CN110343717B - 杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，属于植物细胞学技术领域。本发明的方法为杉木茎段通过酶解法消化酶解释放原生质体、原生质体经纯化、以PEG介导外源基因质粒DNA转化进原生质体中，实现外源基因在裸子植物杉木中的高效瞬时转化，大幅度提高杉木的转化效率。为杉木主要候选基因的分子生物学研究及遗传转化提供的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞学技术领域，主要涉及一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法。
背景技术
杉木（Cunninghamia lanceolata）又名沙木，属柏目，杉科乔木，其具有生长快，材性好，产量高，用途广等特点，是我国特有的亚热带树种，主要在我国长江流域及秦岭以南广泛栽种，是我国重要的商品材树种之一，其杉木根、杉木皮、杉木、杉木叶、种子等都具有一定的药用价值。目前还未见杉木在遗传转化方面的研究报道。原生质体作为细胞组成的一个形态结构单位，是没有细胞壁包被的裸露细胞，由于没有细胞壁，可以作为遗传转化的理想材料，原生质体转化的原理是通过改变细胞膜的通透性来导入外源基因，从而实现瞬时表达或进行长期表达得到转基因细胞团或转基因植株。在一些木本植物中，已可以成功的分离纯化得到原生质体，但是绝大部分的木本植物原生质体的分离纯化体系还尚未成熟，即使在已有相关报道中转化效率较好的杨树也才达到30%的转化效率。杉木作为主要的木本植物，同样也是典型的裸子植物，本专利首次在裸子植物中建立了高效的外源基因转化体系，该体系目前尚未见报道过。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法。
为实现上述目的，主要采取如下的技术方案：
一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，包含以下步骤：（1）对杉木茎段进行消化酶解；（2）酶解后的茎段转入MMG溶液中释放得到原生质体悬浮液，经过离心沉淀，得到纯化的原生质体；（3）得到纯化的原生质体进行产量和活性检测；（4）通过PEG介导进行外源基因的瞬时转化；（5）检测原生质体转化效率；
上述步骤（1）杉木茎段为生长健康的一年生杉木苗，将其剪成8-10cm长茎段，并去皮。
上述步骤（1）消化酶解为：将杉木茎段放入酶解液中黑暗避光静置育孵处理2-4h，温度25℃-26℃；其酶解液配方为： Cellulase R-10：1.5%（w/v），Macerozyme R-10： 0.4%（w/v），Mannitol：0.5M，MES：20mM（pH5.7），KCl：20mM，CaCl2：10mM，0.1%（w/v）BSA，ddH2O：定容至40mL体积。
上述步骤（2）中将经过酶解处理的茎段从酶解液转移至MMG溶液中，水平轻晃1-2min，释放原生质体，MMG变浑浊，得原生质体悬浮液；原生质体悬浮液用70μm滤网2层进行过滤，收集滤液，将滤液离心3-5min，吸去上清，剩下沉淀，用MMG重悬沉淀，得到纯化的原生质体；其中MMG溶液的配方为：Mannitol：0.4M，MES：4mM（pH 5.7），MgCl2：15mM，ddH2O：定容至50mL体积。
上述步骤（3）得到纯化的原生质体产量和活性检测为：取10μL分离得到的纯化原生质体滴加在血球计数板上，使得液体充满整个计数室，在显微镜下观察和计数，原生质体个数＝（血球计数板5个大方格内总原生质体个数×104×稀释倍数）；原生质体的活力测定采用Trypan Blue染色法，正常的活细胞具有完整的胞膜结构，对台盼蓝排斥，台盼蓝不能穿越细胞质膜，不能使其进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，通常认为细胞膜完整性丧失。
Trypan Blue染色方法：取5μL纯化的原生质体于干净的EP管，等体积加入5μL0.2%（w/v）的台盼蓝染色，轻轻混匀，按照原生质体产量的检测方法，置于血球计数板上，在显微镜白光观察并记录被台盼蓝染色的蓝色原生质体个数与总原生质体个数的比值。重复3次，每次重复统计5个视野，取平均值。原生质体活力=（蓝色的原生质体的数量/原生质体总数）×100%
上述步骤（4）通过PEG介导进行外源基因的瞬时转化具体为：在浓度为5×105 -7×105个/mL的纯化的原生质体悬浮液中，依次加入质粒DNA和PEG 4000（现配现用），轻弹混匀，室温孵育15min，相同操作，空白对照组加入与质粒DNA等体积量的ddH2O代替质粒DNA；孵育15min后，缓慢加入500μL的CPW9M 终止反应，轻柔旋转混匀，300g离心3 min，重复此操作2-3次，得到转化后的原生质体沉淀，使用CPW9M溶液缓慢重悬沉淀，将悬浮的转化后的原生质体轻轻转移至90 mm圆形培养皿上，25℃黑暗孵育16-20h；培养皿在加入原生质体前需用1mL 1% （w/v）BSA 洗涤，将培养皿中BSA去除，再加入转化的原生质体。
进一步的，上述步骤（4）中所述质粒DNA为pUC19-35s-sGFP。
进一步的，上述步骤（4）中V（原生质体） :V（质粒DNA） :V（PEG4000）=10:1:11；
进一步的，上述步骤（4）中40%PEG4000的组成为：PEG4000：40% （w/v），Mannitol：0.2M，CaCl2：100mM；CPW9M溶液：为CPW溶液中加入9% （w/v） mannitol（即0.5M mannitol）；其中CPW溶液的组成为：0.2 mmol L−1 KH2PO4，1 mmol L−1 KNO3，10 mmol L−1 CaCl2•2H2O， 1mmol L−1MgSO4•7H2O，1×10−3 mmol L−1 KI，1×10−4mmol L−1CuSO4•H2O，pH 5.7（KOH）。
上述步骤（5）检测原生质体转化效率的方法为：将经黑暗孵育16-20h 的原生质体吸取10 μL于载玻片上，使用荧光显微镜10倍或者20倍镜观察计数，计算转化效率；转化效率=（视野中带GFP荧光的原生质体数/视野中总原生质体数）×100%，统计大于三个视野，计算所观察所有视野的平均转化效率。
本发明的优点在于：本发明提供了一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法。本发明首次实现了裸子植物杉木次生木质部原生质体的制备，并建立外源基因瞬时转化体系，实现对在杉木中外源基因的高效表达，为裸子植物的分子生物学研究和遗传转化提供技术支持。本发明的发明简便快捷，转化效率高，节约成本，具有广阔的应用前景。
附图说明：
图1 Zeiss荧光显微镜10倍，使用蓝光激发，观察并统计转化效率。
图2 Zeiss荧光显微镜20倍下观察单个原生质体转化情况。“Bright field”：在可见光视野下的原生质体；“GFP fluorescence”：使用蓝光激发，视野下表达GFP的原生质体；“Merged”：可见光视野下的原生质体与蓝光激发视野下表达GFP的原生质体的叠加所得到的原生质体图。
具体实施方式：
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
选取生长健康的一年生杉木苗，将主茎剪成9cm的茎段，并去皮。将上述准备的去皮茎段放入含有40mL酶解液的50mL管中，一个管中放4根9cm的茎段，黑暗避光静置育孵处理4h，温度25℃，得到酶解液处理的茎段。将上述经过酶解处理的茎段从酶解液中转移至MMG溶液中，水平轻晃2min，释放原生质体，MMG溶液变浑浊，得原生质体悬浮液；原生质体悬浮液用70μm滤网折叠2层进行过滤，收集滤液，将滤液离心300g，5min，吸去上清，剩下沉淀，用1mL MMG重悬沉淀，得到原生质体悬浮液。取10μL分离得到的原生质体滴加在血球计数板上进行活性检测，原生质体的活力测定采用Trypan Blue染色法，取5μL原生质体于干净的EP管，等体积加入5μL 0.2%（w/v）的台盼蓝染色，轻轻混匀，按照原生质体产量的检测方法，置于血球计数板上，在显微镜白光观察并记录被台盼蓝染色的蓝色原生质体数与总原生质体数的比值。重复3次，每次重复统计5个视野，取平均值。[原生质体活力=蓝色的原生质体的数量/原生质体总数）×100%]，所得原生质体的活力为85%。
在100μL浓度为5×105 -7×105个/mL的纯化原生质体悬浮液中，依次加入pUC19-35s-sGFP质粒DNA 10μL（浓度为1400ng/μL -1500ng/μL）和110μL的40% PEG 4000（现配现用）介导转化，轻弹混匀，室温孵育15min，相同操作，空白对照组加入与质粒等体积ddH2O代替质粒。孵育15min后，缓慢加入500μL的CPW9M 终止反应，轻柔旋转混匀，300g离心3 min，重复该操作2次，得到转化后的原生质体沉淀，使用CPW9M溶液缓慢重悬沉淀，最后用1mL的CPW9M重悬转化的原生质体。转化后原生质体的培养：将转空载质粒DNA的原生质体1mL轻轻转移至90mm圆形培养皿上，25℃黑暗孵育20h。培养皿在加入原生质体前培养皿需用1mL 1%（w/v）BSA 洗涤，将培养皿中BSA去除，加入转化后的原生质体。将经过转化培养20h的原生质体吸取10μL于载玻片上，使用Zeiss荧光显微镜10倍或者20倍镜观察计数，计算转化效率；转化效率=（视野中带GFP荧光的原生质体数/视野中总原生质体数）×100%，统计大于三个视野，计算所观察所有视野的平均转化效率（图1和图2）。利用本专利的流程和配方操作可以达到30%的转化效率。
其中MMG溶液的配方为：Mannitol：0.4M，MES：4mM（pH 5.7），MgCl2：15mM，ddH2O：定容至50 mL体积。
其中40%PEG4000组成为：PEG4000：40%（w/v），Mannitol：0.2M，CaCl2：100mM，水浴55℃，直到PEG粉末完全溶解，恢复至室温，进行后续转化；
上述CPW溶液：0.2 mmol L−1 KH2PO4，1 mmol L−1 KNO3，10 mmol L−1 CaCl2•2H2O， 1mmol L−1MgSO4•7H2O，1×10−3 mmol L−1 KI，1×10−4 mmol L−1CuSO4•H2O，pH 5.7（KOH）。
CPW9M 溶液：CPW溶液中加入9%（w/v）mannitol（即0.5M mannitol）。
实施例2
选取生长健康的一年生杉木苗，将主茎剪成10cm的茎段，并去皮。将上述准备的去皮茎段放入含有40mL酶解液的50mL管中，一个管中放4根10cm的茎段，黑暗避光静置育孵处理3h，温度25℃，得到酶解液处理的茎段。将上述经过酶解处理的茎段从酶解液中转移至MMG溶液中，水平轻晃2min，释放原生质体，MMG溶液变浑浊，得原生质体悬浮液；原生质体悬浮液用70μm滤网折叠2层进行过滤，收集滤液，将滤液离心300g，5min，吸去上清，剩下沉淀，用1mL MMG重悬沉淀，得到原生质体悬浮液。取10μL分离得到的原生质体滴加在血球计数板上进行活性检测，原生质体的活力测定采用Trypan Blue染色法，取5μL原生质体于干净的EP管，等体积加入5μL 0.2%（w/v）的台盼蓝染色，轻轻混匀，按照原生质体产量的检测方法，置于血球计数板上，在显微镜白光观察并记录被台盼蓝染色的蓝色原生质体数与总原生质体数的比值。重复3次，每次重复统计5个视野，取平均值。[原生质体活力=蓝色的原生质体的数量/原生质体总数）×100%]，所得原生质体的活力为85%。
在100μL浓度为5×105 -7×105个/mL浓度的纯化原生质体悬浮液中，依次加入pUC19-35s-sGFP质粒DNA 10μL（浓度为1400ng/μL -1500ng/μL）和110μL的40% PEG 4000（现配现用）介导转化，轻弹混匀，室温孵育15min，相同操作，空白对照组加入与质粒等体积ddH2O代替质粒。孵育15min后，缓慢加入500μL的CPW9M 终止反应，轻柔旋转混匀，300g离心3 min，重复该操作2次，得到转化后的原生质体沉淀，使用CPW9M溶液缓慢重悬沉淀，最后用1mL的CPW9M重悬转化的原生质体。转化后原生质体的培养：将转空载质粒DNA的原生质体1mL轻轻转移至90 mm圆形培养皿上，25℃黑暗孵育18h。培养皿在加入原生质体前培养皿需用1mL 1%（w/v）BSA 洗涤，将培养皿中BSA去除，加入转化后的原生质体。将经过转化培养20h的原生质体吸取10μL于载玻片上，使用Zeiss荧光显微镜10倍或者20倍镜观察计数，计算转化效率；转化效率=（视野中带GFP荧光的原生质体数/视野中总原生质体数）×100%，统计大于三个视野，计算所观察所有视野的平均转化效率（见图1和图2）。利用本专利的流程和配方操作可以达到30%的转化效率。
其中MMG溶液的配方为：Mannitol：0.4M，MES：4mM（pH 5.7），MgCl2：15mM，ddH2O：定容至50 mL体积。
其中40%PEG4000组成为：PEG4000：40% （w/v），Mannitol：0.2M，CaCl2：100mM，水浴55℃，直到PEG粉末完全溶解，恢复至室温，进行后续转化；
上述CPW溶液：0.2 mmol L−1 KH2PO4，1 mmol L−1 KNO3，10 mmol L−1 CaCl2•2H2O， 1mmol L−1MgSO4•7H2O，1×10−3 mmol L−1 KI，1×10−4 mmol L−1CuSO4•H2O，pH 5.7（KOH）。
CPW9M 溶液：CPW溶液中加入9%（w/v）mannitol（即0.5M mannitol）。
实施例3
选取生长健康的一年生杉木苗，将主茎剪成8cm的茎段，并去皮。将上述准备的去皮茎段放入含有40 mL酶解液的50 mL管中，一个管中放4根8cm的茎段，黑暗避光静置育孵处理2h，温度26℃，得到酶解液处理的茎段。将上述经过酶解处理的茎段从酶解液中转移至MMG溶液中，水平轻晃1min，释放原生质体，MMG溶液变浑浊，得原生质体悬浮液；原生质体悬浮液用70μm滤网折叠2层进行过滤，收集滤液，将滤液离心300g，5min，吸去上清，剩下沉淀，用1 mL MMG重悬沉淀，得到原生质体悬浮液。取10μL分离得到的原生质体滴加在血球计数板上进行活性检测，原生质体的活力测定采用Trypan Blue染色法，取5μL原生质体于干净的EP管，等体积加入5μL 0.2%（w/v）的台盼蓝染色，轻轻混匀，按照原生质体产量的检测方法，置于血球计数板上，在显微镜白光观察并记录被台盼蓝染色的蓝色原生质体数与总原生质体数的比值。重复3次，每次重复统计5个视野，取平均值。[原生质体活力=蓝色的原生质体的数量/原生质体总数）×100%]，所得原生质体的活力为87%。
在100μL浓度为5×105 -7×105个/mL浓度的纯化原生质体悬浮液中，依次加入pUC19-35s-sGFP质粒DNA 10μL（浓度为1400ng/μL -1500ng/μL）和110μL的40% PEG 4000（现配现用）介导转化，轻弹混匀，室温孵育15min，相同操作，空白对照组加入与质粒等体积ddH2O代替质粒。孵育15min后，缓慢加入500μL的CPW9M 终止反应，轻柔旋转混匀，300g离心3 min，重复该操作3次，得到转化后的原生质体沉淀，使用CPW9M溶液缓慢重悬沉淀，最后用1mL的CPW9M重悬转化的原生质体。转化后原生质体的培养：将转空载质粒DNA的原生质体1mL轻轻转移至90mm圆形培养皿上，25℃黑暗孵育16h。培养皿在加入原生质体前培养皿需用1mL 1%（w/v）BSA 洗涤，将培养皿中BSA去除，加入转化后的原生质体。将经过转化培养20h的原生质体吸取10μL于载玻片上，使用Zeiss荧光显微镜10倍或者20倍镜观察计数，计算转化效率；转化效率=（视野中带GFP荧光的原生质体数/视野中总原生质体数）×100%，统计大于三个视野，计算所观察所有视野的平均转化效率（见图1和图2）。利用本专利的流程和配方操作可以达到30%的转化效率。
其中MMG溶液的配方为：Mannitol：0.4M，MES：4mM（pH 5.7），MgCl2：15mM，ddH2O：定容至50 mL体积。
其中40%PEG4000组成为：PEG4000：40%（w/v），Mannitol：0.2M，CaCl2：100mM，水浴55℃，直到PEG粉末完全溶解，恢复至室温，进行后续转化；
上述CPW溶液：0.2 mmol L−1 KH2PO4，1 mmol L−1 KNO3，10 mmol L−1 CaCl2•2H2O， 1mmol L−1MgSO4•7H2O，1×10−3 mmol L−1 KI，1×10−4 mmol L−1CuSO4•H2O，pH 5.7（KOH）。
CPW9M 溶液：CPW溶液中加入9%（w/v）mannitol（即0.5M mannitol）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）对杉木茎段进行消化酶解；（2）酶解后的茎段转入MMG溶液中释放得到原生质体悬浮液，经过离心沉淀，得到纯化的原生质体；（3）得到纯化的原生质体进行产量和活性检测；（4）通过PEG介导进行外源基因的瞬时转化；（5）检测原生质体转化效率；
所述步骤（4）通过PEG介导进行外源基因的瞬时转化具体为：在浓度为5×105 -7×105个/mL的纯化的原生质体悬浮液中，依次加入质粒DNA和40%PEG 4000，轻弹混匀，室温孵育15min，相同操作，空白对照组加入与质粒DNA等体积量的ddH2O代替质粒DNA；孵育15min后，缓慢加入500μL的CPW9M溶液终止反应，轻柔旋转混匀，300g离心3min，重复此操作2-3次，得到转化后的原生质体沉淀，使用CPW9M溶液缓慢重悬沉淀，将悬浮的转化后的原生质体轻轻转移至90mm圆形培养皿上，25℃黑暗孵育16-20h；培养皿在加入原生质体前需用1mL 1%（w/v）BSA 洗涤，将培养皿中BSA去除，再加入转化的原生质体；
所述 V（原生质体） :V（质粒DNA） :V（PEG4000）=10:1:11；
所述40%PEG4000的组成为：PEG4000：40% （w/v），Mannitol：0.2M，CaCl2：100mM；CPW9M溶液为：CPW溶液中加入9%（w/v）mannitol；其中CPW溶液的组成为：0.2 mmol L−1 KH2PO4，1mmol L−1 KNO3，10 mmol L−1 CaCl2•2H2O，1 mmol L−1MgSO4•7H2O，1×10−3 mmol L−1 KI，1×10−4mmol L−1CuSO4•H2O，pH 5.7KOH。
2.根据权利要求1所述的一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）杉木茎段为生长健康的一年生杉木苗，将其剪成8-10cm长茎段，并去皮。
3.根据权利要求1所述的一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）消化酶解为：将杉木次生木质部茎段放入酶解液中黑暗避光静置育孵处理2-4h，温度25℃-26℃；其酶解液配方为： Cellulase R-10：1.5%（w/v），Macerozyme R-10：0.4%（w/v），Mannitol：0.5M，pH为5.7的MES：20mM，KCl：20mM，CaCl2：10mM，0.1%（w/v）BSA，ddH2O：定容至40mL体积。
4.根据权利要求1所述的一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（2）中将经过酶解处理的杉木茎段从酶解液转移至MMG溶液中，水平轻晃1-2min，释放原生质体，MMG变浑浊，得原生质体悬浮液；原生质体悬浮液用70μm滤网2层进行过滤，收集滤液，将滤液离心3-5min，吸去上清，剩下沉淀，用MMG重悬沉淀，得到纯化的原生质体；其中MMG溶液的组成为：Mannitol：0.4M，pH为5.7的MES：4mM，MgCl2：15mM，ddH2O：定容至50mL体积。
5.根据权利要求1所述的一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（3）得到纯化的原生质体产量和活性检测为：取10μL分离得到的纯化原生质体滴加在血球计数板上，使得液体充满整个计数室，在显微镜下观察和计数，原生质体个数＝（血球计数板5个大方格内总原生质体个数×104×稀释倍数）；原生质体的活力测定采用Trypan Blue染色法。
6.根据权利要求1所述的一种杉木外源基因高效瞬时转化体系的建立方法，其特征在于：所述步骤（5）检测原生质体转化效率的方法为：将经黑暗孵育16-20h 的原生质体吸取10 μL于载玻片上，使用荧光显微镜10倍或者20倍镜观察计数，计算转化效率；转化效率=（视野中带GFP荧光的原生质体数/视野中总原生质体数）×100%，统计大于三个视野，计算所观察所有视野的平均转化效率。
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