KR20210084604A - Cd20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 - Google Patents

Cd20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물공학 분야에 관한 것으로, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기한 항체를 코딩하는 DNA, 대응되는 발현 벡터, 및 이의 생산 방법뿐 아니라 상기한 항체를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체
본 발명은 생물공학, 특히 항-CD20 항체 또는 이의 항원 결합 단편, B 세포와 관련된 질환의 치료에 있어 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 CD20 (B-림프구 항원 CD20)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 항체의 제조 방법, 및 B 세포, 특히 B-림프구 항원 CD20과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 있어 항체의 용도에 관한 것이다.
림프구는 여러가지 유형의 백혈구 세포 중 하나로, 외래 항원을 특이적으로 인지하여 반응한다. 림프구의 3가지 주 유형은 B-림프구 (B 세포), T-림프구 (T 세포) 및 자연 살상 (NK) 세포이다. B-림프구는 항체 생산 및 체액성 면역을 담당하는 세포이다. B 세포는 골수 안에서 성숙해, 골수를 떠나 세포 표면 상에 항원-결합 항체를 발현한다. 이전에 노출된 적 없는 B 세포는 먼저 막-결합형 항체가 특이적인 항원을 만나게 되면, 이 세포는 빠르게 분열되기 시작해, 이의 자손은 기억 B 세포와 "형질 세포"로 지칭되는 작동자 세포로 분화된다. 기억 B 세포는 수명이 더 길고 기원 부모 세포와 동일한 특이성으로 막-결합형 항체를 계속 발현하게 된다. 형질 세포는 막-결합형 항체를 생산하진 않지만, 대신 분비가능한 형태로 항체를 생산한다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요 작동자 분자이다.
항원 CD20 (인간 B 림프구-제한 분화 항원으로도 지칭됨, Bp35)은 프리-B 및 성숙한 B 세포 림프구 상에 위치한 분자량 대략 35 kDa의 소수성 막관통 단백질이다 (Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19), 1989, p.l 1282-11287; 및 Einfeld et al, EMBO J. 7(3), 1988, p.711-717). 항원은 또한 비-호지킨 림프종 (HXJI)에서 B 세포의 90% 이상에서 표면 상에 발현되지만 (Anderson et al, Blood 63(6), 1984, p.1424-1433), 조혈 줄기 세포, 프로-B 세포, 정상 형질 세포 또는 기타 정상 조직에서는 검출되지 않는다 (Tedder et al, J. Immunol. 135(2), 1985, p. 973-979). CD20은 세포 주기 개시 및 분화를 위한 활성화 공정에서 초기 단계(들)를 조절하는 것으로 보이며 (Tedder et al., supra), 잠재적으로 칼슘 이온 채널으로서 기능한다 (Tedder et al,. J. Cell. Biochem. 14D, 1990, p. 195).
B 세포 림프종에서 CD20의 발현을 감안하면, 이 항원은 림프종의 치료에 유용한 치료학적 표적일 수 있다.
항체 리툭시맵 (RITUXAN, MabThera, Acellbia)은 인간 항원 CD20에 대한 유전자 조작된 키메라 뮤라인/인간 단일클론 항체로서, 재발성 또는 난치성 저-등급 또는 여포성 CD20-양성 B 세포 비-포지킨 림프종을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 것으로 언급된다. 리툭시맵은 US 5,736,137 및 US 5,776,456에서 "C2B8"로 지칭된 항체이다. 시험관내 작동 방식 연구에서, 리툭시맵은 인간 보체에 결합하고, 보체 의존적인 세포독성 (CDC)을 통해 B-림프구 세포주를 세포용해시키는 것으로 입증되었다 (Reff et al, Blood 83(2), 1994, p. 435-445). 아울러, 이 항체는 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 분석에서 유의한 활성을 나타낸다. 생체내 전임상 실험에서는, 리툭시맵이 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis))의 말초혈, 림프절 및 골수로부터, 아마도 보체- 및 세포-매개 공정을 통해 B 세포를 고갈시키는 것으로 확인되었다 (Reff et al, Blood 83(2), 1994, p. 435-445).
아울러, 이후에는, 리툭시맵과 같은 항-CD20 항체가 류마티스 관절염 (특허 RU2358762, RU2489166 및 RU2457860) 또는 베게너 육아종증 (특허 RU2326127)과 같은 다양한 자가면역 질환의 치료에서 효과적인 치료학적 물질인 것으로 밝혀졌다.
인간 요법에서 뮤라인 항체 사용에 대한 주된 한계는 인간 항-마우스 항체 (HAMA)의 형성이다 (예를 들어, Miller R.A. et al ≪Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma≫, Blood, 62, 1983, p. 988-995; 및 Schroff R.W. et al ≪Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy≫, Cancer Res., 45, 1985, p. 879-885를 참조함). 설치류 항체의 가변성 (V) 도메인이 인간 불변 (C) 영역에 융합된 키메라 분자도 여전히 유의한 면역 반응 (HACA, 인간 항-키메라 항체 반응)을 야기할 수 있다 (Neuberger et al, Nature (London), 314, 1985, p. 268-270).
단일클론 항체의 임상적인 사용에서 이러한 한계를 극복하기 위한 매우 효과적인 방식은 뮤라인 항체 또는 비-인간 종 항체의 "인간화"이다 (Jones et al, Nature (London), 321, 1986, p. 522-525; Riechman et al, Nature (London), 332, 1988, p. 323-327).
따라서, 환자에 투여시 최소한의 항원성을 나타내거나 또는 항원성이 없는 CD20 항원에 대한 치료 항체를 생산하는 것이 유익하며, 주로 장기간의 치료 용도로 의도된다. 본 발명은 이러한 문제를 해결한다.
단일클론 항체 BCD-132는 CD20 항원에 선택적이고 특이적으로 결합하며, CD20 항원의 효과적인 저해제이며; 또한 본 발명의 항체는 환자에 투여시 최소한의 항원성을 가진다.
일 측면에서, 본 발명은 CD20에 특이적으로 결합하며 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
1) 서열번호 2 또는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
2) 서열번호 4 또는 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
2) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
2) 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
1) 서열번호 1 또는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
2) 서열번호 3 또는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
1) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
2) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
1) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
2) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 전장 IgG 항체이다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소형 항체이다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 IgG1 이소형 항체이다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 상기한 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는 전술한 항체를 생산하기 위한 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 항체를 생산하기 위한 전술한 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 항체를 생산하기에 충분한 조건에서 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 필요에 따라 수득한 항체를 단리 및 정제하는 것을 포함하는, 상기한 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는 CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용되는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 하기로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 용도로 의도된다:
a) 종양 질환 또는 장애, 또는
b) 자가면역 질환 또는 장애.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 B 세포 림프종 또는 백혈병을 포함하는 군으로부터 선택되는 종양 질환 또는 장애를 치료하기 위한 용도로 의도된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 호지킨 질환 (호지킨 림프종)으로부터 선택되는 B 세포 림프종을 치료하기 위한 용도로 의도된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 만성 림프성 백혈병 (CLL) 또는 소형 림프성 림프종 (SLL)으로부터 선택되는 백혈병을 치료하기 위한 용도로 의도된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 (스틸 질환), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 궤양성 대장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, ANCA 혈관염, 실질 장기의 이식 거부 반응, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 포함하는 군으로부터 선택되는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하기 위한 용도로 의도된다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 치료학적 활성 화합물을 포함하는 CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조합에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 약학적 조합은 화학치료제, 항체 또는 항-호르몬제로부터 선택되는 여러가지 치료학적 활성 항-종양 화합물을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 저해가 필요한 개체에서 CD20의 생물학적 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이이 항원 결합 단편 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 치료 방법은 하기로부터 선택되는 질환 또는 장애에 관한 것이다:
a) 종양 질환 또는 장애, 또는
b) 자가면역 질환 또는 장애.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 치료 방법은 B 세포 림프종 또는 백혈병으로부터 선택되는 종양 질환 또는 장애에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 치료 방법은 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 호지킨 질환 (호지킨 림프종)으로부터 선택되는 B 세포 림프종에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 치료 방법은 만성 림프성 백혈병 (CLL) 또는 소형 림프성 림프종 (SLL)으로부터 선택되는 백혈병에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애의 치료 방법은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 (스틸 질환), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 궤양성 대장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, ANCA 혈관염, 실질 장기의 이식 거부 반응, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 포함하는 군으로부터 선택되는 자가면역 질환 또는 장애에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에서 CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다:
a) 종양 질환 또는 장애, 또는
b) 자가면역 질환 또는 장애.
일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 B 세포 림프종 또는 백혈병을 포함하는 군으로부터 선택되는 종양 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 호지킨 질환 (호지킨 림프종)으로부터 선택되는 B 세포 림프종을 치료하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 만성 림프성 백혈병 (CLL) 또는 소형 림프성 림프종 (SLL)으로부터 선택되는 백혈병을 치료하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 (스틸 질환), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 궤양성 대장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, ANCA 혈관염, 실질 장기의 이식 거부 반응, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 포함하는 군으로부터 선택되는 자가면역 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다.
도 1. 발현 벡터 pEE CK의 맵.
도 2. 발현 벡터 pEE HC의 맵.
도 3. IgG1 형태의 개략도.
도 4. 인간 나이브 조합 라이브러리의 합성 계획도.
도 5. Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 클로닝하기 위한 파지미드의 맵.
도 6. Fab를 배양하기 위한 발현 플라스미드 pLL의 맵.
도 7. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 8. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-026 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 9. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-028 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 10. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-075 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 11. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 12. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-028 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 13. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (1,2) 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 14. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (3,4) 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 15. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (5,6) 후보물질-바이오틴화된 CD20 펩타이드 상호작용 분석.
도 16. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-028 후보물질-FcγRIIIa-158F 상호작용 분석.
도 17. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (1,2) 후보물질-FcγRIIIa-158F 상호작용 분석.
도 18. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (3,4) 후보물질-FcγRIIIa-158F 상호작용 분석.
도 19. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (5,6) 후보물질-FcγRIIIa-158F 상호작용 분석.
도 20. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-028 후보물질-FcγRIIIa-158V 상호작용 분석.
도 21. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (1,2) 후보물질-FcγRIIIa-158V 상호작용 분석.
도 22. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (3,4) 후보물질-FcγRIIIa-158V 상호작용 분석.
도 23. Forte Bio Octet RED 386에서 BCD132L-077 (5,6) 후보물질-FcγRIIIa-158V 상호작용 분석.
도 24. 발현 벡터 pSX의 맵.
도 25. MabThera 대비, 유세포 측정을 이용한 WIL2-S 세포 상의 CD20 수용체에 대한 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 특이적인 결합성 측정.
도 26. MabThera 대비, BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 보체 의존적인 세포독성 측정.
BCD-132-L-028
● MabThera ■ BCD-132-L-028 ▼ BCD-132-L-077.
도 27. MabThera 대비, BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 보체 의존적인 세포독성 측정.
BCD-132-L-077
● MabThera ■ BCD-132-L-028 ▼ BCD-132-L-077.
도 28. MabThera 대비, BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 항체 의존적인 세포성 세포독성 측정. 저 친화성 CD16 리포터 세포주, 표적 WIL2-S 세포주.
BCD-132-L-028
● MabThera ■ BCD-132-L-028 ▼ BCD-132-L-077.
도 29. MabThera 대비, BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 항체 의존적인 세포성 세포독성의 측정. 저 친화성 CD16 리포터 세포주, 표적 WIL2-S 세포주.
BCD-132-L-077
● MabThera ■ BCD-132-L-028 ▼ BCD-132-L-077.
도 30. MabThera 대비, BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 항체 의존적인 세포성 세포독성의 측정. 저 친화성 CD16 리포터 세포주, 표적 WIL2-S 세포주.
BCD-132-L-028
● MabThera ■ BCD-132-L-028 ▼ BCD-132-L-077.
도 31. MabThera 대비, BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 항체 의존적인 세포성 세포독성의 측정. 저 친화성 CD16 리포터 세포주, 표적 WIL2-S 세포주.
BCD-132-L-077
● MabThera ■ BCD-132-L-028 ▼ BCD-132-L-077.
도 32. FF (A) FV (B) 및 VV (C) 알로타입 (allotype)을 이용한, 건강한 공여자의 전혈에서 MabThera 대비 항체 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077에 의해 유도된 CD19+에 의한 B 세포 고갈 측정.
도 33. 상업적으로 이용가능한 항체 리툭시맵 대비 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 항체 의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 측정.
도 34. 염증 반응 중증도 (BCD132-L-077).
도 35. 탈수초화 중증도 (BCD132-L-077).
도 36. BCD132-L-077 제품을 투여량 22.0 mg/kg, 44.0 mg/kg, 88.0 mg/kg으로 정맥내 반복 투여시 영장류 혈청에서의 평탄화된 농도 곡선 (smoothed concentration curve).
정의 및 일반적인 방법
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 과학 용어 및 기술 용어는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가질 것이다.
나아가, 문맥상 달리 요구되지 않은 한, 단수형 용어들은 복수를 포함할 것이며, 복수형 용어들은 단수를 포함할 것이다. 전형적으로, 세포 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석화학, 유기 합성 화학, 의학 및 제약 화학의 분류 및 방법뿐 아니라 본원에 기술된 단백질 및 핵산의 혼성화 및 화학은 잘 알려져 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 광범위하게 사용된다. 효소 반응 및 정제 방법들은 당해 기술 분야에 통상적이거나 또는 본원에 기술된 바와 같이, 제조사의 지침에 따라 수행된다.
항체 관련 정의
CD20 또는 B-림프구 항원 CD20은 단백질, 즉, B-림프구의 표면에서 발견되는 공동-수용체이다. CD20은 인간 MS4A1 유전자의 산물이다. 이 단백질의 실제 기능은 여전히 알려져 있지 않다. 그러나, 이 단백질이 B-림프구의 활성화 및 증식에 역할을 하는 것으로 여겨진다.
MS4A1 유전자는 적어도 25종의 다른 유전자들로 이루어진 MS4A (막에 걸쳐있는 4A) 유전자 패밀리의 일원이다. 이 패밀리에 속하는 유전자는 인간 염색체 좌 11q12―13에 몰려 있다. 대응되는 단백질은 비슷한 공간적인 구조를 가지는 것으로 간주되며: 이들은 N-말단 및 C-말단 세포질 도메인을 가진 테트라스패닝 막 토폴로지를 가진다 (JANAS E. ET ALL., Functional role of lipid rafts in CD20 activity?, Biochem Soc Symp. 2005;(72):165-75).
이 유전자의 증폭 및/또는 이의 단백질의 과다 발현은 하기를 비롯하여 수많은 암 또는 자가면역 질환들에서 관찰된 바 있다:
a) 비-호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 질환 (호지킨 림프종), 만성 림프성 백혈병 (CLL) 또는 소형 림프성 림프종 (SLL)을 포함하는 군으로부터 선택되는 종양 질환 또는 장애.
b) 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 (스틸 질환), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 궤양성 대장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, ANCA 혈관염, 실질 장기의 이식 거부 반응, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 포함하는 군으로부터 선택되는 자가면역 질환 또는 장애.
용어 "결합 분자"는 항체 및 면역글로불린을 포함한다.
본원에서, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린" (Ig)은 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 영역") 또는 단쇄를 포함한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 항원-결합 영역을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부를 포함한다. 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 타입의 포유류 Ig 중쇄가 공지되어 있다. 존재하는 중쇄의 타입이 항체 클래스를 규정하고; 이들 쇄들은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체 각각에서 발견된다. 구별되는 중쇄들은 크기 및 구성 측면에서 다양하다; α 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하지만, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 각각의 중쇄는 2가지 영역, 즉 불변부 및 가변부를 포함한다. 불변부는 동일한 이소형의 항체들 모두에서 동일하지만, 서로 다른 이소형 항체들에서는 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 (일렬로)로 구성된 불변부와, 유연성 (flexibility) 부가를 위한 힌지부를 포함하며 (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); 중쇄 μ 및 ε는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 불변부를 가진다. 포유류에서는, 람다 (λ) 및 카파 (κ)로 언급되는 오직 2가지 타입의 경쇄만 공지되어 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄의 대략적인 길이는 아미노산 211개 내지 217개이다. 바람직하게는, 경쇄는 카파 (κ) 경쇄이고, 불변 도메인 CL은 바람직하게는 C 카파 (κ)이다.
본 발명에서 "항체"는 임의 클래스 (예, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 바람직하게는 IgG) 또는 서브클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 바람직하게는 IgG1)에 속하는 것일 수 있다.
VL 영역 및 VH 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보존성이 높은 영역들과 그 사이에 배치된 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과-가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 가변부와 경쇄 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 등의, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서, 항체의 "항원-결합 영역" 또는 "항원 결합 단편" (또는 간단히 "항체 영역" 또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가진, 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 입증된 바 있다. 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 2개의 Fab 단편들이 연결된 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd-단편; (iv) 항체의 싱글 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv-단편, (v) VH/VHH 도메인으로 구성된 dAb-단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정부 (CDR) 등이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 영역, 즉 VL와 VH는 개별 유전자들에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역들이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 싱글 단백질 쇄를 만들 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법으로 연결될 수도 있다 (단쇄 Fv (scFv)로 알려져 있음; 예로, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883을 참조함). 이러한 단일-가닥 분자는 또한 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 것으로 추정된다. 이러한 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득되며, 이들 단편은 온전한 항체 (intact antibody)와 동일한 방식으로 스크리닝된다.
바람직하게는, 본 발명의 항원-결합 영역의 CDR 또는 전체 항체 항원 결합 영역은 마우스, 라마 또는 인간 도너 라이브러리로부터 유래되거나, 또는 일부 아미노산 잔기가 변형된, 예를 들어 특정 항체 특성, 예를 들어, KD, koff, IC50, EC50, ED50을 최적화하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환된, 실질적으로 인간 기원의 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 프래임워크 영역은 인간 기원의 것이거나 또는 실질적으로 인간 기원의 것이다 (인간 기원의 비율이 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%임).
다른 구현예들에서, 본 발명의 항원 결합 영역은, 비-제한적인 예로, 마우스, 라마, 토끼, 랫 또는 햄스터 등의, 인간을 제외한 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 다른 예로, 항원-결합 영역은 인간 종으로부터 유래될 수 있다.
용어 "가변성 도메인"은 가변성 도메인의 일정 부분이 항체들에서 서열상 상당히 상이하다는 것을 의미한다. V 도메인은 각 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 항원 결합을 매개하고 특이성을 결정한다. 그러나, 가변성이 가변성 도메인의 110개의 아미노산 전체에 균등하게 분산되어 있진 않다. 대신, V 영역은 "과가변부" 또는 CDR로 지칭되는 극도의 가변성을 가진 더 짧은 가닥에 의해 이격된 아미노산 15-30개로 된 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 불변성 단편들로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 각 가변성 도메인은 FR 4개를 포함하며, 연결성 루프, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 과가변부 3개에 의해 연결된, β-시트 배열을 주로 취한다. 각 체인에서 과가변부들은 FR에 의해 서로 인접하게 유지되며, 다른 체인으로부터 유래된 과가변부와 함께 항체의 항원-결합부를 형성하는데 기여한다. 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 참여하진 않지만, 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체 참여 등의 여러가지 작동자 기능을 발휘한다.
본원에서, 용어 "과가변부"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 통상적으로, 과가변부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기 및/또는 "과가변성 루프"로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 타겟 에피토프에 대한 결합 친화성을 높이기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 "친화성 성숙화"라고 하며, 선택적으로, 예를 들어, 항체의 인간화에 의해 결합 특이성 또는 친화성의 저하가 발생하고 역 돌연변이 (inverse mutation) 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 개선하는 것이 가능하지 않을 경우, 인간화와 더불어 수행될 수 있다. 다양한 친화성 돌연변이 방법들, 예를 들어, Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 언급된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)에 제시된 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
"프래임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기이다. 각각의 가변성 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 FR 4개를 가지고 있다. CDR이 Kabat에 따라 정의되는 경우, 경쇄 FR 잔기들은 대략적으로 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) 및 98-107 (LCFR4)번 위치에 위치하고, 중쇄 FR 잔기들은 대략적으로 중쇄에서 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) 및 103-113 (HCFR4)번 위치에 위치한다. CDR이 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 대략적으로 경쇄에서 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) 및 97-107 (LCFR4)번 위치에 존재하며, 중쇄 FR 잔기는 대략적으로 중쇄 잔기에서 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) 및 102-113 (HCFR4)번 위치에 존재한다. CDR이 Kabat에 의해 정의되는 양쪽 CDR 및 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산을 포함하는 일부 경우에, FR 잔기들은 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 경우, 중쇄 FR1 잔기는 1-25번 위치에 위치하고, FR2 잔기는 36-49번 위치에 위치한다.
면역글로불린의 단편 결정화가능한 영역 ("Fc 영역, Fc")은 세포 표면 Fc-수용체와 상호작용하는 면역글로불린 분자뿐 아니라 보체 시스템의 일부 단백질의 "꼬리" 영역이다. 이런 특성이 항체가 면역 시스템을 활성화하게 만든다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형의 경우, Fc 영역은 중쇄 2개의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 유래된 각각의 동일한 단백질 단편 2개로 구성되고; IgM 및 IgE 이소형의 경우, Fc 영역은 각각의 폴리펩타이드 쇄에 중쇄 불변 도메인 3개 (CH 도메인 2-4)를 포함한다.
표적 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는, 항체가 단백질 또는 항원을 발현하는 세포를 표적화하는 치료학적 물질 및/또는 진단 물질로서 사용될 수 있도록 충분한 친화성으로 항원에 결합하며, 다른 단백질과는 일부 교차 반응하는 항체이다. 분석 방법에 따라: 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 방사성면역분석 (RIA) 또는 ELISA, 이러한 구현예에서, 비-표적 단백질에 항체가 결합하는 수준은 특이적인 표적 단백질에 결합하는 항체의 10% 미만이다. 항체가 표적 분자에 결합하는 것과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이라는 용어는, 비-특이적인 상호작용과는 검출가능하게 (측정가능하게) 상이한 결합을 의미한다 (예, bH1-44 또는 bH1-81의 경우, 비-특이적인 상호작용은 소 혈청 알부민, 카세인, 소 태아 혈청 또는 뉴트라비딘에의 결합이다).
특이적인 결합은, 예를 들어, 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 표적과 비슷한 다른 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 표적을 이용한 경쟁적인 반응에 의해 결정할 수 있다. 이 경우, 표지된 표적과 프로브의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 저해된다면, 이는 특이적인 결합이다. 본원에서, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 타겟 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이다라는 표현은, 표적에 대한 Kd가 적어도 약 200 nM 또는 적어도 약 150 nM 또는 적어도 약 100 nM 또는 적어도 약 60 nM 또는 적어도 약 50 nM 또는 적어도 약 40 nM 또는 적어도 약 30 nM 또는 적어도 약 20 nM 또는 적어도 약 10 nM 또는 적어도 약 8 nM 또는 적어도 약 6 nM 또는 적어도 약 4 nM 또는 적어도 약 2 nM 또는 적어도 약 1 nM 또는 그 이상인 분자로 설명될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에만 결합하고 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 상의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 (on) 속도를 의미한다.
본원에서, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 (off) 속도를 의미한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예, 항체)의 단일 결합부와 이의 결합 파트너 (예, 항원) 간의 비-공유성 상호작용들 전체의 세기를 의미한다. 달리 언급되지 않은 한, "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버들 (예, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 나타내는 고유한 (특징적인, 참된) 결합 친화성을 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 바람직한 Kd 값은 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM 또는 그 미만이다. 친화성은 본원에 기술된 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 방법으로 측정할 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 보다 빨리 결합하고 결합된 채 더 길게 유지되는 경향을 보인다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이중 임의의 방법을 본 발명의 목적에 따라 이용할 수 있다.
일 구현예에서, "Kd" 또는 "Kd 값"은 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 칩 CM5 항원을 사용해 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용해 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정한다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음, 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원을 투입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 투입해 비-반응성 기들을 차단한다. 카이네틱스를 측정하기 위해, Fab 2배 연속 희석물 (예, 0.78 nM 내지 500 nM)을 0.05% Tween 20 첨가된 PBS (PBST) 중에 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 및 해리 센소그램을 동시적으로 피팅함으로써, 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 간단한 원 투 원 랭뮤어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용해 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비율로 계산한다. 예를 들어, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881을 참조한다. 이러한 표면 플라스몬 공명 분석에 따라 결합 속도가 106 M- 1 s-1을 초과한다면, 이는, 정지 흐름 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (Thermo Spectronie)와 같은 분광기에서 큐벳을 교반하면서 사용해 측정하는 바와 같이, 항원 농도 증가 조건에서, PBS, pH 7.2의 20 nM 항-항원 항체 용액을 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 (조사) = 340 nm, 16 nm 대역 (band))의 증가 또는 감소를 측정하는, 형광 퀀칭에 의해 결정할 수 있다.
용어 "koff"는 결합 분자와 항원 간의 특수한 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. koff 해리 속도 상수는 예를 들어 Octet™ 시스템을 사용해 바이오레이어 간섭계법 (biolayer interferometry)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 "결합 속도" ("on-rate") 또는 "kon"은 또한 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)에서 ~10 상대적인 단위 (반응 단위, RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용해, 25℃에서, 전술한 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 수 있다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 투입한다. 항원을 주입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 투입하여 미-반응성 기들을 차단한다.
달리 명시되지 않은 한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 "생물학적으로 활성인" 및" 생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 생물학적 분자에 결합하는 능력을 가진 것을 의미한다.
용어 "생물학적 분자"는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 및 이들의 조합을 지칭한다. 일 구현예에서, 생물학적 분자는 자연계에 존재하는 것이다.
Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편은 전체 항체 (whole antibody)의 펩신 또는 파파인 분해와 같은 통상적인 방법을 이용해 전체 항체로부터 수득할 수 있다. 또한, 항체, 항체의 일부 및 면역어드헤신 (mmunoadhesion) 분자는 본원에 기술된 바와 같이 표준적인 재조합 DNA 기법을 이용해 수득할 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주에서 발현된 항체를 지칭하며, 이때 뉴클레오티드 서열(들)은 이들 세포에 천연적으로 조합되어 있지 않은 것이다.
본원에서, 용어 "변이체 항체"는, 부모 항체의 서열과 비교해, 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가, 결손 및/또는 치환함으로써 이의 "부모" 항체의 아미노산 서열과 상이한, 아미노산 서열을 가진 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 변이체 항체는 부모 항체와 비교해 적어도 하나 이상의 (예, 1-12, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개, 일부 구현예에서, 변이체 항체는 1 내지 약 10개의) 아미노산의 부가, 결손 및/또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 부가, 결손 및/또는 치환은 변이체 항체의 CDR에서 이루어진다. 변이체 항체의 서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 변이체 항체 서열에서 부모 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기들의 %로서 본원에서 정의된다. 변이체 항체는, 부모 항체에 결합하는, 동일한 항원, 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 가지고 있으며, 일부 구현예에서 하나 이상의 특성 또는 생활성은 부모 항체보다 우수하다. 예를 들어, 변이체 항체는 부모 항체와 비교해 예를 들어 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있거나, 반감기가 더 길 수 있거나, IC50이 더 낮거나 또는 항원의 생물학적 활성을 저해하는 능력이 강화될 수 있다. 본원에서는, 부모 항체와 비교해, 생물학적 활성이 적어도 2배 이상인 (바람직하게는 5배 이상, 10배 이상 또는 20배 이상) 변이체 항체에 특히 주목한다.
용어 "2중 특이성 항체"는 2개의 별개의 다른 생물학적 분자의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 하나의 생물학적 분자의 별개의 2개의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(들)을 가진 항체를 의미한다. 이중 특이성 항체는 또한 "듀얼 특이성"을 가진 것으로 또는 "듀얼 특이성" 항체인 것으로서 본원에서 지칭된다.
넓은 의미에서, 용어 "키메라 항체"는 하나의 항체의 하나 이상의 영역과, 하나 또는 수개의 다른 항체의 하나 이상의 영역, 전형적으로 부분적으로 인간 및 부분적으로 비-인간 항체, 즉 마우스, 랫 또는 유사 야생 동물과 같은 비-인간 동물 또는 라마 및 알파카 등의 낙타과로부터 일부 유래된 항체의 하나 이상의 영역을 포함하는, 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 일반적으로 인간 항-항체 면역 반응, 예를 들어 뮤라인 항체의 경우 인간 항-마우스 항체 면역 반응의 위험성을 낮추기 위해, 비-인간 항체보다 선호된다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변성 영역의 서열이 뮤라인 서열이고 불변부 서열이 인간 서열인, 항체이다. 키메라 항체의 경우, 비-인간 영역은 항체를 인간화하기 위해 추가적으로 변형될 수 있다.
용어 "인간화 (humanization)"는, 항체가 완전 또는 부분적으로 비-인간 기원, 예를 들어, 대상 항원으로 마우스 또는 라마를 각각 면역화함으로써 수득한 마우스 또는 라마 항체이거나, 또는 이러한 마우스 또는 라마 항체에 기반한 키메라 항체일 경우, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 또는 최소화하기 위해, 일부 아미노산, 특히 중쇄 및 경쇄의 프래임워크 영역 및 불변 도메인의 일부 아미노산을 치환할 수 있다는 것을 의미한다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR 영역들에 위치한 아미노산 잔기를 통해 타겟 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 영역내 아미노산 서열은 CDR 영역 바깥쪽 서열에 비해 개별 항체들에서 훨씬 더 가변적이다. CDR 서열들이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 특이적인 천연 생성 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키거나, 또는 보다 일반적으로는, 예를 들어, 특이 항체로부터 유래된 CDR 서열과 다른 항체로부터 유래된 프래임워크 서열을 발현하는 발현 벡터를 구축함으로써, 아미노산 서열을 가진 임의의 특이 항체를 발현시키는 것이 가능하다. 이로써, 비-인간 항체를 "인간화"하고, 초기 항체의 결합 특이성 및 친화성을 상당히 보존하는 것이 가능하다. 면역원성, 즉 특정 항체에 대한 인간 항-항체 반응을 정확하게 예측하기는 불가능하지만, 비-인간 항체는 전형적으로 인간 항체보다 면역원성이 더 높다. 외래 (예, 야생 동물 또는 낙타과) 불변부가 인간 기원의 서열로 치환된 키메라 항체는, 일반적으로, 완전 외래 기원의 항체보다 면역원성이 더 낮아, 치료 항체로 완전 인간 항체 또는 인간화된 항체를 사용하는 경향이다. 따라서, 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 기타 항체는 따라서 인간 항-항체 반응의 위험성을 낮추기 위해 인간화될 수 있다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변부 서열의 프래임워크 영역의 변형을 수반한다. 상보성 결정부 (CDR 영역)의 일부 아미노산 잔기는, 대부분 인간화에 의해 변형될 가능성이 거의 없지만, 일부 경우에는, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파르테이트 이성질화 부위 또는 부적절한 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하기 위해, CDR의 개별 아미노산 잔기들을 변형하는 것이 바람직할 수 있다. N-연결된 당화는 트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 올리고당 쇄를 부착시켜 이루어지며, 서열에서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-당화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를 다른 잔기로 돌연변이함으로써, 바람직하게는 보존적인 치환에 의해 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자에 따라 이루어질 수 있다. 특히, 아스파라긴 잔기는, 주로 Asn-Gly 서열에 존재하는 경우에는 탈아미드화되기 쉬우며, Asn-Ala과 같은 다른 다이펩타이드 서열에서는 그 정도가 낮다. CDR이 이러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly을 포함하는 한, 전형적으로 관련 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적인 치환에 의해 이 영역을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 다수의 방법들이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 가장 일반적으로 사용되는 방법들 중 한가지는 CDR 그래프팅 (CDR grafting)이다. CDR 그래프팅은 Kabat에 의한 CDR 정의를 기초로 할 수 있지만, 최종 편집판 (Magdelaine-Beuzelin et al, Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210-225 (2007))에서는 IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) 정의가 인간화 결과를 개선할 수 있는 것으로 시사되어 있다 (Lefranc et al, Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). 일부 경우에, CDR 그래프팅은 CDR이 입수된 부모 항체 CDR 영역과 비교해 결합 특이성과 친화성을 낮출 수 있으며, 따라서, CDR 그래프팅된 비-인간 항체의 생물학적 활성을 낮출 수 있다. 역 돌연변이 (때때로, "프래임워크 영역 수리 (framework region reparation)"라고도 함)를, CDR 그래프팅된 항체의 선택 위치에, 통상적으로 프래임워크 영역에 도입하여, 모 항체의 결합 친화성과 특이성을 회복시킬 수 있다. 잠재적인 역 돌연변이를 위한 위치 결정은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 이용해 수행할 수 있다. 역 돌연변이하기 위한 후보 잔기 아미노산 잔기는 일반적으로 항체 분자의 표면 상에 위치하는데 반해, 표면 노출 정도가 낮거나 또는 묻히는 잔기는 일반적으로 변형하지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 역 돌연변이에 대한 대안적인 인간화 방법은, 비-인간 기원의 비-노출 잔기들은 유지하면서 표면 잔기는 인간 잔기로 바꾸는, 재표면화 (resurfacing)이다.
완전 인간 항체는 2가지 기법을 이용해 제조할 수 있다: 시험관내 구축된 파지 라이브러리 (in vitro collected phage libraries)를 이용한 기법, 또는 인간화된 동물 (마우스, 랫 등)의 생체내 면역화 기법.
파지 항체 조합 라이브러리의 구축은, 구분할 수 있는 수종의 항체 라이브러리 타입들: 나이브, 면역 및 합성에 따라, 유전자 레퍼토리의 소스 선택으로 시작한다. 나이브 라이브러리 및 면역 라이브러리는, 건강한 공여자 또는 특정 항원으로 면역화된 공여자 각각의 가변성 면역글로불린 도메인을 코딩하는, 천연 인지 유전자를 이용해 구축한다. 이러한 목적으로 항체-생산 림프구성 세포주로부터 mRNA를 단리한다. 말초혈 림프구가 주로 사용되지만, 비장세포 [Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157-6162 and de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, et al. A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230], 편도세포 및 골수 림프구 [Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard K, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC, et al. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 1996,14:309-314.]도 물론 사용된 바 있다. 이후, mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 올리고-dT 프라이머 및 통계학적으로 고안된 헥사뉴클레오티드를 사용해, 항체의 가변성 도메인을 코딩하는 가능한 모든 유전자 변이체의 cDNA 카피를 제작할 수 있다 [Ulitin AB, Kapralova MV, Laman AG, Shepelyakovskaya AO, Bulgakova EB, Fursova KK, et al. The library of human miniantibodies in the phage display format: Designing and testing DAN: Izd-vo "Nauka"; 2005].
cDNA 수준에서 하나 또는 수개의 가변성 도메인 유전자 패밀리 또는 항체 이소형에 대한 증폭된 유전자의 범위를 제한하기 위해 하나 또는 수개의 프라이머를 동시에 사용할 수 있다 [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]. 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 사용되는 프라이머는 가장 보존적인 영역에 상보적이다. 이의 서열은 Kabat 또는 V BASE 데이터베이스와 같은 데이터베이스를 구성하는 유전자 콜렉션으로부터 선택한다. 또한, 프라이머 설계는 PCR-산물을 적절한 벡터에 클로닝하기 위한 내부 제한효소 부위를 제공한다.
합성 라이브러리 구축은 천연 CDR을 랜덤 서열 세트로 치환하는 것을 토대로 한다. 이 경우, 매우 다양한 항원-결합부를 제작할 수 있다.
파지 디스플레이는 가장 강력하고 널리 사용되는 시험관내 항체 검색 기법이다. 1985년에, 스미스는 외래 DNA 서열을 필라멘트형의 박테리오파지 M13에 클로닝하고, 클로닝한 서열을 융합 단백질로서 파지 입자의 표면에 발현시킬 수 있음을 알게 되었다 (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317). 따라서, 다른 단백질에 결합하는 능력을 토대로 대상 융합 단백질을 선별할 수 있다. 이러한 발견은 PCR 증폭 기법과 조합되었으며, 면역글로불린 유전자의 cDNA 레파토리를 클로닝하여, 타겟-특이적인 단일클론 항체를 신속하게 검색하기 위해 사용될 수 있는, 가변성 도메인을 포함하는 다양한 파지 라이브러리들을 구축할 수 있게 되었다. 파지 라이브러리 레파토리는, 라이브러리 구축에 사용된 혈액의 기원이 되는 각 인간 또는 동물의 B-세포 항체 레파토리를 반영한다. 1995년에, 하이브리도마 기법으로 제조된 것과 비슷할 수 있는 완전 인간 항체 레파토리를 발현하는 유전자 조작 마우스의 구축에 대한 논문 2가지가 발표되었다 (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859). 이들 동물에서, 자신의 내인성 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자는 의도적으로 파괴시킨 다음, 인간 중쇄 및 κ 경쇄 유전자의 세그먼트인 전이유전자가 도입되었다. 인간 유전자 레파토리를 마우스 면역계에 사용하여, 매우 다양한 항원들에 대해 고 특이성 및 고 친화성의 항체가 생산되는 것으로 밝혀졌다. 형질전환 마우스는 기본적으로 마우스 및 인간 성분의 하이브리드 (인간 면역글로불린, 마우스 Igα, Igβ 및 기타 신호전달 분자들)인 B-세포 수용체를 발현함에도 불구하고, 이의 B-세포는 정상적으로 발생 및 성숙한다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 세포의 분리된 클론 집단에 의해 합성 및 단리된 항체를 지칭한다. 클론 집단은 불멸화 세포의 클론 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 클론 집단에서 불멸화 세포는 전형적으로 면역화된 동물 유래 개별 B 림프구를 림프성 종양 유래의 개별 세포와 융합하여 제조되는 하이브리드 세포, 즉 하이브리도마이다. 하이브리도마는 구축된 세포의 한가지 유형이며, 자연계에 존재하진 않는다.
"천연 항체"는 통상적으로 동일한 2개의 경(L) 쇄와 동일한 2개의 중(H) 쇄로 구성된 약 150,000 달톤 분자량의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 이황화 공유 결합에 의해 중쇄와 연결되고, 이황화 결합의 개수는 여러가지 면역글로불린 이소형의 중쇄들에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정하게 이격된 체인내 이황화 결합을 가지고 있다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VH)을 가지고 있으며, 그 뒤에 복수의 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VL)을, 다른 말단에는 불변 도메인을 가지고 있다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변성 도메인과 중쇄 가변성 도메인 사이에 계면(interface)을 형성하는 것으로 보인다.
본원에서 다양한 항체를 기술하기 위해 사용되는 용어 "단리된" ("isolated")은 항체가 발현되는 세포 또는 세포 배양물로부터 동정 및 분리 및/또는 재생된 항체를 지칭한다. 천연 환경으로부터의 불순물 (오염 물질)은 폴리펩타이드의 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 이는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는, (1) 스피닝 컵 서열 분석 장치 (spinning cup sequenator) (Edman sequenator)의 사용시 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 코마시 브릴리언트 블루 또는 바람직하게는 은 염료를 이용한 환원성 또는 비-환원성 조건 하 SDS-PAGE에서의 동질성을 나타내는 수준으로 정제된다. 단리된 항체는, 폴리펩타이드의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않으므로, 재조합 세포 내부의 인 시추 항체를 포함한다. 전형적으로, 단리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조된다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 소스에서 일반적으로 결합되어 있는 하나 이상의 핵산 분자-불순물로부터 동정 및 분리된 것이다. 단리된 핵산 분자는, 천연 환경에서 발견되는 형태 또는 세트와 구별된다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 환경에서 세포내 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 환경에서 세포내 위치화가 아닌 염색체 위치에 존재하는 경우에, 항체가 정상적으로 발현되는 세포내 위치된 핵산 분자를 포함한다.
본원에서, 용어 "에피토프"는 결합 분자 (예, 이중 특이성 결합 분자와 같은, 항체 또는 관련 분자)에 특이적으로 결합하는 항원의 영역 (결정부)을 지칭하는 것으로 의도된다. 에피토프 결정부는 통상적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑들로 이루어지며, 전형적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체 구조 (conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프의 경우, 단백질 (예, 항원)과 상호작용 분자 (예, 항체) 간의 상호작용 지점들 모두 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 이루어진다. 입체 에피토프의 경우, 상호작용 지점들은 1차 아미노산 서열에서 서로 이격되어 있는 단백질의 아미노산 잔기들을 가로질러 형성된다. 바람직한 항원 에피토프가 동정되면, 이 에피토프에 대한 항체를 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법으로 제작할 수 있다. 또한, 항체 또는 기타 결합 분자의 구축 및 특정화로 바람직한 에피토프에 대한 정보를 해명할 수 있다. 이러한 정보를 기반으로, 예를 들어, 항원 결합에 대해 경쟁하는 결합 분자를 탐색하기 위한 경쟁적인 실험들을 수행함으로써, 같은 또는 동일한 (identical) 에피토프에 결합하는 결합 분자를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다.
본원에서, 용어 "펩타이드 링커"는 도메인들을 조합할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 서로 결합하는 도메인에 따라 소정의 길이를 가지며, 임의의 아미노산 서열을 포함하는, 임의의 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 펩타이드 링커는 5개 이상의 아미노산 길이를 가지며, G, A, S, P, E, T, D, K로부터 선택되는 임의의 아미노산 세트로 구성된다.
용어 "시험관내"는 인공적인 조건에서 신체 외부에서의 생물학적 대상, 생물학적 공정 또는 생물학적 반응을 지칭한다. 예를 들어, 시험관내 배양된 세포는 신체 외부 환경, 예를 들어 시험관, 배양 바이얼 또는 마이크로타이터 플레이트에서 배양되는 세포로서 이해된다.
본원에서, 용어 "IC50" (50% 저해 농도)은 측정가능한 활성 또는 반응, 예를 들어 종양 세포와 같은 세포의 성장/증식을 50%까지 저해하는 약물의 농도를 의미한다. IC50은 곡선 피팅을 위한 특수 통계 소프트웨어를 사용해 적절한 농도-반응 곡선으로 계산할 수 있다.
용어 "IC50" (50% 저해 농도 또는 1/2-최대 저해 농도)은 생물학적 과정을 50%까지 저해하는데 필요한 약물 농도 및 저해제 부피를 의미한다. IC50 값은 곡선 피팅을 위한 특수 통계 소프트웨어를 사용해 적절한 용량-반응 곡선을 적용해 계산할 수 있다.
용어 GI50 (50% 성장 저해)은 종양 세포와 같은 세포의 증식을 50%까지 저해하는 약물의 농도를 의미한다.
용어 "ED50" (EC50) (50% 유효 용량/농도)은 50%의 (세포독성을 포함할 수 있는) 생물학적 효과를 발휘하는 약물의 농도를 지칭한다.
용어 "항-증식 활성"은 암 세포와 같은 세포의 성장 중단 또는 저해를 의미하는 것으로 의도된다.
용어 항체 "작동자 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 Fc-영역 서열 또는 Fc-영역 아미노산 변이체)으로부터 기인한 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 작동자 기능의 예로는 Clq 결합 및 보체 의존적인 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예, B 세포 수용체, BCR)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화 등이 있다.
"항체-의존적인 세포성 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포 (예, 자연 살상 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인지한 후 표적 세포의 세포용해 또는 식세포작용을 유발하는, 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 일차 세포, 즉 NK 세포는 FcγRIII만 발현하지만, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포의 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)의 464쪽 표 3에 요약 기술되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위해, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 사용가능한 작동자 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살상 (NK) 세포이다. 다른 예로 또는 부가적으로, 대상 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)에 기술된 바와 같이 동물 모델에서 분석할 수 있다.
"인간 작동자 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하며 작동자 기능을 수행하는, 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하며, ADCC 작동자 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 살상 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있으며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 작동자 세포는 이의 천연 소스로부터, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타내기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 인간 FcR 서열이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (수용체 γ)이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스를 포함하며, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 얼터너티브 슬라이싱된 형태 (alternatively spliced form) 등을 포함한다. FcγRII 수용체는, 주로 세포질 도메인에 차이가 있는 비슷한 아미노산 서열을 가진, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 저해 모티프 (ITIM)를 포함한다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR에 대한 리뷰는 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)에 제공된다. 향후 동정되는 FcR 등의, 기타 FcR도 본원에서 용어 "FcR" 범위에 포함된다. 이 용어는 또한 모계 IgG를 태아에 전달하는 역할을 하는 신생아 (neonatal) 수용체 FcRn을 포함한다.
"보체-의존적인 세포독성" 및 "CDC"는 분자가 보체의 존재시 표적을 세포용해시킬 수 있는 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예, 항체)에 결합함으로써, 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에 기술된 바와 같이, CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 전체 서열에 대해 최대 동일성%를 달성하기 위해 갭을 도입하고, 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 후, 후보 서열의 아미노산 잔기가 이와 비교되는 대응되는 서열의 잔기와 동일한 %를 의미하는 것으로 해석된다. N-말단 또는 C-말단 연장도 삽입도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되진 않을 것이다. 정렬 방법 및 컴퓨터 프로그램들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정할 수 있다 (예, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). 이 소프트웨어는 다양한 치환, 결손 (소거) 및 기타 변형에 대한 상동성 정도를 지정함으로써 유사한 서열들을 매칭시킨다.
항체의 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "상동성"은 항체가 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 이 용어는, 핵산 서열과 관련하여, 뉴클레오티드 서열이 핵산 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 97%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열에 변형(들)이 제공된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산에 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형으로는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결손, 및/또는 삽입, 및/또는 치환 등이 있다. 최종 구조체가 바람직한 특징을 가지는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 결손, 삽입 및 치환의 임의 조합이 행해진다. 또한, 아미노산 변형은 당화 부위의 개수 또는 위치의 변동 등의, 항체에서 번역 후 프로세스를 변경시킬 수 있다.
아미노산 치환을 이용한 항체의 아미노산 서열의 변형 변이체. 이러한 변이체는 항체 분자의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 치환한 것이다. 치환 돌연변이를 유발하기 위한 가장 주목할만한 부위로는 과가변부 또는 CDR 등이 있지만, FR 또는 Fc 변형 역시 고려된다. 보존적인 치환은 표 1의 "바람직한 치환"에 나타낸다. 이러한 치환으로 생물학적 활성에 변화가 생긴다면, 표 A에서 "치환 예"로 또는 아미노산의 클래스를 기술하는 경우에 더 상세하게 후술된 변이로 언급되는 추가적인 실질적인 변화가 만들어질 수 있으며, 또한 산물 스크리닝을 수행할 수 있다.
표 A
원 잔기 치환 예 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn(N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly(G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르루신 Leu
Leu (L) Nor루신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르루신 Leu
용어 "핵산", "뉴클레익 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 핵산의 단편 또는 영역을 결정하고, 비-천연 뉴클레오티드를 함유하거나 또는 비-함유하며, 이중 가닥 DNA 또는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 또는 이들 DNA의 전사 산물인, 변형된 또는 비-변형된 정확한 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명은 천연 염색체 환경, 즉 천연 상태의 뉴클레오티드 서열과 무관한 것으로 본원에 포함되어야 한다. 본 발명의 서열은 단리 및/또는 정제된 것이며, 즉, 예를 들어, 복사 (copy)에 의해 직접 또는 간접적으로 수집된 것이며, 이의 환경은 적어도 부분적으로 변형된다. 이에, 예를 들어, 숙주 세포의 재조합 유전학에 의해 수득되거나 또는 화학 합성에 의해 수득된 단리된 핵산 역시 본 발명에 언급되어야 한다.
뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 즉, 특정 서열을 가진 핵산은 이의 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해되어야 한다.
"조절 서열"이라는 표현은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현시키는데 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합부 등이 있다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치되었을 때, "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프리-서열 (pre-sequence) 또는 분비형 리더 서열의 DNA는, 폴리펩타이드 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면, 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서가 서열 전사에 영향을 미친다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합부가 번역을 용이하도록 배치된다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결된 DNA 서열들이 인접해 있으며, 분비형 리더의 경우에는 인접해 있으며 리딩 페이스 (in reading phase)인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서가 인접하게 위치되어야 하는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이며, 즉 부가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 조각이다. 일부 구현예에서, 벡터는 부가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율적인 복제 (autonomous replication)를 수행할 수 있다 (예, 박테리아의 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 추가적인 구현예들에서, 벡터 (예, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포 게놈에 병합될 수 있으며, 그래서 숙주 유전자와 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로서 언급된다.
본원에서, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 본 발명의 결합 분자의 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인의, 중쇄 또는 이의 항원-결합 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄-코딩 뉴클레오티드 서열 또는 이의 항원-결합 영역, 또는 이 둘다를 포함하는, 숙주 세포에 관한 것이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐 아니라 물론 이 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다. 변형이 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 연속 세대들에서 발생할 수 있으므로, 이들 자손은 실제 모 세포와 동일하지 않을 순 있지만, 이들 세포는 여전히 본 발명의 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 포함된다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 다른 임의의 성분을 표시하기 위해 사용된다.
용어 "CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애"는, 질환 또는 장애의 병인, 발병, 진행, 지속 또는 병리를 포함하여, CD20과 직접 또는 간접적으로 연관된, 모든 질환 또는 장애를 의미한다. "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 하나 이상의 이와 관련된 증상을 완화 또는 제거하는 방법을 의미한다. 본원에서, 질환, 장애 또는 병태를 "완화한다"는 것은 질환, 장애 또는 병태의 증상의 중증도 및/또는 발병 빈도의 감소를 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"는 것은 근치적 (curative), 고식적 (palliative) 및 예방적 치료를 포괄한다.
일 측면에서, 치료 대상 또는 환자는 포유류이며, 바람직하게는 인간 개체이다. 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
용어 "장애"는 본 발명의 화합물을 이용한 치료가 유익한 임의 병태를 의미한다. 이는 포유류가 대상 장애에 취약하게 만드는 병리학적 병태를 비롯해, 만성 및 급성 장애 또는 질환을 의미한다.
용어 "암" 및 "암성"은, 전형적으로 세포의 규제되지 않은 성장/증식을 특징으로 하는, 포유류에서 생리학적 병태를 나타내거나 또는 병리학적 병태를 기술한다. 이 정의는 양성 및 악성 암성 질환을 망라한다. 암성 질환에 대한 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있다. 이러한 암성 질환에 대한 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소-세포 폐암, 비-소 세포성 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 상피암 (squamous carcinoma), 복막암, 간세포성 암, 위장암 등의 위암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 대장암, 결장직장 암, 자궁내막암 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종 및 다양한 두경부암 등이 있다.
용어 "면역 반응", "자가면역 반응" 및 "자가면역 염증"은, 예를 들어, 림프구, 항원-제시 세포, 식세포, 과립구 및 이들 세포 또는 간 세포에 의해 생산되는 용해성 거대분자 (침습적인 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에는 인간 신체로부터 유래된 정상 세포 또는 조직의 선택적인 손상, 파괴 또는 소거의 결과로서 만들어지는 항체, 사이토카인 및 보체)의 작용을 의미한다.
용어 "면역 반응", "자가면역 반응" 및 "자가면역 염증"은, 예를 들어, 림프구, 항원-제시 세포, 식세포, 과립구 및 이들 세포나 간세포에 의해 생산되는 용해성 거대분자 (soluble macromolecule) (침습성 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암 세포 또는 자가면역 또는 병원성 염증의 경우에는 인체로부터 유래된 정상 세포 또는 조직의 선택적인 손상, 파괴 또는 소거의 결과로 생기는, 항체, 사이토카인 및 보체)의 작용을 지칭한다.
본원에서, 용어 "자가항체"는 자기-항원을 겨냥하는 항체를 지칭한다. 자기-항원으로는, 비-제한적으로, 핵산 (예, 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합), 핵 단백질 (예를 들어, SS-A (Ro), SS-B(La), Scl-70, 센트로미어, Jo-1, 히스타딜-tRNA 신테타제, 트레오닐-tRNA 신테타제, PM-1, Mi-2, 히스톤 및 크로마틴), 세포성 수용체 (예, 아세틸콜린 수용체, 갑상선-자극 호르몬 수용체), 세포 단백질 (예를 들어, 카르디올리핀, β2GPl), 세포막 단백질 (예를 들어, 아쿠아포린 (aquaporin), 데스모글레인 (desmoglein)), RNA 단백질 복합체 (예를 들어, RNP 및 Sm), 적혈구 및 혈소판 수용체 당단백질 등이 있다.
본원에서, 용어 "자가면역 질환"은 개체 자신 (자기) 항원 및/또는 조직으로부터 생기며 이를 겨냥하는 비-악성 질환 또는 장애를 지칭한다.
이 용어는, 비-제한적으로, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 화농성 관절염, 라임 골관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 루푸스, 크론질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, "이식 편대 숙주" 반응, 장기 이식 거부 반응, 장기 이식 관련 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 가와사키 질환, 그레이브스 질환, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노호-쉔라인 자반증, 현미경적 신장 혈관염 (microscopic renal vasculitis), 만성 활동성 간염, 포도막염 (uvenita), 패혈증 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅턴 무도명, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모, 원형 탈모증, 혈청반응음성의 관절병증 (seronegative arthropathy), 관절병증, 라이터 질환, 궤양성 대장염 관절병증과 관련된 건선성 관절병증 (psoriatic arthropathy associated with ulcerative colitis arthropathy), 아토피성 알레르기, 자가면역성 수포 질환 (autoimmune bullous disease), 심상성 천포창, 시트형 천포창 (sheet-like pemphigus), 유천포창 질환, 선상 IgA, IgG-관련 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 콤스-양성의 용혈성 빈혈 (Coombs-positive hemolytic anemia), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 소아 악성 빈혈, 두개 거대 동맥염 (cranial giant arteritis), 관절염, 원발성 경화성 A형 간염 (primary sclerosing hepatitis A), 원인불명의 자가면역 간염, 섬유증 폐 질환, 원인불명의 섬유증 폐포염, 염증후 간질성 폐 질환 (post-inflammatory interstitial lung disease), 간질성 폐렴, 만성 호산성 폐렴, 감염후 간질성 폐 질환 (post-infectious interstitial lung disease), 통풍성 관절염, 자가면역 간염, I형 자가면역 간염 (고전적인 자가면역 간염 또는 루포이드), II형 자가면역 간염, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 건선, 특발성 백혈구 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장 NOS-질환, 사구체신염, 현미경적 신장 혈관염 (microscopic renal vasculitis), 원판형 홍반성 루푸스, 특발성 또는 NOS-남성 불임 [정자에 대한 자가면역 (autoimmunity to sperm)], 다발성 경화증 (모든 서브타입), 교감성 안염 (sympathetic ophthalmia), 결합 조직 질환으로 인한 폐 고혈압 (pulmonary hypertension secondary to connective tissue disease), 굿파스처 증후군, 결절성 다발관절염의 폐 증상 (pulmonary manifestations of polyarthritis nodosa), 급성 류마티스성 열, 류마티스 척추염, 강직성 척추염, 스틸 질환, 전신성 경피증, 국소 경피증, 쇼그렌 증후군, 쇼그렌 질환, 베체트병, 강직성 척추염, 척추관절염, 축 부착부염 (axial enthesitis), 재방성 다발염골염, 타카야수 질환, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 위염, 다선성 자가면역 증후군, 갑상선 기능 항진증, 하시모토 질환, 자가면역 위축성 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염 (phacogenic uveitis), 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기, 천식, 정신 질환 (psychiatric disorder) (우울증 및 정신분열증 등), 타입 Th2/타입 Th1-매개 질환, 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알파-1-항트립신 결핍증 (deficiency of alpha-1-antitrypsin), 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 낭포성 섬유증, 사이토카인 테라피 관련 장애 (disorders associated with cytokine therapy), 탈수초 질환, 피부염, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈증-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스 관절염, 자가면역성 장병증, 자가면역성 난청 (autoimmune hearing loss), 자가면역성 림프증식성 증후군, 자가면역성 심근염, 자가면역 심근증, 콕삭키 심근염, 드레슬러 증후군, 루푸스 신염, 유전성 혈관부종을 비롯한 혈관부종, 두드러기, 화농성 한선염, 편평태선, 경화 태선, 태선모양 비강진 (pityriasis lichenoides), 백반증, 애디슨 질환, 자가면역 다분비성 증후군, 자가면역 췌장염, 셀리악 질환, 미세형 대장염, 항-인지질 증후군, 자가면역 림프증식성 증후군, 한랭응집소증, 본태성 저온글로불린혈증, 에반스 증후군, 악성 빈혈, 적혈구 무형성증 (red cell aplasia), CREST 증후군, 호산성 근막염, 펠티 증후군, 중복 증후군, 만성 라임병, 패리-롬버그 증후군, 재발성 류마티즘, 류머티즘, 급성 류마티스성 열, 후복막 증후군, 사르코이드증, 슈니츨러 증후군, 미분화된 결합 조직 질환, 피부근염, 다발성 근염, 섬유근육통, 중증 근무력증, 신경근긴장증, 급성 파종성 뇌척수염, 귈랑 바레 증후군, 데빅병, 하시모토 뇌병증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 다발성 맥관염을 수반한 호산성 육아종증, 백혈구파괴성 혈관염, 루푸스 혈관염, 류마티스성 혈관염, 결정성 다발 혈관염 (polyangitis nodosa), 자가면역 조기 난소 부전 및 안검염을 포괄한다. 또한, 항체는 상기한 장애들의 임의 조합을 치료할 수 있다.
"치료학적 유효량"은 치료 중인 장애의 한가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키는 투여 중인 치료학적 물질의 양을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "만성적인 (chronic)" 투여는, 장기간 동안 초기 치료학적 효과 (활성)를 유지하기 위해, 급성 (일시적) 투여 방식과 반대되는, 물질(들)의 연속적인 (지속적인) 사용을 의미한다.
"간헐적" 투여는 중단없이 계속적으로 수행되는 것이 아니라 사실상 주기적인 치료를 의미한다.
본원에서, 용어 "들을 포함한다", "들을 가진다, "들을 함유한다" 또는 "을 포함한다", "포함하는", "을 가진다", "가지는", "을 함유한다" 또는 "포함하여"와 같은 변형어, 그리고 이의 모든 문법상 변형어들은, 언급된 정수 (integer) 또는 정수군을 포함하는 의미로 이해될 뿐만 아니라, 임의의 다른 정수 또는 정수군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 대한 설명
항체
본 발명은 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 CD20에 특이적으로 결합하고 하기를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
1) 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인:
EVQLVQPGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSS (서열번호 2); 또는
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRATLTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSS (서열번호 6)
2) 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인:
QIVLSQSPAILSASPGERVTLTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFSLTISRVEPEDFAVYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIK (서열번호 4); 또는
QIVLSQSPATLSASPGERATMTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIK (서열번호 8).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
1) 하기 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변성 도메인:
EVQLVQPGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSS (서열번호 2);
2) 하기 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변성 도메인:
QIVLSQSPAILSASPGERVTLTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFSLTISRVEPEDFAVYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIK (서열번호 4).
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
1) 하기 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변성 도메인:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRATLTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSS (서열번호 6);
2) 하기 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변성 도메인:
QIVLSQSPATLSASPGERATMTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIK (서열번호 8).
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기를 포함한다:
1) 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄:
EVQLVQPGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 1) 또는
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRATLTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 5);
2) 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄:
QIVLSQSPAILSASPGERVTLTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFSLTISRVEPEDFAVYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 3) 또는
QIVLSQSPATLSASPGERATMTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 7).
일부 구현예에서, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 BCD132-077이다.
단일클론 항체 BCD132-077은 하기를 포함한다:
1) 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄:
EVQLVQPGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTMTRDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 1);
2) 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄:
QIVLSQSPAILSASPGERVTLTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFSLTISRVEPEDFAVYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 3).
일부 구현예에서, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 BCD132-L-028이다.
단일클론 항체 BCD132-L-028은 하기를 포함하다:
1) 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGRGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFKGRATLTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 5);
2) 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄:
QIVLSQSPATLSASPGERATMTCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQWTSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 7).
일부 구현예에서, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 전장 IgG 항체이다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소형 항체이다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 IgG1 이소형 항체이다.
핵산 분자
또한, 본 발명은, 선택적으로 서로 연결하는 임의의 펩타이드 링커 서열을 포함하는, 핵산 분자, 특히 본원에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 서열에 관한 것이다.
뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 따라서, 특이적인 서열을 가진 핵산은 이의 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해하여야 한다. 본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 염기 10개 이상의 길이의 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 임의 타입의 뉴클레오티드의 변형된 형태로 된 폴리머 형태를 의미한다. 이 용어는 이중 가닥 형태 및 단일 가닥 형태를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-8로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 핵산 분자는 상기한 뉴클레오티드 서열들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하며 하기를 포함하는, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다:
1) 서열번호 2 또는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
2) 서열번호 4 또는 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
1) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
2) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
1) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
2) 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
1) 서열번호 1 또는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
2) 서열번호 3 또는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
1) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
2) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
1) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
2) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
상기한 임의의 구현예에서, 핵산 분자는 단리될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 임의의 원료로부터 단리할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 단리되기 보다는 합성할 수 있다.
일 구현예에서, VH (서열번호 2 또는 서열번호 6) 또는 VL (서열번호 4 또는 서열번호 8) 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, VH가 벡터 내 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되거나 및/또는 VL이 벡터내 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결되도록, 중쇄 불변 (CH) 또는 경쇄 불변 (CL) 도메인을 각각 이미 코딩하고 있는 발현 벡터에 삽입함으로써, 전체 길이를 따라 항체 유전자들로 변환된다. 다른 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, CH 및/또는 CL 도메인을 코딩하는 핵산 분자에 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 표준 분자 생물 기법을 이용해 연결, 예를 들어 라이게이션함으로써, 항체의 전체 길이로 유전자들이 변환된다. 전체 길이로 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 이후 이것이 도입된 세포에서 발현될 수 있다.
이 핵산 분자를 이용해 CD20에 특이적으로 결합하는 재조합 단일클론 항체를 대량 발현시킬 수 있다.
벡터
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 적합한 벡터에 관한 것이다.
본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 일부의 임의 아미노산 서열 (예, 제1 결합 도메인의 중쇄 서열 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 서열)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가적으로 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는, 유전자들이 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열과 같은 필수 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록, 발현 벡터에서, 전술한 바와 같이 수득되는, 제1 또는 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스 (AAV), 식물 바이러스, 예를 들어 콜리플라워 모자익 바이러스, 토바코 모자익 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. DNA 분자는 벡터내 전사 및 번역 조절 서열이 DNA의 전사 및 번역을 조절하는 의도한 기능을 제공하도록, 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합하도록 선택될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA 서열이 각 벡터에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 DNA 분자들의 임의 조합이 동일한 발현 벡터에 도입된다. DNA 분자는 표준 방법 (예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한효소 부위의 라이게이션, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는다면 블런트 엔드 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 도입될 수 있다.
적절한 벡터는, 임의의 VH 또는 VL 서열이 전술한 바와 같이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 적절한 제한효소 부위 조작을 가진, 기능적으로 완전한 (complete) 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 이러한 벡터에서 HC- 및 LC-코딩 유전자는, 대응되는 mRNA를 안정화함으로써 항체 단백질의 전체 수율을 높이는, 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열의 측면에는, RNA 스플라이싱이 발생할 위치를 결정하는 스플라이스 도너 부위와 스플라이스 어셉터 부위가 배치된다. 인트론 서열의 위치는 항체 쇄의 가변부 또는 불변부 중 어느 하나이거나, 또는 복수의 인트론이 사용된 경우에는 가변부 및 불변부 양쪽일 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류 천연 염색체 부위에서 이루어질 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩한다. 항체 쇄 유전자는, 신호 펩타이드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인-프래임으로 연결되도록, 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종의 (heterologous) 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린 단백질 유래 신호 펩타이드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 쇄 유전자 외에도, 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 운반 (caryying)할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 조절 서열의 선택 등의 발현 벡터의 설계가 형질전환할 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 포유류에서 발현 숙주 세포에 대해 바람직한 조절 서열로는, 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예, 주요 후기 프로모터 아데노바이러스 (AdMLP)), 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서 및 천연 면역글로불린 프로모터 또는 액틴 프로모터와 같은 강한 포유류 프로모터 등의, 포유류 세포에서 단백질의 높은 수준의 발현을 보장하는 바이러스 인자 등이 있다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명은, 예를 들어 미국 특허 5,168,062, 4,510,245 및 4,968,615를 참조한다. 프로모터 및 벡터뿐 아니라 식물의 형질전환에 대한 설명을 포함하여, 식물에서 항체와 같은 결합 분자를 발현시키는 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,517,529를 참조한다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어 효모 세포에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 쇄 유전자 및 조절 서열 외에도, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 규제하는 서열 (예, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자 등의, 부가적인 서열을 함유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별할 수 있도록 해준다 (예, 미국 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제 물질에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선별가능한 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭에 dhfr-숙주 세포를 사용하는 경우), neo 유전자 (G418 선별하는 경우), 및 글루타메이트 신테타제 유전자 등이 있다.
본원에서, 용어 "발현 조절 서열"은 이것이 라이게이션된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 작용하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 발현 조절 서열로는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 등의 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA 안정화 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 적절한 경우, 단백질 분비를 강화하는 서열 등이 있다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다르며; 원핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 일반적으로 리보솜 결합부의 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하며; 진핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 전형적으로 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 구성 성분들을 적어도 포함하며, 존재할 경우 유익한 부가적인 구성성분, 예를 들어 리딩 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예는, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포를 생산하고, 이 숙주 세포를 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 발현/생산에 적합한 조건 하에 배양하고, CD20에 특이적으로 결합하는 수득된 단일클론 항체를 단리하는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포에서 이러한 발현에 의해 제조되는 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 본원에서 "CD20에 특이적으로 결합하는 재조합 단일클론 항체"로 언급된다. 본 발명은 또한 이러한 숙주 세포로부터 유래된 세포의 자손, 및 유사하게 제조된 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적절한 포유류 또는 이의 세포, 식물 또는 이의 세포, 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있다. 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 공지된 기법일 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 양이온성 폴리머-핵산 복합체 형질감염, 칼슘 포스페이트 침강, 폴리브렌-매개 형질감염, 프로토플라스트 융합, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 DNA의 핵내 직접 미세주입법 등이 있다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류에 도입될 수 있다. 세포의 형질감염 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다. 식물 세포의 형질전환 방법도 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환 (Agrobacterium-mediated transformation), 바이올리스틱 형질전환 (biolistic transformation), 직접 주입 (direct injection), 전기천공 (electroporation) 및 바이러스 형질전환 등이 있다. 박테리아 및 효모 세포의 형질전환 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
형질전환의 숙주로 사용되는 포유류 세포주는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이용가능한 복수의 불멸화 세포주들을 포함한다. 이러한 것으로는, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, FreeStyle 293 세포 (Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예, Hep G2), A549 세포, 및 복수의 기타 세포주 등이 있다. 발현 수준이 높고 생산되는 단백질의 필수 특징을 제공하는 세포주를 확인함으로써, 세포주를 선정한다. 사용될 수 있는 기타 세포주는 Sf9 또는 Sf21 세포 등의 곤충 세포주이다. CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 더 바람직하게는 숙주 세포를 배양한 배양 배지로의 항체의 방출을 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 제조한다. CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 배양 배지로부터 단리할 수 있다. 식물 숙주 세포로는, 예를 들어, 니코티아나 (Nicotiana), 아라비돕시스 (Arabidopsis), 개구리밥 (duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등이 있다. 박테리아 숙주 세포로는 E. coli 및 스트렙토마이세스 종 등이 있다. 효모 숙주 세포로는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등이 있다.
아울러, 생산 세포주로부터 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 생산 수준은 다수의 공지된 기법을 이용해 강화할 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건에서 발현을 강화하기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 EP 0216846, 0256055, 0323997 및 0338841과 연계하여 전체 또는 일부 논의되어 있다.
여러가지 세포주에 의해 또는 형질전환 동물에서 발현된 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 서로 다른 당화 프로파일을 가질 것임은 틀림없다. 그러나, 본원에 기술된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는, 결합 분자의 당화와 무관하게, 일반적으로 번역 후 수정 여부와 무관하게, 본 발명의 일부이다.
항체 제조
본 발명은 또한 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 및 공정에 관한 것이다.
단일클론 항체
단일클론 항체는 Kohler, et al. Nature 256,1975, p. 495에 최초로 언급된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나 또는 재조합 DNA 방법 (US 4816567)을 이용해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법의 경우, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위해, 전술한 방법에 따라 면역화한다. 다른 구현예에서, 림프구는 시험관내 면역화에 의해 구축할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 골수종 세포주와 적절한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용해 융합시켜, 하이브리도마 세포를 제조한다.
전술한 방식으로 생산된 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 비-융합된 모 골수종 세포의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는, 적절한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍되어 있다면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이토크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지), 즉 HGPRT-결핍 세포의 증식을 저해하는 물질을 함유할 것이다.
골수종 세포 융합의 구성 성분으로서 사용되는, 바람직한 골수종 세포는, 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 뒷받침하며, 비-융합된 모 세포를 선별하는 배지에 민감한 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 미국 캘리포니아 샌디에고 Salk Institite Cell Disrtibution Center에서 입수할 수 있는 뮤라인 종양 MORS-21 및 MPC-11, 그리고 미국 메릴랜드 록빌 American Type Culture Collection에서 입수할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8-653 등의 뮤라인 골수종 세포주이다. 단일클론 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주의 사용 역시 개시되어 있다 (Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, p. 3001).
바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 분석에 의해, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA) 또는 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정한다.
단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)에 기술된 스캐차드 분석 (Scatchard analysis)에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 가진 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정한 후, 제한 희석 공정을 이용해 클론을 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 배양할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어 마우스에 세포의 복막내 (i.p.) 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체내 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 방출되는 단일클론 항체는 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 통례적인 항체 정제 기법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예, 단백질 A- 또는 단백질 G-세파로스 이용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 하이드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 분리할 수 있다.
단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통례적인 공정 (예, 뮤라인 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용해 쉽게 단리 및 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 소스로서 사용된다. DNA는, 단리 후, 발현 벡터에 배치할 수 있으며, 이후 E. coli 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 형질감염되지 않은 항체 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 달성한다.
추가적인 구현예에서, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에 기술된 기법을 이용해 구축한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에는 파지 라이브러리를 이용해 뮤라인 및 인간 항체를 각각 단리하는 방법이 기술되어 있다. 후속 간행물들은 매우 거대한 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 체인 셔플링 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐 아니라 조합 감염 및 생체내 재조합 (combinatorial infection and in vivo recombination)에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조 방법을 개시하였다 (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). 즉, 이러한 기법들은 단일클론 항체를 단리하기 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어, 키메라 또는 융합 항체 폴리펩타이드를 제조하기 위해, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 (CH 및 CL) 불변부의 서열을 상동적인 뮤라인 서열로 치환함으로써 (US 4,816,567 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81: 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩타이드 (이종의 폴리펩타이드)의 코딩 서열 전체 또는 일부에 공유적으로 융합으로써, 변형할 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩타이드 서열로 항체의 불변부를 치환하거나, 또는 항체의 항원-결합 센터의 가변성 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 가진 항원-결합부와 다른 항원에 대한 특이성을 가진 다른 항원-결합부를 포함하는 키메라 2가 항체를 구축할 수 있다.
인간 항체 및 파지 디스플레이 라이브러리에 기반한 기법
현재, 면역화 후, 내인성 면역글로불린 생산 없이 전 범위 (full spectrum)의 인간 항체를 생산할 수 있는, 형질전환 동물 (예, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결손 (homozygous deletion)시, 내인성 항체 생산이 완전히 저해된다는 사실이 개시된 바 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에 전이하면, 항원 챌린지시 인간 항체가 만들어진다 (US 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852).
다른 예로, 면역화된 공여체 유래 면역글로불린 가변 (V) 영역 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 제조하기 위해, 파지 디스플레이 기법을 이용할 수 있다 (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)). 이 기법에 따라, 항체 V-영역 유전자를 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 외막 단백질 유전자와 인-프래임으로 클로닝하여, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 제시한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 1 카피를 포함하므로, 항체의 기능적 특성에 기반한 선택으로 상기한 특성을 가진 항체를 코딩하는 유전자를 선별한다. 즉, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 파지 디스플레이를 위해 여러가지 소스의 V-유전자 세그먼트를 사용할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)에서는, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V-유전자의 소규모 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 세트를 단리하였다. 다양한 항원 세트 (자기-항원 포함)에 대해 비-면역화된 인간 공여체 유래의 V 유전자 레퍼토리를 기본적으로 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기술된 기법에 따라 단리할 수 있다.
전술한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 구축할 수 있다 (US 5,567,610 및 US 5,229,275).
항체 단편
특정 경우에, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 추천된다. 더 작은 크기의 단편이 이를 신속하게 회수하여, 밀집 종양 (dense tumor)에 더 잘 침투시킬 수 있다.
항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기법들이 개발되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 분해 (proteolytic digestion)로부터 파생된다. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 수득할 수도 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 E. coli로부터 발현 및 분비시켜, 이들 단편의 다량 생산을 용이하게 할 수 있다. 항체 단편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 다른 구현예에서, Fab'-SH-단편을 E. coli에서 직접 단리하고, 화학적으로 커플링하여 F(ab')2-단편을 제조할 수 있다 (Carter et al, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2-단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 에피토프 결합성 수용체 잔기를 보유한 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2가 US 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 다른 구현예들에서, 선택 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185, US 5,571,894 및 US 5,587,458 참조). Fv 및 sFcv는 불변부가 결핍된 온전한 결합 부위를 가진 유일한 종이며; 그래서, 생체내 사용시 비-특이적인 결합을 줄이는데 적합하다. scFv 융합 단백질은 scFv의 N- 또는 C-말단에 작동자 단백질이 융합되게 설계될 수 있다. 또한, 항체 단편은, 예를 들어, US 5,641,870에 기술된 바와 같이 "선형 항체 (linear antibody)"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이성 또는 2중 특이성일 수 있다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 (또는 유일한 활성 성분으로서) CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
약학적 조성물은 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 하나 이상과, 약제학적으로 허용가능하고 약리학적으로 적합한 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성성분을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 하나 이상과, 대응되는 하나 이상의 표면 수용체 하나 이상을 표적화하는 하나 이상의 부가적인 결합 분자 (예, 항체)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 CD20과 관련될 수 있는 장애를 개선, 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
"약학적 조성물"은 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 및 충전제, 용매, 희석제, 담체, 보조제, 분배제, 전달제, 보존제, 안정화제, 유화제, 현탁화제, 증점제, 장기 전달 조절제와 같은, 약제학적으로 허용가능하며 약리학적으로 적절한 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들 물질의 선택과 비율은 투여 타입과 경로 및 투여량에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 의심의 여지없이 자명할 것이다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP (우수 의약품제조 관리 기준) 요건을 준수하여 제조되어야 한다. 조성물은 완충제 조성물, 긴장성 물질 (tonicity agent), 안정화제 및 용해제를 포함할 수 있다. 조성물의 장기 작용은 약학적 활성 성분의 흡수를 서행시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 달성될 수 있다. 적합한 담체, 용매, 희석제 및 전달제의 예로는 물, 에탄올, 폴리알코올 및 이들의 혼합물, 오일, 및 주사용 유기 에스테르 등이 있다.
"약제 (약물)"는, 인간 및 동물에서 생리학적 기능을 복구, 개선 또는 수정하고 질환을 치료 및 예방하고, 진단, 마취, 피임, 미용 (cosmetology) 및 기타 용도로 의도된, 정제, 캡슐제, 산제, 동결건조제, 주사제, 주입제, 연고 및 기타 레디 형태 (ready form)의 물질 또는 약학적 조성물로서 물질들의 혼합물이다. 당해 기술 분야에서 허용되는 펩타이드, 단백질 또는 항체를 투여하는 임의 방법이 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 적절하게 적용될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 포유류, 바람직하게는 인간에 투여하기 적합한 하나 이상의 혼용가능한 (compatible) 액체 또는 고체 성분을 지칭한다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 전술한 성분 이외의 임의 성분을 나타내기 위해 사용된다. 이러한 성분은 약물 제품에 필요한 물리화학적 특성을 부여하기 위해 약제 제조에 사용되는 무기 또는 유기 성질의 물질이다.
용어 "완충제", "완충제 조성물", "완충화제 (buffering agent)"는 산-염기 공액 구성성분들의 작용에 의해 pH 변화를 견딜 수 있으며, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 약물이 pH 변화를 견딜 수 있게 하는, 용액을 지칭한다. 일반적으로, 약학적 조성물은 바람직하게는 4.0 내지 8.0 범위의 pH를 가진다. 사용되는 완충제의 예로는, 비-제한적으로, 아세테이트, 포스페이트, 사이트레이트, 히스티딘, 숙시네이트 등이 있다. 완충제 용액.
본원에서, 용어 "긴장성 물질", "삼투용질 (osmolyte)" 또는 "삼투압제 (osmotic agent)"는 액체 항체 제형의 삼투압을 높일 수 있는 부형제를 지칭한다. "등장성" 약물은 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가진 약물이다. 등장성 약물은 전형적으로 약 250 내지 350 mOsm/kg의 삼투압을 가진다. 사용되는 등장제 (isotonic agent)로는, 비-제한적으로, 폴리올, 사카라이드 및 슈크로스, 아미노산, 금속염, 예를 들어, 소듐 클로라이드 등이 있다.
"안정화제"는 활성 물질의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 제공하는 부형제 또는 2 이상의 부형제들의 혼합물을 의미한다. 안정화제로는, 아미노산, 비-제한적인 예로, 아르기닌, 히스티딘, 글리신, 라이신, 글루타민, 프롤린; 계면활성제, 비-제한적인 예로, 폴리소르베이트 20 (상품명 Tween 20), 폴리소르베이트 80 (상품명 Tween 80), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 및 이의 코폴리머 (상품명 Poloxamer), Pluronic, 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 항산화제, 비-제한적인 예로, 메티오닌, 아세틸시스테인, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, 아황산 염 등; 킬레이트제, 비-제한적인 예로, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 소듐 사이트레이트 등이 있다.
약학적 조성물은, 활성 물질이 보관 온도, 예를 들어 2-8℃의 보관 온도에서 지정된 유통 기한 (shelf life) 동안 물리적인 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지한다면, "안정적"이다. 바람직하게는, 활성 물질은 물리적 및 화학적 안정성뿐 아니라 생물학적 활성을 유지한다. 보관 기간은 가속 또는 자연 노화 조건에서의 안정성 검사 결과를 토대로 조율된다.
본 발명의 약학적 조성물은 레디 제형 (ready formulation) 형태의 단일 단위 용량 (single unit dose) 또는 복수개의 단일 단위 용량들로 제조, 포장 또는 널리 시판될 수 있다. 본원에서, 용어 "단일 단위 용량"은 활성 물질을 미리 정해진 양으로 포함하는 개별 약학적 조성물의 양을 의미한다. 활성 물질의 양은 일반적으로 환자에게 투여할 활성 물질의 투여량 또는 투여량의 편리한 일부 (convenient part), 예를 들어 그 투여량의 절반 또는 1/3과 같다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 전형적으로, 주사, 주입 및 이식 (implantation)에 의해 위장관을 우회하여, 피부 또는 점막 장벽에서의 브리치 (breach)를 통해 인체에 투여하기 위한 것으로 의도된 무균성 (sterile) 제형으로서 비경구 투여에 적합하다. 예를 들어, 비경구 투여로는, 특히 피하, 복막내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 뇌실내, 요도내, 두개강내, 활액내, 경피 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기법 등이 있다. 종양내 전달, 예를 들어 종양내 주사도 이용할 수 있다. 또한, 국소 관류 (regional perfusion)도 제공된다. 바람직한 구현예는 정맥내 경로 및 피하 경로를 포함한다. 당해 기술 분야에서 허용되는, 펩타이드 또는 단백질의 임의 투여 방법은, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 적절히 적용될 수 있다.
주사가능한 제형은, 비-제한적으로, 예를 들어, 앰플, 바이얼, 플라스틱 용기, 사전 충전된 주사기, 자동주사 기구내 단위 투약 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 특히 현탁제, 용액제, 오일성 또는 수성 베이스 중의 에멀젼, 파스타제 (pastes) 등을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 투여하기 전에 적절한 베이스 (예, 무균성 발열원 제거 수)를 사용해 재구성하기 위한 건조된 형태 (즉, 분말 또는 과립)로 제공되는 약학적 조성물을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 이러한 제형은, 예를 들어, 냉동 건조로서 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 산물을 냉동시킨 다음 냉동된 물질로부터 용매를 제거하는 것을 수반하는, 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 또한 적절한 추진제가 사용되거나 또는 사용되지 않는, 가압 에어로졸 용기 (aerosol pressurized container), 펌프, 스프레이, 분무기 (atomizer) 또는 네블라이저와 같은 흡입기로부터 단독으로 또는 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로서 흡입에 의해 또는 비강내로, 또는 점비제로서 또는 스프레이제로서 투여할 수 있다.
비경구 투여를 위한 투여 형태는 즉시 방출형으로 및/또는 변형된 방출형으로 제형화될 수 있다. 변형된 방출형 제형은 지연성, 지속성, 펄스형, 조절된, 표적화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 치료학적 용도
일 측면에서, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 CD20 활성 (에 의해 매개되는)과 관련된 장애를 치료하는데 유용하다.
일 측면에서, 개체는 포유류, 바람직하게는 인간 개체이다. 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
종양 (예, 암)의 경우에, 항체 또는 이의 단편 (예, CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편)의 치료학적 유효량은 암 세포의 개수를 감소시키거나; 처음 종양 크기를 줄이거나; 암 세포의 말초 장기로의 침윤을 저해 (즉, 어느 정도 서행, 바람직하게는 정지)하거나; 종양 전이를 저해 (즉, 어느 정도 서행, 바람직하게는 정지)하거나; 종양 증식을 어느 정도 저해하거나; 및/또는 장애와 관련있는 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화할 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 암 세포의 성장을 어느 정도 방지할 수 있거나, 및/또는 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있으며, 이는 세포분열억제 (cytostatic) 및/또는 세포독성을 나타낼 수 있다. 암 요법의 경우, 생체내 효과는, 예를 들어, 종양 진행 시간 (TTP), 치료에 대한 종양 반응률 (RR), 수명 기간 및/또는 질을 평가함으로써 측정할 수 있다.
본원에서, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 하나 이상의 다른 치료학적 물질과 관련하여 용어 "공동-투여 (co-administration)", "공동-투여된다" 및 "와 조합하여 (in combination with)"는,
1) 환자에게 구성 성분들을 실질적으로 동시에 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 제형화되는, 본 발명의 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체와 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시 투여하는 방식,
2) 구성 성분들이 서로 다른 투약 형태로 분리되어 제형화되고, 환자에게 실질적으로 동시에 섭취되어 이들 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 동시에 방출되는 경우에, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시에 투여하는 방식,
3) 구성 성분들이 별개의 투약 형태로 서로 분리되어 제형화되고, 투약 형태들이 충분한 투여 간격으로 환자에게 연속적인 횟수로 섭취되어, 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 다른 시기에 방출되는, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식; 및
4) 환자에게 동시에, 연속적으로 또는 동일 시점에 및/또는 서로 다른 시점에 합동적으로 (jointly) 방출되는 조절된 방식으로 구성 성분들을 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 함께 제형화되고, 각각의 부분이 동일 경로에 의해 또는 서로 다른 경로에 의해 투여될 수 있는, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식을 의미, 언급 또는 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 추가적인 치료학적 처치없이, 즉 독립적인 테라피 (independent therapy)로서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 의한 치료는 하나 이상의 부가적인 치료학적 처치를 포함할 수 있다 (병용 요법). 일부 구현예에서, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 다른 약물/제제와 합동적인 방식으로 투여하거나 또는 이와 함께 제형화할 수 있다.
본원에서, 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방지하거나 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제 및 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 식물 기원의 효소학적 활성 독소와 같은 독소를 이의 단편 및/또는 변이체를 비롯하여 포함하는 것으로 의도된다.
"화학치료제"는 암 치료에 이용가능한 화학적 화합물이다. 화학치료제에 대한 예로는 알킬화제, 예로 티오테파 (thiotepa) 및 사이클로스포스파미드 (CYTOXAN®); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan) 아지리딘 (aziridine), 예를 들어 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파 (meturedopa), 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (methylamelamine), 예로 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민 (trimethylolomelamine); 아세토게닌 (acetogenin) (예를 들어, 불라탁신 (bullatacin) 및 불라탁시논 (bullatacinone)); δ-9-테트라하이드로카나비놀 (드로나비놀 MARINOL®); β-라파콘 (lapachone); 라파콜 (lapachol); 콜히친; 베툴린산 (betulinic acid); 캄프토테신 (camptothecin) (예, 합성 유사체 토포테칸 (topotecan) (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸 (irinotecan), CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 (scopolectin) 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴 (bryostatin); 칼리스타틴 (callystatin); CC-1065 (이의 아도젤레신 (adozelesin), 카르젤레신 (carzelesin) 및 바이젤레신 (bizelesin) 합성 유사체 포함); 포도필로톡신 (podophyllotoxin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 테니포시드 (teniposide); 크립토피신 (cryptophycin) (예를 들어, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴 (dolastatin); 두오카르마이신 (duocarmycin) (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘루테로빈 (eleutherobin); 판크라티스타틴 (pancratistatin); 사르코딕틴 (sarcodictyin); 스폰기스타틴 (spongistatin); 니트로겐 머스타드, 예로 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 모벰비신 (novembichin), 펜에스테린 (phenesterine), 프레드무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴 (carmustine), 클로로조톡신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine) 및 라님누스틴 (ranimnustine); 항생제, 예를 들어 엔다이인 항생제 (enediyne antibiotic) (예, 칼리케아미신 (calicheamicin), 예를 들어, 칼리케아미신 gamma II 및 칼리케아미신 omega II (예, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)를 참조함); 디네미신 (dynemicin), 예를 들어 디네미신 (dynemicin) A; 에스페라미신 (esperamicin) 및 네오카르지노스타틴 크로모포어 (neocarzinostatin chromophore) 및 관련된 크로모프로테인 엔다이인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신 (aclacinomysin), 액티노마이신 (actinomycin), 오트라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 카라비신 (carabicin), 카르미노마이신 (carminomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-다이아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신 (예로, ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사제 (DOXOL®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (MYOCET®), 페길화된 리포솜 독소루비신 (CAELYX®) 및 데옥시독소루비신), 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), ??라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토족신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin) 항-대사산물제, 예를 들어 메토트렉세이트 (methotrexate), 겜시타빈 (gemcitabine) (GEMZAR®), 테가푸르 (tegafur) (UFTORAL®), 카페시타빈 (capecitabine) (XELODA®), 에포틸론 (epothilone) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈 (fludarabine), 6-머캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘, 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록스우리딘 (floxuridine); 항-아드레날린제, 예를 들어 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트릴로스탄 (trilostane); 엽산 보충제 (folic acid replenisher), 예를 들어 프롤린산 (frolinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드글리코시드 (aldophosphamideglycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 에닐우라실 (eniluracil); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비스안트렌 (bisantrene); 에다트렉세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 다이아지쿠온 (diaziquone); 엘포르니틴 (elfornithine); 엘립티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다이닌 (lonidainine); 메이탄시노이드 (maytansinoid), 예를 들어 메이탄신 (maytansine) 및 안사미톡신 (ansamitocin); 미토구아존 (mitoguazone); 미톡산트론 (mitoxantrone); 모피단몰 (mopidanmol); 니트라에린 (nitraerine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 로속산트론 (losoxantrone); 2-에틸하이드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카바진 (procarbazine); PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural product, Eugene, OR); 라족산 (razoxane); 리족신 (rhizoxin); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (trichothecene) (예, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘 (anguidine)); 우레탄; 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드 (taxoid), 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (ABRAXANETM) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®); 클로람부실 (chlorambucil); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트 (methotrexate); 플라티늄 제제, 예를 들어, 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin); 미소관 형성으로부터 튜불린 중합을 방해하는 빈카 (vincas), 예를 들어, 빈블라스틴 (vinblastine) (VELBAN®), 빈크리스틴 (vincristine)(ONCOVIN®),빈데신 (vindesine) (ELDISINE®), FILDESIN®), 및 비노렐빈 (vinorelbine) (NAVELBINE®); 에토포시드 (etoposide) (VP16); 이포스파미드; 미톡산트론 (mitoxantrone); 루코보린 (leucovorin); 노반트론 (novantrone); 에다트렉세이트 (edatrexate); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 이반드로네이트 (ibandronate); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노익산, 예로 벡사로텐 (bexarotene) (TARGRETIN®); 비스포스포네이트, 예로 클로드로네이트 (clodronate) (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (etidronate) (DIDROCAL®), NE- 58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (zoledronate) (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (alendronate) (FOSAMAJX®), 파미드로네이트 (pamidronate)(AREDIA®), 틸루드로네이트 (tiludronate) (SKELID®) 또는 리세드로네이트 (risedronate) (ACTONEL®); 트록사시타빈 (1,3-다이옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것, 예를 들어, PKC-alpha, Raf, H-Ras, 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 저해제 (예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH (예를 들어, ABARELIX®); BAY439006 (소라페닙 (sorafenib) Bayer); SU-11248 (Pfizer); 페리포신 (perifosine), COX-2 저해제 (예를 들어, 셀레콕십 (celecoxib) 또는 에토리콕십 (etoricoxib)), 프로테오좀 저해제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (bortezomib) (VELCADE®); CCI-779; 티피파르닙 (tipifarnib) (Rl 1577); 오라페닙 (orafenib), ABT510; Bcl-2저해제, 예를 들어, 오블리메르센 소듐 (oblimersen sodium) (GENASENSE®); 피산트론 (pixantrone); EGFR 저해제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 저해제 (하기 정의 참조); 및 전술한 임의의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체, 아울러 상기한 물질들의 2 이상의 조합, 예를 들어 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 조합 요법의 약칭인 CHOP, 및 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)을 5-FU 및 루코보빈과 조합하여 치료 요법의 약칭인 FOLFOX를 포함한다.
또한, 이 정의에는, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 저해하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들어, 혼합형 작용제/길합제 프로파일을 가진 항-에스테로겐, 예컨대, 타목시펜 (tamoxifen) (NOLVADEX®), 4-하이드록시타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene) (FARESTON®), 이독시펜 (idoxifene), 드롤록시펜, 랄록시펜 (raloxifene) (EVTSTA®), 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), 및 선택적인 에스트로겐 수용체 모듈레이터 (SERM), 예를 들어 SERM3; 작용제 특성이 없는 순수한 항-에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (fulvestrant) (FASLODEX®), 및 EM800 (이러한 제제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량화를 차단하고, DNA 결합을 저해하며, ER 반감기를 연장하고 및/또는 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 저해제, 예로, 스테로이드계 아로마타제 저해제, 예컨대 포르메스탄 (formestane) 및 엑세메스탄 (exemestane) (AROMASIN®), 및 비스테로이드계 아로마타제 저해제, 예를 들어 아나스트라졸 (anastrazole) (AREVIIDEX®), 레트로졸 (letrozole) (FEMARA®) 및 아미노글루테티미드, 및 기타 아로마타제 저해제, 예로, 보로졸 (vorozole) (RIVISOR®), 메게스트롤 (megestrol) 아세테이트 (MEGASE®), 파드로졸 (fadrozole), 이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 작용제, 예로, 루프롤라이드 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 (goserelin), 부세렐린 (buserelin) 및 트리프테렐린 (tripterelin); 성 스테로이드, 예를 들어, 프로게스틴 (progestine), 예컨대 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate) 및 메드록시프로게스테론 아세테이트 (medroxyprogesterone acetate), 에스트로겐, 예를 들어, 다이에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol) 및 프레마린 (premarin), 및 안드로겐/레티노이드, 예를 들어 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 모든 트란스레티온 산 (transretionic acid) 및 펜레티니드 (fenretinide); 오나프리스톤 (onapristone); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절인자 (ERD); 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드 테스토락톤 및 전술한 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체 및 전술한 물질 2종 이상의 조합도 포함된다.
이러한 자가면역 질환 또는 관련 자가면역 병태의 치료에서, 본원에 제공되는 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는, 면역억제제, 항-염증제, 전신 호르몬 약물, 항-신생물제 및 면역조적 약물 또는 기타 등의 여러가지 치료학적 물질과 조합하여, 다약제 용법을 이용해 환자에 투여할 수 있다. CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 여러가지 치료학적 물질과 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여할 수 있거나, 또는 다른 테라피에 대한 내성 발현 후 투여할 수 있다. 당해 기술 분야에서 사용되는 투여량과 비교해 더 적거나 또는 동일한 투여량으로 여러가지 치료학적 물질을 투여할 수 있다. 바람직한 여러가지 면역억제제를 선정할 때, 치료할 질환의 타입과 환자의 병력 등의 다수 인자들을 고려하여야 한다.
본원에서, 부가적인 테라피 (add-on therapy)에 사용되는 용어 "면역억제제"는 환자의 면역 시스템을 억제 또는 은폐하도록 지정된 물질을 지칭한다. 이들 물질은, 사이토카인 생산을 저해하거나, 자기-항원 발현을 하향-조절 또는 억제하거나 또는 주 조직적합성 복합체 (MHC) 항원을 은폐하는 물질일 수 있다. 이러한 물질의 예로는 스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코이드, 예를 들어 프레드니손 (prednisone), 메틸프레드니솔론 (prednisolone) 및 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (US 4665077 참조), 아자티오프린 (azathioprine) (또는 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 아자티오프린에 대한 유해 반응시); 브로모크립틴 (bromocryptine); 글루타르알데하이드 (US 4120649에 기술된 바와 같이 MHC 항원 은폐); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 (anti-idiotypic) 항체; 사이클로스포린 (cyclosporine) A; 사이토카인 및 사이토카인 수용체 길항제, 예로 인터페론-γ, β 또는 α 항체; 항-종양 괴사 인자 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체, 이종의 항-림프구 글로불린 (heterologous anti-lymphocyte globulin), pan-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유한 용해성 펩타이드 (WO 90/08187, 1990년 6월 26일 공개; TGF-p; 스트렙토도마제 (streptodomase); 숙주 DNA/RNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린 (deoxyspergualin); 라파마이신 (rapamycin); T 세포 수용체 (US 5114721); T 세포 수용체 단편 (Offner et al, Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; 및 WO 91/01133); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340109), 예 T10B9 등이 있다.
류마티스 관절염 치료에서, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 단독으로 또는 다음과 같은 약물 중 하나 이상과 조합하여 환자에게 투여할 수 있다: DMARD (염기성 항염증제 (예, 메토트렉세이트, 레플루노미드 (leflunomide), 설파살라진 (sulfasalazine)), NSAID (비스테로이드계 항-염증제, 예를 들어, 사이클로옥시게나제 저해제s), 코르티코스테로이드 (예, 프레드니솔론 (prednisolone), 부데소니드 (budesonide)). RA를 치료하는데 사용되는 전형적인 DMARD는 하이드록시클로로퀸, 설파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 아자티오프린, D-페니실라민, 금-기반의 제제 (경구), 금-기반의 제제 (근육내), 미노사이클린, 사이클로스포린, 단백질 A 면역흡착에 의해 수득되는 스타필로코칼 (Staphylococcal)이다. 통상적인 RA 치료 방법은, 예를 들어 J. A. Singh et al., 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care Res (Hoboken) 68, 1-25 (2016)에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 전술한 치료 방법에 사용할 수 있거나, 전술한 치료에 사용할 수 있거나, 및/또는 전술한 치료용 약제의 제조에 사용할 수 있는 것을 의미한다.
투여량 및 투여 경로
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 대상 병태를 치료하는데 효과적인 양으로, 즉 바람직한 결과를 달성하는데 필요한 용량 및 시간 동안 투여될 것이다. 치료학적 유효량은 치료 중인 구체적인 병태, 환자의 나이, 성별 및 체중뿐 아니라 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 약물 치료와 조합하여 투여되는 지의 여부와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다.
투약 용법은 최적의 바람직한 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여하거나, 분할된 수회의 용량을 일정 기간 동안 투여하거나, 또는 용량을 치료학적 상황의 긴급성에 의해 지정되는 바와 같이 비례적으로 줄이거나 높일 수 있다. 투여 용이성 및 용량 단일성을 위해 단위 투약 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 단위 투약 형태는 치료할 환자/개체에게 단일한 용량 (unitary dosages)으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하는 것으로 의도되며; 각 단위는 바람직한 약제학적 담체와 조합하여 바람직한 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 기-결정된 함량으로 활성 화합물을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 단위 투약 형태에 대한 사양 (specification)은, (a) 화학요법제의 고유한 특징 및 달성할 구체적인 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체에서 민감도 치료를 위한 활성 화합물의 컴파운딩 기술 분야에서 고유한 한계에 의해 기술되며, 이에 의해 직접 결정된다.
따라서, 당해 기술 분야의 당업자는, 본원에 제공된 내용을 기초로, 용량 및 투여 용법이 치료 분야에서 잘 공지된 방법에 따라 조정됨을 알 것이다. 즉, 최대 허용량은 쉽게 확립할 수 있으며, 환자에게 검출가능한 치료학적 이점을 제공하는 유효량 역시 환자에게 검출가능한 치료학적 효과를 제공하기 위해 각 물질을 투여하는 시간적 요건처럼 결정할 수 있다. 따라서, 일부 용량 및 투여 용법이 본원에 예시되지만, 이들 예는 본 발명의 구현예 수행시 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 용법을 어떠한 방식으로도 제한하는 것은 아니다.
용량 값은 완화할 병태의 유형과 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 1회 투여 또는 다중 투여를 포함할 수 있음에 유념하여야 한다. 또한, 임의 특정 환자의 경우, 구체적인 투여 용법은 개체 필요성에 따라, 그리고 조성물의 투여를 수행 또는 감독하는 의료 전문가의 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 기술된 용량 범위는 단순 예이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용한 투여 용법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적인 상태, 병태의 중증도, 투여 경로 및 사용되는 구체적인 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 등의, 여러가지 인자들에 기초할 수 있다. 즉, 투여 용법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 표준 방법을 이용해 일상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 또는 실험 값과 같은 임상적인 효과를 포함할 수 있는 약동학 및 약력학 파라미터를 기반으로 조정될 수 있다. 이에, 본 발명은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정되는 환자별 용량-증가 (dose-escalation)를 포함한다. 적정 용량 및 용법을 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 아이디어가 제공된다면 당해 기술 분야의 당업자라면 이해할 것이다.
적합한 투여 방법의 예는 상기에 제공된다.
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 적정 용량은 0.1-200 mg/kg, 바람직하게는 0.1-100 mg/kg, 예로, 약 0.5-50 mg/kg, 예를 들어, 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 간주된다. CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는, 예를 들어, 적어도 0.25 mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/kg, 예로, 적어도 1 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 2 mg/kg, 예를 들어, 적어도 3 mg/kg, 예로, 적어도 4 mg/kg, 예를 들어 적어도 5 mg/kg; 예를 들어, 최대 50 mg/kg, 예로, 최대 30 mg/kg, 예를 들어, 20 mg/kg, 예로, 최대 15 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있다. 투여는 전형적으로 적절한 시간 간격으로, 예를 들어 주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회 또는 4주당 1회로, 그리고 주치의가 적절하다고 생각하는 동안 반복될 것이며, 일부 경우에 필요에 따라 용량을 늘리거나 또는 줄일 수 있다.
진단학적 용도 및 조성물
본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 또한 진단 프로세스 (예, 시험관내, 생체외)에 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 환자로부터 수득한 샘플 (예, 염증성 삼출액, 혈액, 혈청, 장액, 타액 또는 뇨와 같은 조직 샘플 또는 체액 샘플)에서 CD20의 농도를 검출 또는 측정하기 위해 이용할 수 있다. 적합한 검출 및 측정 방법으로는 유세포 측정, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 화학발광 분석, 방사성 면역분석 및 면역조직학과 같은 면역분석 등이 있다. 본 발명은 본원에 기술된 CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 키트, 예를 들어 진단 키트를 더 포함한다.
아래 실시예들은 본 발명은 본 발명을 다 잘 이해하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예를 들어 일부 상세하게 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 교시 내용에 비추어, 첨부된 구현예의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 일부 변화 및 수정이 행해질 수 있음은 매우 자명할 것이다.
실시예
아래 실시예들은 본 발명은 본 발명을 다 잘 이해하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예를 들어 일부 상세하게 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 교시 내용에 비추어, 첨부된 구현예의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 일부 변화 및 수정이 행해질 수 있음은 매우 자명할 것이다.
재료 및 일반적인 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반전인 정보는 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 제공된다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 번호가 지정되며, 참조된다 (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991).
재조합 DNA 기법
Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기술된 바와 같이 표준 방법을 이용해 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지침에 따라 사용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 세그먼트를 화학 합성에 의해 제조한 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단일 제한효소 부위가 측면에 위치한 300-4000 kb 길이의 유전자 세그먼트를 PCR 증폭 등의 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션에 의해 조립한 다음 지정된 제한효소 부위를 통해 클로닝하였다. 서브클로닝한 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
DNA 서열 결정
DNA 서열을 생거 서열분석에 의해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
Infomax's Vector NT1 Advance suite version 8.0을 서열 구축, 맵핑, 분석, 주석 (annotation) 및 예시에 사용하였다.
발현 벡터
언급된 항체 및 항원을 발현시키기 위해, 원핵생물 세포 (E. coli)에서의 발현, 진핵생물 세포 (예, CHO 세포)에서의 일시적인 발현을 위해 의도된 발현 플라스미드 변이체를 이용하였다. 벡터에는, 항체 발현 카세트 외에도, E. coli에서 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 오리진, E. coli에 다양한 항생제 (예, 암피실린 및 카나마이신)에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다.
후술한 바와 같이 언급된 항체 쇄를 포함하는 융합 유전자를 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 제작하고, 핵산 세그먼트를, 예를 들어, 해당 벡터내 고유한 제한효소 부위를 이용해 연결함으로써 공지된 재조합 방법 및 기법으로 조립하였다. 서브클로닝한 핵산 서열을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다. 일시적인 형질감염을 위해, 다량의 플라스미드를 E. coli 형질전환된 배양물로부터 플라스미드 제조에 의해 입수하였다.
실시예 1. 포유류 세포의 현탁 배양으로 재조합 대조군 항체의 생산
서열이 공개된 항체인 리툭시맵을 대조군으로 사용하였다. 항체의 중쇄/경쇄 가변성 도메인의 유전자를 합성하여, 포유류 세포에서 단백질을 생산하도록 설계된 벡터 pEE-HC, pEE-CK의 SalI/NheI 및 SalI/BstWI 제한효소 부위에 각각 클로닝하였다 (도 1, 2).
E. coli 세포에서 플라스미드를 필요한 양으로 배양하고, Qiagen 키트를 사용해 정제하였다.
대조군 항체는 중국 햄스터 난소 세포로부터 수득한 확립된 세포주 (CHO-T 세포주)에서 생산하였다. 오르비탈 배양기 셰이커 위에서 플라스크 안에서 8 mM L-글루타민 및 1 g/l pluronic 68이 첨가된 무혈청성 배지 (HyCell TransFx-C)를 사용해 현탁 배양을 수행하였다. 일시적으로 발현시키기 위해, 선형 폴리에틸렌이민 (PEI MAX, Polysciences)을 사용해 세포 (2-2,2x106 주/ml)를 형질감염시켰다. DNA/PEI 비율은 1:3-1:10이었다. 형질감염 후 9일차에, 배양액을 0.5/0.22 ㎛ 딥-베드 필터를 통해 여과하여 세포로부터 배양액을 분리하였다. 박테리아 단백질인 단백질 A가 함유된 친화성 HPLC에 의해 배양액으로부터 표적 단백질을 단리하였다.
수득한 단백질 용액의 순도는 비-환원성 SDS 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
실시예 2. 나이브 인간 항체 FAB-라이브러리 MeganLibTM 구축
인간 공여자 1000명 이상으로부터 채집한 혈액 샘플로부터 수득한 B-림프구의 총 RNA를 RNeasy Mini Kit를 사용해 제안된 프로토콜에 따라 단리하였다 (QIAGEN). RNA 농도 분석은 Nanovue 키트 (GE Healthcare)를 사용해 수행하였으며, 단리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스 겔 전기영동에 의해 검사하였다.
MMuLV 역전사효소와 프라이머로서 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오티드를 사용해, MMLV RT 키트 (Evrogen)에 의해, 권고된 프로토콜에 따라, 역 전사 반응을 수행하였다.
역 전사 산물을 2-단계 중합효소 연쇄 반응의 매트릭스로서 사용해 제한효소 부위들이 측면에 위치한 가변성 도메인 유전자를 제조하였으며, 반응은 문헌 [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30]의 프로토콜에 따라 올리고뉴클레오티드 키트를 사용해 수행하였다.
제조된 DNA 조제물 VL-CK-VH (도 3)에 엔도뉴클레아제 제한효소 NheI/Eco91I을 처리하고, 이를 오리지날 파지미드 pH5에 라이게이션하였다 (도 5). 프로토콜 [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]에 따라 준비한 일렉트로컴피턴트 (electrocompetent) SS320 세포에 라이게이션 산물을 형질전환하였다. 조합 파지 Fab 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM의 레퍼토리는 형질전환체 1011종이었다. Fab 라이브러리 파지 산물은 기존 공정 [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]에 따라 제조하였다.
실시예 3. 파지 디스플레이에 의한 FAB-라이브러리 선별
특이적인 항-CD20 인간 파지 Fab 항체를 조합 파지 Fab 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM로부터 입수하였다. 인간 CD20을 발현하는 진핵생물 세포에서 파지 디스플레이에 의해 [Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3): 581-97], 자기 비드 및 KingFisher Flex 디바이스를 사용해, 바이오패닝을 수행하였는데, 그 이유는 이 기술이 최대 96종의 바이오패닝 계획 및 변형을 동시에 수행할 수 있기 때문이다.
바이오패닝 중에, 바이오틴화된 진핵생물 세포를 회전장치 (rotator) 위에서 30분간 비드와 인큐베이션하여 스트렙타비딘 자기 비드의 표면에 고정시켰다. 그런 후, 비드를 PBS (pH 7.4)로 헹구고, 2% 탈지유/PBS (pH 7.4) 용액으로 1시간 동안 비드를 차단 처리하였다. 이후, 2% 탈지유가 첨가된 PBS (pH 7.4)에서 항원-음성 세포와 예비 인큐베이션한 파지 용액을 세포가 결합된 자기 비드에 첨가하였다. 이 혼합물을 교반하면서 40분간 인큐베이션하였다. 자기 비드를 0.1% Tween-20이 첨가된 PBS (pH 7.4) 용액으로 세척하는 사이클을 수회 실시하여 결합되지 않은 파지를 제거하였다. 세척 사이클의 횟수를 회차에 따라 증가시켰다 (1차 라운드에서는 세척 사이클 10회, 2차 및 3차 라운드에서는 세척 사이클 30회). 자기 비드 표면에 항원에 결합된 파지를 100 mM Gly-HCl 용액 (pH 2.2)을 사용해 15분간 교반 하에 비드로부터 용출시킨 후, 1M Tris-HCl (pH 7.6)로 중화하였다. Е. coli TG1 박테리아에 수득한 파지를 감염시키고, 파지를 박테리아에서 배양하여 단리한 후 다음 선별 사이클에 이용하였다. 3-4회 라운드 후, DNA (파지미드)를 파지로부터 단리하고, Е.coli에서 Fab를 생산하기 위해 항체 가변성 도메인을 발현 벡터 (도 6)에 클로닝하였다.
실시예 4. 라이브러리 스크리닝
초기 스크리닝
Fab를 표준 기법에 따라 제조하였다: 박테리아 세포에 Fab 유전자가 포함된 발현 벡터를 형질전환하였으며, 이후 제조된 형질전환체의 배양 중에 배지로의 lac 오페론의 전사를 촉발하는 유도체 첨가로 Fab의 발현을 유도하였다.
이후, 본 발명자들은 기질-고정된 CD20 펩타이드에 대한 Fab 결합에 대해 ELISA를 수행하였다. 항원-결합된 Fab는 항-인간 Fab HRP-접합된 2차 항체 (Pierce-ThermoScientific)로 검출하였다.
발현 플라스미드 pLL에 삽입된 리톡시맵 Fab 서열을 양성 대조군으로 이용하였다 (도 6).
초기 스크리닝 결과, 본 발명자들은 표적 CD20 펩타이드에 결합할 수 있는 클론을 선별하였다. 이 물질은 2차 스크리닝으로 이동시켰다.
2차 스크리닝
2차 스크리닝은 CD20 펩타이드와 상호작용하고 다른 항원 IL6R-Fc, PCSK9-VG-FE, PD-1-Fc와 상호작용하지 않는 Fab-생산 클론을 선별하는 것을 목표로 하였다.
Fab는 표준 기법에 따라 제작하였다. 표준 공정에 따라 다양한 기판-고정된 항원에 대한 Fab 결합을 ELISA에 의해 분석하였다.
2차 스크리닝 결과, 표적 CD20 펩타이드만 특이적으로 결합하는 Fab-생산 클론이 선별되었다.
실시예 5. 리더 후보 물질의 최적화
선별된 후보물질은 인간화를 개선하기 위해 최적화하였다. YLab 소프트웨어 패키지 (Biocad에 의해 개발됨)의 휴머나이저 툴을 사용해 치환 포인트를 정하였다. 다양한 생물 종으로부터 생식계열 기능성 V, D, J 세그먼트를 IMGT 데이터베이스로부터 입수하여, 데이터 소스로 사용하였다. 인간 세그먼트는 양성 기준으로 이용한 반면, 랫 및 마우스 유래 세그먼트는 음성 기준으로 이용하였다. 이 데이터에 기반하여, 툴은 치환할 위치를 제안해준다.
추가적인 선택을 위해, 선택한 치환 세트의 복수의 하위 세트로 후보 물질 1000개를 구축하였다. 제조된 후보물질을 초기 후보물질-표적 CD20 복합체의 결정 구조에 기초하여 모델링하였다. 모델은 BENDER (개발사: Biocad) 및 BioLuminate (Schrodinger Suite 소프트웨어, 개발사: Schrodinger) 소프트웨어로 구축하였다. 제작한 모델은 100 ns 분자 역학적 궤도를 따라 OPLS 2005 포스 필드를 이용해 평균값 MM-GBSA를 계산함으로써, 평가하였다. 분자 역학적 궤도는 Desmond (Schrodinger Suite, 개발사: Schrodinger)를 이용해 구하였다. 수득한 결과에서, 본 발명자들은, 대조군 후보물질과 더불어, 추가적인 합성이 제안되는 후보물질 133개로 된 클러스터를 명확하게 구별하게 되었다.
실시예 6. IgG1 형태의 전장 항체의 제조
Ylab 소프트웨어 패키지 (BIOCAD)의 OligoDesigner 툴을 사용해 준비된 후보물질 133종에서 CHO 세포에 대한 코돈 최적화를 수행하였다. 중쇄/경쇄 가변성 도메인의 최적화된 서열을 신규 합성하였으며, 벡터 EE-HC, pEE-CK (IgG1 형태)의 Sal1/Nhe1 및 Sal1/BsiW1 제한효소 부위 위치에 각각 클로닝하였다 (도 1, 2). IgG1 형태의 개략도는 도 3에 도시한다.
제조된 구조체를 사용해 CDHO-T 세포주를 형질전환하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 박테리아 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 표준 방법에 따라 단백질을 단리 및 정제하였다. 7.5% 변성 PAGE에서 전기영동을 수행하였다. 후보물질 22종의 생산 성능 (production performance)은 역치 수준 (50 mg/l)보다 낮았으며; 즉, 단리 및 정제되지 않았다.
실시예 7. 고 친화성 클론의 서열분석
양성 클론의 가변성 도메인 서열을 표준 프로토콜에 따라 Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)에서 서열분석하였으며, 분석하였다.
실시예 8. Forte Bio Octert RED 384에서 전장 항체의 친화성 결정
제조되는 전장 후보물질의 KD 값을 Forte Bio Octet RED 384에서 결정하였다.
SAX 바이오센서 및 바이오틴-변형된 CD20 펩타이드 (Sigma Aldrich)를 본 실험에 사용하였다. 항체 리톡시맵은 대조군으로 사용하였다. 펩타이드가 고정된 바이오틴화된 CD20 펩타이드가 20 ㎍/ml 농도로 함유된 용액에 SAX 바이오센서를 침지하였다. 후속적인 분석은 작동 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA가 함유된 PBS를 이용해 30℃에서 수행하였다.
완충액에서 베이스라인을 기록한 후, 센서를 항체 용액이 10 ㎍/ml로 수용된 웰에 150초간 침지하였으며, 복합체가 결합되었다. 이후, 완충액에서 복합체의 해리를 300초간 검출하였다.
결합 곡선은, 기준 신호를 제한 후, Octet Data Analysis 소프트웨어 (Version 9.0)를 사용해 1:1 상호작용 모델을 이용한 표준 공정에 따라 분석하였다.
후보물질 116종이 분석에 투입되었다. 이중 67종은 펩타이드에 대한 어떠한 결합성도 보이지 않았다. 나머지 후보물질 49종은 펩타이드와 나노몰 및 마이크로몰 친화성으로 상호작용하였다 (도 7 및 표 1).
후보물질 반응 (nm) kD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s) 전체 R^2
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BCD132L-114 0.3495 6.03E-08 1.22E+06 7.36E-02 0.877
BCD132L-115 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합
BCD132L-116 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합
BCD132L-117 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합
BCD132L-118 0.5571 9.04E-08 9.57E+05 8.66E-02 0.973
BCD132L-119 0.2468 4.91E-08 2.36E+06 1.16E-01 0.9109
BCD132L-120 0.3083 6.95E-08 1.69E+06 1.18E-01 0.9443
BCD132L-121 0.1834 5.97E-08 2.52E+06 1.50E-01 0.9316
BCD132L-123 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합
BCD132L-124 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합 비-결합
BCD132L-126 0.2006 4.24E-08 2.19E+06 9.29E-02 0.8596
BCD132L-129 0.4355 9.00E-08 1.11E+06 9.98E-02 0.9724
BCD132L-130 0.4193 8.67E-08 1.08E+06 9.31E-02 0.9485
BCD132L-131 0.4494 9.39E-08 9.77E+05 9.17E-02 0.9612
BCD132L-132 0.7019 1.07E-07 8.38E+05 8.97E-02 0.9888
BCD132L-133 0.2948 5.66E-08 2.12E+06 1.20E-01 0.9316
후보물질 BCD132L-026, BCD132L-028, BCD132L-075 및 BCD132L-077을 상기한 분석 결과를 토대로 선택하였다.
실시예 9. Forte Bio Octert RED 384에서 일시적인 생산 후 최종 후보물질의 친화성 결정
SAX 바이오센서 및 바이오틴-변형된 CD20 펩타이드 (Sigma Aldrich)를 본 실험에 사용하였다. 항체 리툭시맵은 대조군으로 사용하였다. SAX 바이오센서는 펩타이드가 고정된 바이오틴화된 CD20 펩타이드 20 ㎍/ml 함유 용액에 침지하였다. 추가적인 분석은 작동 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA가 첨가된 PBS를 이용해 30℃에서 수행하였다.
완충액에서 베이스라인을 기록한 후, 센서를 항체 10 ㎍/ml 농도의 용액이 든 웰에 210초간 침지하였으며, 복합체가 형성되었다. 이후, 완충액에서의 복합체 해리를 100초간 검출하였다.
결합 곡선은, 기준 신호를 제한 후, Octet Data Analysis 소프트웨어 (Version 9.0)를 사용해 1:1 상호작용 모델을 이용한 표준 공정에 따라 분석하였다 (도 8-11).
BCD132L-026 0.5411 3.99E-08 6.98E+05 2.79E-02 0.9795
BCD132L-028 0.4703 6.28E-08 4.17E+05 2.62E-02 0.9924
BCD132L-075 0.8719 6.23E-08 3.30E+05 2.06E-02 0.9969
BCD132L-077 0.4774 2.76E-08 6.36E+05 1.75E-02 0.9413
후보 물질 BCD132L-028 및 BCD132L-077이 상기한 분석 결과를 토대로 선택되었다.
실시예 10. IgG1 형태로 항체를 안정적으로 생산하는 세포주 구축
상기한 분석 결과에 따르면, BCD132-L-028, BCD132-L-077이 가장 우수하였다. 이의 중쇄 및 경쇄 서열을 벡터 pSX의 HindIII, XbaI 부위에 클로닝하였다 (도 24). 제조된 플라스미드를 E. coli 세포에서 배양하고, 600-700 ㎍을 BenchPro로 단리하였다. 이후, 플라스미드에 PvuI 엔도뉴클레아제를 처리하여 밤새 선형화한 다음 에탄올로 다시 석출하여 최종 농도 900-1100 ng/㎕로 수득하였다.
CHO-K1-S 세포주를 S.3.87 MM 배지 (FBS-무 첨가 합성 배지, 개발사: BIOCAD) + 6 mM 글루타민에서 배양하였다. BCD132-L-028, BCD132-L-077 후보물질 쇄들의 코딩 서열을 포함하는 유전자 구조체의 형질감염을 Nucleofector™ (Lonza)를 이용한 전기천공에 의해 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
형질감염 후 다음날 배지에 푸로마이신 (최종 농도 7.2 ㎍/ml), 히그로마이신 B (최종 농도 640 ㎍/ml)를 첨가하여 24일 동안 형질감염된 배양물을 선별하였다. 선별된 세포 집단을 클로닝하였다. BCD132-L-028, BCD132-L-077을 각각 발현하는 세포 클론은, 증식 속도, 집단 동종성 및 형태학적 비-변화를 감안하여 표적 단백질 수준/구조 균일성 분석 결과를 토대로 선별하였고, 후보물질 BCD132-L-026 및 BCD-132-L-075은 제외시켰다.
실시예 11. Forte Bio Octert RED 384에서 안정적인 세포주에서 배양된 최종 후보물질의 CD20 친화성 결정
SAX 바이오센서 및 바이오틴-변형된 CD20 펩타이드 (Sigma Aldrich)를 본 실험에 이용하였다. 항체 리툭시맵은 대조군으로 사용하였다. SAX 바이오센서를 펩타이드가 고정된 바이오틴화된 CD20 펩타이드 20 ㎍/ml 함유 용액에 침지하였다. 추가적인 분석은 작동 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA가 첨가된 PBS를 이용해 30℃에서 수행하였다.
완충액에서 베이스라인을 기록한 후, 센서를 항체 10 ㎍/ml 농도의 용액이 든 웰에 150초간 침지하였으며, 복합체가 형성되었다. 이후, 완충액에서의 복합체 해리를 300초간 검출하였다.
결합 곡선은, 기준 신호를 제한 후, Octet Data Analysis 소프트웨어 (Version 9.0)를 사용해 1:1 상호작용 모델을 이용한 표준 공정에 따라 분석하였다 (도 8-11).
BCD132L-028 0.2717 7.57E-08 9.05E+05 6.85E-02 0.9754
BCD132L-077 (1,2) 0.4031 7.39E-08 6.41E+05 4.74E-02 0.9846
BCD132L-077 (3,4) 0.2913 7.49E-08 8.47E+05 6.34E-02 0.9776
BCD132L-077 (5,6) 0.5857 6.71E-08 9.52E+05 6.39E-02 0.9682
실시예 12. Forte Bio Octert RED 384에서 안정적인 세포주에서 배양된 최종 후보물질의 FcγRIIIa-158F에 대한 친화성 결정
SAX 바이오센서 및 바이오틴-변형된 FcγRIIIa-158F 단백질 (Sigma Aldrich)를 본 실험에 이용하였다. SAX 바이오센서를 5 ㎍/ml 농도의 바이오틴화된 단백질 함유 용액에 침지하였으며, 여기서 단백질을 0.5 nm 신호 수준으로 고정되었다. 추가적인 분석은 작동 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA가 첨가된 PBS를 이용해 30℃에서 수행하였다.
완충액에서 베이스라인을 기록한 후, 센서를 다양한 농도의 항체 용액이 든 웰에 90초간 침지하였으며, 복합체가 형성되었다. 이후, 완충액에서의 복합체 해리를 150초간 검출하였다.
결합 곡선은, 기준 신호를 제한 후, Octet Data Analysis 소프트웨어 (Version 9.0)를 사용해 1:1 상호작용 모델을 이용한 표준 공정에 따라 분석하였다 (도 16-19).
BCD132L-028 5.93E-08 7.273E05 4.316E-02 0.9946
BCD132L-077 (1,2) 4.47E-08 7.658E05 3.423E-02 0.9976
BCD132L-077 (3,4) 5.41E-08 8.084E05 4.375E-02 0.991
BCD132L-077 (5,6) 4.17E-08 9.231E05 3.845E-02 0.9954
실시예 13. Forte Bio Octert RED 384에서 안정적인 세포주에서 배양된 최종 후보물질의 FcγRIIIa-158V 친화성 결정
SAX 바이오센서 및 바이오틴-변형된 FcγRIIIa-158V 단백질 (Sigma Aldrich)을 본 실험에 이용하였다. SAX 바이오센서를 5 ㎍/ml 농도의 바이오틴화된 단백질 함유 용액에 침지하였으며, 여기서 단백질은 0.5 nm 신호 수준으로 고정되었다. 추가적인 분석은 작동 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA가 첨가된 PBS를 이용해 30℃에서 수행하였다.
완충액에서 베이스라인을 기록한 후, 센서를 다양한 농도의 항체 용액이 든 웰에 90초간 침지하였으며, 복합체가 형성되었다. 이후, 완충액에서의 복합체 해리를 150초간 검출하였다.
결합 곡선은, 기준 신호를 제한 후, Octet Data Analysis 소프트웨어 (Version 9.0)를 사용해 1:1 상호작용 모델을 이용한 표준 공정에 따라 분석하였다 (도 20-23).
BCD132L-028 1.78E-08 6.385E05 1.139E-02 0.9963
BCD132L-077 (1,2) 2.38E-08 6.563E05 1.564E-02 0.9942
BCD132L-077 (3,4) 1.66E-08 6.906E05 1.149E-02 0.9961
BCD132L-077 (5,6) 2.27E-08 7.311E05 1.659E-02 0.9952
실시예 14. 유세포 측정을 이용한, WIL2-S 세포주의 CD20 수용체에 대한 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 특이적인 결합 측정
MabThera (리툭시맵)를 대조군 항체로 이용하였다. 샘플 및 대조군 항체를 200 ㎍/ml 농도로 희석하고, 스테인 완충제 (PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3)에서 4 증가 비율로 적정하였다. 1x106 세포/ml 농도의 WIL2-S (ATCC® CRL8885) 세포 현탁물을 표적 및 검사 샘플 용액 타이터와 함께 인큐베이션하였다. 현탁물을 교반하고, 얼음 위에 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 플레이트를 원심분리하고, 상층액을 수집하여 여기에 스테인 완충제 100 ㎕를 첨가한 다음 혼합물은 다시 현탁하고, 원심분리하였다. 상층액을 수집하고, 침전물은 스테인 완충제 중의 접합된 형광성 항-인간 Fc-PE 항체 (Jackson Immunoresearch, 109-115-098) 용액에 재현탁하였다. 플레이트를 암 조건 하 얼음에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 플레이트를 원심분리하여 상층액은 수집하고, 스테인 완충제 100 ㎕를 첨가해 혼합물을 재현탁하여 원심분리하였다. 상층액을 수집하고, 침전물은 스테인 완충제 150 ㎕에 현탁하고, 유세포 측정기 Guava12HT (Merck Millipore)로 분석하였다. 데이터는 guavaSoft 3.1.1 소프트웨어의 InCyte 모듈을 이용해 분석하였다.
WIL2-S 세포주의 CD20 수용체에 대한 검사 항체 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 특이적인 결합 수준은 MabThera (리툭시맵)과 동일하였다. 그 결과는 도 25에 나타낸다.
실시예 15. BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 보체 의존적인 세포독성 측정.
WIL2-S (ATCC® CRL-8885™) 세포주를 보체 의존적인 세포독성 분석에 사용하였다.
본 분석은 2 mM 글루타민, 0.1% 소 혈청 알부민, 50 ㎍/ml 겐타마이신이 첨가된 RPMI-1640에서 수행하였다. 검사 항체 BCD-132-L-028, BCD-132-L-077 및 MabThera (리툭시맵)를 50 ㎍/ml 농도에서부터 연속 희석하였다. 수득한 용액을 96웰 플레이트에 50 ㎕/웰로 첨가하였다. WIL2-S 세포 현탁물을 1 x 106 세포/ml로 준비하여, 플레이트 웰에 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 보체의 작동 용액 (Quidel, A113)을 준비해, 배양 플레이트에 50 ㎕/웰로 첨가하였다.
플레이트를 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 플레이트 웰에 Alamar blue 염료를 15 ㎕/웰로 첨가하고, 농도 구배 염색이 관찰될 때까지 37℃, 5% CO2에서 플레이트를 인큐베이션하였다. Infinite M200Pro 플레이트 리더에서 여기/방출 파장 544/590 nm에서 형광을 측정하였다.
BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 보체 의존적인 세포독성 수준은 MabThera (리툭시맵)과 동일하였다. 그 결과는 도 26, 도 27에 나타낸다.
실시예 16. 리포터 세포주 Jurkat-NFAT-CD16를 이용한 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 항체-의존적인 세포성 세포독성 측정
WIL-2S (ATCC® CRL-8885™)를 항체-의존적인 세포성 세포독성을 측정하기 위한 표적 세포주로 사용하였다. 작동자 세포로서, 세포 표면 FcγRIIIa (CD16a) 수용체를 안정적으로 발현하고 NFAT 반응 인자의 통제 하에 루시퍼라제-코딩 유전자를 운반하는 리포터 세포주 Jurkat-NFAT-CD16 High (CD16의 고 친화성 알로타입, V158) 및 Jurkat-NFAT-CD16 Low (의 저 친화성 알로타입CD16, F158)를 이용하였다.
본 발명자들은 2mM L-Gln, 4% (v/v) low IgG FBS 및 5 ㎍/ml 겐타마이신이 첨가된 RPMI1640에 0,5 x 106 세포/ml로 WIL-2S 세포 현탁물을 준비하였다. 표적 세포 현탁물을 화이트 웰이 구비된 배양 플레이트에 25 ㎕/웰로 첨가하였다.
BCD-132-L-028 또는 BCD-132-L-077 및 MabThera (리툭시맵)의 역가를 5 ㎍/ml에서 5배 증가시켜 첨가하고 (25 ㎕/웰), 3x106 세포/ml 농도의 리포터 세포주 Jurkat-NFAT-CD16 High 또는 Low 현탁물을 (25 ㎕/웰) 첨가하였다. 플레이트를 교반하고, 37℃, 5% CO2에서 4-8시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션이 끝나면, Bio-Glo 루시퍼라제 분석 시약 (Promega)을 75 ㎕/웰로 첨가하고, Infinite M200Pro에서 노출 시간 100 ms 동안 발광을 측정하였다.
BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077은 MabThera와 비교해 현저하게 우수한 ADCC 활성을 나타내었으며: 활성은 CD16의 고 친화성 알로타입을 가진 리포터 세포주를 이용한 경우에는 3-4배 높고, CD16의 저 친화성 알로타입을 가진 리포터 세포주를 이용한 경우에는 12-16배 더 높았다. 이들 결과는 도 28에 나타내며; 도 29는 CD16의 저 친화성 알로타입을 가진 리포터 세포주에 대한 결과를 보여주고, 도 30, 도 31은 CD16의 고 친화성 알로타입을 가진 리포터 세포주에 대한 결과를 보여준다.
실시예 17. 건강한 공여자의 전혈을 이용한 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077에 의해 유도된 CD19+에 의한 B 세포 고갈 측정.
검사 샘플의 활성을 CD16a 수용체 알로타입: FF (저 친화성 수용체), FV (이형접합체), VV (고 친화성 수용체)을 가진 건강한 공여자 유래 전혈을 이용하여 생체외 측정하였다.
MabThera (리툭시맵)을 대조군 항체로 사용하였다. 대조군 및 검사 항체는 96웰 플레이트에서 3세트로 타이트레이션하였다. 건강한 공여자로부터 혈액을 취하여 Li-헤파린이 첨가된 진공관에서 수집하였다. 이 관을 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 준비한 항체 용액 10 ㎕와 전혈 190 ㎕를 측면 홈이 있는 96웰 플레이트 (Eppendorf)에 첨가하였다. DPBS 5 ml을 96웰 플레이트의 측면 홈에 첨가하였다. 이 플레이트를 오르비탈 셰이커 (2 mm) 상에서 2분간 600 rpm으로 교반한 다음 CO2 인큐베이터에서 22시간 인큐베이션하였다.
인큐베이션이 끝나면, 샘플을 CD45, CD3/CD19에 대한 형광-표지된 항체 (BD Pharmingen)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 고정하고, BD Pharmingen 세포용해 완충제를 사용해 적혈구를 세포용해한 다음 스테인 완충제 (DPBS, 0.1% NaN3, 0.5% BSA)에서 세포용해 완충제로부터 2번 헹구고, CD45+CD3+ 및 CD45+CD19+ 이벤트의 횟수 (게이트 CD45+에서 적어도 10,000회)를 측정하였다. 데이터는 guavaSoft 3.1.1 소프트웨어의 InCyte 모듈을 사용해 분석하였다.
상대적인 B 세포 고갈을, 항체 무첨가 시점의 B-/T-세포 비율을 이용해 구였다 (B 세포의 수는 100% = 0% B 세포 고갈로서 간주함). B-/T-세포 비율은 하기 식으로 계산하였다:
Figure pct00001
B 세포 고갈 %는 하기 식으로 계산하였다:
Figure pct00002
확장 패키지 drc를 구비한 통계 환경 R을 적용해, 4-매개변수 곡선을 작성하였다.
검사 항체 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077은 MabThera (리툭시맵)과 비교해 유의하게 높은 활성을 나타내었다. 즉, 알로타입 FF의 헌혈액을 이용하는 경우, BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077은 CD19+ 세포의 약 50%의 고갈을 유발하는데 반해, MabThera (리툭시맵)는 약 20%의 고갈을 유발하였다. CD16 알로타입 FV 및 VV의 헌혈액을 이용할 경우, MabThera (리툭시맵)의 ED50 값은 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077보다 유의하게 높았다. BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077의 B 세포 고갈 수준은 공여체 CD16 알로타입에 의존적이지 않았다. 그 결과는 도 32에 나타낸다.
실시예 18. 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 이용한 Ramos 세포에 대한 항-CD20 항체의 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 활성.
CD20을 발현하는 Ramos 세포주와 건강한 공여자 유래 PBMC를 ADCC 분석에 사용하였다. Ramos 세포는 10% FBS (소 태아 혈청)가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였으며, 세포벽이 손상된 세포에서만 나타나는 형광 염료 칼세인 AM으로 세포를 염색하였다. 세포 현탁물을 105 세포/ml의 농도로 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 준비하였다.
PBMC는 건강한 공여자의 정맥혈로부터 Ficoll 밀도 구배 분리 (1.077 g/cm3)를 통해 단리하였다. 세포 현탁물을 5*106 세포/ml의 농도로 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 준비하였다.
ADCC 분석을 위해 항체 연속 희석물을 96웰 플레이트의 웰에 50 ㎕/웰로 첨가하였다. Ramos 현탁액 100 ㎕/웰 및 PBMC 현탁액 50 ㎕/웰을 여기에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 하에 4시간 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 종료하기 30분 전에 10% Tryton X-100을 10 ㎕/웰로 첨가하여 세포용해를 극대화하였다. 인큐베이션한 후, 세포액 100 ㎕/웰을 세포 채취 없이 새로운 플레이트로 옮겼다. 여기/방출 파장 485/538 nm에서 형광을 측정하였다.
ADCC 효과는 하기 식으로 계산하였다:
Figure pct00003
항체 농도에 따른 ADCC를 토대로, 본 발명자들은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어 패키지를 이용해 4-매개변수 등식에 의해 표시되는 종속성을 확인하였으며, 1/2 유효 농도 (EC50)를 계산하였다.
ADCC 분석에 따르면, 항-CD20 항체 후보물질 BCD-132-L-028 및 BCD-132-L-077은 리툭시맵보다 우수한 성능을 나타내었다. 그 결과는 도 33에 나타낸다.
실시예 19. 자가면역 뇌척수염 (EAE) 실험 모델에서, 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에 정맥내 반복 투여 후 BCD132-L-077 단일클론 항체의 활성 실험.
본 실험은 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) 수컷에서 수행하였다. 총 12마리가 실험에 참여하였으며, 각 그룹은 원숭이 4마리로 구성된다. 본 발명자들은 실험에서 제품을 2가지 용량, 즉 5 mg/kg; 22 mg/kg으로 사용하였으며, 대조군 동물에는 위약 제품을 투여하였다. 동물 실험군에 대한 데이터는 표 2에 제시한다.
표 2. 동물군
그룹 동물수 제품 투여 경로 용량
1 4 (♂) BCD132-L-077 IV 5 mg/kg
2 4 (♂) 22 mg/kg
3 4 (♂) 위약 -
마카카 파시쿨라리스에서 자가면역 뇌척수염 실험 모델을 유도하기 위해, 다수의 간행물들에 기술된 수정된 기법을 적용하였다. 영장류를 감작시키기 위해, JSC <<BIOKAD>>의 재조합 단백질을 이용하였으며, 이 단백질은 인간 마이엘린 푀소돌기신경교 단백질의 세포외 도메인 (rhMOG, 아미노산 1-125)이다.
프로인드 완전 보강제 400 ㎕가 혼합된 포스페이트-완충화된 염수 400 ㎕에 단백질 400 ㎍이 함유된 에멀젼을 각각의 동물에 3번 주사하였다. rhMOG의 1차 투여 직후, 원숭이에게 열-불활화된 백일해 백신을 주사하였다.
rhMOG 1차 투여
에멀젼을 준비하기 위해, rhMOG 10 mg을 포스페이트-완충화된 염수 10 ml에 용해하였다. 제조된 용액에 프로인드 완전 보강제 10 ml을 첨가하였다. 제조된 에멀젼은 8곳에 100 ㎕씩 주사하여 피하 투여하였다 (원숭이 1마리 당 총 투여 부피는 800 ㎕임):
척추 부위에 4회 주사 (견갑골 사이, 척수의 우측 2회, 좌측 2회);
사타구니 부위에 2회 주사 (우측 1회, 좌측 1회);
겨드랑이 부위에 2회 주사 (우측 1회, 좌측 1회);
rhMOG 1차 투여 후, 불활성화된 백일해 입자 1010개를 정맥내 주사하였다.
1차 면역화와 2차 면역화 사이 간격은 28일이었다.
rhMOG 2차 투여
에멀젼을 준비하기 위해, rhMOG 10 mg을 포스페이트-완충화된 염수 10 ml에 용해하였다. 제조된 용액에 프로인드 완전 보강제 10 ml을 첨가하였다. 제조된 에멀젼은 8곳에 100 ㎕씩 주사하여 피하 투여하였다 (원숭이 1마리 당 총 투여 부피는 800 ㎕임):
척추 부위에 4회 주사 (견갑골 사이, 척수의 우측 2회, 좌측 2회);
사타구니 부위에 2회 주사 (우측 1회, 좌측 1회);
겨드랑이 부위에 2회 주사 (우측 1회, 좌측 1회);
2차 면역화와 3차 면역화 사이 간격은 14일이었다.
rhMOG 3차 투여
에멀젼을 준비하기 위해, rhMOG 10 mg을 포스페이트-완충화된 염수 10 ml에 용해하였다. 제조된 용액에 프로인드 완전 보강제 10 ml을 첨가하였다. 제조된 에멀젼은 8곳에 100 ㎕씩 주사하여 피하 투여하였다 (원숭이 1마리 당 총 투여 부피는 800 ㎕임):
척추 부위에 4회 주사 (견갑골 사이, 척수의 우측 2회, 좌측 2회);
사타구니 부위에 2회 주사 (우측 1회, 좌측 1회);
겨드랑이 부위에 2회 주사 (우측 1회, 좌측 1회);
자가면역 뇌척수염 (EAE) 실험 모델에서 BCD132-L-077 제품의 효능 평가
제품의 활성을 측정하기 위해, 뇌 및 척수 조직에 대한 조직학적 검사를 수행하였다. 척수 및 뇌 조직에서 염증 반응의 중증도를 표 3에 따른 3점 척도로 점수를 매겼다.
표 3. 염증 반응 중증도 척도
점수 염증 중증도
0 염증 신호 없음;
1 혈관 주위 침윤 병소 매우 희박 (단편 당 1-3개);
2 혈관 주위 침윤 병소 개수 보통 (단편 당 4-10개); 뇌척수막에 염증 가능성;
3 혈관 주위 침윤 병소 만연 및 신경 조직의 염증성 세포 침윤.
영장류의 척수 및 뇌 조직에서 퇴행성 변화의 중증도를 표 4에 나타낸 척도에 따라 점수를 매겼다.
표 4. 척수/뇌 조직의 탈수초화 중증도 척도
점수 탈수초화 중증도
0 탈수초화 신호 없음;
1 탈수초화 병소 매우 희박 (단편 당 1-3개);
2 탈수초화 병소 개수 보통 (단편 당 4-10개);
3 탈수초화 만연 및 큰 융합성 병소 동반
염증 중증도 측정 결과를 도 34에 나타낸다. 실험에 사용된 용량 5.0 mg/kg 및 22.0 mg/kg 투여시, 전체 군의 점수가 대조군 (모의 대조군)과 비교해 감소한 것으로 확인되었다. 검출된 변화는 신뢰할 수 없었다. 또한, 실험군들 간에 유의한 차이는 존재하지 않았다. 따라서, 제품의 검사 용량 2가지에서 비슷한 항-염증 효과 효능을 언급할 수 있다.
신경 조직에서 퇴행성 변화의 중증도 측정 결과를 도 35에 나타낸다. 시험 제품 BCD132-L-077을 최소 용량 5.0 mg/kg으로 이용할 경우, 탈수초화 점수가 대조군과 비교해 현저하게 감소한 것으로 관찰되었다.
제품을 용량 22.0 mg/kg으로 투여한 동물 군에서도 대상 매개변수 수치 감소가 관찰되었지만, 신뢰할 수 없었다. 실험군들 간에 수치에 유의한 차이는 없었으며; 즉 2가지 용량은 활성 정도가 비슷하다고 할 수 있다.
제품은 용량 5.0 mg/kg 및 22.0 mg/kg에서 효능 측면에서 비슷한 항-염증 효과를 발휘하고, 실험 영장류의 신경 조직에서 탈수초화 정도를 비슷한 수준으로 감소시키는 것으로, 본 실험에서 밝혀졌다. 상기한 데이터를 토대로, 용량 5.0 mg/kg을 약리학적인 활성 용량으로서 확립할 수 있다 (FAD).
실시예 20. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서 수회 피하 투여 후 BCD132-L-077의 독성 및 주요 약동학 매개변수 (독성동태학) 실험.
본 실험은 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) 수컷에서 수행하였다. 동물을 격리한 후, 제품의 투여 용량에 따라 각 군당 동물 3마리씩 4가지 실험군으로 나누었으며; 체중을 원숭이 군 분할 기준으로 이용하였다. 본 발명자들은 실험에서 제품 3가지 용량, 즉 44 mg/kg; 88 mg/kg; 176 mg/kg을 사용하였으며, 대조군 동물에는 위약 제품을 투여하였다. 동물의 상태, 사망 동물의 수 및 사망 시기를 평가 척도로 이용하였다. 주사 후 8시간 동안, 이후에는 42일 동안 매일 동물을 관찰하였다.
동물 실험군의 데이터 및 제품 용량을 표 5에 나타낸다:
표 5. BCD132-L-077 제품의 효능 실험에서 동물 군
그룹 동물수 제품 투여 경로 용량
1 3 (♂) BCD132-L-077 IV 4 mg/kg
2 3 (♂) 88 mg/kg
3 3 (♂) 176 mg/kg
4 3 (♂) 위약
동물의 상태, 사망 동물 수 및 사망 시기를 평가 척도로 사용하였다.
본 실험의 범위 내에서, 임상 검사는 주사 후 8시간 경과시 수행하고, 이후에는 매일 수행하였으며; 아울러, 본 발명자들은 하기를 평가하였다:
· 동물 체중;
· 체온;
· 뇨 분석;
· 다음과 같은 매개변수에 대한 전혈 분석: 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도;
· 혈청에서 다음과 같은 매개변수에 대한 생화학적 분석: 락테이트 데하이드로게나제, 총 빌리루빈, 총 단백질, 글루코스, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제;
· 혈청 내 제품의 농도.
실험에 따라, 검사 제품은 1회 정맥내 투여 후 마카카 파시쿨라리스의 사망을 유도하지 않았으며, 실험 동물은 투여 과정에 매우 허용적이었다. 제품은 대상 매개변수에 따르면 통합 독성 지표 (integral toxicity indicator) 및 장기의 기능 상태에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 제품은 선택한 용량 범위에서 선형적인 약동학을 나타내었다.
실시예 21. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서 BCD132-L-077 제품을 4주간 정맥내 반복 투여한 다음 2주간의 회복 기간을 경과한 이후의 약동학 및 면역원성 실험.
정맥내 반복 투여한 후 약동학 및 면역원성을 용량 22.0, 44.0 및 88.0 mg/kg에서 실험하였다. 성적으로 성숙한 4-7세 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) 암컷 9마리 및 수컷 9마리로 총 18마리를 본 실험에 참여시켰다. 동물은 투여할 제품의 용량에 따라 3개의 군으로 나누었다.
표 6. 동물 군.
그룹 동물수 제품 투여 경로 용량
1 3 (♂) BCD132-L-077 IV 22 mg/kg
3 (♀)
2 3 (♂) 44 mg/kg
3 (♀)
3 3 (♂) 88 mg/kg
3 (♀)
영장류 혈청내 BCD132-L-077 수준을 효소-연계된 면역흡착 분석으로 측정하였다. 실험 중에, 약동학 매개변수에 대한 제품-결합 항체 형성이 미치는 잠재적인 효과를 확립하기 위해, BCD132-L-077 제품의 면역원성을 측정하였다. 또한, 본 발명자들은 AUCss168 (336-504) : AUC0 -168 비율로부터 축적 계수 (accumulation factor)를 계산하였다.
AUC0 -168 값을 계산하기 위해, 제품의 1차 투여 직전에, 그리고 투여 후 0.25, 24, 72 및 168시간에 혈청을 채취하였으며; AUCss168 (336-504) 값을 계산하기 위해, 제품의 4차 투여 직전, 그리고 투여 후 0.25, 24, 72 및 168시간에 혈청을 채취하였다. 약동학 매개변수는 BAb 검출되지 않은 동물에서만 데이터에 기반하여 계산하였다. 즉, 제품에 대해 면역 반응을 나타낸 동물의 데이터는 약동학 매개변수 계산에서 제외시켰다. 제품 축적은 축적 계수에 의해 측정하였으며; 이를 위해 AUC0 -168 및 AUCss(336-504) 값을 결정하고, 하기 식으로 지수를 계산하였다:
Figure pct00004
상기 식에서, AUCss168 (336- 504)는 반복 투여시 투여 간격 (168시간)에 해당하는 기간 동안의 제품 농도-시간 곡선 하 면역의 평균 값이고;
AUC0 - 168는 1차 투여 후 신체에 제품 도입 시점부터 168시간까지의 제품 농도-시간 곡선 하 면적이다.
BCD132-L-077 제품의 항체 결합 수준을 분석하기 위해, 영장류 혈청을 이용하였다. 본 실험에서 샘플은 1차 투여하기 전에 취하고, 실험 4주 및 7주차에 취하였다.
실시예 22. BCD132-L-077 제품을 용량 (22.0 mg/kg, 44.0 mg/kg, 88.0 mg/kg)을 증가시키면서 정맥내 반복 투여하는 경우의 약동학 매개변수의 비교
도 36은 영장류 혈청에서 평탄화된 BCD132-L-077 제품 농도-시간 곡선을 보여준다. 표 7은 군들에서 주요 약동학 매개변수의 평균 값들을 열거한다.
표 7. BCD132-L-077 제품을 용량을 증가시키면서 투여한 후 주요 약동학 매개변수들에 대한 비교 데이터 (정상-상태 (ss) 값은 투여 간격 (168시간)에 해당하는 336-504시간에서 계산함).
PK 매개변수 단위 용량 (mg/kg)
22 ㎍/ml 44 ㎍/ml 88 ㎍/ml
Xmean σ Xmean σ Xmean σ
AUCss (0-168) ㎍/mlxh 13435.59 11150.8 13301.04 8719.1 34145.90 16765.5
AUCss (336-504) ㎍/mlxh 26227.47 16819.4 22366.93 10370.6 97088.33 94675.6
Css(min) ㎍/ml 82.64 75.2 84.58 63.9 162.88 74.7
Css(max) ㎍/ml 326.89 241.7 427.03 266.5 1212.72 830.9
Css ㎍/ml 156.12 100.1 133.14 61.7 577.91 563.5
T1/2 h 94.76 50.3 155.38 111.2 471.00 782.5
C1 l/h 0.00924 0.004 0.01873 0.015 0.01228 0.005
CLss ml/h 4.550 2.37 10.323 6.33 7.352 5.70
Vss ml 521.65 186.9 1639.68 1170.5 2384.08 2213.3
MRTlast h 66.37 13.6 68.30 17.5 71.51 9.2
BCD132-L-077 제품의 약동학 매개변수는, 제품 투여 후 투여 기간 336-504시간 (168시간)에서의 정상-상태 AUC 값을 이용해 계산하였다. 제1 투여 간격 (1-168시간)에서 계산한 처음 AUC는 사용된 용량과 직접적인 상관관계를 나타내었다. 최소-용량 군에서는, 이 매개변수가 13,435.59±11,150.80 (㎍/ml)시간이었고; 평균-용량 군에서는 13,301.04±8,719.10 (㎍/ml)시간; 최대-용량 군에서는 34,145.90±16,765.50 (㎍/ml)시간이었다. 정상-상태 (336-504시간)에서 계산된 AUC 역시 사용 용량에 의존적이었다. AUCss168 (336-504)은, 제품 용량 22 mg/kg 투여 동물군의 경우 26,227.47±16,819.40 (㎍/ml)시간이었고; 평균-용량 군의 경우에는 그 값이 22,366.93±10,370.60 (㎍/ ml)시간이었고, 최대-용량 군의 경우에는 97,088.33±94,675.60 (㎍/ml)시간이었다. 반감기 (T1/2)는 제품 용량 22 mg/kg 투여 동물 군의 경우 94.76±50.30시간, 평균-용량 군의 경우 155.38±111.20시간, 그리고 최대-용량 군의 경우 471.00±782,50시간이었다. 소거율 (clearance)은, 최소-용량 군의 경우 0.00924±0.004 l/h, 평균-용량 군의 경우 0.01873±0.015 l/h, 최대-용량 군의 경우 0.01228±0.005 l/h이었다. 제품의 평균 체류 시간 (MRT)은, 최소-용량 군의 경우 66.37±13.60 h, 평균-용량 군의 경우 68.30±17.50 h, 최대-용량 군의 경우 71.51±9.20시간이었다. 정상 상태 분배 체적 (steady state volume of distribution)(Vdss)은, 최소-, 평균- 및 최대-용량 군에서 각각 521.65±186.90 ml/kg, 1,639.68±1,170.50 ml/kg, 2,384.08±2,213.30 ml/kg이었다. 평균 정상 상태 농도 (Css)는 최소-, 평균- 및 최대-용량 군에서 각각 156.12±100.10 ㎍/ml, 133.14±61.70 ㎍/ml, 577.91±563.50 ㎍/ml이었다. 최대 정상 상태 농도 (Cssmax)는 최소-, 평균- 및 최대-용량 군에서 각각 326.89±241.70 ㎍/ml, 427.03±266.50 ㎍/ml, 1,212.72±830.90 ㎍/ml이었다. 최소 정상 상태 농도 (Cssmin)는 82.64±75.20 ㎍/ml, 84.58±63.90 ㎍/ml, 162.88±74.70 ㎍/ml이었다. 수득한 데이터는, 영장류 혈청내 제품의 농도가 실험에 사용된 BCD132-L-077 용량과 직접적인 상관관계임을, 시사해준다.
제품을 최소 용량 22.0 mg/kg으로 투여한 동물 군의 경우, 축적 지수 (R)는 1.95였다. BCD-132를 평균 용량 44.0 mg/kg으로 투여한 동물 군의 경우, 축적 지수 R은 1.68이었다. 제품을 최대 용량 (88.0 mg/kg)으로 투여한 동물 군의 경우, 지수 R은 2.84였다. 수득한 실험 데이터는, 축적 지수가 사용 용량에 의존적이지 않다는 것을, 보여준다.
실험하는 동안에, 약동학 매개변수에 대한 제품-결합 항체의 형성의 가능한 효과를 확립하기 위해, BCD132-L-077 제품의 면역원성을 측정하였다. 실험 데이터는 실험에 참여한 전체 동물들 중 11.11%에서 BAb가 존재한다는 것을 보여주었다. 성별 의존성은 관찰되지 않았으며; BAb는 수컷 한마리와 암컷 한마리에서 관찰되었다. 제품-결합성 항체는 평균- 및 최대-용량 군들에서, 각 군에서 동물 단 한마리에서만 발견되었다. 약동학 매개변수를 모든 동물 군에서 평가할 수 있으며, 단 결합 항체의 존재가 확립된 동물에 대한 실험 데이터는 처리에서 제외시켰다.
실시예 23. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서 BCD132-L-077 정맥내 반복 투여 후 2주간의 회복 기간 이후의 독성 및 국소 자극 효과 실험.
4-7세 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) 총 30마리, 암컷 15마리 및 수컷 15마리를 본 실험에 참여시켰다. 각 군은 원숭이 6마리를 포함하였다. 반복 투여시 제품 독성을 용량 22 mg/kg, 44 mg/kg 및 88 mg/kg에서 조사하였다. 동물은 투여할 제품의 용량과 안락사 시기에 따라 5개의 군으로 나누었다:
BCD132-L-077 제품, 최소 용량 22 mg/kg (암컷 3마리 및 수컷 3마리);
BCD132-L-077 제품, 평균 용량 44 mg/kg (암컷 3마리 및 수컷 3마리);
BCD132-L-077 제품, 최대 용량 88 mg/kg, 투여 종료 후 안락사 (암컷 3마리 및 수컷 3마리);
BCD132-L-077 제품, 최대 용량 88 mg/kg, 회복 기간 종료 후 안락사 (암컷 3마리 및 수컷 3마리);
모의 대조군 (암컷 3마리 및 수컷 3마리).
동물 실험 군의 데이터는 표 8에 나타낸다.
표 8. 동물 군.
군 번호 동물 개체 수 제품 투여 경로 용량
1 3 (♂) BCD132-L-077 IV 22 mg/kg
3 (♀)
2 3 (♂) 44 mg/kg
3 (♀)
3 3 (♂) 88 mg/kg
3 (♀)
3* 3 (♂) 88 mg/kg
3 (♀)
4 3 (♂) 위약 -
3 (♀)
3* - 새틀라이트 군, 3 - 주요 군
실험 범위에서, 임상 검사는 매일 수행하였으며; 또한 본 발명자들은 하기를 검사하였다:
· 동물 체중;
· 체온;
· 뇨 분석;
· ECG;
· 지혈 매개변수: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (activated partial thromboplastin time), 피브리노겐 농도, 프로트롬빈 시간 (prothrombin time);
· 다음과 같은 매개변수에 대한 전혈 분석: 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도, 림프구, 단핵구, 호중구, 호산구, 호염구;
· 다음과 같은 매개변수에 대한 혈청의 생화학적 분석: 락테이트 데하이드로게나제, 총 빌리루빈, 총 단백질, 글루코스, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 우레아, 크레아테닌, 소듐, 포타슘, 알칼라인 포스파타제;
· 병리형태학적 및 조직학적 검사.
국소 자극 효과를 검사 데이터 및 조직학적 검사의 결과를 토대로 평가하였다. 조직학적 검사에 투여 부위 조직 및 배액 림프절을 선택하였다.
조직학적 검사에 따르면, 검사 제품은 국소 자극 효과를 나타내지 않았다.
JSC <<BIOKAD>>에 의해 생산된 BCD132-L-077 치료학적 단일클론 항체 제품에 대한 독성 실험에서 수득한 데이터는, 4주간 매주 정맥내 반복 투여시 검사 제품이 실험 동물의 주요 장기 및 장기 시스템에 독성 효과를 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 본 실험에서 확립된 무독성량 (no observed adverse effect level, NOAEL)은 검사 제품 BCD132-L-077의 최대 용량에 해당하며, 88 mg/kg에 달하였다.
실시예 24. Raji 인간 림프종 세포주를 이용한 피하 이종이식 모델에서, 인간 NK 세포로 인간화된 면역결핍 hIL15-NOG 마우스에서 복막내 반복 투여 후 BCD132-L-028 제품의 항-종양 활성 실험
본 실험에서는, 인간 IL-15를 구성적으로 발현하며 체중이 15.0-25.0 g인, 면역결핍성 hIL15-NOG 형질전환 마우스로 구성된 군 7가지를 이용하고자 계획하였다. 암컷 동물 총 84마리를 본 실험에 참여시켰다. 그에 대한 데이터는 표 9에 나타낸다.
표 9. 동물 군.
군 번호 군별 동물 개체 수 제품 세포주 NK 세포 접종 개수 투여 경로 용량, mg/kg
1 12 (♀) BCD132-L-023 Raji IV - 세포 6*106주 IP 10 mg/kg
2 12 (♀) BCD132-L-023 30 mg/kg
3 12 (♀) BCD132-L-023 90 mg/kg
4 12 (♀) 오비누투주맵 30 mg/kg
5 12 (♀) 아셀비아 30 mg/kg
6 12 (♀) 위약 -
7 12 (♀) 위약
동물은 종양 세포주를 투여하기 전에, 그리고 실험 내내 주당 2회로 체중을 측정하였다.
종양 결절은 실험 내내 주당 2회로 종양 세포를 투여한 후 측정하였다.
종양 결절의 체적은 하기 식으로 계산하였다:
V = π/6xLxWxH, 여기서 L, W, H는 종양의 길이이다.
검사 제품의 효능은, 종양 증식 지수 (I) 대비 종양 증식 저해 지수 (TGI)에 의해 평가하였다. 지수는 하기 식으로 계산하였디:
Figure pct00005
상기 식에서, Vk 및 Vo는 대조군 및 실험군 각각에서의 종양 체적 중간값 (MM3)임.
Figure pct00006
상기 식에서, I는 종양 증식 지수이고, i는 실험 당일이고, V0는 종양 체적/일이다.
실시예 25. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서 정맥내 1회 투여 후 BCD132-L-028 단일클론 항체 제품의 독성 및 주요 약동학 매개변수 (독성동태학) 실험.
실험에서, 본 발명자들은 각 군당 수컷 3마리를 포함하는 시노몰구스 원숭이로 이루어진 실험군 4가지를 이용하고자 계획하였다. 원숭이는 실험에 따라 동물 번호를 표시하여 개별 사육 장치에서 유지시켰다.
동물은 투여할 물질의 용량에 따라 기준으로서 체중을 이용해 군들로 무작위 할당하였다.
표 10. 동물 군.
군 번호 동물 개체 수 제품 투여 경로 용량, mg/kg
1 3 (♂) BCD132-L-028 IV 20
2 3 (♂) 40
3 3 (♂) 80
4 3 (♂) 위약 -
제품은 멸균 등장성 식염수로서 자정맥에 정맥내 투여하고자 계획하였다. 대조군 동물에는 실험군에서 이용되는 것과 동일한 부피 및 방법으로 등장성 식염수 (위약)을 투여하였다.
실험 범위에서, 임상 검사는 매일 수행하였으며; 또한 본 발명자들은 하기를 검사하였다:
1. 동물 체중;
2. 체온;
3. 뇨 분석;
4. 다음과 같은 매개변수에 대한 전혈 분석: 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도;
5. 다음과 같은 매개변수에 대한 혈청의 생화학적 분석: 락테이트 데하이드로게나제, 총 빌리루빈, 총 단백질, 글루코스, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제
6. 혈청내 제품 농도 검사, 주요 약동학 매개변수 계산 및 약동학 선형성 (pharmacokinetics linearity) 평가.
실시예 26. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서 BCD132-L-028 단일클론 항체 제품의 13주간 정맥내 반복 투여 후 30일의 회복 기간 이후의 약동학 및 면역원성 실험.
13주간 정맥내 반복 투여한 후 30일간의 회복 기간을 거친 이후의 약동학 및 면역원성 실험에서, 본 발명자들은 시노몰구스 원숭이 18마리 (수컷 9마리 및 암컷 9마리)를 이용하고자 계획하였다.
동물은 투여 물질의 용량에 따라, 각 군당 암컷 3마리 및 수컷 3마리로 구성된 3가지 군 (표 11)으로 할당한다: 최소 용량 군 (6 mg/kg), 중간 용량 군 (20 mg/kg), 최대 용량 군 (60 mg/kg).
표 11. 동물 군.
군 번호 군 당 총 동물 개체수 제품 투여 경로 용량, mg/kg
1 3 (♂) BCD132-L-028 IV 6
3 (♀)
2 3 (♂) 20
3 (♀)
3 3 (♂) 60
3 (♀)
본 실험에서, 본 발명자들은 하기를 계획하였다:
1. 실험 동물의 혈청에서 검사 제품의 농도 평가;
2. 용량을 증가시켜 투여할 경우의 제품 축적 평가;
3. 검사 제품의 정맥내 반복 투여시 결합 항체의 수준 평가.
실시예 27. 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)에서 BCD132-L-028 단일클론 항체 제품의 13주간 정맥내 반복 투여 후 30일의 회복 기간 이후의 독성 및 국소 자극 효과 실험.
본 실험에서, 본 발명자들은 각 군당 암컷 3마리 및 수컷 3마리로 구성된 시노몰구스 원숭이 실험군 5가지를 이용하고자 계획하였다: 최소 용량 군 (6 mg/kg, 부검 비실시), 중간 용량 군 (20 mg/kg, 부검 비실시), 새틀라이트 최대 용량 군 (60 mg/kg, 제품 투여 기간 종료 후 부검), 주요 최대 용량 군 (60 mg/kg, 회복 기간 종료 후 부검) 및 모의 대조군 (회복 기간 종료 후 부검).
표 12. 동물 군 (* - 새틀라이트 군의 동물)
군 번호 동물 개체 수 제품 투여 경로 용량, mg/kg
1 3 (♂) BCD132-L-028 IV 6
3 (♀)
2 3 (♂) 20
3 (♀)
3 3 (♂) 60
3 (♀)
3 (♀)
4 3 (♂) 위약 -
3 (♀)
각 동물에 대한 임상 검사를 매일 수행하고; 또한 하기를 평가하고자 하였다:
· 동물 체중;
· 체온 (투여 전, 그리고 실험 종료시까지 매주);
· Poly-Spectr 카디오그래프를 이용한 심혈관 시스템에 대한 효과;
· 뇨 분석;
· 다음과 같은 매개변수에 대한 전혈 분석: 적혈구 수, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도, 림프구 수, 단핵구 수, 호중구 수, 호산구 수, 호염구 수;
· 다음과 같은 매개변수에 대한 응고 시스템의 효과 평가: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 피브리노겐 농도, 프로트롬빈 시간;
· 다음과 같은 매개변수에 대한 혈청의 생화학적 분석: 소듐, 포타슘, 크레아티닌, 우레아, 알칼라인 포스파타제, 락테이트 데하이드로게나제, 총 빌리루빈, 총 단백질, 글루코스, 트리글리세라이드, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 총 콜레스테롤.
제품 투여 기간 종료시 (14주), 본 발명자들은 각각의 동물 군에서 수컷 3마리 및 암컷 3마리를 안락사하고자 계획하였다. 나머지 각 군의 수컷 2마리와 암컷 2마리는 회복 기간이 끝나면 (18주) 안락사시킬 계획이었다. 국소 자극 효과를 부검 데이터와 조직 검사 결과를 토대로 평가하였다. 조직학적 검사를 위해, 자정맥 부위, 투여 부위 조직과 배액 림프절을 선택하였다.
<110> JSC "BIOCAD" <120> MONOCLONAL ANTIBODY THAT SPECIFICALLY BINDS TO CD20 <160> 8 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence BCD132-L-077_HC <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 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Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu 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70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (36)

  1. 하기를 포함하는, CD20에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    1) 서열번호 2 또는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인;
    2) 서열번호 4 또는 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
  2. 제1항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    1) 서열번호 1 또는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    2) 서열번호 3 또는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    1) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    2) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제4항에 있어서,
    1) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    2) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서,
    CD20에 특이적으로 결합하는 항체가 전장 IgG 항체인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 전장 IgG 항체가 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소형 항체인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 전장 IgG 항체가 인간 IgG1 이소형 항체인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA인, 핵산.
  12. 제10항 또는 제11항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항에 따른 벡터로 세포를 형질전환하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위한 숙주 세포의 제조 방법.
  14. 제10항 또는 제11항에 따른 핵산을 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위한 숙주 세포.
  15. 제14항에 따른 숙주 세포를 배양 배지에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양하고, 필요에 따라 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리 및 정제하는 것을 포함하는,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 하기로부터 선택되는, 약학적 조성물:
    a) 종양 질환 또는 장애, 또는
    b) 자가면역 질환 또는 장애.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 종양 질환 또는 장애가 B 세포 림프종 또는 백혈병을 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 B 세포 림프종이 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 호지킨 질환 (호지킨 림프종)으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 백혈병이 만성 림프성 백혈병 (CLL) 또는 소형 림프성 림프종 (SLL)으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 자가면역 질환 또는 장애가 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 (스틸 질환), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 궤양성 대장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, ANCA 혈관염, 실질 장기의 이식 거부 반응, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    하나 이상의 다른 치료학적 활성 화합물을 포함하는,
    CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조합.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 다른 치료학적 활성 항-종양 화합물이 화학치료제, 항체 또는 항-호르몬제로부터 선택되는, 약학적 조합.
  24. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 저해가 필요한 개체에서 CD20의 생물학적 활성을 저해하는 방법.
  25. 치료가 필요한 개체에 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제16항에 따른 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 하기로부터 선택되는, 질환 또는 장애의 치료 방법:
    a) 종양 질환 또는 장애, 또는
    b) 자가면역 질환 또는 장애.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 종양 질환 또는 장애가 B 세포 림프종 또는 백혈병을 포함하는 군으로부터 선택되는, 질환 또는 장애의 치료 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 B 세포 림프종이 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 호지킨 질환 (호지킨 림프종)으로부터 선택되는, 질환 또는 장애의 치료 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 백혈병이 만성 림프성 백혈병 (CLL) 또는 소형 림프성 림프종 (SLL)으로부터 선택되는, 질환 또는 장애의 치료 방법.
  30. 제26항에 있어서,
    상기 자가면역 질환 또는 장애가 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 (스틸 질환), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 궤양성 대장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, ANCA 혈관염, 실질 장기의 이식 거부 반응, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 포함하는 군으로부터 선택되는, 질환 또는 장애의 치료 방법.
  31. CD20에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료가 필요한 개체에서 치료하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제16항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  32. 제27항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 하기로부터 선택되는, 용도:
    a) 종양 질환 또는 장애, 또는
    b) 자가면역 질환 또는 장애.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 종양 질환 또는 장애가 B 세포 림프종 또는 백혈병을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 B 세포 림프종이 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 호지킨 질환 (호지킨 림프종)으로부터 선택되는, 용도.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 백혈병이 림프성 백혈병 (CLL) 또는 소형 림프성 림프종 (SLL)으로부터 선택되는, 용도.
  36. 제32항에 있어서,
    상기 자가면역 질환 또는 장애가 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 (스틸 질환), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 궤양성 대장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, ANCA 혈관염, 실질 장기의 이식 거부 반응, 이식편대숙주 질환 (GvHD), 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
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