CN108486036A - 一种毛白杨胚囊的分离方法 - Google Patents

Abstract

利用酶解‑解剖法结合吸吹的方法，从新鲜毛白杨胚珠中分离得到了完整的胚囊，获得率高达8.7%；同时筛选出分离毛白杨胚珠的混合酶液成分包括半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、甘露醇、BSA，酶解处理后经过醋酸洋红染色和透明处理，在倒置显微镜下观察，看到了完整清楚的毛白杨胚囊的形态与内部结构，呈长椭圆形，大小为2.52µm左右，单珠被，5‑6层珠心细胞，珠孔端有卵器细胞存在，合点端有类似反足细胞的结构。该技术方案同样可应用于长寿花的胚囊分离中。

Description

一种毛白杨胚囊的分离方法

技术领域

本发明涉及一种植物胚囊的分离与提取的步骤，具体为毛白杨及长寿花的分离与提取。

背景技术

动物和低等植物而言进行精、卵细胞的离体操作实验相对容易，原因是在其受精过程中，精细胞与卵细胞的融合是在脱离或半脱离母体的状态下完成的，因此取得的研究结果也较为深入。然而高等植物则不同,其卵细胞深藏在子房中的胚珠深处，为卵细胞的发育机理和离体操作研究带来了很大的困难。利用分离的精细胞、卵细胞在体外诱导融合、重演受精过程的离体受精技术排除了体细胞组织的干扰,使定点追踪受精过程中卵细胞由受精引起的细胞和分子变化得以实现,这也是目前研究受精机制的主要有效手段。分离植物生活卵细胞是进行植物生殖细胞工程研究的基础之一,而卵细胞位于胚囊之中,因此分离生活胚囊是分离生活卵细胞的第一步。而分离的胚囊可以观察到卵细胞进而可利用一定的方法得到卵细胞，卵细胞不仅可以用以开展离体受精研究,也可提供用分子生物学方法研究被子植物卵细胞发育和合子发育机理的实验基础。前苏联学者最早采用酶解法分离胚珠得到生活胚囊。我国学者在金鱼(Antirrhinum majus L.)、烟草(Nicotiana tabacum)中进行了分离生活胚囊的研究工作,目前已从一些植物中分离出生活胚囊及其组分。Kranz等应用分离的玉米(Zea mays L)精、卵细胞体外诱导融合并成功地再生出可育植株。14年后,第二例离体受精实验在水稻中也获得成功。之后从牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)、蓝猪耳(Torenia fournierri Linden.ex Fourn.)和黄花木曼陀罗(Datura aurea)等植物中分离出生活的胚囊或卵细胞等其他结构。

胚囊观察是植物胚胎发育研究中的一个重要方面，经典的方法是石蜡包埋、切片观察，但是由于它制片过程繁琐，耗时长，而且这一方法将立体的结构平面化，必须做大量的连续切片观察，才能抽象出胚囊的真正原貌。这使得植物胚胎学研究不仅难度大，而且工作繁重，耗费研究人员的大量时间和精力，影响着植物胚胎学研究的广泛开展。周嫦、杨弘远和洪亚平等人提出，如果在做胚胎学研究之前，先对胚珠、胚囊等结构进行人工分离，便能建立起有关胚珠和胚囊等结构的立体观念。这样在观察切片时，就可以很容易地判读出各个切片所反映出的结构信息。同时洪亚平(2010)还提出，若将人工分离出来的胚珠、胚囊和卵细胞等微小结构在解剖镜下进行微型包埋、切片和制片，就可以极大地改善植物胚胎学的制片效果和工作效率。然后采用杨弘远提出的整体染色与透明技术，对分离出的胚珠和胚囊等结构进行整体染色与透明，还可以进一步简化植物胚胎学的研究过程。然而，分离植物胚囊和卵细胞并非易事，因为高等植物雌配子体(胚囊和卵细胞)深藏在胚珠的珠心中，而珠心又被层层体细胞包裹。前苏联学者最早采用酶解法酶离胚珠得到胚囊，我国学者在金鱼草、烟草和泡桐中进行了分离胚囊的研究工作。目前已从多种植物中分离出胚囊及其组分，充分表明植物胚囊的分离已经克服了主要的技术障碍。尽管如此，对于一种“新”的植物而言，其胚囊的分离仍然是一个挑战。

毛白杨(Populus tomentosa Carr.)是我国北方重要的乡土树种，也是木本植物研究的模式植物，在我国有很大的栽培面积，其育种学研究具有重要意义。但是，目前有关其胚囊和卵细胞的分离及后续的离体受精等研究未见报道。因此，对毛白杨胚囊和卵细胞进行分离具有一定的理论和实践意义。从毛白杨的生物学特点上看，毛白杨的胚珠小，单珠被，易于酶解；同时，在同一个子房内有很多胚珠，取材十分容易，所以是较为理想的木本植物研究材料。

迄今为止，胚囊分离和卵细胞分离成功的植物品种并不多，尤其是双子叶植物成功的植物品种更少，为了提供更多的植物胚囊发育、生殖学的理论依据，需要增加新的植物胚囊分离的案例，关于长寿花胚囊、卵细胞等的分离未见报道。长寿花(Kalanchoeblossfeldiana Poelln.)，为景天科属多年生常绿多浆植物，叶片翠绿，花朵密集，花色丰富。它既可观叶也可观花，可用于盆栽、花坛布置,有较高的观赏价值，因一年四季都开花，所以在做实验时不会受季节限制，取材方便。而且，长寿花心皮有4，有胚珠无数，倒生胚珠，单珠被，厚珠心，胚囊发育为蓼型，取材较为容易，是进行胚囊分离的理想材料。

发明内容

本发明利用酶解法与解剖法相结合方法，对毛白杨的胚囊进行分离，用人工分离出来的毛白杨胚囊及卵细胞等微小结构，做为单细胞嵌套式PCR技术的试验材料，观察并检测毛白杨雌配子体加倍过程中细胞质内质体和线粒体的DNA含量及其变化情况。同时克服毛白杨胚囊微管免疫荧光定位实验中制片染色效果差的问题，进而提高毛白杨雌配子诱导过程中微管骨架变化及细胞器类核行为观察的工作效率。

毛白杨胚囊的分离方法，具体步骤如下：

(1)取材，取毛白杨雌花序中部开花未授粉、授粉后1-2d的小花；

(2)胚珠的收集与酶解，去掉毛白杨雌花的苞片，在解剖镜下从子房中剥出胚珠，置于混合酶液中，振荡、酶解1-3h后，在Olympus CKX41倒置显微镜下观察胚珠酶解过程，在不含酶液的分离液中分离出胚囊；

(3)染色与透明，对分离出的胚珠和胚囊进行染色或透明处理，所述的染色处理的染色液为1-2％的醋酸洋红；透明处理是将毛白杨花序用卡诺固定液常温固定24h后，放于质量浓度为70-80％的酒精中保存；再依次用质量浓度为40-60％、20-30％，0％的酒精溶液冲洗；加入0.5-2M氢氧化钠溶液50-70℃处理30min，冷却后用清水冲洗；剖开蒴果取出胚珠放入质量浓度为5-15％次氯酸钠溶液中真空浸透1-2h；

所述的胚珠的收集是用尖头镊子去掉雌花的苞片、花盘后，取部分雌花放于培养皿中，然后，在解剖镜下用解剖针固定住子房，再用解剖针从子房的上端向下划破，露出里面的胚珠，将胚珠从子房中挑取出来，即可得到胚珠。

将得到的胚珠迅速转移至混合酶液中，用微量移液器每30min吹打20-30次，使酶液浸没胚珠，并置于10-20℃酶解2-3h，酶解后用微量移液器反复吹打，然后移至分离液中，在倒置显微镜下用解剖针将胚珠外周松散细胞剥去得到珠心，拨开珠心得到胚囊。

所述的混合酶液成分包括质量浓度0.5-2％牛血清白蛋白、8-15％甘露醇(W/V)、0.05-0.2％果胶酶，0.5％-1.5％纤维素酶、0.5％-1.5％半纤维素酶。

所述的混合酶液成分包括质量浓度1％牛血清白蛋白、10％甘露醇(W/V)、0.1％果胶酶，0.5％纤维素酶、0.5％半纤维素酶。

本发明将所述的毛白杨胚囊的分离方法在分离长寿花胚囊上的应用。

上述毛白杨胚囊的分离步骤中，所述的胚珠的酶解过程中，将得到的胚珠迅速转移至混合酶液中，并用吸管吹打，使酶液浸没胚珠，然后酶液于25-28℃，160-170r/min下震荡1.5-2h，震荡酶解后用微量移液器反复吹打，然后移至分离液中，在倒置显微镜下用解剖针将胚珠外周松散细胞剥去得到珠心，拨开珠心得到胚囊。

所述的混合酶液成分包括质量浓度0.5-2％牛血清白蛋白、8-15％甘露醇(W/V)、0.05-0.2％果胶酶，0.5％-1.5％纤维素酶、0.5％-1.5％半纤维素酶。

进一步优选为所述的混合酶液成分包括质量浓度1％牛血清白蛋白、10％甘露醇(W/V)、0.1％果胶酶，0.5％纤维素酶、1.0％半纤维素酶。

所述的步骤(3)中的透明处理步骤中，是将长寿花花期胚珠置于卡诺固定液中，每3小时换一次液，固定20-30小时后转入体积浓度为70％乙醇中，放入冰箱4℃保存备用；再用吸管吸取样品于小瓶中，分别在质量浓度为30％、50％、70％、90％乙醇中脱水，每次脱水1-2小时后在无水乙醇中脱水12小时以上，最后将样品在84消毒液中透明半小时，即可完成该步骤。

本发明的技术方案利用酶解-解剖法结合吸吹的方法，从新鲜毛白杨胚珠中分离得到了大量完整的胚囊。筛选出分离毛白杨胚珠的最佳混合酶液成分和浓度：0.5％半纤维素酶、0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、1％BSA、10％甘露醇；酶解处理2.5h是最适宜的；完整胚囊获得率高达8.7％左右。在倒置显微镜下可以观察到：毛白杨胚囊呈长椭圆形，大小为2.52μm；胚珠经透明处理后，可以观察到毛白杨胚囊为单珠被，5-6层珠心细胞，合点端有类似反足细胞的结构。为杨树卵细胞分离及生殖生物学的研究提供了基础材料，也为杨树的离体受精探索创造了条件，对杨树的转基因研究、远缘杂交育种具有巨大的潜在的应用价值。

利用酶解-解剖的方法可分离完整的长寿花胚囊。在最佳分离条件下，由于胚囊较小，且酶解之后需要手动解剖，最后的胚囊得率很低，2h大约50枚胚珠用于实验，最后只有5-6枚胚囊。但这样的分离数量还是完全可以进行之后的卵细胞、助细胞或中央细胞的分离，也为植物胚囊发育、生殖学的研究创造了条件。

在酶解胚珠时，酶解液浓度是一关键因素，其中果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的浓度过高或过低都会造成分离珠被细胞的粘连或酶解的不充分。渗透压是另一关键因素，甘露醇含量过高易使珠心萎缩，看不清楚里面胚囊的位置，对机械解剖胚囊时造成困难，而且胚囊中细胞也易变形，不易进行细胞学观察，甘露醇含量过低时，酶解液和分离也渗透压较低，细胞膨大，珠被细胞不易酶解，且酶解后珠心或胚囊细胞易破碎。综合分析后确定胚珠酶解的最适条件是1％半纤维素酶+0.5％纤维素酶+0.1％果胶酶+10％甘露醇+1％BSA，酶解时间为2小时。

长寿花胚珠酶解后由于分离细胞与珠心间还存在粘性，经吸管吹打半小时后可得到珠心，但珠心合点端仍留有少量珠被细胞，合点端的细胞外层存在一层角质层，致使合点端细胞不易被酶解。透明处理后可看到长寿花珠被大约有3-4层细胞组成，授粉期的长寿花胚囊处于“七胞八核”成熟期，酶解授粉期的胚珠，分离得到的胚囊成梭状但两极端的细胞核向中央移动。

附图说明

图1毛白杨胚珠的酶解及胚囊分离过程形貌。A.毛白杨雌花(×40)；B.剥去苞片，露出子房的毛白杨雌花(×40)；C.子房中的胚珠(×40)；D.单个胚珠(×200)；E.混合酶液中的胚珠(×100)；F-J.酶解中的的胚珠(×200)；K.酶解中的胚囊(×100)；L-N.胚囊(×200)；O.胚囊(×400)；P-Q.透明处理后的胚珠(×200)；R-S.染色后的胚囊(×200,×400)；T.划破胚囊后，用醋酸洋红染色的周围细胞(×400)；U.西洋杜鹃胚囊(×200)。

图2为长寿花酶解后不经吹打的胚珠在倒置显微镜下的形貌，其中1.C组合酶解后胚珠(100×)；2.E组合酶解后胚珠(100×)；3.G组合酶解后胚珠(100×)。

图3为长寿花胚囊分离过程形貌。其中，1.长寿花胚珠(40×)；2.酶解半小时胚珠(100×)；3.酶解1小时胚珠(100×)；4.酶解1.5小时胚珠(100×)；5.长寿花珠心(100×)；6.长寿花胚囊(100×)。

图4为长寿花不同发育时期的胚珠的形貌。其中，A1，A2，A3.花苞期花型、柱头及胚珠；B1，B2，B3.花开1/3期花型、柱头及胚珠；C1，C2，C3.花开1/2期花型、柱头及胚珠；D1，D2，D3.全部开放期花型、柱头及胚珠；E1，E2，E3.授粉期花型、柱头及胚珠；F1，F2，F3.授完花粉期花型、柱头及胚珠。

图5为长寿花胚珠酶解后的成熟胚珠经醋酸洋红染色的珠心的形貌，其中，E时期透明处理长寿花胚珠(100×)；2.醋酸洋红染色后的长寿花珠心(100×)；3.醋酸洋红染色后的胚囊(100×)。

具体实施方式

实施例1

毛白杨雌花枝于2015年11月采自国家重点林木良种基地山东冠县苗圃，在温室内进行水培催花。分别选取毛白杨雌花序中部不同发育时期的开花未授粉、授粉后1-2d的小花为实验材料。

胚珠的收集与酶解

选取雌配子发育成熟但未授粉的小花，其对应于花的发育阶段为八核胚囊，通常花序长3-4cm，呈黄绿色，柱头四叉，略呈红色时；开花后授粉1-2d的小花。用尖头镊子去掉雌花的苞片、花盘后，取部分雌花放于培养皿中。然后，在解剖镜下左手用解剖针固定住子房，右手的解剖针从子房的上端向下划破，露出里面的胚珠，将胚珠从子房中挑取出来(动作尽量要轻，使胚珠结构不被破坏)。一般情况下，解剖一个子房要20s至35s，能获得2-6枚左右的胚珠。一个完整的毛白杨子房通常含有2-4枚胚珠，但是胚珠并不能全部发育，而且这里的操作追求速度，有些胚珠受到机械损伤，所以不能都被完全剥离出来。多人收集胚珠，在25min-35min内，可以解剖到200-300枚左右的胚珠，这个数量的胚珠可以满足一次实验的需要。

将去掉毛白杨雌花的苞片，在解剖镜下从子房中剥出胚珠，置于混合酶液中，振荡酶解1-3h。对酶液中的酶种类、各种酶的浓度进行了筛选。酶液的基本成分为0.5-2％牛血清白蛋白(BSA)、8-15％甘露醇(W/V)、0.05-0.2％果胶酶(Pectolyse Y-23，Yakult)，附加0.5％-1.5％纤维素酶(Onozuka R-10,Yakult)、0.5％-1.5％半纤维素酶(Sigma公司)，具体见表1，配置好的混合酶液在4℃冰箱静置一夜后，取上清液使用。

。酶解后，在Olympus CKX41倒置显微镜下观察胚珠酶解过程，在不含酶液的分离液中分离出胚囊。

表1酶液配方表

*按照上述表格配制9组混合酶液，均用灭菌双蒸水配制，用1％MES调至pH5.8μm

进行酶解处理时，用解剖针将新鲜的胚珠从子房中取出，立即放入塑料的小培养皿中，加入4-5mL的混合酶液，用手充分摇匀，使胚珠完全浸没在混合酶液中，记录下酶解前胚珠的大小，在Olympus CKX41倒置显微镜下测量长宽，选取9个视野，每个视野范围内随机取20个样本，取平均值作为胚珠的大小(原始数据见表2)。

表2毛白杨胚珠酶解前大小

注：目镜10X，物镜4X，格值为0.25μm

起初，采用摇床振荡方法，转速为100-120r/min。后来对比酶解前后胚珠的大小发现，酶解后的胚珠体积反而增大。经过酶解，胚珠珠被细胞已经松散但未完全脱落。然后，使用吸管吹打法代替摇床振荡法，效果明显，但胚珠结构损坏较多。最后，用微量移液器代替吸管每30min吹打20-30次，酶解温度为室温14℃，酶解结束后，记录下酶解后胚珠的大小，同样选9个视野，每个视野范围内随机取20个样本，测量长宽，取平均值作为胚珠的大小(原始数据见表3)，并且在Olympus CKX41倒置显微镜下观察胚珠酶解过程，分离出完整胚囊大约需要2.5h。将获得的部分胚囊用于染色与透明，部分胚囊转移至PCR管中-80℃冷冻保存备用。

表3毛白杨胚珠酶解后大小

注：目镜10X，物镜4X，格值为0.25

染色与透明

为便于观察胚珠和胚囊的内部结构，对分离出的胚珠和胚囊进行染色与透明处理。染色液采用稀释的醋酸洋红，透明处理方法，包括(1)固定：将毛白杨花序用卡诺固定液常温固定24h后，放于75％的酒精中保存。(2)水合：用50％、25％，0％的酒精溶液冲洗。(3)解离：加入1M氢氧化钠溶液60℃处理30min。冷却后用清水冲洗。(4)剖开蒴果取出胚珠放入10％次氯酸钠溶液中真空浸透2h。

胚囊的分离

毛白杨雌花序为葇荑花序，每一朵雌花很小(图1，A-B)，胚珠更小，通常子房内有2-4枚倒生胚珠(图1，C)。新鲜的胚珠为长椭圆形，外观为乳白色(图1，D)。经酶解20min后，胚珠的外珠被开始破裂(图1,E)，酶液中有脱落的珠被细胞。此时混合酶液中的胚珠，外部已被部分酶解，但是这种现象仅出现在胚珠外部，内部胚囊周围的细胞仍然没有被酶解，在倒置显微镜下可以观察到胚珠的酶解过程(图1,E-I)。继续酶解2.5h后，环绕在胚囊外的细胞和各种组织被酶解松散，在吹打作用下，大部分可以与胚囊分离(图1,J-L)。被分离出的胚囊呈长椭圆形，在合点端都附有一团未离散的胚珠组织(图1,M-O)，表明毛白杨分离胚囊酶解处理时间2.5h是适宜的。另外，胚珠的酶解产物除了胚囊以外，还有大量的珠被和珠心组织细胞。

胚囊的细胞学观察

由图1，L-O中可见，毛白杨胚珠经酶解去除珠被细胞以后，整个胚囊可以完全裸露，只是在合点端仍然有一团不易被酶解的珠被组织。经醋酸洋红染色后，在珠孔端上部有卵器细胞存在(图1R,S)。为了观察到胚囊的内部结构，尝试把毛白杨胚珠进行透明处理，在倒置显微镜下继续观察，可以清楚地看到毛白杨胚囊为单珠被，由5-6层珠心细胞组成，胚囊呈长椭圆形(图1,P)，在合点端看到类似反足细胞的结构(图1,Q)。

考虑到胚囊细胞的分离可能在不同植物之间有差异，我们以西洋杜鹃为材料，也进行了胚囊分离实验，同等酶解条件下，得到了胚囊，但是在西洋杜鹃胚囊表面有一层透明的、类似胼胝体的细胞，不易被酶解(图1,U)。再次说明，利用酶解-解剖方法分离成熟的胚囊，杨树是较为理想的木本植物研究材料。

分离条件的筛选

酶液的渗透压

酶液中的渗透压是影响胚囊细胞分离效果的一个重要因素。渗透压过低时，胚囊细胞很难释放，在操作时胚囊细胞易破裂；渗透压过高时，释放的胚囊细胞易收缩，对细胞生活力的损伤较大。

酶液的成分和浓度

通常在没有酶的情况下，很难解剖胚珠，加入适当的酶，经过一段时间的酶解后，解剖胚珠的操作将相对容易进行。不同酶的组合和浓度对分离效果有明显的影响。

果胶酶的酶解性能非常强，对子房壁和胚珠体细胞的的软化有重要的作用，没有Y-23果胶酶，仅用其他酶很难剥出胚囊。纤维素酶和半纤维素酶的作用主要是使胚囊细胞原生质体化，易于从胚珠中释放出。半纤维素酶、纤维素酶不同浓度的组合及酶解结果见表4、5、6、7。可以看出，当半纤维素酶浓度为0.5％，纤维素酶浓度为0.5％时，混合酶液中散落的珠被细胞最多，酶解得到的完整胚囊最多(8.7％)。当半纤维素酶浓度为1％，纤维素酶浓度为0.5％时，混合酶液中散落的珠被细胞最少，大多数粘成细胞团，酶解得到的胚囊最多(7.14％)。当纤维素酶浓度为1.0％时，混合酶液中散落的珠被细胞最多，在酶解1h时，可以观察到胚囊，然而在酶解2h后，几乎观察不到胚囊组织。当半纤维素酶浓度为1.5％，纤维素酶浓度为1.5％时，混合酶液中散落的珠被细胞最多，酶解得到的完整胚囊最多(4.26％)。

表4纤维素酶浓度对毛白杨胚珠酶解的影响I

表5纤维素酶浓度对毛白杨胚珠酶解的影响II

表6纤维素酶浓度对毛白杨胚珠酶解的影响III

从以上9种混合酶液的酶解效果看，0.5％半纤维素酶、0.5％纤维素酶组合和1.0％半纤维素酶、0.5％纤维素酶组合的酶解效果较好。从表1和表4-5中可以看出，两种组合主要的差别是半纤维素酶的浓度不同。

表7显示，当纤维素酶浓度为0.5％时，随着半纤维素酶浓度的升高，酶解所得的胚囊反而减少，散落在混合酶液中的珠被细胞数量也减少，并且粘连成团，说明半纤维素酶浓度升高以后，对胚囊细胞的伤害较大。

考虑到成本最低的原则，同时增加牛血清蛋白BSA提高各种酶的作用活性，最后确定毛白杨胚囊细胞分离的混合酶液的成分和浓度以0.5％半纤维素酶、0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、10％甘露醇、1％BSA较为适宜。

表7半纤维素酶浓度对毛白杨胚珠酶解的影响

当毛白杨花序长3-4cm，呈黄绿色，柱头分为四叉(图1-B)，略显红色时，胚囊发育成熟，形成八核胚囊。毛白杨基生胎座上生2-4枚胚珠，通常1-2枚发育，其余败育。因此，本研究在取材时，一方面选取花序外部形态发育成熟未授粉的小花，其对应于花的发育阶段为八核胚囊。另一方面，选取开花授粉1-2d的小花，尽量保证小花的胚珠发育正常，胚囊处在成熟期。分离出的胚囊经过透明处理，观察到毛白杨的胚囊为蓼型，单珠被，厚珠心(图1-P,Q)。

本发明的技术方案采用酶解-解剖法：选择适当的酶液，将胚珠放入酶液中进行酶解，在解剖镜下将胚囊、卵细胞等从胚珠内解剖出来。操作相对简单，速度快，成本低。使用摇床振荡辅助酶解，对比酶解前后胚珠大小，发现酶解后胚珠的体积反而增大，镜检观察发现是胚珠酶解松散的珠被细胞未脱落。然后用吸管吸吹，珠被细胞脱落效果明显，但是胚珠损伤较多。最后用微量移液器代替吸管每30分钟吹打20-30次，并在倒置显微镜在OlympusCKX 41下观察酶解情况，能够分离出完整胚囊。

综上所述，本研究利用酶解-解剖法结合吸吹的方法，从新鲜毛白杨胚珠中分离得到了完整的胚囊，获得率高达8.7％左右；同时筛选出分离毛白杨胚珠的最佳混合酶液成分和浓度为0.5％半纤维素酶、0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、10％甘露醇、1％BSA，pH值5.8；酶解处理2.5h是最适宜的。镜检观察发现毛白杨胚囊呈长椭圆形，大小为2.52μm左右，单珠被，5-6层珠心细胞，珠孔端有卵器细胞存在，合点端有类似反足细胞的结构。

利用酶解-解剖的方法可分离完整的长寿花胚囊。在最佳分离条件下，由于胚囊较小，且酶解之后需要手动解剖，最后的胚囊得率很低，2h大约50枚胚珠用于实验，最后只有5-6枚胚囊。但这样的分离数量还是完全可以进行之后的卵细胞、助细胞或中央细胞的分离，也为植物胚囊发育、生殖学的研究创造了条件。

在酶解胚珠时，酶解液浓度是一关键因素，其中果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的浓度过高或过低都会造成分离珠被细胞的粘连或酶解的不充分。渗透压是另一关键因素，甘露醇含量过高易使珠心萎缩，看不清楚里面胚囊的位置，对机械解剖胚囊时造成困难，而且胚囊中细胞也易变形，不易进行细胞学观察，甘露醇含量过低时，酶解液和分离也渗透压较低，细胞膨大，珠被细胞不易酶解，且酶解后珠心或胚囊细胞易破碎。综合分析后确定胚珠酶解的最适条件是1％半纤维素酶+0.5％纤维素酶+0.1％果胶酶+10％甘露醇+1％BSA，酶解时间为2小时。

长寿花胚珠酶解后由于分离细胞与珠心间还存在粘性，经吸管吹打半小时后可得到珠心，但珠心合点端仍留有少量珠被细胞，说明合点端的细胞外层可能存在一层角质层，致使合点端细胞不易被酶解。透明处理后可看到长寿花珠被大约有3-4层细胞组成，授粉期的长寿花胚囊处于“七胞八核”成熟期，酶解授粉期的胚珠，分离得到的胚囊成梭状但两极端的细胞核向中央移动。

实施例2

实验材料购买于保定市东二环花鸟鱼市场温室内生长良好的长寿花。长寿花是多年生肉质草本花期为2-5月。分别采集开花前2天到开花后1周的花。去除花瓣、花柄和花萼后，露出子房,用解剖针取出胚珠，备用。

酶解胚珠及观察

依据长寿花胚珠和胚囊的特点以及不同酶的特性，配置好9种酶液组合，将配好的酶液放到4℃冰箱中过夜沉淀保存。每次实验时，只需取1-2mL放入4mL小离心管中，并将离心管置于放有冰块的冰盒中，用解剖针挑取胚珠放到酶液中，并用吸管吹打，使酶液浸没胚珠，然后酶液于25-28℃，160-170r/min恒温震荡1.5-2h。每半小时挑取胚珠放到分离液中，置于Olympus CKX41倒置显微镜下观察。震荡酶解后用微量移液器反复吹打，然后移至分离液中，在倒置显微镜下用解剖针将胚珠外周松散细胞剥去得到珠心，珠心合点端仍有一团不易去除的细胞。轻轻划开珠心得到胚囊。用微量移液器吸取少量含珠心和胚囊的溶液，放在载玻片上，用醋酸洋红进行染色，染色后在Olympus CKX41倒置显微镜下观察。

表8酶配方表

透明处理

为确定长寿花各个花期胚囊的发育状态和内部细胞的位置，对长寿花胚珠进行透明处理。透明处理分以下几步：(1)将所取各花期胚珠置于卡诺固定液中，每3小时换一次液，固定24小时后转入70％乙醇中，放入冰箱4℃保存备用；(2)用吸管吸取1mL样品于青霉素小瓶中，在30％、50％、70％、90％乙醇中脱水，每次脱水1小时。之后在无水乙醇中脱水12小时以上；(3)乙醇梯度脱水后，将样品在84消毒液中透明半小时。(4)将透明后的胚珠置于载玻片上，用84消毒液封片在光学显微镜下观察。

酶解液浓度的筛选

不同酶解液的浓度和组合对胚囊的分离效率和胚囊中的细胞状态有明显影响。果胶酶的酶解效果较强，对胚珠珠被细胞的酶解有很大的作用。当果胶酶浓度低时，胚珠酶解效果不佳，珠被细胞不易剥落，当果胶酶浓度高时，则不仅会使分离掉落的珠被细胞间发生粘连，还会造成淀粉物质对珠心的易吸附性。经多次试验控制分离中果胶酶浓度，确定为0.1％。另外，酶解液和分离液的渗透压也是分离出胚囊的重要因素。用甘露醇维持渗透压，当甘露醇浓度高时，胚囊细胞易发生皱缩或者因表皮细胞的萎缩而发生迁移，致使细胞核在胚囊中的位置发生变化，当甘露醇浓度低时，珠心或者胚囊及胚囊中的细胞发生破裂，而且活性降低，经多次试验，确定甘露醇的浓度为10％。BSA可以增加各种酶的作用活性。

纤维素酶和半纤维素酶的主要作用是使胚囊细胞原生质体化，易于从胚囊中逃逸出来，而且相互作用可使果胶酶酶解效果加强，使分离掉落的细胞间粘性降低。胚珠在酶解后不经吹打前，其珠被细胞因为酶解原因而变得蓬松，但是由于细胞之间的粘性不会掉落，导致酶解后的胚珠较酶解前大，在倒置显微镜下，抽出10个胚珠样品通过目镜测微尺测得各个酶浓度组合的这10个样品酶解前后的长和宽，计算出平均周长，然后比较各个组合的新周长：原周长和吹打后所获得的珠心数见表8。

表9酶解后各组合效果比较(目镜10×，物镜4×,格值为0.25μm)

发现在以上9个酶解液组合中，C、D、G三个组合的效果较好。将酶解后不经吹打的胚珠在倒置显微镜下观察(见图2-1，2，3)，可见D、G两个组合酶解效果较C好，即纤维素酶浓度为0.5％时，酶解效果最佳，而其中以D组合的周长比和珠心得率较高，说明在半纤维素酶浓度为1％时，酶解效果最佳。故最佳酶解液组合为D组合，即1％半纤维素酶+0.5％纤维素酶+0.1％果胶酶+10％甘露醇+1％BSA。

胚囊的分离

长寿花子房为4心皮，内有胚珠无数，肉眼观察长寿花胚珠为白色小颗粒，在体式解剖镜下则呈透绿色、椭圆状(见图3-1)，大约10分钟可剖取100枚生活胚珠。胚珠酶解半小时后，珠被出现裂痕，细胞开始出现破裂(见图3-2)。1小时后，虽然周围散落细胞增多，但胚珠看起来变化不大(见图3-3)。在酶解1.5小时后周围散落细胞增多，珠被细胞因酶解明显变得更加松散(见图3-4)，说明胚珠在1-1.5小时这短时间中酶解速度加快。2小时后，经过吹打，胚珠珠被细胞大部分散落只有合孔端还残留部分细胞。由此可见分离出完整珠心大约需要2h，但胚囊不能直接通过酶解得到，表明珠心的表皮细胞特殊，不易被酶解。故只能手动解剖出胚囊。

将酶解后的珠心转移到分离液中，在倒置显微镜下观察发现，珠心呈长椭圆状，可以隐约看到珠心内的胚囊，胚囊和珠心的珠孔端、合点端紧密相连(见图3-5)。用1mm解剖针在珠心一个侧面划开，同时用镊子轻轻挤压另一端或另用一个无针头的解剖针将胚囊分离出来。分离出的胚囊见图3-6。若是要得到卵细胞或中央细胞可直接划破合孔端，挤压珠孔端即可。最后将分离出的长寿花胚囊及分离液放入80℃冰箱中保存备用。

胚囊成熟期的筛选

胚珠中胚囊母细胞经减数分裂产生大孢子，为单倍体，然后大孢子发育成胚囊，胚囊是长寿花的雌配子体，长寿花胚囊为蓼型，所以成熟胚囊应为八核七细胞结构。不同花期的长寿花，胚囊内部细胞结构不同。在光学显微镜下观察花苞期(A)、花开1/3期(B)、花开1/2期(C)、全部开放期(D)、授粉期(E)、授完花粉期(F)的胚囊结构，并且在体式显微镜下观察不同花期的花、柱头、胚珠的外部形态大小，进而找到“七胞八核”时期，为以后卵细胞、中央细胞和助细胞的分离和观察提供理论依据。

由图4可见，随着长寿花渐渐开放，胚珠也会慢慢变大，B期开始柱头开始膨大，到D期和E期胚珠大小基本一致，说明胚珠从D期开始缓慢生长。柱头从花开1/3时候开始弯曲，到D期柱头发亮，说明正处于可授期，E期柱头上有黄色粉末说明处于授粉阶段，F期柱头破裂，说明花已授粉，花粉管破裂。由此可见，D、E、F是最有可能的胚囊成熟期。选取全部开放、授粉、授完花粉的长寿花胚珠进行透明处理，在倒置显微镜下观察到(见图4-1)，长寿花胚珠为单珠被，且珠被较厚有3-4层细胞组成，胚囊为长椭圆状与图3-6基本一致。这三个时期中，在处于E期即授粉期的胚珠的合点端出现类似反足细胞的结构，说明此时期胚囊处于成熟期，即“七胞八核”时期。

成熟胚囊的细胞学观察

将酶解后的成熟胚珠的珠心经醋酸洋红染色后，在倒置显微镜下观察可看到胚囊的中央细胞核结构，没有观察到卵细胞、反足细胞和助细胞(见图5-2)。紧接着对分离的胚囊进行醋酸洋红染色，在显微镜下观察可见类似于“七胞八核”结构(见图5-3)。但分离出的胚囊中的细胞核的位置发生变化，其合孔端和珠孔端的细胞核向中央移动。

Claims (9)

1.一种毛白杨胚囊的分离方法，其特征在于，

（1）取材，取毛白杨雌花序中部开花未授粉、授粉后1-2d的小花；

（2）胚珠的收集与酶解，去掉毛白杨雌花的苞片，在解剖镜下从子房中剥出胚珠，置于混合酶液中，振荡、酶解1-3h后，在Olympus CKX41倒置显微镜下观察胚珠酶解过程，在不含酶液的分离液中分离出胚囊；

（3）染色与透明，对分离出的胚珠和胚囊进行染色或透明处理，所述的染色处理的染色液为1–2%醋酸洋红；透明处理是将毛白杨花序用卡诺固定液常温固定24h后，放于质量浓度为70-80%的酒精中保存；再依次用质量浓度为40-60%、20-30%，0%的酒精溶液冲洗；加入0.5-2M氢氧化钠溶液50-70℃处理30min，冷却后用清水冲洗；剖开蒴果取出胚珠放入质量浓度为5-15%次氯酸钠溶液中真空浸透1-2h。

2.权利要求1所述的毛白杨胚囊的分离方法，其特征在于，所述的胚珠的收集是用尖头镊子去掉雌花的苞片、花盘后，取部分雌花放于培养皿中，然后，在解剖镜下用解剖针固定住子房，再用解剖针从子房的上端向下划破，露出里面的胚珠，将胚珠从子房中挑取出来，即可得到胚珠。

3.权利要求2所述的毛白杨胚囊的分离方法，其特征在于，将得到的胚珠迅速转移至混合酶液中，用微量移液器每30min吹打20-30次，使酶液浸没胚珠，并置于10-20℃酶解2-3h，酶解后用微量移液器反复吹打，然后移至分离液中，在倒置显微镜下用解剖针将胚珠外周松散细胞剥去得到珠心，拨开珠心得到胚囊。

4.权利要求1所述的毛白杨胚囊的分离方法，其特征在于，所述的混合酶液成分包括质量浓度0.5-2%牛血清白蛋白、8-15%甘露醇(W/V) 、0.05-0.2%果胶酶，0.5%-1.5%纤维素酶、0.5%-1.5%半纤维素酶。

5.权利要求2所述的毛白杨胚囊的分离方法，其特征在于，所述的混合酶液成分包括质量浓度1%牛血清白蛋白、10%甘露醇(W/V) 、0.1%果胶酶，0.5%纤维素酶、0.5%半纤维素酶。

6.权利要求1-5任一项所述的毛白杨胚囊的分离方法在分离长寿花上的应用。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的胚珠的酶解过程中，将得到的胚珠迅速转移至混合酶液中，并用吸管吹打，使酶液浸没胚珠，然后酶液于25-28℃，160-170r/min下震荡1.5-2h，震荡酶解后用微量移液器反复吹打，然后移至分离液中，在倒置显微镜下用解剖针将胚珠外周松散细胞剥去得到珠心，拨开珠心得到胚囊。

8.权利权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的混合酶液成分包括质量浓度1%牛血清白蛋白、10%甘露醇(W/V) 、0.1%果胶酶，0.5%纤维素酶、1.0%半纤维素酶。

9.权利权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的步骤（3）中的透明处理步骤中，是将长寿花花期胚珠置于卡诺固定液中，每3小时换一次液，固定20-30小时后转入体积浓度为70%乙醇中，放入冰箱4℃保存备用；再用吸管吸取样品于小瓶中，分别在质量浓度为30%、50%、70%、90%乙醇中脱水，每次脱水1-2小时后在无水乙醇中脱水12小时以上，最后将样品在84消毒液中透明半小时，即可完成该步骤。