CN115181735B - 一种制备杨树根原生质体的复合酶液和方法 - Google Patents
一种制备杨树根原生质体的复合酶液和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种制备杨树根原生质体的复合酶液，该复合酶液括以下组分：纤维素酶RS、果胶酶Y‑23、2‑(N‑吗啉基)乙磺酸(MES)、甘露醇、CaCl2、KH2PO4、MgSO4和KNO3；其中，纤维素酶RS的质量浓度为3±0.2％(w/v)，果胶酶Y‑23的质量浓度为1±0.2％(w/v)。根据杨树根细胞的细胞膨压高、细胞壁果胶含量高等特点，通过合理地选择酶解能力更强的酶，调整用量等措施，有效地制备了杨树根原生质体，并且杨树根原生质体的存活率高。
Description
技术领域
本发明涉及植物细胞生物技术领域，尤其涉及一种制备杨树根原生质体的复合酶液和方法。
背景技术
植物原生质体是指去除细胞壁后，被质膜所包围的、具有生活力的细胞。原生质体被广泛应用于植物细胞生物学、生理生化、分子生物学、组学、育种等的研究中，如蛋白的亚细胞定位检测、胞内生化反应的实时检测、离子通道/转运体理化性质分析、单细胞测序、植物转基因、组织再生、细胞融合培育新品种等。
制备原生质体的方法主要有两种：机械分离法和酶解分离法。机械分离法存在产量低、方法繁琐以及对分生组织和液泡化程度不高的细胞分离效率低等缺点，现已很少使用。酶解分离法是目前普遍采用的原生质体分离方法。酶解法通常包括预处理、酶解和纯化三个步骤。由于不同种类植物、不同植物器官原生质体分离方法存在很大差异，因此，对于不同植物或同一植物不同器官的原生质体制备均需要根据具体情况而进行细致地摸索和优化。目前，现有技术中已经建立了一些高效的原生质体制备方法。例如，在发明专利“CN110577925B一种制备水稻根原生质体的组合物和方法”中，谷晓峰和刘青建立了水稻根原生质体制备酶液和方法，其所使用的酶液包括纤维素酶RS(2％)、半纤维素酶、离析酶R10(1％)、果胶酶Y-23(0.5％)、甘露醇(0.6mol/L)、MES(0.01mol/L)、CaCl2(1mmol/L)、牛血清蛋白(1g/L)、β-巯基乙醇(0.04g/L)和羧苄青霉素(50mg/L)；在发明专利“CN113430161A一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法”中，张兵等建立了狗牙根叶片原生质体制备酶液和方法，其酶液包括纤维素酶R10(2％–4％)、离析酶R10(0.6％-0.8％)、MES(20mmol/L)、甘露醇(0.52mol/L)、KCl(20mmol/L)、CaCl2(10mmol/L)和牛血清蛋白(0.1％)；舒小娟等建立了葡萄叶片原生质体制备酶液和方法，其酶液包括纤维素酶R10(3％)、离析酶R10(0.75％)和甘露醇(0.6mol/L)(葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立，研究论文，西北植物学报，2015，35(6)：1262-1268)等。
杨树是林木研究的模式植物，因此杨树原生质体的制备对林木研究具有重要意义。现有技术中，已建立了从杨树叶片、木材中制备原生质体的方法。然而目前，针对杨树根原生质体高效制备的方法尚未见报道。虽然一些研究也制备出了杨树根的原生质体(如NaCl-Induced Alternations of Cellular and Tissue Ion Fluxes in Roots of Salt-Resistant and Salt-Sensitive Poplar Species,Plant physiology,2009,149:1141–1153；Salinity tolerance of Populus,Plant biology,2010,12:317–333)，但这些研究只是简单地借用其它植物根(如玉米、拟南芥等植物根)原生质体的制备方法，直接应用于杨树根的原生质体制备，其效率、产量和质量均有待商榷。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种制备杨树根原生质体的复合酶液和方法，其针对杨树根与地上组织的不同之处，根据其细胞膨压高、细胞壁果胶含量高等特点，通过合理地选择酶解能力更强的酶并调整用量等措施，高效率地制备杨树根原生质体，并且使杨树根原生质体的存活率高。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种制备杨树根原生质体的复合酶液，该复合酶液括以下组分：
纤维素酶RS、果胶酶Y-23、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、甘露醇、CaCl2、KH2PO4、MgSO4和KNO3；
其中，纤维素酶RS的质量浓度为3±0.2％(w/v)，果胶酶Y-23的质量浓度为1±0.2％(w/v)。
植物初生细胞壁只要由三种多糖构成，即纤维素、半纤维素和果胶，纤维素酶可降解细胞壁中的纤维素、半纤维素，促使细胞壁溶解，其广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)。常用的纤维素酶RS源于木霉突变株，其母株为纤维素酶R-10生产菌株，纤维素酶RS与纤维素酶R-10相比具有更高的分解天然纤维素的活性，因此能在更短时间内降解细胞壁，获得原生质体。
本发明的复合酶液中，采用了酶解能力更强的纤维素酶RS和果胶酶Y-23联合使用，能有效地实现杨树根部强度更高、韧性更大的细胞壁的酶解。同时，本发明中纤维素酶RS的质量浓度为3±0.2％(w/v)，果胶酶Y-23的质量浓度为1±0.2％(w/v)。这两种酶的含量不能低于下限值，否则会导致细胞壁难以酶解，酶解程度不够，原生质体数量低；同时这两种酶含量不能高于上限值，否则会严重降低原生质体的存活率，无法获取满足要求的研究样品。
进一步的，复合酶液中的纤维素酶RS的质量浓度为3％(w/v)，果胶酶Y-23的质量浓度为1％(w/v)。
进一步的，纤维素酶RS和果胶酶Y-23的质量比为3:1。
发明人研究发现，当复合酶液中纤维素酶RS和果胶酶Y-23的质量比为3:1时，原生质体数量最多，并且原生质体的存活率也相对较高，当提高或降低纤维素酶RS和果胶酶Y-23中任一种酶的含量，都会降低制得的原生质体数量，同时存活率也会降低，因此，复合酶液中纤维素酶RS和果胶酶Y-23的最适宜的质量比为3:1。
进一步的，本发明的复合酶液包括以下浓度的各组分：
3％(w/v)纤维素酶RS、1％(w/v)果胶酶Y-23、20mmol/L 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、0.6mol/L甘露醇、10mmol/L CaCl2、0.2mmol/LKH2PO4、1mmol/L MgSO4和1mmol/LKNO3。
复合酶液中，纤维素酶RS质量浓度采用3％(w/v)，果胶酶Y-23质量浓度采用1％(w/v)，设置了合理的配比，增加了两种酶的用量，更多的获得原生质体的同时，也能保证原生质体较高存活率；此外，甘露醇浓度为0.6mol/L，通过在复合酶液中适当地增加甘露醇的浓度，甘露醇可作为维持细胞膜内外渗透压平衡的稳定剂，适当提高用量，可以提高甘露醇对原生质体的保护效果，减少了原生质体发生胀破的数量，从而提高存活率。
进一步的，本发明的复合酶液pH值为5.6。
酶液pH值的高低，直接影响酶的活性，其中纤维素酶RS的最适pH为4–5，果胶酶Y-23的最适pH为4.5–6.5。同时，杨树根原生质体的活性也受pH的影响，其最适pH为5.6-5.8。由于原生质体活性对pH十分敏感，因此，将酶液pH设为5.6，在维持原生质体高活性的同时，尽可能兼顾酶活性，从而得到较高的原生质体产率。
第二方面，本发明提供一种制备杨树根原生质体的方法，主要包括以下步骤：
S1、根据本发明提出的复合酶液配方，配制复合酶液；
S2、将步骤S1制得的复合酶液加热预处理，冷却至室温备用；
S3、取杨树根尖，采用甘露醇溶液浸泡处理，得到甘露醇处理后的杨树根尖；
S4、将步骤S3中得到的杨树根尖切段后，采用所述复合酶液进行避光酶解，得到酶解液；
S5、将步骤S4得到的酶解液过滤，所得滤液进行离心分离，收集沉淀物，采用W5溶液重悬沉淀物，重悬后得到杨树根原生质体。
进一步的，步骤S1中所述复合酶液加热预处理采用水浴加热，温度为55℃，加热时间10–20min。
进一步的，杨树根尖为杨树根顶端0–5mm的区段，采用甘露醇处理后，切成长度为1mm的根段进行酶解。
进一步的，步骤S3中，甘露醇浓度为0.7mol/L，浸泡时间为20–40min。
进一步的，步骤S4中，酶解温度为26-28℃，转速为75–80r/min，酶解时间为3-4小时。
进一步的，步骤S4中，酶解温度为28℃，转速为80r/min，酶解时间为3小时。
进一步的，步骤S4中，所述复合酶液用量为10–20ml/每克杨树根尖。
进一步的，步骤S5中，所述W5溶液包括CaCl2溶液、NaCl溶液、KCl溶液、葡萄糖和水。
(三)有益效果
本发明提供的制备杨树根原生质体的复合酶液，包含了具备更强酶解能力的纤维素酶RS和果胶酶Y-23，并且，通过设置合理的浓度和配比，提高对杨树根细胞细胞壁的酶解能力，提高原生质体数量，同时还能够保持相对较高的原生质体存活率。此外，本发明还通过提高复合酶液中甘露醇的浓度，增加其对于原生质体的保护作用，减少了原生质体胀破现象，从而提高存活率。
本发明提供的制备杨树根原生质体的方法，利用包含纤维素酶RS和果胶酶Y-23的复合酶液对杨树根酶解，并且酶解前先将复合酶液经过水浴加热预处理，提高了酶的活性，从而提高了原生质体产量；本发明还采用了0.7mmol/L的甘露醇溶液浸泡处理杨树根尖，使细胞质壁分离，从而使酶液与细胞壁充分接触，提高了酶解效率，增加了原生质体的产率；本发明在酶解时，增加了酶解的转速，并且酶解时间为3–3.5小时，转速的增加以及酶解时间的科学合理的设置均能使得本发明制备方法具有较高的产率和存活率。
综上所述，利用本发明的复合酶液和方法制备的杨树根原生质体浓度可达6×106个/克根，原生质体存活率可达90％以上，并且本发明中复合酶液中酶的种类少，配置简单；同时，本发明的原生质体制备时间更短，能更大程度的保留原生质体的生理生化代谢活性。
附图说明
图1为实施例2制得的杨树根尖原生质体活性检测图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
根据发明人长期研究发现，杨树根原生质体与杨树叶片、木材原生质体的制备方法有明显不同，前者难度更大。杨树根位于地下，其结构、生理生化代谢过程与叶片、木材这些位于地上部分的组织存在明显不同，相对于叶片和木材细胞，杨树根细胞排列更加紧密，细胞膨压更高，细胞壁果胶含量高、韧性和强度更高。因此，这些特点导致杨树根细胞壁很难被酶解，且杨树根原生质体很容易因膨压大而胀破。因而制备杨树叶片和木材原生质体所采用的酶液和方法难以用于杨树根原生质体的制备。基于上述研究结论，发明人提供了本发明方案的设计构思。
本实施例提出一种制备杨树根原生质体的方法，包括以下步骤：
S1、根据本发明提出的复合酶液配方，配制复合酶液。
其中，复合酶液包括以下浓度的各组分：
3±0.2％(w/v)纤维素酶RS、1±0.2％(w/v)果胶酶Y-23、20mmol/L2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、0.6mol/L甘露醇、10mmol/L CaCl2、0.2mmol/L KH2PO4、1mmol/L MgSO4和1mmol/L KNO3。本实施例中采用了具备较强酶解能力的纤维素酶RS酶解细胞壁中的纤维素、半纤维素等，并配合果胶酶Y-23降解细胞壁间的中胶层。当纤维素酶RS质量浓度为3％(w/v)，果胶酶Y-23质量浓度为1％(w/v)时，也就是两者质量比为3:1时，制得的复合酶液酶解效果最好，酶解得到的原生质体数量最多，且存活率也相对较高。配制复合酶液时，pH值通过影响酶的活性和原生质体的活性，从而影响酶液酶解效果和原生质体存活率，本实施例配制复合酶液过程中，pH值调节为5.6，在保证原生质体活性的条件下，提高原生质体的产率。
S2、将步骤S1制得的复合酶液加热预处理，冷却至室温备用。
本实施例中，复合酶液在使用前需经过预处理过程，预处理采用水浴加热的方式，将盛有复合酶液的容器置于55℃水浴中，加热10–20min后，转移至培养皿中备用。经过预处理的复合酶液，可提高酶的酶解能力，增加制得的原生质体数量。
S3、取杨树根尖，采用0.7mol/L的甘露醇溶液浸泡处理，浸泡时间为20–40min，得到甘露醇处理后的杨树根尖。
本实施例所使用的杨树根来自于水培灰杨(Populus×canescens)苗，其培养过程和条件为：取生长一个月的灰杨组培苗，转移到1/4的Hoagland营养液中培养一个月。培养过程中持续向营养液中泵入空气，每隔2天更新一次营养液。杨树苗被放置在人工气候室中，温度为20–24℃，光照时间为16小时，光照强度为1000lux。经培养后，取直径约为0.2mm的杨树根，截取顶端0–5mm的区段(包含根冠、分生区、伸长区、成熟区)用于原生质体制备。
S4、将步骤S3中得到的杨树根尖切成长度为1mm的根段，采用预处理得到的复合酶液进行避光酶解，得到酶解液。
其中，酶解温度为26–28℃，转速为80r/min，酶解时间为3小时。并且，每克根需要复合酶液体积为10–20ml。
S5、将步骤S4得到的酶解液过滤，所得滤液进行离心分离，收集沉淀物，采用W5溶液重悬沉淀物，重悬后得到杨树根原生质体。
本实施例中，采用孔径50μm的滤网过滤酶解液，收集滤液，随后在4℃，100g条件下离心5分钟，去上清液，收集沉淀物，沉淀物采用W5溶液进行重悬，其中，W5溶液由125mmol/L的CaCl2溶液、5mmol/L的KCl溶液、5mmol/L的葡萄糖溶液、155mmol/L NaCl溶液和去离子水组成，且W5溶液pH调至5.6。重悬后，去上清液，收集沉淀物为制得的杨树根尖原生质体。
实施例1
实施例1及对比例1-5的设置是为验证不同酶液对制备杨树根尖原生质体的影响。
1、溶液的配制
1.1、实施例1复合酶液的配制
本实施例根据本发明中提出的配方配制进行复合酶液的配制。
首先配置复合酶液的基础液，用去离子水配置20mmol/L MES溶液，随后加入甘露醇、CaCl2、KH2PO4、KNO3、MgSO4，使它们的终浓度分别达到0.6mol/L、10mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L和1mmol/L，将pH调至5.6。随后在基础液中按比例加入纤维素酶RS和果胶酶Y-23，其中纤维素酶RS质量浓度3％，果胶酶Y-23质量浓度1％，例如，在10ml的基础液中加入0.3g纤维素酶RS，0.1g果胶酶Y-23，配制得到复合酶液。
1.2、对比例1-6复合酶液的配制
对比例1至对比例6中基础液含量及浓度均与实施例1相同，为20mmol/L MES溶液、0.6mol/L的甘露醇溶液、10mmol/L的CaCl2溶液、0.2mmol/L的KH2PO4溶液、1mmol/L的KNO3溶液、1mmol/L的MgSO4溶液和去离子水，将pH值调节为5.6。随后，分别加入与实施例1不同的酶液，其中，对比例1至对比例6添加酶液如下表所示：
表1对比例1-6中酶的种类和含量
| 纤维素酶R10 | 纤维素酶RS | 离析酶R10 | 果胶酶Y-23 | |
| 对比例1 | 3％ | / | 1％ | 1％ |
| 对比例2 | 2％ | 2％ | 1％ | 1％ |
| 对比例3 | / | 2％ | / | 1％ |
| 对比例4 | / | 3％ | / | 0.5％ |
| 对比例5 | / | 3％ | / | 1.5％ |
| 对比例6 | / | 4％ | / | 1％ |
注：“/”表示不含有该组分
1.3、W5溶液的配制
在去离子水中加入CaCl2、KCl、葡萄糖和NaCl，使它们的终浓度分别达到125mmol/L、5mmol/L、5mmol/L和155mmol/L，pH调至5.6。
2、材料的获得
2.1、杨树的培养
将生长一个月的灰杨组培苗转运到1/4Hoagland营养液中培养一个月。培养过程中持续向营养液中泵入空气，每隔2天更新一次营养液。杨树苗被放置在人工气候室中，温度为20–24℃，光照时间为16小时，光照强度为1000lux。
2.2、杨树根尖处理
取直径约为0.2mm的杨树根，截取顶端0–5mm的区段，随后浸入到0.7mol/L的甘露醇溶液中，预处理30分钟。
3、原生质体的制备实验
将浸泡后的杨树根尖从甘露醇溶液中取出，用双面刀片切成1mm长的小段，随后立即转移至盛有实施例1及对比例1至对比例6的复合酶液的培养皿中，每克根尖加入复合酶液体积为15ml，将培养皿置于28℃的培养箱中，80r/min避光酶解4个小时。
酶解后，用孔径50μm的滤网过滤酶解液，收集滤液，随后在4℃，100g条件下离心5分钟，去上清，收集原生质体；随后用W5溶液重悬原生质体。利用细胞计数板计数原生质体数量，并利用FDA染色观察原生质体，统计存活率。
上述试验设置三次重复实验，结果取平均值，得到的原生质体统计结果如表2所示。
表2不同复合酶液对杨树根原生质体产量和质量的影响
| 原生质体数量(百万个/克) | 原生质体存活率(％) | |
| 实施例1 | 1.77±0.37 | 76±4 |
| 对比例1 | 0.89±0.08 | 79±3 |
| 对比例2 | 0.94±0.09 | 77±4 |
| 对比例3 | 0.93±0.12 | 76±3 |
| 对比例4 | 1.13±0.17 | 81±3 |
| 对比例5 | 1.43±0.09 | 63±2 |
| 对比例6 | 1.30±0.08 | 73±2 |
根据以上实验结果可以看出，对比例1和对比例2中仅含有纤维素酶R10、离析酶R10和果胶酶Y-23，以及还同时含有少量纤维素酶RS的复合酶液制备得到的原生质体数量都明显低于实施例1中复合酶液制得的原生质体数量；并且，根据实施例1及对比例3至对比例6可以看出，两种酶液的用量及比例对制得的原生质体数量和存活率有重要的影响，当纤维素酶RS和果胶酶Y-23含量分别为3％和1％时，原生质体产量最高，且存活率也相对较高。
实施例2
本实施例根据实施例1中复合酶液的组成配制复合酶液及其他溶液，并根据本发明提供的制备方法进行杨树根原生质体的制备。
1、复合酶液预处理：
将盛有复合酶液的容器置于55℃水浴中加热10分钟，随后在室温自然冷却，备用。
2、材料的获得：
将生长一个月的灰杨组培苗转运到1/4Hoagland营养液中培养一个月。培养过程中持续向营养液中泵入空气，每隔2天更新一次营养液。杨树苗被放置在人工气候室中，温度为20-24℃，光照时间为16小时，光照强度为1000lux。经培养后，取直径约为0.2mm的杨树根，截取顶端0-5mm的区段，浸入到0.7mol/L的甘露醇溶液中，预处理30分钟。
3、原生质体的获得：
将经过甘露醇溶液浸泡处理的根尖取出，用双面刀片切成1mm长的小段，随后立即转移至盛有复合酶液的培养皿中，每克根尖加入15ml复合酶液，然后将培养皿置于28℃的培养箱中，80r/min避光酶解3个小时。酶解结束后，用孔径50μm的滤网过滤酶解液，收集滤液，随后在4℃，100g条件下离心5分钟，去上清，收集原生质体；随后用W5溶液重悬原生质体，去除上清液，得到杨树根尖原生质体。
对比例7
本例探究了复合酶液预处理对制备原生质体的影响。
本例中，复合酶液的配制、材料的获得和后续原生质体的获得过程均与实施例2相同，不同的是，本例中的复合酶液不经过水浴加热的预处理过程，配制得到的复合酶液直接用于原生质体的制备，得到杨树根尖原生质体。
对比例8-10
对比例8-10探究了不同酶解时间对制备原生质体的影响。
在对比例8-10中，复合酶液的配制、材料的获得过程均与实施例2相同，不同的是，本例在获得原生质体的过程中，分别设置不同的酶解时间，其他的酶解条件和实施例2相同，分别制备得到杨树根尖原生质体。酶解时间分别为：
| 对比例 | 酶解时间 |
| 对比例8 | 2小时 |
| 对比例9 | 4小时 |
| 对比例10 | 5小时 |
对比例11-12
对比例11-12探究了复合酶液中不同的甘露醇浓度对制备原生质体的影响。
在对比例11-12配制复合酶液时，酶液的用量、浓度，基础液中MES溶液、CaCl2溶液、KH2PO4溶液、KNO3溶液和MgSO4溶液的浓度和用量均与实施例2相同，其中，分别设置不同的甘露醇的浓度，得到不同复合酶液。其余的材料的获得、原生质体的获得过程均与实施例2相同。甘露醇浓度设置如下：
| 对比例 | 甘露醇浓度 |
| 对比例11 | 0.5mol/L |
| 对比例12 | 0.7mol/L |
实施例2及对比例7至对比例12的原生质体制备实验设置三次重复实验，分别利用细胞计数板计数原生质体数量，并利用FDA染色观察原生质体，统计存活率，结果取平均值，得到的原生质体统计结果如表3所示：
表3实施例2、对比例7-12制备原生质体统计
| 原生质体数量(百万个/克) | 原生质体存活率(％) | |
| 实施例2 | 5.99±0.30 | 90±3 |
| 对比例7 | 1.85±0.03 | 76±4 |
| 对比例8 | 1.66±0.21 | 95±3 |
| 对比例9 | 4.12±0.14 | 88±3 |
| 对比例10 | 2.87±0.19 | 36±1 |
| 对比例11 | 4.82±0.12 | 93±3 |
| 对比例12 | 4.19±0.21 | 85±3 |
由以上实验可以看出，其中，根据实施例2及对比例7，复合酶液的预处理可以提高酶的活性，经过水浴加热预处理的复合酶液制备得到的原生质体数量增加一倍以上，并且，原生质体的存活率提高，因此，复合酶液的水浴加热预处理能够提高原生质体数量和存活率。根据实施例2及对比例8至对比例10可知，随酶解时间的增加，原生质体的数量先升高再降低，而原生质体的存活率则逐渐降低，当酶解时间为3小时时，原生质体的产量和存活率均维持在较高水平。根据实施例2及对比例11和对比例12可知，随着复合酶液中甘露醇浓度的增加，酶解制得的原生质体数量先升高再降低，原生质体存活率则逐渐降低，其中，甘露醇浓度为0.6mol/L时，原生质体的产量最高，同时原生质体存活率也可以维持在适当水平。
实施例3
本例采用本发明中的方法制备84K杨的根部原生质体。
1、复合酶液的配制：用去离子水配置20mmol/L MES溶液，然后加入甘露醇、CaCl2、KH2PO4、KNO3、MgSO4，使它们的终浓度分别达到0.6mol/L、10mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L和1mmol/L，并将pH调至5.6。再向溶液中加入3％的纤维素酶RS和1％的果胶酶Y-23，得到复合酶液。
3、材料的获得：
将生长一个月的84K杨(Populus alba×Populus glandulosa)组培苗转运到1/4Hoagland营养液中培养一个月。培养过程中持续向营养液中泵入空气，每隔2天更新一次营养液。杨树苗被放置在人工气候室中，温度为20-24℃，光照时间为16小时，光照强度为1000lux。取直径约为0.2mm的杨树根，截取顶端0–5mm的区段，随后浸入到0.7mol/L的甘露醇溶液中，预处理30分钟。
4、原生质体的获得：
将浸泡后的杨树根尖从甘露醇溶液中取出，用双面刀片切成1mm长的小段，随后立即转移至盛有复合酶液的培养皿中，每克根尖加入复合酶液体积为15ml，将培养皿置于28℃的培养箱中，80r/min避光酶解3个小时。
酶解后，用孔径50μm的滤网过滤酶解液，收集滤液，随后在4℃，100g条件下离心5分钟，去上清，收集原生质体；随后用W5溶液重悬原生质体。试验设置三次重复实验，结果取平均值，并利用细胞计数板计数原生质体数量，利用FDA染色观察原生质体，统计存活率。制得的原生质体数量为5.54±0.31(百万个/克)，存活率为90±4％，由此可见，本发明提供的复合酶液和原生质体制备方法对于其他杨树也同样有效，可获得较高的原生质体数量及存活率，因此本发明的复合酶液和原生质体制备方法具有一定的普适性，可应用于其他杨树。
实施例4
实施例4及对比例13–14的设置是为对比不同酶液和方法制备杨树根尖原生质体的效率。实施例4将采用本发明的酶液和方法，对比例13将采用Sun等(NaCl-InducedAlternations of Cellular and Tissue Ion Fluxes in Roots of Salt-Resistant andSalt-Sensitive Poplar Species,Plant physiology,2009,149:1141–1153.)制备胡杨根原生质体的酶液和方法，对比例14将采用谷晓峰和刘青(CN110577925B一种制备水稻根原生质体的组合物和方法)制备水稻根原生质体的酶液和方法。
1、溶液的配制
1.1、实施例4复合酶液的配制
用去离子水配置20mmol/L MES溶液，然后加入甘露醇、CaCl2、KH2PO4、KNO3、MgSO4，使它们的终浓度分别达到0.6mol/L、10mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L和1mmol/L，并将pH调至5.6。再向溶液中加入3％的纤维素酶RS和1％的果胶酶Y-23，得到复合酶液。
1.2、对比例13酶液组合物的配置
用去离子水配置2mmol/L MES溶液，随后加入甘露醇、CaCl2、MgCl2、牛血清白蛋白，使他们的终浓度分别达到0.33mol/L、10mmol/L、2mmol/L、0.1％，并将pH调至5.7。再向溶液中加入1.5％的纤维素酶R10、1％的离析酶和0.1％的果胶酶Y-23，得到酶液组合物。
1.3、对比例14酶液组合物的配置
用去离子水配置10mmol/L MES溶液，随后加入甘露醇、纤维素酶RS、半纤维素酶、离析酶R10、果胶酶Y-23，使他们的终浓度分别达到0.6mol/L、2％、1％、0.75％、0.5％，并将pH调至5.7。将溶液在55℃水浴中加热10分钟，随后加入CaCl2、牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、羧苄青霉素，使它们的终浓度分别达到1mmol/L、1g/L、0.04％(v/v)、50mg/L。
2、杨树的培养
将生长一个月的灰杨组培苗转运到1/4Hoagland营养液中培养一个月。培养过程中持续向营养液中泵入空气，每隔2天更新一次营养液。杨树苗被放置在人工气候室中，温度为20–24℃，光照时间为16小时，光照强度为1000lux。
3、原生质体的制备
3.1、实施例4原生质体制备方法
取直径约为0.2mm的杨树根，截取顶端0-5mm的区段，随后浸入到0.7mol/L的甘露醇溶液中，预处理30分钟。将盛有复合酶液的容器置于55℃水浴中加热10分钟，随后在室温自然冷却，备用。将浸泡后的杨树根尖从甘露醇溶液中取出，用双面刀片切成1mm长的小段，随后立即转移至盛有复合酶液的培养皿中，每克根尖加入复合酶液体积为15ml，将培养皿置于28℃的培养箱中，80r/min避光酶解3个小时。酶解后，用孔径50μm的滤网过滤酶解液，收集滤液，随后在4℃，100g条件下离心5分钟，去上清，收集原生质体；随后用W5溶液重悬原生质体。
3.2、对比例13原生质体制备方法
取直径约为0.2mm的杨树根，截取顶端0–5mm的区段，用双面刀片切成1mm长的小段，随后立即转移至盛有复合酶液的培养皿中，每克根尖加入复合酶液体积为15ml，将培养皿置于28℃的培养箱中，60r/min避光酶解6个小时。随后，用孔径50μm的滤网过滤酶解液，收集滤液。未消解的组织被转移到3mL的维持溶液中(含有5mmol/L KCl、2mmol/LCaCl2、1mmol/L MgCl2、10mmol/L蔗糖、10mmol/L葡萄糖、2mmol/LMES、0.33mol/L甘露醇，pH为5.7)，用玻璃棒轻轻搅拌，使原生质体进一步脱落。随后再一次用滤网过滤，收集滤液。滤液在300g下离心5min，去上清，用维持溶液重悬原生质体。
3.3、对比例14原生质体制备方法
取直径约为0.2mm的杨树根，截取顶端0–5mm的区段，用双面刀片切成1mm长的小段，随后立即转移至盛有复合酶液的培养皿中，每克根尖加入复合酶液体积为15ml。将培养皿放到真空室中，抽真空30min。随后，将培养皿放到28℃的培养箱中，60r/min避光酶解2个小时，再80r/min避光酶解半小时。加入W5溶液终止酶解反应，得到混合液。将混合液过50μm的滤网，随后130g离心5min，去上清，收集原生质体；随后用W5溶液重悬原生质体。
实施例4及对比例13和14的原生质体制备实验设置三次重复实验，分别利用细胞计数板计数原生质体数量，并利用FDA染色观察原生质体，统计存活率，结果取平均值，得到的原生质体统计结果如表4所示：
表4实施例4、对比例13–14制备原生质体统计
| 原生质体数量(百万个/克) | 原生质体存活率(％) | |
| 实施例4 | 6.01±0.35 | 91±2 |
| 对比例13 | 1.51±0.11 | 94±2 |
| 对比例14 | 2.15±0.16 | 91±1 |
由以上实验可以看出，相比于已有的植物根原生质体制备酶液和方法，利用本发明的复合酶液和方法制备杨树根原生质体，数量提高了1.8–3倍，同时原生质体的存活率未有明显降低。因此，本发明的复合酶液和方法在杨树根原生质体制备中具有明显优势。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种制备杨树根原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、配制复合酶液，所述复合酶液为以下浓度的各组分：
3% (w/v)纤维素酶RS、1% (w/v)果胶酶Y-23、20 mmol/L 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、0.6 mol/L甘露醇、10 mmol/L CaCl2、0.2 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L MgSO4和1 mmol/LKNO3；
S2、将步骤S1制得的复合酶液加热预处理，冷却至室温备用；
S3、取杨树根尖，采用甘露醇溶液浸泡处理，得到甘露醇处理后的杨树根尖；
S4、将步骤S3中得到的杨树根尖切段后，采用所述复合酶液进行避光酶解，得到酶解液；酶解温度为26-28℃，转速为60-80 r/min，酶解时间为3-3.5小时；
S5、将步骤S4得到的酶解液过滤，所得滤液进行离心分离，收集沉淀物，采用W5溶液重悬沉淀物，重悬后得到杨树根原生质体；
所述W5溶液包括CaCl2溶液、NaCl溶液、KCl溶液、葡萄糖和水。
2.根据权利要求1所述的制备杨树根原生质体的方法，其特征在于，所述复合酶液的pH值5.6。
3.根据权利要求1所述的制备杨树根原生质体的方法，其特征在于：
步骤S2中所述复合酶液加热预处理采用水浴加热，温度为55℃，加热时间10-20 min。
4.根据权利要求1所述的制备杨树根原生质体的方法，其特征在于：
步骤S3中，所述甘露醇浓度为0.7 mol/L，浸泡时间为20-40 min。
5.根据权利要求1所述的制备杨树根原生质体的方法，其特征在于，步骤S4中，所述复合酶液用量为10-20 ml/每克杨树根尖。
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| CN106967670A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-07-21 | 江苏省农业科学院 | 一种杜梨原生质体的制备方法 |
| CN112048464A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-08 | 北京林业大学 | 一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法 |
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