CN107488675A - 油菜原生质体的分离及转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种油菜原生质体分离及转化方法，包括以下步骤：1、选取油菜子叶或真叶，去除下表皮；2、置入酶解液中酶解，酶解液配方为：1wt%纤维素酶，0.3wt%离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl，20mM pH为5.7的MES，10mM CaCl2，0.1wt%BSA；3、在酶解混合液中加入等体积的W5溶液低速离心去上清，加W5洗涤重悬，将重悬液加入到20wt%的蔗糖溶液中进行纯化，水平离心取上层绿色原生质体液层；4、离心去除W5溶液，用MMG溶液重悬原生质体沉淀；5、原生质体转化。本发明首次在油菜中建立了原生质体分离及转化方法，利用油菜原生质体为受体进行转化，黄色荧光蛋白YFP、萤光素酶Luc及海洋腔肠萤光素酶Ren能够成功表达。

Description

油菜原生质体的分离及转化方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种油菜高质量原生质体分离、培养及瞬时转化的方法。通过polyethylene glycol(PEG)介导，将外源基因转入油菜原生质体并进行瞬时表达的方法。
背景技术
油料作物生产不仅在国民经济和社会发展中占有重要地位，也是促进中国农业可持续发展的主要因素之一。目前中国的植物油生产量仅能满足国内1/2－2/3的消费需求，大量依赖进口，是世界上最大的油料进口国。油菜是中国最主要的油料作物之一，菜籽油在中国的食用油中约占40％。中国油菜年种植面积750万公顷，菜籽总产量超过1,000万吨，面积和总产均为世界第二位，分别占全世界的1/5。目前经过几代育种家的努力，通过传统育种途径已经使油菜单产提高了许多，进一步通过传统育种途径大幅度提高产量的难度很大。油菜及其祖先种白菜、甘蓝的基因组测序均已完成，为油菜功能基因组研究奠定了坚实的基础，对油菜育种和改良产生深远的影响。现在人们越来越多地把重点放在产油量相关功能基因的分离上，并利用这些基因进行相关的基因工程品种改良，争取从根本上改善种子的品质，提高产油量。
随着油菜基因组信息的完善，油菜功能基因研究加快，大量重要基因的功能特征需进一步鉴定。目前，已有多种研究技术成功运用于油菜功能基因的确认及机理解析，如转录组测序、基因组测序、芯片技术、全基因组关联分析(GWAS)、油菜转基因及瞬时表达等。农杆菌介导的油菜下胚轴转化是油菜基因功能研究最普遍且行之有效的技术。但是由于生长周期长，转化效率低等因素，限制该技术在大规模筛查功能基因上的应用。因此，需要瞬时表达这种简便又快捷的方法来进行基因功能的研究，使研究工作更为高效。
瞬时表达(transient expression)在分子生物学研究中被广泛应用，包括外源基因的表达、转录因子与顺式作用元件的互作、蛋白质间的互作启动子功能分析、蛋白的亚细胞定位等。为了使基因的表达产物正确折叠、修饰并精确定位在相应的亚细胞结构上，受体细胞的选择非常关键。烟草下表皮、烟草BY-2(Bright Yellow-2)细胞、叶肉原生质体、洋葱表皮细胞均被作为受体材料，成功用于功能基因的瞬时表达分析。其中利用原生质体进行瞬时表达分析研究的准确性更高，因此得到广泛利用。目前，已在拟南芥、烟草、小麦、水稻等作物中建立基于原生质体瞬时表达遗传转化体系，并广泛用于目标基因表达分析。但在本发明申请之前，尚无利用油菜原生质体遗传转化开展目的基因功能验证的报道，影响油菜这一重要油料作物科研工作进展。虽然拟南芥、水稻等植物原生质体分离及转化体系已经成熟，但由于不同物种叶片的特性及状态不同，叶肉细胞的状态如细胞渗透压等也就不同，所以建立适用于所研究物种的原生质体分离及转化体系十分必要，加快科研工作进程。为此，我们探索并建立了油菜原生质体分离及转化体系。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种油菜原生质体分离及转化的方法。该方法的优点是可选取子叶制备原生质体，缩短实验周期；针对油菜叶片的特点，选取了合适的酶比例及甘露醇浓度，提高了原生质体的产量，降低了相关酶的使用量，从而降低成本；此外，增加了蔗糖纯化步骤，提高原生质体的质量进而提高转化效率。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
将外源基因导入油菜原生质体进行瞬时表达的方法：以油菜子叶或真叶为原材料，分析影响油菜叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素，确定适用于油菜的酶解、分离、纯化及转化的体系，最终以油菜原生质体为受体，利用合适浓度的PEG介导，将整合了外源基因的表达载体转入油菜原生质体中，经过优化培养，使外源基因在油菜原生质体中成功表达，建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。本发明中所述的瞬时表达载体具有如下特点：易于整合外源基因；载体一般小于10Kb，过大降低转化效率；带有植物启动子及终止子，确保外源基因能够表达。
油菜原生质体的分离及转化方法，包括以下步骤：
(1)选取生长健壮的油菜子叶或真叶，去除下表皮；
(2)将去除下表皮的子叶或真叶置入酶解液中，25-28℃避光静置酶解，所述的酶解液配方为：1wt％纤维素酶，0.3wt％离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl，20mM pH为5.7的MES，10mM CaCl2，0.1wt％BSA；
(3)酶解后，在酶解混合液中加入等体积的W5溶液离心终止酶解反应，离心去上清后，用W5溶液重悬原生质体，将重悬液加入到20wt％的蔗糖溶液中水平离心，上层绿色溶液即为纯化后的原生质体；
(4)离心去除W5溶液，用MMG溶液重悬，重悬后细胞密度为1.5-2×105细胞/mL，备用；
(5)原生质体转化：转化体系为10μg质粒，200μL原生质体-MMG悬混液，220μL 40％PEG-4000，轻柔混匀后室温放置10-15min，再加入880μL W5溶液重新悬浮，终止转化；离心弃上清，加入100μL W5+5mM葡萄糖溶液重悬浮，室温培养12-18h。
优选的，步骤(1)选取子叶制备原生质体。
优选的，步骤(2)中酶解时间为3小时。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明是国内外首次公开油菜原生质体的分离、培养、转化及在瞬时表达分析上的应用。目前利用油菜原生质体进行生理生化及基因功能研究没有相关报道。通过对比取材时期及部位、酶的比例及甘露醇的浓度等确定适用于油菜原生质体分离及转化的体系。其中利用子叶可大大缩短实验周期，提高科研工作效率。而且降低了所用酶的比例，降低实验成本。此外，利用蔗糖对细胞进行纯化，有利于得到漂亮的图片或更可靠的结果。本发明实验结果表明，利用油菜原生质体为受体进行转化，黄色荧光蛋白YFP、萤光素酶基因等能够成功被表达。因此，本发明提出可利用油菜原生质体为对象进行生理生化及基因功能等方面的研究。
附图说明
图1四周大的油菜真叶下表皮的分离方法。(A)图显示用胶带撕掉油菜叶片下表皮，所用品种为中双9号；(B)图显示用尖镊子撕掉油菜叶片的下表皮，所用油菜品种为阳光2009；(C)图显示2周大的油菜子叶下表皮的分离过程。
图2为不同浓度甘露醇酶解液中的原生质体的分离效果。
图3为原生质体的纯化和活力检测。(A)图显示纯化前原生质体W5重悬液；(B)图显示利用20wt％的蔗糖溶液纯化原生质体水平离心后的液面分层；(C)图显示利用FDA检测纯化后原生质体的活力，有荧光的为活细胞；(D)图为纯化后原生质体显微镜明场成像。
图4为黄色荧光蛋白YFP表达载体图谱。
图5为激光共聚焦显微镜观察YFP在油菜原生质体中的瞬时表达。(A)图显示YFP荧光通道；(B)图显示叶绿体自发荧光；(C)图显示明场通道；(D)图显示3个通道叠加后成像。
图6为Luc及Ren双分子报告载体图谱。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例一酶解液及酶解时间对油菜原生质体分离的影响
原生质体能否成功分离的关键是酶解细胞壁所用的酶，我们设置了两种酶解液比较不同酶浓度下原生质体的产量及质量，具体方法如下：
第一组：植物原生质体分离常用的酶浓度配制酶解液，酶解液含1.5wt％纤维素酶、0.4wt％离析酶、0.5M甘露醇、20mM KCl、20mM MES(pH，5.7)、10mM CaCl2、0.1wt％BSA；
第二组：1wt％纤维素酶、0.3wt％离析酶、0.5M甘露醇、20mM KCl、20mM MES(pH，5.7)、10mM CaCl2、0.1wt％BSA；
结果表明，酶解3小时后，第一组处理原生质体产量为(4±0.2)×105个/克叶片，第二组处理原生质体产量为(1.06±0.3)×106个/克叶片。第二组1％纤维素酶加0.3％离析酶更适用于油菜原生质体的分离，原生质体的产量优于第一组。
原生质体能否成功培养的关键因素是酶解液的细胞渗透压，因此酶解液中甘露醇的含量我们设置了不同浓度梯度(0.2M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M)，从而观察不同渗透压对原生质体的影响，具体方法同上述实验，所用酶解液为1wt％纤维素酶、0.3wt％离析酶、不同浓度的甘露醇(0.2M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M)、20mM KCl、20mM MES(pH，5.7)、10mM CaCl2、0.1wt％BSA。
实验结果表明(图2)，含不同浓度甘露醇的酶解液分离出的原生质体的产量和质量各不相同。当甘露醇浓度为0.2M时，显微镜观察到不到完整的原生质体细胞，即酶解液不能成功去除细胞壁。当甘露醇浓度为0.5M时，原生质体的产量和质量较好，酶解3小时后每克叶片可分离1.32×106个原生质体细胞。随着甘露醇浓度的升高，原生质体的产量及质量均降低，产生较多的细胞碎片，无法满足实验要求。
确定了酶解液的组成(1wt％纤维素酶、0.3wt％离析酶、0.5M甘露醇、20mM KCl、20mM MES(pH，5.7)、10mM CaCl2、0.1wt％BSA)，我们进一步检测了酶解时间对油菜原生质体产量的影响。分别在酶解进行3h、4h及5h取酶解液进行镜检计数，统计如表一，酶解3h原生质体产量最高，为1.02±0.35×106，随着酶解时间延长，破碎的细胞越来越多，反而导致完整的原生质体产量下降。
表一酶解时间对油菜原生质体产量的影响
综合上述实验，我们确定适用于油菜原生质体分离的酶解液配方是：1％纤维素酶、0.3％离析酶、0.5mol·L–1甘露醇、20mM KCl、20mM MES(pH 5.7)、10mM CaCl2、0.1％BSA，酶解3小时为佳。
实施例二黄色荧光蛋白在油菜原生质体中的瞬时表达
使用的溶液组成如下：
酶解液：1wt％纤维素酶，0.3wt％离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl，20mM MES(pH5.7)，10mM CaCl2，0.1％wtBSA，现配现用；
W5溶液：4mM MES，154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，2mM MES(pH 5.7)；
MMG溶液：0.4M mannitol，15mM MgCl2及4mM MES(pH 5.7)。
1、原生质体的分离纯化方法
(1)选取油菜真叶或生长2周左右的油菜子叶3-5片(子叶发芽7天即可获得，培养的环境及技术简单，易于获得，大幅缩减实验周期)，将一段胶带两端固定在桌面上，使粘面朝上，然后将叶片或子叶粘在胶带上，使下表皮朝上，再用胶带粘在下表皮上，轻轻地将下表皮撕除，露出叶肉细胞；将去除下表皮的子叶从胶带上剪下，加入到准备好的酶解液中(2mL酶解液酶解5片左右子叶)，25-28℃避光静置或40转/分钟酶解(图1)，使叶肉完全酶解，叶片只剩表皮，至酶解混合液呈现绿色为止，此过程大约3小时，显微镜观察细胞是否为完整及饱满；
(2)酶解终止后，用镊子去除剩余残渣，加入等体积的W5溶液；
(3)混合液转入10mL圆底离心管中，100×g室温离心2min，弃上清液；
(4)加入W5溶液2mL轻轻悬浮，重复步骤(3)；
(5)加1mL W5溶液重悬沉降的原生质体，用移液枪吸取重悬液缓慢加到5mL20wt％蔗糖溶液，室温130×g水平转离心2min，离心后分层，上层绿色溶液层面为纯化后的原生质体，此步骤纯化后可去除杂质及破碎细胞，提高转化效率，用FDA染色检测细胞活力(图3)；
(6)小心吸取原生质体液层至2mL圆底离心管中，100×g室温离心2min，尽可能去除W5上清液，加1mL MMG溶液重悬原生质体沉淀，重悬后细胞密度为1.5-2×105细胞/mL(过高影响转化效率)。
2、以PEG介导的油菜原生质体的瞬时转化方法
(1)表达载体质粒准备：所用载体为pEarlygate104，该质粒从Invitrogen公司获得，质粒图谱见图4，质粒提取利用天根无内毒素质粒提取试剂盒，根据说明书进行操作，将提取的质粒浓度调整为1μg/μL左右备用；
(2)将10μg质粒DNA(1μg/μL)加入到200μL原生质体-MMG悬混液，轻弹管底混匀；
(3)加220μL40％PEG-4000，轻弹管底混匀，室温放置15min；
(4)加880μLW5溶液重新悬浮，轻弹管底混匀，终止转化；
(5)100×g离心2min，弃上清液，加入100μL W5+5mM葡萄糖溶液重悬浮，室温培养12-18h；
(6)荧光蛋白的检测：以荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察，黄色荧光蛋白激发波长488nm，发射波长503-530nm。如图5所示，35S启动子驱动YFP蛋白成功在原生质体中表达，本实施例所用质粒大于10kb，转化率30％左右，如果载体小于10kb转化效率可提高到60-80％。
实施例三报告基因LUC及Ren在油菜原生质体中的瞬时表达
1、原生质体的分离纯化
与实施例二中原生质体的分离纯化方法相同。
2、以PEG介导的油菜原生质体的瞬时转化方法
表达载体质粒准备：所用载体为pGreenII 0800-35S-LUC，载体图谱如图6所示，质粒提取利用天根无内毒素质粒提取试剂盒，根据说明书进行操作，将提取的质粒浓度调整为1μg/μL左右备用。
(1)将10μg质粒DNA(1μg/μL)加入到200μL原生质体-MMG悬混液，轻弹管底混匀；
(2)加220μL 40％PEG-4000，轻弹管底混匀，室温放置15min；
(3)加880μL W5溶液重新悬浮，轻弹管底混匀，终止转化；
(4)100×g离心2min，弃上清液，加入100μL W5+5mM葡萄糖溶液重悬浮，室温培养12-18h；
(5)报告基因LUC及Ren的检测
购买普洛麦格(Promega)公司双分子报告分析试剂盒，试剂盒货号E1910，根据试剂盒说明书进行操作。检测结果见表二，未转化的原生质体对照LUC及Ren两个报告基因只有极低的本地表达，而转化的三个重复均有较高的表达，说明本方法可成功用于双分子报告系统。
表二报告基因LUC及Ren在油菜原生质体中的瞬时表达

Claims (3)

1.油菜原生质体的分离及转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取生长健壮的油菜子叶或真叶，去除子叶或真叶的下表皮；
(2)将去除下表皮的子叶或真叶置入酶解液中，25-28℃避光酶解，所述的酶解液配方为：1wt％纤维素酶，0.3wt％离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl，20mM pH为5.7的MES，10mMCaCl2，0.1wt％BSA；
(3)酶解后，在酶解混合液中加入等体积的W5溶液离心洗涤原生质体，离心去上清后，用W5溶液重悬原生质体，将重悬液加入到20wt％的蔗糖溶液中进行纯化，水平离心后上层绿色溶液即为纯化后的原生质体；
(4)离心去除W5溶液，用MMG溶液重悬原生质体沉淀，重悬后细胞密度为1.5-2×105细胞/mL，备用；
(5)原生质体转化：转化体系为10μg质粒，200μL原生质体-MMG悬混液，220μL 40％PEG-4000，轻柔混匀后室温放置10-15min，再加入880μL W5溶液重新悬浮，终止转化；离心弃上清，加入100μL W5+5mM葡萄糖溶液重悬浮，室温培养12-18h。
2.根据权利要求1所述的油菜原生质体的分离及转化方法，其特征在于，步骤(1)选取子叶制备原生质体。
3.根据权利要求1所述的油菜原生质体的分离及转化方法，其特征在于，步骤(2)中酶解时间为3小时。
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