CN104131026A - 利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法 - Google Patents
利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：1)遗传转化载体的构建；2)球孢白僵菌原生质体的制备及转化；3)PEG介导的遗传转化体系建立；4)平均转化效率分析；5)PCR检测；6)荧光观察。本发明利用抗杀菌剂萎锈灵基因为筛选标记，成功进行球孢白僵菌遗传转化，转化效率达到26个转化子/μgDNA，拓宽了球孢白僵菌遗传转化筛选标记基因范围，解决bar基因存在的安全性问题。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法。
背景技术
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种致病性与适应性很强，且寄主范围广的昆虫病原真菌，已被作为昆虫真菌制剂广泛用于玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育种过程中，启动子是外源或内源基因导入效率的重要因素之一。
目前，球孢白僵菌的遗传转化筛选标记主要为抗草甘膦基因bar，但对于bar基因的环境安全性问题一直存在争论，因此，开发一种新筛选标记能够为球孢白僵菌遗传转化提供更多的选择，为球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法。其具体技术方案为：
一种利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：
1)遗传转化载体的构建：利用NotI和NodI限制性内切酶对otef:CAR载体和PF载体同时进行双酶切并连接，将抗萎锈灵基因carboxin构建到pgpdA为启动子，含有绿色荧光蛋白GFP标记基因，TtrpC为终止子的遗传转化载体上，构建PgpdA：car:GFP转化载体；
2)球孢白僵菌原生质体的制备及转化
原生质体的获得
(1)将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；
(2)渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mL EP管中；
(3)在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μL β-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；
(4)28℃下100r/min培养20-25min；
(5)将小管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；
(6)用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；
(7)28℃下100r/min培养1h，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；
萎锈灵抗性浓度的筛选
将制备的原生质体分别涂布于含有不同浓度梯度萎锈灵的查氏培养基上，萎锈灵浓度分别为0.5、1、2、3、4mg/ml培养基，并设置不含萎锈灵的培养基为对照，26℃培养48h后，观察菌落生长情况；
3)PEG介导的遗传转化体系建立
(1)将得到的原生质体悬液吸取400μL到三个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照和PgpdA：car:GFP质粒；
(2)对应管中分别加入10μLPgpdA：car:GFP质粒，质粒浓度60.5ug/μL，冰浴20min；
(3)每个管中各加入100μL PEG4000溶液，混匀，冰浴20min；
(4)各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；
(5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；
(6)吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；
(7)将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100μL均匀涂在带有萎锈灵抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察；
4)平均转化效率分析
(1)对PgpdA：car:GFP载体进行球孢白僵菌原生质体遗传转化，每个载体转化5个平板；
(2)转化后对每个转化平板进行转化子数量的统计，取平均值，进行统计分析；
转化子的PCR检测及荧光观察
(1)利用灭菌环将查氏培养基上的转化子小心挑出，在提前准备的PDA平板上画多个“Z”字，分别标记为转PgpdA：car:GFP和CK；
(2)将划好的平板置于26℃恒温培养箱恒温培养3d；
(3)此时得到转化子第一代，继续挑出孢子划线在新的PDA培养基上，培养3d得到第二代孢子；
(4)同上述过程，得到第三代转化子孢子，在超净工作台中挑出，置于SDY培养基中摇2-3d；
5)PCR检测：利用氯化苄法提取球孢白僵菌转化子基因组DNA，然后利用基因组做模版，利用GFP基因特异性引物，进行PCR及电泳检测；
6)荧光观察：菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，将实验控制在相同的培养条件及时间，在培养第48h置于倒置荧光显微镜下观察。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明筛选了球孢白僵菌对萎锈灵的最佳抗性浓度，并进行了萎锈灵抗性的遗传转化，获得含GFP的阳性转化子。利用抗杀菌剂萎锈灵基因为筛选标记，成功进行球孢白僵菌遗传转化，转化效率达到26个转化子/μgDNA，拓宽了球孢白僵菌遗传转化筛选标记基因范围，解决bar基因存在的安全性问题。
附图说明
图1是PgpdA：car:GFP载体图谱；
图2是球孢白僵菌原生质体显微镜观察效果图；
图3是；球孢白僵菌抗萎锈灵最佳浓度筛选；
图4是转PgpdA：car:GFP载体的球孢白僵菌转化子图片，图4a是阳性转化子，图4b是对照；
图5是转化子PCR检测；
泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-7转PgpdA：car:GFP基因样品检测；
图6是转PgpdA：car:GFP质粒转化子荧光显微检测结果图，其中，图6(a)为荧光下；图6(b)为白光下；图6(c)为合成光下。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1实验方法：
1.1遗传转化载体的构建：将抗萎锈灵基因carboxin构建到pgpdA为启动子，含有绿色荧光蛋白GFP标记基因，TtrpC为终止子的遗传转化载体上，构建PgpdA：car:GFP转化载体。
1.2球孢白僵菌原生质体的制备及转化
原生质体的获得
(1)将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；
(2)渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mLEP管中；
(3)在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μLβ-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；
(4)28℃下100r/min培养20-25min；
(5)将小管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；
(6)用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；
(7)28℃下100r/min培养1h左右，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体。
萎锈灵抗性浓度的筛选
将制备的原生质体分别涂布于含有不同浓度梯度萎锈灵的查氏培养基上，萎锈灵浓度分别为0.5、1、2、3、4mg/ml培养基，并设置不含萎锈灵的培养基为对照，26℃培养48h后，观察菌落生长情况。
PEG介导的遗传转化体系建立
(1)将得到的原生质体悬液吸取400μL到三个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照和PgpdA：car:GFP质粒；
(2)对应管中分别加入10μLPgpdA：car:GFP质粒(质粒浓度60.5ug/μL)冰浴20min；
(3)每个管中各加入100μL PEG4000溶液，混匀，冰浴20min；
(4)各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；
(5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；
(6)吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；
(7)将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打。吸出100μL均匀涂在带有萎锈灵抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察。
平均转化效率分析
(1)对PgpdA：car:GFP载体进行球孢白僵菌原生质体遗传转化，每个载体转化5个平板；
(2)转化后对每个转化平板进行转化子数量的统计，取平均值，进行统计分析；
1.3转化子的PCR检测及荧光观察
(1)利用灭菌环将查氏培养基上的转化子小心挑出，在提前准备的PDA平板上画多个“Z”字，分别标记为转PgpdA：car:GFP和CK。
(2)将划好的平板置于26℃恒温培养箱恒温培养3d。
(3)此时得到转化子第一代，继续挑出孢子划线在新的PDA培养基上，培养3d得到第二代孢子；
(4)同上述过程，得到第三代转化子孢子，在超净工作台中挑出，置于SDY培养基中摇2-3d。
PCR检测：利用氯化苄法提取球孢白僵菌转化子基因组DNA，然后利用基因组做模版，利用GFP基因特异性引物，进行PCR及电泳检测。
荧光观察：菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，将实验控制在相同的培养条件及时间，在培养第48h置于倒置荧光显微镜下观察。
Claims (1)
1.一种利用抗萎锈灵基因carboxin为筛选标记的球孢白僵菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)遗传转化载体的构建：利用NotI和NodI限制性内切酶对otef:CAR载体和PF载体同时进行双酶切并连接，将抗萎锈灵基因carboxin构建到pgpdA为启动子，含有绿色荧光蛋白GFP标记基因，TtrpC为终止子的遗传转化载体上，构建PgpdA：car:GFP转化载体；
2)球孢白僵菌原生质体的制备及转化
原生质体的获得
(1)将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；
(2)渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mL EP管中；
(3)在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μL β-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；
(4)28℃下100r/min培养20-25min；
(5)将小管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；
(6)用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；
(7)28℃下100r/min培养1h，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；
萎锈灵抗性浓度的筛选
将制备的原生质体分别涂布于含有不同浓度梯度萎锈灵的查氏培养基上，萎锈灵浓度分别为0.5、1、2、3、4mg/ml培养基，并设置不含萎锈灵的培养基为对照，26℃培养48h后，观察菌落生长情况；
3)PEG介导的遗传转化体系建立
(1)将得到的原生质体悬液吸取400μL到三个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照和PgpdA：car:GFP质粒；
(2)对应管中分别加入10μLPgpdA：car:GFP质粒，质粒浓度60.5ug/μL，冰浴20min；
(3)每个管中各加入100μL PEG4000溶液，混匀，冰浴20min；
(4)各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；
(5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；
(6)吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；
(7)将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100μL均匀涂在带有萎锈灵抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察；
4)平均转化效率分析
(1)对PgpdA：car:GFP载体进行球孢白僵菌原生质体遗传转化，每个载体转化5个平板；
(2)转化后对每个转化平板进行转化子数量的统计，取平均值，进行统计分析；
转化子的PCR检测及荧光观察
(1)利用灭菌环将查氏培养基上的转化子小心挑出，在提前准备的PDA平板上画多个“Z”字，分别标记为转PgpdA：car:GFP和CK；
(2)将划好的平板置于26℃恒温培养箱恒温培养3d；
(3)此时得到转化子第一代，继续挑出孢子划线在新的PDA培养基上，培养3d得到第二代孢子；
(4)同上述过程，得到第三代转化子孢子，在超净工作台中挑出，置于SDY培养基中摇2-3d；
5)PCR检测：利用氯化苄法提取球孢白僵菌转化子基因组DNA，然后利用基因组做模版，利用GFP基因特异性引物，进行PCR及电泳检测；
6)荧光观察：菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，将实验控制在相同的培养条件及时间，在培养第48h置于倒置荧光显微镜下观察。
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