CN102690790A - 猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，本发明包含猪圆环病毒2型病毒生物反应器微载体悬浮培养带毒细胞制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产工艺。本发明可以大量降低生产成本，投入产出比提高5-10倍；而且生产周期短2-3天，占用场地小，同样产量下，占底面积仅为传统转瓶工艺的1/5，易于快速扩大生产规模，全密闭罐体生产条件下环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定；可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。

Description

猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养生产方法，具体涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养技术生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法。

背景技术

目前，国内猪圆环病毒2型灭活疫苗生产主要都采用细胞转瓶培养方法实现，该传统工艺生产半成品抗原效价低，仅为10^4.5-5.5TCID₅₀/ml，难以达到配苗要求(每毫升抗原含量应≥10^5.5TICD₅₀)，需要进行不同倍数的浓缩。且该法劳动强度大，生产一批需要100-200个转瓶；耗时长，需要6-7天；效率低，每次培养只收获一次；生产成本高，人工、场地及原料费用大；容易被环境污染，转瓶清洗产生的含毒废水需要专门处理；不同生产批次间或同一生产批次不同瓶间的差异大，影响整批抗原质量；难以扩大生产，需要较大场地和GMP厂房；逐瓶接种收获容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有细胞转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器微载体培养技术生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法。该方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原降低60-70％，而且生产周期较转瓶工艺缩短2-3天，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著提高疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择PK-15克隆细胞接毒制备的带毒细胞作为制苗用细胞；并包括如下步骤：

(1)、带毒细胞的制备和扩增

将细胞状态良好长为单层的健康pK-15克隆细胞消化传代后按照细胞培养体积的1％-5％接种PCV2种毒，培养24-48h待细胞长满50％以上后，换含MEM维持液继续维持48h，待细胞长满后即得到带毒细胞F1代；

(2)、带毒细胞在转瓶上的培养

利用预热的无菌PBS将长满的带毒细胞F1代轻轻洗涤一次，加入15-20ml胰酶消化液消化，不断旋转转瓶直至细胞全部消化脱落，加入MEM生长液终止消化，摇匀，按照1∶2至1∶5的传代比例分瓶；传代后代次为F2，依次类推；

(3)、带毒细胞在生物反应器上的培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体的密度设定为3-5g/L，准备好后备用；

将带毒细胞传代至F3代时挑选状态良好的细胞接种生物反应器，接种的密度为3-4×10⁵个/ml，接种后采用搅拌10-15min，停止10-15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁；更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养；

(4)、病毒的收获和效价测定

所述更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养50h后静置，吸出上清收获，继续加入的MEM维持液培养40h，观察若细胞大部分已脱落则连同微载体一起全部收获，若细胞状态依然较好则继续收获上清，添加MEM维持液再收获一次，至最后一次收获时连同微载体上的细胞一同收获，反复冻融2-3次后作为半成品测定效价。

进一步的技术方案是，所述的生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为3L-3000L；所述的微载体为Cytodex-1，微载体的使用浓度为3-5g/L，培养温度33-38℃、pH6.5-7.6、溶氧30％-70％、搅拌速度40-50rpm，微载体生物反应器在使用前需要采用如下方法进行电极校正，灭菌，平衡：

(1)生物反应器的准备：

根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道、补料和辅助罐，换液的接口，接上T，pH，DO电极，进行电极的校正；

(2)微载体的准备：

根据培养的体积和微载体浓度称取Cytodex-1微载体于已硅化处理的玻璃瓶中或不锈钢容器中，加入50倍微载体质量的PBS缓冲液浸泡30min，此后更换新鲜的PBS缓冲液继续浸泡2h；更换10倍体积的PBS缓冲液于待灭菌的生物反应器中准备灭菌；

(3)灭菌：

灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，5L以下采用离线灭菌，在高压锅中121℃高压30min，灭菌结束后取出自然冷却；10L以上的生物反应器采用在位灭菌的方式。

进一步的技术方案是，上述MEM维持液的成份体积分数为：MEM(低限基本培养基)为96％，NBCS(新生牛血清)为2％，D-氨基葡萄糖为1％，双抗为1％。

进一步的技术方案是，上述胰酶消化液中胰酶的质量分数为0.25％。

进一步的技术方案是，上述MEM生长液的成份体积分数为：MEM(低限基本培养基)为88％，NBCS(新生牛血清)为10％，双抗为1％，L-Glutamin为1％。

更进一步的技术方案是，上述双抗为含10000IU/mL青霉素和10000μg/mL的链霉素溶液。

进一步的技术方案是，所述PBS缓冲液的成分与含量为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，所述PBS缓冲液的pH为7.2-7.4。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明用生物反应器微载体细胞悬浮培养工艺代替现有转瓶细胞培养工艺生产猪圆环病毒2型抗原，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低的问题，通过生产技术和生产工艺的改变，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安全性。

(2)本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，每个生产周期仅需3-4天，相比现有转瓶细胞培养法的6-7天以上明显缩短。

(3)本发明应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高(培养温度、酸碱度、溶氧量、剪切力均由电脑程序控制)，用人少，生产工艺简单稳定，易操作、产量大占用场地小，仅为转瓶工艺的1/5，易于快速扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

(4)本发明的产品病毒效价比传统转瓶细胞培养法提高10-20倍，病毒效价可以稳定在10^6.5-6.7TCID₅₀/ml之间，成本降低3-4倍；产品质量均一，每罐收获的病毒抗原均一一致，最大可实现3000L生物反应器培养，易于规模化生产，整个生产工艺过程因完全在密闭的罐体和管道中进行，是不开放状态，不涉及传统生产方法所存在的其他生物安全和公共卫生问题。

附图说明

图1为本发明的制备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，包括如下步骤：

(1)、健康细胞的传代与培养

取pK-15克隆细胞经胰酶消化液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为37.0℃(±0.2)℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体培养；

(2)、带毒细胞的制备与传代

将细胞状态良好长为单层的健康pK-15克隆细胞消化传代后按照细胞培养体积的5％接种PCV2种毒，培养48h待细胞长满50％以上后，换含MEM维持液继续维持48h，待细胞长满后即得到带毒细胞F1代；利用预热的无菌PBS缓冲液将长满的带毒细胞F1代轻轻洗涤一次，加入15ml胰酶消化液消化，不断旋转转瓶直至细胞全部消化脱落，加入MEM生长液终止消化，摇匀，按照1∶5的传代比例分瓶；传代后代次为F2，依次类推，将带毒细胞传代至F3代时挑选状态良好的细胞用于接种生物反应器；

(3)、带毒细胞在生物反应器上的培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体的密度设定为5g/L，高压灭菌后备用；

消化带毒细胞F3代，按照3×10⁵个/ml的密度接种到生物反应器中，接种后采用搅拌15min，停止15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁；细胞贴壁后继续培养24h，此时绝大多数的细胞均表现出良好的生长态势；更换MEM维持液继续培养，设定培养条件为pH7.5，DO为70％，搅拌转速为50rpm继续培养50h；

(4)、病毒的收获和效价测定

所述更换MEM维持液在pH7.5，DO为70％，搅拌转速为50rpm的条件下继续培养50h后静置，吸出上清收获，继续加入MEM维持液培养40h，观察细胞状态依然较好则继续收获上清，添加MEM维持液再收获一次，至最后一次收获时连同微载体上的细胞一同收获，反复冻融3次后作为半成品测定效价。

经3次反复冻融后的病毒液过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存作为半成品。

半成品检验及疫苗制造、成品检验

1、收获病毒液毒价的测定：根据国家标准病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀/ml。

2、半成品检验：无菌检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。

3、成品检验：疫苗制造和成品检验按《猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)制造及检验规程》要求进行，符合要求。

上述技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为3L。

上述技术方案中，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：

1)用PBS浸泡微载体2小时；

2)用PBS清洗微载体3遍；

3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。

上述技术方案中，所述胰酶消化液中胰酶的质量分数为0.25％，所述MEM(低限基本培养基)生长液的成份体积分数为：MEM 88％，NBCS(新生牛血清)10％，双抗1％，L-Glutamin1％。

上述技术方案中，生物反应器设定参数为：培养温度33℃、pH7.6、溶氧70％、搅拌速度40rpm。

上述技术方案中，上述MEM维持液的成份体积分数为：MEM(低限基本培养基)为96％，NBCS(新生牛血清)为2％，D-氨基葡萄糖为1％，双抗为1％。

上述技术方案中，上述双抗为含10000IU/mL青霉素和10000μg/mL的链霉素溶液。

上述技术方案中，所述PBS缓冲液的成分与含量为：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，所述PBS缓冲液的pH为7.2。

实施例2

一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，包括如下步骤：

(1)、健康细胞的传代与培养

取pK-15克隆细胞经胰酶消化液消化传代，以细胞生长液培养，培养温度为37.0℃(±0.2)℃；形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体培养；

(2)、带毒细胞的制备与传代

将细胞状态良好长为单层的健康pK-15克隆细胞消化传代后按照细胞培养体积的1％接种PCV2种毒，培养24h待细胞长满50％以上后，换含MEM维持液继续维持48h，待细胞长满后即得到带毒细胞F1代；利用预热的无菌PBS缓冲液将长满的带毒细胞F1代轻轻洗涤一次，加入20ml胰酶消化液消化，不断旋转转瓶直至细胞全部消化脱落，加入MEM生长液终止消化，摇匀，按照1∶2的传代比例分瓶；传代后代次为F2，依次类推，将带毒细胞传代至F3代时挑选状态良好的细胞用于接种生物反应器；

(3)、带毒细胞在生物反应器上的培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体的密度设定为3g/L，高压灭菌后备用；

消化带毒细胞F3代，按照4×10⁵个/ml的密度接种到生物反应器中，接种后采用搅拌10min，停止10min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁；细胞贴壁后继续培养24h，此时绝大多数的细胞均表现出良好的生长态势；更换MEM维持液继续培养，设定培养条件为pH7.6，DO为50％，搅拌转速为40rpm继续培养50h；

(4)、病毒的收获和效价测定

所述更换MEM维持液在pH7.6，DO为50％，搅拌转速为40rpm的条件下继续培养50h后静置，吸出上清收获，继续加入MEM维持液培养40h，观察细胞状态依然较好则继续收获上清，添加MEM维持液再收获一次，至最后一次收获时连同微载体上的细胞一同收获，反复冻融3次后作为半成品测定效价。

经3次反复冻融后的病毒液过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存作为半成品。

半成品检验及疫苗制造、成品检验

1、收获病毒液毒价的测定：根据国家标准病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀/ml。

2、半成品检验：无菌检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。

3、成品检验：疫苗制造和成品检验按《猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)制造及检验规程》要求进行，符合要求。

上述技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为5L。

上述技术方案中，微载体在使用前需清洗、灭菌，方法如下：

1)用PBS浸泡微载体2小时；

2)用PBS清洗微载体3遍；

3)用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟。

上述技术方案中，所述胰酶消化液中胰酶的质量分数为0.25％，所述MEM(低限基本培养基)生长液的成份体积分数为：MEM 88％，NBCS(新生牛血清)10％，双抗1％，L-Glutamin1％。

上述技术方案中，生物反应器设定参数为：培养温度38℃、pH6.5、溶氧30％、搅拌速度50rpm。

上述技术方案中，上述MEM维持液的成份体积分数为：MEM(低限基本培养基)为96％，NBCS(新生牛血清)为2％，D-氨基葡萄糖为1％，双抗为1％。

上述技术方案中，上述双抗为含10000IU/mL青霉素和10000μg/mL的链霉素溶液。

上述技术方案中，所述PBS缓冲液的成分与含量为：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，所述PBS缓冲液的pH为7.4。

在本说明书中所谈到的“实施例1”、“实施例2”，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

尽管这里参照本发明的实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：

选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择PK-15克隆细胞接毒制备的带毒细胞作为制苗用细胞；并包括如下步骤：

(1)、带毒细胞的制备和扩增

将细胞状态良好长为单层的健康pK-15克隆细胞消化传代后按照细胞培养体积的1％-5％接种PCV2种毒，培养24-48h待细胞长满50％以上后，换含MEM维持液继续维持48h，待细胞长满后即得到带毒细胞F1代；

(2)、带毒细胞在转瓶上的培养

利用预热的无菌PBS将长满的带毒细胞F1代轻轻洗涤一次，加入15-20ml胰酶消化液消化，不断旋转转瓶直至细胞全部消化脱落，加入MEM生长液终止消化，摇匀，按照1∶2至1∶5的传代比例分瓶；传代后代次为F2，依次类推；

(3)、带毒细胞在生物反应器上的培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体的密度设定为3-5g/L，准备好后备用；

将带毒细胞传代至F3代时挑选状态良好的细胞接种生物反应器，接种的密度为3-4×10⁵个/ml，接种后采用搅拌10-15min，停止10-15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁；更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养；

(4)、病毒的收获和效价测定

所述更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养50h后静置，吸出上清收获，继续加入的MEM维持液培养40h，观察若细胞大部分已脱落则连同微载体一起全部收获，若细胞状态依然较好则继续收获上清，添加MEM维持液再收获一次，至最后一次收获时连同微载体上的细胞一同收获，反复冻融2-3次后作为半成品测定效价。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述的生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为3L-3000L；所述的微载体为Cytodex-1，微载体的使用浓度为3-5g/L，培养温度33-38℃、pH6.5-7.6、溶氧30％-70％、搅拌速度40-50rpm，微载体生物反应器在使用前需要采用如下方法进行电极校正，灭菌，平衡：

(1)生物反应器的准备：

根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道、补料和辅助罐，换液的接口，接上T，pH，DO电极，进行电极的校正；

(2)微载体的准备：

根据培养的体积和微载体浓度称取Cytodex-1微载体于已硅化处理的玻璃瓶中或不锈钢容器中，加入50倍微载体质量的PBS缓冲液浸泡30min，此后更换新鲜的PBS缓冲液继续浸泡2h；更换10倍体积的PBS缓冲液于待灭菌的生物反应器中准备灭菌；

(3)灭菌：

灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，5L以下采用离线灭菌，在高压锅中121℃高压30min，灭菌结束后取出自然冷却；10L以上的生物反应器采用在位灭菌的方式。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述MEM维持液的成份体积分数为：MEM为96％，NBCS为2％，D-氨基葡萄糖为1％，双抗为1％。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述胰酶消化液中胰酶的质量分数为0.25％。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述MEM生长液的成份体积分数为：MEM为88％，NBCS为10％，双抗为1％，L-Glutamin为1％。

6.根据权利要求3或5所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述双抗为含10000IU/mL青霉素和10000μg/mL的链霉素溶液。

7.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的成分与含量为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，所述PBS缓冲液的pH为7.2-7.4。

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