CN105950571B - 一种基于鲤鱼上皮瘤细胞epc的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒isknv的增殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。所述增殖方法为：培养EPC细胞系；用ISKNV感染EPC细胞，恒温培养后收集培养液上清；再用培养液上清中的ISKNV感染EPC细胞，重复操作2～3次，ISKNV毒种复壮后，取培养液上清液氮保存，作为ISKNV扩增毒种；用复壮后的ISKNV毒种感染EPC细胞，恒温培养至CPE>80％，收集上清液，获得ISKNV病毒粒子。本发明以EPC细胞系作为ISKNV感染的敏感细胞，EPC细胞系商品化程度高，易于获得，容易培养，并且和鳜鱼的亲缘关系较远，可大大降低ISKNV用于灭活疫苗时的纯化难度，减少不良反应。

Description

一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒 ISKNV的增殖方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。
背景技术
鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)于1998年从鳜鱼中分离出来。该病毒在细胞质内复制与组装，直径为150nm，是细胞质双链线状DNA病毒。ISKNV对鳜鱼、石斑鱼、大黄鱼等多种海淡水养殖鱼类的致死率极高，是危害我国养殖鱼类最严重的病毒病之一。ISKNV能感染鳜鱼脾、肾、肝、鳃、脑、性腺、心脏和消化道等组织器官，脾、肾为其主要感染器官。感染实验表明ISKNV能够通过四种方式感染宿主：(1)肌肉注射；(2)划痕浸泡；(3)腹腔注射；(4)口服。四种感染方式均可导致鳜鱼发病且死亡，但前三组死亡时间在10天左右，第四组则需20天。此外，温度对ISKNV的感染有影响，24-32℃是其适合的流行温度，当温度降到20℃时，鳜鱼脾肾坏死病并不发生大规模爆发。
ISKNV感染范围广，垂直传播+水平传播的感染，使得鳜鱼养殖病害频发，经济损失巨大。目前没有针对性的鱼用药物，疫苗免疫是目前控制该病的唯一有效途径，所以ISKNV病毒的大量扩增技术，纯度要求对于灭活疫苗的生产尤为重要。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)EPC细胞的培养：将EPC细胞接种于培养基，培养至细胞长成单层，细胞数量>106/mL；
(2)ISKNV毒种的制备：取EPC细胞，向其中加入含ISKNV病毒的感染液，恒温培养后，收集培养液上清；
(3)ISKNV毒种的复壮：另取EPC细胞，向其中加入收集的培养液上清，用培养液上清中的ISKNV病毒感染EPC细胞，恒温培养后，再次收集培养液上清；重复此步骤2～3次；
(4)ISKNV毒种经多次复壮后，取培养液上清液氮保存，作为ISKNV病毒扩增毒种；
(5)利用ISKNV病毒扩增毒种感染EPC细胞，恒温培养至细胞裂解比例>80％，收集上清液，ISKNV病毒粒子即存在于所述上清液中。
上述方案中，步骤(1)所述培养基为含10％(质量浓度)胎牛血清的M199培养基。
上述方案中，步骤(1)中EPC细胞的培养时间为2～3天。
上述方案中，步骤(2)所述感染液还含有2％(质量浓度)胎牛血清。
上述方案中，步骤(2)所述感染液为含有2％(质量浓度)胎牛血清和ISKNV病毒的M199培养基。
上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述恒温培养的温度为25℃，时间为8～12天。
上述方案中，步骤(5)所述恒温培养的温度为25℃，时间为5～6天。
上述方案中，对步骤(5)收集的上清液进一步离心后取上清液，所述上清液中ISKNV病毒粒子的含量>109/mL。
上述方案中，所述离心的转速为12000rpm。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用贴壁培养的EPC细胞系作为ISKNV感染的敏感细胞，EPC细胞系商品化程度高，易于获得，容易培养，培养成本低廉，生长迅速，并且和鳜鱼的亲缘关系交远，将其用于ISKNV病毒灭活疫苗生产时，将大大降低了纯化难度，减少灭活疫苗的不良反应；
(2)本发明将ISKNV病毒连续传代复壮后感染EPC细胞，显著提高了ISKNV病毒对EPC细胞的亲和力，获得的ISKNV病毒扩增毒种用于后续的病毒扩增，极大的缩短了ISKNV病毒的扩增时间，将平均培养时间从10天减少到5天，即可达到CPE>80％，大大节约了病毒增殖时间；
(3)本发明进一步还通过控制培养条件来影响ISKNV病毒增值，高浓度的胎牛血清有利于EPC细胞快速、旺盛生长，低浓度的胎牛血清更有利于ISKNV病毒感染EPC细胞，通过控制培养环境调整EPC细胞生长状态，可以使ISKNV病毒得到快速扩增，同时EPC细胞的贴壁生长，可以减少培养液上清中的细胞碎片，有利于提高培养液上清中ISKNV病毒的纯度；
(4)本发明所述ISKNV病毒增殖方法为低成本的ISKNV疫苗生产提供了技术支撑。
附图说明
图1为EPC细胞形态的显微镜图。
图2为ISKNV感染EPC细胞出现CPE的显微镜图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中，商品化的鲤鱼上皮瘤细胞由本实验室保存；ISKNV病毒株由本实验室分离保存；M199培养基、胎牛血清、胰酶为BI公司生产。
本发明中ISKNV病毒粒子的含量的测定方法如下：
第一天，细胞准备：将生长状态良好的EPC细胞消化计数后稀释至1×106/mL，加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备10个孔；放入25℃，5％CO2培养箱中培养。
第二天，加病毒：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度；稀释方法如下：准备10个1.5mL EP管，每管加入90μL培养液，往第一个管中加入10μL病毒原液，混匀后，吸取10μL加入第二个管混匀；依此类推，做十个稀释度；吸去96孔板中原有的培养液，向96孔板中加入含稀释好的病毒感染液；并做好标记。
第三天，追加培养液：在每个孔再加入100μL完全培养液(含10％胎牛血清的M199培养基)，利于细胞的生长。
第五天，观察结果并计算滴度：在显微镜下观察CPE，并数出最后两个有CPE个数；假设为X和Y，则滴度(TU/mL)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(μL)。
实施例1
一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，包括如下步骤：
(1)EPC细胞的培养：将EPC细胞接种于含10％(质量浓度)胎牛血清的M199培养基中，25℃恒温培养2天，至细胞长成单层，细胞数量>106/mL；
(2)ISKNV毒种的制备：取EPC细胞，向其中加入含ISKNV病毒的感染液(感染液为含2wt％胎牛血清、ISKNV病毒的M199培养基)，恒温培养后，收集培养液上清；
(3)ISKNV毒种的复壮：另取EPC细胞，向其中加入收集的培养液上清，用培养液上清中的ISKNV病毒感染EPC细胞，25℃恒温培养10天后，再次收集培养液上清；重复此步骤2次；
(4)ISKNV毒种经多次复壮后，取培养液上清液氮保存，作为ISKNV病毒扩增毒种；
(5)利用ISKNV病毒扩增毒种感染EPC细胞，25℃恒温培养5天后，细胞裂解比例>80％，收集上清液，进一步将收集的上清液12000rpm离心后，再取上清，所述上清中含有高纯度的ISKNV病毒粒子。
采用本发明所述ISKNV病毒粒子含量的测定方法检测本实施例收集的上清中ISKNV病毒粒子的含量，检测结果显示，所述上清中ISKNV病毒粒子的含量>109/mL。
同时对本实施例所得ISKNV病毒的上清液的成本进行分析，分析结果如下：采用T25细胞培养瓶培养，可获得5mL病毒液，经细胞计数，病毒含量>109/mL，其中培养基60元/500mL，胎牛血清350元/100mL，培养过程中用胎牛血清0.6mL，培养基10mL，成本约3.3元，获得病毒计数为5Χ109，即经济成本：1.52Χ109/元。时间成本，细胞培养2天，病毒接种5天，共计7天，时间成本：7.14Χ108/天。大量增殖时成本还将大幅降低。本方法建立在EPC细胞对ISKNV敏感，细胞生长活跃，病毒的亲和力通过多次传代得到增强的基础上，极大的降低了生产成本和时间成本，具有很强的产业化应用前景。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）EPC细胞的培养：将EPC细胞接种于培养基中，培养至细胞长成单层，细胞数量>106/mL；
（2）ISKNV毒种的制备：取EPC细胞，向其中加入含ISKNV病毒和2%胎牛血清的感染液，恒温培养后，收集培养液上清；所述恒温培养的温度为25℃，时间为8~12天；
（3）ISKNV毒种的复壮：另取EPC细胞，向其中加入收集的培养液上清，用培养液上清中的ISKNV病毒感染EPC细胞，恒温培养后，再次收集培养液上清；重复此步骤2~3次；所述恒温培养的温度为25℃，时间为8~12天；
（4）ISKNV毒种经多次复壮后，取培养液上清液氮保存，作为ISKNV病毒扩增毒种；
（5）利用ISKNV病毒扩增毒种感染EPC细胞，恒温培养至细胞裂解比例>80%，收集上清液，ISKNV病毒粒子即存在于所述上清液中；所述恒温培养的温度为25℃，时间为5~6天。
2.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步骤（1）所述培养基为含10%胎牛血清的M199培养基。
3.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步骤（1）中EPC细胞的培养时间为2~3天。
4.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步骤（2）中所述感染液为含有ISKNV病毒和2%胎牛血清的M199培养基。
5.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，对步骤（5）收集的上清液进一步离心后取上清液，所述上清液中ISKNV病毒粒子的含量>109/mL。
6.根据权利要求5所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，所述离心的转速为12000rpm。
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