CN101530613A - 传染性脾肾坏病毒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种传染性脾肾坏病毒疫苗及其制备方法和应用，该疫苗是通过在鱼类细胞中接种传染性脾肾坏病毒，收获病毒液并灭活后得到的。本发明疫苗的制备方法包括细胞的制备，病毒接种和培养，病毒收集、灭活和稀释以及疫苗制备四个步骤，本发明的传染性脾肾坏病毒疫苗可用于预防淡水鱼类、海水鱼类的传染性脾肾坏病毒感染，其保护作用可达100％。本发明的疫苗本身不含对人类有害的成分，对注射疫苗的鱼类可以安全食用；且疫苗本身对鱼类生长没有影响。本发明疫苗的免疫力持续时间长达半年以上。本发明疫苗的制备方法简单，所用试剂成本低，有利于大规模推广。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及传染性脾肾坏病毒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
自20世纪70年代以来，我国的水产养殖业取得了巨大的成就，先后掀起了藻类、对虾、鱼类和贝类养殖等几次大的浪潮，使我国水产品养殖总量多年居世界第一。但随着养殖密度的增大以及养殖生态环境的恶化，经常发生传染性疾病的暴发性流行，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。
肿大细胞病毒是指虹彩病毒科肿大细胞病毒属，是新近出现的对鱼类具有重大危害作用的烈性传染病的病原，分子流行病学研究发现，有50多种的海水鱼类和近10种的淡水鱼类是这种病毒的携带者。肿大细胞病毒对世界各国，特别是东亚、东南亚及澳大利亚等国家和地区的水产养殖业构成巨大威胁，每年都能造成重大经济损失。肿大细胞病毒的代表种主要有鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)(也称为传染性脾肾坏死病毒)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、条石鲷虹彩病毒(RBIV)、海鲈虹彩病毒(SBIV)、大黄鱼(LYCIV)、台湾石斑鱼虹彩病毒(TGIV)和斜带石斑鱼虹彩病毒(OSGIV)等。肿大细胞病毒的宿主覆盖了众多具有重大经济价值的养殖鱼类，对肿大细胞病毒所引发的系列鱼病的控制成为有关国家的共识。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种传染性脾肾坏病毒疫苗，该疫苗可以用于传染性脾肾坏病毒的预防，大大降低水产业病毒性疾病的发病率。
本发明的另一个目的是提供上述传染性脾肾坏病毒疫苗的制备方法，该制备方法简单，成本低，有利于大规模推广应用。
本发明的再一个目的是提供上述传染性脾肾坏病毒疫苗在鱼类传染性脾肾坏病毒预防中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)，就是指鳜传染性脾肾坏死病毒，它是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种，海水鱼类病毒RSIV、RBIV和TGIV等均是和ISKNV具有微小差异的肿大细胞病毒的不同毒株而已，因此本发明是针对ISKNV进行的疫苗研究。
一种传染性脾肾坏病毒疫苗，该疫苗是通过在鱼类细胞中接种传染性脾肾坏病毒，收获病毒液并灭活后得到的。
上述传染性脾肾坏病毒疫苗的制备方法，其具体步骤如下：
(1)细胞的制备：将鱼类细胞系经酶消化分散后，进行细胞培养成片(即细胞扩大培养)，用于接种传染性脾肾坏病毒；
(2)病毒接种和培养：上述鱼类细胞培养成片后，吸出培养瓶中的培养基，然后加入传染性脾肾坏病毒液，进行病毒吸附；病毒吸附结束后，吸出感染上清，加入细胞维持液，再次进行细胞培养，至细胞出现明显病变为止；
(3)病毒收集、灭活和稀释：将上述病变的细胞经三次冻融后，收获病毒液，用有机溶剂灭活该病毒液，再用盐类缓冲液稀释灭活病毒液；
(4)疫苗制备：将上述稀释后的病毒液与油性佐剂混合后，振荡混匀，尽可能使得病毒能够均匀分散在混合液的各个部分，即得传染性脾肾坏死病毒疫苗成品。
上述步骤(1)中，消化时可用胰酶；细胞培养成片时可采用DMEM完全培养液(市售)中25～27℃培养，优选27℃。
上述步骤(2)中，病毒吸附可以选择在25～27℃的温度下(优选27℃)吸附1小时；细胞维持液可选择采用添加有5体积％胎牛血清(FBS)的DMEM；再次细胞培养的温度可选择25～27℃，优选27℃。
本发明的FBS(胎牛血清)和DMEM均为本领域通用试剂，市售。
上述步骤(3)中，用于病毒灭活的有机溶剂可以选择氯仿、乙醚、甲醛、福尔马林(35体积％～40体积％甲醛水溶液)等，优选福尔马林，用福尔马林灭活该病毒液，福尔马林的加入量为该病毒液的0.1％，用于稀释病毒灭活液的盐类缓冲液可以选择无菌磷酸盐缓冲液，稀释倍数为20倍。
上述步骤(4)中，稀释后的病毒液与油性佐剂混合的体积比为3：7，油性佐剂可以选择ISA 763A油性佐剂，混合液在振荡器上震荡均匀后，还可以再用超声波粉碎仪进行适当作用，从而保证病毒能够均匀分散在混合液的各个部分。
本发明的传染性脾肾坏病毒疫苗可用于预防海鱼类、淡水鱼类的传染性脾肾坏病毒感染。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的传染性脾肾坏病毒疫苗对鱼类预防传染性脾肾坏病毒感染的保护作用可达100％；
2.本发明的疫苗本身不含对人类有害的成分，对注射疫苗的鱼类可以安全食用；
3.疫苗本身对鱼类生长没有影响，在保证水环境和饲料的情况下，被注射有疫苗的鱼类生长状况良好；
4.免疫力持续时间长达半年以上；
5.本发明的疫苗制备方法简单，所用试剂成本低，有利于大规模推广；
6.本发明的疫苗本身不易失效，普通冰箱4度放置一周仍有效。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 传染性脾肾坏病毒疫苗的制备
本实施例的生物材料选择发明人自己建立的鳜鱼仔鱼细胞系，该细胞系的相关内容已经公布于已发表论文中(Dong，C.，Weng，S.，Shi，X.，Xu，X.，Shi，N.&He，J.(2008).DeVelopment of a mandarin fish Siniperca chuatsi fry cell linesuitable for the study ofinfectious spleen and kidney necrosis Virus(ISKNV).VirusRes 135，273-81.)。
本实施例传染性脾肾坏病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)细胞的制备：将鳜仔鱼细胞系(MMF-1)用胰酶消化分散，加入DMEM完全培养(市售)在27℃培养成片，用于接种传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)；
(2)病毒接种和培养：将上述MMF-1细胞培养成片后，吸出培养瓶中的培养基，然后加入传染性脾肾坏死病毒液，置27℃约1h进行病毒吸附；病毒吸附结束后，吸出感染上清，加入细胞维持液(添加5体积％FBS的DMEM)，再次置27℃细胞培养箱培养，至细胞出现明显病变为止(约4～6天)；
(3)病毒收集、灭活和稀释：病变的细胞经三次冻融后，收获病毒液，向病毒液中加入40％甲醛溶液，直到甲醛的体积占溶液总体积的0.1％为止，室温放置24h(灭活)，再4℃放置7d即可将病毒彻底灭活。然后用无菌磷酸盐缓冲液将灭活病毒液稀释20倍；
(4)疫苗制备：将上述稀释病毒液与ISA 763A油性佐剂(ISA 763A油性佐剂为Seppic公司产品，鱼类疫苗专用)以3：7的体积比混合，振荡器上先震荡混匀，然后用超声波粉碎仪适当作用，尽可能使病毒能够均匀分散在混合液的各个部分，即为成品。
本实施例所用试剂均为本领域技术人员通用试剂，实施例中所涉及的细胞培养、病毒接种、培养、吸附、灭活、稀释和疫苗制备等操作，均为本领域技术人员的常规操作，详细步骤可参考相关教科书或试剂盒说明。
实施例2 传染性脾肾坏病毒疫苗用于预防ISKNV感染
用实施例1制备所得传染性脾肾坏病毒疫苗进行预防ISKNV感染试验。
1.试验鱼及其饲养条件
鳜购自广东南海某养殖场，暂养于本实验室的鱼池中，平均规格约90g，水温保持在25～27℃，空气动力泵自动充气，循环水系统即时将鱼池中的废物吸出，日常投喂鲜活饵料鱼，一天投喂一次，免疫前鳜在饲养池中最少暂养2周以上。
2.免疫
灭活组：随即选择39尾鳜，腹腔注射实施例1所得传染性脾肾坏病毒疫苗，0.5ml/尾。
对照组：随即选择40尾鳜，每尾注射0.5ml无菌磷酸盐缓冲液。
将两组处理后的鳜放养在3.5×1.0×0.5m3的中等水泥鱼池中。
3.攻毒
免疫后30天，无菌PBS将108.2TCIDB50 B/ml的病毒悬液稀释20倍，以0.5ml/尾的剂量，腹腔注射两组鳜。
感染期间继续投喂鲜活饵料鱼，池水温度稳定在25～27℃。每日不定时观察，死鱼及时清理，印片法检测死亡鱼类的脾脏肿大情况。
4.感染病毒后两组鱼的死亡情况如表1所示。
表1 注射灭活疫苗再攻毒后鳜的死亡情况
| 感染后天数 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 累计死亡数 |
| PBS对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 15 | 14 | 3 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 37/40 |
| 灭活疫苗组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0/39 |
传染性脾肾坏死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney NecrosisVirus)是一种主要的造成鱼类大量死亡的病毒，感染后10天死亡率为90％～100％，目前国内外尚无有效抑制ISKNV的药物，通常养殖者采用生石灰、硫酸铜、次氯酸盐、碘盐或投放抗生素等方法，通过改变水体环境抑制病毒生长，但是该病毒生命力非常顽强，无法起到预防作用，尤其在水温27～30℃时更有大规模的爆发，传统的抗生素对该病毒也不起作用。
但是从表1可以看出，感染了ISKNV后，对照组的鳜鱼死亡了37条，尤其是在感染后的第8、9天，而灭活疫苗组注射了本发明方法制备的传染性脾肾坏病毒疫苗，感染后的15天内没有一条死亡，由此可以看出本发明传染性脾肾坏病毒疫苗其预防传染性脾肾坏病毒感染的保护作用可达到100％。
Claims (9)
1、一种传染性脾肾坏病毒疫苗，其特征在于该疫苗是通过对鱼类细胞接种传染性脾肾坏病毒，收获病毒液并灭活后得到的。
2、一种制备权利要求1所述传染性脾肾坏病毒疫苗的方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：
(1)细胞的制备：
将鱼类细胞系经酶消化分散后，进行细胞扩大培养；
(2)病毒接种和培养：
在上述培养好的细胞中加入传染性脾肾坏病毒液，进行病毒吸附；病毒吸附结束后，吸出感染上清，再次进行细胞培养，至细胞出现明显病变为止；
(3)病毒收集、灭活和稀释：
将上述病变的细胞经冻融后，收获病毒液，用有机溶剂灭活该病毒液后，用盐类缓冲液稀释；
(4)疫苗制备：
将上述稀释后的病毒液与油性佐剂混合后，振荡混匀，即得病毒疫苗成品。
3、根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，细胞扩大培养的培养温度为25～27℃。
4、根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，病毒吸附所用温度为25～27℃，吸附时间为1小时。
5、根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，细胞培养温度为25～27℃。
6、根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，有机溶剂是氯仿、乙醚或35体积％～40体积％甲醛水溶液。
7、根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述有机溶剂的加入量为病毒液终体积的0.1％
8、根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述步骤(4)中，稀释后的病毒液与油性佐剂混合的体积比为3：7。
9、权利要求1所述传染性脾肾坏病毒疫苗在预防海鱼类、淡水鱼类传染性脾肾坏病毒感染中的应用。
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