CN112048464B - 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法 - Google Patents

一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112048464B
CN112048464B CN202010993617.3A CN202010993617A CN112048464B CN 112048464 B CN112048464 B CN 112048464B CN 202010993617 A CN202010993617 A CN 202010993617A CN 112048464 B CN112048464 B CN 112048464B
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
protoplast
tissue
leaf
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010993617.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112048464A (zh
Inventor
张德强
徐伟杰
谢剑波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN202010993617.3A priority Critical patent/CN112048464B/zh
Publication of CN112048464A publication Critical patent/CN112048464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112048464B publication Critical patent/CN112048464B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01011—Pectinesterase (3.1.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02002—Pectate lyase (4.2.2.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法，属于植物原生质体制备技术领域。本发明提供的用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，包括纤维素酶和浸解酶，所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述浸解酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和浸解酶的质量比为(14.5～15.5):(3.5～4.5)。本发明通过纤维素酶和浸解酶组合使用对毛白杨叶片和/或根组织进行酶解，既保持了原生质体的高活性，且获得的原生质体的数量多，酶的价格又相对廉价，降低了成本，可以满足后续试验研究的要求。

Description

一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及 其试剂和方法
技术领域
本发明属于植物原生质体制备技术领域，具体涉及一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法。
背景技术
毛白杨是中国特有的乡土树种，分布广泛，在辽宁(南部)、河北、山东、山西、陕西等省均有分布，以黄河流域中、下游为中心分布区，在我国北方林业生产和生态环境建设中占有重要地位，是北方地区森林培育的先锋树种。但杨树为多年生树种，以传统的杂交育种方式进行遗传改良耗费时间较长。利用原生质体进行细胞融合和体细胞杂交，可有效改善这一缺点。杨树也是木本植物的模式物种，原生质体的获得可以为一些重要基因的科学研究提供良好的材料。目前，国内外对于杨树叶片组织原生质体的分离与培养已有一定的研究基础(WANG,1991；宋少宇，张俊琦等,2015)，但这些以拟南芥酶解为基础的方法分离杨树叶片的原生质体效率较低，目前急需一种分离效果好的杨树组织原生质体的制备方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/ 或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法。本发明提供的用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物不仅分离效果好，而且制备得到的原生质体的活性好、数目多。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，包括纤维素酶和浸解酶，所述纤维素酶的酶活为 250～350U/g，所述浸解酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和浸解酶的质量比为(14.5～15.5):(3.5～4.5)。
优选的，所述纤维素酶为纤维素酶R10，所述浸解酶为浸解酶R10。
优选的，还包括甘露醇、KCl、2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物、 CaCl2和小牛血清白蛋白。
优选的，包括以下浓度的组分：纤维素酶14.5～15.5g/L、浸解酶 3.5～4.5g/L、甘露醇0.5～0.7mol/L、KCl15～25mmol/L、2-(N-吗啡林) 乙磺酸一水合物15～25mmol/L、CaCl210～15mmol/L和小牛血清白蛋白0.9～1.1g/L。
本发明提供了上述技术方案中所述组合物在毛白杨叶片和/或根组织原生质体制备中的应用。
本发明还提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合试剂，其特征在于，包括独立分装的试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A为上述技术方案中所述组合物；所述试剂B为W5溶液，所述W5溶液包括以下含量的组分：CaCl2120～130mmol/L、NaCl150～160mmol/L、KCl3～7mmol/L和2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物 1～3mmol/L；所述试剂C包括以下含量的组分：PEG4000200～600g/L、甘露醇0.8～1.2mol/L和CaCl20.8～1.2mmol/L。
优选的，还包括独立分装的甘露醇溶液，所述甘露醇溶液的浓度为0.38～0.42mol/L。
本发明提供了上述技术方案中所述组合试剂在制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的应用。
本发明还提供了一种制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的方法，使用上述技术方案中所述组合试剂进行处理，具体包括如下步骤：
1)将毛白杨叶片和/或根组织进行切割，获得组织材料；将获得的组织材料浸没于甘露醇溶液中，得到甘露醇溶液处理后的组织材料；
2)将甘露醇溶液处理后的组织材料浸泡到试剂A中，在黑暗条件下进行酶解；所述酶解的时间为6～8h，所述酶解的温度为36～38℃；
3)将酶解后的溶液过滤，取滤液进行离心，离心后取沉淀，用试剂B重悬；
4)步骤3)重悬后离心取沉淀，用试剂C重悬，然后添加试剂B终止反应；；
5)步骤4)终止反应后离心取沉淀，用试剂B重悬，得到毛白杨叶片和/或根组织原生质体。
优选的，所述毛白杨叶片和/或根组织取自培养15～30d的毛白杨组培苗；所述叶片选取颜色饱满，叶片半径在1～2cm，不褶皱的叶片；所述根组织选取根尖端部位组织；所述切割的沿生长方向切割。
有益效果：
本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，包括纤维素酶和浸解酶，所述纤维素酶的酶活为 250～350U/g，所述浸解酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和浸解酶的质量比为(14.5～15.5):(3.5～4.5)。本发明通过纤维素酶和浸解酶组合使用对毛白杨叶片和/或根组织进行酶解，既保持了原生质体的高活性，且获得的原生质体的数量多，酶的价格又相对廉价，降低了成本。
进一步的，在组合物中添加甘露醇、KCl、2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物、CaCl2和小牛血清白蛋白，可以进一步提高酶活性并给组织细胞提供合适的渗透压，防止组织细胞破坏，提高原生质体的活性和数量。
进一步的，本发明还提供了制备制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的方法，在获取切割好的组织材料之后，本发明将切割好的组织材料先用甘露醇溶液浸泡后再进行酶解，可以将组织材料中的次生代谢产物充分释放，可进一步提高酶解效率，还可以使组织材料在酶解前保持新鲜的状态，提高原生质体的活性；本发明通过改进的PEG 溶液，可以对原生质体进行富集，使制备的原生质体可以满足后续试验研究的要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍。
图1为实施例4制备的毛白杨原生质体悬浮液；图1中A为将毛白杨叶片分割为1mm的叶条浸没于0.4mol/L的甘露醇中的观察结果；图1中B为黑暗条件酶解后，将溶液过滤到新的离心管中的观察结果；图1中C为用试剂B温和重悬后离心的观察结果；
图2为实施例4制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
图3为实施例5制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
图4为对比例1制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片；
图5为对比例2制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片。
具体实施方式
本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，包括纤维素酶和浸解酶，所述纤维素酶的酶活为 250～350U/g，所述浸解酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和浸解酶的质量比为(14.5～15.5):(3.5～4.5)。在本发明中，所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，进一步优选为300U/g；所述浸解酶的酶活为700～900U/g，进一步优选为800U/g。在本发明中，所述纤维素酶的浓度优选为14.5～15.5g/L，进一步优选为15g/L；所述浸解酶的浓度优选为3.5～4.5g/L，进一步优选为4g/L。在本发明中，所述纤维素酶优选为纤维素酶R10，所述浸解酶优选为浸解酶R10。本发明通过纤维素酶和浸解酶组合使用对毛白杨叶片和/或根组织进行酶解，既保持了原生质体的高活性，且获得的原生质体的数量多，酶的价格又相对廉价，降低了成本。
本发明所述组合物还优选包括甘露醇、KCl、2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物、CaCl2和小牛血清白蛋白。在本发明中，所述组合物中甘露醇的浓度优选为0.5～0.7mol/L，进一步优选为0.6mol/L；所述组合物中KCl的浓度优选为15～25mmol/L，进一步优选为20mmol/L；所述组合物中2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物(MES)的浓度优选为 15～25mmol/L，进一步优选为20mmol/L；所述组合物中CaCl2的浓度优选为10～15mmol/L，进一步优选为10mmol/L；所述组合物中小牛血清白蛋白(BSA)的浓度优选为0.9～1.1g/L，进一步优选为1g/L。在本发明中，所述甘露醇、KCl、2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物、CaCl2和小牛血清白蛋白以溶液的形式加入。本发明在组合物中添加甘露醇、KCl、2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物、CaCl2和小牛血清白蛋白，可以进一步提高酶活性并给组织细胞提供合适的渗透压，防止组织细胞破坏，提高原生质体的活性和数量。
本发明对所述组合物的制备方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。
本发明所述组合物的制备方法优选包括如下步骤：依次添加纤维素酶、浸解酶、甘露醇、KCl和2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物，将上述配制的溶液在于55℃水浴10min，再冷却至室温。向冷却后的溶液中依次加入CaCl2和小牛血清白蛋白，充分混匀。
本发明提供了上述技术方案中所述组合物在毛白杨叶片和/或根组织原生质体制备中的应用。
本发明还提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合试剂，包括独立分装的试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A 为上述技术方案中所述组合物；所述试剂B为W5溶液，所述W5 溶液包括以下含量的组分：CaCl2120～130mmol/L、NaCl 150～160mmol/L、KCl3～7mmol/L和2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物 1～3mmol/L；所述试剂C包括以下含量的组分：PEG4000200～600g/L、甘露醇0.8～1.2mol/L和CaCl20.8～1.2mmol/L。
本发明所述组合试剂包括独立分装的试剂A、试剂B和试剂C。在本发明中，所述试剂A为上述技术方案中所述组合物，主要用于酶解毛白杨组织材料细胞壁，得到原生质体。在本发明中，所述试剂 B为W5溶液，所述W5溶液包括120～130mmol/LCaCl2，进一步优选为125mmol/L；所述W5溶液包括150～160mmol/LNaCl，进一步优选为154mmol/L；所述W5溶液包括3～7mmol/LKCl，进一步优选为5mmol/LKCl；所述W5溶液包括1～3mmol/L2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物，进一步优选为2mmol/L，在本发明中，所述W5溶液对制备的原生质体进行清洗，在保持原生质体活性的同时，提高原生质体的纯度。在本发明中，所述试剂C包括200～600g/LPEG4000，进一步优选为0.4g/L；所述试剂C包括0.8～1.2mol/L甘露醇，进一步优选为1.0mol/L；所述试剂C包括0.8～1.2mmol/LCaCl2，进一步优选为1mmol/L，在本发明中，所述试剂C为改进PEG溶液，能够对制备的原生质体进行富集，使制备的原生质体可以满足后续试验研究的要求。
在本发明中，所述组合试剂优选还包括独立分装的甘露醇溶液，所述甘露醇溶液的浓度优选为0.38～0.42mol/L。在组织材料进行酶解前，先用甘露醇溶液对组织材料进行处理，可以将组织材料中的次生代谢产物充分释放，可进一步提高酶解效率，还可以使组织材料在酶解前保持新鲜的状态，提高原生质体的活性。
本发明提供了上述技术方案中所述组合试剂在制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的应用。
本发明还提供了一种制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的方法，使用上述技术方案中所述组合试剂进行处理，具体包括如下步骤：
1)将毛白杨叶片和/或根组织进行切割，获得组织材料；将获得的组织材料浸没于甘露醇溶液中，得到甘露醇溶液处理后的组织材料；
2)将甘露醇溶液处理后的组织材料浸泡到试剂A中，在黑暗条件下进行酶解；所述酶解的时间为6～8h，所述酶解的温度为36～38℃；
3)将酶解后的溶液过滤，取滤液进行离心，离心后取沉淀，用试剂B重悬；
4)步骤3)重悬后离心取沉淀，用试剂C重悬，然后添加试剂 B终止反应；
5)步骤4)终止反应后离心取沉淀，用试剂B重悬，得到毛白杨叶片和/或根组织原生质体。
本发明将毛白杨叶片和/或根组织进行切割，获得组织材料；将获得的组织材料浸没于甘露醇溶液中，得到甘露醇溶液处理后的组织材料。本发明所述毛白杨叶片和/或根组织优选取自培养15～30d的毛白杨组培苗，使用这个阶段的毛白杨制备的原生质体效果最好；所述叶片优选颜色饱满，叶片半径在1～2cm，不褶皱的叶片；所述根组织优选取根尖端的部位组织。本发明优选用手术刀片对毛白杨叶片和/ 或根组织进行切割，所述切割的方向优选沿其生长方向切割。所述切割获得的组织材料的宽度优选为1～2mm，组织材料切的越细越好，可使组织材料充分和试剂A接触，提高酶解效率。得到切割后的组织材料后，本发明将获得的组织材料浸没于甘露醇溶液中，所述甘露醇溶液的浓度优选为0.38～0.42mol/L，每毫升甘露醇溶液浸泡的切割后的组织材料的个数优选为60～150个，进一步优选为80～120个，更进一步优选为100个。所述甘露醇溶液对组织材料进行处理，可以将组织材料中的次生代谢产物充分释放，可进一步提高酶解效率，还可以使组织材料在酶解前保持新鲜的状态，提高原生质体的活性。
得到甘露醇溶液处理后的组织材料后，本发明将甘露醇溶液处理后的组织材料浸泡到试剂A中，在黑暗条件下进行酶解。在本发明中，所述酶解过程中甘露醇溶液处理后的组织材料的个数优选为 60～150个/ml，进一步优选为80～120个/ml，更进一步优选为100个/ml。在本发明中，所述酶解的时间为6～8h，进一步优选为7h；所述酶解的温度为36～38℃，进一步优选为37℃。本发明试剂A主要用于酶解毛白杨组织材料细胞壁，得到原生质体。本发明通过优选酶解条件，进一步提高了原生质体的活性和获得的原生质体的数量。
酶解后，本发明将酶解后的溶液过滤，取滤液进行离心，离心后取沉淀，用试剂B对沉淀重悬，所述重悬后的重悬液优选与未离心前的体积相等。本发明试剂B主要对制备的原生质体进行清洗，给组织细胞提供合适的渗透压，防止组织细胞破坏，在保持原生质体活性的同时，提高原生质体的纯度。本发明优选用试剂B对制备的原生质体重复清洗2～3次，进一步提高原生质体的纯度。
在试剂B重悬后和试剂C重悬前，本发明优选将重悬液离心取沉淀(原生质体)，用预冷的MMg反应液重悬。在本发明中，所述离心的转速为100～200g，进一步优选为140g；所述离心的时间为 1～4min，进一步优选为2min；所述离心的温度优选为0～5℃，进一步优选为4℃。在本发明中，所述重悬后的重悬液的体积优选为未离心前的40％～60％。在本发明中，所述MMg反应液处理的时间优选为20～60min，进一步优选为30min。使用MMg溶液处理可以进一步富集原生质体，使得保持活性的条件下，原生质体溶液浓度更高，本发明经过多次富集得到的原生质体更加理想可用于后期的实验。
用试剂B重悬后本发明将重悬液离心取沉淀，用试剂C对沉淀重悬，然后添加试剂B终止反应。在本发明中，所述离心的转速为 100～200g，进一步优选为150g；所述离心的时间优选为1～4min，进一步优选为2min；所述离心的温度优选为0～5℃，进一步优选为4℃。在本发明中，所述重悬后的重悬液的体积优选为试剂B重悬后悬液体积的2％～3％，进一步优选为2.5％。在本发明中，所述试剂C优选在室温下进行处理，所述试剂C处理的时间优选为20～60min，进一步优选为30min；试剂C处理后添加试剂B终止反应，所述终止反应的试剂B的添加量优选为所述重悬液体积的0.5～2倍，进一步优选为 1倍。试剂C能够对制备的原生质体进行富集，使制备的原生质体可以满足后续试验研究的要求。
使用试剂B终止反应后本发明将终止反应后的重悬液离心取沉淀，用试剂B对沉淀重悬，得到毛白杨叶片和/或根组织原生质体。在本发明中，所述离心的转速为100～200g，进一步优选为150g；所述离心的时间为1～4min，进一步优选为2min；所述离心的温度为 0～5℃，进一步优选为4℃。在本发明中，所述重悬后的重悬液的体积优选为未离心前体积的40～60％。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，由以下浓度的组分组成：15g/L纤维素酶和4g/L浸解酶；其中纤维素酶为纤维素酶R10，浸解酶为浸解酶R10，两种酶均购自拜尔迪生物公司。
实施例2
一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，由以下浓度的组分组成：纤维素酶14g/L、浸解酶4g/L、甘露醇0.6mol/L、 KCl20mmol/L、2-(N-吗啡)乙磺酸10mmol/L、CaCl210mmol/L和小牛血清白蛋白100g/L；酶的来源与实施例1相同。
配制方法：
10ml组合物体系
(a)依次向50mL离心管中加入纤维素酶R100.15g，浸解酶 R100.04g，1mol/L甘露醇6ml，2mol/LKCl0.1ml，0.2mol/LMES 1ml(pH＝5.7，使用前需70℃水浴5min)，水均使用蒸馏水。充分震荡混匀上述溶液后在水浴锅中55℃水浴10min，再冷却至室温；水浴可使酶在一个合适的温度中充分的溶解混合，且不破坏酶的活性，提高后续的酶解效率。
(b)向冷却至室温后的溶液中依次加入1mol/LCaCl20.1mL， 10％BSA0.1mL，ddH2O3.7mL，充分混匀即配置完成。
实施例3
一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的试剂，由试剂 A、试剂B和试剂C组成；试剂A为实施例2组合物；试剂B为W5 溶液，W5溶液为以下含量的组分：CaCl2125mmol/L、NaCl 154mmol/L、KCl5mmol/L和2-(N-吗啡)乙磺酸2mmol/L；试剂C为以下含量的组分：PEG4000400g/L、甘露醇0.2mol/L和CaCl2 100mmol/L。
实施例4
一种制备毛白杨叶片原生质体的方法，如下步骤：
1)选取生长状态一致的毛白杨组培幼苗(2个月内)，用锋利的手术刀片去除叶片下胚轴1～2cm的组织部分，选择颜色饱满，叶片半径大小约在2cm左右，不褶皱的叶片；将叶片组织沿其生长方向分割开后，宽度约为1mm，将切割后的叶片组织100个左右浸没于10ml的0.4mol/L甘露醇溶液中，浸泡0.5h，得到甘露醇溶液处理后的组织材料，如图1中A；
2)将甘露醇处理后的组织材料在37℃黑暗条件下(可用锡箔纸包住)放入10ml实施例3的试剂A中酶解7h，需要将组织完全浸泡在酶解液中。
3)将酶解后的溶液用75μm的尼龙网过滤到一个50ml离心管中，并将含有滤液的离心管放在冰上，得到的滤液如图1B；然后将含有滤液的离心管置于4℃，140g离心2min。
4)用剪过的枪头吸去上清液，沉淀如图1中C；沉淀用10ml 实施例3的试剂B对原生质体进行重悬，重悬后继续离心，该步骤重复2次，对原生质体进行洗涤。
5)用剪过的枪头吸去上清液，用10ml试剂B温和重悬。将含有重悬溶液的离心管放在冰上30min，使原生质体沉淀到50mL离心管管底。
6)将重悬溶液于4℃，170g离心2min，用剪过的枪头吸去上清液，用5ml预冷的MMg反应液重悬原生质体，处理30min。
MMg反应液的配方如下表1：
表1 MMg溶液配方
反应液总体积 100mL 50mL
1M甘露醇 40mL 20mL
15mMMgCl<sub>2</sub> 1.5mL 0.75mL
4mMMES 2mL 1mL
ddH<sub>2</sub>O 56.5mL 28.25mL
7)将步骤6中反应液处理后重悬的原生质体置于0.2ml实施例3 的试剂C中，并轻柔混匀后将反应液静置。
8)室温反应10min，用0.2mL的试剂B终止反应。
9)终止反应后离心取沉淀，用0.2mL的试剂B反应液重悬原生质体，得到毛白杨叶片原生质体。
实施例5
一种制备毛白杨根组织原生质体的方法，其制备方法同实施例4，不同之处在于，组织材料为根组织，选取根尖端(大约在1～2mm) 的根组织。
对比例1
制备过程与实施例4相同，不同之处在于，试剂A中浸解酶以果胶酶代替，果胶酶的酶活为150U/g，果胶酶的浓度为4g/L，果胶酶购自日本公司yakult。
对比例2
制备过程与实施例4相同，不同之处在于，毛白杨组织材料不进行甘露醇溶液处理。
用光学显微镜观察原生质体
通过显微镜下制片观察实施例4～5和对比例1～2制备的原生质体，考察制备的原生质体活性，结果如图2～5，其中图2为实施例4 制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片，图3为实施例5制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片，图4为对比例1制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片，图5为对比例2制备的原生质体悬浮液在光学显微镜下的照片。通过血球计数板来统计原生质体的数量，结果如表2。
由图2～3可知，本发明制备得到的毛白杨叶片原生质体和根组织原生质体形态完整，其中根组织原生质体中不含叶绿体，更适合作为科研研究的材料；由图4可知，果胶酶处理得到原生质体不完整，原生质体破碎情况严重；由图5可知，未对毛白杨组织材料进行甘露醇处理，得到较为少量的原生质体，显微镜下的圆球为气泡。
表2实施例4～5和对比例1～2制备的原生质体数量统计表
溶液体积 原生质体数量(个/ml)
实施例4 10ml 2*10<sup>5</sup>
实施例5 10ml 10<sup>5</sup>
对比例1 10ml 10<sup>2</sup>
对比例2 10ml 10<sup>2</sup>
由表2可知，本发明实施例4～5得到的原生质体数量可达到105个/ml，可满足后续科研实验的需要；而对比例1和对比例2得到的原生质体数量与本发明的原生质体的数量有2～3个数量级的差别，显著差于本发明。
由实施例的结果可知，本发明提供的用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物不仅分离效果好，而且制备得到的原生质体的活性好、数目多。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (2)

1.一种组合试剂在制备毛白杨叶片原生质体和/或根组织原生质体的应用，其特征在于，包括独立分装的试剂A、试剂B和试剂C；
所述试剂A由以下浓度的组分组成：纤维素酶14.5～15.5g/L、浸解酶3.5～4.5g/L、甘露醇0.5～0.7mol/L、KCl 15～25mmol/L、2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物15～25mmol/L、CaCl210～15mmol/L和小牛血清白蛋白0.9～1.1g/L；
所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述浸解酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和浸解酶的质量比为(14.5～15.5):(3.5～4.5)；
所述纤维素酶为纤维素酶R10，所述浸解酶为浸解酶R10；
所述试剂B为W5溶液，所述W5溶液包括以下含量的组分：CaCl2120～130mmol/L、NaCl150～160mmol/L、KCl 3～7mmol/L和2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物1～3mmol/L；
所述试剂C包括以下含量的组分：PEG4000200～600g/L、甘露醇0.8～1.2mol/L和CaCl20.8～1.2mmol/L；
所述组合试剂还包括独立分装的甘露醇溶液，所述甘露醇溶液的浓度为0.38～0.42mol/L；
所述组合试剂制备毛白杨叶片原生质体和/或根组织原生质体的方法，具体步骤如下：
1)将毛白杨叶片和/或根组织进行切割，获得组织材料；将获得的组织材料浸没于甘露醇溶液中，得到甘露醇溶液处理后的组织材料；
2)将甘露醇溶液处理后的组织材料浸泡到试剂A中，在黑暗条件下进行酶解；所述酶解的时间为6～8h，所述酶解的温度为36～38℃；
3)将酶解后的溶液过滤，取滤液进行离心，离心后取沉淀，用试剂B重悬；
4)步骤3)重悬后离心取沉淀，用试剂C重悬，然后添加试剂B终止反应；
5)步骤4)终止反应后离心取沉淀，用试剂B重悬，得到毛白杨叶片和/或根组织原生质体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述毛白杨叶片和/或根组织取自培养15～30d的毛白杨组培苗；所述叶片选取颜色饱满，叶片半径在1～2cm，不褶皱的叶片；所述根组织选取根尖端部位组织；所述切割的沿生长方向切割。
CN202010993617.3A 2020-09-21 2020-09-21 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法 Active CN112048464B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010993617.3A CN112048464B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010993617.3A CN112048464B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112048464A CN112048464A (zh) 2020-12-08
CN112048464B true CN112048464B (zh) 2022-07-01

Family

ID=73604152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010993617.3A Active CN112048464B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112048464B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113897330A (zh) * 2021-11-10 2022-01-07 北京林业大学 一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法和应用
CN113913411A (zh) * 2021-12-01 2022-01-11 北京林业大学 一种从植物中提取真菌原生质体的组合物及其应用
CN115181735B (zh) * 2022-08-15 2024-02-13 中国林业科学研究院林业研究所 一种制备杨树根原生质体的复合酶液和方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754632A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 中国林业科学研究院林业研究所 一种灰楸叶片原生质的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754632A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 中国林业科学研究院林业研究所 一种灰楸叶片原生质的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficient isolation of Magnolia protoplasts and the application to subcellular localization of MdeHSF1;Yamei Shen等;《Plant Methods》;20170523;第13卷(第44期);摘要，方法部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112048464A (zh) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112048464B (zh) 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法
CN113046291B (zh) 一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法
CN105861414B (zh) 一种紫花苜蓿原生质体的制备方法
CN114058564A (zh) 一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用
CN107267549A (zh) 一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法
CN113652390B (zh) 一种紫薇原生质体的制备方法
CN115247145B (zh) 一种油茶花瓣原生质体的分离及瞬时转化体系构建方法
CN103374545B (zh) 一种游离苹果果肉原生质体的方法及其专用试剂盒
CN110438118B (zh) 一种提取黄瓜线粒体及其dna的有效方法
CN113897330A (zh) 一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法和应用
CN110577925B (zh) 一种制备水稻根原生质体的组合物和方法
CN114214264A (zh) 一种草莓原生质体分离纯化及基因瞬时表达的方法
CN114276976A (zh) 一种沙地云杉根尖细胞原生质体的解离方法
CN112980766A (zh) 一种棉花下胚轴单细胞的分离方法
WO2024077899A1 (zh) 一种拟南芥叶片样本组织解离液及解离方法
CN113249296B (zh) 一种茶树新鲜组织原生质体的分离与纯化方法
CN112442476A (zh) 一种绣球原生质体制备及瞬时转化的方法
CN110878281A (zh) 一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法
CN110358722B (zh) 一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法
CN105706923A (zh) 一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法
CN112391370B (zh) 一种制备油松针叶原生质体的方法
CN110669718A (zh) 一种落羽杉根，茎，叶原生质体分离、纯化及瞬时高效转化的方法
CN114214305B (zh) 一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用
CN110724660B (zh) 一种樟子松针叶原生质体的制备方法及应用
CN117568256A (zh) 一种玫瑰花瓣原生质体分离及瞬时转化体系构建的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant