CN103740652A - 一种猪圆环病毒ⅱ型的制备新方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒Ⅱ型的制备新方法，对接毒的PK-15细胞用不同浓度梯度D-氨基葡萄糖处理，利用IFA筛选，不但能够使PK-15细胞正常生长，而且PCV2病毒滴度有显著提高，该方法获取的PCV2病毒的滴度不低于10⁵TCID₅₀,筛选的适宜D-氨基葡萄糖浓度对PCV2的增殖和操作方法，用于PCV2疫苗和相关诊断试剂的研究与产品制备。

Description

一种猪圆环病毒Ⅱ型的制备新方法

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒的制备，采用的新方法制备猪圆环病毒II型既节约时间、又降低污染，提高了病毒滴度，有利于产量的提高。 

背景技术

应用常规的同步接毒或异步接毒的方式进行病毒培养,再加入D-氨基葡萄糖溶液处理,D-Hanks清洗后,加入病毒维持液继续培养,不仅工序繁多，而且避免不了高浓度的D-氨基葡萄糖对细胞造成的致死性的损伤，从而影响病毒在细胞上的增殖。目前使用PCV2抗原制成的疫苗在对PMWS的预防中初见成效，但是PCV2全病毒灭活疫苗生产的难题在于病毒滴度低，达不到全病毒灭活疫苗生产的要求，主要是实验室培养PCV2均在猪肾细胞系PK-15上增殖，病毒滴度低，免疫荧光试验显示，受PCV2感染的PK-15细胞比例仅有20%-30%。Tischer等报道,在接种PCV的PK-15细胞培养物中加入D-氨基葡萄糖可促进病毒大量复制，使含有PCV2抗原的细胞数提高30%，由于高浓度的D-氨基葡萄糖对细胞有毒性作用，处理不当会造成细胞大面积死亡脱落[1],因此，需要寻找一种有效可靠的方法来获取高滴度的PCV2病毒。 

专利文献检索披露：1）严伟东李文洁李文涛崔晓汪洋何启盖（6）[2010]报道的猪圆环病毒Ⅱ型制备方法,针对分离鉴定的PCV2-WH株通过应用细胞与病毒同步接种并用300mm的D-氨基葡萄糖处理；同步接种不用D-氨基葡萄糖处理；不同步接种并用D-氨基葡萄糖处理；不同步接种不用D-氨基葡萄糖处理等四种不同的方法进行病毒增殖优化培养;最终结果表明：同步接种并用D-氨基葡萄糖处理的病毒含量比其他三种培养工艺所获病毒量分别提高了12.8％，14.7％，56.7％。2）姜平等（12）[2010]为获得能稳定产生高滴度PCV2的PK15细胞系，对PK15母细胞进行有限稀释后进行了连续的细胞克隆和亚克隆，利用IFA筛选，获得1株对PCV2具有高敏感性的PK15-B1细胞系。该细胞接种PCV2后，37℃培养3-4天，病毒滴度达107.0TCID50/ml;以上方法均制备出较高滴度的病毒，但仍然需要通过复杂的操作和较高的技术水平才能完成。 

本发明构思的300mm D-氨基葡萄糖处理细胞，病毒的滴度确实有所提高，但是为了避免高浓度的D-氨基葡萄糖对细胞造成的损害，这需要严格的时间控制，以提高PCV2滴度为切入点，在营养液中直接添加2mM D-氨基葡萄糖不仅有利于PK-15细胞的高效产毒，同时有利于PCV2的驯化和抗原的大量获得,新方法，既减少了繁琐的操作，又缩短了工序，提高了生产产量,具有重要的生产实用价值。 

发明内容

本发明的目的在于：应用这种制备猪圆环病毒Ⅱ型的新方法，代替常规制备猪圆环病毒Ⅱ型的方法。 

本发明的目的是这样实现的：一种猪圆环病毒Ⅱ型的制备新方法，分步实施； 

步骤1PK-15细胞的培养： 

取复苏密度为1.0×10⁶的PK-15冻存细胞1.8ml，置于37℃水浴中，晃动溶解1-2min，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入10-15ml细胞培养液，再转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中，培养72h，用浓度0.25%的EDTA-胰酶3-5ml消化细胞，再用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液5ml，稀释成1.0×10⁶的PK-15细胞悬液，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入10-15ml细胞培养液，转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中，培养72h，得到PK-15细胞。 

步骤2病毒培养液的配制 

在盛有950mL DMEM培养液的容器中，加入50mL胎牛血清，混合均匀，加入终浓度为2mM的D-氨基葡萄糖溶液20mL，得病毒培养液，其中培养液含5%胎牛血清。 

步骤3病毒的繁殖 

将1.0×10⁶的PK-15细胞悬液1mL与1×10⁴TCID₅₀PCV21mL同步接种于细胞培养瓶中，加入13mL步骤2的病毒培养液，在37℃、5%CO₂条件下，培养成致密单层，收集培养液。然后用浓度0.25%的EDTA-胰酶3-5ml消化细胞，再用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液5ml，稀释成1.0×10⁶的PK-15细胞悬液，继续同步传代，收集每一代次病毒液，进行病毒毒价测定。 

步骤4病毒毒价的测定 

抽取猪圆环病毒毒液100ul，用DMEM溶液做10倍的梯度稀释，取10^-1-10^-8的滴度样，分别加入到96孔板中，每孔100ul；同时设对照每孔加病毒培养液100ul，将1×10⁴TCID₅₀/mL的PK-15细胞悬液加入到96孔板中，每孔100ul，将96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中，培养至96h后，拍干96孔板，加入-20℃下预冷好的80%的丙酮溶液50ul，室温作用10min，弃去丙酮，自然干燥，用PBST洗5遍，放置4℃冰箱备用；继续向各孔分别加入一抗，操作完毕后，放置4℃冰箱过夜，弃去一抗，用PBST洗5遍，加入FITC标记兔抗猪IgG，即二抗，室温作用2h，弃去二抗，用PBST洗5遍，最终各孔加入PBST，每孔50μL，在荧光显微镜下观察，依据Reed-Muench法计算TCID₅₀值；其中PBST溶液的pH为7.2。 

上述PBST溶液的配制：取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.25g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾，加注射用水配制成1000ml，再加终浓度为0.05%的吐温-20500μL，溶解均匀后即得溶液。 

上述80%丙酮溶液由丙酮与去离子水按体积比4:1配制。 

上述0.1M D-氨基葡萄糖溶液由2.155g D-氨基葡萄糖溶解到DMEM溶液中，定容至100ml后即得到。 

本方法使病毒感染方式为同步接毒，病毒与细胞的作用至少延长时间24h，有利于病毒的复制。 

本方法，在病毒增殖液中加入终浓度为2mM/L的D-氨基葡萄糖，减少污染，使病毒滴度不低于10⁵TCID₅₀。 

本方法与常规方法相比，省去了弃去培养液、加入D-氨基葡萄糖、D-Hanks清洗等步骤，节省了时间，使病毒传至20代后滴度至少提高了100倍。 

本发明的新方法，即将适当浓度的D-氨基葡萄糖加入到病毒培养液中进行病毒的驯化培养。该方法不但减少了一半的操作工序，而且病毒传至第20代后病毒滴度至少提高100倍。用1×培养基方法克隆出的病毒TCID₅₀的平均值为10^7.2；而用2×培养基方法克隆出的病毒TCID₅₀的平均值为10^6.55，前者是后者的3.55倍；该方法不仅简化了操作，缩短时间，同时又提高了病毒的毒价，具有重要的应用价值，彰显技术进步。 

附图说明

本发明结合附图作进一步说明。 

附图为不同浓度D-氨基葡萄糖作用下病毒滴度增长的示意图； 

如图所示：终浓度为0.5mM、1mM、2mM D-氨基葡萄糖的营养液对病毒的增殖作用具有影响;其中2mM D-氨基葡萄糖的营养液对病毒的增殖作用最明显，培养72h后，病毒滴度可达到10^6.0TCID₅₀/ml;营养液中D-氨基葡萄糖浓度为4mM和8mM时，PK-15细胞生长产生受到明显的抑制作用，病毒滴度明显低于对照组。 

具体实施方式

下面将结合实施例对发明作进一步说明。 

实施例 

1）PK-15细胞的制备 

将载有复苏密度为1.0×10⁶的PK-15冻存细胞1.8ml的容器瓶，置于37℃水浴中，晃动溶解2min，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入15ml细胞培养液，转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中，培养72h，用浓度0.25%的EDTA-胰酶5ml消化细胞，再用DMEM细胞培养液（含10%胎牛血清）5ml稀释成1.0×10⁶的PK-15细胞悬液，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入13ml细胞培养液，转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中，培养72h，得到所要制备的PK-15细胞； 

2）病毒培养液的配制 

将950mL DMEM培养液中加入50mL胎牛血清，混合均匀，再加入终浓度为2mM的D-氨基葡萄糖溶液20mL，即得病毒培养液； 

3）病毒的繁殖 

将1.0×10⁶的PK-15细胞悬液1mL与1×10⁴TCID₅₀PCV21mL同步接种于细胞培养瓶中，加入13mL步骤2的病毒培养液，在37℃、5%CO₂条件下，培养成致密单层，收集培养液,然后用浓度0.25%的EDTA-胰酶3-5ml消化细胞，再用DMEM细胞培养液(含10%胎牛血清)5ml，稀释成1.0×10⁶的PK-15细胞悬液，继续同步传代，收集每一代次病毒液，进行病毒毒价测定； 

4）病毒毒价的测定 

抽取猪圆环病毒毒液100ul，用DMEM溶液做10倍的梯度稀释， 取10^-1-10^-8的滴度样，分别加入到96孔板中，每孔100ul；同时设对照每孔加病毒培养液100ul，将1×10⁴TCID₅₀/mL的PK-15细胞悬液加入到96孔板中，每孔100ul，将96孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中，培养至96h，拍干96孔板，加入-20℃预冷好的80%的丙酮50ul，室温作用10min，弃去丙酮，自然干燥，用PBST（pH=7.2）洗5遍，放置4℃冰箱备用；各孔分别加入用PBST1:100倍稀释的猪圆环病毒阳性血清，操作完毕后，放置4℃冰箱过夜，弃去一抗，用PBST洗5遍，加入用PBST1:200倍稀释的FITC标记兔抗猪IgG(二抗)，室温作用2h，弃去二抗，用PBST洗5遍，最终加入PBST，50μL/孔，在荧光显微镜下观察荧光，依据Reed-Muench法计算TCID₅₀值，最终判定当D-氨基葡萄糖的终浓度在2mM/L，培养72-96h，PCV2滴度达10^6.0TCID50/ml。 

5）D-氨基葡萄糖浓度的筛选 

将1×10⁵个/mL细胞悬液与1×10⁴TCID₅₀/mL PCV2混合均匀接种到96孔板中，0.1mL/孔。将不同浓度梯度的D-氨基葡萄糖（终浓度分别为0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM）加入到96孔板中,每个梯度设8个平行对照，将未加D-氨基葡萄糖的孔作为对照,在37℃5%CO2条件下培养72h，在此期间观察细胞形态和细胞生长状况。 

6）接毒PK-15细胞的特性研究 

将1×10⁴TCID₅₀/mL PCV2混合均匀接种到6孔板中，1mL/孔，然后加入含有1×10⁵个/mL细胞的病毒培养液（含0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM D-氨基葡萄糖），使每孔细胞数均为1.0×10⁵个。在37℃5%CO2条件下培养72h。培养期间观察细胞形态和生长状况。分别在培养8、16、24、36、48、72h、96h后用浓度0.25%的EDTA-胰酶1ml消化细胞。消化完毕后，加入适量的培养基用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞；取其中100μl，加900μl的Hanks液，混匀后滴于血细胞计数板上进行细胞计数。 

本实验选用的猪圆环病毒Ⅱ型是由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司自行分离鉴定。 

本方法的实验结果见表。 

表不同时间点下接毒细胞计数结果 

注：“*”表示在37℃、5%的CO₂培养箱中培养，未加D-氨基葡萄糖时每孔的细胞数；以上细胞数都以六孔细胞培养板每孔中细胞总数为单位。 

由上表数据得知:营养液中终浓度为0.5mM、1mM、2mM的D-氨基葡萄糖对PK-15细胞生长没有明显的影响，培养72h后，细胞密度仍能维持在10⁶个细胞/ml以上；而营养液中终浓度为4mM和8mM的D-氨基葡萄糖对PK-15细胞生长产生明显的抑制作用，细胞密度明显减低。 

本发明选用的PK-15细胞购自购自中国典型培养物中心进行保藏，货号：CX0251；DMEM(高糖)培养基由GIBCO公司生产，货号：11965-084；胎牛血清由GIBCO公司生产，货号：10099-141的；EDTA-胰酶消化液为Hyclone生产，货号25200056；FITC标记兔抗猪IgG由Bethyl公司生产，货号：A100-114F；猪圆环病毒阳性血清由JBT公司生产，货号：107HS394；其他常用试剂均为国产分析纯试剂。 

Claims (3)

1.一种猪圆环病毒Ⅱ型的制备新方法，其特征在于：分步实施；

步骤1 PK-15细胞的培养：

  取复苏密度为1.0×10⁶的PK-15冻存细胞1.8ml，置于37℃水浴中，晃动溶解1-2min，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入10-15ml细胞培养液，再转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中，培养72h，用浓度0.25%的EDTA-胰酶3-5ml消化细胞，再用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液5ml，稀释成1.0×10⁶的PK-15细胞悬液，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入10-15ml细胞培养液，转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中，培养72h，得到PK-15细胞；

步骤2病毒培养液的配制

在盛有950mL DMEM培养液的容器中，加入50 mL胎牛血清，混合均匀，加入终浓度为2mM的D-氨基葡萄糖溶液20mL，得病毒培养液，其中培养液含5%胎牛血清；

步骤3病毒的繁殖

将1.0×10⁶的PK-15细胞悬液1mL与1×10⁴TCID₅₀PCV2 1mL同步接种于细胞培养瓶中，加入13mL步骤2的病毒培养液，在37℃、 5% CO₂条件下，培养成致密单层，收集培养液。

2.然后用浓度0.25%的EDTA-胰酶3-5ml消化细胞，再用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液5ml，，稀释成1.0×10⁶的PK-15细胞悬液，继续同步传代，收集每一代次病毒液，进行病毒毒价测定；

    步骤4病毒毒价的测定

抽取猪圆环病毒毒液100ul，用DMEM溶液做10倍的梯度稀释，取10^-1-10^-8的滴度样，分别加入到96孔板中，每孔100ul；同时设对照每孔加病毒培养液100ul，将1×10⁴TCID₅₀/mL的 PK-15细胞悬液加入到96孔板中，每孔100ul，将96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中，培养至96h后，拍干96孔板，加入-20℃下预冷好的80%的丙酮溶液50ul，室温作用10min，弃去丙酮，自然干燥，用PBST洗5遍，放置4℃冰箱备用；继续向各孔分别加入一抗，操作完毕后，放置4℃冰箱过夜，弃去一抗，用PBST洗5遍，加入FITC标记兔抗猪IgG，即二抗，室温作用2h，弃去二抗，用PBST洗5遍，最终各孔加入PBST，每孔50μL，在荧光显微镜下观察，依据Reed-Muench法计算TCID₅₀值；其中PBST溶液的pH为7.2；

上述PBST溶液的配制：取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.25g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾，加注射用水配制成1000ml，再加终浓度为0.05%的吐温-20 500μL，溶解均匀后即得；

上述80%丙酮溶液由丙酮与去离子水按体积比4:1配制；

上述0.1M D-氨基葡萄糖溶液由2.155 g D-氨基葡萄糖溶解到DMEM溶液中，定容至100 ml后即得。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：在病毒增殖液中加入终浓度为2mM/L的D-氨基葡萄糖，减少污染，使病毒滴度不低于10⁵TCID₅₀。

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