CN116574667A - 一种高效的玉米根尖病原菌侵染及原生质体悬液制备的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效的玉米根尖病原菌侵染及原生质体悬液制备的方法，所述原生质体悬液的制备方法，包括如下步骤：1)将待制备原生质体的植物器官在预处理液中进行质壁分离预处理，得到预处理后的植物器官，所述预处理液为包含L‑半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；2)将步骤1)中预处理后的植物器官切片，在酶解液中酶解处理，得到含有原生质体的粗提液，所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液；3)将步骤2)中含有原生质体的粗提液进一步纯化，得到原生质体混合液。本发明的方法制备的原生质体悬浮液中的细胞碎片等杂质得到有效清除，且获得原生质体质量较高，达到单细胞测序的要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体的说，涉及一种原生质体悬液的制备方法，尤其是玉米根尖病原菌侵染的原生质体的制备方法。
背景技术
细胞是构成植物机体的基本功能单元。基于细胞的增殖、分化和生长，细胞从原初细胞逐渐分化形成具有不同功能的特化细胞、组织和器官，该过程本质是具有相同遗传物质的细胞进行基因差异表达的结果(刘德培等,1994)。为了揭示细胞基因选择性表达的调控机理，现代生物技术的发展使对特定部位或特定时期细胞进行单细胞测序成为可能。然而建立不同类型细胞的基因表达谱首先要将不同类型的细胞群体分开，以收集足够数目的单一类型细胞进行转录组测序。目前，单一类型细胞分离主要有两种形式(董燕等,2015)：一种是通过显微切割分离单个细胞，提取RNA并反转录为cDNA，然后进行扩增和测序。上述方法需要较为复杂的操作技术，某些寡拷贝基因难以在后续扩增和测序中进行检测。另一种方法是分离同一类型细胞进行测序，即通过流式细胞仪或者显微操作收集一定数量的单一类型细胞，然后进行RNA提取和测序。Bimbaum等(2005)以不同部位特定表达的基因为标记，通过流式分选的方法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)根不同层的细胞进行分离和测序。在玉米根细胞生长、分裂、分化过程中，玉米根尖细胞中的基因选择性表达，使得根原细胞分化成为根冠细胞、分生区细胞、伸长区细胞和成熟区细胞(Sánchez et al.,2018)。为探究基因表达对根尖细胞命运决定的影响，需要将上述4种类型的细胞分群，以进行更深入的分析。而且原生质体不仅是原生质体培养和融合的基础，还可作为一个单细胞系统而用于研究细胞的生长发育过程，包括细胞壁再生、细胞分裂和分化等(Zhou等,2005)。此外，原生质体还可作为体细胞杂交、基因工程等理论研究的基础材料，进行导入外源基因、病毒侵染等操作(Reddy等,2006)。而获取的单细胞的质量和数量直接影响着后续实验的开展及实验结果的可靠性，植物由于细胞壁的存在，分离出大量高质量单细胞较困难，因此迫切需要一种高效的获取大量、高质量单细胞的方法。目前，拟南芥和烟草叶片单细胞的制备方法比较成熟，而玉米等其他植物的单细胞制备方法相对滞后。制备单细胞的材料一般为代谢活跃的组织或器官，如幼茎、叶鞘、叶片、根尖、根毛、子叶、胚轴、愈伤组织、体细胞胚等。
发明内容
为了提高玉米根尖病原菌侵染效率，降低玉米根尖原生质体制备的试验成本，缩短制备时间，提高制备玉米根尖原生质体的数量和活性。本发明提供一种能够高效制备玉米根尖病原菌侵染及原生质体悬液制备的方法。
本发明提供一种原生质体悬液的制备方法，包括如下步骤：
1)将待制备原生质体的植物器官在预处理液中进行预处理，得到预处理后的植物器官，所述预处理液为包含L-半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；
2)将步骤1)中预处理后的植物器官切片，在酶解液中酶解处理，得到含有原生质体的粗提液，所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液；
3)将步骤2)中含有原生质体的粗提液进一步纯化，得到原生质体混合液。
其中，所述步骤1中的预处理液中L-半胱氨酸的的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。
其中，所述步骤1中预处理条件为将1g植物器官，转移到预处理液中，用铝箔纸包严以避光，置于27℃摇床35rpm/min处理50min使根尖细胞发生质壁分离；其中植物器官与预处理液的用量比为每1g植物器官：5mL预处理液。
其中，所述酶解液中纤维素酶的纤维素酶的浓度为0.01g/ml、果胶酶的浓度为0.003g/ml，离析酶的浓度为0.005g/ml。
其中，所述步骤2中酶解条件为将切片的植物器官放入酶解液中，铝箔纸包严后置于摇床27℃，35rpm/min，酶解150min～180min。
其中，所述步骤3包括：
31)使用W5溶液两次润洗原生质体的粗提液，离心，吸去上清，除掉W5溶液；
32)使用PBS重悬细胞至少一次；
33)使用PBS润洗的细胞过滤筛过滤重悬后的细胞。
其中，植物器官为植物根尖，所述切片为从根尖向上的5mm进行切片，每片厚度为0.5mm。
本发明还提供一种用于原生质体的分离的组合物，所述组合包括预处理液和酶解液；所述预处理液为包含L-半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液。
其中，所述预处理液中L-半胱氨酸的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。
其中，所述酶解液中纤维素酶的浓度为0.01g/ml、果胶酶的浓度为0.003g/ml，离析酶的浓度为0.005g/ml。
本发明以生长7～8d的玉米根尖组织为原材料，利用酶解法分离玉米根尖组织原生质体，利用荧光染料对其染色，在荧光显微镜下观察，确定单细胞的数量及活性。本发明为后续的RNA提取、测序和基因表达研究奠定技术基础。实验表明浓度分别别为0.01g/ml、0.003g/ml、0.005g/ml的纤维素酶R10、离析酶R10及果胶酶Y-23的酶组合对解离玉米根尖组织的效率较高，可以减少获取一定单细胞的组织用量。将玉米根尖酶解时间缩短到3h，对于上述最佳条件下提取的原生质体进行纯化、过滤，原生质体悬浮液中的细胞碎片等杂质得到有效清除，且获得原生质体质量较高，达到单细胞测序的要求。本发明改良后的酶解法制备原生质体成本低、浓度大、活性高、可操作性强。
附图说明
图1为玉米幼苗萌发过程图。
图2为玉米幼苗根尖病原菌侵染的过程图。
图3为玉米根尖原生质体分离结果图，其中图A为刚分离未稀释的玉米根尖原生质体；B为稀释未纯化的玉米根尖原生质体；C为纯化后的玉米根尖原生质体；D为纯化后进行活力测定的玉米根尖原生质体。
图4中A为添加离析酶在酶解3h时的酶解效果，B为不添加离析酶在酶解3h时的酶解效果。
图5为进行二次过滤与不进行二次过滤对比。
图6为沉降前与沉降后细胞浓度对比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中：Sorbitol(SIGMA)、L-cysteine(SIGMA)、Cellulase R10(Yakult)、Macerozyme R10(Yakult)、果胶酶Y-23(BIODEE)、D-mannitol(SIGMA)、氯化钾(SIGMA)、氯化钙(SIGMA)、氯化钠(SIGMA)、BSA(SIGMA)、β-Mercaptoethanol(索莱宝)、D-(+)-glucose(SIGMA)、MES Free Acid Monohydrate(Fisher BioReagents)、磷酸二氢钠(SIGMA)、磷酸氢二钠(SIGMA)。0.2μm cellulose acetate filter(sartorius)、50mL圆底离心管、2.0mL离心管、不锈钢刀片、40μm Cell Strainer(FALCON)、30μmSmartStrainers(MACS)、CellCulture Dish(60×15mm eppendorf)。
实施例1材料准备
1.按照下述方法分别配置下述实施例中使用的各种溶液：
预处理液(25mL):准确称取Sorbitol 0.75g,L-cysteine 0.0075g,用ddH2O溶解,混匀后定容至25mL备用。所述溶液中L-半胱氨酸的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。
酶解液(15mL):准确称取D-mannitol干粉1.5g,氯化钾0.022365g,纤维素酶Cellulase R10 0.15g,果胶酶Y-23 0.045g，离析酶Macerozyme R10 0.075g,加入10mLddH2O混匀,55℃水浴10min,水浴后待溶液温度将至室温后依次加入1mol/L氯化钙150μL,BSA 0.015g,β-巯基乙醇3μL,定容至15mL后混匀,用0.2μm cellulose acetate filter过滤后备用。
W5溶液(40mL):准确称取固体氯化钠0.36g,氯化钙0.634g,氯化钾0.015g,D-(+)-glucose 0.036g,MES Free Acid Monohydrate 0.012g,ddH2O溶解后用KOH调节pH为5.8，定容至40mL，用0.2μm cellulose acetate filter过滤后备用。
PBS溶液(20mL):准确称取固体D-mannitol 1.46g,氯化钠0.16g,氯化钾0.004g,磷酸氢二钠0.0288g,磷酸二氢钾0.0048g，MES Free Acid Monohydrate 0.02g，加入ddH2O溶解后用KOH调节pH为7.2，定容至20mL,0.2μm cellulose acetate filter过滤后备用。
荧光染色液配制：荧光素双醋酸酯(fluorescein diacetate,FDA)染色液母液：2mg FDA(Sigma,F7378)溶于1mL丙酮。
0.02％ FDA工作液：0.1mL FDA母液用10mL PBS稀释至最终浓度为0.02％。
2.病原菌接种物制备：将单孢分离的Fusarium verticillioides接种到新鲜制备的马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Aga,PDA)培养基上，26℃黑暗培养5～6d用于制备接种物。将5皿生长旺盛的菌丝垫(约125mL)置于厨房用搅拌机，加入少量ddH2O，充分搅拌至糊状，然后用ddH2O定容至200mL。同样体积的PDA培养基研磨均一化后作为模拟接种物。
3.种子处理及萌发
分别将玉米自交系Qi319或B104种子置于10％过氧化氢溶液中浸泡30min进行消毒。取出种子用ddH2O洗净，将5～6粒种子放在四张用无菌水浸润的发芽纸上，沿着纸张较短一边的边缘排成一行，均匀摆放在发芽纸上，再将一张湿润的发芽纸铺在上面来盖住种子,将发芽纸对齐(如图1A所示)。将发芽纸卷成圆筒状(注意：卷纸时尽量不要把种子弄乱)，用橡皮筋把发芽纸的两端扎紧，让纸卷紧一些(当纸卷垂直放置时，种子应该固定在原处)。在纸筒外覆盖一层铝箔纸，防止根部接受光线照射，用另一根橡皮筋来固定铝箔。将发芽纸和种子放入一个在直径为5cm,高15cm的玻璃管中。在玻璃管中加入无菌水使其达到纸张高度的1/4(如图1B所示)。放入培养箱培育，光照16小时(26℃)，黑暗8小时(22℃)，湿度50％。
4.玉米根尖病原菌侵染
在步骤3中培养6～7天后，展开发芽纸评估幼苗生长情况，到这个时候，可以看到发育良好的主根以及次生根(如图2A所示)。外观健康植株用于后续根尖病原菌侵染和的根尖单细胞制备。
在侵染前，每8株健康的幼苗转移到大小为24×24-cm的1/2MS培养基(约250mL)上，小心地将玉米幼苗的根贴合到培养基的表面(如图2B所示)。
用移液器吸取20μL F.verticillioides接种物，加在玉米幼苗根尖处，进行病原菌接种；另外一些玉米幼苗根尖覆盖20μL PDA作为模拟接种对照。接种完成后，玉米幼苗根系覆盖一层用1/2MS液体培养基预浸透的发芽纸(如图2C所示)，然后再覆盖一层铝箔以避免光照和其他潜在微生物的侵染(如图2D所示)。培养皿盖上盖后转移到培养箱中，在16h光照(26℃)，8h黑暗(22℃)条件下培养48h后，去除铝箔和发芽纸，侵染后的幼苗用于病情分级和根尖单细胞分离(如图2E所示)。
实施例2单细胞的提取及纯化
1.根尖的预处理：取F.verticillioides侵染或模拟接种的玉米幼苗，用刀片获取长约7mm的根尖，收集切好的玉米根尖1g，转移到5mL预处理液中，用铝箔纸包严以避光，置于27℃摇床35rpm/min处理50min使根尖细胞发生质壁分离。
2.将预处理后的根尖组织用吸水纸吸干表面的预处理液，用刀片从根尖处切成0.5mm左右的薄片，用刀片将根尖组织切成薄片时，只从根尖向上的5mm进行切片，丢掉镊子夹取固定一端的1～2mm(该部分在被夹取及固定时可能会被损伤)。用刀片和镊子小心放入盛有5mL酶解液的细胞培养皿中，动作要快且轻柔。用铝箔纸包严后置于摇床27℃，35rpm/min酶解，150min～180min后根尖组织细胞基本上被酶解完全。
3.酶解完成后，得到的原生质体位于酶解液的底部，轻轻摇匀，加入5mL预冷的W5溶液以稀释游离的细胞(使用宽口的移液器吸头以避免损伤细胞)，摇匀，使用W5润洗后的细胞过滤筛过滤酶解液体系，将液体过滤至预冷的50mL圆底离心管中，置于冰上。
4.将离心管轻柔放入预冷至4℃离心机，300rcf/min离心3min以收集细胞，弃去上清。
5.用宽口吸头轻柔加入6mL预冷的W5，轻轻摇匀使细胞散开，200rcf/min离心2min30s，吸去上清。
6.用500～1000μL预冷的PBS重悬细胞，吸取少量细胞用显微镜检查背景，如果背景干净可进行下一步，若背景中有杂质可向离心管中轻轻加入4mL PBS，混匀后250rcf/min离心2min 30s，轻轻吸去上清后再用PBS重悬。
7.使用PBS润洗的细胞过滤筛过滤重悬后的细胞，将滤液过滤至2.0mL离心管中。将滤液避光置于冰上30min以使细胞沉降，弃上清，留管底的100～200μL溶液轻柔混匀。
实施例3原生质体活性检测
将实施例2或者以下对比例1或2中制备的原生质体按照如下步骤进行活性检测：1)用去掉尖头的1000μl吸头各吸取300μl样品放入1.5ml离心管中。
2)离心管中各加入等体积的0.02％的FDA溶液，冰上静置5min。
3)取适量样品在载玻片上，用镊子轻轻盖上盖玻片、并避免盖玻片滑动。
4)在荧光显微镜下，5点取样，每个视野下原生质体数目不少于40个，统计记录原生质体总数和发黄绿荧光原生质体数目。发黄绿荧光原生质体即为有活力的原生质体。原生质体活力(％)＝发黄绿荧光原生质体数目/观察的原生质体总数×100％。
5)重复步骤1)–4)。
原生质体计数方法：采用横竖格为25×16的血球计数板，于显微镜下对原生质体悬液进行计数。计算公式为：原生质体平均数/mL＝(80小格内原生质体数/80)×4×106×稀释倍数。
以移液枪轻轻收集含有完整原生质体的溶液铺于载玻片，镜检结果显示：纯化体系中细胞结团现象明显减少，原生质体数量相应有所减少，但变化不大(如图3所示，图3中A为刚分离未稀释的玉米根尖原生质体；B为稀释未纯化的玉米根尖原生质体；C为纯化后的玉米根尖原生质体；D为纯化后进行活力测定的玉米根尖原生质体)。使用血球计数板于显微镜下对原生质体悬液进行计数，通过荧光染色对原生质体的活性进行鉴定，结果提示，所提取的原生质体大部分有活性，适于下一步实验。
对比例1
用于原生质体制备的酶解液酶成分主要为纤维素酶、半纤维素酶、离析酶及果胶酶中一种或几种，酶解液中酶成分的不同及浓度配比的不同对组织的解离效果影响较大。另外，酶成分的配比也会影响完全酶解所需的时长，进而影响获得原生质体的活性。将实施例2中的酶解液成分参考文献孔瑶_玉米根尖组织原生质体的分离和流式分析中的酶解液成分：果胶酶浓度为0.3％、纤维素酶浓度为1％，甘露醇浓度为10％。
本发明在此基础上又加入了浓度为0.005g/ml的离析酶R10。发现纤维素酶浓度为1％，果胶酶浓度为0.3％，添加0.5％浓度离析酶，可提高酶解效率，缩短酶解时间(如图4所示)。
对比例2：
在的原生质体分离过程中，常常混杂有亚细胞碎片、维管束成分、未解离细胞、破碎的原生质体等，这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响，此外还需去掉酶溶液，因此必须对原生质体进行纯化，常用的纯化方法有离心沉淀法、漂浮法和界面法。在原生质体纯化过程中，离心-重悬步骤会不可避免地导致部分细胞黏结成团，给后续单细胞捕获造成不利影响，所以本发明使用30μm细胞筛进行二次过滤，进行二次过滤(如图5B所示)和不进行二次过滤(如图5A所示)相比大大减少结团细胞。
对比例3：
单细胞测序实验对原生质体浓度要求较高，离心-重悬的富集方式很难控制原生质体的浓度和细胞活性，所以本发明通过自然沉降法使原生质体富集在离心管底部，沉降后的细胞浓度足以达到单细胞测序实验要求，如图6所示。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.原生质体悬液的制备方法，其特征在于,包括如下步骤：
1)将待制备原生质体的植物器官在预处理液中进行质壁分离预处理，得到预处理后的植物器官，所述预处理液为包含L-半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；
2)将步骤1)中预处理后的植物器官切片，在酶解液中酶解处理，得到含有原生质体的粗提液，所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液；
3)将步骤2)中含有原生质体的粗提液进一步纯化，得到原生质体混合液。
2.根据权利要求1中的方法，其特征在于，所述步骤1中的预处理液中L-半胱氨酸的的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。
3.根据权利要求2中的方法，其特征在于，所述步骤1中预处理条件为将1g植物器官，转移到预处理液中，用铝箔纸包严以避光，置于22℃摇床35rpm/min处理50min使根尖细胞发生质壁分离；其中植物器官与预处理液的用量比为每1g植物器官：5mL预处理液。
4.根据权利要求1中的方法，其特征在于，所述酶解液中纤维素酶的的浓度为0.01g/ml、果胶酶的浓度为0.003g/ml、离析酶的浓度为0.005g/ml。
5.根据权利要求4中的方法，其特征在于，所述步骤2中酶解条件为将切片的植物器官放入酶解液中，铝箔纸包严后置于摇床22℃，35rpm/min，酶解150min～180min。
6.根据权利要求5中的方法，其特征在于，所述步骤3包括：
31)使用W5溶液两次润洗原生质体的粗提液，离心，吸去上清，除掉W5溶液；
32)使用PBS重悬细胞至少一次；
33)使用PBS润洗的细胞过滤筛过滤重悬后的细胞。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，植物器官为植物根尖，所述切片为从根尖向上的5mm进行切片，每片厚度为0.5mm。
8.一种用于原生质体的分离的组合物，其特征在于，所述组合包括预处理液和酶解液；所述预处理液为包含L-半胱氨酸和山梨糖醇的水溶液；所述酶解液为包含纤维素酶、果胶酶和离析酶的水溶液。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述预处理液中L-半胱氨酸的浓度为0.0003g/ml，山梨糖醇的浓度为0.03g/ml。
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述酶解液中纤维素酶的浓度为0.01g/ml、果胶酶的浓度为0.003g/ml，离析酶的浓度为0.005g/ml。
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