CN103789274A - 一种兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。本发明涉及疫苗的生产毒株是重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8052，该毒株系采用的表达载体为分泌表达，且含有6个组氨酸标签，易于蛋白检测分析用；用其作为生产毒株生产兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗，该疫苗不含病毒基因组，无动物安全危害和潜在散布性；免疫针对性强，能激发免疫动物产生足量的免疫抗体，并产生长久保护力。按照本发明提供的技术生产RHDV病毒样颗粒，1000L生物反应器中收获的病毒液血凝价达到1:32768～1:262144，该RHDV病毒颗粒蛋白表达量约150mg/L，每升病毒液半成品可以制成标准疫苗5000～100000头份，高于国内技术水平8～20倍；该重组亚单位疫苗添加了佐剂，有效的提高了疫苗的免疫效果，是一种明显优于现有技术生产的灭活组织疫苗的新疫苗。

Description

一种兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。该疫苗是一种应用昆虫杆状病毒表达系统生产的具有抗兔病毒性出血症作用的重组亚单位疫苗，属于兽用生物制品及生物技术领域。

背景技术

兔出血性疾病（Rabbit hemorrhagic disease,RHD）是一种具有高度传染性和致死性的疾病，宿主包括野生兔和家兔，已经成为野兔生存和家兔衍生产业发展的一个重大威胁。

RHDV（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）是引发RHD的病毒，该病毒是一个无囊膜病毒，属杯状病毒科家族（V F Ohlinger,B Haas,G Meyers,F Weiland and H J Thiel.Identification and characterization of the virus causing rabbit hemorrhagic disease.Journal ofVirology.1990(64)3331-3336；F Parra and M Prieto.Purification and characterization of acalicivirus as the causative agent of a lethal hemorrhagic disease in rabbits..Journal of Virology.1990(64)4013-4015）。RHDV颗粒由一个7.5kb的单链正向RNA基因组组成，其缠绕在一个直径约38nm的二十面体小衣壳上。RHDV衣壳蛋白（VP60）约为60kD。天然的病毒衣壳由180个VP60组成（J Barcena,N Verdaguer,R Roca,M Morales,I Angulo,C Risco,J LCarrascosa,J M Torres,J R Caston.The coat protein of Rabbit hemorrhagic disease virus contains amolecular switch at the N-terminal region facing the inner surface of the capsid.Virology.2004(322)118–134.）。

RHDV于1984年第一次在中国发现。几年之内，蔓延到韩国和欧洲大陆（S Mitro,H Krauss.Rabbit hemorrhagic disease:A review with special reference to its epizootiology.1993(9)70-78）。随后在大洋洲，北非，中东，俄罗斯，印度，古巴，美国和墨西哥以及乌拉圭爆发（A Bouslama,G M De Mia,S Hammami,T Aouina,H Soussi,T Frescura.Identication of the virus of rabbithaemorrhagic disease in Tunisia.Veterinary Research 1996(138)108-110.）。1989年，国际兽医局（OIE）将该病正式列为B类传染病，我国将其列为二类传染病。通常情况下，RHD在感染后48h～72h发作，通过急性肝损伤和弥漫性血管内凝血导致80%的成年动物死亡（

J M Martín-Alonso,P García Palencia,et al.Macrophage tropism of rabbithemorrhagic disease virus is associated with vascular pathology.Virus research.1999(60)21-28）。这种疾病具有高度的传染性，病毒能通过口腔、鼻腔或结膜方式传播。幸存的动物甚至可在病毒感染后4周内持续释放病毒。RHDV病毒能够抵抗多种极端环境，包括低pH、高温和反复冻融，使其能够在自然环境中保持稳定（S R Moss,S L Turner,R C Trout,P J White,P JHudson,A Desai,M Armesto,N L Forrester,E A.Gould Molecular epidemiology of Rabbithaemorrhagic disease virus.Journal of Genetic Virology.2002(83)2461-2467）。

RHDV缺乏有效的在体外繁殖系统，这阻碍了利用单细胞大规模生产病毒作为疫苗抗原的来源。目前，粗病毒从受感染的兔肝脏（V J L Argüello.Viral haemorrhagic disease of rabbits:vaccination and immune response.Revue scientifique et technique(International Office ofEpizootics).1991(10)459）获得，并制成灭活疫苗。这种疫苗制备方式所带来的生物安全、污染物残留和动物福利问题日益得到关注。

早期的研究表明，重组VP60可诱导保护性体液免疫应答对RHDV侵染（S Laurent,J FVautherot,M F Madelaine,G Le Gall,D Rasschaert.Recombinant rabbit hemorrhagic disease viruscapsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and inducesprotection.Journal Virology.1994(64)6794–6798）。几种表达系统中已被用来生产重组VP60的，包括细菌、酵母、植物、痘病毒载体和昆虫细胞杆状病毒表达系统；（J L Martinez-Torrecuadrada,E Cortes,C Vela,J P Langeveld,R H Meloen,K Dalsgaard,W D Hamilton,J ICasal.Antigenic structure of the capsid protein of rabbit haemorrhagic disease virus.Journal ofGenetic Virology 1998(79)1901–1909；H S Nagesha,L F Wang,A D Hyatt.(1999)Virus-likeparticles of calicivirus as epitope carriers.Archives of Virology.1999(144)2429–2439；J Plana-Duran,M Bastons,M J Rodriguez,I Climent,E Cortes,C Vela,I Casal,1996.Oral immunizationof rabbits with VP60 particles confers protection against rabbit hemorrhagic disease.Archives ofVirology.1996(141)1423–1436；；B Gromadzka,B Szewczyk,G Konopa,A Fitzner,A Kesy.Recombinant VP60 in the form of virion-like particles as a potential vaccine against rabbithemorrhagic disease virus.Acta Biochimica Polonica.2006(53)371–376）。采用基因工程的手段也被用来研究RHDV衣壳蛋白的结构和装配。然而，相关的生物安全风险和高昂的费用阻碍了重组RHDV亚单位疫苗的商业化生产。

理想的RHDV疫苗的一个重要标准就是成本低：用于兔免疫的疫苗售价每剂量仅几分钱。正如上面所提到的，使用昆虫细胞杆状病毒表达系统生产重组VP60的技术，为此提供了一种较好的选择。但众所周知，目前应用生物反应器大规模培养昆虫细胞既困难又昂贵，只有解决相关技术难题，如培养基成本、生物反应器放大技术等，才能够使该疫苗的商业化成为可能。

杆状病毒是有囊膜的DNA病毒，特异性感染昆虫，利用高效的多角体或P10启动子，被广泛用作真核表达的载体。杆状病毒表达系统的优点包括高水平表达，易于表达重组蛋白，能够表达大片段的外源基因，正确的翻译后修饰，以及良好的生物安全性等（T A Kost,J PCondreay,D L Jarvis.Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect andmammalian cells.Nature biotechnology.2005(23)567-575）。然而，通常情况下外源蛋白的表达水平仍远低于野生型病毒所表达的多角体蛋白。通过对昆虫细胞基因组进行分子水平上的改进等努力将有利于显著提高外源基因的表达量。

病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）是一种高度有效类型的亚单位疫苗半成品，它模仿病毒粒子的整体结构，却不含有传染性遗传物质。事实上，病毒样颗粒完全缺乏DNA或RNA病毒的基因组，只拥有和灭活、减毒病毒疫苗所含病毒衣壳蛋白相近的构象。通常情况下，仅较低剂量的VLPs作为抗原免疫宿主，便足以达到正常剂量全病毒疫苗所引起宿主相类似的免疫反应。它们除了能激发B细胞介导的免疫反应，也已被证明是非常有效的刺激CD4增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）响应的抗原物质。

RHDV具有约40nm的直径。在负染的电子显微照片中显示典型的杯状病毒形态，具有规则排列的杯形结构。该病毒包含一个单链正向，含有7437个核苷酸RNA基因组。包括长的编码一个2344个氨基酸残基的多聚蛋白的开放阅读框架ORF1的和一个较短的开放阅读框架ORF2。在RHDV基因组中，ORF1从10至7042的核苷酸编码一个多聚蛋白，并可以被裂解成衣壳蛋白VP60。衣壳蛋白VP60主要来自两条途径：上述多聚蛋白的水解加工和亚基因组RNA（sgRNA）的翻译（M Soledad Marín,J M Martín Alonso,L I Pérez Ordoyo García et al.Immunogenic properties of rabbit haemorrhagic disease virus structural protein VP60 expressed bya recombinant baculovirus:an efficient vaccine[J].Virus research,1995,39(2):119-128；J A Boga,M S Marin,R Casais et al.In vitro translation of a subgenomic mRNA from purified virions of theSpanish field isolate AST/89 of rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV).Virus Research.1993(26)33-40.）。重组VP60能够自我装配成病毒样颗粒，拥有立体构象，而且VP60的N端第62个氨基酸之后的氨基酸即使缺失，也不会影响其包装功能。大量研究结果证明，RHDV的衣壳蛋白VP60与病毒的致病性和免疫性密切相关：RHDV在宿主细胞中完成一个复制周期后，由VP60组装的衣壳将子代病毒RNA包裹形成完整的病毒粒子，然后细胞裂解，病毒粒子释放，继续侵染其它的敏感细胞。VP60有2个主要抗原区：一个在N端，位于第31～250位氨基酸残基处；另一个在C端，位于第477～579位氨基酸残基处。重组VP60能够自我装配成病毒样颗粒，且能模拟完整的RHDV病毒子诱导宿主的免疫系统，这一发现为研制RHDV的新型疫苗奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的安全、高效的兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗。这种疫苗含有本发明提供的重组RHDV衣壳蛋白VP60，不含有RHDV病毒基因组成分，从而避免了病毒扩散和基因组释放的风险。本发明的内容包括：

（1）本发明涉及一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在pVL1393载体PolyA后的SnaBⅠ酶切位点插入HS4序列；在多克隆位点之前插入蜂毒素信号肽；在多克隆位点中插入一个拷贝的RHDV结构蛋白VP60基因（图1）。插入绝缘子后可以显著提高VP60蛋白的表达量，而增加蜂毒素分泌信号肽可以是VP60能够为正确引导到内质网内加工，并分泌到细胞外。这样得到的蛋白表达量显著提高，且表达的蛋白绝大多数被分泌到培养上清中，避免了破碎细胞产生大量的细胞碎片，极大的简化了纯化环节。

（2）提供一种大规模低成本培养工艺，较传统工艺显著降低了成本，且采用昆虫细胞杆状病毒表达系统，整个生产过程完全在摇瓶和生物反应器中完成，符合GMP的要求，产品品质高，批次稳定，质量可控，是一种明显优于组织疫苗的新疫苗。

（3）本发明所涉及的疫苗，添加了佐剂，有效的提高了疫苗的免疫效果，间接的降低了生产成本，而传统的组织疫苗受限于含有大量组织成分，导致疫苗粘稠而无法添加任何佐剂，只能采用生理盐水稀释。

本发明的的技术路线是

（1）本发明所述重组杆状病毒的构建是：在pVL1393转移载体的PolyA后的SnaBⅠ酶切位点插入HS4序列；在多克隆位点之前插入蜂毒素信号肽；在多克隆位点中插入RHDV结构蛋白VP60序列；在外源基因的N端含有6个组氨酸的标签序列；该重组的杆状病毒被命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60株，该株病毒于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8052。

（2）该重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8052能够感染Sf9细胞并高效率的分泌表达重组亚单位蛋白VP60，该重组VP60蛋白质在功能上等同于RHDV天然VP60蛋白质并能够进一步自组装成RHDV衣壳蛋白。

（3）所述的RHDV衣壳蛋白，即病毒样颗粒蛋白，其特征在于在Sf9细胞中表达量比常规商业化载体pVL1393系列载体的表达量更高，且被分泌到胞外，稳定存在于表达的上清液中，此上清液不需要经纯化即能使用。

（4）该重组RHDV衣壳蛋白在抗原性和免疫源性上与天然的RHDV一样，并且能够诱导兔产生针对RHDV感染的免疫应答的一种蛋白。

（5）本发明所涉及的用于预防兔病毒性出血症的病毒重组亚单位疫苗，包含了以上所述重组RHDV衣壳蛋白和表达的上清液。

（6）该疫苗为肌肉注射剂型，含有兽用生物制品常用的佐剂。

（7）该兔病毒性出血症病毒亚单位疫苗的大规模制备方法，包括如下步骤：

利用三角摇瓶无血清全悬浮培养Sf9细胞制备种子细胞；

利用三角摇瓶无血清全悬浮制备表达RHDV亚单位蛋白VP60的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8052；

将种子细胞直接接种入搅拌式生物反应器全悬浮培养Sf9细胞，将生物反应器的培养规模放大至1000L细胞罐，并通过流加培养工艺将细胞密度培养至2.0×10⁶cells/ml～4.0×10⁶cells/ml，在此细胞密度情况下，以感染复数（multiplicityofinfection，MOI）为0.5～5.0接种病毒CGMCC No.8052，培养72～140h，收获上述疫培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗；

（8）该制备方法中在于：全部培养过程，包括细胞冻存和复苏，均为单细胞全悬浮的、无血清、无蛋白培养环境；

使用机械搅拌式生物反应器全悬浮培养Sf9细胞，并且最大细胞培养罐达到1000L。

本发明详细描述

一、重组的杆状病毒的构建

绝缘子是一段DNA序列，可以将目标基因与其周围的调控元件隔离，以确保其表达（J AWallace,G Felsenfeld,We gather together:insulators and genome organization.Current Opinion inGenetics and Development.2007(17)400–407）。已经确定了两类绝缘子：增强-阻断绝缘子和隔断绝缘体。增强-阻断绝缘子可以阻断末端增强作用，并防止不适当的激活在增强子和启动子之间的基因表达。阻断绝缘子可以阻止异染色质的扩展和保护转录活性区域。许多在酵母，果蝇，人类和其它真核生物基因组中的绝缘子已经被鉴定出来。他们通常定位在基因附近的区域，而且通常包含DNA酶-I敏感位点。鸡5-HS4-珠蛋白绝缘子（HS4）长约1.2kb，见图2，是最常见的研究脊椎动物的绝缘体,。它具有增强-阻断绝缘子和隔断绝缘子双重功能，同时还具有阻断沉默子的效果（S Yao,C S Osborne,R R Bharadwaj,P Pasceri,T Sukonnik,D Pannell,FRecillas-Targa,A G West,J Ellis.Retrovirus silencer blocking by the cHS4 insulator is CTCFindependent.Nucleic Acid Research.2003(31)5317–5323）。

我们实验室的前期工作发现，HS4绝缘子置于杆状病毒表达载体的目的基因表达盒的下游，多角体蛋白启动子启动的基因表达显着增加。进一步，我们尝试将HS4绝缘子置于RHDV主要结构蛋白（VP60）表达盒的下游，发现VP60的表达量在48h、72h、96h和120h都有大幅提高，其中72h的表达量大约是对照组的6倍，其它时间段3～5倍之间。结果暗示VP60蛋白表达受到异染色质效应的影响而降低其表达水平，HS4能够降低这种影响的水平。

我们前期的实验发现，Sf9细胞表达VP60蛋白，在组装成类病毒颗粒后，是能够被分泌到细胞外的，也就是说在没有信号肽的情况下，胞内表达形成病毒样颗粒具有一套分泌机制。在常规表达的情况下，表达的50%蛋白都可以通过分泌途径分泌到胞外环境。同时我们也发现，在高表达情况下，有超过90%的类病毒颗粒不能够被分泌到胞外，原有的分泌通路处于限制性环节。只有通过对收获的细胞病毒悬液进行反复冻融，才能够使胞内的大量的类病毒颗粒释放出来。所以我们考虑通过在VP60上增加信号肽来促进类病毒颗粒的分泌。

多数哺乳动物基因的信号肽往往不能被昆虫细胞识别,若将包含信号肽的全基因克隆到重组杆状病毒,常常不能实现分泌型表达。Tessier（D C Tessier,D Y Thomas,H E Khouri et al.Enhanced secretion from insect cells of a foreign protein fused to the honeybee melittin signalpeptide.Gene.1991(98)177-183）等于1991年首先报道蜂素信号肽(Honeybee melittin signalpeptide)能够介导外源蛋白通过分泌表达的形式存在于培养上清中,并能够使外源蛋白的表达量增加5倍。所以我们通过在多角体启动子的上游添加蜂毒信号肽的方法来提高类病毒颗粒的分泌比例。

1.兔病毒性出血症病毒（RHDV）结构蛋白VP60基因的扩增

抽提齐鲁动物保健公司所拥有毒株RHDV北京株的基因组RNA,根据NCBI上公布的一株RHDV基因组序列（GENBANK公布该蛋白的蛋白序列:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/25121581（登陆号：NP_740333.1），并且该蛋白对应的基因序列在兔瘟病毒基因组中可以查到：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/9790292?report=genbank，蛋白编号：NP740333.1），设计合成VP60基因上下游引物（由上海生工生物工程有限公司合成）VP60-F（序列2）/VP60-R（序列3）。然后使用RT-PCR的方法扩增VP60基因，将扩增出的基因克隆入pMD19-T载体中（pMD19-VP60），以质粒的形式保存在E.coli中。

2.构建含有绝缘子顺式作用元件和蜂毒素信号肽的转移载体

（1）含有蜂毒素信号肽的载体构建

人工合成含有蜂毒素信号肽序列（HBM）的DNA片段（序列4，该DNA片段包括蜂毒素信号肽，6个组氨酸标签（6×His Tag），多克隆位点等（由上海生工生物工程有限公司完成），合成的DNA片段已经克隆入pMD19-T载体（宝生物工程（上海）有限公司）中（pMD19-HBM），以质粒的形式保存在E.coli中,然后PCR扩增该片段，使用BamHⅠ，PstⅠ双酶切pVL1393载体和PCR产物，然后将双酶切的PCR产物与载体相连，合成的含有蜂毒素信号肽的DNA片段就替换了pVL1393上的相应的一段序列。

（2）在含有蜂毒素信号肽的载体插入HS4绝缘子基因序列

根据GeneBank公布序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U78775.2登陆号：U78775.2）人工合成全长的HS4绝缘子序列（序列5，由上海生工生物工程有限公司完成）DNA片段。合成的DNA片段已经克隆入pMD19-T载体（宝生物工程（上海）有限公司）中（pMD19-HBM），以质粒的形式保存在E.coli中,通过PCR扩增该片段，然后将其通过单酶切连接的方法插入到上述构建好的含有蜂毒素信号肽的pVL-HBM位于基因表达盒下游的SnaBI酶切位点。新的载体命名为pVL-HBM-HS4。

3.构建含有VP60基因的昆虫杆状病毒表达质粒并制备重组昆虫细胞杆状病毒

昆虫细胞表达质粒pVL-HBM-HS4经限制性内切酶EcoRI/KpnI37℃过夜消化水解后，用凝胶电泳及过滤柱抽提纯化。在T4DNA连接酶的作用下，与使用EcoRI/KpnI酶切pMD19-VP60质粒回收的VP60基因片段于16℃连接过夜，然后采用热休克方法将连接产物转导入E.coliDH5α感受态细胞。

具体操作如下：将50μlDH5α感受态细胞移入到一小塑料离心管中，加入5μl的连接反应液，混匀后将小管置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克90s，迅速放回冰上，2min后加入950μlLB培养基，37℃培养1h。取1mL菌液浓缩成100μl涂布于LB固体培养基（含有100μg/ml氨苄西林）上，37℃培养16h，使用VP60-F（序列2）/VP60-R（序列3）引物进行菌落PCR，鉴定长出的阳性克隆，引物序列如下：

具体操作：挑取长出的单菌落接种于2mlLB培养液（含有100μg/ml氨苄西林）中，37℃，转速250r/min，震荡培养2h，然后取1μl菌液作为模板PCR，然后琼脂糖凝胶电泳，鉴定出阳性克隆。然后送测序。保存测序正确克隆，获得转移载体pVL-HBM-HS4-VP60。将pVL-HBM-HS4-VP60载体与BD BaculoGold Linearized Baculovirus DNA（美国TRANSLAB产品）共感染Sf9细胞获得重组杆状病毒。

在6cm的组织培养皿中接种2×106个Sf9细胞，细胞汇合度为50%～70%。待细胞贴壁后（大约15min），从培养皿中移除培养基，加1mL的转染缓冲液A。将0.5μg的BD BaculoGoldLinearized BaculovirusDNA和2μg的pVL-HBM-HS4-VP60质粒在无菌EP管中混匀放置5min，加入1mL转染试剂B，混合均匀，吸取1mL的转染试剂B/DNA混合物一滴一滴的滴加到组织培养皿中，将培养皿在27℃孵育4h，移除转染复合物，使用细胞培养基洗三次，加入3mL新鲜培养基在27℃培养4～5天。使用封口膜将培养皿封口，同时在培养箱中放入湿纸巾。4天后收获上清，获得重组病毒。

通过蚀斑实验获得单克隆杆状病毒。具体操作如下：

（1）在6mm的组织培养皿中接种2～2.5×10⁶个Sf9细胞，室温下放置5min。梯度稀释（10^-4～10^-7）收获的共转染病毒上清。在每一个培养皿中加入1mL稀释的病毒。在室温下放置1h，每过15min摇晃一下，让病毒充分感染。

（2）同时使用无菌水配置2%的低浓度琼脂糖，使用微波加热到60℃充分融化。然后放入42℃水浴锅中保温，然后加入等体积的Grace培养基（GIBCO，2倍浓缩）混合均匀。

（3）吸走培养皿中上清，使用枪头小心的在细胞表面覆盖4mL的1%琼脂糖，同时吸走所有的气泡。大约10～15min后琼脂糖凝固。

（4）然后将培养皿在湿润的环境中27℃培养7天就可以看到噬斑。在培养皿上画一个点标记噬斑，然后使用枪头挑取数个噬斑，放入700μl SF-SFM培养基（苏州市沃美生物技术有限公司）中与4℃摇晃过夜。获得病毒悬液（P0代），-80℃冷冻保存作为种子库。

将收获重组杆状病毒命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60，该病毒于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8052。

重组杆状病毒滴度的测定：

采用空斑计数法，准备20ml细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵cells/ml，于6孔板中每孔铺2ml细胞。待低熔点琼脂液化后，马上将低熔点琼脂、昆虫培养基（苏州市沃美生物技术有限公司产品）放入超净台。吸取13ml4%低熔点琼脂加入装有39ml培养基（浓度为常规培养基的1.3倍）试剂瓶中，温和混匀。准备好后，放于40℃水浴中。用昆虫培养基将病毒稀释7个浓度梯度（10^-1～10^-7），方法：取0.5ml病毒液放入4.5ml培养基中（用10ml无菌离心管），稀释为10-1，其余依此类推。P1代病毒测10^-4、10^-5、10^-6三个滴度，P2代病毒测10^-5、10^-6、10^-7，P3代病毒测10^-6、10^-7、10^-8三个滴度，每个滴度4个孔。细胞贴壁后将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。在27℃培养箱中吸附1h后，将病毒液吸出，马上将放在40℃水浴的平板培养基（低熔点琼脂糖培养基）放入超净台，将2ml的平板培养基放入。将孔板用封口膜包好，并放于自封袋内，于27℃培养箱中培养。在转染后第7～10天时，配制1mg/ml的中性红溶液（用灭菌蒸馏水配制）。每孔加入0.5ml（或1ml）的1mg/ml的中性红溶液，室温孵育1～2h。观察到重组病毒形成的近似透明的小点即为空斑。计算统计观察病毒蚀斑形成单位（plaque forming units，PFU）。利用公式“滴度=蚀斑数×稀释倍数×（1/接种体积ml/孔）”，计算病毒滴度，优化范围是6孔板上每个孔计算3～20个斑。

4.重组杆状病毒侵染Sf9细胞生产RHDV病毒样颗粒的检测和鉴定

（1）重组杆状病毒侵染Sf9细胞生产RHDV病毒样颗粒

200mlSf9细胞悬液培养于1L螺口三角摇瓶中，细胞培养基为无血清培养基SF-SFM（苏州市沃美生物技术有限公司），摇床转速为110r/min，温度恒定于27℃。当细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，以MOI=0.5接种杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60。培养96h后，收集上清，4℃3000r/min离心10min，收集上清液，-20℃冷冻保存。由于上清中病毒样颗粒具有蛋白特性，能够被SDS凝胶电泳（见图4）检测和Westernblot检测（见图5）

（2）凝胶蛋白电泳检测VP60蛋白的表达

取上述培养重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60的细胞上清，4℃离心（9000r/min）5min，收集上清液，进行SDS凝胶电泳。设置电泳条件为恒定电压100V，时间为2h。结束后，凝胶置于1%R型考马斯亮蓝染色液中，水平摇摆染色1h，然后用脱色液脱色，并拍照，见图6。

（3）Westernblot检测分析VP60蛋白的表达

取上述培养重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60的细胞上清，4℃离心（9000r/min）5min，收集上清液，取10μl与10μl的2XSDS上样缓冲液混合，99℃处理5min后，将样品加入12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的点样空中，进行电泳。转膜时，恒定电流300mA，4℃下转移1.5h，取出硝酸纤维素膜放于5%脱脂奶粉中封闭3h。孵育时，一抗采用抗6个组氨酸的兔源抗体（1∶500），二抗采用的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1∶1000）。

（4）RHDV病毒杨颗粒的HA滴度检测

将96孔血凝板的连续18个孔标记，每孔加入0.25ml生理盐水，再向第一个孔加入0.25ml的重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60的细胞上清，将样品进行1∶2的倍比稀释，设置6～8个孔的空白对照，只添加生理盐水，向每一孔加入0.25ml1%的人O型红血球，混匀后37℃放置20min，查看并记录血凝结果，见图7。

（5）RHDV类病毒颗粒的纯化

采用蔗糖梯度离心，将收获的病毒悬液（RHDV\约150ml）分装至50ml离心管中，用高速冷冻离心机离心（500g）10min，弃去上清。用密度梯度离心裂解液约10ml，将4个离心管中的细胞沉淀重悬，再加入蛋白酶抑制剂（上海生工生物工程有限公司，Protease InhibitorCocktall，1mL用于10⁹cells）及PMSF蛋白酶抑制剂（苯甲基磺酰氟,100X，终浓度0.1mM）。将裂解好的悬液放至冰上，用超声波细胞粉碎机超声超声10min，显微镜下看超声效果。超声完毕后将混合液分装至2mlEP管中，用高速冷冻离心机，12000r/min，4℃离心15min，将上清转入新的EP管中，再离心15min。将离心后的上清转移至新EP管中，每个样品6个EP管，1.5ml/个，准备做蔗糖梯度离心。转头可以放置6个离心管。将6个离心管加满40%的蔗糖（SigmaSucrose，BCBH5304V），根据样品的量吸出适量的蔗糖，将样品慢慢加到蔗糖上面。安装不锈钢套管编号。离心速度：200000g（39900r/min），离心2h，温度4℃。将离心好的样品取出，用400μlTAE溶液重悬样品沉淀（留样检测）。在2个离心管中依次加入30%,45%,60%（W/W）的蔗糖，加的时候用长针头从底部往上加。在两个超速离心管中各加入200μl含病毒样品的溶解液。150000g，4℃离心2h。离心完毕后，发现60%蔗糖层内有一条明亮的条带，即为目标蛋白，用枪头将蛋白吸出。

电镜拍片检测：将少量的纯化浓缩后的RHDV病毒样颗粒样品固定处理后，置于新制备的无负荷塑胶/碳包被网格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2%磷钨酸钠溶液进行负染色。电子显微镜下观察并拍片，见图8。

二、生产种毒批的制备和保存

重组杆状病毒制备工艺主要包含重组pVL1393质粒（保存在宿主菌中）和同源重组成功并通过噬斑实验纯化的重组杆状病毒（第一代毒）。前者加入甘油保存在-80℃中，生产用种毒是在第一代毒中加入3%胎牛血清分装保存在-80℃中，种毒的长期实验室保存是通过抽提重组病毒基因组保存在-80℃中。制备生产用病毒批通常是将分装保存的种毒P1（第一代）病毒感染Sf9细胞制备P2（第二代）病毒、依次类推制备P3（第三代）病毒。

生产用种毒批的制备和保存方法如下：

1.将收获的同源重组成功的病毒通过噬斑实验，筛选几个噬斑制备出纯的重组病毒。此为P0病毒；

2.将P0病毒感染Sf9细胞，收获P1病毒；

3.将P1病毒添加20%血清后按照每细胞冻存管1ml进行分装，然后放于-80℃冰箱保存，作为生产用的种毒库。依次扩增P1种毒获得P2，P3病毒，P3病毒作为生产用病毒。

按照这种方法制备一个批次的种毒可以供一个生产周期的使用，且种毒性质均一。种毒批用完之前，不需要重新制备种毒。

三、疫苗生产

（1）复苏冻存Sf9细胞的种子细胞1ml于100ml无血清培养基中，置于500ml螺口玻璃三角摇瓶中培养，摇床温度27℃，转速110r/min。培养48h后补加200ml无血清培养基，稀释传代于3000ml螺口玻璃三角摇瓶中。培养48h后补加400ml无血清培养基。按照每48h，1∶2稀释比例传代至3000ml种子细胞，细胞密度达到3.0×106cells/ml；

（2）上述3000ml种子细胞接种入30L搅拌式生物反应器（工作体积20L）。培养72～96h后，通过流加培养添加营养浓缩液，继续培养72h，细胞密度达到4.0～8.0×10⁶cells/m；

（3）将上述30L搅拌式生物反应器中的20L种子细胞直接接种入1000L生物反应器，逐步补加新鲜培养基至总培养体积750L，并通过流加培养工艺将细胞密度培养至2.0×106cells/ml～4.0×10⁶cells/ml；

（4）利用三角摇瓶无血清全悬浮培养制备表达RHDV亚单位蛋白VP60的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCCNo.8052，将其以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.5～5.0，接种入以上1000L生物反应器中培养的细胞悬液中；

（5）收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗。

3.兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗成品检验

（1）性状检验静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

（2）无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

（3）装量检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，100ml/瓶应不少于100ml。

（4）安全检测将兔瘟VLP灭活疫苗颈背部免疫1.5～3.0kg健康易感家兔（抗RHDV-HI值为阴性）5只，4ml/只，连续观察10日，所有家兔应全部健活。

（5）效力检测将兔瘟VLP灭活疫苗颈背部免疫1.5～3.0kg健康易感家兔（抗RHDV-HI值为阴性）5只，0.5ml/只，免疫后14日连同对照组家兔5只，皮下注射1:10稀释的兔病毒性出血症病毒AV-34株强毒1ml（不低于1.0×10^3.0个最小致死量），攻毒后观察10日，对照组家兔应至少死亡4只，免疫组家兔应全部健活。

（6）汞类防腐剂残留量测定分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，汞类防腐剂残留量为0.01%。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及到的重组杆状病毒是利用商业化试剂盒（购自BD公司）中所含载体pVL1393，通过载体改造的方法，将蜂毒素信号肽（HBM）和绝缘子（HS4）插入到载体中的适当位置，再将兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白（VP60）基因（该基因以本公司所拥有兔病毒性出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）北京株作为模板制成，该毒株是具有农业部生产批准文号的市售产品兔病毒性出血症疫苗生产毒株，中华人民共和国农业部颁发的兽药产品生产批准文号：兽药生字（2011）150256004）插入到上述改造载体的多克隆位点，然后与BaculoGold Linearized baculovirus DNA（杆状病毒基因组）共转染Sf9细胞，pVL1393质粒与BaculoGold Linearized DNA发生同源重组，目的基因插入到杆状病毒基因组中形成环状的病毒基因组，然后组装成完整的病毒颗粒分泌到细胞外。未发生同源重组的病毒基因组因为其中含有一个致死性缺失突变，不能组装成完整病毒构建含有上述基因的重组杆状病毒基因组Bacmi，从而使得同源重组率在99%以上。然后通过噬斑实验进一步纯化挑选重组杆状病毒。该重组杆状病毒被命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60，该病毒于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8052。

附图说明：

图1RT-PCR扩增VP60基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，图中1：空白对照；2：VP60基因PCR扩增产物；3：DL5000 DNA分子量标准。

图2人工合成的HS4绝缘子序列DNA片段经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳，图中1：空白对照；2：HS4 PCR扩增产物；3：DL5000DNA分子量标准。

图3重组杆状病毒（rBac-HBM-HS4-VP60）表达质粒示意图。

图4重组杆状病毒侵染昆虫细胞（Sf9）表达RHDV VP60蛋白的SDS凝胶电泳图，图中：1：接毒后培养72h上清；2：未接毒培养72h上清（阴性对照1）；3：接种野生病毒培养72h上清（阴性对照2）；4：Marker；5：蔗糖梯度离心纯化RHDV病毒样颗粒样品（阳性对照）。

图5杆状病毒侵染昆虫细胞（Sf9）表达RHDVVP60蛋白表达的Western blot分析，A图中：1：接毒后培养72h上清；2：接毒后培养72h细胞沉淀；3：未接毒培养72h细胞悬液；4：Marker；5：接毒后培养120h上清；6：接毒后培养120h细胞沉淀；B图中：C：未感染重组杆状病毒的Sf细胞培养72h细胞悬液；1：含有HS4绝缘子的Bac-HBM-VP60感染Sf9细胞后培养72h上清；M：Marker；2：不含有HS4绝缘子的Bac-HBM-VP60感染Sf9细胞后培养72h上清

图6凝胶法测重组杆状病毒的滴度

图7重组昆虫杆状病毒在昆虫细胞内表达的RHDV病毒样颗粒的血凝效价

图8纯化后的病毒样颗粒电镜照片

本发明的积极意义

本发明涉及一种兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。本发明涉及疫苗的生产毒株是重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCCNo.8052，该毒株系采用的表达载体为分泌表达，且含有6个组氨酸标签，易于蛋白检测分析用；用其作为生产毒株生产兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗，该疫苗不含病毒基因组，无动物安全危害和潜在散布性；免疫针对性强，能激发免疫动物产生足量的免疫抗体，并产生长久保护力。按照本发明提供的技术生产RHDV病毒样颗粒，1000L生物反应器中收获的病毒液血凝价达到1∶32768～1∶262144，该RHDV病毒颗粒蛋白表达量约150mg/L，每升病毒液半成品可以制成标准疫苗5000～100000头份，高于国内技术水平8～20倍；该重组亚单位疫苗添加了佐剂，有效的提高了疫苗的免疫效果和免疫效价该疫苗安全、有效，质量稳定、可控，是一种明显优于现有技术生产的灭活组织疫苗的新疫苗。

具体实施方式

通过下述给出的例子可以进一步清楚的理解本发明。但下述实施例不是对本发明的限定。

实施例1

——重组昆虫细胞杆状病毒的构建

1.兔病毒性出血症病毒（RHDV）结构蛋白VP60基因的扩增

抽提齐鲁动物保健公司所拥有毒株RHDV北京株的基因组RNA,根据NCBI上公布的一株RHDV基因组序列（GENBANK公布该蛋白的蛋白序列:（登陆号：NP_740333.1），并且该蛋白对应的基因序列在兔瘟病毒基因组中可以查到，蛋白编号：NP740333.1。），设计合成VP60基因上下游引物（由上海生工合成）VP60-F（序列2）/VP60-R（序列3）。然后使用RT-PCR的方法扩增VP60基因，将扩增出的基因克隆入pMD19-T载体中（pMD19-VP60），以质粒的形式保存在E.coli中。

2.构建含有绝缘子顺式作用元件和蜂毒素信号肽的转移载体

（1）含有蜂毒素信号肽的载体构建

人工合成含有蜂毒素信号肽序列（HBM）的DNA片段（序列4，该DNA片段包括蜂毒素信号肽，6个组氨酸标签（6×His Tag），多克隆位点等（由上海生工生物工程有限公司完成），合成的DNA片段已经克隆入pMD19-T载体（宝生物工程（大连）有限公司）中（pMD19-HBM），以质粒的形式保存在E.coli中,然后PCR扩增该片段，使用BamHⅠ，PstⅠ双酶切pVL1393载体和PCR产物，然后将双酶切的PCR产物与载体相连，合成的含有蜂毒素信号肽的DNA片段就替换了pVL1393上的相应的一段序列。

（2）在含有蜂毒素信号肽的载体插入HS4绝缘子基因序列

根据GeneBank公布序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U78775.2登陆号：U78775.2）人工合成全长的HS4绝缘子序列（序列5，由上海生工生物工程有限公司完成）DNA片段。合成的DNA片段已经克隆入pMD19-T载体（宝生物工程有限公司）中（pMD19-HBM），以质粒的形式保存在E.coli中,通过PCR扩增该片段，然后将其通过单酶切连接的方法插入到上述构建好的含有蜂毒素信号肽的pVL-HBM位于基因表达盒下游的SnaBI酶切位点。新的载体命名为pVL-HBM-HS4。

3.构建含有VP60基因的昆虫杆状病毒表达质粒并制备重组昆虫细胞杆状病毒

昆虫细胞表达质粒pVL-HBM-HS4经限制性内切酶EcoR I/Kpn I37℃过夜消化水解后，用凝胶电泳及过滤柱抽提纯化。在T4 DNA连接酶的作用下，与使用EcoR I/Kpn I酶切pMD19-VP60质粒回收的VP60基因片段于16℃连接过夜，然后采用热休克方法将连接产物转导入E.coliDH5α感受态细胞。

具体操作如下：将50μlDH5α感受态细胞移入到一小塑料离心管中，加入5μl的连接反应液，混匀后将小管置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克90s，迅速放回冰上，2min后加入950μlLB培养基，37℃培养1h。取1mL菌液浓缩成100μl涂布于LB固体培养基（含有100μg/ml氨苄西林）上，37℃培养16h，使用VP60-F（序列2）/VP60-R（序列3）引物进行菌落PCR，鉴定长出的阳性克隆，引物序列如下：

具体操作：挑取长出的单菌落接种于2ml LB培养液（含有100μg/ml氨苄西林）中，37℃，转速250r/min，震荡培养2h，然后取1ul菌液作为模板PCR，然后琼脂糖凝胶电泳，鉴定出阳性克隆。然后送测序。保存测序正确克隆，获得转移载体pVL-HBM-HS4-VP60。将pVL-HBM-HS4-VP60载体与BDBaculoGold Linearized Baculovirus DNA共感染Sf9细胞获得重组杆状病毒。

在6cm的组织培养皿中接种2×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50%～70%。待细胞贴壁后（大约15min），从培养皿中移除培养基，加1mL的转染缓冲液A。将0.5ug的BD BaculoGoldLinearized BaculovirusDNA和2ug的pVL-HBM-HS4-VP60质粒在无菌EP管中混匀放置5min，加入1mL转染试剂B，混合均匀，吸取1mL的转染试剂B/DNA混合物一滴一滴的滴加到组织培养皿中，将培养皿在27℃孵育4h，移除转染复合物，使用细胞培养基洗三次，加入3mL新鲜培养基在27℃培养4～5天。使用封口膜将培养皿封口，同时在培养箱中放入湿纸巾。4天后收获上清，获得重组病毒。

通过蚀斑实验获得单克隆杆状病毒。具体操作如下：

（1）在6mm的组织培养皿中接种2～2.5×10⁶个Sf9细胞，室温下放置5min。梯度稀释（10^-4-10^-7）收获的共转染病毒上清。在每一个培养皿中加入1mL稀释的病毒。在室温下放置1h，每过15min摇晃一下，让病毒充分感染。

（2）同时使用无菌水配置2%的低浓度琼脂糖，使用微波加热到60℃充分融化。然后放入42℃水浴锅中保温，然后加入等体积的Grace培养基（GIBCO，2倍浓缩），混合均匀。

（3）吸走培养皿中上清，使用枪头小心的在细胞表面覆盖4mL的1%琼脂糖，同时吸走所有的气泡。大约10～15min后琼脂糖凝固。

（4）然后将培养皿在湿润的环境中27℃培养7天就可以看到噬斑。在培养皿上画一个点标记噬斑，然后使用枪头挑取数个噬斑，放入700μl SFM中与4℃摇晃过夜。获得病毒悬液（P0代），-80℃冷冻保存作为种子库。

将收获重组杆状病毒命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60，该病毒于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8052。

重组杆状病毒滴度的测定：采用空斑计数法，准备20ml细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵cells/ml，于6孔板中每孔铺2ml细胞。待低熔点琼脂液化后，马上将低熔点琼脂、昆虫培养基（苏州市沃美生物技术有限公司产品）放入超净台。吸取13ml4%低熔点琼脂加入装有39ml培养基(浓度为常规培养基的1.3倍)试剂瓶中，温和混匀。准备好后，放于40℃水浴中。用昆虫培养基将病毒稀释7个浓度梯度（10^-1～10^-7），方法：取0.5ml病毒液放入4.5ml培养基中(用10ml无菌离心管)，稀释为10^-1，其余依此类推。P1代病毒测10^-4、10^-5、10^-6三个滴度，P2代病毒测10^-5、10^-6、10^-7，P3代病毒测10^-6、10^-7、10^-8三个滴度，每个滴度4个孔。细胞贴壁后将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。在27℃培养箱中吸附1h后，将病毒液吸出，马上将放在40℃水浴的平板培养基（低熔点琼脂糖培养基）放入超净台，将2ml的平板培养基放入。将孔板用封口膜包好，并放于自封袋内，于27℃培养箱中培养。在转染后第7～10天时，配制1mg/ml的中性红溶液（用灭菌蒸馏水配制）。每孔加入0.5ml(或1ml)的1mg/ml的中性红溶液，室温孵育1～2h。观察到重组病毒形成的近似透明的小点即为空斑。计算统计观察病毒蚀斑的形成单位（plaque forming units，PFU）。利用公式“滴度=蚀斑数×稀释倍数×（1/接种体积ml/孔）”，计算病毒滴度，优化范围是6孔板上每个孔计算3～20个斑。

4.重组杆状病毒侵染Sf9细胞生产RHDV病毒样颗粒的检测和鉴定

（1）重组杆状病毒侵染Sf9细胞生产RHDV病毒样颗粒

200mlSf9细胞悬液培养于1L螺口三角摇瓶中，细胞培养基为无血清培养基SF-SFM（苏州市沃美生物技术有限公司），摇床转速为110r/min，温度恒定于27℃。当细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，以MOI=0.5接种杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60。培养96h后，收集上清，4℃3000r/min离心10min，收集上清液，-20℃冷冻保存。

（2）凝胶蛋白电泳检测VP60蛋白的表达

取上述培养重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60的细胞上清，4℃离心（9000r/min）5min，收集上清液，进行SDS凝胶电泳。设置电泳条件为恒定电压100V，时间为2h。结束后，凝胶置于1%R型考马斯亮蓝染色液中，水平摇摆染色1h，然后用脱色液脱色，并拍照，见图6。

（3）Western blot检测分析VP60蛋白的表达

取上述培养重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60的细胞上清，4℃离心（9000rpm）5min，收集上清液，取10μl与10μl的2×SDS上样缓冲液混合，99℃处理5min后，将样品加入12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的点样空中，进行电泳。转膜时，恒定电流300mA，4℃下转移1.5h，取出硝酸纤维素膜放于5%脱脂奶粉中封闭3h。孵育时，一抗采用抗6个组氨酸的兔源抗体（1∶500），二抗采用的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1∶1000）。

（4）RHDV病毒杨颗粒的HA滴度检测

将96孔血凝板的连续18个孔标记，每孔加入0.25ml生理盐水，再向第一个孔加入0.25ml的重组杆状病毒rBac-HBM-HS4-VP60的细胞上清，将样品进行1：2的倍比稀释，设置6-8个孔的空白对照，只添加生理盐水，向每一孔加入0.25ml1%的人O型红血球，混匀后37℃放置20min，查看并记录血凝结果，见图7。

（5）RHDV类病毒颗粒的纯化

采用蔗糖梯度离心，将收获的病毒悬液（RHDV\约150ml）分装至50ml离心管中，用高速冷冻离心机离心（500g）10min，弃去上清。用密度梯度离心裂解液约10ml，将4个离心管中的细胞沉淀重悬，再加入蛋白酶抑制剂（上海生工生物工程有限公司，Protease InhibitorCocktall，1mL用于10⁹cells）及PMSF蛋白酶抑制剂（苯甲基磺酰氟,100X，终浓度0.1mM）。将裂解好的悬液放至冰上，用超声波细胞粉碎机超声超声10min，显微镜下看超声效果。超声完毕后将混合液分装至2mlEP管中，用高速冷冻离心机，12000RPM，4℃离心15min，将上清转入新的EP管中，再离心15min。将离心后的上清转移至新EP管中，每个样品6个EP管，1.5ml/个，准备做蔗糖梯度离心。转头可以放置6个离心管。将6个离心管加满40%的蔗糖（SigmaSucrose，BCBH5304V），根据样品的量吸出适量的蔗糖，将样品慢慢加到蔗糖上面。安装不锈钢套管编号。离心速度：200000g（39900r/min），离心2h，温度4℃。将离心好的样品取出，用400μlTAE溶液重悬样品沉淀（留样检测）。在2个离心管中依次加入30%,45%,60%（W/W）的蔗糖，加的时候用长针头从底部往上加。在两个超速离心管中各加入200μl含病毒样品的溶解液。150000g，4℃离心2h。离心完毕后，发现60%蔗糖层内有一条明亮的条带，即为目标蛋白，用枪头将蛋白吸出。

（6）电镜拍片检测：

将少量的纯化浓缩后的RHDV病毒样颗粒样品固定处理后，置于新制备的无负荷塑胶/碳包被网格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2%磷钨酸钠溶液进行负染色。电子显微镜下观察并拍片，见图8。

实施例2

——重组杆状病毒种毒批制备

制备rBac-HBM-HS4-VP60P1种毒库（200支，1ml/支）：将纯化的P0代重组病毒，感染对数生长期Sf9细胞250mL，接毒MOI=0.1～0.01，感染后96h收获上清，获得P1代种毒，具体操作同实施例3。将收集的P1代种毒取适量样品检测病毒滴度，其余分装到1.8ml细胞冻存管，每管加入1mlP1病毒和0.11ml胎牛血清（Invitrogen公司产品）。将上述分装好的冻存管放于超低温冰箱-80℃保存。

实施例3

——Sf9细胞生产用重组杆状病毒种毒批制备

将液氮冻存的细胞，复苏后接种于250ml摇瓶，置27℃恒温摇床上培养，转速为110r/min。待细胞密度达到3.0×10⁶cells/ml以上时，按照体积比1:2放大到1L摇瓶中，最终放大至3L摇瓶。3L摇瓶细胞达到2.0×10⁶cells/ml时，按MOI=0.05～0.1接种重组杆状病毒，27℃悬浮培养80～96h，收获培养液，取样测定HA效价，定量分装，冷冻保存，即为生产用毒种。注明收获日期、毒种代次等。

实施例4

——疫苗病毒液制备（以按本发明技术方案试生产的1308001批、1308002批、1308003批疫苗为例）

（1）复苏冻存Sf9细胞的种子细胞1ml于100ml无血清培养基中，置于500ml螺口玻璃三角摇瓶中培养，摇床温度27℃，转速110r/min。培养48h后补加200ml无血清培养基，稀释传代于3000ml螺口玻璃三角摇瓶中。培养48h后补加400ml无血清培养基。按照每48h，1∶2稀释比例传代至3000ml种子细胞，细胞密度达到3.0×10⁶cells/ml；

（2）上述3000ml种子细胞接种入30L搅拌式生物反应器（工作体积20L）培养条件设定为：接种密度：1.5×10⁶cells/ml，温度：27℃，pH：6.2～6.3，转速：50～80r/min，DO：35%～45%。每天取样观察细胞状态和细胞密度，当细胞密度达到2×10⁷cells/ml；

（3）将上述30L搅拌式生物反应器中种子细胞按照体积比1∶20的比例将种子细胞转移至1000L生物反应器中，培养体积400L。1000L细胞罐的转速为35r/min。培养48h后，当1000L细胞罐细胞密度达到约3.5×10⁶cells/ml时，补加培养基稀释细胞密度至1.6～1.8×10⁶cells/ml；

（4）利用三角摇瓶无血清全悬浮培养制备表达RHDV亚单位蛋白VP60的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8052，将其以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.5接种入以上1000L生物反应器的培养的细胞中，继续培养，96～110h，收获抗原液。取样测定HA效价，对人“O”型红细胞凝集价为1:32768。

取摇瓶中健康培养的9L Sf9细胞，细胞密度为3.0×10⁶cells/ml。接种于30L细胞培养罐内，培养体积18L培养条件设定为：接种密度：1.5×10⁶cells/ml，温度：27℃，pH：6.2～6.3，转速：50～80r/min，DO：35%～45%。每天取样观察细胞状态和细胞密度，当细胞密度达到2×10⁷cells/ml时，按照体积比1∶20的比例将种子细胞转移至1000L生物反应器中，培养体积400L。1000L细胞罐的转速为35r/min。培养48h后，当1000L细胞罐细胞密度达到约3.5×10⁶cells/ml时，补加培养基稀释细胞密度至1.6～1.8×10⁶cells/ml，按照MOI=0.5接种生产种毒继续培养，96～110h，收获抗原液。取样测定HA效价，对人“O”型红细胞凝集价为1:32768。收获抗原冷冻保存。

实施例5

——灭活及配苗（以按本发明技术方案试生产的1308001批、1308002批、1308003批疫苗为例）

将上述实施例3培养的病毒液置灭活容器中，在搅拌状态下加入浓度为1mol/L的BEI至终浓度为0.005mol/L，边加边搅拌，混合均匀后，保持37℃，灭活40～48h。灭活终止时，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的2mol/L硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）溶液，使其终浓度为0.005mol/L，充分搅拌均匀。灭活后的病毒液和氢氧化铝胶按9∶1的体积比进行配苗，使疫苗中氢氧化铝胶含量以氧化铝表示不超过3.9mg/ml，再加入1%的硫柳汞溶液，使其在疫苗中的终浓度为0.01%，充分搅拌后进行分装。

实施例6

——疫苗检验（以按本发明技术方案试生产的1308001批、1308002批、1308003批疫苗为例）

1.性状检验：静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

3.安全检测：取49日龄健康易感家兔20只，随机分为4组，5只/组，第一组不接种，作为对照，其余3组单剂量（4ml/只）分别接种不同批次（1308001批、1308002批、1308003批）的重组亚单位疫苗疫苗。各组隔离饲养14日，记录其精神、饮食、粪便、体温情况以及接种部位是否出现肿胀、坏死和全身不良反应。14日时剖杀所有家兔进行病理学检测，记录免疫后14天免疫家兔精神、体温、饮食、粪便情况；接种部位是否出现肿胀、坏死等反应，结果见表1。

表1兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗安全试验结果

4.效力检测：免疫攻毒法

取健康家兔20只，随机均分为4组，对照组不接种，其余三组分别单剂量（0.5ml/只）接种三个批次（1308001批、1308002批、1308003批）的疫苗。免疫后14天，连同对照组一起皮下接种兔病毒性出血症病毒强毒（肝、脾毒），1mL/只进行攻毒，观察7日，记录发病情况并记录死亡情况，具体见表2

表2兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗免疫家兔攻毒检测结果

Claims (9)

1.一种杆状重组病毒，其特征在于：该重组杆状病毒的转移载体包括：在pVL1393转移载体PolyA后的SnaBⅠ酶切位点插入HS4序列，在多克隆位点之前插入蜂毒素信号肽；在多克隆位点中插入一个拷贝的MEV结构蛋白VP2基因；在外源基因的C端含有6个组氨酸的标签序列，该株病毒被命名为重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒rBac-HBM-HS4-VP60，已于2013年08月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8052。

2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于该重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8052能够感染Sf9细胞并高效率的分泌表达重组亚单位蛋白VP60，该重组VP60蛋白质在功能上等同于RHDV天然VP60蛋白质，并能够进一步自组装成RHDV衣壳蛋白。

3.如权利要求2所述的RHDV衣壳蛋白，其特征在于在SF9细胞中表达量比常规商业化载体pVL1393系列载体的表达量更高，且被分泌到胞外，稳定存在于表达的上清液中，此上清液不需要经纯化即能使用。

4.如权利要求2所述的重组RHDV衣壳蛋白，其特征在于该重组RHDV衣壳蛋白在抗原性和免疫源性上与天然的RHDV一样，并且能够诱导兔产生针对RHDV感染的免疫应答的一种蛋白。

5.一种用于预防兔病毒性出血症的病毒重组亚单位疫苗，其特征是：它包含了权利要求2所述的重组RHDV衣壳蛋白和权利要求3所述的表达的上清液。

6.根据权利要求5所述的预防兔病毒性出血症的病毒重组亚单位疫苗，其特征是：疫苗为肌肉注射剂型，含有兽用生物制品常用到的佐剂。

7.一种兔病毒性出血症病毒亚单位疫苗的大规模制备方法，包括如下步骤：

（1）利用三角摇瓶无血清全悬浮培养Sf9细胞制备种子细胞；

（2）利用三角摇瓶无血清全悬浮制备表达RHDV亚单位蛋白VP60的重组苜蓿银粉夜蛾核型多角体病毒CGMCC No.8052；

（3）将种子细胞直接接种入搅拌式生物反应器全悬浮培养Sf9细胞，将生物反应器的培养规模放大至1吨细胞罐，并通过流加培养工艺将细胞密度培养至2.0×10⁶cells/ml～4.0×10⁶cells/ml；

（4）以感染复数为0.5～5.0接种病毒CGMCC No.8052，培养72～140h；

（5）收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于全部培养过程，包括细胞冻存和复苏，均为单细胞全悬浮的、无血清、无蛋白培养环境。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于使用机械搅拌式生物反应器全悬浮培养Sf9细胞，并且最大培养规模达到1吨细胞罐。

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