CN106167787B

CN106167787B - 一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法

Info

Publication number: CN106167787B
Application number: CN201610713001.XA
Authority: CN
Inventors: 董玉田; 林二培; 楼雄珍; 牛明月; 黄华宏; 童再康
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2016-08-23
Filing date: 2016-08-23
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2036-08-23
Also published as: CN106167787A

Abstract

本发明提供一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法，其包括如下步骤：1)选择生长状况良好的光皮桦一年生植株，取当年生的茎段，用流水冲洗5‑20min，剥去树皮；2)将步骤1)获得的光皮桦茎段木质部用酶解液在黑暗中进行酶解；3)将酶解后茎段转移到MMG溶液中，将原生质体分散到MMG溶液中，用孔径为70μm的细胞筛进行过滤，收集滤液，滤液离心，用MMG溶液把收集到的原生质体重新悬浮，得到纯化的原生质体；4)在质粒浓度为1500ng/μl，PEG处理时间为10min时，木质部原生质体瞬时转化效率最高。本发明方法得到的原生质体平均密度为4.5×10⁶个·mL^‑1，平均产量为1.2×10⁶个·g^‑1·FW^‑1，活性最高可达到96％，最高瞬时转化效率平均可达55％左右。

Description

一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种光皮桦原生质体的制备方法。

背景技术

植物原生质体研究最早可追溯到1892年，Klercker等从一种藻类植物中成功分离出原生质体。Kuster和Miche最早发现细胞融合现象，2个细胞的细胞膜和细胞质在特定的条件下能发生融合。20世纪60年代初，Cocking使原生质体的成功制备和分离得以实现，用酶解法分离出大量有活力的番茄根尖原生质体。原生质体没有细胞壁，且具有全能性，是进行细胞壁再生、细胞分裂、摄入外源DNA、膜透性和信号转导等研究的理想材料；近年来，原生质体被用来研究光信号、胁迫和激素作用及调节机制等。利用原生质体获得目的基因瞬时表达体系，具有检测快速、通量高等特点，结合报告基因的使用，该技术已被广泛用于目标基因表达、亚细胞定位、启动子及蛋白互作等基因功能分析研究。原生质体在转基因、林木新品种改良、基因功能研究及蛋白互作等方面具有广阔的应用前景。

光皮桦广泛分布于我国南方山地，其材质优良，纹理细致，木材坚硬，是做高级家具的优良材料，具有较高的观赏和经济价值。光皮桦生长速度快，多数种质童期较短(约18个月)，是林木遗传研究的优良材料，但在原生质体方面目前尚未有见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法，其包括如下步骤：

1)选择生长状况良好的光皮桦一年生植株，取当年生的茎段，用流水冲洗5-20min，剥去树皮；

2)将步骤1)获得的光皮桦茎段木质部用酶解液在黑暗中置于摇床上进行酶解；

3)将处理好的茎段转移到MMG溶液中，轻摇分散原生质体，用孔径为70μm的细胞筛过滤，收集滤液，离心收集原生质体，用MMG重新悬浮，即得到纯化的原生质体；

4)用MMG溶液将原生质体稀释，使其浓度为1-5×10⁶个·mL^-1，加入质粒，混合均匀，加入等体积新鲜配制的PEG溶液，将原生质体与PEG混合均匀，黑暗条件下室温静置；

5)静置处理后，缓慢加入两倍体积的W5溶液，混匀，离心去上清，用W5溶液将原生质体重新悬浮，黑暗培养；

6)培养10-15h后，离心去上清，用MMG将原生质体重新悬浮，即可检测基因瞬时表达情况。

其中，所述的酶解液含有如下成分：0.4M甘露醇、20mM KCl、20mM MES-KOH、10mMCaCl₂、0.1％牛血清蛋白，1.0％纤维素酶-Rs，1.0％离析酶-R10，0.5％半纤维素酶。

其中，所述的光皮桦茎段粗度为0.5-0.8cm，长度为6-10cm。

其中，步骤2)中摇床转速为30-50rpm/min。

其中，酶解的温度为为25～27℃，酶解时间为2-4h。

其中，滤液用300g/min离心3min。

其中，步骤4)中质粒浓度为1500-2700ng/μl。

其中，步骤4)中原生质体瞬时转化PEG处理时间为10-30min。

其中，步骤5)中用300g/min离心2-5min。

其中，步骤6)中用300g/min离心2-5min。

本发明的有益效果是：(1)相对于叶片等组织，利用木质部制备原生质体可操作性强，且木质部原生质体更加容易分离；(2)针对光皮桦木质部的特性建立了相应的酶解体系和处理方法，获得的原生质体产量高、活力强；(3)针对光皮桦木质部原生质体建立了相应的瞬时转化方法，转化效率高；(4)本发明对木本植物木质部原生质体的制备及瞬时转化具有一定的借鉴意义。本发明优选的实施方案可得到的原生质体平均密度为4.5×10⁶个·mL^-1，平均产量为1.2×10⁶个·g^-1·FW^-1，活性最高可达到96％，最高瞬时转化效率平均可达55％左右。

附图说明

图1为不同的酶组合获得的白光下和FDA染色后发绿色荧光的原生质体。其中，1为3％Cellulase-R10和1％Macerozyme-R10的组合；2为3％Cellulase-R10和1％果胶酶Y-23的组合；3为0.5％半纤维素酶，3％Cellulase-R10和1％Macerozyme-R10的组合；4为0.5％半纤维素酶，3％Cellulase-R10和1％果胶酶Y-23的组合；5为1％Cellulase-R10和1.5％Cellulase-Rs的组合；6为1.5％Cellulase-Rs和1％果胶酶Y-23的组合；7为0.5％半纤维素酶，1.5％Cellulase-Rs和1％Macerozyme-R10的组合；8为5％Cellulase C-2605和2％果胶酶C-2611的组合。

图2为不同浓度的酶组合获得的白光下和FDA染色后发绿色荧光的原生质体。其中1为0.50％Hemicellulase，1％Macerozyme-R10，1.5％Cellulase-Rs的组合；2为1％Hemicellulase，1％Macerozyme-R10，1％Cellulase-Rs的组合；3为1％Hemicellulase，1％Macerozyme-R10，2％Cellulase-Rs的组合；4为0.50％Hemicellulase，0.5％Macerozyme-R10，0.5％Cellulase-Rs的组合；5为0.50％Hemicellulase，1％Macerozyme-R10，2％Cellulase-Rs的组合；6为0.50％Hemicellulase，1％Macerozyme-R10，1.％Cellulase-Rs的组合。

图3为在0.50％Hemicellulase，1％Macerozyme-R10，1.％Cellulase-Rs的酶组合条件下，不同酶解时间获得的白光下和FDA染色后发绿色荧光的原生质体。其中，A为酶解2h；B为酶解3h；C为酶解4h。

图4为不同质粒浓度瞬时转化的原生质体荧光检测图。其中，A为质粒浓度为700ng·μl^-1，瞬时转化效率最低；B为质粒浓度为1500ng·μl^-1，瞬时转化效率最高。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)酶解液的配制与酶解分离条件

基本液：0.4M甘露醇，20mM KCl，20mM MES-KOH(pH 5.7)，10mM CaCl₂，0.1％牛血清蛋白(BSA，W/V)。酶液配制时，先加入甘露醇，KCl，MES-KOH和酶，待酶完全溶解后，于55℃水浴10min，冷却至室温后加入CaCl₂和BSA。

木质部细胞原生质体分离酶液：用基本溶液配置。

2)材料预处理

选择生长状况良好的光皮桦一年生植株，取当年生的茎段(粗度约为0.5-0.8cm，长度为8cm)，用流动清水冲洗10min，戴上一次性手套，将其剥去树皮。

3)木质部原生质体的分离

将预处理好的光皮桦茎段置于盛有20mL酶解液的50mL的离心管中，用锡箔纸将离心管包裹，置于摇床上(转速为35rpm/min)进行酶解。

4)光皮桦木质部原生质体的收集

将处理好的茎段用干净的镊子转移到盛有20ml MMG(4mM MES-KOH pH 5.7，15mMMgCl2，0.4M甘露醇)的50ml离心管，上下轻柔颠倒6-7次，将原生质体分散到MMG溶液中，将茎段弃掉，用孔径为70μm的细胞筛过滤到一个新的50ml的离心管，300g离心3min，用500μl-1000μl MMG把收集到的原生质体重新悬浮，得到纯化的原生质体。

5)木质部原生质体产量测定

原生质体产量的测定采用血球计数板对原生质体产量进行统计。将盖玻片先置于血球计数板的观测位置，将分离得到的原生质体取10μl滴加在0.1mm的血球计数板上，使其充满整个计数室，在显微镜下观察和统计。在10倍镜弱光下找到计数室的9个方格(每个方格0.1mm³，即0.1μl)，统计中间方格和4个角上方格内的原生质体数(共5格)，然后根据以下公式计算原生质体产量(原生质体产量(个.g FW^-1)＝5个方格原生质体数×1000×稀释倍数/样品鲜重)。

6)光皮桦木质部原生质体的活力测定

原生质体活力的测定采用FDA染色法，FDA本身无荧光，无极性，能自由地穿越完整的细胞质膜。FDA一旦进入原生质体后，受到有活力的原生质体内酷酶的作用，分解形成有荧光的极性物质一荧光素。荧光素不能穿越细胞质膜，因而积累在有活力的原生质体中，当用紫外光照射时，便产生绿色荧光。而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。

方法：取10μl原生质体于干净的单排管中，加入1μl0.01％(W/V)的FDA染色，轻轻混匀静置一分钟，按上述产量检测方法，置于血球计数板上，在显微镜白光观察并记录原生质体个数，并在荧光下观察记录发黄绿色荧光的原生质体个数，并根据以下公式计算原生质体活力[原生质体活力＝(发黄绿色荧光的原生质体数量/原生质体总数量)×100％]。

7)酶组合对木质部原生质体活力和产量的影响

光皮桦木质部原生质体分离体系的建立首先对酶解组合进行筛选(见表1)，包括半纤维素酶，Cellulase-R10，Macerozyme-R10，Cellulase-Rs，果胶酶Y-23，Cellulase C-2605，果胶酶C-2611，发现不同酶的组合分离原生质体的效果不同，其中0.5％半纤维素酶，1.5％Cellulase-Rs和1％Macerozyme-R10的酶组合分离效果最好，得到的原生质体最多，且在荧光下发绿色荧光的最多，活性最高，但在白光下观察有很多杂质(表1，图1)。

表1光皮桦原生质体不同酶解组合筛选

8)酶浓度对原生质体活性和产量的影响

其次，对筛选出的酶组合进一步优化(见表2)，针对不同的酶，设计不同浓度，发现0.5％半纤维素酶，1.0％Cellulase-Rs和1.0％Macerozyme-R10的酶浓度组合得到的原生质体明显高于其他组合，产量可达到1.2×10⁶个·g^-1·FW^-1，细胞活性达到96％，且没有太多的细胞碎片等杂质(表2，图2)。

表2不同酶浓度对木质部原生质体制备的影响

9)酶解时间对木质部原生质体活性和产量的影响

进一步对酶解时间进行筛选(表3)，在0.5％半纤维素酶，1.5％Cellulase-Rs和1％Macerozyme-R10的酶液组合下分别酶解2h，3h，4h，通过检测原生质体得率和细胞活性，发现酶解时间3h时分离得到的原生质体产量和活性最高，分别可达到1.27×10⁶个·g^-1·FW^-1和91％(表3)。酶解时间为2h，分离得到的原生质体的产量较低，可见酶解时间不够，可能酶还没有将木质部酶解彻底。酶解4h，原生质体的活性会明显降低，可见，酶解时间过长会对细胞活性造成不良影响(图3)。

表3光皮桦原生质体制备不同酶解时间的筛选

10)质粒浓度对原生质体瞬时转化效率的影响

质粒浓度是影响原生质体瞬时转化的主要因素之一，通过不同质粒浓度对原生质体瞬时转化效率的比较(表4)，发现当质粒浓度为1500ng·μl^-1时，转化效率最高，平均可达55％，与700ng·μl^-1的质粒浓度的瞬时转化效率相比，达到极显著水平(表4，图4)。而随着质粒浓度的升高(在1500ng·μl^-1到2700ng·μl^-1时)，原生质体的瞬时转化效率又持略微下降趋势，差异不显著。可见，原生质体的瞬时转化效率并不是一直随质粒浓度增高而升高，质粒浓度太高，反而会降低原生质体的瞬时转化效率。质粒浓度低于1500ng·μl^-1时，对原生质体瞬时转化效率影响较大。

表4不同质粒浓度下光皮桦原生质体瞬时转化效率

质粒浓度(ng·μl<sup>-1</sup>)	700	1200	1500	1900	2400	2700
							转化效率(％)	35	38	55	50	51	48

11)PEG处理时间对原生质体瞬时转化效率的影响

PEG处理时间对原生质体瞬时转化效率有较大的影响，在质粒浓度为1500ng·μl^-1时，通过比较不同处理时间的转化效率(表5)，发现PEG处理时间为10min时，转化效率最高，可达到55％；其次,PEG处理20min时，转化效率为48％左右；PEG处理30min时，瞬时转化效率为42％左右；说明PEG处理时间过长会降低瞬时转化的效率。

表5不同PEG处理时间对光皮桦原生质体瞬时转化效率的影响

PEG处理时间(min)	10	20	30
				转化效率(％)	55	48	42

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法，其包括如下步骤：

1）选择生长状况良好的光皮桦一年生植株，取当年生的茎段，用流水冲洗5-20min，剥去树皮；

2）将步骤1）获得的光皮桦茎段木质部用酶解液在黑暗中置于摇床上进行酶解，所述的酶解液含有如下成分：0.4M甘露醇、20 mM KCl、20 mM MES-KOH、10 mM CaCl₂、0.1 % 牛血清蛋白，1.5% 纤维素酶-Rs，1.0% 离析酶-R10，0.5% 半纤维素酶，酶解的温度为25～27℃，酶解时间为3小时；

3）将处理好的茎段转移到MMG溶液中，轻摇分散原生质体，用孔径为70μm的细胞筛过滤，收集滤液，离心收集原生质体，用MMG重新悬浮，即得到纯化的原生质体；

4）用MMG溶液将原生质体稀释，使其浓度为1-5×10⁶个•mL^-1，加入质粒，混合均匀，加入等体积新鲜配制的PEG溶液，将原生质体与PEG混合均匀，黑暗条件下室温静置；

5）静置处理后，缓慢加入两倍体积的W5溶液，混匀，离心去上清，用W5溶液将原生质体重新悬浮，黑暗培养；

6）培养10-15h后，离心去上清，用MMG将原生质体重新悬浮，即可检测基因瞬时表达情况；

其中，所述的光皮桦茎段粗度为0.5-0.8cm，长度为6-10cm；

其中，步骤2）中摇床转速为30-50 rpm/min；

其中，步骤3）中滤液用300g/min离心2-5min；

其中，步骤4）中质粒浓度为1500 ng/µl；

其中，步骤4）中原生质体瞬时转化PEG处理时间为：10-30 min；

其中，步骤5）中用300g/min离心2-5min；

其中，步骤6）中用300g/min离心2-5min。