CN114574423B - 一种蜈蚣草原生质体制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜈蚣草原生质体制备方法及其应用。本发明用含有2％(w/v)纤维素酶R10、0.1％(w/v)果胶酶Y23和1％(w/v)离析酶R10的酶解液在30℃下酶解蜈蚣草根尖组织细胞壁4h，能克服蜈蚣草根尖木质化严重的问题，促进蜈蚣草根尖原生质体释放。在富集纯化原生质体时，碎样方法选择刀切法，富集离心力选择150g，两次过滤时滤膜孔径分别选择70μm与40μm，获取的原生质体数量多，质量佳，碎片率低，活性高。同时，本发明的制备方法能够捕捉到蜈蚣草全细胞类型的原生质体，单细胞测序分群后，共得到15种细胞亚群，是蜈蚣草单细胞样品测序前可靠的原生质体制备方法。

Description

一种蜈蚣草原生质体制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物细胞技术领域，具体地，涉及一种蜈蚣草原生质体制备方法及其应用。

背景技术

砷是一种在自然界中广泛存在的有毒类金属元素，是世界卫生组织、美国卫生和人类服务部确定的一类致癌物(National Research Council 2001)。受采矿和金属冶炼的影响，部分地区的农田砷污染非常严重，砷含量远超出土壤背景值。蜈蚣草是世界上发现的第一种砷超富集植物，也是目前对砷吸收、富集能力最强的植物。不管是在植物砷富集途径的机制研究中，还是在应用超富集植物进行砷污染土壤的植物提取修复实践中，蜈蚣草都是科研人员的重点研究对象。

蜈蚣草属于蕨类植物门、凤尾蕨科、凤尾蕨属，喜碱性土壤环境，具有较强的适应能力。作为一种典型的蕨类植物，蜈蚣草生长缓慢、世代周期长、根系木质化严重，与高等植物幼嫩且发白的根系相比，蜈蚣草根系整体发黑，仅在水培环境下，蜈蚣草根尖呈现浅褐色或青色。同时，受限于蜈蚣草世代交替的繁殖方式，难以在蜈蚣草中进行分子编辑等操作，缺乏能够推广应用的原位技术手段。想要挖掘蜈蚣草分子机理机制，就需要进一步获取高质量蜈蚣草原位组织，为蜈蚣草分子实验的开展提供服务。

原生质体是指去除植物细胞壁后剩余的细胞组分，在模式植物分子生物学的研究中有广泛应用，包括亚细胞定位研究和单细胞组学研究等。同时，原生质体在植物工程育种方面也有广泛用途。原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁剥离，原生质体能保持原细胞的活性。获得高活力、去壁较为完全、高浓度和低碎片率的原生质体对于后续开展分子实验非常重要。由于各种植物细胞壁的组成不同，破壁所用的酶的种类及浓度和其他反应条件均有显著不同，需要采用有针对性的原生质体制备方法。

植物由多样化的细胞类型组成，不同细胞类型间的特异性转录程序产生了各细胞类型间独特的生物学功能。单细胞转录组技术是近年来兴起的新一代研究手段，于2003年在模式植物中得以成功开发及应用。该技术通过将植物组织分散成单个细胞后对单个细胞进行捕捉、标记和测序，可以深入揭示植物原位的基因表达及定位信息。

现有的原生质体制作方法，既未见针对根尖的制备方法，也未保证原生质体获得的数量，未考虑同一组织中原生质体细胞类型的全面性，缺乏应用于单细胞测序的全细胞类型的蜈蚣草原生质体。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种蜈蚣草原生质体制备方法及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种蜈蚣草原生质体的制备方法。

本发明的第二个目的是提供所述的制备方法制备得到的蜈蚣草原生质体。

本发明的第三个目的是提供一种分析蜈蚣草原生质体的方法。

本发明的第四个目的是提供一种用于分析蜈蚣草原生质体的样品。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种蜈蚣草原生质体的制备方法，所述制备方法的步骤如下：

S1：将采集的蜈蚣草根尖组织碎样；

S2：将含有纤维素酶、果胶酶和/或离析酶的酶解液与步骤S1碎样后的蜈蚣草根尖组织混合，避光真空处理后，再再恢复气压至100～101kPa酶解，得到酶解产物；

S3：纯化。

优选地，所述碎样方法为刀切法。

更优选地，用刀片将根尖剪切成0.1～1mm长的小段。

优选地，所述酶解液中纤维素酶的浓度为1.95％～2.05％w/v，果胶酶的浓度为0.05～0.15％w/v，离析酶的浓度为0.95～1.05％w/v。

更优选地，所述酶解液中纤维素酶的浓度为2％w/v，果胶酶的浓度为0.1％w/v，离析酶的浓度为1％w/v。

更优选地，所述纤维素酶为纤维素酶R10，所述果胶酶为果胶酶Y23，所述离析酶为离析酶R10。

更优选地，所述酶解液还含有0.95～1.05％(w/v)PVP40，0.45～0.55M甘露醇，19.9～20.05mM KCl，9.95～10.05mM吗啉乙磺酸，22.95％～23.05％(v/v)ddH₂O，9.95～10.05mM CaCl₂，0.05～0.15％(w/v)BSA和0.45～0.55mM DTT。

更优选地，所述酶解液还含有1％(w/v)PVP40，0.5M甘露醇，20mM KCl，10mM MES，23％(v/v)ddH₂O，10mM CaCl₂，0.1％(w/v)BSA和0.5mM DTT。

最优选地，所述酶解液的制备方法为，将2％(w/v)纤维素酶R10、0.1％(w/v)果胶酶Y23、1％(w/v)离析酶R10、1％(w/v)PVP40、0.5M甘露醇、20mM KCl、10mM吗啉乙磺酸与23mM ddH₂O混合，55℃水浴10min，冷却至25℃后加入10mM CaCl₂，0.1％(w/v)BSA和0.5mMDTT混匀，过滤。

优选地，步骤S2中，避光真空处理时间为9～31min。

更优选地，避光真空处理时间为10min。

优选地，步骤S2中，酶解温度为27～31℃，酶解时间为1.5～4.5h。

更优选地，酶解温度为30℃，酶解时间为4h。

优选地，步骤S3中，将甘露醇或海藻糖与步骤S2得到的酶解产物混合，用细胞分离装置分离混有甘露醇或海藻糖的酶解产物，收集分离液，140～500g离心，去上清，用甘露醇或海藻糖重悬，重复分离，离心，去上清，得到细胞悬液。

优选地，步骤S3中，分离所用滤膜的孔径为30～70μm。

更优选地，首次分离所用滤膜的孔径为70μm，第二次分离所用滤膜的孔径为40μm。

所述的制备方法制备得到的蜈蚣草原生质体。

一种分析蜈蚣草原生质体的方法，使用所述的制备方法对蜈蚣草进行前处理。

一种用于分析蜈蚣草原生质体的样品，所述样品含有所述的蜈蚣草原生质体。

优选地，所述分析蜈蚣草原生质体为蜈蚣草高通量测序、亚细胞定位和/或蜈蚣草富集元素研究。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明用含有2％(w/v)纤维素酶R10、0.1％(w/v)果胶酶Y23和1％(w/v)离析酶R10的酶解液在30℃下酶解蜈蚣草根尖组织细胞壁4h，能克服蜈蚣草根尖木质化严重的问题，促进蜈蚣草根尖原生质体释放。

在富集纯化原生质体时，碎样方法选择刀切法，富集离心力选择150g，两次过滤时滤膜孔径分别选择70μm与40μm，获取的原生质体数量多，质量佳，碎片率低，活性高。

同时，本发明的蜈蚣草原生质体制备方法能够捕捉到蜈蚣草全细胞类型的原生质体，经过单细胞测序分群后，共得到15种细胞亚群，是蜈蚣草单细胞样品测序前可靠的原生质体制备方法。蜈蚣草是重要的砷超富集植物，对蜈蚣草体内砷代谢分子过程的挖掘需要依赖高质量的原生质体，本发明的制备方法的对超富集植物蜈蚣草体内砷富集分子过程的进一步挖掘和以蜈蚣草为代表的蕨类植物根系原生质体的制备方法的开发，具有重要指导意义。

附图说明

图1为水培的蜈蚣草生长状态。

图2为蜈蚣草根尖幼嫩组织样本。

图3为蜈蚣草单细胞测序细胞亚群聚类分析图。

图4为种类和配比对蜈蚣草原生质体的释放效果的影响；其中a为1.25％(w/v)纤维素酶+0.5％(w/v)半纤维素酶，b为1％(w/v)半纤维素酶+1％(w/v)蜗牛酶，c为1.25％(w/v)纤维素酶+0.5％(w/v)离析酶，d为1.25％(w/v)纤维素酶+0.5％(w/v)半纤维素酶+1.0％(w/v)果胶酶，e为2％(w/v)崩溃酶，f为1％(w/v)纤维素酶+0.5％(w/v)半纤维素酶+0.5％(w/v)果胶酶，g为1.25％(w/v)纤维素酶R10+0.75％(w/v)离析酶R10，h为1.3％(w/v)纤维素酶R10+0.3％(w/v)离析酶R10，i为2％(w/v)纤维素酶R10+0.1％(w/v)果胶酶Y23+1％(w/v)离析酶R10，j为1.5％(w/v)纤维素酶R10+0.1％(w/v)果胶酶Y23+0.3％(w/v)离析酶R10。

图5为不同酶解温度对蜈蚣草原生质体释放效果的影响；其中a为28℃，b为30℃。

图6为不同酶解时间对蜈蚣草原生质体释放效果的影响；其中a为1h，b为2h，c为4h。

图7为不同富集离心转速对蜈蚣草原生质体富集数量和质量的影响；其中a为150g，b为300g，c为500g。

图8为不同植物碎样方式对蜈蚣草原生质体富集数量和质量的影响；其中a为剪样法过膜前，b为剪样法过膜后，c为刀切法过膜前，d为刀切法过膜后。

图9为不同原生质体过滤方式对蜈蚣草原生质体富集数量和质量的影响；其中a为70μm过滤膜，b为70μm过滤膜+40μm过滤膜，c为70μm过滤膜+40μm过滤膜+30μm过滤膜。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1制备蜈蚣草原生质体

1、植物材料的培养

首先培养蜈蚣草孢子，使其萌发。将蜈蚣草孢子、水和有机质土(荷兰Giffy品牌)混匀，喷洒在营养土上层，浇水并覆盖透明塑料薄膜以保持土壤湿润。培养2个月，蜈蚣草孢子体萌发至2～3片羽叶，将单株蜈蚣草分别移至穴盘中进行营养土培养。土培1～2周后，蜈蚣草生长成有3～4片羽叶的幼苗，将根洗净后移至20％(v/v)霍格兰营养液中水培，在水培装置中添加曝气装置，每周更换1次营养液。

水培2～3周后，采集生长状态良好、长势一致的蜈蚣草植株的根尖。如图1所示，水培的蜈蚣草生长健康且长势良好。

2、采集蜈蚣草根尖幼嫩组织

取距蜈蚣草根尖约0.5cm长的根尖幼嫩组织，其颜色为青白色。用去离子水冲洗蜈蚣草根尖表面的杂质，随后用吸水纸将其表面的水分吸干，用刀片将根尖剪切成0.1～1mm长的小段，用缓冲液(0.44M甘露醇，也可以用0.4M的海藻糖)清洗2次后，得到清洗好的蜈蚣草根尖幼嫩组织。图2为蜈蚣草根尖幼嫩组织样本，无褐色且木质化较重。

3、酶解蜈蚣草根尖组织

按照表1所示的方法配置酶解液，将清洗好的蜈蚣草根尖幼嫩组织加入酶解液中酶解，蜈蚣草根尖幼嫩组织与酶解液的用量比为1g：5mL。用宽枪头将混合有酶解液的植物组织转移至避光的三角瓶中，随后置于真空干燥器内，室温(20～30℃)真空培养10min。真空培养完成后，恢复气压至100kpa，将三角瓶置于恒温摇床内，设置转速为60rpm，30℃条件下避光培养4h，得到酶解产物。

表1酶解液组成及配置过程

4、富集纯化原生质体

酶解结束后，先用1mL缓冲液(0.44M甘露醇，也可以用0.4M海藻糖)润洗细胞过滤器。用宽枪头取酶解产物加入70μm细胞过滤器中过滤，用1mL缓冲液冲洗瓶底和过滤器两次，收集过滤液。随后，用注射器的活塞轻轻按压过滤器上的组织10次，加入1mL缓冲液，再次按压10次，反复进行这一操作3次，可以将组织上的细胞尽可能地冲洗下来。将过滤液全部收集到15mL离心管中，在150g离心力下，水平离心10min，用移液枪吸去上清，加入1mL缓冲液轻轻重悬沉淀，轻缓混匀后，再次用40μm细胞过滤器过滤，150g水平离心5min，用枪吸去上清，保留100～500μL细胞悬液，得到纯化的原生质体。

实施例2蜈蚣草原生质体聚类分析

蜈蚣草作为典型的砷超富集植物，对其砷关键基因的挖掘和原位功能解析是揭示其超富集机制的重点内容。根据实施例1的制备方法制备得到纯化的蜈蚣草根尖原生质体，再结合10x Genomics Chromiu单细胞测序技术，获得蜈蚣草根尖单细胞数据库，并通过细胞聚类将无差别捕捉的根尖细胞进行聚类分析。

结果如图3所示，在纯化的蜈蚣草根尖原生质体悬液样本中，共获得了20974个经质控检验的高质量原生质体，进一步对20974个高质量原生质体进行聚类和t-SNE降维分析，共得到15个细胞簇，定义为15种细胞亚群。如图3中所示，每一个点代表一个细胞的测序结果，该图由20974个高质量原生质体的测序结果构成，15种细胞类型分别用图例中的15种颜色表示。表明实施例1的制备方法能够捕捉全细胞类型的原生质体，是蜈蚣草单细胞样品测序前可靠的原生质体制备方法。

实施例3酶解液配方对蜈蚣草原生质体释放效果的影响

一、实验方法

制备蜈蚣草单细胞需要大量高活性低碎片率的原生质体，制备原生质体过程中，需要细胞壁消解酶消解蜈蚣草的细胞壁。消解酶选自纤维素酶、离析酶、果胶酶、崩溃酶和半纤维素酶。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还含有高活力的木聚糖酶。纤维素酶作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。

植物细胞离析酶是一种生物技术工具酶，其作用是把植物组织分离成单细胞，可与纤维素酶配合使用，制备高等植物原生质体。

果胶酶可以使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。

崩溃酶主要含纤维素酶和果胶酶，还含有蛋白酶和核酸酶，可消解细胞壁。

半纤维素酶为复合酶系，主要包括木聚糖酶和甘露聚糖酶，其功能是降解植物细胞壁的半纤维素成分。

按照实施例1的方法制备原生质体，为了确定酶解液配方对蜈蚣草原生质体释放效果的影响，将酶解液的配方改成如表2所示的实验组。恢复气压后的酶解过程中，每隔一段时间取样10μL于显微镜下观察释放程度，取样前用1mL宽枪头轻轻吹吸，可以促进原生质体的释放和分离。

二、实验结果

如图4所示，通过视野内观察恢复气压后酶解4h的细胞释放的数量，发现了酶的种类和配比对制备蜈蚣草根尖原生质体有不同影响，如图4a所示，E1组有一定量细胞释放，细胞整体状态较好，但释放细胞的数量少，浓度较低；如图4b所示，E2组细胞几乎没有从组织上释放下来，细胞数量少，释放效果差；如图4c所示，E3组细胞几乎没有从组织上释放下来，细胞数量少，释放效果差；如图4d所示，E4组细胞细胞数量较少，浓度较低；如图4e所示，E5组细胞活性差，浓度低，且有较多破碎细胞，说明原生质体在该条件下无法保持活性；如图4f所示，E6组细胞在组织上难以释放，原生质体浓度低；如图4g和图4h所示，E7组和E8组细胞数量较多，浓度较高，说明原生质体释放效果较好，但释放程度不够彻底，组织上仍有未释放的原生质体细胞，不足以覆盖所有细胞类型的原生质体；如图4i所示，E9组细胞数量多，浓度高，原生质体形态良好，组织上的细胞释放较为彻底，可以充分覆盖不同细胞类型的原生质体，效果最佳；如图4j所示，E10组细胞释放效果较差。综上，含有E9组酶(2％(w/v)纤维素酶R10、0.1％(w/v)果胶酶Y23、1％(w/v)离析酶R10)的酶解液，对原生质体的释放效果最佳，因此选择E9组的酶的种类及配比制备酶解液。

表2酶的种类和配比对蜈蚣草原生质体的释放效果的影响

注：原生质体释放效果根据结果评估星级，满5星。其中1星表示，几乎没有原生质体的释放；2星表示，有极少量原生质体的释放；3星表示，能观察到较多原生质体的释放，但释放程度不够彻底，组织上仍有未释放的原生质体细胞；4星表示，能观察到大量原生质体的释放，但释放程度不够彻底，组织上仍有未释放的原生质体细胞；5星表示，能观察到大量原生质体，且释放较为彻底，组织上几乎观察不到原生质体细胞。

实施例4抽真空时间、酶解温度和酶解时间对原生质体释放效果的影响

一、实验方法

原生质体是指除去细胞壁的细胞或一个被质膜包围的裸露细胞。大量制备原生质体是细胞组织培养和植物基因功能研究的重要基础。通过实验确定不同真空时间、酶解温度、酶解转速和酶解时间对原生质体释放效果的影响。

1、抽真空时间对原生质体释放效果的影响

真空环境帮助酶解液进入组织间隙，促进酶解液消化细胞壁从而促进原生质体的释放。按照实施例1的方法制备原生质体，比较不同抽真空时间(0min、10min和30min)对原生质体释放效果的影响，抽真空的压力为-6kpa。

2、酶解温度对原生质体释放效果的影响

制备不同植物的原生质体，其最适酶解环境不同。合适的酶解环境可以促进原生质体的快速释放。按照实施例1的方法制备原生质体，比较不同酶解温度(28℃和30℃)对原生质体释放效果的影响。

3、酶解时间对原生质体释放效果的影响

降低酶解时间能有效缓解酶解过程对细胞内分子过程的刺激和影响，为原生质体细胞获取后的进一步研究有重要意义。按照实施例1的方法制备原生质体，比较不同酶解时间(1h、2h和4h)对原生质体释放效果的影响。

恢复气压后的酶解过程中，每隔一段时间取样10μL于显微镜下观察释放程度，取样前用1mL宽枪头轻轻吹吸，可以促进原生质体的释放和分离。

二、实验结果

1、抽真空时间对原生质体释放效果的影响

实验结果如表3所示，不同的抽真空时间对蜈蚣草根尖原生质体的制备有较大影响，抽真空能极大地促进原生质体细胞的释放，其中抽10min真空时，释放效果最佳，抽30min真空后观察到细胞变形及破碎，不易于下一步原生质体的释放，因此选择10min抽真空时间。

表3抽真空时间对蜈蚣草原生质体释放效果的影响

注：原生质体释放效果根据结果评估星级，满5星。其中，2星表示细胞数量一般，细胞形态较好；3星表示细胞形态有所破碎，影响了细胞总量，总量较少；5星表示细胞数量及形态效果最佳。

2、酶解温度对原生质体释放效果的影响

结果如图5和表4所示，酶解温度能显著影响蜈蚣草根尖原生质体的释放效果。其中在30℃时，原生质体的释放效果最好(图5b)，而在28℃时，同样酶解条件下，细胞释放数量较少(图5a)，说明蜈蚣草根尖在30℃时的酶解效果最佳，由此我们选择蜈蚣草根尖的酶解温度为30℃。

表4酶解温度对蜈蚣草原生质体释放效果的影响

注：原生质体释放效果根据结果评估星级，满5星。其中，2星表示该温度下释放的细胞数量相对较少；5星表示该温度下释放的细胞数量相对较多。

3、酶解时间对原生质体释放效果的影响

结果如图6和表5所示，随着酶解时间的延长，蜈蚣草根尖原生质体的释放程度逐步增强，酶解1h时，仅有少量原生质体释放(图6a)，酶解2h时，原生质体释放的数量逐渐增多(图6b)，酶解4h时，观察到大量原生质体的释放(图6c)，此时植物组织的酶解已经较为充分，细胞释放数量充足，可以满足一般后续实验的需求。同时时间过长也会增强对细胞的胁迫，不利于富集后的分子检测，因此我们选择酶解4h时的细胞悬液进行后续实验中细胞的富集和纯化。

表5酶解时间对蜈蚣草原生质体释放效果的影响

注：原生质体释放效果根据结果评估星级，满5星。其中，2星表示该时间下释放的细胞数量相对较少；4星表示该时间下释放的细胞数量相对较多；5星表示该时间下释放的细胞数量做多。

实施例5富集离心转速、碎样方式和过滤方式原生质体的富集纯化效果的影响

一、实验方法

1、富集离心转速对原生质体数量/质量的影响

离心时的转速可以促进原生质体和破碎组织之间的分离纯化，获得更高质量的细胞悬液。按照实施例1的方法制备原生质体，比较不同离心转速(150g、300g和500g)对原生质体数量质量的影响。

2、碎样方式对原生质体数量/质量的影响

不同的碎样方式会极大的影响所得原生质体的碎片率结果，低碎片率对原生质体进一步分子操作有重要保障。按照实施例1的方法制备原生质体，比较分别用刀切法和剪样法，将根尖碎成0.1～1mm长的小段，对原生质体数量及质量的影响。

3、过滤方式对原生质体数量/质量的影响

不同大小膜孔的细胞筛在过滤样品过程中对原生质体的数量质量有较大影响。膜孔大的细胞筛可减少原生质体数量的损失但同时会增加碎片率，膜孔小的细胞筛可降低碎片率，但所得原生质体数量也随之降低。按照实施例1的方法制备原生质体，比较不同的过滤方式(70μm过滤膜、70μm过滤膜+40μm过滤膜和70μm过滤膜+40μm过滤膜+30μm过滤膜)对原生质体数量/质量的影响。

在显微镜下观察原生质体富集情况：用去尖头的200μL枪头轻轻吹吸混匀细胞，取10μL单细胞悬液，以悬液：0.4％(w/v)台盼蓝＝1：1(v/v)的比例混合，染色3min内，用细胞计数板统计全部的单细胞数量、碎片数量、原生质体数量、原生质体活性和碎片率。

二、实验结果

1、富集离心转速对原生质体数量/质量的影响

如图7和表6所示，不同的富集离心转速对蜈蚣草根尖原生质体的制备的结果有较大影响，其中图7a显示，富集离心转速150g所得的原生质体数量/质量最佳，图7b和图7c显示，随着转速的提升，原生质体破碎情况逐步加重，损失大量酶解获得的细胞，因此富集离心转速选择150g。

表6富集离心转速对蜈蚣草原生质体富集数量和质量的影响

注：原生质体富集数量和质量根据结果评估星级，满5星。其中，2星表示该离心转速下释放的大部分细胞形态受到严重影响，细胞破碎多；3星表示该离心转速下部分细胞形态受到严重影响，细胞破碎较多；5星表示该离心转速下细胞形态最为完好，细胞破碎少。

如图8和表7所示，不同的植物碎样方式对细胞悬液的质量有决定性影响。如图8a和图8b所示，剪样法可获得数量更多的原生质体细胞，但同时碎片率高达92％，过滤后，碎片率仍然保持较高水平，而细胞却大量损失。大量的碎片不但会影响细胞的富集，还会对后续分子操作产生阻碍。相反，如图8c和图8d所示，刀切法条件下过滤前后所得的原生质体数量可观，碎片率较剪样法显著降低，质量较好，因此选择刀切法进行细胞悬液的制备。

表7植物碎样方式对蜈蚣草原生质体富集数量和质量的影响

注：原生质体富集数量和质量根据结果评估星级，满5星。3星表示该碎样方式下部分细胞碎片率较高，最终获得的原生质体总量较低；5星表示该碎样方式下细胞碎片率较低，最终获得的原生质体总量较高。

如图9和表8所示，不同的原生质体过滤方式对根尖原生质体的制备结果有显著影响。如图9a所示，70μm过滤膜细胞数量多，但细胞碎片率高；图9b所示，70μm过滤膜+40μm过滤膜条件下所得的原生质体数量/质量最佳；图9c所示的70μm过滤膜+40μm过滤膜+30μm过滤膜条件下得到的原生质体数量减少，且碎片率有所上升，因此选择70μm过滤膜+40μm过滤膜对原生质体进行过滤纯化。

表8原生质体过滤方式对蜈蚣草原生质体富集数量和质量的影响

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注：原生质体富集数量和质量根据结果评估星级，满5星。3星表示该过滤方式下碎片率较高，细胞数量及活性较好；4星表示该过滤方式下碎片率一般，细胞数量较少，活性较好；5星表示该过滤方式下碎片率最低，细胞数量及活性较好。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种蜈蚣草原生质体的制备方法，其特征在于，使用如下制备方法对蜈蚣草进行前处理，

S1：将采集的蜈蚣草根尖组织碎样，所述碎样方法为刀切法；

S2：将含有纤维素酶、果胶酶和离析酶的酶解液与步骤S1碎样后的蜈蚣草根尖组织混合，避光真空处理后，再恢复气压至100～101 kpa酶解，得到酶解产物；

所述酶解液中纤维素酶的浓度为2％w/v，果胶酶的浓度为0.1％w/v，离析酶的浓度为1％w/v；所述纤维素酶为纤维素酶R-10，所述果胶酶为果胶酶Y-23，所述离析酶为离析酶R-10；

避光真空处理时间为10 min；

酶解温度为30℃，酶解时间为4 h；

S3：纯化；

将甘露醇或海藻糖与步骤S2得到的酶解产物混合，用细胞分离装置分离混有甘露醇或海藻糖的酶解产物，用注射器的活塞按压过滤器上的组织促进细胞释放，收集分离液，150g离心，去上清，用甘露醇或海藻糖重悬，重复分离，离心，去上清，得到细胞悬液；

分离所用滤膜为40 μm过滤膜加70 μm过滤膜。