CN1948463A - 聚－γ－谷氨酸作为苏云金芽胞杆菌制剂保护剂的应用 - Google Patents
聚－γ－谷氨酸作为苏云金芽胞杆菌制剂保护剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物农药制备技术领域，具体涉及一种聚－γ－谷氨酸(γ－PGA)作为苏云金芽胞杆菌制剂保护剂的用途以及在制备苏云金芽胞杆菌制剂中作为保护剂的应用。γ－PGA作为Bt制剂的应用，可以减少Bt粉剂制剂在喷雾干燥过程中的活性损失，与对照相比，本发明制剂的杀虫活性、晶体蛋白和芽孢含量分别提高约18.55％、11.24％和20.38％。此外，本发明的应用提高了Bt制剂在实际使用过程中的耐紫外线照射的能力，阳光照射7天后，其杀虫活性为对照的4.30倍。本发明的应用提高了Bt制剂在植株上的黏附能力，耐雨水冲刷，其杀虫活性可达到对照的2.23倍以上，从而延长残效期。
Description
技术领域
本发明属于微生物农药制备技术领域，具体涉及一种聚-γ-谷氨酸作为苏云金芽胞杆菌制剂保护剂的用途以及在制备苏云金芽胞杆菌制剂中作为保护剂的应用。
背景技术
资源与环境问题已成为当前世界人类所面临的重大问题。据联合国粮农组织调查，全世界每年由病虫害造成谷物经济损失达1200亿美元。为了对付病虫害，化学农药长期、大量和反复使用，同时带来了对土壤、水体和大气的污染；农副产品中农药残留增加，也直接危害了人类的健康及生存；以及破坏了生态平衡。近年来，随着人类经济文化水平的提高，人们对食物安全和环境安全提出了更高的要求，生物农药也因此得到了迅猛的发展。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)制剂是目前世界上产量最大、使用最广泛的微生物杀虫剂，它广泛用于防治农业害虫、森林和果树害虫，贮藏害虫及医学害虫。然而在其生产和应用过程中也存在一些问题导致其杀虫活性减弱甚至失效、残效期短等缺点：(1)喷雾干燥过程导致其活性降低。喷雾干燥是生产高效价Bt原粉的重要方法，工业生产中一般先将发酵液喷雾干燥制成原粉，再用原粉加工成所需要的剂型。但是高温干燥容易导致Bt制剂活性成分如伴胞晶体的变性、芽孢失活以及其它热敏性活性成分的丧失等，最终必然引起制剂杀虫活性的下降；(2)在田间应用过程中残效期短，效果不稳定。这是由于Bt不耐紫外线(UV)，阳光中的UV是降低Bt制剂田间防治效果的首要因素。同时，雨水冲刷是降低其田间防治效果的另一主要因素。
在申请号为200310121196.1(一种提高生物农药抗太阳光照射的办法)，记载了利用含-NH2、-COOH或-NH2、-COOH二者并存的化合物据称可以作为苏云金芽胞杆菌保护剂抗阳光照射。但是该专利文献没有公开该保护剂的具体组分及其配比，人们无法实施其发明，亦无法达到该专利文献所示的效果。
已有一些作者研究发现某些生物高分子聚合物具有抗UV照射和高温损伤的能力。例如Y.Murat Elcin(Y.Murat Elcin.Bacillus sphaericus 2362-calcium alginate microcapsule for mosquitocontrol.Enzyme and Microbial Technology，1995，17：587-591)研究发现海藻酸盐(alginate)可以有效地提高Bt对UV和高温的耐受性，从而提高Bt的田间使用效果。另外，Masakazu Furuta等人(Furuta M，Huy N Q，Tsuchiya H N，Hayashi T.Protective effect of poly(α-L-glutamate)against UV and γ-irradiation.Radiat Phys Chem.2004，71：111-114)发现聚-α-谷氨酸[poly(a-l-glutamate)]可以提高α-淀粉酶对γ射线和UV照射的抗性。从化学结构上看，藻酸盐和聚-α-谷氨酸的高分子长链上均含有众多的反应活性较高的游离羧基，然而到目前为止对于二者的保护机理还没有完全阐明。
聚-γ-谷氨酸[英文名称是Poly(γ-glutamic acid)，简称γ-PGA]是自然界中微生物发酵产生的阴离子型多聚氨基酸，由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu)通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每一个重复单元的α-碳原子还有一个游离的羧基。平均分子量10,000-10,000,000道尔顿。聚-γ-谷氨酸的水溶性、吸水性、生物可降解性、对金属离子的亲和性、无毒、抗冻、对环境友好和对蛋白酶的抗性等特点使它在农业、食品、医药、轻化工等领域具有广阔的应用前景。与藻酸盐和聚-α-谷氨酸结构类似，γ-PGA有望成为一种潜在的Bt保护剂。γ-PGA是微生物合成的一种高分子聚合物，具有生产快、产量高和成本低等优势。随着全球环保意识的不断加强，人类回归自然、保护生态平衡的愿望愈来愈强烈，γ-PGA的应用有着不可估量的前景。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的缺陷，利用一种聚-γ-谷氨酸作为苏云金芽胞杆菌制剂的保护剂以及在制备苏云金芽胞杆菌制剂中作为保护剂的应用。该保护剂可有效保护苏云金芽胞杆菌制剂的生物活性，减少紫外线、环境等对苏云金芽胞杆菌制剂稳定性的损失，以提高苏云金芽胞杆菌的应用效果。
本发明是这样实现的：
作为本发明实施的保护剂选自聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)。
γ-PGA由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu)通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每一个重复单元的α-碳原子还有一个游离的羧基。
所述的γ-PGA用于Bt液体或固体制剂(如Bt发酵液、粉剂、可湿性粉剂和悬浮剂或乳化剂)等剂型的应用。该γ-PGA的应用可以是在Bt制剂化中的应用(例如在喷雾干燥中的应用，或者是产品复配中的应用，例如Bt原粉与γ-PGA制备的粉剂、可湿性粉剂；或是Bt原粉与γ-PGA和乳化剂制备的悬浮剂或乳剂等)。
所述的γ-PGA产品的生产可按照本申请人的专利号为ZL 03118908.3公开的文献生产，或者商业购买。
所述的苏云金芽胞杆菌发酵菌液的生产可参照本申请人的专利号ZL95106749.4(苏云金芽胞杆菌高毒力菌株YBT-1520及发酵工艺与产品)文献所公开方法进行。
本发明中涉及苏云金芽胞杆菌制剂的生产(或称之为“制剂化”，如发酵原液、粉剂、可湿性粉剂、悬浮剂和油剂)生产参照本申请人的专利号为ZL 01128475.7(苏云金芽胞杆菌基因工程菌WG001及生产工艺与产品)文献所公开的方法生产。
所述的γ-PGA的应用包括：在Bt制剂加工过程中的应用以及在Bt制剂施用前的应用。
γ-PGA在Bt制剂化中的应用按照以下的步骤进行：
1、γ-PGA作为保护剂在Bt喷雾干燥制备Bt原粉中的应用：
以重量/体积比(w/v)计，将0.1-1.0％的分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA加入Bt发酵液，搅拌均匀后喷雾干燥。喷雾干燥工艺条件为：进风口温度150-250℃，出风口温度50-100℃，喷头压力0.10-0.25Mpa，使制剂的含水量控制在4％以下。本制剂化中的具体应用参照专利文献ZL 01128475.7报道的方法生产。
2、γ-PGA作为Bt液体制剂保护剂的田间施用前的应用：
以重量/体积比(w/v)计，将分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA以0.1-1.0％使用量加入Bt液体制剂中，混合均匀，将上述混合了γ-PGA的Bt液体剂型按商品说明书要求使用的浓度和方法进行，在虫害发生前期进行叶面喷施，以抵抗阳光中紫外线照射和雨水冲刷。
3、γ-PGA作为Bt可湿性粉剂保护剂的田间施用前的应用：
以质量百分比(w/w)计，将分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA以1.5-15.0％使用量加入商品Bt可湿性粉剂中，混合均匀，将上述混合了γ-PGA的Bt可湿性粉剂按商品说明书要求使用的浓度和方法进行，在虫害发生前期进行叶面喷施，以抵抗阳光中紫外线照射和雨水冲刷。
本发明的有益效果
(1)生物可降解性。γ-PGA是微生物合成的由谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，可被微生物完全降解，对人和环境友好。
(2)γ-PGA作为Bt制剂的应用，可以减少Bt粉剂制剂在喷雾干燥过程中的活性损失，与对照相比，本发明制剂的杀虫活性、晶体蛋白和芽孢含量可分别提高约18.55％、11.24％和20.38％；
(3)本发明提高了Bt制剂在实际使用过程中的抗阳光中紫外线照射能力。阳光照射7天后，其杀虫活性为对照的4.30倍；
(4)本发提高了Bt制剂在植株上的黏附能力，耐雨水冲刷，其杀虫活性可达到对照的2.23倍以上，从而延长残效期。
附图说明
图1：γ-PGA对Bt发酵液喷雾干燥过程的保护效果
图2：不同出风口温度条件下γ-PGA对Bt发酵液喷雾干燥的保护效果
图3：不同进风口温度条件下γ-PGA对Bt发酵液喷雾干燥的保护效果
图4：γ-PGA对Bt制剂抗紫外线的应用效果
图5：不同紫外线照射时间下γ-PGA对Bt制剂抗紫外线的应用效果
图6：不同降雨量条件下γ-PGA对Bt制剂残留生物活性影响
图7：不同阳光照射时间γ-PGA对Bt制剂的残留生物活性影响
具体实施方式
实施例1：γ-PGA作为Bt发酵液喷雾干燥过程中保护剂的应用
分别取分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA 0g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g、1.4g、1.8g、2.0g溶解于200ml Bt发酵液中，发酵液的杀虫晶体蛋白含量为5.43mg/ml，芽孢数为6.77×109cfu/ml，致死率(稀释4000倍时)为91.27％。搅拌均匀后分别进行喷雾干燥，喷雾干燥工艺条件为：进风口温度180±5℃，出风口温度70±2℃，喷头压力0.15Mpa，使制剂的含水量控制在4％以下。测量不同条件下喷雾干燥后Bt制剂杀虫晶体蛋白、芽孢和杀虫活性，以喷雾干燥前Bt制剂杀虫晶体蛋白、芽孢和杀虫活性为对照，计算杀虫晶体蛋白残留率、芽孢残留率和残留生物活性。
计算公式如下：
杀虫晶体蛋白残留率＝(处理后晶体蛋白含量/处理前晶体蛋白含量)×100％，
芽孢残留率＝(处理后芽孢含量/处理前芽孢含量)×100％，
残留生物活性＝(处理后致死率/处理前致死率)×100％
实验结果如表1和图1所示。
表1 喷雾干燥过程中不同浓度γ-PGA对Bt制剂的影响
| γ-PGA添加量(％，w/v) | 晶体蛋白残留率(％) | 芽孢残留率(％) | 残留生物活性(％) |
| 00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0 | 87.1193.7695.9498.3596.8494.4391.1590.6289.4988.7388.07 | 73.5687.0489.5193.9489.2486.8783.7679.9379.6077.0875.88 | 72.2976.1782.5490.8488.2083.6576.6678.9476.5173.9273.63 |
表1和图1说明，加入不同浓度γ-PGA后，与对照相比，Bt制剂的残留生物活性均有明显提高。γ-PGA浓度为0.1-0.8％(w/v)对Bt制剂有明显的保护效果，当γ-PGA浓度为0.3％(w/v)时对残留生物活性的保护效果最好，其残留生物活性比对照高18.55％。同时，发现γ-PGA对Bt制剂主效成分-晶体和芽孢有明显保护效果，可以明显提高晶体和芽孢残留率。当γ-PGA浓度为0.3％(w/v)时，晶体和芽孢残留率分别比对照提高了11.24％和20.38％。
实施例2：γ-PGA作为Bt发酵液喷雾干燥过程中不同出风口温度条件下保护剂的应用
取分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA 3.6g溶解于Bt发酵液1200ml，发酵液的杀虫晶体蛋白含量为5.43mg/ml，芽孢数为6.77×109cfu/ml，致死率(稀释4000倍时)为91.27％。搅拌均匀后平均分成六份，分别进行喷雾干燥。考察在不同出风口温度下γ-PGA对喷雾干燥Bt原粉芽孢和晶体含量影响时，控制进风口温度180±5℃，出风口温度50-100±5℃，喷头压力0.15Mpa，使制剂的含水量控制在4％以下。测量不同条件下Bt制剂残留生物活性。
实验结果见表2和图2所示：
表2 不同出风口温度下添加0.3％γ-PGA(w/v)对Bt制剂生物活性残留率的影响
| PGA添加量(％，w/v) | 出风口温度(℃) | |||||
| 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 | |
| CK(空白)0.3相对效果 | 81.9292.341.13 | 81.0392.121.14 | 72.2990.841.26 | 63.6787.011.37 | 57.3780.691.41 | 49.9173.461.47 |
注：相对效果＝含0.3％γ-PGA(w/v)Bt制剂生物活性残留率/对照生物活性残留率
结果表明，出风口温度越高，γ-PGA的相对保护效果越好。当出风口温度为100℃时，添加0.3％γ-PGA样品的残留生物活性为对照的1.47倍。以上结果表明，γ-PGA能显著降低高温对Bt制剂中活性物质损伤，提高它们对高温的耐受性
实施例3：γ-PGA作为Bt发酵液喷雾干燥过程中不同进风口温度条件下保护剂的应用
取分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA 3.6g溶解于1200ml Bt发酵液，发酵液的杀虫晶体蛋白含量为5.43mg/ml，芽孢数为6.77×109cfu/ml，致死率(稀释4000倍时)为91.27％。搅拌均匀后平均分成六份，分别喷雾干燥。考察在不同进风口温度下γ-PGA对喷雾干燥Bt原粉芽孢和晶体含量影响时，控制出风口温度70±2℃，进风口温度150-250℃，喷头压力0.15Mpa，使制剂的含水量控制在4％以下。测量不同条件下Bt制剂残留生物活性。
实验结果见表2和图3所示：
表2 不同进风口温度下添加0.3％γ-PGA(w/v)对Bt制剂生物活性残留率的影响
| PGA添加量(％，w/v) | 进风口温度(℃) | |||||
| 150 | 170 | 190 | 210 | 230 | 250 | |
| CK0.3相对效果 | 79.1491.921.16 | 73.6691.391.24 | 71.0890.061.27 | 66.2887.141.31 | 60.2982.621.37 | 52.4376.131.45 |
注：相对效果＝含0.3％γ-PGA(w/v)Bt制剂生物活性残留率/对照生物活性残留率
结果表明，进风口温度在150-190℃时γ-PGA的相对保护效果较好，优选的进风口温度应控制在170-190℃。
实施例4：γ-PGA作为Bt制剂的抗紫外线保护剂的应用
分别取分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA 0.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g溶解于Bt发酵液各10ml，发酵液的杀虫晶体蛋白含量为5.43mg/ml，芽孢数为6.77×109cfu/ml，致死率(稀释4000倍时)为91.27％。于60℃下处理30min杀死营养细胞，移取6ml于直径为10cm的灭菌培养皿中，置于30W的紫外灯下，培养皿与灯的垂直距离为20cm。每隔15min摇动一次培养皿，照射2h后取0.2ml按1∶10稀释到2ml用于芽孢计数、蛋白测定和生物活性测定。
实验结果见表3和图4所示：
表3 紫外线照射对含γ-PGA Bt液体制剂的影响
| γ-PGA添加量(％，w/v) | 晶体蛋白残留率(％) | 芽孢残留率(％) | 杀虫活性残留率(％) |
| 00.10.20.30.40.50.6 | 53.3461.6965.2676.4669.8265.9861.35 | 45.5052.4663.1370.8468.5759.7154.40 | 52.3371.5378.6087.6782.2976.9674.18 |
结果表明，经2个小时紫外线照射后，添加γ-PGA的Bt制剂的残留生物活性明显高于对照，其中以添加γ-PGA浓度为0.3％(w/v)时效果最佳，UV照射2h后其残留生物活性为87.67％。进一步研究发现，经UV照射2h后，加入γ-PGA能有效提高Bt制剂晶体蛋白和芽孢的残留率。加入γ-PGA后晶体和芽孢残留率与残留生物活性的变化趋势基本一致。当γ-PGA浓度为0.3％(w/v)时，晶体和芽孢残留率分别比对照高23.12％和25.34％。
实施例5：γ-PGA作为Bt制剂抗紫外线保护剂的应用
取分子量为100,000-10,000,000道尔顿的γ-PGA 0.03g溶解于Bt发酵液10ml，发酵液的杀虫晶体蛋白含量为5.43mg/ml，芽孢数为6.77×109cfu/ml，致死率(稀释4000倍时)为91.27％。处理参照实施例4，分别在紫外线照射第0、1、2、3、4和5h取样。
实验结果见表4和图5所示：
表4 不同紫外线照射时间下γ-PGA对Bt制剂的影响
| UV照射时间(h) | 晶体蛋白残留率 | 芽孢残留率 | 残留杀虫活性 | |||
| 0 | 0.3％γ-PGA(w/v) | 0 | 0.3％γ-PGA(w/v) | 0 | 0.3％γ-PGA(w/v) | |
| 012345 | 10071.5253.3437.8927.6616.82 | 10091.5276.4661.0445.5034.58 | 10064.8645.5929.9217.878.83 | 10086.3270.8452.5142.7624.45 | 10075.8552.3331.4917.8913.46 | 10094.3587.6776.5858.9246.26 |
结果表明，对于未加γ-PGA的Bt原粉，紫外线处理的失活效应非常显著，随着UV照射时间的延长，残留杀虫活性迅速降低，5h后其残留杀虫活性仅为13.46％。对于含0.3％γ-PGA的Bt制剂，延长UV照射时间，与对照相比，其残留杀虫活性下降缓慢，5h后其残留杀虫活性仅为46.26％。同样，添加0.3％γ-PGA制剂的晶体蛋白残留率和芽孢存活率随着UV照射时间的延长也存在一定程度的下降，但与对照相比下降速率要慢。UV照射5h后，加入0.3％γ-PGA制剂的晶体蛋白残留率和芽孢存活率分别为对照的2.06倍和2.77倍。
实施例6：阳光照射条件下对γ-PGA作为Bt制剂保护剂的应用
将田间长势良好、整齐一致未施过农药的小白菜(品种：上海青)移至花盆内备用。将含有0和0.3％(w/v)γ-PGA(分子量为100,000-10,000,000道尔顿)的Bt悬浮剂(4000IU/μl)分别稀释200倍后对小白菜进行喷雾，将花盆置于室外日光照射(以自然太阳光照射10小时/天)，分别于第3、5和7天剪下菜叶，置于培养皿内，培养皿内预先放一张润湿的滤纸。每个培养皿内接入10头三龄棉铃虫幼虫，6个重复。28℃下置于黑暗处培养2天后检测死亡率。
实验结果见表5和图7所示：
表5 阳光照射下γ-PGA对Bt制剂的影响
| γ-PGA添加量(％，w/v) | 阳光处理时间(d) | ||
| 3 | 5 | 7 | |
| 对照0.3％相对效果 | 82.2691.641.11 | 47.3974.721.58 | 11.4849.364.30 |
注：相对效果＝含0.3％γ-PGA(w/v)Bt制剂生物活性残留率/对照生物活性残留率
结果表明，γ-PGA包被能很好地保护Bt杀虫活性物质免受阳光中的紫外线破坏。
实施例7：雨水冲刷条件下对γ-PGA作为Bt制剂保护剂的应用
将长势良好、整齐一致未施过农药的田间种植的小白菜(品种：上海青)移至花盆内，取Bt可湿性粉剂(32000IU/mg)1g，分别加0.015g，0.05g，0.15g固体γ-PGA(分子量为100,000-10,000,000道尔顿)后加水稀释2000倍并混合均匀，对小白菜进行喷雾，自然风干，用喷雾器喷洒清水，模拟降雨(5mm、20mm和50mm)，旁边放置一量筒用于测定降雨量。待风干后剪下叶片参照实施例6的方法测定残留生物活性。
实验结果见表6和图6。
表6 雨水冲刷下γ-PGA对Bt制剂的影响
| γ-PGA添加量(g) | 下雨量(mm) | ||
| 5 | 20 | 50 | |
| CK0.0150.050.15 | 87.7393.2698.6588.69 | 69.3678.2994.5075.21 | 38.2756.9285.4649.38 |
结果表明，添加0.3％γ-PGA制剂有较强的抵抗雨水的冲刷作用，这是由于γ-PGA能较好的黏附于植物叶片表面。
Claims (5)
1、聚-γ-谷氨酸作为苏云金芽胞杆菌制剂保护剂的应用。
2、聚-γ-谷氨酸在制备苏云金芽胞杆菌制剂中作为保护剂的应用。
3、权利要求1的应用，其中的应用包含液体制剂或固体制剂中的应用。
4、包含权利要求1保护剂的苏云金芽胞杆菌制剂。
5、权利要求4所述的制剂，其中的制剂包含液体或固体状态的。
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2006
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