CN106636173B - 增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物病理学技术领域，具体涉及一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。本发明提供的一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法构建了mig2－5－1启动子调控EGFP表达的载体PHD3－mig2－5－1－EGFP，利用原生质体遗传转化法将载体转入玉米丝黑穗菌内，并且采用PCR方法和荧光检验可以发现mig2－5－1启动子能诱导EGFP在菌株中获得大量且高效地荧光表达，同时能稳定地遗传表达。本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株，能够用于抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面，鉴定结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响，重复性高。

Description

增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和 应用
技术领域
本发明涉及植物病理学技术领域，尤其涉及一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。
背景技术
玉米丝黑穗病又称乌米、哑玉米，是我国玉米的主要病害之一。玉米丝黑穗病是在玉米发芽期侵入的侵染性病害，一经感病，首先破坏雌雄穗，使果穗形成一个黑粉包。由于部分品种的抗病性不强或不抗病、病菌变异、防治不力等原因，近年来，发病率有所提高，严重影响玉米产量。
玉米丝黑穗病是由玉米丝轴团散黑粉菌引起的真菌病害。玉米丝黑穗病菌以冬孢子散落在土壤中，混入粪肥里或沾附在种子表面越冬，翌年在玉米发芽时直接侵入玉米幼芽的分生组织的侵染性病害。
对于玉米丝黑穗病的传统的防治方法主要以种子包衣为主，但该方法会造成农民生产成本的提高，并对环境产生不良影响，选育和推广抗病品种是控制玉米丝黑穗病发生的有效措施。而抗玉米丝黑穗病资源鉴定是培育抗病玉米新品种基础，传统资源评价方式为田间菌土接种法，该法存在鉴定周期长、用地量多、鉴定群体大、受环境影响较大等缺点。
寻找简单易行、鉴定周期短、不受外界影响的方法筛选抗玉米丝黑穗病的玉米品种是关键。荧光蛋白基因可以作为报告基因，对细胞内的物质进行跟踪定位。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光性稳定、检测方便、无种属特异性、对受体细胞无毒害，因此，可作为一种性能优异的报告基因，广泛应用于分子学生物方面。
有鉴于此，本发明提出增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，构建了含mig2－5－1启动子调控EGFP表达的载体PHD3－mig2－5－1－EGFP并转入玉米丝黑穗菌内，使得增强型绿色荧光蛋白在玉米丝黑穗菌株中能够获得大量且高效地荧光表达，且能稳定地遗传的表达。
本发明的第二目的在于提供一种通过上述方法制备的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株，该菌株能够正常生长且能正常荧光表达，对玉米植株有致病性，能够清晰的观察到玉米丝黑穗菌株在玉米植株内的菌丝状态，便于更加形象地理解病原菌与植物之间的互作关系。
本发明的第三目的在于提供上述增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株在抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面的应用，鉴定结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响，重复性高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，包括如下步骤：
(a)构建增强型绿色荧光蛋白标记的表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP；
(b)制备玉米丝黑穗菌原生质体；
(c)利用原生质体遗传转化法，将表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP转入玉米丝黑穗菌内；
(d)对标记增强型绿色荧光蛋白的玉米丝黑穗菌株进行检测和筛选；
(e)获得增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株；
其中：表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP是由启动子mig2－5－1与EGFP连接构建；
mig2－5－1启动子片段序列为：
AACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGTGGAGCGTTCCAACCCACACCTTGAGGTCGAGATCCAGTAGCCACATATTCCACGCATTTCTGGATTCGTTTCCAGTATGTGATCAAGTTGGTGGGCCTTGCAACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGCTCTTGACTCATCACAGCCGTTACTCTGCATTGCTTGCTCTCGAT。
进一步的，步骤(a)包括：
1)切除含有EGFP的质粒PHD3中的otef启动子，命名为PHD3—H；
2)将mig2－5－1启动子与含有EGFP的PHD3—H连接构建表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP。
进一步地，所述步骤(a)中用限制性内切酶NcoⅠ与XbaⅠ双酶切质粒PHD3去除otef启动子；mig2－5－1启动子在与PHD3—H连接前与用NcoⅠ与XbaⅠ双酶切处理。
进一步地，所述玉米丝黑穗菌为玉米丝黑穗菌株SR1和SR2。
进一步地，所述步骤(b)的具体方法为：将玉米丝黑穗菌加入到YEPS培养液内混匀，振荡过夜培养，离心收集沉淀，再用SCS溶液重悬沉淀，用Novozyme溶液重悬沉淀，最后用STC溶液冲洗沉淀物，重悬后即可得到原生质体；其中，Novozyme溶液的用量为25－30mg/ml。
进一步地，所述步骤(c)的具体方法为：将构建成功的载体质粒，采用ScaⅠ内切酶切线性化，产物纯化回收；将线性化载体质粒和肝素钠溶液吸打混匀后，加入原生质体并吸打混匀，最后加入STC/PEG混匀，得到混合液；将混合液均匀涂在平板上，放置于28℃培养箱中；选取菌落在PDA平板上均匀划线，放置于28℃培养箱中；其中，载体质粒和肝素钠溶液的重量之比为1：6。
进一步地，所述步骤(d)包括：
1)采用PCR方法，检测表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP是否进入玉米丝黑穗菌中；
2)采用倒置荧光显微镜观察增强型绿荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株是否具有荧光表达。
进一步地，进行PCR验证时，mig2－5－1－EGFP上下游引物序列为：
mig2－5－1－EGFP－F：ATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTG；
mig2－5－1－EGFP－R：TCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAG。
根据上述方法制备的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株。
上述增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株在抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，构建了含mig2－5－1启动子调控EGFP表达的载体PHD3－mig2－5－1－EGFP，利用原生质体遗传转化法将载体转入玉米丝黑穗菌内，并且采用PCR方法和荧光检验可以发现mig2－5－1启动子能诱导EGFP在菌株中获得大量且高效的荧光表达，并且能稳定地遗传表达。
2.本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株，能够正常生长和荧光表达，同时对玉米有致病性，并能够清晰的观察到玉米丝黑穗菌株在玉米植株内的菌丝状态，便于更加形象的理解病原菌与植物之间的互作关系。
3.本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株可用于在抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面，鉴定结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响，重复性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为菌株SR1－mig2－5－1－EGFP和SR2－mig2－5－1－EGFP的表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP的PCR产物的电泳图；
图2A为含有mig2－5启动子调控EGFP表达的转化菌株的荧光表达；
图2B为含有mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株的荧光表达；
图3A为含有mig2－5和mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株的RT－PCR产物的电泳图；
图3B为含有mig2－5和mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株的相对荧光表达量；
图4为玉米丝黑穗菌株侵染玉米植株的发病情况图；
图5A、图5B和图5C为含有mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株在玉米叶片内处于穿透寄主细胞壁的状态；
图6A和图6B为含有mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株在玉米叶片内处于与寄主细胞平行生长的状态；
图7A、图7B、图7C、图7D和图7E为感玉米丝黑穗病玉米品种内的菌丝状态。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，包括如下步骤：
(a)构建增强型绿色荧光蛋白标记的表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP；
(b)制备玉米丝黑穗菌原生质体；
(c)利用原生质体遗传转化法，将表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP转入玉米丝黑穗菌内；
(d)对标记增强型绿色荧光蛋白的玉米丝黑穗菌株进行检测和筛选；
(e)获得增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株；
其中：表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP是由启动子mig2－5－1与EGFP连接构建；
mig2－5－1启动子片段序列为：
AACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGTGGAGCGTTCCAACCCACACCTTGAGGTCGAGATCCAGTAGCCACATATTCCACGCATTTCTGGATTCGTTTCCAGTATGTGATCAAGTTGGTGGGCCTTGCAACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGCTCTTGACTCATCACAGCCGTTACTCTGCATTGCTTGCTCTCGAT。
其中，步骤(a)用于构建增强型绿色荧光蛋白标记的表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP。
质粒PHD3中含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和otef启动子，otef启动子能够调控增强型绿色荧光蛋白表达。
本发明中，采用mig2－5－1启动子替换质粒PHD3中的otef启动子，调控增强型绿色荧光蛋白的表达。
质粒PHD3中来自于德国马普所。
mig2－5－1启动子片段是由大连宝生物公司合成获得，是在mig2－5启动子片段的5′端加入52bp的碱基序列：
AACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCT。
mig2－5启动子是从玉米黑粉菌的mig2－5基因的启动子序列片段扩增得到。
mig2－5启动子片段大小为203bp；mig2－5启动子片段序列为：
AGTGGAGCGTTCCAACCCACACCTTGAGGTCGAGATCCAGTAGCCACATATTCCACGCATTTCTGGATTCGTTTCCAGTATGTGATCAAGTTGGTGGGCCTTGCAACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGCTCTTGACTCATCACAGCCGTTACTCTGCATTGCTTGCTCTCGAT。
所得mig2－5－1启动子片段大小为255bp；mig2－5－1启动子片段序列为：
AACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGTGGAGCGTTCCAACCCACACCTTGAGGTCGAGATCCAGTAGCCACATATTCCACGCATTTCTGGATTCGTTTCCAGTATGTGATCAAGTTGGTGGGCCTTGCAACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGCTCTTGACTCATCACAGCCGTTACTCTGCATTGCTTGCTCTCGAT。
本发明中，步骤(a)包括两步：
1)切除含有EGFP的质粒PHD3中的otef启动子，命名为PHD3—H；
2)将mig2－5－1启动子与含有EGFP的PHD3—H连接构建表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP。
本发明中，采用限制性内切酶NcoⅠ与XbaⅠ双酶切质粒PHD3去除otef启动子。同时，mig2－5－1启动子在与PHD3—H连接前用NcoⅠ与XbaⅠ双酶切处理。
步骤(b)用于制备玉米丝黑穗菌原生质体。
步骤(b)中，玉米丝黑穗菌为玉米丝黑穗菌SR1和SR2菌株。这是由于只有将菌株SR1和SR2混合后才能具有侵染玉米能力，同时SR1和SR2菌株便于人工培养、菌株原生质体的制备及实验过程中的菌株状态观察。
本发明中，玉米丝黑穗菌SR1和SR2菌株来自德国马普所。
玉米丝黑穗菌的原生质体制备方法为：将玉米丝黑穗菌加入到YEPS培养液内混匀，振荡过夜培养，离心收集沉淀，再用SCS溶液重悬沉淀，用Novozyme溶液重悬沉淀，最后用STC溶液冲洗沉淀物，重悬后即可得到原生质体。
本发明中，Novozyme溶液的用量为25－30mg/ml。
具体操作步骤如下：
1)将SR1和SR2菌株分别加入200mLYEPS培养液内混匀，振荡培养箱220rpm，28℃，振荡过夜培养。OD600nm为0.3－0.8时停止生长。
2)离心收集沉淀，冷冻离心机13000rpm，4℃，离心10min。
3)倒去上清液，用20ml的SCS溶液重悬沉淀，冷冻离心机13000rpm，4℃，离心6min。
4)倒去上清液，用4ml的浓度为28mg/ml的Novozyme溶液重悬沉淀物。(Novozyme溶液现用现配，用SCS溶液溶解Novozyme。)
5)室温条件下放置10min，等待细胞壁的降解，在8min左右时取出微量液体在显微镜下观察细胞壁降解情况。
6)接着继续加人SCS溶液到40mL，混匀后，使用冷冻离心机8000rpm，4℃，离心10min。
7)倒去上清液，再用20ml的SCS溶液冲洗沉淀物，重悬后，使用冷冻离心机8000rpm，4℃，离心8min。
8)重复步骤8。
9)倒去上清液，使用20ml的STC溶液冲洗沉淀物，重悬后，使用冷冻离心机8000rpm，4℃，离心8min。
10)最后倒去上清液，使用1ml的STC溶液重悬沉淀物，每个小离心管60μl溶液进行分装，放于－80℃冰箱中保存备用。
步骤(c)用原生质体遗传转化法将载体PHD3－mig2－5－1－EGFP转入玉米丝黑穗菌SR1和SR2内，制备含有mig2－5－1启动子调控的EGFP标记的玉米丝黑穗菌株SR1－mig2－5－1－EGFP、SR2－mig2－5－1－EGFP。
原生质体遗传转化法为：
将构建成功的载体质粒，采用ScaⅠ内切酶切线性化，产物纯化回收；将线性化载体质粒和肝素钠溶液吸打混匀后，加入原生质体并吸打混匀，最后加入STC/PEG混匀，得到混合液；将混合液均匀涂在平板上，放置于28℃培养箱中；选取菌落在PDA平板上均匀划线，放置于28℃培养箱中。
具体操作步骤如下：
1)将构建成功的载体质粒PHD3－mig2－5－1－EGFP采用ScaⅠ内切酶切线性化，产物纯化回收。
2)取5ug的线性化载体质粒和2μl的肝素钠溶液(15ug/μl)吸打混匀，冰上放置10min。
3)从－80℃的冰箱中取出上述制备好的原生质体，放置冰上融化后吸取50μl原生质体加入上述混合液中，吸打混匀，再次放置于冰上10min。
4)再次加入600μl的STC/PEG，混匀后放置于冰上15min。
5)用剪过的蓝色枪头将混合液转到Regeneration－Agar平板上涂匀，放置于28℃培养箱中。第一天正放，第二天将平板倒置，持续七天左右出现菌落。
6)用牙签挑取菌落在PDA平板上均匀划线，放置于28℃培养箱中。
7)大约1到2天，取出放于4℃冰箱保存。
本发明中，最佳的肝素钠浓度为30ug与5ug的线性DNA混匀后，加入到上述50ul的原生质体内混匀。
步骤(d)对标记增强型绿色荧光蛋白的玉米丝黑穗菌株进行检测和筛选，包括：
1)采用PCR方法，检测启动子mig2－5－1与增强型绿荧光蛋白EGFP是否进入玉米丝黑穗菌中；
首先上述构建的玉米丝黑穗菌绿荧光蛋白标记菌株进行培养，采用CTAB法提取玉米丝黑穗菌DNA，在表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP中选取EGFP基因序列与启动子mig2－5－1序列之间的片段，设计特异性引物，进行PCR验证。
本发明中，进行PCR验证时，mig2－5－1－EGFP基因片段为845bp，
mig2－5－1－EGFP上下游引物序列为：
mig2－5－1－EGFP－F：ATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTG；
mig2－5－1－EGFP－R：TCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAG。
本发明中，mig2－5－1－EGFP的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min；12℃保温。
本发明中，mig2－5－1－EGFP的PCR扩增的溶液体系见表1。
表1 mig2－5－1－EGFP的PCR扩增的溶液体系
进行PCR扩增后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测启动子mig2－5－1与增强型绿荧光蛋白EGFP是否进入玉米丝黑穗菌中。
2)采用倒置荧光显微镜观察增强型绿荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株是否具有荧光表达。
本发明中，采用倒置荧光显微镜的型号为日本东京Olympus BX41。
(e)获得增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株。
下面对本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法的效果进行分析。
为了说明本发明的效果，与之前研究中的mig2－5启动子调控EGFP的表达载体PHD3－mig2－5－EGFP进行比较，表达载体PHD3－mig2－5－EGFP的制备方法和上述方法类似，并进一步按照上述方法得到玉米丝黑穗菌株SR1－mig2－5－EGFP和SR2－mig2－5－EGFP。
之前实验研究中的mig2－5启动子片段大小为203bp；mig2－5启动子片段序列为：
AGTGGAGCGTTCCAACCCACACCTTGAGGTCGAGATCCAGTAGCCACATATTCCACGCATTTCTGGATTCGTTTCCAGTATGTGATCAAGTTGGTGGGCCTTGCAACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGCTCTTGACTCATCACAGCCGTTACTCTGCATTGCTTGCTCTCGAT。
效果例1
增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株的PCR验证
将本发明的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株进行培养，提取菌株的DNA，在绿荧光蛋白基因序列与组成型表达启动子序列之间选845bp左右的片段，进行PCR验证。
进行PCR扩增后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测启动子与增强型绿色荧光蛋白基因是否被整合到玉米丝黑穗菌的基因组中。
PCR验证结果见图1，其中M为maker，1和2泳道为玉米丝黑穗菌株SR1－mig2－5－1－EGFP，3和4泳道为玉米丝黑穗菌株SR2－mig2－5－1－EGFP。
在图1中能明显看到在845bp左右处有明显的基因片段，可见表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP已进入玉米丝黑穗菌中，即mig2－5－1启动子和EGFP基因已经被整合到玉米丝黑穗菌的基因组中。
效果例2
增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的荧光表达
将上述PCR验证阳性的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株，进行培养，利用倒置荧光显微镜观察菌株的孢子。
观察结果见图2A和图2B，图2A显示的是含有mig2－5启动子调控EGFP表达的玉米丝黑穗菌株的孢子；图2B显示的是含有mig2－5－1启动子调控EGFP表达的玉米丝黑穗菌株的孢子。
由图2A和图2B可知，图2A和图2B中都能观察到荧光的孢子，但图2B中荧光的孢子的荧光亮度与强度远高于图2A中荧光孢子的荧光亮度与强度，可见mig2－5－1启动子调控增强型绿色荧光蛋白表达的效果远高于mig2－5启动子调控增强型绿色荧光蛋白表达的效果。
效果例3
增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的稳定性
将转化成功的SR1－mig2－5－1－EGFP和SR2－mig2－5－1－EGFP菌株在不含cbx(委秀灵抗生素)的YPD培养基上继代5次，再转接至含有cbx的培养基上。
结果发现转化菌株培养5代后仍能正常生长且荧光表达正常，说明插入到玉米丝黑穗菌基因组中的mig2－5－1启动子调控的增强型绿色荧光蛋白能够稳定地遗传和表达。
效果例4
增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的增强型绿色荧光蛋白表达量
分别以含有mig2－5启动子和mig2－5－1启动子转化成功的菌株的cDNA为模板，经RT－PCR扩增后测定EGFP表达量，结果见图3A和图3B。
图3A含有mig2－5和mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株的RT－PCR产物的电泳图，其中a)含有mig2－5启动子的玉米丝黑穗菌株的基因片段PCR产物电泳图，b)为含有mig2－5－1启动子的玉米丝黑穗菌株的基因片段PCR产物电泳图，可以看出启动子mig2－5和mig2－5－1均可调控EGFP表达转化菌株获得荧光表达。
图3B为含有mig2－5和mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株的相对荧光表达量，其中，a)含有mig2－5启动子的玉米丝黑穗菌株，b)含有mig2－5－1启动子的玉米丝黑穗菌株，可以看出含有mig2－5－1启动子调控EGFP表达转化菌株的相对荧光表达量为含有mig2－5启动子调控EGFP表达转化菌株的相对荧光表达量的2.1倍，可见mig2－5－1启动子调控EGFP表达的效果明显高于mig2－5启动子。
效果例5
增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的致病性检测
选用玉米品种吉单209的种子进行处理及育苗，当玉米植株2片叶时，开始进行用含mig2－5和mig2－5－1启动子的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌侵染玉米实验，采用玉米颈基部注射方式侵染，观察增强型绿色荧光蛋白标记菌株的致病性。
通过肉眼观察，在玉米叶片上形成明显的退绿病斑，见图4。并取发病部位，将发病部位的叶片背面用灭菌后的手术刀刮去叶肉后，进行荧光观察。
图5A、图5B、图5C、图6A和图6B为含mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株在玉米植株内的荧光表达图，可以清楚地发现在玉米植株内可以看见穿梭在细胞间的玉米丝黑穗菌菌丝，说明含mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株能够在玉米植株内获得大量的荧光表达。
同时在观察过程中发现：相较于含mig2－5启动子调控EGFP表达的转化菌株，含mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株在玉米植株内更加容易和清楚地观察到获得大量荧光表达的玉米丝黑穗菌菌丝，说明含mig2－5－1启动子调控EGFP表达的转化菌株在玉米植株内的荧光表达效果远高于含mig2－5启动子调控EGFP表达的转化菌株在玉米植株内的荧光表达效果。
通过效果例2、4和5，可以看出与mig2－5启动子诱导EGFP荧光表达相比，mig2－5－1启动子能够诱导EGFP更加大量且高效地荧光表达，分析其原因，主要是由于mig2－5－1启动子是在mig2－5启动子序列的5′端加入了52bp的碱基序列，该碱基序列含有7个CCA/TGG基序。研究发现，位于mig2－5启动子的－120至－240区内的CCA/TGG基序对启动子活性起到关键性的作用，因此选取了位于mig2－5启动子的－120至－240区内的含有7个CCA/TGG基序的52bp碱基序列加入到mig2－5启动子序列的5′端，并将此获得的碱基序列命名为mig2－5－1启动子。发明人出乎意料地发现新加入的52bp的碱基序列增强了启动子的活性，诱导EGFP在玉米丝黑穗菌中的荧光效果得到了明显提升。
效果例6
玉米植株内mig2－5－1启动子活性分析
将转化成功的SR1－mig2－5－1－EGFP、SR2－mig2－5－1－EGFP菌株接种玉米植株，取发病叶片通过倒置荧光显微镜进行荧光观察，观察结果见图5A、图5B、图5C、图6A和图6B。
从图5A、图5B、图5C、图6A和图6B中可以看出，由mig2－5－1启动子调控EGFP在玉米丝黑穗菌中获得了大量表达，同时可以清晰地观察到玉米丝黑穗菌在玉米植株内存在两种形式，一种形式是菌丝形成附着胞穿透寄主细胞壁吸收营养物质，保证菌株的正常生长，如图5A、图5B和图5C所示；另外一种形式是与寄主细胞平行生长，菌丝的扩展方向趋向于寄主的生长点，如图6A和图6B所示。可见mig2－5－1启动子调控EGFP的玉米丝黑穗菌能够便于更加形象地理解病原菌与植物之间的互作关系。
效果例7
用增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株进行玉米抗性鉴定筛选
1.试验品种：抗玉米丝黑穗病玉米品种有银河32号、吉单631、宏兴1号、省原78、先玉023；感玉米丝黑穗病玉米品种有吉单50、禾育35、利民33、农华206、吉单209。
2.试验方法：每个玉米品种均按常规方法进行玉米品种的种子及育苗，当玉米植株2片叶时，用增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株SR1－mig2－5－1－EGFP和SR2－mig2－5－1－EGFP混合侵染玉米，每个玉米品种6盆，每盆5棵玉米苗，其中5盆为用玉米丝黑穗菌株注射侵染玉米苗，一盆为用野生型菌株侵染玉米苗作为对照。注射接种后第二天，选取感病品种的玉米叶片的褪绿病斑部位进行荧光观察，抗病品种选取注射部位的叶片进行荧光观察。
3.试验结果：
通过观察可以发现用增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株侵染玉米苗和用野生型菌株侵染玉米苗的症状一致，即感病品种有退绿病斑，抗病品种无退绿病斑。说明用增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株和野生型菌株侵染的侵染能力一致。
通过倒置荧光显微镜观察，可见感病玉米品种叶片上能观察到清晰的玉米丝黑穗菌菌丝状态；抗病玉米品种叶片上观察不到玉米丝黑穗菌菌丝状态。感病玉米品种在玉米植株内的菌丝状态见图7A、图7B、图7C、图7D和图7E。
可见，用增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株筛选玉米抗性的结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)构建增强型绿色荧光蛋白标记的表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP；
(b)制备玉米丝黑穗菌原生质体；
(c)利用原生质体遗传转化法，将表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP转入玉米丝黑穗菌内；
(d)对标记增强型绿色荧光蛋白的玉米丝黑穗菌株进行检测和筛选；
(e)获得增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株；
其中：表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP是由启动子mig2－5－1与EGFP连接构建；
mig2－5－1启动子片段序列为：
AACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGTGGAGCGTTCCAACCCACACCTTGAGGTCGAGATCCAGTAGCCACATATTCCACGCATTTCTGGATTCGTTTCCAGTATGTGATCAAGTTGGTGGGCCTTGCAACCATCTTTTCCCCACCCATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTGTCCCACCTAGCTCTTGACTCATCACAGCCGTTACTCTGCATTGCTTGCTCTCGAT。
2.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(a)包括：
1)切除含有EGFP的质粒PHD3中的otef启动子，命名为PHD3—H；
2)将mig2－5－1启动子与含有EGFP的PHD3—H连接构建表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP。
3.根据权利要求2所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(a)中用限制性内切酶NcoⅠ与XbaⅠ双酶切质粒PHD3去除otef启动子；mig2－5－1启动子在与PHD3—H连接前用NcoⅠ与XbaⅠ双酶切处理。
4.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述玉米丝黑穗菌为玉米丝黑穗菌株SR1和SR2。
5.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(b)的具体方法为：将玉米丝黑穗菌加入到YEPS培养液内混匀，振荡过夜培养，离心收集沉淀，再用SCS溶液重悬沉淀，用Novozyme溶液重悬沉淀，最后用STC溶液冲洗沉淀物，重悬后即可得到原生质体；其中，Novozyme溶液的用量为25－30mg/ml。
6.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(c)的具体方法为：将构建成功的载体质粒，采用ScaⅠ内切酶切线性化，产物纯化回收；将线性化载体质粒和肝素钠溶液吸打混匀后，加入原生质体并吸打混匀，最后加入STC/PEG混匀，得到混合液；将混合液均匀涂在平板上，放置于28℃培养箱中；选取菌落在PDA平板上均匀划线，放置于28℃培养箱中；其中，载体质粒和肝素钠溶液的重量之比为1：6。
7.根据权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，所述步骤(d)包括：
1)采用PCR方法，检测表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP是否进入玉米丝黑穗菌中；
2)采用倒置荧光显微镜观察增强型绿荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株是否具有荧光表达。
8.根据权利要求7所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，其特征在于，进行PCR验证时，mig2－5－1－EGFP上下游引物序列为：
mig2－5－1－EGFP－F：ATTGGACGCCAACCGTGGTGACCTG；
mig2－5－1－EGFP－R：TCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAG。
9.根据权利要求1－8任一项中所述的方法制备的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株。
10.权利要求9所述的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株在抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面的应用。
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