CN105087501A

CN105087501A - 猪圆环病毒2型毒株及由其制备的灭活疫苗和应用

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Publication number: CN105087501A
Application number: CN201510320280.9A
Authority: CN
Inventors: 何玉友; 冯建民; 袁立民; 颜彤; 王国辉; 王石; 刘斌; 杨键; 李长艳; 廉维; 杨泽彬; 冯会; 柳志光; 白杨; 吴艳丽; 田丽华; 于志云; 曲红; 李海
Original assignee: JILIN ZHENGYE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: JILIN ZHENGYE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-06-11
Also published as: CN105087501B

Abstract

本发明公开了一株猪圆环病毒2型病毒株及由其制备的灭活疫苗和应用，属于猪圆环病毒2型病毒株的分离和应用领域。本发明首先公开了一株猪圆环病毒2型Yh-1株，其微生物保藏编号是：CGMCC？No.10409。本发明还公开了应用所述Yh-1株制备预防猪圆环病毒灭活疫苗的方法，包括：(1)扩增猪圆环病毒2型Yh-1株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。动物实验结果表明，由本发明猪圆环病毒2型Yh-1制备的灭活疫苗安全性高，免疫原性好，免疫保护率达到100％，对圆环病毒2型强毒攻毒能提供完全保护，能够对流行的猪圆环病毒实现有效防治。

Description

猪圆环病毒2型毒株及由其制备的灭活疫苗和应用

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒株，尤其涉及一株猪圆环病毒2型毒株，本发明还涉及由所述猪圆环病毒2型毒株制备的灭活疫苗及其应用，属于猪圆环病毒2型毒株的分离和应用领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)感染是造成断奶仔猪多系统衰竭综合征((PMWS)的主要原因，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特征，病猪主要表现生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。同时由于是免疫抑制性疾病，机体免疫防御功能降低，致使临床上常常发生混合感染，产生所谓的各种综合征，如：猪皮炎肾病综合征，仔猪先天性震颤以及母猪繁殖障碍等，增加了疾病控制的难度。自1991年在加拿大猪群中爆发以来，该病毒在全球迅速传播，目前PCV2已呈全球分布，猪群感染率越来越高。中国于2000年首次报道PCV2以来，该病毒在中国猪场中感染率迅速上升，猪群的平均阳性率大于20％，有的甚至超过50％，有些地区高达100％，给中国养猪业造成了巨大的经济损失，急需采取防治措施控制该病毒的传播。

至目前为止，国内外的试验表明，疫苗是预防此病的主要措施之一，为了有效地预防PCV2感染，国内外相继开展了许多有关PCV2灭活疫苗和基因工程疫苗的研究，并取得了一定效果。迄今为止，尚缺乏一种安全、高效、廉价的PCV2灭活疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株分离的猪圆环病毒2型毒株，采用该毒株制备的灭活疫苗免疫原性好，能够有效防治由猪圆环病毒2型引起的各种疾病。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一株分离的猪圆环病毒2型Yh-1株。

本发明将分离的猪圆环病毒2型Yh-1株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.10409；分类名是：猪圆环病毒(Porcinecircovirus)；保藏时间是：2015年3月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将内蒙古某发病猪场发病死亡仔猪，分别取肺脏和淋巴结，置于-70℃超低温冰箱中保存备用。剪取一定体积病料，加入5倍体积的5％血清的MEM，使用玻璃研磨器研磨，匀浆经12000rpm4℃离心10min，上清使用0.22μm滤器过滤除菌待用；将RT-PCR检测为阳性的病料上清过滤除菌后，接种于已长至90％的单层PK-15细胞上，每个T-25细胞瓶1mL，放入37℃的5％CO₂培养箱中孵育1h，弃上清并加入含2％胎牛血清的MEM9mL继续37℃培养，连续传至第3代。采用微载体悬浮培养圆环病毒，得到猪圆环病毒液，连续传15代。通过连续传代获得了稳定的高滴度的PCV-2病毒，病毒传至第4代，TCID₅₀值为1.0×10^6.70，传至第11代时，TCID₅₀值达到1.0×10^7.90，最终病毒的滴度稳定在1.0×10^7.90左右。

本发明猪圆环病毒2型Yh-1株能够应用于制备预防由猪圆环病毒所引起的各种疾病的疫苗或药物。

本发明进一步公开了一种预防由猪圆环病毒所引起的各种疾病的疫苗组合物，包括：免疫上有效量的猪圆环病毒2型Yh-1株和药学上可接受的佐剂。

本发明还公开了一种预防由猪圆环病毒所引起的各种疾病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)扩增所述的猪圆环病毒2型Yh-1株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)所述扩增为采用PK-15细胞培养猪圆环病毒2型Yh-1株；优选的，将分离的猪圆环病毒2型Yh-1株按病毒维持液量的1％接入形成PK-15细胞培养物中；所述培养条件优选为37℃旋转培养。

步骤(2)按照质量g/体积mL计，灭活剂与病毒液的比例为0.02：100；所述灭活剂为甲醛。

步骤(3)所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4：96混合均匀，得到水相；

所述制备油相包括：将油佐剂、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94：6：2混合均匀。

步骤(4)将水相和油相按照体积比1：1.5的比例混合均匀。

安全性试验结果表明，本发明制备的灭活疫苗对猪安全性好，免疫前后猪没有体温升高的现象。猪群采食和精神正常。单倍剂量和双倍剂量疫苗注射后，连续观察14d，均未见注射部位有肿块出现，免疫后28d，每组解剖2头猪，注射部位也未见有白色油乳剂样物质存在，疫苗吸收很完全。说明本发明的灭活疫苗接种后对猪是安全的。

免疫原性试验结果表明，在仔猪免疫攻毒试验中，用本发明的灭活疫苗免疫后21天，仔猪抗体全部转阳，攻毒后，免疫组保护率可达100％，所有试验动物均未发病。本发明分离的猪圆环病毒2型Yh-1株制备的灭活疫苗保护率为100％，证明本发明分离的猪圆环病毒2型Yh-1株免疫原性好，免疫保护力强。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“分离的”意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分(例如细胞质或膜组分)。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

术语“免疫有效量”是将引发针对猪圆环病毒的免疫应答的无毒力猪圆环病毒毒株的量。“免疫有效量”将依赖于受体动物的物种、品种、年龄、大小、健康状况等因素。

附图说明

图1PCV2的PCR扩增结果；1.阴性对照；2.DL2000marker；3.PCR扩增片段。

图2PK-15细胞分离毒的间接免疫荧光鉴定结果；A：感染分离毒的PK-15细胞；B：未感染分离毒的PK-15细胞。

图3猪圆环病毒强毒攻毒后各组动物的体温测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1实验材料

1.1实验动物

3～4周龄健康仔猪，血清抗体经ELISA和IFA检验，无PCV-2抗体；经gB-ELISA和gE-ELISA检测无伪狂犬病野毒抗体，购自哈尔滨市阿城某养殖场。

1.2试剂与工具酶

MEM培养基购自Gibco公司；标准胎牛血清购自山东劲牛生物制品科技有限责任公司，基因组DNA提取试剂盒购自上海华舜生物有限公司；蛋白酶K、LATaq(含10×Buffer，6×LoadingBuffer，0.025MMgCl₂)、dNTPMixture、DL2000Marker均购自宝生物工(大连)有限公司；胰酶购于华美生物工程公司。FITC-兔抗猪IgG购自Sigma公司。Marcol52油佐剂购自美国埃索。

实施例1猪圆环病毒2型Yh-1株的分离和鉴定

1、实验方法

1.1病料样本及病毒分离用细胞

内蒙古某发病猪场发病死亡仔猪，分别取肺脏和淋巴结，置于-70℃超低温冰箱中保存备用。PK-15细胞由本研发中心保存，使用含10％犊牛血清的GibcoMEM培养基与37℃的5％CO₂培养箱培养。

1.2病料的处理

剪取一定体积病料，加入5倍体积的5％血清的MEM，使用玻璃研磨器研磨，匀浆经12000rpm4℃离心10min，上清使用0.22μm滤器过滤除菌待用。

1.3引物设计

根据已发表的PCV2序列设计PCV2特异性检测引物，采用PCR方法扩增病毒基因序列，并进行序列测定与分析，建立PCR检测方法，PCR产物长度为264bp。引物由上海生工生物公司合成，引物序列如下：

PCV2R：5'-TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT-3'；

PCV2F：5'-CCGCACCTTCGGATATACTG-3'。

1.4PCR检测

用基因组DNA提取试剂盒提取PCV2基因组，作为PCR检测用模板DNA。建立25μLPCR反应体系：ddH₂O12.5μL，10×ExTaqbuffer2.5μL，dNTPMixture(2.5mmol/L)4μL，20μmol/L上下游引物各0.5μL，LATaq0.25μL，基因组模板4μL。PCR反应条件如下：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，30循环；循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

1.5PCV-2的分离与培养

RT-PCR检测为阳性的病料上清过滤除菌后，接种于已长至90％的单层PK-15细胞上，每个T-25细胞瓶1mL，放入37℃的5％CO₂培养箱中孵育1h，弃上清并加入含2％胎牛血清的MEM9mL继续37℃培养，连续传至第3代。

采用微载体悬浮培养圆环病毒：当细胞培养到达第四天时沉降微载体，排出细胞培养袋中液体，加入PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，加入病毒维持液并接种PCV-2F3代病毒，其中病毒接种剂量为5％、病毒增值的培养基为含2％血清的MEM，pH值7.4，温度35℃。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体并检测样品TCID₅₀，96h后停止培养，收获病毒液，于-30℃冻融两次，得到猪圆环病毒液，连续传15代。

1.6毒价测定

将PCV2培养液用2％牛血清MEM做10倍系列稀释，取10⁴、10⁵、10⁶3个稀释度，每个稀释度接种96孔细胞培养板培养的PK-15细胞各5个复孔，在37℃条件下培养3天，用IFA方法进行染色，以细胞内可见典型的黄绿色荧光判为阳性，按ReedMuench氏法计算病毒的TCID₅₀值。

1.7免疫荧光技术鉴定

待细胞长到半铺满时，倾去培养液，接种病毒悬液，于37℃感作1～1.5小时；加入2％MEM营养液继续培养至细胞铺满，弃去上清液，用终浓度为0.3MD-氨基葡萄糖37℃处理30min。弃掉D-氨基葡萄糖液，用无血清MEM营养液洗两次后，每孔加入1.0mL2％牛血清MEM培养基，继续培养72h，进行间接免疫荧光(IFA)检测。将细胞用预冷的丙酮固定10min，用PBS清洗3次，自然干燥，于4度保存备用。取固定的96孔细胞培养板，每孔加入50μL用PBS1:20倍稀释的PCV-2阳性血清，37℃湿盒作用45min，然后用PBS清洗3次，每次5min，清洗后每孔加入1:100倍稀释的FITC-兔抗猪IgG(稀释液为含1/10000伊文斯兰的PBS)，37℃湿盒作用45min，PBS清洗3次，每次5min，清洗后自然晾干，置荧光显微镜下观察。

2.实验结果

2.1猪圆环病毒2型Yh-1株分离鉴定

用引物对从临床病料基因组中扩增PCV2阳性病料，扩增出了PCV2相应大小的特异性片段，约264bp，与预期结果相符，如图1所示。选取阳性病料组织，将处理的病料上清液接于PK-15细胞，传至第3代后，用间接免疫荧光进行检测。免疫荧光试验结果表明，用PCV2单克隆抗体检测为阳性，在感染的细胞浆内发出特异性的绿色荧光，有的充满整个胞浆，有的成块状，而细胞核内无荧光，呈暗黑色(图2A)；而细胞对照无荧光斑(图2B)

2.2PCV2Yh-1株增殖

通过连续传代获得了稳定高滴度的PCV-2病毒(表1)，并且在培养过程中不需要D-氨基葡萄糖的添加。

表1病毒传代培养

病毒代次	TCID₅₀/1.0ml
		F4	1.0×10^6.70
F5	1.0×10^7.10
		F6	1.0×10^7.20
F7	1.0×10^7.31
		F8	1.0×10^7.40
F9	1.0×10^7.50
		F10	1.0×10^7.61
F11	1.0×10^7.90
		F12	1.0×10^7.81
F13	1.0×10^7.86
		F14	1.0×10^7.90
F15	1.0×10^7.90

实施例2猪圆环病毒2型Yh-1株的灭活疫苗的制备

1、实验方法

1.1病毒灭活

PCV-2Yh-1株F15代病毒液按总量的0.2％加入甲醛溶液，振摇5分钟后置37℃下灭活20h，期间振摇3～4次，每次3分钟。灭活液于2～8℃保存。

1.2灭活检验

取PCV-2Yh-1株灭活病毒液，50倍稀释接种已长成单层的pk-15细胞，每个样品接种4瓶，每瓶1mL，吸附1h后，加维持液至原量37℃继续培养4d，应无细胞病变出现；继续培养，再盲传2代，再用间接免疫荧光和PCR方法检测病毒。同时设有同批未经灭活的病毒液为对照。

1.3灭活疫苗的制备及性状检验

1.3.1油相制备

取美国埃索Marcol52油佐剂94份(以毫升为单位)，加入硬脂酸铝2份(以克为单位)，边加边搅拌，直到透明为止，再加入6份司本80(以毫升为单位)，充分混匀，高压灭菌备用。

1.3.2水相制备

在96份灭活的病毒液中加4份灭菌吐温-80，充分摇动，直到吐温-80彻底溶解。

1.3.3乳化

取6份油相放入胶体磨中。开动机器慢速搅拌，同时徐徐加入3份水相，加完后以8000-10000r/min乳化2.5分钟，然后加入1份水相，继续搅拌30秒，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一。

1.3.4外观

白色乳剂。

1.3.5型剂

油包水型，将疫苗数滴滴于冷水表面，不扩散，呈规则圆形。

1.3.6稳定性

疫苗置37℃下21d，不应有破乳、分层现象；将疫苗装入小离心管中，经3000r/min离心15min，不出现分层。

1.3.7粘度

用出口内径为1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右室温下，令其垂直流出，在8s内应流出0.4mL以上判为合格。

2.实验结果

2.1病毒灭活效果检验

取PCV2Yh-1株灭活病毒液，10倍稀释接种已长成单层的PK-15细胞，每个样品接种4瓶，每瓶1mL，37℃继续培养72h，然后进行间接免疫荧光检测(IFA)，接种瓶无发黄绿色荧光的细胞出现，继续培养，再盲传2代，均应无发黄绿色荧光细胞出现，PCR检测，应无PCV2的病毒DNA检出。

2.2灭活疫苗性状检验

外观为白色乳液，油包水型灭活疫苗。将研制的油乳剂苗置37℃条件下，21d内疫苗不分层、不破乳。以3000r/min离心15min，疫苗不分层、不破乳。用1mL吸管(内径约为1.2mm)在25℃室温下吸满1mL疫苗，垂直放出在3s流出0.4mL以上，适合于注射用。

实验例2猪圆环病毒2型灭活苗的安全性试验

将15头4-5周龄PRRSV阴性仔猪随机分成3组，5头/组，I组免疫灭活苗单倍剂量，II组免疫灭活苗双倍剂量，III组注射乳化后的MEM培养基2mL作为对照。在免疫前测量体温，免疫后7d每天测定体温；免疫后连续14d观察猪群的采食情况，触摸局部，有无肿块。免疫后28d，每组解剖2头猪，观察疫苗的吸收状况。

测定了单倍剂量和双倍剂量免疫前和免疫后猪的体温状况。免疫前后猪没有体温升高的现象。猪群采食和精神正常。单倍剂量和双倍剂量疫苗注射后，连续观察14d，均未见注射部位有肿块出现，免疫后28d，每组解剖2头猪，注射部位也未见有白色油乳剂样物质存在，疫苗吸收很完全。说明单倍和2倍剂量接种后对猪是安全的。

实验例3猪圆环病毒2型灭活苗的免疫原性试验

1.实验方法

1.1试验分组及免疫方案

将20头3-4周龄PCV-2抗体阴性仔猪随机分成5组，5头/组，group1、group2、group3和group4组分别用含10^4.0TCID₅₀、10^5.0TCID₅₀、10^6.0TCID₅₀和10^7.0TCID₅₀等不同抗原含量的灭活苗免疫2mL，IV组注射乳化后的MEM培养基2mL作为对照组，均颈部肌肉注射免疫。分别于免疫后1、2、3、4周采血，ELISA测定抗体水平。

1.2攻毒方案

免疫四周后分别颈部肌肉注射PCV-2Yh-1株强毒3mL(含毒量10⁵TCID₅₀/mL)，观察28天，攻毒后逐日测量体温，观察临床症状，并于攻毒前和攻毒21日称重后扑杀。分别于攻毒后3、6、9、12、21d采血，PCR方法检测血液中PCV-2。试验结束时，解剖所有猪只，PCR方法检测淋巴结、肺脏、心脏、肝脏、扁桃体、脾脏和肾脏中的PCV-2。

2.实验结果

2.1不同含量制备灭活疫苗的抗体检测

将注射圆环病毒2型疫苗的试验组的7d、14d、21d、28d的抗体按照PCV2ORF2-ELISA试剂盒说明书进行检测，OD值>0.42为+，OD值<0.32为阴性，检测结果统计如表2。

10^6.0TCID₅₀组、10^5.0TCID₅₀组、10^7.0TCID₅₀PCV-2制备的灭活苗能够刺激机体产生较好的体液免疫，免疫后7天抗体转阳，而后抗体一直处于上升趋势。10^4.0TCID₅₀组和未免疫对照组始终未检测到特异性抗体。说明制备PCV-2Yh-1株灭活疫苗的抗原含量需要达到10^5.0TCID₅₀才有效果。

表2PCV-2疫苗免疫抗体检测结果

2.2攻毒后临床和体温观察

攻毒后第3天，group2-4组未出现可观察到的体温反应。而group1组与group5(对照组)则出现明显的体温升高(>40.5℃即为发热)，并且高体温水平持续更长的时间(图3)。

表3结果表明免疫后21天，仔猪抗体全部转阳，攻毒后，group3-4免疫组保护率可达100％，所有试验动物均未发病。

表3各组的保护效力

注：仔猪发病判定标准：1、临床症状连续3日体温升高至40℃以上；精神食欲下降，生长迟缓，消瘦；皮肤出现红色丘疹，腹股沟淋巴结肿大。2、病毒抗原检测用PCR检测淋巴结组织，应检测到PCV2抗原。3、相对日增重标准；根据每组中每头猪的相对日增重来计算每组猪的平均相对日增重，将各组猪的平均相对日增重与空白对照组的平均相对日增重进行比较，试验组的平均相对日增重显著低于空白对照组(P＜0.05)时即判为发病。符合以上3条中任何2条，即可判为发病。

Claims

1.一株分离的猪圆环病毒(Porcinecircovirus)2型Yh-1株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCCNo.10409。

2.权利要求1所述猪圆环病毒2型Yh-1株在制备预防或治疗由猪圆环病毒所引起的疾病疫苗中的应用。

3.一种预防或治疗由猪圆环病毒所引起的各种疾病的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫上有效量的权利要求1所述的猪圆环病毒2型Yh-1株和药学上可接受的佐剂。

4.一种制备预防或治疗由猪圆环病毒所引起的各种疾病的灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)扩增权利要求1所述的猪圆环病毒2型Yh-1株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述扩增为采用PK-15细胞培养猪圆环病毒2型Yh-1株。

6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)按照质量g/体积mL计，灭活剂与病毒液的比例为0.02：100；所述灭活剂为甲醛。

7.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

步骤(3)所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4：96混合均匀；

所述油相制备包括：将油佐剂、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94：6：2混合均匀。

8.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)将水相和油相按照体积比1：1.5混合均匀。

9.权利要求4至8任何一项所述制备方法制备得到的灭活疫苗。