CN104721817B - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括流感病毒样颗粒和新城疫的病毒样颗粒。本发明将禽流感病毒样颗粒以及新城疫病毒颗粒制备疫苗组合物，与鸡胚生产的疫苗组合物相比，该疫苗组合物的生产可利用大体积生物反应器技术、规模化培养昆虫细胞制备抗原、保证产量的同时，产品质量的稳定性和均一性也得到保障，且在生产过程中不涉及活的病毒，无生物安全方面的隐患。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗组合物，具体地，本发明涉及一种含禽流感病毒样颗粒抗原以及新城疫病毒颗粒抗原的疫苗组合物，以及其制备方法和应用。

背景技术

病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs），是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm～400nm的空心颗粒。VLPs的制备原理是在体外高效表达某种病毒的一种（或几种）结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。其方法主要是将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中，再将这些载体转入原核或真核细胞中进行表达。

禽流感（Avian influenza，AI）是禽流行性感冒的简称，由禽流感病毒（Avianinfluenza virus，AIV）引起的多种禽类感染的急性呼吸道传染病，也能感染人类，被国际兽医局（OIE）和我国《家畜家禽防疫条例》列为A类烈性传染病。截止到目前，接种疫苗仍然是预防和控制禽流感病毒大流行的最有效手段。由于禽流感病毒的变异速度远远大于变异株相应疫苗的制备速度，而且不同亚型之间几乎不产生交叉免疫保护。因为禽流感疫苗的生产需要随着病毒的变异而不断更新，针对流感病毒流行株相应疫苗的生产周期较长、生产成本较高，造成人力、物力的浪费，还可能达不到预想的防控效果。

新城疫（ND）是危害我国养禽业的一种重要的病毒性传染病，病原是新城疫病毒（NDV）。NDV只有一个血清型，但是可以分为不同的基因型，疫苗免疫接种是预防该病的主要措施之一。有学者研究证明，近十多年来，从不同种类宿主临床病例中所分离到的NDV毒株绝大多数属于VII型。基因Ⅶ型毒株流行和传播越来越普遍并对养殖场亦造成的现实损失，疫苗免疫接种是预防该病的主要措施之一，尽管大面积和普遍的新城疫基因Ⅱ和Ⅲ型的弱毒苗及灭活苗使用对新城疫的大规模扩散和传播仍能起到一定的防控作用，但这些传统基因型疫苗诱导的免疫对新城疫基因Ⅶ型流行株防控能力在逐渐的下降。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明将H9N2亚型禽流感病毒样颗粒以及基因VII型新城疫病毒颗粒制备二联疫苗，与鸡胚生产的二联苗相比，该二联苗的生产可利用大体积生物反应器技术、规模化培养昆虫细胞制备抗原、保证产量的同时，产品质量的稳定性和均一性也得到保障，且在生产过程中不涉及活的病毒，无生物安全方面的隐患。

本发明的技术路线：本发明以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统为基础，将编码H9N2亚型禽流感病毒SZ株的HA和NA基因克隆至杆状病毒表达载体，形成重组杆状病毒，转染sf9细胞，扩大培养，蔗糖密度梯度离心收获AIV的VLP。将编码基因VII型新城疫的F基因、HN基因和M基因，克隆至杆状病毒表达载体，形成重组杆状病毒，转染sf9细胞，扩大培养，蔗糖密度梯度离心收获NDV的VLP。在此基础上，将两种病毒样颗粒以适当的比例配比，辅以佐剂，制备H9N2亚型禽流感与基因VII型新城疫病毒的病毒样颗粒二联疫苗。

因此，本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括流感病毒样颗粒抗原和新城疫的病毒样颗粒抗原。

优选地，所述流感病毒样颗粒抗原为H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原，所述新城疫的病毒样颗粒抗原为基因VII型新城疫的病毒样颗粒抗原。

更优选地，所述H9亚型禽流感病毒样颗粒抗原包括H9亚型禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、H9亚型禽流感病毒的神经氨酸酶NA和H9亚型禽流感病毒的基质蛋白M1的自我装配体；以及所述基因VII型新城疫的病毒样颗粒抗原包括基因VII型新城疫病毒的融合蛋白F、核衣壳蛋白NP和基质蛋白M的自我装配体。

优选地，所述疫苗组合物还包括佐剂。

本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法，所述方法包括：（1）克隆表达权利要求1所述的流感病毒的抗原蛋白，所述流感病毒的抗原蛋白能够自我装配为所述流感病毒样颗粒抗原；（（2）克隆表达权利要求1所述的新城疫病毒的抗原蛋白，所述新城疫病毒的抗原蛋白能够自我装配为所述新城疫的病毒样颗粒抗原；以及（3）按比例将所述流感病毒样颗粒抗原和新城疫的病毒样颗粒抗原混合，加入佐剂。

优选地，所述步骤（1）中流感病毒的抗原蛋白包括H9亚型禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、H9亚型禽流感病毒的神经氨酸酶NA和H9亚型禽流感病毒的基质蛋白M1；以及所述步骤（2）中新城疫病毒的抗原蛋白包括基因VII型新城疫病毒的融合蛋白F、核衣壳蛋白NP和基质蛋白M。

H9N2亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备包括如下步骤：

1）重组质粒rbacmid/HANAM1的构建与提取；

2）将重组质粒rbacmid/HANAM1转染Sf9昆虫细胞拯救重组杆状病毒，在Sf9细胞内装配病毒样颗粒；

3）模化Sf9细胞培养、重组病毒感染和病毒样颗粒的纯化。

基因VII型新城疫病毒样颗粒疫苗的制备包括如下步骤：

1）重组质粒pAcAb₄-F-HN-M的构建与提取；

2）将重组质粒pAcAb₄-F-HN-M转染Sf9昆虫细胞拯救重组杆状病毒，在Sf9细胞内装配病毒样颗粒；

3）规模化Sf9细胞培养、重组病毒感染和病毒样颗粒的纯化。

更优选地，所述步骤（1）中所述HA、NA和M1克隆于同一个表达载体于昆虫细胞表达体系进行表达；所述步骤（2）中所述F、NP和M克隆于同一个表达载体于昆虫细胞表达体系进行表达。

本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备治疗和预防流感病毒和新城疫病毒相关疾病的药物中的应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1.H9N2亚型禽流感病毒样颗粒（VLPs）的构建与检测

1.引物的设计与合成根据本公司保存的禽流感病毒SZ株（保藏号为CCTCCV201240，保藏单位为中国典型培养物保藏中心）基因组序列中血凝素HA编码序列、神经氨酸酶NA序列和基质蛋白M序列，分别设计合成三对特异性引物，分别扩增HA、NA和M1基因；设计一条A型流感病毒通用引物用于cDNA合成；各引物由上海生物工程技术有限公司合成了各引物的序列如下：

1）HA基因PCR扩增引物

上游引物AIV-P1：

5’-AGGATCCATGGAAACAATATCACTAATAAC-3’

下游引物AIV-P2：

5‘-AGGTA-CCTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3’

2）NA基因PCR扩增引物

上游引物AIV-P3：

5‘-AGAATTC-ATGAATCCAAATCAAAAGATAATA-3’

下游引物AIV-P4：

5’-AGATAT-CTTATATAGACATGAAATTGATATTC-3’

3）M1基因PCR扩增引物

上游引物AIV-P5：

5’-AGAA-TTCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3’

下游引物AIV-P6：

5‘-AGGT-ACCTCACTTGAATCTCTGCATTTGC-3’

4）A型流感病毒通用逆转录引物：5‘-AGCAAAAGCAGG-3’

2.H9N2禽流感病毒SZ株总RNA提取及cDNA合成

取250μlSZ株尿囊液，用总RNA提取试剂盒（一步法总RNA提取试剂盒，BSC51S1，上海华舜生物工程有限公司产品），按试剂盒操作说明书介绍的方法提取病毒总RNA。提取的RNA溶于16μlDEPC处理过的水中，加入1μl通用逆转录引物，70℃反应5min，迅速冰浴5min，加入逆转录混合液：5×逆转录酶缓冲液（RT Buffer）5μl，dNTPs（10μM）0.5μl，RNA酶抑制剂（RNsin）0.5μl，M-MLV1μl。在PCR热循环仪上进行以下反应：42℃60min，95℃5min，置冰浴，产物即为病毒基因组cDNA，冻存备用。

3.PCR扩增

以步骤2合成的H9N2禽流感病毒cDNA为模板，PCR分别扩增HA，NA和M1基因，扩增反应体系和具体反应条件如下：

1）HA基因扩增

用移液器将上述组份混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：95℃变性5min，再95℃30sec，52℃30sec，72℃200sec进行30个循环。72℃10min。

2）NA基因扩增

用移液器将上述组份混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：95℃变性5min，再95℃30sec，52℃30sec，72℃170sec进行30个循环。72℃10min。

3）M1基因扩增

用移液器将上述组份混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：95℃变性5min，再95℃30sec，52℃30sec，72℃120sec进行30个循环。72℃10min。

4.用HA、NA和M1基因重组转移质粒pFBDM/HANAM1和pUCDM/HANAM1构建

1）用限制性核酸内切酶Xma I和Nhe I双酶切消化pFBDM^TM载体（Redbiotec公司产品），然后用Xma I和Nhe I双酶切消化步骤3.1）PCR扩增的HA产物，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒（W5211，上海华舜生物工程有限公司产品，下同）分别回收DNA片段（按试剂盒说明书操作），以1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑起重组子阳性克隆接种5mlLB培养基中37℃培养过夜，质粒纯化试剂盒（Omiga公司产品，下同）提取质粒DNA（按试剂盒说明书操作），经酶切分析核苷酸测序验证，获得重组质粒pFBDM/HA。

2）用限制性核酸内切酶SaI I和Hind III双酶切分别消化pFBDM/HA载体和步骤3.3)PCR扩增的M1产物，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收DNA片段接种5ml，以1:3比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑起重组子阳性克隆于LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒DNA（操作步骤同4.1），获得重组质粒pFBDM/HAM1。

3）用限制性核酸内切酶Xma I和Nhe I双酶切分别消化pFBDM载体和步骤3.2)PCR扩增的NA产物，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收DNA片段，以1:3比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑起重组子阳性克隆接种5mlLB培养基中37℃培养过夜，提取质粒（操作步骤同4.1），获得重组质粒pFBDM/NA。

4）用限制性核酸内切酶Pme I和Avr II双酶切消化pFBDM/HAM1，凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒纯化HAM1融合片段；用SpeI和NruI消化pFBDM/NA凝胶纯化得线性化的pFBDM/NA，把线性化的pFBDM/NA和HAM1以1:3比例连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从相应的抗性平板上挑斑。并用菌落PCR鉴定出阳性克隆，用该阳性克隆于5ml大肠杆菌DH5a培养物中37℃培养过夜，提取质粒DNA（操作步骤同4.1），获得重组转移质粒pFBDM/HANAM1。

5）用限制性核酸内切酶Pme I和Avr II双酶切消化pFBDM/HANAM1，凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒纯化HANAM1融合片段；用PmeI和Avr II酶切pUCDM，凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒纯化线性化质粒pUCDM，pUCDM与HANAM1融合片段1：3的比例混合连接。连接产物转化大肠杆菌BW23474，从相应的抗性平板上挑斑。并用菌落PCR鉴定出阳性克隆。用该阳性克隆于5ml大肠杆菌BW23474培养物中37℃培养过夜，提取质粒（操作步骤同4.1），获得重组转移质粒pUCDM/HANAM1。HA、NA、M1构建在同一个质粒上，方便了转染操作，各自有单独的启动子，分别表达。

5.重组Bacmid的获得

1）制备感受态大肠杆菌DH10Multibac^Cre

采用CaCl₂法制备大肠杆菌DH10Multibac^Cre（Redbiotec公司产品）感受态细胞。具体地，取1.5ml培养至对数生长期菌液至2ml离心管中，冰浴10min；4℃，4200rpm离心5min；弃去上清，加入1ml预冷0.1MCaCl₂溶液重悬细胞，冰浴10min；4℃，4200rpm离心5min；弃去上清，加入100μl预冷0.1MCaCl₂溶液重悬细胞；4℃保存过夜，次日用于转化连接产物，或者加入DMSO，-70℃长期保存备用。

2）重组质粒在宿主菌DH10Multibac^Cre中重组

将纯化的重组质粒pFBDM/HANAM1转化DH10Multibac^Cre，按照MultibacExpressionSystem说明书操作。具体地，取1μl重组质粒pFBDM/HANAM1加入100μl DH10Multibac^Cre感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃，热激45sec；冰浴2min；加入二抗的LB培养基（卡那霉素50μg/ml和四环素10μg/ml）于37℃，200rpm培养4h；将转化DH10Multibac^Cre培养菌液10倍梯度稀释，每梯度取200μl涂布含有X-gal（100μg/ml）和IPTG（40μg/ml）的三抗平板（含卡那霉素50μg/ml，四环素10μg/ml，庆大霉素7μg/ml），37℃静置培养36-48h。挑取白色菌落，在含有X-Gal和IPTG三抗平板（含卡那霉素50μg/ml，四环素10μg/ml，庆大霉素7μg/ml）上划线两次，继续培养，挑取白色菌落，获得含重组Bacmin克隆。

双表达盒重组Bacmid制备：将纯化的重组转移质粒pFBDM/HANAM1和pUCDM/HANAM1共转化DH10Multibac^Cre，按照Multibac Expression System说明书操作。具体地，取2-4μg重组质粒pFBDM/HANAM1和2-4μg pUCDM/HANAM1加入100μlDH10Multibac^Cre感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃，热激45sec；冰浴2min；加入二抗LB培养基（卡那霉素50μg/ml和四环素10μg/ml）于37℃，200rpm培养4h；将转化DH10Multibac^Cre培养菌液10倍梯度稀释，每梯度取200μl涂布含有X-gal（100μg/ml）和IPTG（40μg/ml）的四抗平板上（含卡那霉素50μg/ml，四环素10μg/ml，庆大霉素7μg/ml，氯霉素25μg/ml），37℃静置培养36-48h。挑取白色菌落，在X-gal和IPTG四抗平板上划线两次，继续培养，挑取白色菌落，获得含重组Bacmid的克隆。

4）重组Bacmid提取

经抗性和蓝白斑筛选获得纯rbacmid菌落，挑取纯培养工程菌落，接种5ml液体LB，37℃培养；14000g离心1min；弃去上清，沉淀用0.3ml溶液I，重悬；加入0.3ml溶液II，轻轻混匀，室温静置5min；慢慢加入0.3ml3M乙酸钾，混匀，冰上静置5min，14000g离心10min；将上清转移到新的离心管，再加入0.8ml异丙醇，混匀，冰上放置10min；4℃，14000g离心15min；用70%的乙醇洗两次，室温放置让乙醇挥发；TE（pH7.4）溶解，-20℃保存备用。获得穿梭质粒rbacmid/HANAM1。

5）rbacmid鉴定

由于rbacmid基因组大，不能直接进行酶切鉴定，采用引物特异性PCR扩增和产物测序加以验证。按步骤5.3）提取重组bacmid作为模板，用引物P1与P2、P3与P4、P5与P6分别进行PCR，扩增出HA、NA和M1基因，琼脂糖凝胶电泳分离，DNA试剂盒纯化各种PCR产物，测序验证正确的克隆用于拯救重组杆状病毒。

6.重组杆状病毒的拯救

1）Sf9昆虫细胞培养采用贴壁方式培养Sf9细胞拯救重组杆状病毒。从液氮罐中取出1支Sf9种子细胞，37℃水浴快速解冻，转移细胞悬液至15ml无菌离心管，加入27℃预温的Grace’s培养液（含10%胎牛血清）中，轻轻混匀，1000rpm离心5min，弃上清，细胞用10mlGrace’s培养液（含10%胎牛血清）悬浮，接种到T25细胞培养瓶，置27℃静置培养4-6天至细胞单层形成。

重组杆状病毒的产生采用Lipofectamine2000（invitrogen公司产品）将穿梭质粒rbacmid/HANAM1转染Sf9细胞，拯救重组杆状病毒。转染过程参照产品说明书进行，具体步骤如下：取生长状态良好的Sf9细胞，用0.25%胰酶消化，按每孔2-4×10⁵个细胞的浓度铺于6孔板（Corning公司产品）中，细胞形成约80%-90%单层；用96μlGrace’s培养液（无血清）稀释4μg重组bacmid DNA，轻轻混匀；取8μl Lipofectamine2000加入92μlGrace’s培养液（无血清），轻轻混匀；静置15min，将重组质粒混合物缓慢加入到脂质体混合物中，轻轻混匀，期间用无血清Grace’s培养液洗涤细胞，向细胞孔内加入800μl（无血清）；将脂质体-质粒混合物滴加到细胞孔中，轻轻混匀，27℃孵育6h后吸去转染混合物，换用2%胎牛血清的Grace’s培养基，继续培养4-6天，将细胞冻融1次，4℃离心10min，收集细胞培养上清，获得表达禽流感HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒。

2）重组杆状病毒的克隆纯化

采用有限稀释法纯化杆状病毒。具体方法如下：在96孔板中，按5×10⁵细胞/ml的量铺板50μl，6h；待细胞贴壁后，吸弃培养基，用PBS洗两遍；将病毒液加入Grace’s培养基（无血清）至100μl稀释到10^-7，吸取1μl病毒液加入到细胞孔中，1h；弃去培养基，加入Grace’s培养基（2%胎牛血清）100μl，27℃孵育72h；挑取一孔仅有一个细胞出现变大变圆、脱落死亡的细胞孔；按5×10⁵细胞/ml的量铺板50μl于96孔板中，将前面挑取的单个感染细胞放入该96孔细胞孔中培养，27℃孵育72h，收取上清；按5×10⁵细胞/ml的量铺板200μl，上一步骤收取的上清转移到24孔细胞板中，扩大培养，直至得到滴度较高的重组杆状病毒。此时得到的病毒再按上述步骤操作一次，即可得到纯化的重组杆状病毒。

7.重组杆状病毒的鉴定

1）PCR鉴定重组杆状病毒按基因组DNA提取试剂盒说明书提取重组杆状病毒基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳，检测制备的DNA完整性和浓度。以所制备的DNA为模板，用引物P1与P2、P3与P4、P5与P6分别进行PCR，扩增出HA、NA和M1基因，测序验证。

2）间接免疫荧光染色检测重组杆状病毒感染Sf9细胞中目的蛋白的表达：取生长状态良好的Sf9细胞单层，用0.25%胰酶消化，用Grace’s培养液（8-10%）制成1×10⁵细胞悬液，接种于6孔板（1ml/孔），27℃静置培养48h。取200μl重组杆状病毒液，用6ml无血清Grace’s培养液稀释，加入Sf9细胞的6孔板中（0.5ml/孔），不加病毒稀释液的孔为阴性对照；27℃静置1h。吸弃病毒液，换成含2%胎牛血清Grace’s培养液，27℃继续培养48h。弃去培养液，PBS洗涤细胞1次；加入200μl-20℃预冷丙酮/甲醇混合液（1:1，vol/vol），室温固定10min；吸弃丙酮/甲醇混合液，PBST洗涤细胞2次，5min/次；加入稀释的抗-HA或抗-NA多克隆抗体（1:800稀释）（200μl/孔）37℃作用1h；吸弃抗体混合液，PBST洗涤3次，5min/次；加入FITC标记的羊抗兔IgG（1:200）（31460，Pierce公司产品），37℃避光作用1h；吸弃标记抗体混合液，PBST洗涤3次，5min/次；在荧光显微镜下观察实验结果。

结果显示，感染重组杆状病毒的Sf9细胞中能表达H9N2病毒HA和NA蛋白。

3）Western Blotting重组杆状病毒感染Sf9细胞中HA、NA和M1蛋白表达：用抗-HA、抗-NA、抗-M1多克隆抗体或者三者的混合组分为一抗，Westernblotting分析相应蛋白表达。具体步骤包括：

（1）样品处理：重组杆状病毒感染Sf9细胞（T75细胞培养瓶）72h后，收获细胞培养上清和细胞，上清液真空冻干，加入200μlPBS重悬。细胞用细胞刮收集，200μlPBS重悬细胞。取200μl细胞重悬液和上清液（冻干粉重悬液体积），分别加入等体积样品缓冲液（Loadingbuffer）混匀，水浴锅煮沸5min，冷却备用。

（2）蛋白质组份SDS-PAGE电泳分离：采用5%浓缩胶、10%分离胶进行电泳。具体按《分子克隆实验手册》进行。为便于比较，电泳加样时使用相同体积的各样品。

（3）转膜与抗体反应待电泳结束，取出凝胶并用清水洗涤。同时用转膜缓冲液浸泡硝酸纤维膜（NC）和滤纸5min，按阴极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-阳极顺序铺设凝胶和NC膜，放入电泳槽，88V电压低温条件下电泳3h。取出NC膜用1×PBST（%Tween-20的PBS）洗涤5min，加入含5%脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液（blocking buffer），37℃孵育2h。PBST洗涤NC膜3次，每次10min。加入兔抗HA、抗NA和M1多克隆抗体混合物（1:500PBST稀释），37℃孵育2h。PBST充分洗涤NC膜3-5次，每次10min。加入HRP标记羊抗兔IgG抗体（Pierce公司产品，PBST1:3000稀释），37℃孵育1h，PBST充分洗涤NC膜3-5次，每次10min。加入DAB显色（具体配方见《分子克隆实验手册》），室温避光显色5-10min，清水洗NC膜观察记录结果。

结果显示，纯化的重组杆状病毒可表达HA、NA和M1。

8.重组杆状病毒增殖和滴度测定

1）重组杆状病毒的增殖取0.1ml经克隆化的重组杆状病毒液稀释至5ml（含8-10%胎牛血清的Grace’s），接种70-80%的Sf9细胞单层上（T25瓶），轻轻混匀，27℃静置培养48-72h，冻融细胞1次，细胞裂解液转移至15ml离心管中，4℃，500g离心10min，收获上清液，记录重组病毒代次，-70℃或液氮中冻存备用。

2）病毒滴度测定取生长良好的Sf9细胞，0.25%胰酶消化，加入Grace’s培养液悬浮细胞，使浓度稀释至5×10⁵细胞/ml，按1ml/孔接种6孔板，37℃静置培养48-72h。

待Sf9细胞长至70-80%单层，用无血清无抗生素的Grace’s培养基轻轻冲洗细胞，取重组病毒原液用无血清无抗生素的Grace’s培养基10倍梯度稀释，加入到Sf9细胞单层上（1ml/孔），每个稀释度做2个平行孔；27℃静置吸附1h；吸弃病毒液，换成含1%甲基纤维素的Grace’s培养基（8%-10%胎牛血清），27℃静置培养4-6天，观察空斑形成。

每个细胞孔用200μl福尔马林固定30min，加入15的结晶紫（50μ/孔l），室温染色1h，清水轻轻冲洗后，再加入中性红复染30min；冲洗、晾干后计数空斑；计算病毒效价pfu/ml。

3）重组杆状病毒基因组遗传稳定性测定重组杆状病毒按MOI=3接种70-80%单层Sf9细胞，27℃静置培养4-6天，收获病毒液；按相同方法连续传代20代以上，收获各代次病毒液，分装，冻存-70℃或液氮中，备用。

分别取第5代、第10代、第15代和第20代的病毒液，提取病毒基因组，按基因组DNA提取试剂盒说明书（Solarbio，Beingjing Solarbio2008）进行，采用特异性引物PCR扩增HA、NA基因片段，测序分析两个基因的核苷酸序列。

结果显示，重组杆状病毒在Sf9细胞上连续传代20代次，抗原蛋白编码基因HA和NA未发生突变。

实施例2：基因VII型新城疫病毒样颗粒（VLPs）的构建与检测

1.引物的设计与合成根据GenBank中新城疫基因VII型毒株（GenBank:AF431744.3），的F基因、HN基因和M基因序列分别设计合成三对特异性引物，分别扩增F、HN和M基因；各引物由上海生物工程技术有限公司合成了各引物的序列和编号如下：

F基因的扩增引物：

NDV-P1：5'-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTC-3'

NDV-P2：5'-TGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAG-3'

HN基因的扩增引物：

NDV-P3：5'-GCAGCCTGTGTGTCAATTCCGAT-3'

NDV-P4：5'-CTACCCGTGTTCTCCCTTGTTG-3'

M基因的扩增引物：

NDV-P5：5'-AGGACAATCGGGCTGTACTTT-3'

NDV-P6：5'-CAGGTGAACTAACTATAAGCAGTC-3'

2.基因VII型NDV病毒ZJ1株总RNA提取及cDNA合成

取250μl ZJ1株尿囊液，用总RNA提取试剂盒（一步法总RNA提取试剂盒，BSC51S1，上海华舜生物工程有限公司产品），按试剂盒操作说明书介绍的方法提取病毒总RNA。提取的RNA溶于16μlDEPC处理过的水中，加入1μl六聚体随机引物，70℃变性5min破坏RNA二级结构，迅速冰浴5min，加入逆转录混合液：5×RT Buffer5μl，dNTPs（10μM）1μl，RNsin（40U/μl）0.5μl，AMV reverse transcriptase（10U/μl）0.5μl，用手指在外壁轻拨混匀，瞬时离心，置PCR热循环仪上进行以下反应：42℃反转录90min，之后取出95℃作用5min以灭活残余的反转录酶，置冰浴，产物即为病毒基因组cDNA，冻存备用。

3.PCR扩增

以步骤2合成的基因VII型NDV病毒cDNA为模板，PCR分别扩增F，HN和M基因，扩增反应体系和具体反应条件如下：

1）F基因扩增

用移液器将上述组份混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性2min，再94℃20sec，56℃30sec，72℃90sec进行30个循环。72℃10min。

6）NA基因扩增

用移液器将上述组份混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性2min，再94℃20sec，56℃30sec，72℃90sec进行30个循环。72℃10min。

M基因扩增

用移液器将上述组份混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性5min，再94℃30sec，55℃30sec，72℃90sec进行30个循环。72℃10min。

4.杆状病毒转移载体的构建

将F、HN和M基因亚克隆到载体上，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，提取质粒。测序，将阳性质粒命名为pMD-18T-F、pMD-18T-HN、pMD-18T-M。

用限制性核酸内切酶BgI I酶切重组质粒pMD-18T-F，Xba I、Stu I双酶切pMD-18T-HN，Sma I、Spe P双酶切消化pMD-18T-M。分别从各质粒上将F、HN和M基因切下，杆状病毒转移载体按照载体构建的次序用相应的内切酶酶切。依次将F、HN和M基因构建到杆状病毒转移载体pAcAb₄（购自BD Biosciences公司）上，转化大肠杆菌感受态DH5a，提取质粒，酶切鉴定和质粒PCR鉴定均按常规方法及试剂盒说明书进行。最后获得一个杆状病毒转移载体为pAcAb₄-F-HN-M。F、HN和M基因构建在同一个质粒上，方便了转染操作，各自有单独的启动子，分别表达。

5.重组杆状病毒的拯救

1）Sf9昆虫细胞培养采用贴壁方式培养Sf9细胞拯救重组杆状病毒。从液氮罐中取出1支Sf9种子细胞，37℃水浴快速解冻，转移细胞悬液至15ml无菌离心管，加入27℃预温的Grace’s培养液（含10%胎牛血清）中，轻轻混匀，1000rpm离心5min，弃上清，细胞用10mlGrace’s培养液（含10%胎牛血清）悬浮，接种到T25细胞培养瓶，置27℃静置培养4-6天至细胞单层形成。

2）重组杆状病毒的产生待Sf9细胞长到60-70%时，pAcAb₄-F-HN-M与LinearizedbaculovirusDNA（购自BD Biosciences公司）共转染Sf9细胞，拯救重组杆状病毒。转染过程参照产品说明书进行。转染之后96h-120h，收集细胞培养上清，获得表达基因VII型新城疫病毒的F、HN和M蛋白的重组杆状病毒。

3）重组杆状病毒的克隆纯化

采用有限稀释法纯化杆状病毒。具体方法如下：在96孔板中，按5×10⁵细胞/ml的量铺板50μl，6h；待细胞贴壁后，吸弃培养基，用PBS洗两遍；将病毒液加入Grace’s培养基（无血清）至100μl稀释到10^-7，吸取1μl病毒液加入到细胞孔中，1h；弃去培养基，加入Grace’s培养基（2%胎牛血清）100μl，27℃孵育72h；挑取一孔仅有一个细胞出现变大变圆、脱落死亡的细胞孔；按5×10⁵细胞/ml的量铺板50μl于96孔板中，将前面挑取的单个感染细胞放入该96孔细胞孔中培养，27℃孵育72h，收取上清；按5×10⁵细胞/ml的量铺板200μl，上一步骤收取的上清转移到24孔细胞板中，扩大培养，直至得到滴度较高的重组杆状病毒。此时得到的病毒再按上述步骤操作一次，即可得到纯化的重组杆状病毒。

6.重组杆状病毒的鉴定

1）PCR鉴定重组杆状病毒按基因组DNA提取试剂盒说明书提取重组杆状病毒基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳，检测制备的DNA完整性和浓度。以所制备的DNA为模板，用引物AIV-P1与AIV-P2、AIV-P3与AIV-P4、AIV-P5与AIV-P6分别进行PCR，扩增出F、HN和M基因，测序验证。

2）间接免疫荧光染色检测重组杆状病毒感染Sf9细胞中目的蛋白的表达：方法同实施例1的7.2）。结果显示，感染重组杆状病毒的Sf9细胞中能表达基因VII型新城疫病毒F、HN和M蛋白。

3）Western Blotting重组杆状病毒感染Sf9细胞中F、HN和M蛋白表达：用抗-F、抗-HN、抗-M多克隆抗体或者三者的混合组分为一抗，Westernblotting分析相应蛋白表达。具体步骤同实施例1的7.3）。结果显示，纯化的重组杆状病毒可表达F、HN和M蛋白。

7.重组杆状病毒增殖和滴度测定具体操作方法同实施例1的8.1）、8.2）、8.3）。结果显示，重组杆状病毒在Sf9细胞上连续传代20代次，抗原蛋白编码基因F、HN和M未发生突变。

实施例3：禽流感、新城疫二联病毒样颗粒的规模化制备及检定

1.SF9昆虫细胞培养条件优化与规模化细胞悬浮培养

1）重组杆状病毒最佳接种浓度优化

取生长状态良好的Sf9细胞，0.25%胰酶消化，接种到6孔板中，细胞形成约80%单层，分别以MOI=0.01、0.1、1、3、5和10几种不同稀释度接种第三代重组杆状病毒，吸附1h后，更换新鲜Grace’s培养液（2%胎牛血清），于27℃静置培养，分别于接种病毒后2、3、4、5、6和7天各收获病毒液。

病毒滴度测定：取生长良好的Sf9细胞，0.25%胰酶消化，加入Grace’s培养液悬浮细胞，使浓度稀释至5×10⁵细胞/ml，按1ml/孔接种6孔板，27℃，静置培养48-72h。

待Sf9细胞长至70%-80%单层，用无血清无抗生素的Grace’s培养液轻轻冲洗细胞，取重组病毒原液用无血清无抗生素的Grace’s培养液10倍梯度稀释，加入到Sf9细胞单层上（1ml/孔），每个稀释度做2个平行孔；27℃，静置吸附1h；吸弃病毒液，换成含1%甲基纤维素的Grace’s培养基（8-10%胎牛血清），27℃，静置培养4-6天，观察空斑形成。

每个细胞用200μl福尔马林固定30min，加入1%的结晶紫（50μl/孔），室温染色1h，清水轻轻冲洗后，再加入中性红复染30min；冲洗、晾干后计数空斑；计算病毒效价pfu/ml。

按上述方法测定各MOI感染剂量在不同增殖时间后的病毒滴度，确定重组杆状病毒的最佳感染剂量和增殖培养时间。

结果表明，在Sf9细胞中，重组杆状病毒最佳接种浓度为MOI=3或MOI=5；接种病毒72-120h后获得最高病毒滴度。

2）细胞初始接种密度的确定

取生长状态良好的Sf9细胞，用0.25%胰酶消化，用Grace’s（8-10%胎牛血清）配制成5×10⁵细胞/ml细胞悬液，按10ml/瓶接种在T75细胞培养瓶，每批接种10-20瓶，27℃静置培养4-6天，待细胞长满单层，吸弃Grace’s培养液，用0.25%胰酶消化后，加入新鲜Grace’s培养液（含8-10%胎牛血清）悬浮细胞；

取0.1ml细胞悬液，用PBS（pH7.4）稀释至1ml，加入等体积4%台盼蓝染色液，室温染色5-10min，轻轻混匀，滴注细胞计数板中显微镜下计数细胞密度。

按2-4×10⁵细胞/ml的密度，将Sf9细胞接种到转瓶中，根据细胞总数加入200-1000ml培养基和终浓度10U/ml的肝素钠（商品肝素钠粉剂的活性单位150-190U/1mg），27℃，28rpm悬浮培养细胞。每日无菌条件下吸取1ml悬浮培养液，加入等体积4%台盼蓝染色液染色5-10min，显微镜下计数，计算细胞密度和存活率。结果显示，Sf9细胞悬浮培养42-60h密度达2×10⁶细胞/ml、细胞存活率在90%以上，此时进行重组病毒接种。

2.病毒颗粒纯化

1）待悬浮细胞扩增至浓度约为2×10⁶细胞/ml、细胞存活率在90%以上，按MOI=3的剂量接种重组杆状病毒rBV-HANAM1或者pAcAb₄-F-HN-M，于27℃，28rpm继续悬浮培养72h。

2）收取接种了重组杆状病毒的Sf9细胞培养物，转移至50-250ml离心管中进行差速离心，即：4℃，100g离心5min，500g离心5min，1000g离心5min，1500g离心5min，2000g离心10min，最后4000g离心30min，收取上清。

3）取50-250mlBeckman离心管（离心管大小视样品量选取）2-6只，离心管底部铺30%蔗糖溶液10ml，将步骤2.2）制备的培养上清液缓缓加入到离心管蔗糖层上，4℃，40，000g离心3-4h；弃去上清液，用1-2ml预冷的无菌PBS重悬沉淀物。

4）取10-50ml Beckman离心管2-6只，向离心管底部加入浓度梯度20-60%蔗糖溶液，每个蔗糖梯度溶液加3-4ml，用1ml注射器吸取各蔗糖溶液顶层，4℃。100,000g，离心12-14h；用注射器分别收集各蔗糖层样品，采用Western blot、血凝试验分别检测样品中HA、NA、M1蛋白表达F、HN、M蛋白和VLPs血凝活性；采用磷钨酸溶液染色，电镜观察VLPs结构。

3病毒样颗粒的检定

1）Western blot检测Sf9细胞系中病毒蛋白（HA，NA、M1和F、HN、M）的表达：禽流感的用抗-HA、抗-NA、抗-M1多克隆抗体或者三者的混合组分为一抗（新城疫的用抗-F、抗-HN、抗-M多克隆抗体或者三者的混合组分为一抗），Westernblotting分析相应蛋白表达。具体方法同实施例1的7.3）。

2）血凝活性测定

取96孔V型血凝板，向第2至第12列中加入生理盐水（50μl/孔），在第1列中加入50μl纯化的VLPs样品液，在第2列孔内加入50μl纯化的VLPs样品液，混合数次，吸出50μl至第3列孔，混匀，依次系列倍比稀释至第11列，混匀后弃去50μl混合液，第12列孔作为阴性对照。每孔加入50μl1%的鸡红细胞悬液，轻轻混匀，室温静置10-30min，至阴性对照孔红细胞完全沉淀时开始观察结果。

以测定管出现红细胞完全凝集的抗原最高稀释倍数作为样品的血凝效价。结果显示，经蔗糖梯度离心分离纯化的H9N2禽流感VLPs血凝效价为1:32～1:64；基因VII型新城疫VLPs血凝效价为1:64～1:128。

3）病毒样颗粒的电子显微镜检测

取纯化的VLPs样品液1-2滴，滴加在铜网支持膜上，作用1min后用滤纸沿铜网边缘吸干，向样品铜网上滴加1-2滴2%磷钨酸染色液（蒸馏水配制，pH6.8），室温染色1min，滤纸沿铜网边缘吸干，将制备好的负染色样品置投射电子显微镜下观测，记录结果。

电镜观察结果显示，本发明描述技术获得的H9N2禽流感病毒VLPs呈典型的流感病毒颗粒结构，基因VII型新城疫病毒VLPs呈典型的新城疫病毒颗粒结构。

实施例4：禽流感、新城疫病毒样颗粒二联疫苗的制备与检验

1.疫苗制备

1.1油相制备取注射用白油94份和司本-806份混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌冷却后备用，即为油相。

1.2水相制备将两种抗原（取血凝价为1:32～1:64的H9N2VLPs与血凝价为1:64～1:128的NDV VLPs）按1:1～1:2比例混合于灭菌容器中，加入4%灭菌并冷却后的吐温-80，充分振摇，使吐温-80完全溶解为止，即为水相。

1.3乳化取油相置乳化罐内，开动电机慢速搅拌，然后徐徐加入水相，加完后再以2800r/min乳化40分钟即可（水相:油相比例为1:1～1:3）。在乳化终止前加入1%硫柳汞，使其终浓度为0.01%。

2.成品检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，疫苗的外观、剂型、稳定性、黏度及无菌性均合格。

实施例5：禽流感、新城疫病毒样颗粒二联疫苗的功能检测

为了评价禽流感、新城疫病毒样颗粒二联疫苗的安全性和免疫效力，本发明采用SPF鸡为动物模型，将此病毒样颗粒二联苗与常规的二联灭活苗进行安全性和效力比较

1.禽流感、新城疫病毒样颗粒二联疫苗安全性评价

取14日龄SPF鸡30只，随机分为3组，每组10只，A组肌肉注射禽流感、新城疫病毒样颗粒二联疫苗，剂量1ml，B组肌肉注射常规的二联灭活苗（名称：鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗，批号120932），剂量1ml，C组肌肉注射1ml无菌PBS作为阴性对照。

注射后观察14天，鸡只有无任何全身症状或局部炎症反应。

结果显示，禽流感、新城疫病毒样颗粒二联疫苗免疫组、常规二联灭活苗免疫组和PBS对照组鸡只均无任何全身症状或局部炎症反应。

2.禽流感、新城疫病毒样颗粒二联疫苗效力评价

1）鸡新城疫部分HI抗体测定用30～60日龄SPF鸡25只，10只各皮下或肌肉注射病毒样颗粒二联苗12μl，另取10只各皮下或肌肉注射常规二联灭活苗12μl，另5只作对照。免疫后21～28日，每只鸡各采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果显示，病毒样颗粒二联苗免疫组HI抗体效价的几何平均值不低于1∶256（微量法），常规二联灭活苗免疫组的HI抗体效价的几何平均值不低于1∶84（微量法），对照组HI抗体效价均不高于1∶4（微量法）。

2）禽流感（H9亚型）部分HI抗体测定用3～4周龄SPF鸡，25只，其中10只各皮下或肌肉注射病毒样颗粒二联苗0.15ml，另取10只各皮下或肌肉注射常规二联灭活疫苗0.15ml，另5只不免疫作对照。免疫后21日，每只鸡分别采血并分离血清，用商品化的禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体效价。结果显示，病毒样颗粒二联苗免疫组HI抗体效价的几何平均值不低于1∶256（微量法），常规二联灭活苗免疫组的HI抗体效价的几何平均值不低于1∶128（微量法），对照鸡HI抗体效价均不高于1∶4。

3）禽流感（H9亚型）部分攻毒试验将实施例5的2）步骤中的试验鸡在免疫后21日，分别各静脉注射禽流感病毒（H9亚型）SZ株(Avian influenza virus(H9subtype)strainSZ)（保藏号为CCTCCNO:V201240，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉·武汉大学，保藏日期2012年9月16日）、HL株（见文献：孙进忠等，禽流感病毒（H9N2亚型，HL株）与国内部分省禽流感病毒（H9亚型）流行株抗原相关性及交互免疫的研究，2007年畜牧兽医学会年会论文集，2007，35-38）病毒液0.2ml（含10^7.0EID₅₀）进行攻毒。攻毒后第5日，采集每只鸡的喉头及泄殖腔棉拭子。将同一只鸡的两种棉拭子液混合后作为一个样品，经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察5日，测定所有鸡胚液HA效价。每个样品接种的5枚鸡胚中，只要有1枚鸡胚的鸡胚液HA效价不低于1∶16（微量法），即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。结果显示，经两株病毒攻毒后，本发明病毒样颗粒二联苗免疫组均0/10排毒；常规二联灭活苗免疫组经禽流感病毒HL株攻毒后2/10～3/10排毒，经禽流感病毒SZ株攻毒后3/10～4/10排毒；对照组均5/5排毒。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括流感病毒样颗粒抗原和新城疫的病毒样颗粒抗原；其中，所述流感病毒样颗粒抗原包括H9亚型禽流感病毒SZ株的表面抗原红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA和基质蛋白M1的自我装配体，所述SZ株保藏号为CCTCC V201240；以及

所述新城疫的病毒样颗粒抗原为基因VII型新城疫ZJ1株的病毒样颗粒抗原，所述基因VII型新城疫的病毒样颗粒抗原包括基因VII型新城疫病毒的融合蛋白F、核衣壳蛋白NP和基质蛋白M的自我装配体，所述ZJ1株GenBank登录号为AF431744.3。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括佐剂。

3.一种疫苗组合物的制备方法，所述方法包括：

(1)克隆表达权利要求1所述的流感病毒的抗原蛋白，所述流感病毒的抗原蛋白能够自我装配为所述流感病毒样颗粒抗原，所述流感病毒的抗原蛋白包括H9亚型禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA和基质蛋白M1；

(2)克隆表达权利要求1所述的新城疫病毒的抗原蛋白，所述新城疫病毒的抗原蛋白能够自我装配为所述新城疫的病毒样颗粒抗原，所述新城疫病毒的抗原蛋白包括基因VII型新城疫病毒的融合蛋白F、核衣壳蛋白NP和基质蛋白M；以及

(3)按比例将所述流感病毒样颗粒抗原和新城疫的病毒样颗粒抗原混合，加入佐剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述HA、NA和M1克隆于同一个表达载体于昆虫细胞表达体系进行表达；所述步骤(2)中所述F、NP和M克隆于同一个表达载体于昆虫细胞表达体系进行表达。

5.根据权利要求1～2任一项所述的疫苗组合物在制备治疗和预防流感病毒和新城疫病毒相关疾病的药物中的应用。