CN105288608A - 猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，首先筛选出PCV2增殖敏感的细胞，扩大培养后消化细胞，接种到一级生物反应器，MEM细胞生长液培养后排出生长液，补加MEM细胞维持液，培养后排出维持液，细胞消化、分散后转入二级生物反应器中培养，收获细胞生长液和细胞维持液，细胞消化、分散后再转入三级生物反应器中培养，收获细胞生长液和细胞维持液，继续在三级生物反应器中用细胞生长液和细胞维持液交替培养，收获细胞生长液和细胞维持液至12代。PCV2增殖敏感的细胞适宜微载体连续多代次收获抗原培养；生物反应器生产效率高、成本低；本发明的维持液抗原效价较传统转瓶的抗原效价提高10-20倍。
Description
技术领域
本发明的实施方式涉及兽用生物制品技术领域，更具体地，本发明的实施方式涉及一种适合猪圆环病毒2型悬浮培养的敏感细胞株筛选，使用该敏感细胞进行猪圆环病毒连续收毒悬浮培养生产。
背景技术
目前，关于猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产基本都用猪源PK-15细胞采用传统转瓶工艺实现。但转瓶培养过程中，细胞增殖缓慢且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如PH、溶氧、糖耗等难以监控和及时补给，无法提供最佳培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因转瓶细胞培养环境不可控性，导致产品质量稳定性差，批间差较大。而PCV2生物学特性特殊，在细胞中增殖滴度低且不产生细胞病变，这与当前动物疫苗大规模生产不相适应。此外，如要扩大该疫苗生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果导致车间生产所需设备、人员等需求更大。另外，提高病毒效价，保证疫苗良好的临床效果是解决猪圆环疫苗2型灭活疫苗产业化的当务之急。
传统工艺难以满足猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产需求，已有的猪圆环病毒2性悬浮培养生产工艺，病毒效价虽有所提高，但收毒代次较少，生产成本较高，与传统工艺比较优势并不显著。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供一种猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，涉及猪圆环病毒2型敏感细胞株的筛选，实现猪圆环病毒连续收毒悬浮培养。
为解决上述的技术问题，本发明的一种实施方式采用以下技术方案：
一种猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，它包括以下步骤：
(1)准备PK15克隆细胞
用PK-15细胞克隆得到PK15克隆细胞备用，该PK15克隆细胞的分类命名为猪肾上皮细胞PK15，该细胞在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO:11198；
(2)PCV2增殖敏感细胞筛选
消化不同的PK-15克隆细胞和母细胞并同步接种相同剂量的PCV2病毒，待细胞长满至少50％时更换细胞维持液为MEM细胞维持液，37℃培养2d，用间接免疫荧光试验检测病毒感染的细胞量，筛选出PCV2增殖敏感的细胞，然后置37℃恒温箱连传3代进行种细胞扩繁，细胞长满后加入适量细胞冻存液，于液氮冻存；
(3)PCV2增殖敏感细胞增殖
将冻存的PCV2增殖敏感细胞在T25细胞瓶中进行复苏，待细胞长满单层后，以胰酶-EDTA消化，以含8％新生牛血清的MEM细胞生长液传代培养，按1:4至1:6传代比例逐级传代放大至15L转瓶内培养，按1:4至1:5传代比例在15L转瓶中扩传；
(4)PCV2悬浮培养及带毒传代
消化所述15L转瓶中生长良好的PCV2增殖敏感细胞，按终浓度6-8×105cells/ml的接种密度接种预处理好的含微载体的16L一级生物反应器，培养体积不小于8L，以含5-10％新生牛血清的MEM细胞生长液培养细胞，在接种细胞时按0.2％终体积同步接种PCV2种毒，细胞与种毒接种后，一级生物反应器中培养的带毒细胞标记为F1代；待细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，排出F1代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，排出F1代细胞维持液；以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的含微载体的二级生物反应器培养；
二级生物反应器的体积至少为一级生物反应器的2倍，培养体积不小于二级生物反应器体积的1/2，二级生物反应器中的带毒细胞标记为F2代；待二级生物反应器中细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获F2代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F2代细胞维持液；以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的含微载体的三级生物反应器培养；
三级生物反应器为的体积至少为二级生物反应器的2倍，培养体积不小于三级生物反应器体积的1/2，三级生物反应器中的带毒细胞标记为F3代；待三级生物反应器中细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获F3代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F3代细胞维持液；
(5)带毒细胞悬浮培养与连续收毒
(5.1)带毒细胞生长液培养
三级生物反应器中培养的带毒细胞，收获F3代细胞维持液后，加入预热至室温的含5-10％新生牛血清的MEM细胞生长液，带毒细胞标记为F4代；生长液培养24h后，沉淀微载体与细胞，收获F4代细胞生长液；
(5.2)带毒细胞维持液培养
三级生物反应器中的带毒细胞，收获F4代细胞生长液后，加入预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F4代细胞维持液；
(5.3)带毒细胞连续收毒
收获F4代细胞维持液后，重复步骤(5.1)的操作，以生长液培养带毒细胞24h后，收获F5代细胞生长液；重复步骤(5.2)的操作，以维持液培养带毒细胞48h后，收获F5代细胞维持液；重复上述步骤，连续收毒至F12代以上，每个代次取样观察细胞状态；
(6)PCV2抗原液检测
对收获不同代次的生长液与维持液分别进行无菌检验与PCV2病毒含量测定。
优选的方案是：所述一级生物反应器的培养体积为10L；二级生物反应器的体积为85L，培养体积为50L；三级生物反应器的体积为500L，培养体积为300L。
进一步的技术方案是：所述步骤(1)的具体操作方法如下：将复苏的PK-15细胞培养成单层后用胰酶-EDTA消化，再加入适量含10％小牛血清的MEM细胞生长液吹打使细胞分散成单个，然后进行10倍梯度稀释至10-20cells/mL，将稀释好的细胞按照200μL/孔铺于96孔细胞培养板，于37℃、5％CO2条件下培养9～11d，选取单个克隆进行扩大培养。
更进一步的技术方案是：所述胰酶-EDTA中胰酶的质量分数为0.25％。
更进一步的技术方案是：所述一级生物反应器、二级生物反应器和三级生物反应器中的微载体为cytodex-1微载体，使用浓度为3～5g/L。
更进一步的技术方案是：所述MEM细胞维持液为含2％新生牛血清和1％D-氨基葡萄糖的细胞维持液。
更进一步的技术方案是：所述预处理是指将一级生物反应器、二级生物反应器或三级生物反应器连接好各种管道、补料和辅助罐，接上T、pH、DO电极，进行电极的校正，培养参数的设置，所述预处理还包括微载体的浸泡和灭菌；三种生物反应器的培养参数都为PH值7.0-7.4，DO为20-30，温度为37℃，搅拌转速为18-25rpm。
更进一步的技术方案是：所述无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行；所述PCV2病毒含量测定用间接免疫荧光试验测定各样品中PCV2的TCID50。
上述MEM细胞生长液、MEM细胞维持液中新生牛血清或者小牛血清的含量和D-氨基葡萄糖的含量均是指体积分数。
与现有技术相比，本发明的有益效果之一是：(1)本发明从PK-15母细胞中克隆筛选出一株PCV2高敏感细胞，该细胞增值速度快，贴壁性强，可提高生产效率，适宜微载体连续多代次收获抗原培养；(2)本发明应用生物反应器生产PCV2抗原，每代次可收获抗原液300L左右，较传统转瓶工艺，自动化程度高，人工成本低，生产工艺简单稳定，产品质量均一稳定，并以更替换液方式可连续多代次收获抗原，极大降低疫苗生产成本；(3)本发明生产出的维持液抗原效价较传统转瓶生产出的抗原效价提高10-50倍，稳定在107.5TCID50/ml以上，且收获的生长液也能稳定107.0TCID50/ml以上，生长液中病毒效价较转瓶工艺高5-10倍，经纯化处理后亦可配苗使用，极大的降低生产成本；且整个生产过程均在封闭的管道和罐体内经行，保证生产过程的生物安全。
附图说明
图1为本发明连续收毒悬浮培养的工艺流程图。
保藏细胞说明
本发明使用的PK15克隆细胞的分类命名为猪肾上皮细胞PK15，该细胞在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO:11198；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年9月23日。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明下述实施例的工艺流程如图1所示。猪圆环病毒病毒2型和PK-15细胞均为市场供应产品。下述实施例中使用的胰酶-EDTA中胰酶的质量分数为0.25％，下述实施例中使用的MEM细胞维持液(V/V)为含2％新生牛血清和1％D-氨基葡萄糖的细胞维持液。
实施例1
步骤1：PK15细胞克隆：将PK-15细胞复苏后于细胞瓶培养形成单层，胰酶-EDTA消化后，加入适量含10％小牛血清的MEM细胞生长液吹打，分散细胞成单个，然后进行10倍梯度稀释至约15cells/mL，将稀释好的细胞铺于96孔细胞培养板，200μL/孔，于37℃、5％CO2培养10d左右，观察孔内细胞克隆数。选取单个克隆进行扩大培养后，对克隆细胞进行进一步鉴定。多次克隆并重复下述步骤2-6，筛选出最适合用于制备PCV2增殖敏感细胞的PK15克隆细胞，即猪肾上皮细胞PK15CGMCC11198。
步骤2：PCV2增殖敏感细胞筛选：消化不同PK-15克隆细胞和母细胞并同步接种相同剂量的PCV2病毒，待细胞长至50％左右更换维持液(更换为上述MEM细胞维持液：含2％新生牛血清和1％D-氨基葡萄糖)，37℃培养2d，用间接免疫荧光试验(IFA)检测病毒感染的细胞量，筛选出PCV2增殖敏感的克隆细胞株。将筛选出来的敏感细胞置37℃温箱连传3代进行种细胞扩繁，加入适量细胞冻存液，于液氮冻存。
PCV2敏感细胞克隆结果：筛选敏感细胞1株，经克隆后的敏感细胞接毒后收获抗原效价较原始母细胞接毒后收获抗原效价高出4倍，冻存克隆细胞，建立细胞种子库。
步骤3：PCV2增殖敏感细胞增殖：将冻存的PCV2增殖敏感细胞(PK15-15#)在T25细胞瓶中进行细胞复苏，待细胞长满单层后，以胰酶-EDTA消化，以含8％新生牛血清的MEM细胞生长液传代培养，按1:4至1:6传代比例逐级传代放大至15L转瓶内培养，按1:4至1:5传代比例在15L转瓶中扩传。
步骤4：PCV2悬浮培养及带毒传代：
一级生物反应器培养：消化15L转瓶中生长良好的PK15-15#细胞，按终浓度约7×105cells/ml的接种密度接种预处理好的含微载体的16L生物反应器，cytodex-1微载体使用浓度为5g/L，16L生物反应器培养体积为10L，PK15-15#细胞生长液为含8％新生牛血清的MEM细胞培养液。PCV2以同步接毒的方式进行接毒，在接种细胞时接种0.2％(V/V)PCV2种毒，细胞与种毒接种后，培养参数为pH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，得到带毒细胞标记为F1代。待细胞长至80％左右时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，排出细胞生长液(F1代生长液)，补加预热至室温的上述MEM细胞维持液，更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，排出细胞维持液(F1代维持液)。以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的二级生物反应器培养。
二级生物反应器培养:二级生物反应器为85L生物反应器，cytodex-1微载体使用浓度为3g/L，培养体积为50L。二级生物反应器培养参数为PH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，得到带毒细胞标记为F2代。待二级生物反应器中细胞长至80％左右时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获细胞生长液(F2代生长液)，补加预热至室温的上述MEM细胞维持液，更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，收获细胞维持液(F2代维持液)。以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的三级生物反应器培养。
三级生物反应器培养:三级生物反应器为500L生物反应器，cytodex-1微载体使用浓度为3g/L，培养体积为300L。三级生物反应器培养参数为PH值7.0-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，得到带毒细胞标记为F3代。待三级生物反应器中细胞长至80％左右时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获细胞生长液(F3代生长液)，补加预热至室温的上述MEM细胞维持液，更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，收获细胞维持液(F3代维持液)。
步骤5.1：带毒细胞生长液培养:三级生物反应器中培养的PK15-15#带毒细胞，收获F3代维持液后，加入预热至室温的含8％新生牛血清的MEM细胞生长液，培养参数设置为PH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，带毒细胞标记为F4代。生长液培养24h后，沉淀微载体与细胞，收获细胞培养上清(F4代生长液)。
步骤5.2：带毒细胞维持液培养:三级生物反应器中的PK15-15#带毒细胞，收获F4代生长液后，加入预热至室温的上述MEM细胞维持液，培养参数设置为PH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm。更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，收获细胞维持液(F4代维持液)。
步骤5.3：带毒细胞连续收毒：收获F4代维持液后，重复5.1操作，以生长液培养带毒细胞24h后，收获F5代生长液；重复5.2操作，以维持液培养带毒细胞48h后，收获F5代维持液。重复上述步骤，连续收毒至F12代以上，每个代次取样观察细胞状态。
步骤6：PCV2抗原液检测:对收获不同代次的生长液与维持液(F1代至F12代)进行无菌检验与PCV2病毒含量测定。无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。PCV2病毒含量测定用间接免疫荧光试验(IFA)测定各样品中PCV2的TCID50。具体方法如下：
1)制备PK-15细胞单层的96孔细胞培养板；
2)将抗原液以含2％新生牛血清的MEM细胞维持液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度，分别接种PK-15细胞单层的96孔细胞培养板，每孔接种100μl，每个稀释度接种6孔，同时设立正常细胞与PCV2阳性对照，吸附1h后每孔补加100μl含2％新生牛血清的MEM细胞维持液，置37℃含5％CO2的培养箱中继续培养48h；
3)弃去细胞培养液，用PBS(PH值7.0)洗涤细胞3次，加入冷丙酮，每孔150μl，置2-8℃固定30分钟；
4)弃去丙酮，置室温下干燥，用PBS洗涤3次，加入1:50倍稀释的PCV2抗体，每孔50μl，置37℃作用1小时；
5)弃去孔内液体，用PBS洗涤3次，加入1:100倍稀释的FITC标记的二抗，每孔50μl，置37℃作用1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤3次；
6)用倒置荧光显微镜进行观察。正常细胞对照孔应无荧光物质着染，PCV2阳性对照孔有荧光物质着染；
7)根据观察结果，按Reed-Muench法计算抗原液TCID50。
7.PCV2连续收毒悬浮培养结果
对悬浮培养收获抗原进行无菌检验、病毒含量测定。抗原液无菌生长，每代次收获抗原量及效价测定结果如下表1。
表1PCV2悬浮培养结果
实施例2
步骤1：PK-15克隆细胞备用：准备猪肾上皮细胞PK15CGMCC11198；。
步骤2：PCV2增殖敏感细胞筛选：消化不同PK-15克隆细胞和母细胞并同步接种相同剂量的PCV2病毒，待细胞长至50％左右更换维持液(更换为上述MEM细胞维持液)，37℃培养2d，用间接免疫荧光试验(IFA)检测病毒感染的细胞量，筛选出PCV2增殖敏感的克隆细胞株。将筛选出来的敏感细胞置37℃温箱连传3代进行种细胞扩繁，加入适量细胞冻存液，于液氮冻存。
PCV2敏感细胞克隆结果：筛选敏感细胞1株，经克隆后的敏感细胞接毒后收获抗原效价较原始母细胞接毒后收获抗原效价高出5倍，冻存克隆细胞，建立细胞种子库。
步骤3：PCV2增殖敏感细胞增殖：将冻存的PCV2增殖敏感细胞(PK15-15#)在T25细胞瓶中进行细胞复苏，待细胞长满单层后，以胰酶-EDTA消化，以含8％新生牛血清的MEM生长液传代培养，按1:4至1:6传代比例逐级传代放大至15L转瓶内培养，按1:4至1:5传代比例在15L转瓶中扩传。
步骤4：PCV2悬浮培养及带毒传代：
一级生物反应器培养：消化15L转瓶中生长良好的PK15-15#细胞，按终浓度8×105cells/ml的接种密度接种预处理好的含微载体的16L生物反应器，cytodex-1微载体使用浓度为5g/L，16L生物反应器培养体积为10L，PK15-15#细胞生长液为含8％新生牛血清的MEM细胞生长液(即MEM细胞培养液)。PCV2以同步接毒的方式进行接毒，在接种细胞时接种0.2％(V/V)PCV2种毒，细胞与种毒接种后，培养参数为pH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，得到带毒细胞标记为F1代。待细胞长至80％左右时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，排出细胞生长液(F1代生长液)，补加预热至室温的上述MEM细胞维持液，更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，排出细胞维持液(F1代维持液)。以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的二级生物反应器培养。
二级生物反应器培养:二级生物反应器为85L生物反应器，cytodex-1微载体使用浓度为3g/L，培养体积为50L。二级生物反应器培养参数为PH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，得到带毒细胞标记为F2代。待二级生物反应器中细胞长至80％左右时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获细胞生长液(F2代生长液)，补加预热至室温的上述MEM细胞维持液，更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，收获细胞维持液(F2代维持液)。以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的三级生物反应器培养。
三级生物反应器培养:三级生物反应器为500L生物反应器，cytodex-1微载体使用浓度为3g/L，培养体积为300L。三级生物反应器培养参数为PH值7.0-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，得到带毒细胞标记为F3代。待三级生物反应器中细胞长至80％左右时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获细胞生长液(F3代生长液)，补加预热至室温的上述MEM细胞维持液，更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，收获细胞维持液(F3代维持液)。
步骤5.1：带毒细胞生长液培养:三级生物反应器中培养的PK15-15#带毒细胞，收获F3代维持液后，加入预热至室温的含8％新生牛血清的MEM细胞生长液，培养参数设置为PH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm，带毒细胞标记为F4代。生长液培养24h后，沉淀微载体与细胞，收获细胞培养上清(F4代生长液)。
步骤5.2：带毒细胞维持液培养:三级生物反应器中的PK15-15#带毒细胞，收获F4代生长液后，加入预热至室温的上述MEM细胞维持液，培养参数设置为PH值7-7.6，溶氧(DO)30-40，温度(T)32-37℃，搅拌转速为18-24rpm。更换维持液后培养48h，沉淀微载体与细胞，收获细胞维持液(F4代维持液)。
步骤5.3：带毒细胞连续收毒：收获F4代维持液后，重复5.1操作，以生长液培养带毒细胞24h后，收获F5代生长液；重复5.2操作，以维持液培养带毒细胞48h后，收获F5代维持液。重复上述步骤，连续收毒至F12代以上，每个代次取样观察细胞状态。
步骤6：PCV2抗原液检测:对收获不同代次的生长液与维持液(F1代至F12代)进行无菌检验与PCV2病毒含量测定。无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。PCV2病毒含量测定用间接免疫荧光试验(IFA)测定各样品中PCV2的TCID50。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
Claims (8)
1.一种猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)准备PK15克隆细胞
用PK-15细胞克隆得到PK15克隆细胞备用，该PK15克隆细胞的分类命名为猪肾上皮细胞PK15，该细胞在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO:11198；
(2)PCV2增殖敏感细胞筛选
消化不同的PK-15克隆细胞和母细胞并同步接种相同剂量的PCV2病毒，待细胞长满至少50％时更换细胞维持液为MEM细胞维持液，37℃培养2d，用间接免疫荧光试验检测病毒感染的细胞量，筛选出PCV2增殖敏感的细胞，然后置37℃恒温箱连传3代进行种细胞扩繁，细胞长满后加入适量细胞冻存液，于液氮冻存；
(3)PCV2增殖敏感细胞增殖
将冻存的PCV2增殖敏感细胞在T25细胞瓶中进行复苏，待细胞长满单层后，以胰酶-EDTA消化，以含8％新生牛血清的MEM细胞生长液传代培养，按1:4至1:6传代比例逐级传代放大至15L转瓶内培养，按1:4至1:5传代比例在15L转瓶中扩传；
(4)PCV2悬浮培养及带毒传代
消化所述15L转瓶中生长良好的PCV2增殖敏感细胞，按终浓度6-8×105cells/ml的接种密度接种预处理好的含微载体的16L一级生物反应器，培养体积不小于8L，以含5-10％新生牛血清的MEM细胞生长液培养细胞，在接种细胞时按0.2％终体积同步接种PCV2种毒，细胞与种毒接种后，一级生物反应器中培养的带毒细胞标记为F1代；待细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，排出F1代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，排出F1代细胞维持液；以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的含微载体的二级生物反应器培养；
二级生物反应器的体积至少为一级生物反应器的2倍，培养体积不小于二级生物反应器体积的1/2，二级生物反应器中的带毒细胞标记为F2代；待二级生物反应器中细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获F2代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F2代细胞维持液；以胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的含微载体的三级生物反应器培养；
三级生物反应器为的体积至少为二级生物反应器的2倍，培养体积不小于三级生物反应器体积的1/2，三级生物反应器中的带毒细胞标记为F3代；待三级生物反应器中细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获F3代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F3代细胞维持液；
(5)带毒细胞悬浮培养与连续收毒
(5.1)带毒细胞生长液培养
三级生物反应器中培养的带毒细胞，收获F3代细胞维持液后，加入预热至室温的含5-10％新生牛血清的MEM细胞生长液，带毒细胞标记为F4代；生长液培养24h后，沉淀微载体与细胞，收获F4代细胞生长液；
(5.2)带毒细胞维持液培养
三级生物反应器中的带毒细胞，收获F4代细胞生长液后，加入预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F4代细胞维持液；
(5.3)带毒细胞连续收毒
收获F4代细胞维持液后，重复步骤(5.1)的操作，以生长液培养带毒细胞24h后，收获F5代细胞生长液；重复步骤(5.2)的操作，以维持液培养带毒细胞48h后，收获F5代细胞维持液；重复上述步骤，连续收毒至F12代以上，每个代次取样观察细胞状态；
(6)PCV2抗原液检测
对收获不同代次的生长液与维持液分别进行无菌检验与PCV2病毒含量测定。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于所述一级生物反应器的培养体积为10L；二级生物反应器的体积为85L，培养体积为50L；三级生物反应器的体积为500L，培养体积为300L。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于所述步骤(1)的具体操作方法如下：将复苏的PK-15细胞培养成单层后用胰酶-EDTA消化，再加入适量含10％小牛血清的MEM细胞生长液吹打使细胞分散成单个，然后进行10倍梯度稀释至10-20cells/mL，将稀释好的细胞按照200μL/孔铺于96孔细胞培养板，于37℃、5％CO2条件下培养9～11d，选取单个克隆进行扩大培养。
4.根据权利要求1或3所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于所述胰酶-EDTA中胰酶的质量分数为0.25％。
5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于所述一级生物反应器、二级生物反应器和三级生物反应器中的微载体为cytodex-1微载体，使用浓度为3～5g/L。
6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于所述MEM细胞维持液为含2％新生牛血清和1％D-氨基葡萄糖的细胞维持液。
7.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于所述预处理是指将一级生物反应器、二级生物反应器或三级生物反应器连接好各种管道、补料和辅助罐，接上T、pH、DO电极，进行电极的校正，培养参数的设置，所述预处理还包括微载体的浸泡和灭菌；三种生物反应器的培养参数都为PH值7.0-7.4，DO为20-30，温度为37℃，搅拌转速为18-25rpm。
8.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于所述无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行；所述PCV2病毒含量测定用间接免疫荧光试验测定各样品中PCV2的TCID50。
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