CN110577925B - 一种制备水稻根原生质体的组合物和方法 - Google Patents

一种制备水稻根原生质体的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备水稻根原生质体的组合物和方法。本发明首先公开了一种制备水稻根原生质体的组合物，所述组合物包括纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶。本发明进一步公开了用于制备水稻根原生质体的酶解液和方法。通过本发明水稻根原生质体的体系和方法，600个(约0.15g)水稻幼苗种子根根尖分生区可以制备出约30000个原生质体，利用台盼蓝染色镜检，活力达到90％以上，为后续进行单细胞测序及原生质体转化等实验提供了充足材料。

Description

一种制备水稻根原生质体的组合物和方法
技术领域
本发明涉及植物细胞生物技术领域，具体涉及一种制备水稻根原生质体的组合物和方法。
背景技术
基因工程和合成生物技术已成为研究和改良作物性状的重要手段。原生质体为受体的遗传转化是其中重要途径之一。水稻作为单子叶模式植物并且为世界上主要的粮食作物，是研究较为广泛较为深入的物种之一，但由于其植物特性-细胞壁，无法像动物细胞一样可以进行便利深入的研究。
许多新兴技术如单细胞测序，基因线路转化等依赖于原生质体的获得，水稻根原生质体无法高效制备使得这些技术应用于水稻等的研究和遗传改良研究相对滞后。
目前，没有对水稻根原生质体大量高效提取的相关报道，已有技术提取单株幼苗所有根组织只提取到约20个原生质体，无法满足单细胞测序技术，基因线路转化等新型技术对单细胞的数量要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何高效获得水稻根原生质体。
为解决上述问题，本发明提供了一种用于制备水稻根原生质体的组合物。
本发明用于制备水稻根原生质体的组合物包括维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10和果胶酶Y-23。
上述组合物中，所述维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10和果胶酶Y-23的质量比为：2∶1∶0.5-0.75∶0.3-0.5。
上述用于制备水稻根原生质体的组合物可只由纤维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10和果胶酶Y-23组成；还可包括甘露醇、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、CaCl2和/或牛血清蛋白(BSA)。
上述组合物在制备水稻根原生质体中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明进一步提供了一种用于制备水稻根原生质体的酶解液。
本发明用于制备水稻根原生质体的酶解液包括纤维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10和果胶酶Y-23；所述纤维素酶RS在酶解液中的含量为20g/L，所述半纤维素酶在酶解液中的含量为10g/L，所述离析酶R10在酶解液中的含量为7.5g/L，果胶酶Y-23在酶解液中的含量为5g/L。
上述酶解液的溶质可只由纤维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10和果胶酶Y-23组成。
上述酶解液的溶质还可包括甘露醇、MES、CaCl2和牛血清蛋白(BSA)；其中，甘露醇在所述酶解液的含量为109.3g/L，MES在所述酶解液的含量为0.01mol/L，CaCl2在所述酶解液的含量为1mmol/L，牛血清蛋白(BSA)在所述酶解液的含量为1g/L。
上述酶解液还包括β-巯基乙醇、羧苄青霉素和溶剂；其中，β-巯基乙醇在所述酶解液的体积百分含量为0.04％，羧苄青霉素在所述酶解液的含量为50mg/L。
上述酶解液中所述溶剂为水。
上述酶解液在制备水稻根原生质体中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明进一步提供了一种制备水稻根原生质体的方法，所述方法包括从水稻根尖分生区得到水稻根原生质体的步骤。
上述方法中，所述水稻根尖分生区为水稻幼苗种子根的根尖分生区。
上述方法中，所述水稻根尖分生区取自于水稻幼苗种子根萌发至3-15cm的种子根(即水稻种子培养后3-14天获得的水稻幼苗种子根)的根尖分生区；具体的，为水稻幼苗种子根萌发至3-10cm的种子根(即水稻种子培养后3-7天获得的水稻幼苗种子根)的根尖分生区；更具体的，为水稻幼苗种子根萌发至3cm的种子根(即水稻种子培养后3天获得的水稻幼苗种子根)的根尖分生区。
所述水稻种子培养为将露白后的水稻种子在如下水稻培养液中在28℃光照培养箱中培养3-14天，光照强度为10,0001x，每天14小时黑暗、10小时光照，每天更换水稻培养液：
水稻培养液的母液配方及配置
Figure BDA0002235814680000021
Figure BDA0002235814680000031
按照表中配置母液I、母液II、母液III、母液IV和母液V，将1ml母液I、1ml母液II、1ml母液III、1ml母液V以及5ml母液IV加入到ddH2O混匀，定容到1L，调pH值5.8-6.2，得到水稻培养液。
上述方法中，所述从水稻根尖分生区得到水稻根原生质体包括将水稻根尖分生区在上述酶解液中进行酶解，得到含有原生质体的酶解溶液，从所述酶解溶液中分离出水稻根原生质体。
上述方法中，所述水稻根尖分生区酶解前切成小于等于1mm的小段。
上述方法中，每克水稻根尖分生区至少需要15-20mL酶解液。
上述方法中，所述酶解为在真空状态下25-28℃以转速A避光酶解2-2.5小时后再以转速B避光酶解0.5-1小时；其中转速A小于转速B。具体的，所述转速A为50-60rpm；所述转速B为70-80rpm，与现有技术相比转速有所提高，其有助于细胞壁酶解后的原生质体从组织中散落下来，后期转数增加有利于原生质体散落。
上述方法中，还包括将W5溶液加入到含有原生质体的酶解溶液得到混合液，过滤，得到滤液，离心，弃上清，得到水稻根原生质体。
上述方法中，所述过滤为过300目的筛子。
上述方法中，所述W5溶液由CaCl2、NaCl、KCl、MES和ddH2O组成；其中，所述CaCl2在所述W5溶液的含量为0.125mol/L，所述NaCl在所述W5溶液的含量为0.154mol/L，所述KCl在所述W5溶液的含量为0.005mol/L，所述MES在所述W5溶液的含量为0.002mol/L。
本发明通过对酶解液、取材时间及部位进行优化，得到一套高效分离、高活力、高数量的制备水稻根原生质体的体系和方法，600株(0.15g)水稻幼苗种子根的根尖分生区位置可以制备出约30000个原生质体，利用台盼蓝染色镜检，3分钟内观察，绝大部分原生质体不变蓝，活力达到90％以上，为后续进行单细胞测序及原生质体转化等实验提供了充足材料，弥补了植物因细胞壁无法像动物细胞一样便捷实验的缺陷。
附图说明
图1为水稻种子的培养方式。
图2为水稻根尖原生质体活力检测；其中，圆形浅色细胞为活力旺盛的根原生质体。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例和对比例中的纤维素酶RS为Yakult公司货号为L0011-5g的产品，其参数如下：最优pH值为4-5，最优温度为40-50度，酶活力为10000U/g。
下述实施例和对比例中的纤维素酶R10为Yakult公司货号为L0012-5g的产品，其参数如下：最优pH值为4-5，最优温度为40-50度，酶活力为10000U/g。
下述实施例和对比例中的果胶酶Y-23为Yakult公司货号为L0042-1g的产品，其参数如下：最优pH值为4.5-6.5，最优温度为40-55度，酶活力为1000U/g。
下述实施例和对比例中的离析酶R10为Yakult公司货号为L0021-5g的产品，其参数如下：最优pH值为5.0-6.0，最优温度为40-50度，酶活力为3000U/g。
下述实施例和对比例中的半纤维素酶为sigma公司货号为H2125-150ku的产品，其参数如下：最优pH值为5-6.5，最优温度为40-50度，酶活力为300-3000U/g。
实施例1酶解液和水稻幼苗的发育时期对水稻根原生质体制备的影响
1、溶液的配置
1.1酶解液的配置
酶解液1-4中各酶的含量如表1所示，所述酶解液1-4中其余组分及其含量为甘露醇在所述酶解液1-4的含量均为109.3g/L，MES在所述酶解液的含量均为0.01mol/L，CaCl2在所述酶解液的含量均为1mmol/L，牛血清蛋白(BSA)在所述酶解液的含量均为1g/L，β-巯基乙醇在所述酶解液的体积百分含量均为0.04％，羧苄青霉素在所述酶解液的含量均为50mg/L。
表1酶解液中酶的含量
酶解液组别 1 2 3 4
纤维素酶R10 - 20g/L - -
纤维素酶RS 20g/L - 20g/L 20g/L
半纤维素酶 10g/L 10g/L 10g/L 10g/L
离析酶R10 7.5g/L 7.5g/L - 7.5g/L
果胶酶Y-23 - - 5g/L 5g/L
注：“-”表示小含有该组分
酶解液1：按照表1中个酶解液1中各酶的配方依次向离心管加入纤维素酶RS0.2g、半纤维素酶0.1g、离析酶R10 0.075g、甘露醇1.093g和100mM MES(pH5.7)溶液1mL混合得到溶液1，将溶液1在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液1中加入100mM CaCl2溶液100uL、BSA 0.01g、β-巯基乙醇4ul、50mg/ml羧苄青霉素溶液10ul再加入ddH2O至酶解液总体积为10mL，得到酶解液1。
酶解液2：按照表1中个酶解液2中各酶的配方依次向离心管加入纤维素酶R100.2g、半纤维素酶0.1g、离析酶R10 0.075g、甘露醇1.093g和100mM MES(pH5.7)溶液1mL混合得到溶液2，将溶液2在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液2加入100mM CaCl2溶液100uL、BSA 0.01g、β-巯基乙醇4ul、50mg/ml羧苄青霉素溶液10ul再加入ddH2O至酶解液总体积为10mL，得到酶解液2。
酶解液3：按照表1中个酶解液3中各酶的配方依次向离心管加入纤维素酶RS0.2g、半纤维素酶0.1g、果胶酶Y-230.05g、甘露醇1.093g和100mM MES(pH5.7)溶液1mL混合得到溶液3，将溶液3在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液3加入100mM CaCl2溶液100uL、BSA 0.01g、β-巯基乙醇4ul、50mg/ml羧苄青霉素溶液10ul再加入ddH2O至酶解液总体积为10mL，得到酶解液3。
酶解液4：按照表1中个酶解液4中各酶的配方依次向离心管加入纤维素酶RS0.2g、半纤维素酶0.1g、离析酶R10 0.075g、果胶酶Y-23 0.05g、甘露醇1.093g和100mM MES(pH5.7)溶液1mL混合得到溶液4，将溶液4在55℃水浴10min，冷却至室温，向冷却的溶液4加入100mM CaCl2溶液100uL、BSA 0.01g、β-巯基乙醇4ul、50mg/ml羧苄青霉素溶液10ul再加入ddH2O至酶解液总体积为10mL，得到酶解液4。
1.2水稻培养液
水稻培养液母液配方及配置如表2所示。
表2水稻培养液母液配方及配置
Figure BDA0002235814680000061
按照表2中配置母液I、母液II、母液III、母液IV和母液V，将1ml母液I、1ml母液II、1ml母液III、1ml母液V以及5ml母液IV加入到ddH2O混匀，定容到1L，调pH值5.8-6.2，得到水稻培养液。
1.3W5溶液
所述W5溶液由CaCl2、NaCl、KCl、MES和ddH2O(溶剂)组成；其中，所述CaCl2在所述W5溶液的含量为0.125mol/L，所述NaCl在所述W5溶液的含量为0.154mol/L，所述KCl在所述W5溶液的含量为0.005mol/L，所述MES在所述W5溶液的含量为0.002mol/L。
依次向试剂瓶中加入CaCl21.84g、NaCl 0.9g、100mM KCl溶液5mL、100mM MES(pH5.7)溶液2mL，再加入ddH2O至100mL，得到100mL W5溶液。
2、材料的获得
将日本晴种子置于干净的烧杯中，加入蒸馏水没过种子，早晚更换蒸馏水，37℃培养箱避光培养。
待种子露白后，将种子转移至水稻培养液中(液面约15cm高)，在28℃光照培养箱中培养，光照强度为10,000lx，每天14小时黑暗、10小时光照。每天更换水稻培养液，培养方式见图1。
培养3天后，大部分水稻幼苗种子根萌发至3cm，用吉列刀片切取种子根的5mm根尖分生区，并切成1mm左右的小段，取材时间控制在1小时以内，获得4份材料A，每份约600个种子根(0.15g)。
培养5天后，大部分水稻幼苗根萌发至6cm，用吉列刀片切取种子根的5mm根尖分生区，并切成1mm左右的小段，取材时间控制在1小时以内，获得4份材料B，每份约600个种子根(0.15g)。
培养7天后，部分水稻幼苗根萌发至10cm用吉列刀片切取种子根的5mm根尖分生区，并切成1mm左右的小段，取材时间控制在1小时以内，获得4份材料C，每份约600个种子根(0.15g)。
培养14天后，部分水稻幼苗根萌发至15cm用吉列刀片切取种子根的5mm根尖分生区，并切成1mm左右的小段，取材时间控制在1小时以内，获得4份材料C，每份约600个种子根(0.15g)。
3、水稻根原生质体的制备
将步骤2得到的4份材料A、4份材料B和4份材料C分别移入步骤1得到的酶解液1、酶解液2、酶解液3和酶解液4中，共获得12组，封口，抽真空30分钟，避光放在28℃培养箱中，60rpm酶解2小时后80rpm酶解半小时，加入W5溶液终止反应，得到混合液；
将混合液过300目的筛子，将滤液放在培养皿中，侧放，用剪过的蓝枪头将液体吸到10ml管子中，130g离心5分钟，加速度和减速度均为1g，弃上清，得到水稻根原生质体。将得到的水稻根原生质体分为两份。
一份水稻根原生质体用W5缓冲液重悬，130g离心5分钟，加速度和减速度均为1g，弃上清，再加入少量W5缓冲液，得到悬浊液，置于4℃冰箱，并利用血球技术器计数。另一份水稻根原生质体用8％甘露醇重悬原生质体，130g离心5分钟，加速度和减速度均为1g，弃上清，再加入少量8％甘露醇，得到悬浊液，置于4℃冰箱，吸取少量悬浊液利用台盼蓝染色镜检进行活力检测，3分钟内观察并计数。
上述试验设置三次重复实验，结果取平均值，得到的结果如表1所示。
表1本实施例得到的原生质体情况
Figure BDA0002235814680000081
通过以上试验，本发明进行水稻根原生质体的制备时，选择水稻种子培养3天后水稻幼苗种子根(即水稻幼苗种子根萌发至3cm的种子根)的根尖分生区作为制备原生质体的材料，选择酶解液4进行酶解得到的原生质体最多；其中，所述酶解液4由纤维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10、果胶酶Y-23、甘露醇、MES、CaCl2、牛血清蛋白(BSA)、β-巯基乙醇、羧苄青霉素和溶剂(水)组成；所述纤维素酶RS在酶解液中的含量为20g/L，所述半纤维素酶在酶解液中的含量为10g/L，所述离析酶R10在酶解液中的含量为7.5g/L，果胶酶Y-23在酶解液中的含量为5g/L，甘露醇在酶解液的含量为109.3g/L，MES在酶解液的含量为0.01mol/L，CaCl2在所述酶解液的含量为1mmol/L，牛血清蛋白(BSA)在所述酶解液的含量为1g/L，β-巯基乙醇在所述酶解液的体积百分含量为0.04％，羧苄青霉素在所述酶解液的含量均为50mg/L。
实施例2水稻根原生质体的制备
1、材料的获得
将籼稻9311水稻种子置于干净的烧杯中，加入蒸馏水没过种子，早晚更换蒸馏水，37℃培养箱避光培养。
待种子露白后，将种子转移至水稻培养液中(液面约15cm高)，在28℃光照培养箱中培养3天，光照强度为10,000lx，每天14小时黑暗、10小时光照。每天更换水稻培养液。
培养3天后，大部分水稻幼苗种子根萌发至3cm，用吉列刀片切取种子根的5mm根尖分生区，并切成1mm左右的小段，取材时间控制在1小时以内，获得籼稻9311材料，每份约1200个种子根(0.30g)。
2、水稻根原生质体的制备
将籼稻9311材料移入实施例1中制备得到的酶解液4中，封口，抽真空30分钟，避光放在28℃培养箱中，60rpm酶解2小时后80rpm酶解半小时，加入实施例1制备的W5溶液终止反应，得到混合液；
将混合液过300目的筛子，将滤液放在培养皿中，侧放，用剪过的蓝枪头将液体吸到10ml管子中，130g离心5分钟，加速度和减速度均为1g，弃上清，得到水稻根原生质体。将得到的水稻根原生质体分为两份。
一份水稻根原生质体用W5缓冲液重悬，130g离心5分钟，加速度和减速度均为1g，弃上清，再加入少量W5缓冲液，得到悬浊液，置于4度冰箱，并利用血球计数板计数，结果显示600个种子根的根尖分生区得到约30000个水稻原生质体。
另一份水稻根原生质体用8％甘露醇重悬原生质体，130g离心5分钟，加速度和减速度均为1g，弃上清，再加入少量8％甘露醇，得到悬浊液，置于4℃冰箱，吸取少量悬浊液利用台盼蓝染色镜检进行活力检测，3分钟内观察并利用血球计数板计数。600个种子根的根尖分生区得到约30000个水稻原生质体，并且活力达到90％以上。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (1)

1.一种制备水稻根原生质体的方法，其特征在于：所述方法包括从水稻根尖分生区得到水稻根原生质体的步骤；所述水稻根尖分生区取自于水稻幼苗种子根萌发至3cm的种子根的根尖分生区；
所述从水稻根尖分生区得到水稻根原生质体还包括将水稻根尖分生区在酶解液中进行酶解，得到含有原生质体的酶解溶液，从所述酶解溶液中分离出水稻根原生质体；
所述酶解液由纤维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10、果胶酶Y-23、甘露醇、MES、CaCl2、牛血清蛋白、β-巯基乙醇、羧苄青霉素和水组成；其中，所述纤维素酶RS在酶解液中的含量为20g/L，所述半纤维素酶在酶解液中的含量为10g/L，所述离析酶R10在酶解液中的含量为7.5g/L，果胶酶Y-23在酶解液中的含量为5g/L，所述甘露醇在所述酶解液的含量为109.3g/L，所述MES在所述酶解液的含量为0.01mol/L，所述CaCl2在所述酶解液的含量为1mmol/L，所述牛血清蛋白在所述酶解液的含量为1g/L，所述β-巯基乙醇在所述酶解液的体积百分含量为0.04％，所述羧苄青霉素在所述酶解液的含量为50mg/L；
所述酶解为在真空状态下25-28℃以转速A避光酶解2-2.5小时后再以转速B避光酶解0.5-1小时；其中转速A小于转速B；转速A为50-60rpm；所述转速B为70-80rpm。
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