CN101376027A - 表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rL－H9HA。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。

Description

表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达编码禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rL-H9HA。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。

背景技术

世界动物卫生组织(OIE)规定的A类传染病中，包括两种禽类烈性传染病，分别为高致病性禽流感和新城疫。高致病性禽流感除H5或H7亚型AIV以外，还有可感染人的H9亚型AIV，具有更为重要的公共卫生意义。采用新城疫弱毒疫苗构建防制高致病性禽流感重组病毒活载体疫苗，可以真正实现一种疫苗预防两种重大疫病。现有禽流感灭活疫苗具安全、免疫保护效果好的优点，但仍存在着制造成本高、使用相对不便的不足^[1，2，3]。研制高效安全、成本低廉、使用方便的新一代疫苗具有重要的现实意义。

AIV属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可诱导机体产生抗体介导的特异性体液免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。

重组新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)可同时诱导体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫^[4，5]，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式；经过多年的临床应用检验，NDV遗传相对稳定，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，便于规模化生产。因此，NDV作为疫苗载体具有广阔的应用空间和巨大的经济意义。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔拯救(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功拯救了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

针对上述研究背景，本发明人为进一步提高禽流感病毒表达抗原的免疫原性，构建表达禽流感病毒H9亚型HA免疫原蛋白的重组NDV活载体二联弱毒疫苗rL-H9HA，通过滴鼻、点眼、肌肉注射甚至饮水、喷雾吸入等多种途径免疫动物以诱导对禽流感的保护免疫反应，用于禽类新城疫与禽流感(H9亚型)的预防免疫。

因此，本发明的一个目的是提供一种表达编码禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

在一个实施方案中，所述用于表达HA蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC))。

在一个实施方案中，所述禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在另一个实施方案中，所述编码禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示。

在另一个实施方案中，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗为rL-H9HA。

本发明还有一个目的是提供本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种生产本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码禽流感病毒H9型HA蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

在一个实施方案中，其中所述转录质粒是pBRN-FL-H9HA。

在另一个实施方案中，所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP和pBSL。

在另一个实施方案中，所述宿主细胞是稳定表达T7聚合酶的细胞系。

本发明还有一个目的是提供根据本发明的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗rL-H9HA。

本发明以我国广泛使用的一株新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株(AV1615，商购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC)为载体，通过反向遗传操作技术，构建了表达A/Chicken/Shandong/07/2/H9N2(SD/07)分离株裂HA基因重组NDV LaSota疫苗株，经临床试验证实可以保护SPF雏鸡免受H9N2强毒株的攻击，为防制禽流感和新城疫的多联/多价重组基因工程活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

更具体地，本发明在现有技术已知的新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统(参见ZL200510097997.8)的基础上，构建了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组NDV基因组cDNA克隆，经间接免疫荧光鉴定成功拯救重组病毒rL-H9HA。重组病毒平均致死时间(MDT)≥168小时，脑内致病指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)均为0。重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性，并且鸡胚连续传9代次仍保持HA的稳定表达及生物学特性不变。以1x10⁶EID₅₀(半数感染量(EID₅₀))病毒量接种SPF雏鸡，免疫后21d对鸡新城疫病毒北京株(F48E9)的致死性攻击可提供100％的保护，对于H9亚型禽流感病毒002的攻击，免疫鸡在攻毒后3天的喉头和泻殖腔拭子病毒分离阳性率为1/10，5天时喉头一例阳性，其余为阴性。而对于H9亚型禽流感病毒FJ株的攻击，仅3天的喉头拭子一例阳性，其余为阴性。免疫组病毒的分离率显著低于对照组。重组病毒rL-H9HA具有作为同时预防H9亚型禽流感和新城疫的双价苗的应用前景。

附图说明

图1.新城疫病毒重组H9亚型HA基因组cDNA的构建。空白矩形框代表NDV LaSota基因，HA基因为灰色阴影矩形，经Pme I位点插入rLaSota-HA载体，图上部为HA基因开放阅读框，大括号表示插入外源基因的核酸序列，边框部分表示基因起始信号和基因终止信号序列，基因间隔序列见标示，HA基因起始密码子ATG和终止密码子TAA以下划线标示，HA基因其余部分用逗点表示，Kozak序列用斜体表示；

图2.重组病毒RT-PCR检测结果。1为重组病毒接种SPF鸡胚尿囊液RT-PCR结果，2为DNA分子量标准；

图3.重组病毒感染BHK细胞HA基因表达的检测。重组病毒感染BHK-21细胞，A-C为rLaSota感染组，D-F为rL-H9HA感染组，A，D组以抗NDV血清为一抗，B，E组以抗H9N2 AIV为一抗，C，F以SPF鸡阴性血清为一抗进行免疫荧光检测；

图4.pBRN-FL-PmeI的质粒图谱；

图5.pBRN-FL-H9HA的质粒图谱；

图6.质粒pBSNP的序列，带下划线的斜体部分是NP基因的编码序列；

图7.质粒pBSP的序列，带下划线的斜体部分是P基因的编码序列；

图8.质粒pBSL的序列，带下划线的斜体部分是L基因的编码序列；

图9.质粒pBRN-FL-H9HA的全序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1  表达禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的构建和生物学活性

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

BHK-21细胞(ATCC CCL-10)，培养基为含10％胎牛血清的DMEM；H9亚型禽流感毒株A/Chicken/Shandong/07/2/H9N2(SD/07)商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室；攻毒试验用鸡新城疫病毒北京株(F48E9)商购自中国兽医药品监察所；稳定表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)购于ATCC；新城疫血凝抑制试验(HI)诊断抗原由哈尔滨维科生物技术开发公司生产并提供；H9亚型禽流感病毒高免血清和H9亚型禽流感血凝抑制试验(HI)诊断抗原商购自国家禽流感参考实验室。鸡抗NDV高免性血清和SPF阴性血清购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂和仪器

FITC标记的兔抗鸡荧光二抗购自Sigma公司。工具酶均购自TaKaRa公司。RNA提取试剂Trizol，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒，无血清培养基Opti-MEM I、磷酸钙转染试剂盒以及胎牛血清均购自Invitrogen公司，TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)处理的胰酶购自Sigma公司(Sigma，Cat#T8802)。质粒中量提取试剂盒购自QIAGEN公司。普通显微镜与荧光显微镜，分别购自Leica公司。PCR仪购自MJ Research公司。核酸测序采用BECKMAN CEQ 8000自动测序仪，所用试剂为BECKMAN公司产品。P2级生物安全柜购LABCONCO自公司。不同型号离心机均购自BECKMAN公司。-70℃超低温冰箱购自NBS公司。各种规格细胞培养瓶及细胞培养板均购自CORNING公司。

1.3 试验动物

9-11日龄SPF鸡胚和0-8周龄SPF鸡均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。所有SPF鸡感染及免疫实验均在哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供的负压隔离器中进行。

1.4 引物

试验中所用引物见表1。

表1 克隆质粒构建所用到的引物

注：下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，Kozak序列用斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用字符边框表示。

1.5 病毒基因组RNA的提取、反转录和PCR

取H9亚型禽流感毒株A/Chicken/Shandong/07/2/H9N2(SD/07)接种SPF鸡胚，2天后收取病毒尿囊液备用。提取RNA并进行反转录，产生病毒HA基因的cDNA。PCR在Pfu高保真DNA聚合酶作用下进行，按试剂盒说明书方法进行。

1.6 表达HA基因的全长cDNA克隆的构建

以SD/07病毒的cDNA为模板，以引物H9HA-PF和H9HA-PR进行PCR反应，扩增出HA片段，在HA基因ORF的5′端引入Pme I限制酶识别序列和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)及转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)，在HA的ORF的3′端引入Pme I限制酶识别序列，并确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数。PCR产物经凝胶电泳回收后平端克隆到pBlueScript载体(Clontech)的EcoR V位点，克隆产物为pBS-H9HA。经测序无误后，pBS-H9HA经PmeI处理，回收HA片段，并与同样经Pme I酶切的pBRN-FL-PmeI^[6](葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4):547～551)(病毒基因组转录质粒pBRN-FL-PmeI，含有新城疫病毒的基因组全长cDNA，质粒图谱见图4)连接，构建表达HA基因的重组基因组cDNA的pBRN-FL-H9HA(其全序列见SEQ ID No.3，质粒图谱见图5)。

1.7 重组病毒的拯救

如ZL200510097997.8或参考文献[6]所述，将表达新城疫病毒(基因组序列：GenBank登录号AY845400)的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBlueScript载体(Clontech)质粒T7启动子下游，分别构建转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL(序列分别如图6至8所示)。将表达H9HA的重组基因组全长cDNA克隆质粒pBRN-FL-H9HA与三个辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3的BHK-21细胞拯救重组病毒，详细过程参见参考文献^[6]。收获鸡胚尿囊液进行HA及NDV抗血清HI检验，阳性样品分装后，-70℃冻存，用于重组病毒鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定、连续传代、致病性、生物学特性及免疫原性试验。

1.8 RT-PCR鉴定及序列测定

不同代次重组病毒HA外源基因裂解位点的序列分析：取拯救重组病毒250μL，用Trizol RNA提取试剂盒提取病毒RNA，用上游引物P1：ATGGAAACAGTATCACTAATAAC和下游引物P2：TTATATACAAATGTTGCATCTGC，进行RT-PCR方法扩增H9亚型禽流感病毒HA基因部分片段，对扩增的PCR产物进行序列分析。

1.9 间接免疫荧光检测(IFA)

鸡胚尿囊腔接种扩增重组病毒尿囊液以DMEM适当倍数稀释，按感染复数MOI约为1、100μL体积感染生长于24孔板的BHK-21细胞，37℃，孵育1小时后弃去培养液，然后加入完全DMEM继续培养，20小时后用冰冷3％多聚甲醛室温固定细胞20分钟，含0.05％ Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗细胞后用1％ BSA进行封闭1小时后，以1:100稀释鸡抗NDV高免血清和抗H9N2 AIV高免血清(商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)作为一抗，同时设相同稀释倍数的NDV高免血清和SPF阴性血清为对照进行间接免疫荧光检测。

2.结果

2.1 表达H9HA基因的NDV全基因组cDNA克隆的构建和重组病毒的拯救

经PCR方法，在HA基因两端引入GE、GS和Pme I酶切位点，构建成的克隆质粒命名为pBS-H9HA。pBS-H9HA经Pme I酶切处理后回收，并进一步亚克隆连入同样经Pme I酶切处理过的pBRN-FL-PmeI上，构建成表达HA基因的重组NDV cDNA克隆质粒pBRN-FL-H9HA(图1)。

为了从克隆的cDNA中拯救感染性重组NDV，首先将pBRN-FL-H9HA与表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。收获转染细胞上清接种于9—11日龄的SPF鸡胚。4天后收获血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验呈阳性结果的鸡胚尿囊液。收获的阳性病毒尿囊液作为拯救重组病毒的F1代。进一步的RT-PCR(图2)及序列分析结果显示，重组病毒基因组带有HA基因，和预期完全相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用疫苗株基因组cDNA克隆成功拯救具有感染性的子代病毒rL-H9HA(也称为rLaSota-H9HA)。

2.2 间接免疫荧光试验(IFA)

rL-H9HA重组病毒感染细胞以NDV高免血清(图3D)和H9N2 AIV高免血清(图3E)为一抗的细胞孔内均观察到强荧光信号；不表达HA基因的rLaSota病毒(按照ZL200510097997.8制备)感染细胞以NDV高免血清(图3A)为一抗的细胞孔内观察到同样的荧光信号(图3A)，用H9N2AIV高免血清为一抗检测rLaSota感染细胞不能观察到阳性反应(图3B)，rLaSota和重组病毒rL-H9HA感染细胞以SPF血清为一抗的间接免疫荧光染色结果为阴性(图3C、F)。

实施例2 rL-H9HA重组病毒的致病性试验和对雏鸡的免疫试验

1.材料与方法

材料、仪器同实施例1。

1.1 重组病毒的致病性试验

重组病毒rL-H9HA的鸡胚平均致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)及鸡静脉内致病指数(IVPI)等致病性试验按O.I.E.标准进行^[1，2]。

1.2 重组病毒对雏鸡的免疫试验

为了评价重组病毒对SPF雏鸡的免疫保护效果，鸡胚扩增尿囊毒以2x10⁶EID₅₀剂量经滴鼻加点眼途径分别人工免疫12羽7日龄白色来亨SPF鸡雏(商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)，另设非免疫对照组8羽；免疫组和非免疫对照组分别饲养于空气负压过滤隔离器中。免疫后19天翅静脉采血分离血清按常规检测NDV特异血凝抑制(HI)抗体，用H5亚型禽流感病毒4单位抗原测定血凝抑制(HI)抗体，免疫后21天用强毒F48E9以及H5N1亚型禽流感同源或异源病毒分别进行攻击，观察两周，统计发病与死亡情况。

攻毒后3、5、7天采集喉头拭子和泻殖腔拭子，对于鸡则采集死亡当天的拭子，棉拭子采集后在9-11日龄SPF鸡胚中进行病毒滴定。具体操作为：在采集喉头和泻殖腔拭子样品中直接加入1mL冰上预冷的灭菌PBS(每毫升PBS含1000单位青霉素和1000单位链霉素)，摇动混匀，然后以4000rpm/min低速离心5分钟。上清样品进行10倍系列稀释，各稀释度经尿囊腔途径接种9-11日龄SPF鸡胚4枚。孵化48小时后，收集鸡胚尿囊液，进行血凝试验(HA)。

2.结果

2.1 重组病毒的致病性试验

重组病毒rL-H9HA尿囊液鸡胚平均致死时间(MDT)大于168小时。重组病毒在SPF鸡胚上进行传代，各代次病毒对鸡均不表现出致病性，对6周龄SPF鸡静脉内致病指数(IVPI)与野生型亲本LaSota疫苗株完全一致，在感染后10天内没有出现任何发病症状，也没有死亡，IVPI值均为0。对新生雏鸡的脑内致病指数(ICPI)由亲本LaSota的0.4下降为0，说明病毒重组后被进一步致弱。

2.4 重组病毒对SPF雏鸡的免疫攻毒保护试验

采用rL-H9HA毒株和rLaSota毒株，分别以2x10⁶EID₅₀剂量经滴鼻加点眼途径分别人工免疫30羽4周龄白色来亨SPF鸡雏，另设非免疫对照组10羽，免疫后三周，采集血清，测定HI抗体，结果rLaSota-HA免疫后三周平均HI抗体滴度可以达到4log2以上。

免疫后三周，每组平均分成3组，其中2组分别用H9N2 AIV SD/02和FJ/04株(都由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室提供)10²LD₅₀剂量经鼻腔途径进行攻击。重组病毒免疫雏鸡攻毒后均未出现任何临床症状和死亡，攻毒后3、5天分别采集喉头及泻殖腔拭子，接种9-11日龄SPF鸡胚进行病毒分离滴定，重组病毒免疫组攻毒后病毒排放检测结果阳性率≤90％，远低于rLaSota免疫组和非免疫对照组病毒分离阳性率。

最后一组与对照组用NDV强毒F48E9以10⁵ELD₅₀的剂量，经肌肉注射途径进行攻击。重组病毒和rLaSota免疫雏鸡攻毒后未出现任何临床症状和死亡，而非免疫对照组6只鸡在攻毒后3天全部死亡，未进行喉头和泻殖腔拭子病毒分离试验。试验结果说明HA重组新城疫病毒rL-H9HA对免疫鸡提供了完全保护(表2)。

表2 rL-H9HA重组病毒对SPF鸡的免疫保护试验

a.实验组SPF鸡以10⁶EID₅₀的剂量，经滴鼻点眼途径接种rL-H9HA双价苗，每只鸡100μL，免疫后3周分别攻击10⁵EID₅₀的H9N1或是10⁵ELD₅₀的F48E9。

b.攻毒后3天、5天采集攻毒SPF鸡喉头和泄殖腔拭子。

c.对照鸡均为SPF鸡。

禽流感病毒跨越种间障碍传播的机率在逐渐加大，HPAIV(H5、H7、H9亚型)感染人和其它哺乳动物的报道屡见不鲜，这加重了人们对流感大流行发生的担忧。疫苗接种作为控制流感的一种主要手段，历来受到人们的高度关注。自1997年人们便开始研究可能用于预防流感大流行而使用的各种疫苗，但流感病毒变异频繁，血清型众多，而且型间无交叉保护，这给疫苗的研制造成了很大困难。目前，处于不同实验室研究阶段的流感大流行疫苗主要是针对H5N1和H7N7及H9N2的全病毒灭活疫苗、重配全病毒灭活疫苗、禽痘载体疫苗等，生产成本和技术难度限制了疫苗的广泛应用，研制新型禽流感疫苗成为众多科研工作者的焦点。

新城疫病毒作为载体表达外源蛋白是近年迅速发展起来的一项新技术。Plase.P采用高度致弱的B1株为载体，构成H7AIV重组新城疫病毒疫苗株，结果一次免疫雏鸡，对新城疫强毒和H7亚型高致病力禽流感病毒(HPAIV)的致死攻击的保护率仅为40％^[4]。通过对F基因裂解位点的修饰，提高B1株的致病力，结果对NDV强毒和HPAIV的致死性攻击保护率分别达到100％和90％^[7]。我们采用与Palese相似的策略，将H9 HA基因插入基因组P和M基因之间，重组病毒诱导出高水平H9特异HI抗体反应。尽管ICPI由重组前的0.4降为0，但一次免疫雏鸡，对新城疫强毒的致死性攻击的保护率为100％，对H9 AIV的攻击可大大降低免疫鸡的排毒率以及排毒量。

重组新城疫病毒表达流感病毒HA糖蛋白可以被动的装配到NDV病毒粒子表面，有可能发挥其相应的生物学功能^[5，8]。HA裂解位点是决定AIV高致病特性的分子基础。为此，构建了表达裂解位点连续疏水碱性氨基酸删除的突变型HA基因的重组NDV。

重组新城疫LaSota疫苗株能够一过性感染BHK-21等部分哺乳动物细胞系^[9]，可在细胞内有效复制、装配释放出成熟病毒粒子，同时表达重组的外源抗原蛋白H5亚型禽流感HA蛋白，并导致细胞圆缩等细胞病变。但在培养液缺乏特定蛋白酶情况下，释放出的重组病毒粒子表面F蛋白不能有效裂解为F1和F2亚单位，难以维持持续感染。因而，感染后24～36小时进行新城疫病毒抗原及禽流感病毒H5亚型HA抗原的免疫荧光检测，通过比较新城疫病毒和H5亚型禽流感病毒HA特异荧光阳性细胞的数量，可准确判断疫苗组成病毒的纯粹性和外源重组HA抗原表达的遗传稳定性。

重组新城疫病毒作为活毒疫苗不仅可诱导强烈的细胞免疫反应，而且可通过滴鼻、点眼等粘膜途径直接给苗，对诱导粘膜免疫极为有利。我们在研究中发现，雏鸡个体间对HA抗原的HI抗体反应能力存在着较大差距。rL-H9HA(SD)以10⁶EID₅₀常规剂量免疫后，个体间新城疫特异HI抗体反应显著，差别较小，但少数雏鸡个体间的H9禽流感特异HI抗体水平则差别显著，可以为1log2、2log2甚至阴性，但这些雏鸡往往对H9亚型禽流感病毒的攻击仍然可以形成保护，攻毒后不发病，攻毒后第3、5天喉头及泄殖腔排毒检测绝大部分仍为阴性，这些现象表明以新城疫为载体的疫苗其细胞免疫和粘膜免疫机制发挥了极为关键的免疫保护作用。

新城疫病毒反向遗传操作系统的成功建立使之成为研究外源蛋白生物学活性的完美表达载体，而作为禽病疫苗载体更具有绝对优势。新城疫病毒作为弱毒苗在生产实践中应用多年，具有良好的安全性和有效性。适应鸡胚生长，滴度高，便于大量生产，成本低。如果能够部分替代禽流感灭活疫苗的使用，不仅减轻生产压力，更能节约大量的国家财政开支。

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[9].Martine-Sobrido L.，Gitiban N.，Fernandez-Sesma A.et al Protection aginst RespiratorySyncytial Virus by a Recombinant Newcastle Disease Virus Vector.J.Virol[J]，2006，1130-1139.

序列表

<110>  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>  表达禽流感病毒H9型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

<130>  IB085346

<160>  2

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  560

<212>  PRT

<213>  禽流感病毒H9亚型

<400>  1

<210>  2

<211>  1683

<212>  DNA

<213>  禽流感病毒H9亚型

<400>  2

Claims (10)

1.一种表达编码禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

2.根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述用于表达HA蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615。

3.根据权利要求1或2的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求3的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述编码禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为rL-H9HA。

6.根据权利要求1-5中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。

7.一种生产权利要求1-5中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码禽流感病毒H9亚型HA蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株。

8.根据权利要求7的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-H9HA。

9.根据权利要求7的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP和pBSL。

10.根据权利要求7-9中任何一项的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rL-H9HA。

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