:363、364及365之V LCDR； (xix) 包含SEQ ID NO:380、381及382之V HCDR及SEQ ID NO:383、384及385之V LCDR； (xx) 包含SEQ ID NO:390、391及392之V HCDR及SEQ ID NO:393、394及395之V LCDR； (xxi) 包含SEQ ID NO:400、401及402之V HCDR及SEQ ID NO:403、404及405之V LCDR； (xxii) 包含SEQ ID NO:410、411及412之V HCDR及SEQ ID NO:413、414及415之V LCDR； (xxiii) 包含SEQ ID NO:420、421及422之V HCDR及SEQ ID NO:423、424及425之V LCDR； (xxiv) 包含SEQ ID NO:430、431及432之V HCDR及SEQ ID NO:433、434及435之V LCDR； (xxv) 包含SEQ ID NO:450、451及452之V HCDR及SEQ ID NO:453、454及455之V LCDR； (xxvi) 包含SEQ ID NO:460、461及462之V HCDR及SEQ ID NO:463、464及465之V LCDR； (xxvii) 包含SEQ ID NO:470、471及472之V HCDR及SEQ ID NO:473、474及475之V LCDR； (xxviii) 包含SEQ ID NO:480、481及482之V HCDR及SEQ ID NO:483、484及485之V LCDR； (xxix) 包含SEQ ID NO:490、491及492之V HCDR及SEQ ID NO:493、494及495之VL CDR多肽； (xxx) 包含SEQ ID NO:500、501及502之V HCDR及SEQ ID NO:503、504及505之VL CDR多肽； (xxxi) 包含SEQ ID NO:510、511及512之V HCDR及SEQ ID NO:513、514及515之VL CDR多肽； (xxxii) 包含SEQ ID NO:520、521及522之V HCDR及SEQ ID NO:523、524及525之VL CDR多肽； (xxxiii) 包含SEQ ID NO:530、531及532之V HCDR及SEQ ID NO:533、534及535之VL CDR多肽； (xxxiv) 包含SEQ ID NO:540、541及542之V HCDR及SEQ ID NO:543、544及545之VL CDR多肽； (xxxv) 包含SEQ ID NO:550、551及552之V HCDR及SEQ ID NO:553、554及555之VL CDR多肽； (xxxvi) 包含SEQ ID NO:560、561及562之V HCDR及SEQ ID NO:563、564及565之V LCDR； (xxxvii) 包含SEQ ID NO:570、571及572之V HCDR及SEQ ID NO:573、574及575之V LCDR； (xxxviii) 包含SEQ ID NO:580、581及582之V HCDR及SEQ ID NO:583、584及585之V LCDR； (xxxix) 包含SEQ ID NO:590、591及592之V HCDR及SEQ ID NO:593、594及595之V LCDR； (xl) 包含SEQ ID NO:600、601及602之V HCDR及SEQ ID NO:603、604及605之V LCDR； (xli) 包含SEQ ID NO:610、611及612之V HCDR及SEQ ID NO:613、614及615之V LCDR； (xlii) 包含SEQ ID NO:620、621及622之V HCDR及SEQ ID NO:623、624及625之V LCDR； (xliii) 包含SEQ ID NO:630、631及632之V HCDR及SEQ ID NO:633、634及635之V LCDR； (xliv) 包含SEQ ID NO:640、641及642之V HCDR及SEQ ID NO:643、644及645之V LCDR； (xlv) 包含SEQ ID NO:650、651及652之V HCDR及SEQ ID NO:653、654及655之V LCDR； (xlvi) 包含SEQ ID NO:660、661及662之V HCDR及SEQ ID NO:663、664及665之V LCDR； (xlvii) 包含SEQ ID NO:670、671及672之V HCDR及SEQ ID NO:673、674及675之V LCDR； (xlviii) 包含SEQ ID NO:680、681及682之V HCDR及SEQ ID NO:683、684及685之V LCDR； (xlix) 包含SEQ ID NO:690、691及692之V HCDR及SEQ ID NO:693、694及695之V LCDR； (l) 包含SEQ ID NO:700、701及702之V HCDR及SEQ ID NO:703、704及705之V LCDR； (li) 包含SEQ ID NO:710、711及712之V HCDR及SEQ ID NO:713、714及715之V LCDR； (lii) 包含SEQ ID NO:720、721及722之V HCDR及SEQ ID NO:723、724及725之V LCDR； (liii) 包含SEQ ID NO:730、731及732之V HCDR及SEQ ID NO:733、734及735之V LCDR； (liv) 包含SEQ ID NO:740、741及742之V HCDR及SEQ ID NO:743、744及745之V LCDR； (lv) 包含SEQ ID NO:750、751及752之V HCDR及SEQ ID NO:753、754及755之V LCDR； (lvi) 包含SEQ ID NO:760、761及762之V HCDR及SEQ ID NO:763、764及765之V LCDR； (lvii) 包含SEQ ID NO:780、781及782之V HCDR及SEQ ID NO:783、784及785之V LCDR； (lviii) 包含SEQ ID NO:790、791及792之V HCDR及SEQ ID NO:793、794及795之V LCDR； (lix) 包含SEQ ID NO:800、801及802之V HCDR及SEQ ID NO:803、804及805之V LCDR；或 (lx) 包含SEQ ID NO:810、811及812之V HCDR及SEQ ID NO: 813、814及815之V LCDR。
  2. 如請求項1之經分離的或重組的人類或人源化抗體，其 (i) 包含SEQ ID NO:380、381及382之VH CDR及SEQ ID NO:383、384及385之VL CDR； (ii) 包含SEQ ID NO:400、401及402之VH CDR及SEQ ID NO:403、404及405之VL CDR； (iii) 包含SEQ ID NO:470、471及472之VH CDR及SEQ ID NO:473、474及475之VL CDR； (iv) 包含SEQ ID NO:500、501及502之VH CDR及SEQ ID NO:503、504及505之VL CDR多肽； (v) 包含SEQ ID NO:530、531及532之VH CDR及SEQ ID NO:533、534及535之VL CDR多肽； (vi) 包含SEQ ID NO:570、571及572之VH CDR及SEQ ID NO:573、574及575之VL CDR； (vii) 包含SEQ ID NO:600、601及602之VH CDR及SEQ ID NO:603、604及605之VL CDR；或 (viii) 包含SEQ ID NO:740、741及742之VH CDR及SEQ ID NO:743、744及745之VL CDR。
  3. 如請求項1之經分離的或重組的人類或人源化抗體，其 (i) 包含SEQ ID NO:176之VH多肽及SEQ ID NO:178之VL多肽； (ii) 包含SEQ ID NO:186之VH多肽及SEQ ID NO:188之VL多肽； (iii) 包含SEQ ID NO:196之VH多肽及SEQ ID NO:198之VL多肽； (iv) 包含SEQ ID NO:206之VH多肽及SEQ ID NO:208之VL多肽； (v) 包含SEQ ID NO:216之VH多肽及SEQ ID NO:218之VL多肽； (vi) 包含SEQ ID NO:226之VH多肽及SEQ ID NO:228之VL多肽； (vii) 包含SEQ ID NO:236之VH多肽及SEQ ID NO:238之VL多肽； (viii) 包含SEQ ID NO:246之VH多肽及SEQ ID NO:248之VL多肽； (iv) 包含SEQ ID NO:256之VH多肽及SEQ ID NO:258之VL多肽； (x) 包含SEQ ID NO:266之VH多肽及SEQ ID NO:268之VL多肽； (xi) 包含SEQ ID NO:276之VH多肽及SEQ ID NO:278之VL多肽； (xii) 包含SEQ ID NO:286之VH多肽及SEQ ID NO:288之VL多肽； (xiii) 包含SEQ ID NO:296之VH多肽及SEQ ID NO:298之VL多肽； (xiv) 包含SEQ ID NO:306之VH多肽及SEQ ID NO:308之VL多肽； (xv) 包含SEQ ID NO:316之VH多肽及SEQ ID NO:318之VL多肽； (xvi) 包含SEQ ID NO:336之VH多肽及SEQ ID NO:338之VL多肽； (xvii) 包含SEQ ID NO:356之VH多肽及SEQ ID NO:358之VL多肽； (xviii) 包含SEQ ID NO:366之VH多肽及SEQ ID NO:368之VL多肽； (xix) 包含SEQ ID NO:386之VH多肽及SEQ ID NO:388之VL多肽； (xx) 包含SEQ ID NO:396之VH多肽及SEQ ID NO:398之VL多肽； (xxi) 包含SEQ ID NO:406之VH多肽及SEQ ID NO:408之VL多肽； (xxii) 包含SEQ ID NO:416之VH多肽及SEQ ID NO:418之VL多肽； (xxiii) 包含SEQ ID NO:426之VH多肽及SEQ ID NO:428之VL多肽； (xxiv) 包含SEQ ID NO:436之VH多肽及SEQ ID NO:438之VL多肽； (xxv) 包含SEQ ID NO:456之VH多肽及SEQ ID NO:458之VL多肽； (xxvi) 包含SEQ ID NO:466之VH多肽及SEQ ID NO:468之VL多肽； (xxvii) 包含SEQ ID NO:476之VH多肽及SEQ ID NO:478之VL多肽； (xxviii) 包含SEQ ID NO:486之VH多肽及SEQ ID NO:488之VL多肽； (xxix) 包含SEQ ID NO:496之VH多肽及SEQ ID NO:498之VL多肽； (xxx) 包含SEQ ID NO:506之VH多肽及SEQ ID NO:508之VL多肽； (xxxi) 包含SEQ ID NO:516之VH多肽及SEQ ID NO:518之VL多肽； (xxxii) 包含SEQ ID NO:526之VH多肽及SEQ ID NO:528之VL多肽； (xxxiii) 包含SEQ ID NO:536之VH多肽及SEQ ID NO:538之VL多肽； (xxxiv) 包含SEQ ID NO:546之VH多肽及SEQ ID NO:548之VL多肽； (xxxv) 包含SEQ ID NO:556之VH多肽及SEQ ID NO:558之VL多肽； (xxxvi) 包含SEQ ID NO:566之VH多肽及SEQ ID NO:568之VL多肽； (xxxvii) 包含SEQ ID NO:576之VH多肽及SEQ ID NO:578之VL多肽； (xxxviii) 包含SEQ ID NO:586之VH多肽及SEQ ID NO:588之VL多肽； (xxxix) 包含SEQ ID NO:596之VH多肽及SEQ ID NO:598之VL多肽； (xl) 包含SEQ ID NO:606之VH多肽及SEQ ID NO:608之VL多肽； (xli) 包含SEQ ID NO:616之VH多肽及SEQ ID NO:618之VL多肽； (xlii) 包含SEQ ID NO:626之VH多肽及SEQ ID NO:628之VL多肽； (xliii) 包含SEQ ID NO:636之VH多肽及SEQ ID NO:638之VL多肽； (xliv) 包含SEQ ID NO:646之VH多肽及SEQ ID NO:648之VL多肽； (xlv) 包含SEQ ID NO:656之VH多肽及SEQ ID NO:658之VL多肽； (xlvi) 包含SEQ ID NO:666之VH多肽及SEQ ID NO:668之VL多肽； (xlvii) 包含SEQ ID NO:676之VH多肽及SEQ ID NO:678之VL多肽； (xlviii) 包含SEQ ID NO:686之VH多肽及SEQ ID NO:688之VL多肽； (xlix) 包含SEQ ID NO:696之VH多肽及SEQ ID NO:698之VL多肽； (l) 包含SEQ ID NO:706之VH多肽及SEQ ID NO:708之VL多肽； (li) 包含SEQ ID NO:716之VH多肽及SEQ ID NO:718之VL多肽； (lii) 包含SEQ ID NO:726之VH多肽及SEQ ID NO:728之VL多肽； (liii) 包含SEQ ID NO:736之VH多肽及SEQ ID NO:738之VL多肽； (liv) 包含SEQ ID NO:746之VH多肽及SEQ ID NO:748之VL多肽； (lv) 包含SEQ ID NO:756之VH多肽及SEQ ID NO:758之VL多肽； (lvi) 包含SEQ ID NO:766之VH多肽及SEQ ID NO:768之VL多肽； (lvii) 包含SEQ ID NO:786之VH多肽及SEQ ID NO:788之VL多肽； (lviii) 包含SEQ ID NO:796之VH多肽及SEQ ID NO:798之VL多肽； (lix) 包含SEQ ID NO:806之VH多肽及SEQ ID NO:808之VL多肽；或 (lx) 包含SEQ ID NO:816之VH多肽及SEQ ID NO: 818之VL多肽。
  4. 如請求項1之經分離的或重組的人類或人源化抗體，其 (i) 包含SEQ ID NO:386之VH多肽及SEQ ID NO:388之VL多肽； (ii) 包含SEQ ID NO:406之VH多肽及SEQ ID NO:408之VL多肽； (iii) 包含SEQ ID NO:476之VH多肽及SEQ ID NO:478之VL多肽； (iv) 包含SEQ ID NO:506之VH多肽及SEQ ID NO:508之VL多肽； (v) 包含SEQ ID NO:536之VH多肽及SEQ ID NO:538之VL多肽； (vi) 包含SEQ ID NO:576之VH多肽及SEQ ID NO:578之VL多肽； (vii) 包含SEQ ID NO:606之VH多肽及SEQ ID NO:608之VL多肽；或 (viii) 包含SEQ ID NO:746之VH多肽及SEQ ID NO:748之VL多肽。
  5. 如請求項1或2之經分離的或重組的人類或人源化抗體，其中其包含一人類IgG1 Fc或恆定區。
  6. 一種醫藥學組合物，其包含如請求項1至5中任一項之經分離的或重組的人類或人源化抗體之至少一者。
  7. 一種如請求項1至5中任一項之經分離的或重組的人類或人源化抗體之至少一者於製備藥物之用途，該藥物是用於治療癌症或感染。
  8. 如請求項7之用途，其中該藥物包含另一種免疫調節性抗體或一免疫調節性融合蛋白。
  9. 如請求項7或8之用途，其中該藥物將與另一種藥物組合使用，該另一種藥物包含另一種免疫調節性抗體或一免疫調節性融合蛋白。
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