CN113325201A

CN113325201A - 一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法

Info

Publication number: CN113325201A
Application number: CN202110580209.XA
Authority: CN
Inventors: 关心; 石宏卓; 黄晓
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113325201B

Abstract

本发明公开了一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，通过建立植物愈伤组织诱导的瞬时悬浮细胞系，将悬浮细胞用特定酶解液酶解后，得到原生质体并进行纯化，添加甘露醇溶液得到原生质体的甘露醇溶液，用盐酸多巴胺溶液和Tris‑HCl缓冲溶液处理塑料培养皿，在培养皿表面制备质子化多巴胺自氧化聚合膜，在经过处理的培养皿中黏附原生质体，裂解原生质膜和去除细胞器与可溶蛋白质并固定细胞骨架，经干燥后可用于AFM扫描成像。本发明创造了从瞬时悬浮细胞系建立、制备、纯化、黏附原生质体到裂解原生质膜、固定细胞骨架和AFM观察的完整方法，为研究细胞骨架的结构提供了一种新途径。

Description

一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法

技术领域

本发明属于植物细胞骨架观察技术领域，涉及一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法。

背景技术

细胞骨架是动、植物细胞的重要组成结构，由微管蛋白、微丝蛋白和中间纤维组成复杂的网络结构。他们对于细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化、物质运输、信号传导等起到重要作用。植物细胞骨架包括微管蛋白和微丝蛋白。相较于动物，植物在面对外界威胁时不能迅速逃避，而是在数亿年演化中形成了能够抵抗不良环境的多种机制(内源免疫)。最新研究发现，细胞骨架除了起到传统认识上的骨架支撑作用，在胁迫发生的最早期阶段起到感应器作用。植物细胞骨架在应对生物/非生物胁迫时，通过自身解聚、聚合及其重排将膜信号进行转导，调控离子信号和基因表达，起到对外界胁迫的抵御。鉴于此，在病虫害防治、新品种选育等现代农业研究中，聚焦于细胞骨架领域的研究引起越来越多的重视，对进行植物细胞骨架介导的内源免疫早期反应阶段观察研究的技术手段需求极为迫切。

现有资料公开了两种观察植物细胞骨架的方法。一种是通过荧光染料染色将细胞骨架进行免疫荧光标记(Chang et al.,Plos One,2015)。这种方法需要将细胞固定，用特异的能结合植物微管蛋白或微丝蛋白的并带有荧光基团的抗体进行孵育。而后借助荧光显微镜进行观察。这意味着只有显著的细胞骨架的结构变化能够在反应的晚期阶段才能够被检测到，而早期细微的变化过程，如微丝蛋白、微管蛋白自身的解聚、聚合以及微管蛋白与微丝蛋白的交联现象是无法被捕捉到的。

第二种方法是创建活体荧光标记细胞系对细胞骨架结构进行实时观察(Guan etal.,Journal ofPlantPhysiology,2014)。这种方法需要进行遗传转化，运用转牒激光共聚焦显微镜技术，对微管蛋白进行实时示踪。然而对于某些多年生果树的种和品种，悬浮细胞系的建立和进行外源基因遗传转化是两大世界难题。不仅转化周期长，而且成功率低。同时，获得荧光标记细胞系后进行显微观察不仅需要分辨率高、对待观察样品漂白程度低的转碟激光共聚焦显微镜，而且对操作人员的实验技术要求较高。能够得到活体荧光标记细胞系的案例非常少，在非专业级别的实验室几乎是不可能实现的。

在具体技术方面，专利200810226611.2公开了一种制备大规模原生质体的方法。该方法适用于制备拟南芥和烟草等模式植物的原生质体(10⁸～10¹⁰个)；对于大多数多年生果树，与拟南芥和烟草等草本植物相比，它们属于多年生木本植物，其稳定的悬浮系建立是一个复杂而冗长的过程，获得大量的可用于原生质体制备的稳定悬浮细胞系是一个巨大的障碍。

此外，Berdyyeva et al.,Ultramicroscopy,2005公开了通过原子力显微镜可视化细胞骨架的方法，该方法能够使细胞膜裂解，除去可溶性蛋白质和细胞器，对细胞骨架损伤较小。最终在干燥的空气中和在含有盐溶液的环境条件下都能够在原子力显微镜下观察到细胞骨架结构。然而该方法针对人体(哺乳动物)细胞，在对哺乳动物细胞进行去除细胞膜固定细胞骨架之前并不需要特殊将其黏附于培养皿表面的操作，因为动物细胞膜外周存在纤连蛋白，它是细胞外基质和基底膜中的主要非胶原性糖蛋白，在细胞黏附中起到帮助动物细胞黏附于培养皿表面的关键作用。而植物原生质体细胞膜表面没有类似于动物细胞膜外周的纤连蛋白结构，无法完成自发贴壁过程。

发明内容

针对现有免疫荧光标记法和构建活体荧光标记细胞系法难以对多年生果树细胞骨架介导的内源免疫早期反应阶段细微结构变化进行观察这一难题，本发明旨在提供一种方法使其适用于不易建立稳定悬浮细胞系的多年生果树。通过获得少量原生质体(10～10²个)，制备适用于原子力显微镜观察的细胞骨架。为研究细胞骨架的精细结构提供一种新途径。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，包括以下步骤：

1)植物愈伤组织诱导的瞬时悬浮细胞系建立：在超净工作台中，用无菌镊子将植物愈伤组织表面处于旺盛分裂期的细胞夹成尽可能小的细胞团，取适量细胞(细胞浓度控制在自然沉降体积比：沉降后细胞体积/悬浮液中的体积＝30～40％)转移到装有10ml液体培养基的50ml锥形瓶中，用无菌锡箔纸封口，置于25℃，黑暗，转速为200rpm的摇床中振荡培养2小时，诱导瞬时悬浮细胞系；

2)在植物愈伤组织诱导的瞬时悬浮细胞系中加入酶解液进行酶解；

3)将酶解完成后的混合培养液过滤去除未酶解的细胞团，收集滤液在室温下用离心机在400rpm离心10分钟，去除上清液，保留原生质体沉淀进行纯化，添加甘露醇溶液，使原生质体重悬待用；

4)用盐酸多巴胺溶液和Tris-HCl缓冲溶液在室温下浸泡处理塑料培养皿，除去上述多巴胺溶液和Tris-HCl缓冲溶液，用Tris-HCl缓冲液和甘露醇溶液分别在室温下浸泡培养皿，在培养皿表面制备质子化多巴胺自氧化聚合膜；

5)将制备的原生质体甘露醇溶液滴加于处理好的培养皿中；

6)待原生质体黏附完成之后，去除甘露醇溶液，固定原生质体，用表面活性剂与细胞骨架保护缓冲液浸泡原生质体20分钟，洗去细胞骨架保护缓冲液，室温下干燥，即可用于AFM扫描成像。

进一步的，步骤1)中液体培养基的组成为：MS培养基粉末4.3g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾200mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素1mg/L，2，4-D 0.2mg/L，用KOH和HCl调节pH至5.8，121℃高温高压灭菌20分钟。

进一步的，步骤2)中酶解液包括：MES 5mmol/L，CaCl₂0.02mol/L，KCl 0.01mol/L，甘露醇0.4mol/L，果胶酶0.05％(m/m)和纤维素酶1.0％(m/m)。

进一步的，酶解条件为：在转速为30rpm摇床上避光酶解，酶解时间为12～14小时，酶解温度为24～26℃。

进一步的，步骤3)中过滤采用30μm孔径的尼龙网格滤膜。

进一步的，步骤3)中纯化采用原生质体纯化洗液，包括以下组分：NaCl 155mmol/L，CaCl₂125mmol/L，MES 1.5mmol/L，KCl 5mm/L，葡萄糖5mm/L。

进一步的，步骤6)中表面活性剂选用TritonX-100。

进一步的，步骤6)中细胞骨架保护缓冲液包括：Tris-HCl 10mmol/L，NaCl0.14mol/L，MgCl₂5mmol/L，和聚乙二醇60004.0％(m/m)。

本发明的有益效果为：

1)运用能够观察到纳米级的原子力显微镜对微管蛋白、微丝蛋白及其交联结构进行扫描观察，弥补免疫荧光标记法和创建活体荧光标记细胞系两种传统研究方法的不足，成为该研究中一个关键的、可行性的技术方法。

2)通过诱导瞬时悬浮细胞系作为实验原始材料可以克服不能在短时间获得稳定的悬浮细胞系的障碍。2小时的短暂悬浮培养(本发明定义为“瞬时”，该时间段也被细胞生物学实验中公认为有效的培养微环境改变后的稳定期)还能获得由来自于愈伤组织的细胞团充分分散开的悬浮状态的细胞，以便于后续更加充分的酶解。

3)开创性地利用多巴胺具有超强黏附性能且能通过表面化修饰后与生物分子发生反应的化学特性，并作用于塑料培养皿表面将其质子化，来实现不具有自动贴壁功能的原生质体黏附。解决了相较动物细胞，植物细胞不能自动贴壁的难题。

4)发明了用于细胞质收集的细胞筛与滤液收集器。将1ml移液枪所用的枪头从底端往上剪掉3cm，并用顶部紧密贴合30μm孔径的尼龙网格滤膜(详见下条5)描述)制成一个小型细胞筛，用10ml离心管去掉顶部一半作为滤液收集器。

5)采用30μm孔径的尼龙网滤膜来除去残留的未酶解或酶解不彻底的细胞和细胞团。所使用的美国millipore公司生产的30μm孔径的尼龙网可以用于过滤收集直径大小在20-30μm的多年生果树细胞原生质体。在不损伤制备好的原生质体的情况下将其过滤下去，从而保证了90％以上原生质体纯化率及其生理状态的稳定性。

6)采用果胶酶(Pectolyase Y-23)和纤维素酶(Cellulase onaz yka RS)组合。这两种酶为日本Yakult公司生产的用于制备高纯度原生质体的酶试剂。低浓度的酶解液在酶解的过程中既能将植物细胞壁去除，又可以避免对细胞膜的损伤，因此采用这种酶组合十分适合于制备量少而质精的多年生果树原生质体。

7)本发明采用低转速长时间(30rpm，12～14小时)的酶解条件，能够充分保证原生质体的制备率以及制备后生理状态的稳定性。

8)通过创建愈伤组织诱导的瞬时悬浮细胞系，可以逾越建立多年生木本植物稳定悬浮细胞系的屏障，制备量少而质精的原生质体(30～60个)，满足适用于AFM观察的实验需求

附图说明

图1为本发明实施例提供的细胞骨架制备、观察方法的流程示意图；

图2是本发明制备纯化后单个分散的葡萄原生质体倒置荧光显微镜(IX-73,Olympus,日本)呈像；所用实验材料为美洲沙地葡萄微管蛋白标记系(V.rupestrisexpressing GFP-AtTUB6)瞬时悬浮细胞系；

图3是本发明已稳定黏附到培养皿表面的单个葡萄原生质体的倒置荧光显微镜成像；

图4是本发明葡萄原生质体裂解、细胞骨架固定过程倒置荧光显微镜呈像；

图5是本发明细胞结构黏附并固定在培养皿上用原子力显微镜扫描35×35μm²平面图；右边的柱状条表示该结构的高度从-1.4μm变化到2.1μm；

图6是本发明细胞结构边缘区域5×5μm²扫描平面图；右边的柱状条表示该结构的高度从0nm变化到69.9nm。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明针对运用现有方法(免疫荧光标记法和构建活体荧光标记细胞系法)难以对多年生果树细胞骨架介导的内源免疫早期反应阶段的细微结构变化进行观察这一难题，通过原生质体构建和细胞骨架固定两大模块，分8个步骤建立了适用于原子力显微镜观察的植物细胞骨架材料。

如图1所示，首先建立愈伤组织诱导的瞬时悬浮细胞系，然后制备、纯化原生质体，接下来制备质子化聚多巴胺涂层，黏附原生质体，继而固定原生质体，最后裂解原生质膜、去除可溶蛋白及细胞器，将得到的材料用于AFM成像观察。

具体步骤如下：

1、愈伤组织诱导瞬时悬浮细胞系

(1)液体培养基的配制：MS培养基粉末4.3g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾200mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素1mg/L，2，4-D 0.2mg/L，用KOH和HCl调节pH至5.8，121℃高温高压灭菌20分钟。

(2)诱导瞬时悬浮细胞：在超净工作台中，用无菌镊子将植物愈伤组织表面处于旺盛分裂期的细胞夹成尽可能小的细胞团，取适量细胞(细胞浓度控制在自然沉降体积比：沉降后细胞体积/悬浮液中的体积＝30～40％)转移到装有10ml相应的液体培养基的50ml锥形瓶中，用无菌锡箔纸封口，置于25℃，黑暗，转速为200rpm的摇床中振荡培养2小时，诱导瞬时悬浮细胞系；

2、原生质体制备

(1)收集细胞：在超净工作台中，用200μl移液枪(所用枪头剪掉长度为5mm的尖端)吸取100μl由植物愈伤组织诱导的瞬时悬浮细胞于2ml离心管中；

(2)酶解液的配制：按照体积比悬浮细胞液:酶解液＝1:10的比例配制1ml酶解液(表1)装入2ml离心管，并用1.0mol/L KOH溶液调节pH值至5.6～5.8；

表1酶解液

其中酶解液为水溶液。

(3)酶解液过滤灭菌：在超净工作台中，将酶解液经0.22μm微孔滤膜过滤灭菌；

(4)悬浮细胞酶解：在超净工作台中，将过滤灭菌后的酶解液加入装有100μl悬浮细胞的2ml离心管中，在转速为30rpm摇床上避光酶解，酶解时间为12～14小时，酶解温度为24～26℃。

3、原生质体纯化

(1)将1ml移液枪所用的枪头从底端往上剪掉3cm，并用顶部紧密贴合30μm孔径的尼龙网格滤膜制成一个小型细胞筛，用10ml离心管去掉顶部一半作为滤液收集器。将酶解完成后的混合培养液通过上述装置过滤除去未酶解的细胞团，收集的滤液转移至2ml离心管中，室温下用离心机在400rpm离心10分钟，吸取上清液，保留原生质体沉淀；

(2)用原生质体纯化洗液(表2)1ml洗涤沉淀，室温下静置20分钟，使原生质体自然沉降；

表2原生质体纯化洗液

(3)洗涤完成后小心吸出上层洗液，保留原生质体沉淀，加入1ml 0.4mol/L的甘露醇溶液，使原生质体重悬待用。

4、多巴胺自氧化聚合膜的制备及其质子化处理

(1)配制浓度为0.01mol/L盐酸多巴胺溶液10ml，用pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液调整多巴胺溶液的pH至8.5，最后用配制好的溶液室温下在直径60mm的塑料培养皿表面浸泡处理6.5小时；

(2)除去上述多巴胺和Tris-HCl缓冲溶液混合液，之后用pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液冲洗培养皿3遍，再依次用10ml pH＝3.0的Tris-HCl缓冲液和10ml 0.4mol/L甘露醇溶液在室温下浸泡处理直径60mm的塑料培养皿表面各2小时，即得到质子化多巴胺自氧化聚合膜用于吸附表面带负电荷的原生质体。

5、原生质体黏附

将2ml离心管中含有原生质体的甘露醇溶液用200μl移液枪(所用枪头剪掉长度为5mm的尖端)小心吸出200μl滴于制备好的质子化多巴胺自氧化聚合膜表面(保持浓度为0.4mol/L的甘露醇液体环境)，补加0.4mol/L甘露醇溶液使其完全浸润培养皿表面，25℃静置2个小时，使原生质体黏附在培养皿表面聚合膜层。

6、用于原子力显微镜成像的细胞骨架准备

(1)黏附完成之后用1000μl移液枪小心吸出甘露醇溶液并用1000μl移液枪吸取HBSS溶液洗涤2次培养皿表面，去除原生质体表面的甘露醇溶液残留；

(2)在室温下用含1.0％的福尔马林溶液10ml固定原生质体15分钟；之后除去福尔马林溶液并用1000μl移液枪吸取HBSS溶液洗涤2次已经固定的原生质体，去除残留的福尔马林溶液，再用10ml超纯水洗除HBSS溶液；

(3)室温下用10ml 0.5％的TritonX-100与细胞骨架保护缓冲液(表3)混合之后浸泡原生质体20分钟，缓冲液用pH＝9.0的Tris-HCl溶液调节pH至7.6～7.8，既能在保证裂解原生质膜并溶解细胞器和其他可溶蛋白质的前提下又不至于损伤细胞骨架结构；期间可将培养皿放置在能够放置培养皿的显微镜下观察裂解原生质膜和去除可溶蛋白质的情况。浸泡完之后用1000μl移液枪小心吸取除去处理溶液；

表3细胞骨架保护缓冲液

(4)用1000μl移液枪吸取缓冲液5ml洗涤原生质体2次，每次2分钟，洗掉已去除的原生质膜、细胞器和其他可溶蛋白质；

(5)最后用10ml超纯水洗涤培养皿表面，洗去缓冲液，并在室温下干燥20分钟，即可用AFM对其扫描成像，置于培养皿中的干燥细胞骨架样本可于4℃冰箱保存24小时之内观察。

7、细胞骨架的扫描观察

由德国JPK公司生产的型号为Nano Wizard 310800的原子力显微镜用于研究观察。将处理好的培养皿固定在AFM的夹盘上，使用标准轻敲模式对已经干燥的细胞骨架样本表面进行扫描观察，试验所用扫描探针为德国JPK公司RTESP7型号探针。

多巴胺可以溶解在弱碱性Tris-HCl中并在氧气的催化作用下发生自聚合生成具有超强黏附性能的聚多巴胺涂层，聚多巴胺在塑料材料表面呈现出一种致密的连续膜状态，并且由于聚多巴胺涂层含有大量可以参与反应的儿茶酚/苯醌基团，能够与含有氨基(-NH-R)和巯基(-SH-R)的生物分子发生反应从而实现对其的黏附和固定。本发明利用上述多巴胺的化学结构特性与原生质膜表面含有-NH-R和-SH-R的蛋白质发生反应从而实现对原生质体的黏附和固定，而这种黏附功能就可以起到如动物细胞膜外周纤连蛋白的作用。除此之外，将多巴胺表面质子化的目的是利用原生质膜表面磷脂中的磷酸基团带有强负电荷的性质通过正负离子静电作用来吸附原生质体，使得原生质体能够在培养皿表面铺展开来，这样有助于下一步裂解原生质膜并露出细胞骨架的操作。

在去膜时，采用福尔马林溶液固定原生质体，防止后续去膜处理对细胞骨架造成结构变化，除此之外由于动、植物细胞膜和原生质膜表面结构和化学成分存在部分差异，在用0.5％TritonX-100处理裂解原生质体时，处理时间较动物细胞处理延长15分钟，确保植物原生质膜充分裂解。

实施例1利用美洲沙地葡萄微管蛋白标记系(V.rupestris expre ssing GFP-AtTUB6)瞬时悬浮细胞系观察细胞骨架结构。

1、试验材料与仪器

1.1试验材料

美洲沙地葡萄微管蛋白标记系(V.rupestris expressing GFP-At TUB6)瞬时悬浮细胞系。

1.2试验试剂

MS培养基粉末、葡萄糖、蔗糖、KH₂PO₄、肌醇、硫胺素、2，4-D、潮霉素B、果胶酶(Pectolyase Y-23)、纤维素酶(Cellulase onazyka RS)、MES、CaCl₂、KCl、NaCl、MgCl₂、聚乙二醇6000、甘露醇溶液、1.0mol/L KOH溶液、1.0mol/L HCl溶液、0.01mol/L盐酸多巴胺溶液(索莱宝)、Tris-HCl缓冲溶液、Hank's平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution,HBSS溶液)、1.0％福尔马林溶液、表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100。

(1)MS液体培养基：MS培养基粉末4.3g/L、蔗糖30g/L、KH₂PO₄200mg/L、肌醇100mg/L、硫胺素1mg/L、2，4-D 0.2mg/L、潮霉素B30 mg/L，溶液pH＝5.8。

(2)酶解液：MES 5mmol/L，CaCl₂0.02mol/L，KCl 0.01mol/L，甘露醇0.4mol/L，果胶酶(0.05％,m/m)和纤维素酶(1.0％,m/m)，溶液pH＝5.8。

(3)原生质体纯化洗液：154mmol/L NaCl，125mmol/L CaCl₂，1.5mmol/L MES，5mm/L KCl，5mm/L葡萄糖，溶液pH＝5.8。

(4)细胞骨架保护缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，0.14mol/L Na Cl，5mmol/LMgCl₂，聚乙二醇6000(4％,m/m)，溶液pH＝7.6。

MS液体培养基(含维生素)(Duchefa，荷兰)，其他的试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3试验用具和仪器

镊子、酒精灯、钥匙、称量纸、50ml量筒、1000μl移液枪、200μl移液枪、2ml已灭菌的离心管、10ml离心管、5ml注射器、0.22μm微孔滤膜、1ml移液枪所用的枪头从底端往上剪掉3cm之后用顶部贴合30μm孔径大小的尼龙网(Millipore，美国)制成的细胞筛、直径60mm无菌塑料培养皿、超净工作台(苏净安泰)、电子天平(赛多利斯)、pH计(上海梅特勒-托利多)、超纯水系统(Millipore，美国)、恒温摇床(Thermo，美国)、离心机(蜀科)、多用恒温培养箱(Shel Lab，美国)、倒置荧光显微镜(IX-73,Olympus,日本)、原子力显微镜(NanoWizard310800，JPK Instruments AG，德国)。

2、试验步骤

2.1多巴胺自氧化聚合膜的制备及其质子化处理

(1)配制浓度为0.01mol/L盐酸多巴胺溶液10ml，用pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液调整多巴胺溶液的pH至8.5，将配制好的溶液在室温下浸泡处理直径60mm的塑料培养皿表面6.5小时。

(2)除去上述多巴胺和Tris-HCl缓冲溶液混合液，用pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液冲洗培养皿3遍，再依次用10ml pH＝3.0的Tri s-HCl缓冲液和10ml 0.4mol/L甘露醇溶液在室温下浸泡处理60mm的塑料培养皿表面各2小时，即得到质子化多巴胺自氧化聚合膜，之后将培养皿一直浸润在0.4mol/L甘露醇溶液环境中并盖好培养皿盖，室温存放直至使用(存放不超过24小时)。

2.2葡萄愈伤组织诱导瞬时悬浮细胞系

(1)液体培养基的配制：按照如下表格所示试剂进行配制MS液体培养基10ml，配制完成后用KOH和HCl调节pH至5.8，并用121℃高温高压灭菌20分钟后冷却至40℃以下加入潮霉素B30mg/L。

表4 MS液体培养基

(2)诱导瞬时悬浮细胞：在超净工作台中，用无菌镊子将生长良好的美洲沙地葡萄微管蛋白标记系(V.rupestris expressing GFP-AtTUB6)愈伤组织表面处于旺盛分裂期的细胞夹成尽可能小的细胞团，取适量细胞(细胞浓度控制在自然沉降体积比：沉降后细胞体积/悬浮液中的体积＝30～40％)转移到装有10ml MS液体培养基的50ml锥形瓶中，用无菌锡箔纸封口，置于25℃，黑暗，转速为200rpm的摇床中振荡培养2小时，诱导瞬时悬浮细胞系；

2.3葡萄原生质体制备

(1)收集葡萄悬浮细胞：在超净工作台中，用200μl移液枪(所用枪头剪掉长度为5mm的尖端)吸取100μl葡萄愈伤组织诱导的瞬时悬浮细胞于2ml离心管中；

(2)酶解液的配制：用2ml离心管配制1ml酶解液(表4)，酶解液用1.0mol/L KOH溶液调节pH值至5.7；

表5酶解液

其中酶解液为水溶液。

(4)葡萄悬浮细胞酶解：在超净工作台中，将过滤灭菌后的酶解液加入装有100μl葡萄悬浮细胞的2ml离心管中，在室温下转速为30rpm的摇床上避光酶解14小时。

2.4葡萄原生质体纯化

(1)将1ml移液枪所用的枪头从底端往上剪掉3cm，并用顶部紧密贴合30μm孔径的尼龙网格滤膜制成一个小型细胞筛，用10ml离心管去掉顶部一半作为滤液收集器。将酶解完成后的混合培养液通过上述装置过滤除去未酶解的细胞团，收集的滤液转移至新的2ml离心管中，室温下用离心机在400rpm离心10分钟，吸取上清液，保留原生质体沉淀；

(2)用原生质体纯化洗液(表6)1ml洗涤沉淀，在室温下静置20分钟，使原生质体自然沉降。

表6原生质体纯化洗液

(3)洗涤完成之后用200μl移液枪小心吸出上层洗液，保留原生质体沉淀，加入1ml0.4mol/L的甘露醇溶液，使原生质体重悬待用。

2.5葡萄原生质体黏附

将2ml离心管中含有原生质体的甘露醇溶液用200μl移液枪(所用枪头剪掉长度为5mm的尖端)小心吸出200μl滴于制备好的质子化多巴胺自氧化聚合膜表面(保持浓度为0.4mol/L的甘露醇液体环境)，并补加0.4mol/L甘露醇溶液使其完全浸润培养皿表面，25℃下静置2小时，使原生质体黏附在培养皿表面聚合膜层。

2.6用于原子力显微镜成像的细胞骨架准备

(1)黏附完成之后用1000μl移液枪小心吸出甘露醇溶液并用1000μl移液枪吸取HBSS溶液洗涤2次培养皿表面，去除已黏附的葡萄原生质体表面甘露醇溶液的残留；

(3)在室温下用10ml 0.5％的TritonX-100与细胞骨架保护缓冲液(表7)混合后浸泡原生质体20分钟，缓冲液用pH＝9.0的Tris-HCl溶液调节pH至7.6～7.8，这样既能在保证裂解原生质膜并溶解其他可溶蛋白质的前提下又不至于损伤细胞骨架结构；期间将培养皿放置在显微镜下观察裂解原生质膜和去除可溶性蛋白质的情况。浸泡完之后用1000μl移液枪小心吸取除去处理溶液；

表7细胞骨架保护缓冲液

(4)最后用10ml超纯水洗涤培养皿表面，洗去缓冲液，并在室温干燥20分钟，即可用AFM对其扫描成像，置于培养皿中的干燥细胞骨架样本可于4℃冰箱保存24小时之内观察。

2.7细胞骨架的扫描观察

由德国JPK公司生产的型号为Nano Wizard 310800的原子力显微镜(AFM)用于研究观察。将处理好的培养皿固定在AFM的夹盘上，使用标准轻敲模式对已经干燥的细胞骨架样本表面进行扫描观察，试验所用扫描探针为德国JPK公司RTESP7型号探针。

3、结果与分析

3.1光学显微镜下观察制备纯化后的葡萄原生质体

将加入了酶解液的美洲沙地葡萄微管蛋白标记系(V.rupestris expressingGFP-AtTUB6)瞬时悬浮细胞在25℃、30rpm摇床上避光酶解14小时并通过30μm细胞筛过滤纯化之后可以获得单个分离且状态稳定的葡萄原生质体(图2)。

3.2倒置荧光显微镜观察葡萄原生质体黏附固定：

室温下，保持葡萄原生质体处在浓度为0.4mol/L的甘露醇液体环境中，在质子化多巴胺自氧化聚合膜表面黏附2个小时，可观察到葡萄原生质体稳定的黏附固定在薄膜培养皿表面。吸取制备纯化后200μl的葡萄原生质体中有约80个分散的原生质体，约75％能够分散且稳定黏附在培养皿表面(图3)。

3.3倒置荧光显微镜观察用于原子力显微镜成像的葡萄细胞骨架制备过程

用0.5％TritonX-100与缓冲液处理原生质体过程中，观察到原生质膜裂解过程(15分钟，图4a)，周围出现杂质(原生质膜杂质、原生质体裂解释放的细胞器和剩余可溶蛋白质等)。通过1.0％福尔马林溶液固定、HBSS溶液清洗和超纯水清洗室温干燥20分钟后，细胞结构如图4b)。图4代表，一次独立实验中的约60个原生质体在15分钟内质膜裂解并露出细胞骨架的过程。

3.4原子力显微镜扫描观察细胞骨架

(1)用AFM扫描观察原生质膜裂解露出细胞骨架样本的原生质体，成像时扫描得到一个原生质膜上剩余不溶蛋白质、细胞核和细胞骨架塌陷到培养皿表面的结构。中间高亮部分为细胞核结构，周围白色丝状为细胞骨架和不溶蛋白质(图5)。

(2)将图4中的细胞骨架结构进一步放大扫描可观察到多处有约7nm变化高度的微丝蛋白结构(图6白色箭头)，剩余的亮白色大小不一且分布不均匀的为质膜上其他剩余不溶的蛋白质(图6黑色箭头所指)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将植物愈伤组织表面处于旺盛分裂期的细胞制成细胞团，取细胞转移到液体培养基中，在黑暗25℃下，转速为200rpm的摇床中振荡培养，诱导瞬时悬浮细胞系；

3)将酶解完成后的混合培养液过滤去除未酶解的细胞团，收集滤液在室温下用离心机在400rpm离心10分钟，去除上清液保留原生质体沉淀以进行纯化，添加甘露醇溶液，将原生质体重悬待用；

4)用盐酸多巴胺溶液和Tris-HCl缓冲溶液在室温下浸泡处理塑料培养皿，除去多巴胺溶液和Tris-HCl缓冲溶液，用Tris-HCl缓冲液和甘露醇溶液分别在室温下浸泡培养皿，在培养皿表面制备质子化多巴胺自氧化聚合膜；

5)将制备的原生质体甘露醇溶液滴加于处理好的培养皿中；

6)原生质体黏附完成之后，去除甘露醇溶液，用表面活性剂与细胞骨架保护缓冲液浸泡原生质体20分钟以固定原生质体，洗去表面活性剂与细胞骨架保护缓冲液，室温下干燥，即可用于AFM扫描成像。

2.根据权利要求1所述的一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，步骤1)中液体培养基的组成为：MS培养基粉末4.3g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾200mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素1mg/L，2,4-D 0.2mg/L，用KOH和HCl调节pH至5.8，121℃高温高压灭菌20分钟。

3.根据权利要求1所述的一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，步骤2)中酶解液包括：MES5mmol/L，CaCl₂0.02mol/L，KCl 0.01mol/L，甘露醇0.4mol/L，果胶酶0.05％(m/m)和纤维素酶1.0％(m/m)。

4.根据权利要求1所述的一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，步骤2)中酶解条件为：在转速为30rpm摇床上避光酶解，酶解时间为12～14小时，酶解温度控制在24～26℃。

5.根据权利要求1所述的一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，步骤3)中过滤采用30μm孔径的尼龙网格滤膜。

6.根据权利要求1所述的一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，步骤3)中纯化采用原生质体纯化洗液，包括以下组分：NaCl 155mmol/L，CaCl₂125mmol/L，ME S 1.5mmol/L，KCl 5mm/L，葡萄糖5mm/L。

7.根据权利要求1所述的一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，步骤6)中表面活性剂选用聚乙二醇辛基苯基醚。

8.根据权利要求1所述的一种适用于原子力显微镜观察多年生果树细胞骨架的方法，其特征在于，步骤6)中细胞骨架保护缓冲液包括：Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 0.14mol/L，MgCl₂5mmol/L，和聚乙二醇60004％(m/m)。