CN109810937A

CN109810937A - 一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法

Info

Publication number: CN109810937A
Application number: CN201910257339.2A
Authority: CN
Inventors: 杜雄明; 王丽媛; 王晓阳; 傅国勇; 何守朴; 潘兆娥; 陈保军; 贾银华; 耿晓丽; 王立如; 庞保印; 李洪戈
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2039-04-01
Also published as: CN109810937B

Abstract

本发明公开了一种亚洲棉原生质体分离与外源基因转化的方法。该方法包括亚洲棉种子萌发、酶解分离原生质体、离心收集原生质体、培养、外源基因转化及显微观察鉴定等步骤。本发明黑暗环境中生长的叶片所分离的原生质体浓度符合实验需求且完整度高，可得到完整的转化成功的原生质体。因此本发明得出的利用黑暗环境培养的叶片分离原生质体方法，更好地解决了亚洲棉原生质体分离及外源基因转化的难题。亚洲棉原生质体分离及外源基因成功转化，可为开展亚洲棉大规模细胞培养、有目的地导入外源基因及进一步创新和品质改良工作提供基础帮助。

Description

一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学和分子生物学领域，具体涉及一种亚洲棉原生质体分离与外源基因转化的方法。

背景技术

植物原生质体指的是去除细胞壁的由质膜包被的裸露细胞，具有细胞全能性，可再生成完整的植株，同时，原生质体也是一种理想的单细胞系统。原生质体采用原生质体转化技术可进行基因瞬时表达研究，可获得突变体材料，也可导入外源目的基因以改良植物种质资源。因此，原生质体可以为现代生物技术研究的诸多方面提供有利的试验材料，已被广泛地应用于植物基础理论研究和遗传改良中。原生质体的制备主要有机械法和酶解法，其中机械法制备原生质体具有操作条件剧烈、损伤大、收率低等缺点。目前，人们广泛使用的酶解液组合为纤维素酶+离析酶或纤维素酶+果胶酶，已被成功地用于小麦、马铃薯、油菜、柑橘等植物的原生质体分离。

绿色荧光蛋白(GFP)作为易于检测的报告基因，具有操作技术方便、不需要制样，无特异性标记的影响，在激光共聚焦显微镜的照射下能够自发发出一种绿色荧光，对细胞无害且灵敏度高等优点。GFP在光照下是稳定的，各种光照都不会引起其变性，作为荧光标记分子广泛应用于植物外源蛋白亚细胞定位。

棉花在分类学上属于锦葵科中的棉属，有51个种，包括4个栽培棉种和47个野生棉种。亚洲棉栽培种植株较适应亚洲土壤气候，生长期短，抗逆性强等，对棉花育种有一定价值。亚洲棉是一个古老的二倍体种，具有丰富的遗传多样性，且具有早熟、抗逆性强、纤维强力高、弹性好等一些优良的性状，这些特性正是当前陆地棉栽培种所欠缺的。因此利用亚洲棉为材料应用原生质体分离与转化技术在植物遗传育种、性状改良和遗传转化等领域都具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，可以获得完整度高且浓度满足要求的原生质体，成功进行外源基因的转化与鉴定。

本发明的技术方案为：一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，包括以下步骤：

(1)取饱满的亚洲棉种子，黑暗环境下萌发生长；

(2)取步骤(1)生长至8-10天的子叶，切成细条放入酶解液中，抽真空，然后将酶解液及子叶转移至无菌锥形瓶中，黑暗培养10-16h；

(3)向步骤(2)处理后的酶解液内加入等体积预冷的W5溶液后轻轻摇晃，释放原生质体，低速离心，弃上清；

(4)向步骤(3)中保留溶液内加入预冷的W5溶液重新悬浮原生质体，低速离心，弃上清，加入适量W5溶液重新悬浮收集原生质体；

(5)将步骤(4)中原生质体放在冰上静置30min，弃上清液加入预冷的Mmg溶液重新悬浮原生质体，并通过细胞计数板计数；

(6)将步骤(5)中原生质体装至圆底离心管，加入载体；轻轻混匀，再加入等体积的40％PEG-Ca²⁺溶液，轻轻上下颠倒混匀，室温静置18min后加入两倍体积的W5溶液终止转化；

(7)将步骤(6)中的混合物低速离心后吸去40％PEG-Ca²⁺溶液，加入等体积W5溶液，低速离心，去上清液，然后加入等体积W5溶液，再次低速离心后吸去W5溶液，加入等体积WI溶液，轻轻混匀，低速离心；然后转移至培养板孔中，25℃恒温黑暗培养14-16h。

进一步地，步骤(2)中，黑暗培养条件为25℃摇床，50r/min。

进一步地，W5溶液配方为：MES 2mM、KCl 5mM、CaCl₂ 0.125M、NaCl 0.15M，溶剂为ddH₂O。

进一步地，Mmg溶液配方为：MES 4mM、D-甘露醇0.4M、MgCl₂ 0.015M，溶剂为ddH₂O。

进一步地，40％PEG-Ca²⁺溶液配方为：PEG4000 40％、D-甘露醇0.4M、CaCl₂ 0.01M，溶剂为ddH₂O。

进一步地，WI溶液配方为：MES 4mM、D-甘露醇0.5M、KCl 0.02M，溶剂为ddH₂O。

进一步地，酶解液配方为：Cellulose R10 1.5％、Macerozyme R10 0.4％、D-甘露醇0.6M、KCl 0.02M、MES 0.02M、CaCl₂ 0.01M、β-巯基乙醇0.05％、BSA 0.01％。

进一步地，所述低速离心为：离心速度为100g，且加减速设为1，离心时间2min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用黑暗环境培养的叶片分离原生质体方法，分离的原生质体浓度符合实验需求且完整度高，可得到完整的转化成功的原生质体。

本发明取样选取子叶，避免了棉花真叶中蜡质、酚类等物质的影响，且子叶中叶肉细胞较多，提升了原生质体分离效率。

本发明调整了酶解液配方中各组分的浓度，保证酶解过程充分完成，又省去了各组分过量造成的不必要浪费。

本发明根据棉花中酚类物质含量高的特点，提升了β-巯基乙醇的浓度，防止酚类物质氧化造成原生质体褐化，提高原生质体的活力。

本发明新增添了WI溶液，WI溶液与W5溶液相比增加了甘露醇，调节渗透压，防止水分渗入细胞内部，保持原生质体完整性，且相较于其他糖类物质甘露醇对于原生质体没有毒害作用。

本发明解决了亚洲棉原生质体分离及外源基因转化的难题。亚洲棉原生质体分离及外源基因成功转化，可为开展亚洲棉大规模细胞培养、有目的地导入外源基因及进一步创新和品质改良工作提供基础帮助。

附图说明

图1A为正常光照生长的叶片浸入酶解液中制备原生质体；图1B为黑暗环境生长的叶片浸入酶解液中制备原生质体；

图2A为正常光照生长的叶片酶解过滤后原生质体溶液；图2B为黑暗环境生长的叶片酶解过滤后原生质体溶液；

图3A为10x视野下正常光照生长的叶片所制备的原生质体计数；图3B为40x视野下正常光照生长的叶片所制备的原生质体计数；图3C为10x视野下黑暗环境生长的叶片所制备的原生质体计数；图3D为40x视野下黑暗环境生长的叶片所制备的原生质体计数；

图4A为正常光照生长的叶片所制备的原生质转入GFP载体后可见光视野下观察；图4B为绿色荧光视野下正常光照生长的叶片所制备的原生质转入GFP载体后观察；图4C为黑暗环境生长的叶片所制备的原生质转入GFP载体后可见光视野下观察；图4D为绿色荧光视野下黑暗环境生长的叶片所制备的原生质转入GFP载体后观察。

具体实施方式

实施例1

(1)选取两组30粒饱满的亚洲棉972种子，植入营养土中，一组正常光照下培养，另一组黑暗培养，温度均设置为16h28℃/8h25℃处理。大约长至8-10天即子叶完全展开但尚未长出真叶时取样，期间浇水2-3次。

(2)原生质体制备前准备工作：对剪刀、镊子、100ml锥形瓶、50ml圆底离心管、2ml圆底离心管、剪去顶端的1ml蓝枪头和200ul黄枪头、量筒等实验耗材进行灭菌处理，并配置无菌超纯水和过滤除菌的母液。

表1 母液配方

试剂	浓度	产品	备注
				NaCl	2M	进口sigma
KCl	2M	进口sigma
				CaCl<sub>2</sub>	1M	进口sigma
MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	2M	进口sigma
				D-甘露醇	0.8M	进口sigma	室温保存
MES	0.2M	进口sigma	用KOH调节PH至5.7，过滤除菌

(3)用无菌50ml圆底离心管配制酶解液，需现配现用，定容后于超净工作台中用0.45μm滤器过滤除菌。

表2 酶解液配方

(4)在昏暗或黄光灯下进行原生质体的制备。用酒精洗过的剪刀从子叶基部切下，保留叶片的完整性。选取15-20叶整齐的叠在一起，轻轻按住并用单刃刀片切成0.5-1mm左右的细条，将切下的细条放入酶解液中(避光，用锡箔纸包裹)，用镊子将叶片浸入酶解液，且抽真空(20min)使酶解液快速进入叶片内。将离心管内酶解液及叶片转移至无菌锥形瓶中(如图1所示)。

(5)原生质体的解离与释放，将上步中酶解的叶片放入25℃摇床，以50r/min黑暗培养10-16h。

(6)培养期间配制W5溶液、Mmg溶液、WI溶液和40％PEG-Ca²⁺溶液并灭菌。

表3 W5溶液、Mmg溶液、WI溶液和40％PEG-Ca²⁺溶液试剂配方

(7)过滤原生质体。沿锥形瓶壁加入等体积预冷的W5溶液后轻轻摇晃，释放原生质体。将300目纱布放入漏斗中，先用W5溶液润洗纱布，再将酶解液过滤至100ml锥形瓶中(如图2所示)，用W5溶液冲洗残渣。

(8)收集原生质体。低速水平离心，以100g速度，且加减速设为1，离心2min；用剪过的枪头将上清液弃掉(注意不要吹打，防止破坏原生质体)，用预冷的W5溶液重新悬浮原生质体，并以100g速度，且加减速设为1，离心2min收集原生质体，加入适量W5溶液重新悬浮。

(9)冰上静置30min，期间观察原生质体制备的状态。弃上清液加入预冷的Mmg溶液重新悬浮原生质体，并通过细胞计数板计数。正常光照下生长的叶片所分离得到的原生质碎片较多，完整度低，浓度低；黑暗环境生长的叶片所分离得到的原生质体完整度高，浓度为1.25*10⁶/mL(如图3所示)。

(10)原生质体40％PEG-Ca²⁺溶液转化。设置目的载体(GFP)3个重复，每个重复各加入10ug(载体质粒浓度大于1000ng/ul)，然后每管(2ml圆底离心管)加入200ul步骤9获得的原生质体并轻轻混匀，再加入相应体积(210ul)的40％PEG-Ca²⁺溶液，轻轻上下颠倒混匀，室温静置18min后加入两倍体积(820ul)的W5溶液终止转化。

(11)原生质体培养。以100g速度，且加减速设为1，离心2min，吸去40％PEG-Ca²⁺溶液，加入1mlW5溶液，轻轻混匀，以100g速度，且加减速设为1，离心2min，吸去W5溶液，加入1mlWI溶液，轻轻混匀，然后转移至培养板孔中(提前用0.01％BSA溶液润洗)，25℃恒温黑暗培养14-16h。

(12)荧光显微镜下观察转化后原生质体完整度及转化结果(如图4所示)，在488nm激发光下观察，未成功转入载体的原生质体因叶绿体自发荧光呈现红色荧光，GFP载体转入后呈现绿色荧光，证明外源GFP基因转化成功。正常光照下生长的叶片所分离得到的原生质碎片较多，转化后难以得到完整的原生质体；黑暗环境生长的叶片所分离得到的原生质体完整度高，可得到完整的转化成功的原生质体。

本发明比较了正常光照与黑暗环境两种培养方式下生长的叶片分离得到的原生质体完整度与转化结果，正常光照下生长的叶片所分离的原生质体易破碎，完整度差，浓度低，转化后更难以得到完整的原生质体；黑暗环境中生长的叶片所分离的原生质体浓度符合实验需求且完整度高，可得到完整的转化成功的原生质体。因此本发明得出的利用黑暗环境培养的叶片分离原生质体方法，更好地解决了亚洲棉原生质体分离及外源基因转化的难题。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取饱满的亚洲棉种子，黑暗环境下萌发生长；

2.根据权利要求1所述的一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，步骤(2)中，黑暗培养条件为25℃摇床，50r/min。

3.根据权利要求1所述的一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，W5溶液配方为：MES 2mM、KCl 5mM、CaCl₂ 0.125M、NaCl 0.15M，溶剂为ddH₂O。

4.根据权利要求1所述的一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，Mmg溶液配方为：MES 4mM、D-甘露醇0.4M、MgCl₂ 0.015M，溶剂为ddH₂O。

5.根据权利要求1所述的一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，40％PEG-Ca²⁺溶液配方为：PEG4000 40％、D-甘露醇0.4M、CaCl₂ 0.01M，溶剂为ddH₂O。

6.根据权利要求1所述的一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，WI溶液配方为：MES 4mM、D-甘露醇0.5M、KCl 0.02M，溶剂为ddH₂O。

7.根据权利要求1所述的一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，酶解液配方为：Cellulose R10 1.5％、Macerozyme R10 0.4％、D-甘露醇0.6M、KCl0.02M、MES 0.02M、CaCl₂ 0.01M、β-巯基乙醇0.05％、BSA 0.01％。

8.根据权利要求1所述的一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，所述低速离心为：离心速度为100g，且加减速设为1，离心时间2min。