CN110846270A

CN110846270A - 小麦原生质体的制备方法及小麦原生质体介导的转化方法

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Publication number: CN110846270A
Application number: CN201911178070.5A
Authority: CN
Inventors: 白建芳; 张立平; 赵昌平; 郭昊宇; 苑少华; 刘子涵; 李艳梅
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-02-28

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及小麦原生质体的制备方法及小麦原生质体介导的转化方法。本发明的小麦原生质体制备方法包括以下步骤：培养小麦种子；剪取三叶期的小麦苗叶片，利用酶解液酶解；固液分离，得到小麦原生质体。本发明建立了小麦原生质体制备及转化体系，方法简单、有效，可以用于小麦蛋白亚细胞定位，小麦蛋白互作和蛋白纯化以及荧光素酶标记的基因表达等方面的研究。

Description

小麦原生质体的制备方法及小麦原生质体介导的转化方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及小麦原生质体的制备方法及小麦原生质体介导的转化方法。

背景技术

植物原生质体表现出对激素、代谢物、环境信号和病原诱导子的生理感知和反应类似于完整组织和植物的细胞自主反应，其对高通量筛选和基因功能的系统表征而定义的原生质体瞬时表达系统的发展，与遗传、基因组和转基因方法相结合，对阐明植物信号转导途径有很大的贡献。一些植物中已建立了类似的系统，例如，利用原生质体瞬态表达的欧芹、玉米、胡萝卜、紫花苜蓿、拟南芥和烟草悬浮培养细胞。

小麦是小麦属植物的统称，代表种为普通小麦(Triticum aestivum L.)，是一种在世界各地广泛种植的谷类作物，小麦的颖果是人类的主食之一，磨成面粉后可制作面包、馒头、饼干、面条等食物，发酵后可制成啤酒、酒精、白酒(如伏特加)或生物质燃料。小麦的原生质体十分脆弱，提取及实验过程中易失活，破碎，故而对试剂的配比浓度、pH值和实验流程有着极高的要求。目前，小麦制备原生质体的方法费时费力，不利于快速验证基因功能。因此，不成熟的小麦转化及再生体系技术制约了利用转基因技术研究小麦基因功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小麦原生质体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供利用上述方法得到的小麦原生质体的转化方法。

根据本发明具体实施方式的小麦原生质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将小麦种子培育成小麦苗；

(2)剪取三叶期小麦苗的叶鞘部分，切成细条后，用0.6M甘露醇避光处理；

(3)用酶解液处理步骤(2)得到的叶片，其中，酶解液包括以下组分：酶解液包括以下组分：1.5w/v％纤维素酶、0.4％w/v离析酶、0.4M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1w/v％BSA、20mM MES，pH为5.7，余量为dd H₂O；

(4)将步骤(3)酶解后溶液进行固液分离，得到原生质体。

根据本发明具体实施方式的小麦原生质体的制备方法，步骤(3)中，将叶片加入酶解液后，抽真空，在黑暗中，温度为25℃、60rpm条件下，酶解4–5h。

根据本发明具体实施方式的小麦原生质体的制备方法，步骤(4)中，使用100目尼龙网过滤酶解液处理的叶片，残渣用W5溶液漂洗后过滤，合并滤液；将滤液在室温下100g离心，沿离心管壁加入10mL预冷的W5溶液，重悬沉淀，离心。

根据本发明具体实施方式的小麦原生质体的制备方法，步骤(4)中，W5溶液包括以下组分：2mM MES(pH为5.7)、150mM NaCl、125mM CaCl₂、50mM KCl，余量为水。

根据本发明具体实施方式的小麦原生质体介导的转化方法，所述方法包括将外源性质粒DNA与小麦原生质体混合孵育的步骤。

根据本发明具体实施方式的小麦原生质体介导的转化方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将外源性质粒DNA与含有小麦原生质体的MMG溶液混匀；

(2)加入40％PEG4000溶液，混匀，室温静置孵育；

(3)加入W5溶液，混匀，除去上清液，即得转化子。

根据本发明具体实施方式的小麦原生质体介导的转化方法，步骤(3)中，加入1mLW5溶液，混匀，100g离心2分钟，除去上清液。

本发明的有益效果：

小麦的原生质体十分脆弱，提取及实验过程中易失活，破碎，本发明的制备方法中酶解液的纤维素酶与离析酶具有最适配比浓度、并且酶解液具有稳定的pH值，提高小麦原生质体的完整性和高活力。与细胞培养系相比，利用新鲜组织作为原生质体来源不但能够保留了细胞特性和分化状态，而且改造效率高、维修费用低。本发明的制备方法获得的原生质体是生理的和通用的细胞系统，可用于研究植物色素、生物钟、GA、光、糖、胁迫、生长素、H₂O₂、膜运输、细胞分裂素和细胞凋亡控制等一系列植物信号机制；有助于实现小麦个体基因及其产物的功能基因组和蛋白质组分析；也为细胞、遗传和分子分析以及现有突变的补充提供了方便和强大的工具。

本发明的小麦原生质体的转化体系可用于小麦蛋白亚细胞定位、小麦蛋白互作(双分子荧光互补，BiFC)和蛋白纯化以及荧光素酶(Luciferase)标记的基因表达等方面的研究，因此，为小麦基因功能的研究提供了便利条件。

附图说明

图1显示利用小麦原生质体介导转化的结果。

具体实施方式

实施例1制备原生质体

1.小麦种子的培育

小麦种子泡在水中12小时，种子充分吸水后，将其播种于育苗盘中，播种后置于25℃，14小时光照下培养10天，使幼苗长至三叶期。

2.小麦苗的预处理

取生长良好的小麦苗(约50株)，剪取中间的叶片部分，用刀片切成0.5mm细条(越细越好，尽量一刀切碎，不要反复切，避免使细胞受到损伤)。将切碎叶片放于0.6M甘露醇中避光预处理10分钟。

3.酶解处理

把预处理好的叶片转移入含有30mL酶解液的50mL三角瓶中(用锡箔纸遮住)；用真空泵-40kPa抽真空30min后，在黑暗中消化酶解4h-5h(25℃,60rpm)，期间使用显微镜检查原生质体裂解状态。

所述原生质体酶解液按照如下方法制备而成：称取0.45g的纤维素酶R10(Cellulose R10)、0.12g的离析酶R10(Macerozyme R10)、2.184g甘露醇(Mannitol),量取600ul的KCl(1M)、6mL的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES,0.1M，pH为5.7)，混合均匀，放置55℃水浴锅中加热约10分钟，待完全溶解后冷却至室温，加300uL的CaCl₂(1M)和0.003g的牛血清白蛋白(BSA)，最后用dd H₂O定容至30ml，细菌过滤器抽滤灭菌，备用。

表1酶解液配方组成

试剂名称	用量	终浓度
			Cellulase R10	0.45g	1.5％
Macerozyme R10	0.12g	0.4％
			Mannitol	2.184g	0.4M
1M KCl	600ul	20mM
			0.1M MES	6ml	20mM
1M CaCl<sub>2</sub>	0.3ml	10mM
			BSA	0.03g	0.1％

注：酶解液需现用现配。需55℃水浴加热约10min待完全溶解后，冷却至室温，再加入CaCl₂和BSA，最后用0.45um细菌过滤器过滤灭菌。

根据本发明的技术方案，优化酶解液中纤维素酶与离析酶的配比可使单位体积内获得的原生质体个数达到(1.3±0.12)×10⁷个/g，显著多于其他配比。2-(N-吗啉)乙磺酸稳定酶解液的pH值为5.7，保证小麦原生质体的活性。甘露醇作为渗透稳定剂，其作用是使酶解液同小麦原生质体细胞渗透压相近，保持原生质体膜的稳定，避免细胞破裂。KCl和CaCl₂能保持原生质体质膜的电荷平衡，同时对原生质体的生长发育有利。牛血清白蛋白(BSA)可以减少或防止降解细胞壁过程中对细胞器的破坏，使得有活性的原生质体比例达到97.2±2.1％。

4.固液分离(注意吸取时枪头应减去尖口)

使用100目尼龙网过滤酶解液处理的叶片，滤液过滤到50mL离心管。残渣用W5漂洗再过滤，合并滤液。沿离心管壁加入10mL预冷的W5溶液，在室温下100g(加速度1)离心3min，去除上清。

沿离心管壁加入30mL预冷的缓冲液W5，重悬沉淀，离心，去除上清。

用30ml预冷的W5重悬沉淀，冰上放置30min，即可得到小麦原生质体用于后续实验。

W5溶液按照如下方法制备而成：2.5ml的KCl(1M)、62.5mL的CaCl₂(1M)、4.5gNaCl、10mL的MES(0.1M,用KOH调pH至5.7)，用H₂O定容至500mL，细菌过滤器抽滤灭菌，备用。

表2 W5溶液(500ml)的配方组成

试剂名称	用量	终浓度
			0.1M MES	10mL	2mM
NaCl	4.51g	150mM
			1M CaCl<sub>2</sub>	62.5mL	125mM
1M KCl	2.5mL	50mM

注：酶解液需现用现配。最后用0.45um细菌过滤器过滤灭菌。

实施例2原生质体介导转化

(1)准备含有绿色荧光蛋白(GFP)植物表达载体的菌液，用质粒试剂盒(版本号：DP180816)提取质粒DNA，使得质粒最终浓度达到1000mg/uL；

(2)将提取好的原生质体溶液100g离心3min，加速度为1，除去上清，加入2mL MMG溶液重悬；

(3)准备10μg提取的GFP质粒DNA，分别加到2mL离心管底部，向管中加入200μL小麦原生质体的MMG溶液，轻轻混匀；

(4)向离心管加入220μL的40％PEG4000溶液，轻轻混匀，避光静置15分钟；

(5)加入1mL W5溶液，混合均匀，100g离心2分钟，除去上清；

(6)加入1.5mL W5溶液，混合均匀，转移到细胞培养板上避光培养24-48小时。

表3 MMG溶液(10ml)配方组成

试剂名称	用量	终浓度
			0.1M MES	400uL	4mM
Mannitol	0.728g	0.4M
			1M MgCl<sub>2</sub>	750uL	75mM

注：MMG溶液需现用现配；最后用0.45um细菌过滤器过滤灭。

表4 40％PEG 4000溶液(10ml)配方组成

试剂名称	用量	终浓度
			PEG4000	4.00g	0.1M
Mannitol	0.364g	0.2M
			1M CaCl<sub>2</sub>	1mL	0.1M

注：40％PEG4000溶液需现用现配；最后用0.45um细菌过滤器过滤灭菌。

在激光共聚焦显微镜下观察GFP信号。

结果如图1所示，可以明显看到在细胞质、细胞膜和细胞核都有很强的荧光信号，并且原生质体呈现圆形、未破裂的状态，说明本发明的方法所制备的小麦原生质量好、转化效率也很高。因此，本发明的方法可用于对小麦的其它基因进行亚细胞定位研究。

Claims

1.小麦原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将小麦种子培育成小麦苗；

(3)用酶解液处理步骤(2)得到的叶片，其中，酶解液包括以下组分：1.5w/v％纤维素酶、0.4％w/v离析酶、0.4M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1w/v％BSA、20mM MES，pH为5.7，余量为dd H₂O；

(4)将步骤(3)酶解后溶液进行固液分离，得到原生质体。

2.根据权利要求1所述的小麦原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将叶片加入酶解液后，抽真空，在黑暗中，温度为25℃、60rpm条件下，酶解4–5h。

3.根据权利要求1所述的小麦原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，使用100目滤网过滤酶解液处理的叶片，滤液过滤到离心管中，残渣用W5溶液漂洗后过滤，合并滤液；沿离心管壁加入10mL预冷的W5溶液，在室温下100g离心，去除上清；沿离心管壁加入30mL预冷的缓冲液W5，重悬沉淀，离心，去除上清。

4.根据权利要求3所述的小麦原生质体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，W5溶液包括以下组分：2mM MES、150mM NaCl、125mM CaCl₂、50mM KCl，余量为水。

5.小麦原生质体介导的转化方法，其特征在于，所述方法包括将外源性质粒DNA与权利要求1～4任一项所述的制备方法制备的小麦原生质体混合并孵育的步骤。

6.小麦原生质体介导的转化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将外源性质粒DNA与权利要求1～4任一项所述的制备方法制备的小麦原生质体的MMG溶液混合；

(2)加入40％PEG 4000溶液，混匀，室温静置孵育；

(3)加入W5溶液，混匀，除去上清液，即得转化子。

7.根据权利要求6所述的小麦原生质体介导的转化方法，其特征在于，步骤(3)中，加入1mL W5溶液，混匀，100g离心2分钟，除去上清液。