CN101289655A - 一种制备猪圆环病毒的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备猪圆环病毒的工艺，该方法包括制备PK15细胞液、采用生物反应器技术与灌注工艺培养猪圆环病毒2型(PCV2)。与现有技术相比，本发明具有病毒产量高、操作方便、病毒效价高、操作空间小、工艺参数控制精确等优点，可用以最终提高PCV2疫苗免疫原性和研制高效的PCV2疫苗。

Description

一种制备猪圆环病毒的工艺
技术领域
本发明涉及动物病毒，尤其是涉及一种制备猪圆环病毒的工艺。
背景技术
20世纪70年代Tischer等首次发现猪圆环病毒(PCV)，PCV分为PCV1和PCV2两种基因型，其中PCV2有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，还是育肥猪的猪皮炎和肾病综合征(PDNS)的主要病因，并且与怀孕母猪的繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤(CT)、增生性和坏死性肺炎(PNP)的发生密切相关。由于该病属于免疫抑制疾病，可引发严重的继发感染从而危害猪群健康，是继猪繁殖呼吸道综合征之后又一个严重危害全球养猪业的重大疾病，在我国规模化猪群中PCV2感染率超过90％。近两年在国际上已获得批准的猪圆环病毒疫苗有4个，这些疫苗中有的是通过基因工程技术手段研制得到，也有采用常规病毒培养技术制备得到，但无论哪种技术手段均获得了严格的国际专利保护，这给研发新型PCV2疫苗设置了较高的门槛。在我国还未有确实有效并经过农业部批准的PCV2疫苗。
目前国内兽用细胞疫苗的生产基本采用大方瓶和滚瓶技术，这些技术在规模化生产细胞和病毒时劳动强度高、占地大、批间差异大，难于进行标准化生产的质量控制。我国兽用疫苗市场中由于批间差异问题和病毒效价不高引起的质量不稳定的问题时有发生。在细胞疫苗生产行业中大规模生产动物细胞和病毒是疫苗产业化生产的前提。提高病毒效价和产量，是提升疫苗产业化生产的必由之路。
生物反应器技术高密度发酵工艺生产细胞和病毒是1970年代新开发的技术，利用此技术的连续培养工艺生产非裂解型病毒(PCV2属此类病毒)具有良好的商业开发前景，国际上最成功的例子是狂犬病疫苗，采用该技术可以连续收获病毒30天以上，病毒效价提高5倍，增加病毒产量5倍以上，成本降低50％。利用生物反应器规模化生产动物细胞和病毒基本上可以克服方瓶和滚瓶技术的以上缺陷，它具有操作方便、占地小、节省人工、可控程度高、病毒效价和产量高、易于进行标准化控制，是新一代兽用细胞疫苗生产的必由之路。
目前，国际上采用的技术得到的PCV2的病毒效价在104.0左右，还没有解决猪圆环病毒2型疫苗研究过程中存在的如何提高病毒产量和病毒效价的难点问题。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺合理、病毒产量和效价高的制备猪圆环病毒的工艺。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种制备猪圆环病毒的工艺，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备密度为2×105个/毫升的PK15细胞液；
(2)于7.5升生物反应器内接种5升细胞液，微载体浓度为5mg/ml；
(3)加入细胞液体积8％的胎牛血清和1％的双抗，并同步加入10％的猪圆环病毒2型(PCV2)种毒；
(4)于37℃培养48小时，生物反应器的参数为：转速50rpm，溶氧量30～60％，二氧化碳浓度5％，pH值7.2；
(5)24小时后将生物反应器内的细胞用PBS洗涤三次，加入200mM氨基葡萄糖作用30分钟；
(6)弃去氨基葡萄糖，将细胞用PBS洗涤三次；
(7)加入细胞生长液继续培养细胞，生物反应器的参数与步骤(4)中相同；
(8)24小时后，采用灌注工艺培养10天，灌注体积为2.5升/天，在生物反应器出口处放置4℃冰箱收集病毒；
(9)10天后停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒与生物反应器内的病毒混合，于-20℃冻融两次，冻融过程中不停摇晃，得到猪圆环病毒。
所述的微载体包括Cytodex 3。
与现有技术相比，本发明的制备猪圆环病毒的工艺通过新型生物反应器技术高密度发酵工艺生产细胞和PCV2病毒，提高了PCV2的病毒效价，从而最终提高PCV2疫苗免疫原性和研制高效的PCV2疫苗，本发明具有以下优点：
(1)病毒产量高：以5L工作体积为例，本发明灌注培养工艺可以生产病毒25L，而传统工艺仅能生产5L病毒；
(2)操作方便：以5L工作体积为例，本发明灌注培养工艺仅需1人就可完成全部操作，而传统工艺需要100个大方瓶或滚瓶最少需要4人才能完成，随着工作体积的增加这就优势更加明显；
(3)病毒效价高：传统工艺生产的病毒效价仅为104.0/ml，而本发明灌注培养工艺生产的病毒效价可以达到105.0/ml；
(4)操作空间小：以5L工作体积为例，本发明灌注培养工艺仅需3m2的操作区域，而传统工艺需要30m2以上的操作区域，随着工作体积的增加这就优势更加明显；
(5)工艺参数控制精确：本发明采用生物反应器灌注培养工艺生产时可控参数有温度、pH值、溶氧量、二氧化碳浓度、转速、载体浓度，可实现在线监测的参数有葡萄糖、乳酸和铵离子浓度，为实现批次质量的稳定性奠定了基础，而传统工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异大。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种制备猪圆环病毒的工艺，该方法包括以下步骤：
(1)制备密度为2×105个/毫升的Dulac系PK15细胞液；
(2)于7.5升NBS公司的生物反应器内接种5升细胞液，微载体Cytodex3浓度为5mg/ml；
(3)加入细胞液体积8％的胎牛血清和1％的双抗，并同步加入10％的猪圆环病毒2型(PCV2)种毒；
(4)于37℃培养48小时，生物反应器的参数为：转速50rpm，溶氧量30～60％，二氧化碳浓度5％，pH值7.2；
(5)24小时后将生物反应器内的细胞用PBS洗涤三次，加入200mM氨基葡萄糖作用30分钟；
(6)弃去氨基葡萄糖，将细胞用PBS洗涤三次；
(7)加入细胞生长液继续培养细胞，生物反应器的参数与步骤(4)中相同；
(8)24小时后，采用灌注工艺培养10天，灌注体积为2.5升/天，在生物反应器出口处放置4℃冰箱收集病毒；
(9)10天后停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒与生物反应器内的病毒混合，于-20℃冻融两次，冻融过程中不停摇晃，得到猪圆环病毒。
取样检测病毒效价(细胞培养和PCR结合法)可达105.0/ml细胞感染量。

Claims (2)

1.一种制备猪圆环病毒的工艺，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备密度为2×105个/毫升的PK15细胞液；
(2)于7.5升生物反应器内接种5升细胞液，微载体浓度为5mg/ml；
(3)加入细胞液体积8％的胎牛血清和1％的双抗，并同步加入10％的猪圆环病毒2型(PCV2)种毒；
(4)于37℃培养48小时，生物反应器的参数为：转速50rpm，溶氧量30～60％，二氧化碳浓度5％，pH值7.2；
(5)24小时后将生物反应器内的细胞用PBS洗涤三次，加入200mM氨基葡萄糖作用30分钟；
(6)弃去氨基葡萄糖，将细胞用PBS洗涤三次；
(7)加入细胞生长液继续培养细胞，生物反应器的参数与步骤(4)中相同；
(8)24小时后，采用灌注工艺培养10天，灌注体积为2.5升/天，在生物反应器出口处放置4℃冰箱收集病毒；
(9)10天后停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒与生物反应器内的病毒混合，于-20℃冻融两次，冻融过程中不停摇晃，得到猪圆环病毒。
2.根据权利要求1所述的一种制备猪圆环病毒的工艺，其特征在于，所述的微载体包括Cytodex 3。
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