CN113249296A

CN113249296A - 一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法

Info

Publication number: CN113249296A
Application number: CN202110737134.1A
Authority: CN
Inventors: 彭传燚; 徐学丰; 朱海燕; 蔡荟梅; 宛晓春
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113249296B

Abstract

本发明公开了一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法，属于木本植物原生质体制备技术领域。本发明以茶树自然茶园中茶树根、嫩茎和叶片(嫩叶和老叶)等新鲜器官组织及多品种嫩片(紫鹃、黄山白茶、黄魁和舒茶早)为研究材料进行复合酶解，释放后经纯化获得的原生质直径小于20μm，细胞器清晰可见；原生质体数量大于10⁶/g(FW)，不同茶树器官的原生质体活力均大于88％。该制备方法具有稳定、高效、操作简单和茶树材料要求低等优点，为茶树基因改良和基因功能等研究提供了技术支持。

Description

一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法

技术领域

本发明涉及一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法，属于木本植物原生质体制备技术领域。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属于山茶科山茶属，为多年生木本植物，是世界三大植物饮料之一。茶树叶片中含有丰富的儿茶素、茶氨酸等特征性次生代谢产物，使得茶叶具有独特的色、香、味品质，是饮茶健康功效的化学物质基础。因此，茶树次生代谢调控机制一直是茶叶品质化学研究的热点。众所周知，茶树属于自交不亲和且高杂合的多年生木本植物，其转基因技术和组培技术的一直是制约茶树生物学发展的“卡脖子”技术难题，一些重要的影响茶叶品质的关键基因无法进行同源验证，只能在烟草和拟南芥等模式植物中进行异源验证，这大大降低了茶树次生代谢和功能基因的研究水平。

植物原生质体具有活细胞的性质，可以直接摄取外源的DNA融合形成杂种细胞，是遗传转化和基因功能研究的理想受体。离体的原生质体具有细胞全能性，在无菌条件下能够生长、分化和再生成完整的植株。因此，茶树功能基因的研究可以借助于原生质体融合来开展茶树基因的亚细胞定位和相互作用等研究，利用原生质体融合进行体细胞杂交，有效的克服了茶树杂交不亲和的生殖障碍。目前，从高等植物中分离得到高制备率和高活力的原生质体，大多是草本植物，而木本植物较难分离得到令人满意的原生质体。茶树多器官(根、茎、嫩叶和老叶)原生质体的分离纯化研究鲜有报道，由于茶树的叶片和根系中纤维素、多酚和原花青素等含量高，其分离得到的原生质体的产率、完整性和活力均较低，且对茶树来源要求较高；茶树茎组织的原生质体的制备还未有报道。

发明内容

[技术问题]

现有技术中，针对茶树多器官原生质体的分离纯化的通用提取方法鲜有报道，本发明实际要解决的技术问题是提供一种高得率、高活力茶树原生质体的提取方法。

[技术方案]

本发明方法用自然茶园中茶树新鲜组织(根、茎、嫩叶和老叶)作为实验材料，由新鲜组织采集、原生质体酶解、释放和纯化四个步骤完成；该方法的分离材料易于得到，提取操作简单，分离得到的原生质体数量多、得率高，活力好、完整性好，为原生质体融合奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种茶树新鲜组织原生质体的提取方法，所述方法为将新鲜采摘的茶树器官灭菌并片切，将片切后的茶树器官使用酶解液处理，得到原生质体后再利用碘克沙醇或蔗糖进行纯化；所述酶解液包括纤维素酶R-10和离析酶R-10；所述碘克沙醇的浓度为31～65.2％，蔗糖的浓度为20～30％。

具体地，可采用以下步骤：

(1)采集茶树器官并灭菌；

(2)将灭菌后的茶树器官片切，并转移至酶解液中进行反应；

(3)收集步骤(2)中的酶解液，过滤并离心收集沉淀；

(4)利用碘克沙醇或蔗糖悬浮步骤(3)中的沉淀，离心并收集下层原生质体。

在一种实施方式中，步骤(1)中，茶树器官为茶树的根(须根)、茎(未木质化)、新鲜嫩叶(一芽二叶)或新鲜老叶(三至五叶)。

在一种实施方式中，步骤(1)中，灭菌的方式为用灭菌的镊子将茶树器官置于70～75％酒精，灭菌30～40s，用灭菌水冲洗至少3遍。

在一种实施方式中，步骤(2)中，将茶树器官片切为0.5-1.0mm宽/厚的薄片或小细条。

在一种实施方式中，步骤(2)中，茶树器官和酶解液的添加比例为(0.5～1.5)g：(10～20)mL.

在一种实施方式中，步骤(2)中，酶解液的配制：配制含有30mM MES(pH＝5.7)，0.3M甘露醇和30mM KCl混合溶液，于70℃条件下水浴3-5min，冷却后，将纤维素酶R-10和离析酶R-10溶于其中，最后加入10mM CaCl₂和0.1％BSA。

在一种实施方式中，所述纤维素酶R-10和离析酶R-10的添加量分别为质量体积比的1.5～2.5％和0.2～0.8％。

在一种实施方式中，步骤(2)中，酶解的方法为，将含有酶解液的培养皿放置于抽滤瓶中，在真空和避光条件下酶解30-60min后，在40rpm，25℃恒温培养箱中酶解4-12h。

在一种实施方式中，步骤(3)中，酶解完成后，用80～120μm的无菌细胞筛过滤，滤液在2～6℃温度下180～220g离心2～4min，去除上清液，收集沉淀；利用预冷的5mL洗涤液溶液重悬沉淀，于2～6℃温度180～220g离心2～4min，去除上清液。

在一种实施方式中，所述洗涤液的配方为，3.5～4.5mM MES(pH＝5～6)，140～160mM NaCl，110～130mM CaCl₂和2～8mM KCl。

在一种实施方式中，步骤(4)中，离心的条件为，2～6℃温度下45～55g离心2～4min。

有益效果：

(1)本发明以茶树自然茶园中茶树根、嫩茎和叶片(嫩叶和老叶)等新鲜器官组织及多品种嫩片(紫鹃、黄山白茶、黄魁和舒茶早)为研究材料进行复合酶解，释放后经纯化获得数量多、活力高的原生质体，该制备方法具有稳定、高效、操作简单和茶树材料要求低等优点，为茶树基因改良和基因功能等研究提供了技术支持。

(2)原生质体直径小于20μm，细胞器清晰可见；原生质体数量大于10⁶/g(FW)，不同茶树器官的原生质体活力均大于88％。

(3)原生质体分离纯化效率高于现有文献报道，与模式植物原生质体的制备效率相当；其中，首次实现对茎组织的原生质体分离纯化。

附图说明

图1酶解液图(透亮的淡黄棕色)；

图2根原生质体；a:100倍目镜；b：400倍目镜；

图3嫩叶原生质体；a:100倍目镜；b：400倍目镜；

图4老叶原生质体；a:100倍目镜；b：400倍目镜；

图5茎原生质体；a:100倍目镜；b：400倍目镜；

图6不同品种茶树嫩叶原生质体图(100倍目镜)，a:黄魁；b:舒茶早；c:黄山白茶；d:紫鹃；

图7不同品种茶树嫩叶原生质体图(400倍目镜)。a:黄魁；b:舒茶早；c:黄山白茶；d:紫鹃。

具体实施方式

原生质体活力测定：FDA染色法，称量2mg FDA溶于2ml丙酮中，取20μl FDA溶液加入原生质体中，5min后，镜检；

原生质体活力(％)＝荧光视野下原生质体总数/明场视野下原生质体总数*100％。

纤维素酶R-10：购买自Yakult(Japan)，酶活>10000U/g。

离析酶R-10：购买自Yakult(Japan)，酶活>3000U/g。

果胶酶Y-23：购买自Yakult(Japan)，酶活>1000U/g。

实施例1

(1)在自然茶园中选取长势较好、无病虫害的茶树，采集根(须根)作为待提取样品；

(2)用灭菌的镊子将根置于70％酒精，灭菌30s，用灭菌水冲洗3遍；

(3)在冰浴的条件下，用灭菌的刀片快速将根(1.0g)切成0.5-1.0mm宽/厚的薄片或小细条，并迅速转移至盛有酶解液(15mL)的培养皿中，使其完全沉浸于酶解液中；

酶解液配制：配制含有30mM MES(pH＝5.7)，0.3M甘露醇和30mM KCl混合溶液，于70℃条件下水浴3-5min，冷却后，将2％(w/v)纤维素酶R-10，0.5％(w/v)离析酶R-10溶于其中，最后加入10mM CaCl₂和0.1％BSA。配制完成后，用0.45μm针式过滤器过滤除菌，酶液应呈透亮的淡黄棕色(图1)，每10mL分装于15mL离心管中，-20℃保存，备用。酶液需现配现用，不宜长期保存，以减少酶活性的损失。

(4)将培养皿放置于抽滤瓶中，在真空(-0.1MPa)和避光条件下酶解30-60min，促使酶解液渗透至细胞间隙，提高酶解效率；

(5)真空酶解后，在40rpm，25℃恒温培养箱中酶解4-12h，培养皿溶液慢慢变绿，可在显微镜下观察到大量原生质体，监测原生质体释放情况；

(6)酶解完成后，用100μm的无菌细胞筛过滤，除去未酶解的叶片残渣。4℃温度下200g离心3min，去除上清液，绿色沉淀即为原生质体；将沉淀加入预冷的5mL洗涤液W5(4mMMES(pH＝5.7)+154mM NaCl+125mM CaCl₂+5mM KCl)溶液游离原生质体，于4℃温度下200g离心3min，去除上清液；

(7)将沉淀用预冷1mL的65.2％碘克砂醇悬浮，4℃温度下50g离心3min，界面明显分为绿色的杂质层(上层)和清澈透明的碘克砂醇层(下层，纯化后原生质体)。

结果如图2所示，取步骤(7)下层在显微镜下观察，即可观察到大量纯净的茶树根的原生质体，直径小于20μm；经血球计数板计数原生质体数量为2.8±0.4×10⁶/g(FW)；采用FDA染色法计数原生质体的活力，结果表明原生质体活力为90±1.5％；

实施例2

原生质体的提取方式同实施例1，区别在于，步骤(1)中的待提取样品选用茶树的新鲜嫩叶(一芽二叶)和新鲜老叶(三至五叶)。结果如图3和图4所示，不管是茶树的嫩叶还是老叶，提取得到的原生质体中细胞器清晰可见，直径小于20μm；经血球计数板计数原生质体数量大于10⁶/g(FW)，且嫩叶的原生质体数量(6.13±0.72×10⁶/g(FW))大于老叶4.68±0.55×10⁶/g(FW)；采用FDA染色法计数原生质体的活力，结果表明嫩叶原生质体活力为94±2.6％，老叶原生质体活力为89±3.2％。

针对不同品种茶树的嫩叶提取原生质体，结果如图6和图7所示，黄魁、舒茶早、黄山白茶和紫鹃的原生质体数量均能达到10⁶/g(FW)，其中紫鹃的原生质体能清晰的观察到原生质体中的花青素。

实施例3

原生质体的提取方式同实施例1，区别在于，步骤(1)中的待提取样品选用茶树的茎(未木质化)。结果如图5所示，直径小于20μm；经血球计数板计数原生质体数量为3.68±0.25×10⁶/g(FW)；采用FDA染色法计数原生质体的活力，结果表明原生质体活力为88±1.9％。

实施例4

原生质体的提取方式同实施例1，设置步骤(7)中碘克砂醇的浓度为31％、45％和65.2％，探究不同浓度碘克沙醇对原生质体提取率及活力的影响。结果显示，随着碘克砂醇的浓度浓度的增加，原生质体的提取率(10⁶/g(FW))分别为1.98，4.52，6.13，原生质体的活力在94％左右无明显差别。

实施例5

原生质体的提取方式同实施例1，区别在于，步骤(1)中的待提取样品选用茶树的新鲜嫩叶(一芽二叶)，步骤(7)中的65.2％碘克砂醇替换为25％蔗糖。结果显示，碘克砂醇纯化的原生质体中细胞器清晰可见，直径小于20μm，而蔗糖纯化的原生质体杂质较多；经血球计数板计数，碘克砂醇纯化的原生质体数量6.06±0.41×10⁶/g(FW)，蔗糖纯化的原生质体数量1.08±0.1×10⁶/g(FW)；采用FDA染色法计数原生质体的活力，结果表明，碘克砂醇和蔗糖纯化的原生质体活力的活力分别为94±2.6％和82±4.7％。

实施例6

原生质体的提取方式同实施例1，区别在于，步骤(1)中的待提取样品选用茶树的新鲜嫩叶(一芽二叶)，设置步骤(3)中纤维素酶R-10和离析酶R-10的添加量分别为质量体积比的1.5％和0.2％、1.5％和0.4％、1.5％和0.6％、1.5％和0.8％、1％和0.4％、1.5％和0.4％、2％和0.4％、2.5％和0.4％探究不同比例纤维素酶R-10和离析酶R-10对原生质体提取率及活力的影响。结果显示，原生质体的提取率(10⁶/g(FW))分别为：1.62，2.78，5.98，3.16，2.48，5.92，2.50，2.37，活力分别为：85％，94％，93％，90％，91％，94％，92％，92％。

对比例1

原生质体的提取方式同实施例1，区别在于，步骤(1)中的待提取样品选用茶树的新鲜嫩叶(一芽二叶)，步骤(3)中酶解液中再额外添加0.1％(w/v)果胶酶Y-23。结果显示，原生质体的数量为1.51±0.1×10⁶/g(FW)，原生质体的活力为79±3％，相比实施例1的原生质体的数量和活力分别降低了27％和11％。

本申请所指的茶树不局限于现阶段为人们所知的茶树，与已知的茶树存在相似性的已知或未知的茶树皆适用于本申请的方法，并能够达到制备原生质体的数量与原生质体活力的近似效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种茶树新鲜组织原生质体的提取方法，其特征在于，将茶树器官灭菌并片切，将片切后的茶树器官使用酶解液处理，得到原生质体后再利用碘克沙醇或蔗糖进行纯化；所述酶解液包括纤维素酶R-10和离析酶R-10；所述碘克沙醇的浓度为31～65.2％，蔗糖的浓度为20～30％。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集茶树器官并灭菌；

(2)将灭菌后的茶树器官片切，并转移至酶解液中进行反应；

(3)收集步骤(2)中的酶解液，过滤并离心收集沉淀；

(4)利用碘克沙醇或蔗糖悬浮步骤(3)中的沉淀，离心并收集纯化后的原生质体。

3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，茶树器官包括茶树的须根、未木质化的茎、新鲜嫩叶或新鲜老叶；所述新鲜嫩叶包括一芽一叶或一芽二叶，新鲜老叶包括三至五叶。

4.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，灭菌的方式为将茶树器官置于70～75％酒精中30～40s，再用灭菌水冲洗至少3遍。

5.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，茶树器官和酶解液的添加比例为(0.5～1.5)g：(10～20)mL。

6.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，酶解液的配制：配制含有30mMMES(pH＝5.7)，0.3M甘露醇和30mMKCl混合溶液，于65～75℃条件下水浴3～5min，冷却后，将纤维素酶R-10和离析酶R-10溶于其中，最后加入10mMCaCl₂和0.1％BSA；所述纤维素酶R-10和离析酶R-10的添加量分别为质量体积比的1.5～2.5％和0.2～0.8％。

7.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，酶解的方法为，将含有酶解液的培养皿放置于抽滤瓶中，在真空和避光条件下酶解30～60min后，在35～45rpm，20～30℃恒温培养箱中酶解4-12h。

8.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，酶解完成后，用80～120μm的无菌细胞筛过滤，滤液在2～6℃温度下180～220g离心2～4min，去除上清液，收集沉淀；利用预冷的5mL洗涤液溶液重悬沉淀，于2～6℃温度180～220g离心2～4min，去除上清液；所述洗涤液的配方为，3.5～4.5mMMES(pH＝5～6)，140～160mMNaCl，110～130mMCaCl₂和2～8mMKCl。

9.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，离心的条件为，2～6℃温度下45～55g离心2～4min。

10.权利要求1～9任一所述的提取方法制备的原生质体在植物学领域中的应用。