CN102793917A

CN102793917A - 猪乙脑疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102793917A
Application number: CN2012102588362A
Authority: CN
Inventors: 熊炜; 高杨; 刘俊生; 刘延亭
Original assignee: BEIJING ZHONGLIANKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING ZHONGLIANKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-07-24
Also published as: CN102793917B

Abstract

本发明涉及猪乙脑疫苗及其制备方法。其中，制备猪乙脑疫苗的方法包括：利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养，以便获得BHK-21细胞悬浮液；将SA14-14-2株乙脑病毒接种于BHK-21细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集乙脑病毒的培养液；以及将富集乙脑病毒的培养液依次进行冻融和离心，以便收集富集的乙脑病毒，获得猪乙脑疫苗。利用该方法，能够以工业化规模、高效地生产猪乙脑疫苗，并且获得的猪乙脑疫苗质量优良，病毒含量高，能够有效地用于猪乙脑预防接种，且免疫效力高、免疫效果稳定。

Description

猪乙脑疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及猪乙脑疫苗及其制备方法。

背景技术

乙型脑炎简称乙脑，是由乙型脑炎病毒引起的一种人畜共患传染病。本病最早发现于日本，所以又称日本乙型脑炎。乙脑是人畜共患的自然疫源性疾病，人与许多动物都可以成为本病的传染源，乙脑是严重威胁人类和动物健康的传染性疾病，对畜牧业造成严重的危害。在动物中，猪是主要的乙脑病毒的主要宿主，乙脑病毒必须依靠吸血雌蚊作媒介进行传播，流行环节是猪-蚊-猪。自然环境中，猪的感染率很高，仔猪经过一个流行季以后几乎100%感染。猪感染乙脑后多出现高热，精神沉郁或有神经症状，食欲减退，有的出现麻痹症状。

由于乙型脑炎是由蚊子叮咬而引起的，我们无法完全消灭蚊子也无法阻止猪只不被蚊子咬，因此，注射疫苗成为预防乙型脑炎的首选。然而，目前的乙脑疫苗制备方法效率低，制备的乙脑疫苗病毒含量低、免疫效力低、免疫效果不稳定。

因此，目前制备乙脑疫苗的方法仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

现阶段，我国使用猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2株）进行猪预防接种，注射后3周可产生坚强的免疫力，能有效预防猪乙脑的发生。目前商业化的猪乙型脑炎活疫苗采用原代地鼠肾细胞转瓶工艺进行生产，由于原代细胞制备过程复杂，并且使用转瓶培养细胞，整个生产过程完全采用人工手工操作，容易造成制品的污染以及产品质量的不稳定，不适合乙脑疫苗工业化大规模生产。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的申请人经过艰苦的努力寻找并发现了可解决上述技术问题的关键因素——BHK-21细胞。BHK-21细胞是一种可连续传代培养的地鼠肾细胞，已经成功用于猪口蹄疫疫苗、犬狂犬病疫苗的生产，是一种良好的疫苗生产用细胞。与原代地鼠肾细胞比较，使用BHK-21细胞制备疫苗，由于BHK-21细胞可连续传代培养，经多代扩增培养后可得到大量细胞用于制备疫苗，因此克服了细胞来源限制问题。同时由于BHK-21细胞可采用生物反应器悬浮培养，在严格可控的培养条件下，细胞能在最适合的条件下生长繁殖，细胞生长迅速且状态良好，培养获得的细胞密度远远高于转瓶培养，更适合工业化生产。

此外，本发明的发明人还发现，BHK-21细胞对乙脑病毒敏感，接种乙脑病毒后3-4天出现细胞病变，适于乙脑病毒的培养。

由此，本发明提出了一种乙脑疫苗及其制备方法。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种制备猪乙脑疫苗的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养，以便获得BHK-21细胞悬浮液；将SA14-14-2株乙脑病毒接种于BHK-21细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集乙脑病毒的培养液；以及将富集乙脑病毒的培养液依次进行冻融和离心，以便收集富集的乙脑病毒，获得猪乙脑疫苗。发明人惊奇地发现，利用该方法，能够以工业化规模、高效地生产猪乙脑疫苗，并且获得的猪乙脑疫苗质量优良，病毒含量比现有商业化转瓶制备的疫苗高10倍，能够有效地用于猪乙脑预防接种，且免疫效力高、免疫效果稳定。此外，根据本发明的实施例，该方法还具有设备体积小、节省空间，放大容易，工艺可控性好，对操作人员要求不高等优点。

根据本发明的实施例，在本发明的制备猪乙脑疫苗的方法中，利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养的方法不受特别限制，只要能够将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养，获得大量可用于疫苗制备的细胞即可。根据本发明的一些实施例，利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养可以进一步包括：于摇瓶中，利用含10体积%新生牛血清的MD611培养基将BHK-21种子细胞依次进行第一悬浮培养和转种培养，以便获得第一BHK-21细胞悬浮液，其中经过第一悬浮培养的BHK-21种子细胞的细胞密度不小于2×10⁶细胞/ml，优选不小于2.3×10⁶细胞/ml，第一BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于2.5×10⁶细胞/ml；将第一BHK-21细胞悬浮液接种于第一生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，进行第二悬浮培养，以便获得第二BHK-21细胞悬浮液，该第二BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于2×10⁶细胞/ml，优选不小于3.4×10⁶细胞/ml；将第二BHK-21细胞悬浮液接种于第二生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，进行第三悬浮培养，以便获得前述的BHK-21细胞悬浮液，该BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于1.5×10⁶细胞/ml，其中，第二生物反应器的容量大于第一生物反应器，第一生物反应器的容量大于摇瓶。由此，能够有效地将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养，从而能够获得大量可用于疫苗制备的细胞。

此外，根据本发明的实施例，前述的第一悬浮培养、转种培养、第二悬浮培养以及第三悬浮培养的培养条件以及所采用的设备均不受特别限制，只要适于将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养即可。根据本发明的一些优选实施例，摇瓶的容量为250ml，第一生物反应器的容量为10L，第二生物反应器的容量为100L，由此，能够逐步、有效地将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养，从而能够获得大量可用于疫苗制备的细胞。根据本发明的具体示例，第一悬浮培养是在37℃温度，120rpm转速下培养3-4天，由此，能够有效地使经过第一悬浮培养的BHK-21种子细胞的细胞密度不小于2.3×10⁶细胞/ml，以便进行后续的转种培养，进而能够进行后续的传代扩增培养。根据本发明的一些实施例，转种培养是按1：4的体积比例进行细胞转种，在37℃温度，120rpm转速下培养3-4天，由此，能够有效地使第一BHK-21细胞悬浮液中的细胞密度不小于2.5×10⁶细胞/ml，进而能够进行后续的传代扩增培养，以便实现细胞的扩增。根据本发明的另一些实施例，第二悬浮培养是在36-37℃温度，80-100rpm转速，pH 7.1-7.2，溶氧浓度40-60%下培养4-5天，优选在36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下培养4天，由此，能够有效地使第二BHK-21细胞悬浮液中的细胞密度不小于3.4×10⁶细胞/ml，进而能够进行后续的第三悬浮培养，从而实现细胞的传代扩增。根据本发明的一些具体示例，第三悬浮培养是在36-37℃温度，80-100rpm转速，pH 7.1-7.2，溶氧浓度40-60%下培养2-3天，优选在36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下培养3天，由此，能够有效地获得细胞密度不小于1.5×10⁶细胞/ml放入BHK-21细胞悬浮液，从而能够成功地通过连续传代扩增获得大量可用于疫苗制备的细胞。

根据本发明的实施例，在本发明的制备猪乙脑疫苗的方法中，SA14-14-2株乙脑病毒的病毒滴度不小于10^8.0TCID₅₀/ml。由此，能够使SA14-14-2株乙脑病毒有效地感染BHK-21细胞，并能够通过培养高效地生产富集乙脑病毒，从而能够有效地获得富集乙脑病毒的培养液。其中，需要说明的是，本文中所使用的术语“病毒滴度”是指病毒的含量，衡量病毒滴度的单位有最小致死量（MLD）、最小感染量（MID）、半数致死量（LD50），以感染发病作指标的半数感染量（ID50），鸡胚半数致死量（ELD50）、鸡胚半数感染量（EID50），以及试验的材料是细胞时所用的组织细胞培养半数感染量（TCID₅₀），而本文中即是采用组织细胞培养半数感染量（TCID₅₀）作为病毒滴度的单位。此外，还需要说明的是，本发明中是采用96孔细胞板测定乙脑病毒和疫苗的病毒滴度的。具体地：用含0.3重量%牛血清白蛋白的MD611培养基将待检病毒液和疫苗进行10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，接种于长满BHK-21细胞的96孔细胞板中，每稀释度接种4孔，每孔接种30μl，于37℃下孵育1h后，每孔再补加含0.3体积%牛血清白蛋白的MD611培养基70μl，于36-37℃下培养5天，观察细胞病变，并计算TCID₅₀。

根据本发明的实施例，在本发明的制备猪乙脑疫苗的方法中，将SA14-14-2株乙脑病毒接种于所述BHK-21细胞悬浮液中进行培养的方法和具体步骤不受特别限制，只要能够有效地进行病毒培养和生产，获得富集乙脑病毒的培养液即可。根据本发明的一些具体示例，将SA14-14-2株乙脑病毒接种于所述BHK-21细胞悬浮液中进行培养可以进一步包括：将SA14-14-2株乙脑病毒按照1：100的比例接种于BHK-21细胞悬浮液中，并于36-37℃温度，80-100rpm转速，pH7.2-7.4，溶氧浓度40-60%下培养3天，优选于35℃温度，90rpm转速，pH7.3，溶氧浓度50%下培养3天。由此，能够有效地进行病毒培养，获得富集乙脑病毒的培养液。根据本发明的实施例，富集乙脑病毒的培养液中细胞的密度不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，采用前述培养方法培养3天后，获得的富集乙脑病毒的培养液中细胞密度不小于3.3×10⁶细胞/ml。

此外，获得富集乙脑病毒的培养液后，需要从中分离培养富集的乙脑病毒。根据本发明的实施例，在本发明的制备猪乙脑疫苗的方法中，从富集乙脑病毒的培养液中收集富集的乙脑病毒的方法不受特别限制，可以通过将富集乙脑病毒的培养液依次进行冻融和离心来实现。根据本发明的一些具体示例，于-20℃下进行所述冻融两次，由此，能够使细胞充分裂解破碎，方便病毒的分离。根据本发明的一些实施例，于2000rpm转速下进行离心，并弃去沉淀，由此，能够有效地收集富集的乙脑病毒。

根据本发明的实施例，在本发明的制备猪乙脑疫苗的方法中，富集的乙脑病毒的病毒滴度不小于10^7.5TCID₅₀/ml，优选为10^8.3TCID₅₀/ml。由此，本发明富集的乙脑病毒能够有效地进行猪乙脑疫苗的制备。

具体地，根据本发明的一些实施例，本发明的制备猪乙脑疫苗的方法还可以包括：

于摇瓶中，在37℃温度，120rpm转速下，利用含10体积%新生牛血清的MD611培养基将BHK-21种子细胞进行第一悬浮培养3-4天，至细胞密度不小于2.3×10⁶细胞/ml时，按照1：4的比例，于37℃温度，120rpm转速下进行转种培养3-4天，以便获得第一BHK-21细胞悬浮液，其中第一BHK-21细胞悬浮液中细胞密度为2.5×10⁶细胞/ml；将第一BHK-21细胞悬浮液接种于的第一生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，于36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下进行第二悬浮培养4天，以便获得第二BHK-21细胞悬浮液，该第二BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于3.4×10⁶细胞/ml；将第二BHK-21细胞悬浮液接种于第二生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，于36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下进行第三悬浮培养3天，以便获得BHK-21细胞悬浮液，该BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于1.5×10⁶细胞/ml，其中，第二生物反应器的容量大于第一生物反应器，第一生物反应器的容量大于转瓶；

将SA14-14-2株乙脑病毒按照1：100的比例接种于BHK-21细胞悬浮液中，并于35℃温度，90rpm转速，pH 7.3，溶氧浓度50%下培养3天，以便获得富集乙脑病毒的培养液；以及

将富集乙脑病毒的培养液于-20℃下进行冻融两次，然后于2000rpm转速下进行离心，并弃去沉淀，以便收集富集的乙脑病毒，经过配制、冻干后获得猪乙脑疫苗。

此外，需要说明的是，相比现阶段的采用原代地鼠肾细胞转瓶工艺生产猪乙脑疫苗的方法，本发明的制备猪乙脑疫苗的方法至少具有以下优点：

本发明所采用的BHK-21细胞，可连续传代扩增获得大量的细胞用于疫苗的制备，细胞来源不受限制；本发明所采用的BHK-21细胞，适于乙型脑炎病毒的培养，病毒产量高；本发明采用生物反应器悬浮培养BHK-21细胞，获得的细胞密度比转瓶培养工艺高5-10倍，并且能够精确控制细胞和病毒的培养条件，实现了生产过程工艺化控制，能制备高病毒含量的产品，可实现猪乙型脑炎病毒的工业化规模生产；并且，本发明利用生物反应器进行疫苗生产，具有设备体积小，节省空间，放大容易，工艺可控性好，对人员要求不高等优点。

根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种猪乙脑疫苗。根据本发明的实施例，该猪乙脑疫苗是通过本发明的制备猪乙脑疫苗的方法制备的。发明人惊奇地发现，本发明的猪乙脑疫苗质量优良，病毒含量比现有商业化转瓶制备的疫苗高10倍，能够有效地用于猪乙脑预防接种，并且免疫效力高、免疫效果稳定。

具体地，根据本发明的实施例，本发明的猪乙脑疫苗可以包含：病毒滴度不小于10^7.5TCID₅₀/ml，优选为10^8.3TCID₅₀/ml的SA14-14-2株乙脑病毒；1重量%的明胶；以及5重量%的蔗糖。

此外，根据本发明的实施例，本发明的猪乙脑疫苗的形式不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，猪乙脑疫苗呈冻干状态。

需要说明的是，相比现有的商业化转瓶工艺制备的猪乙脑疫苗，本发明的猪乙脑疫苗至少具有以下优点：

本发明的猪乙脑疫苗，病毒含量比现有商业化转瓶制备的疫苗高10倍，质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定，有效填补了国内空白。

此外，还需要说明的是，本发明的制备猪乙脑疫苗的方法生产的猪乙脑疫苗为猪乙型脑炎活疫苗，能够有效地用于猪乙脑预防接种。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的制备猪乙脑疫苗的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

一般方法：

参考图1，本发明的制备猪乙脑疫苗的方法可以包括：

（1）生物反应器悬浮培养BHK-21细胞

于摇瓶中，在37℃温度，120rpm转速下，利用含10体积%新生牛血清的MD611培养基将BHK-21种子细胞进行第一悬浮培养3-4天，至细胞密度不小于2.3×10⁶细胞/ml时，按照1：4的比例，于37℃温度，120rpm转速下进行转种培养3-4天，以便获得第一BHK-21细胞悬浮液，其中第一BHK-21细胞悬浮液中细胞密度为2.5×10⁶细胞/ml；将第一BHK-21细胞悬浮液接种于的第一生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，于36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下进行第二悬浮培养4天，以便获得第二BHK-21细胞悬浮液，该第二BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于3.4×10⁶细胞/ml；将第二BHK-21细胞悬浮液接种于第二生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，于36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下进行第三悬浮培养3天，以便获得BHK-21细胞悬浮液，该BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于1.5×10⁶细胞/ml，其中，第二生物反应器的容量大于第一生物反应器，第一生物反应器的容量大于转瓶。

（2）SA14-14-2株病毒接种与培养

将SA14-14-2株乙脑病毒按照1：100的比例接种于BHK-21细胞悬浮液中，并于35℃温度，90rpm转速，pH 7.3，溶氧浓度50%下培养3天，以便获得富集乙脑病毒的培养液。

（3）分离病毒

将富集乙脑病毒的培养液于-20℃下进行冻融两次，然后于2000rpm转速下进行离心，并弃去沉淀，以便收集富集的乙脑病毒，获得猪乙脑疫苗。

实施例1：猪乙脑疫苗的制备

1)生物反应器悬浮培养BHK-21细胞：

取液氮保存的BHK-21种子细胞2ml，37度水浴迅速融化，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用含10体积%新生牛血清的MD611培养基50ml重悬浮，转移至250ml摇瓶中，于37℃、120rpm下进行第一悬浮培养3-4天，至细胞密度达到2.3×10⁶细胞/ml时，按照1：4的比例，于37℃温度，120rpm转速下进行转种培养3-4天，将细胞扩增至800ml体积，使细胞密度达到2.5×10⁶细胞/ml，以便获得第一BHK-21细胞悬浮液。

将上述获得的800ml第一BHK-21细胞悬浮液，接种于已灭菌的10L第一生物反应器中，加入含2体积%新生牛血清的MD611培养基8L，控制细胞培养温度36.5℃，Ph 7.15，搅拌转速90rpm，溶解氧浓度50%，进行第二悬浮培养4天，至细胞密度达到3.4×10⁶细胞/ml，以便获得第二BHK-21细胞悬浮液。

将上述获得的第二BHK-21细胞悬浮液，接种于已灭菌的100L第二生物反应器中，加入含2体积%新生牛血清的MD611培养基80L，控制细胞培养温度36.5℃，pH 7.15，搅拌转速90rpm，溶解氧浓度50%，进行第三悬浮培养3天，至细胞密度达到1.5×10⁶细胞/ml，以便获得BHK-21细胞悬浮液。

其中，所采用的MD611培养基购自清大天一公司（批号：110704）。

2)SA14-14-2株病毒接种与培养

直接向第二生物反应器中接种SA14-14-2株乙脑病毒（病毒滴度≥10^8.0TCID₅₀/ml），病毒接种量为0.8L，控制培养温度35℃，pH 7.3，搅拌转速90rpm，溶解氧浓度50%，进行病毒培养3天，至细胞密度达到3.3×10⁶细胞/ml，以便获得富集乙脑病毒的培养液。

3)分离病毒

将富集乙脑病毒的培养液于-20℃进行冻融2次，然后于2000rpm转速下进行离心10分钟，并弃去细胞沉淀物，以便收集获得富集的乙脑病毒。

然后，将获得的富集的乙脑病毒（病毒滴度为10^8.3TCID₅₀/ml），添加1重量%的明胶、5重量%的蔗糖，制成半成品，并分装冻干，以便获得猪乙脑疫苗。

实施例2：

按照《中华人民共和国兽药典（三部2010版）》（通过参照将其全文并入本文）中的检定方法和标准，对实施例1制备获得的猪乙型脑炎活疫苗和市售的地鼠肾细胞猪乙型脑炎活疫苗进行检定、比较，结果见下表。

检定项目	实施例1的疫苗	市售疫苗
			性状	合格	合格
无菌检验	符合规定	符合规定
			支原体检验	符合规定	符合规定
鉴别检验	合格	合格
			病毒含量测定	10^7.8TCID₅₀/ml	10^6.5TCID₅₀/ml
安全检验	合格	合格
			剩余水份测定	2.5%	2.6%
真空度	合格	合格
			结论	合格	合格

由上表可以看出：与市售同类产品相比，实施例1生产的猪乙型脑炎活疫苗，病毒含量高10倍以上。而病毒含量是反应疫苗中有效成分的重要指标，含量越高，免疫效果越好，对被免疫者的保护能力越强，因此，检验结果表明，通过本发明的制备猪乙脑疫苗的方法生产的猪乙脑疫苗，其质量优于市售疫苗，相对于市售疫苗，免疫效力更高，免疫效果更稳定。并且，由上表可知，本发明的猪乙脑疫苗的其他指标也均符合《中华人民共和国兽药典（三部2010版）》的标准，安全可靠。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种制备猪乙脑疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养，以便获得BHK-21细胞悬浮液；

将SA14-14-2株乙脑病毒接种于所述BHK-21细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集乙脑病毒的培养液；以及

将所述富集乙脑病毒的培养液依次进行冻融和离心，以便收集富集的乙脑病毒，获得所述猪乙脑疫苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养进一步包括：

于摇瓶中，利用含10体积%新生牛血清的MD611培养基将BHK-21种子细胞依次进行第一悬浮培养和转种培养，以便获得第一BHK-21细胞悬浮液，其中经过第一悬浮培养的BHK-21种子细胞的细胞密度不小于2.3×10⁶细胞/ml，所述第一BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于2.5×10⁶细胞/ml；

将所述第一BHK-21细胞悬浮液接种于第一生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，进行第二悬浮培养，以便获得第二BHK-21细胞悬浮液，所述第二BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于3.4×10⁶细胞/ml；以及

将所述第二BHK-21细胞悬浮液接种于第二生物反应器中，并添加含2体积%新生牛血清的MD611培养基，进行第三悬浮培养，以便获得所述BHK-21细胞悬浮液，所述BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于1.5×10⁶细胞/ml，

其中，所述第二生物反应器的容量大于所述第一生物反应器，所述第一生物反应器的容量大于所述摇瓶，

优选地，所述摇瓶的容量为250ml，所述第一生物反应器的容量为10L，所述第二生物反应器的容量为100L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一悬浮培养是在37℃温度，120rpm转速下培养3-4天，

任选地，所述转种培养是按1：4的体积比例进行细胞转种，在37℃温度，120rpm转速下培养3-4天，

任选地，所述第二悬浮培养是在36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下培养4天，

任选地，所述第三悬浮培养是在36.5℃温度，90rpm转速，pH 7.15，溶氧浓度50%下培养3天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SA14-14-2株乙脑病毒的病毒滴度不小于10^8.0TCID₅₀/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将SA14-14-2株乙脑病毒接种于所述BHK-21细胞悬浮液中进行培养进一步包括：

将SA14-14-2株乙脑病毒按照1：100的比例接种于所述BHK-21细胞悬浮液中，并于35℃温度，90rpm转速，pH 7.3，溶氧浓度50%下培养3天，

任选地，所述富集乙脑病毒的培养液中细胞密度不小于3.3×10⁶细胞/ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，于-20℃下进行所述冻融两次，

任选地，于2000rpm转速下进行所述离心，并弃去沉淀。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集的乙脑病毒的病毒滴度不小于10^7.5TCID₅₀/ml，优选为10^8.3TCID₅₀/ml。

8.一种猪乙脑疫苗，其是通过权利要求1-7任一项所述的方法制备的。

9.根据权利要求8所述的猪乙脑疫苗，其特征在于，所述猪乙脑疫苗包含：

病毒滴度不小于10^7.5TCID₅₀/ml，优选为10^8.3TCID₅₀/ml的SA14-14-2株乙脑病毒；

1重量%的明胶；以及

5重量%的蔗糖。

10.根据权利要求9所述的猪乙脑疫苗，其特征在于，所述猪乙脑疫苗呈冻干状态。