CN110862956B - 一种新城疫病毒/全悬浮chok1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗，所述细胞株为CHOK1‑DC005细胞株，保藏号为CGMCC No.16211。本发明使得新城疫疫苗实现了由鸡胚向哺乳动物细胞大规模培养生产的转变，这不仅简化了新城疫疫苗的生产工艺，降低生产成本，还大大提高疫苗的产量和质量。

Description

一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞 株制备的抗原及疫苗
技术领域
本发明涉及CHOK1细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用，属于兽用生物制药领域，具体地，本发明涉及一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗。
背景技术
目前，国内禽用疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”工艺实现。虽然这种技术也不断进化来应对各种挑战，包括产量、自动化、容量、质量保证和生产速度等方面。但在我国实际的生产过程中，由于SPF(无特异性病原)鸡胚供应量的制约以及成本问题，许多的国产疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。尤其是禽用弱毒疫苗的制备，若所用鸡胚来自普通鸡蛋，可造成外源病原的污染，并由此造成了某些疫病的传播和蔓延。与此同时，鸡胚中的母源抗体还会干扰接种疫苗病毒的繁殖，直接影响疫苗的质量，常常会造成免疫失败。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株。
本发明的另一目的在于，提供一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株的制备方法。
本发明的再一目的在于，提供一种新城疫病毒抗原的制备方法以及采用所得到的抗原制备新城疫疫苗。
本发明利用悬浮培养的CHOK1细胞进行新城疫疫苗的生产，不仅缩短了疫苗生产周期，降低劳动强度和生产成本，还减少批间差异提高了疫苗质量，悬浮CHOK1细胞在新城疫疫苗上的应用，有望终结新城疫疫苗的鸡胚时代。
为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，所述细胞株为CHOK1-DC005细胞株，保藏号为CGMCC No.16211，为中国仓鼠卵巢细胞。
一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将适合新城疫病毒侵染的CHOK1细胞通过全悬浮驯化与筛选最终获得新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株。
一种新城疫病毒抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)复苏上述新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，并采用悬浮细胞培养瓶逐级放大，将细胞扩增，待细胞生长至浓度为不低于6×106cells/mL后，全部转移至生物反应器中，培养并采样进行细胞计数和活力检测；
2)接毒和收毒
当生物反应器中活细胞密度不低于2.5×106细胞/mL，按细胞培养液体积的1％-5％比例接入新城疫病毒，于接毒后24h起，每隔一时间段采样进行细胞计数，当活细胞密度低于0.5×106后，收获病毒液即为新城疫病毒抗原，效价HA滴度达10-12log2/100μL。
优选地，所述新城疫病毒的病毒株为新城疫病毒Ⅰ系疫苗株、新城疫病毒Ⅱ系疫苗株、新城疫病毒Ⅲ系疫苗株、新城疫病毒Ⅳ系疫苗株、新城疫病毒克隆-30疫苗株或新城疫病毒基因Ⅶ型疫苗株。
一种新城疫疫苗，所述疫苗采上述制备的新城疫病毒抗原制备得到。
一种新城疫疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)将收获的新城疫病毒抗原用甲醛灭活；
2)向灭活后的新城疫病毒抗原加入水相混匀，与油相混合乳化分散均匀即得新城疫疫苗。
具体地，本发明新城疫病毒抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)病毒株的选择：
病毒株的选择为新城疫病毒为Ⅰ系、Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(Lasota株)、克隆-30、基因Ⅶ型等疫苗株；
2)悬浮细胞株的驯化：
将适合新城疫病毒培养用的CHOK1细胞进行全悬浮驯化和连续克隆纯化，获得新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株；
3)悬浮细胞扩大培养：
复苏新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，采用悬浮细胞培养瓶逐级放大为总体积为1升的悬浮培养液，待细胞浓度达到6×106细胞/mL后，全部转移至赛多利斯
Figure BDA0001778393360000031
A总体积为5L的生物反应器中，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和二氧化碳，转速200r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧40％，分别于培养24h、48h采样进行细胞计数和活力检测；
4)接毒和收毒：
当赛多利斯
Figure BDA0001778393360000032
A中活细胞密度不低于2.5×106细胞/mL，按细胞培养液体积的1％比例接入新城疫病毒，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和二氧化碳，转速200r/min，温度37℃，pH 7.4，溶氧40％，于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×106细胞/mL后，收获病毒液即为抗原，效价HA滴度可以达到10-12(log2/100μL)。
本发明用于制备抗原所用到的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生产毒株，优选地，所述新城疫病毒的病毒株为新城疫病毒Ⅰ系疫苗株、新城疫病毒Ⅱ系疫苗株、新城疫病毒Ⅲ系疫苗株、新城疫病毒Ⅳ系疫苗株、新城疫病毒克隆-30疫苗株或新城疫病毒基因Ⅶ型疫苗株。
一种新城疫疫苗的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
1.病毒株的选择
1)病毒株的选择为新城疫病毒为Ⅰ系、Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(Lasota株)、克隆-30、基因Ⅶ型等疫苗株。
2.毒种库的建立(以Lasota株为例)
1)将鸡胚放在灭菌的蛋盘中，在温度36.0-39.0℃，湿度45-65％培养；
2)将鸡胚接种之前用碘酒和酒精消毒，PBS将病毒稀释104-105倍；用锥子给鸡胚打孔，尿囊腔接种病毒量为0.1mL/枚；
3)将鸡胚封口，将接种后鸡胚置于36.0-39.0℃的孵化箱中培养；
4)接种后，每天观察鸡胚的死亡情况，将第一天死亡的鸡胚放入生物垃圾桶弃掉；
5)选接种72h-120h死亡的且病痕明显的鸡胚，置于4℃中冷却4-24h；
6)将鸡胚表面消毒，打开气室表面的蛋壳；打开壳膜，收获鸡胚液(尿囊液及羊水)收获于灭菌的容器中，将病毒分装于1.5mL的EP管中储存于-65(-75)℃中备用；
7)收获的E4代前基础种毒，用PBS稀释105倍后，混匀，分装于1.5mL无菌EP管中，储存于-65(-75)℃冰箱中作为基础种毒库；
8)工作种毒库是在基础毒库的基础上对病毒进行传代，收获病毒液，混匀后分装于无菌的EP管中，记录病毒的详细信息(包括代次，数量等)，储存于-65(-75)℃冰箱中作为工作种毒库。
3.悬浮细胞株的驯化
(1)全悬浮CHOK1细胞的筛选与克隆；具体方法为：
1)利用含2-8％血清的培养基在37℃，5％CO2单层贴壁培养适合新城疫病毒培养用CHOK1细胞，收集培养上清中贴壁能力弱或不贴壁的散在细胞；
2)在37℃，5％CO2条件下悬浮培养收集的细胞，悬浮培养的CHOK1细胞经1000r/min离心15min，弃上清，重悬细胞沉淀；
3)细胞沉淀重悬后经培养基适当稀释，利用微量细胞板对收集的CHOK1细胞进行连续单克隆化培养，筛选出不贴壁生长的单细胞克隆株。
(2)全悬浮CHOK1细胞的放大和种子批建立；具体方法为：
1)利用低血清或无血清培养基将CHOK1细胞克隆株用摇瓶悬浮培养放大，得到适应低血清或无血清全悬浮培养的CHOK1细胞；
2)将全悬浮细胞经1000rpm离心15min，弃上清，取细胞沉淀，用细胞冻存液重悬为50万细胞/mL，分装后置液氮保存，建立细胞基础种子批(新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株)。
4.悬浮细胞扩大培养：
复苏新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，采用悬浮细胞培养瓶逐级放大为总体积为1升的悬浮培养液，待细胞浓度达到6×106细胞/mL后，全部转移至赛多利斯
Figure BDA0001778393360000041
A总体积为5L的生物反应器中，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和二氧化碳，转速200r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧40％，分别于培养24h、48h采样进行细胞计数和活力检测；
接毒和收毒：
当赛多利斯
Figure BDA0001778393360000042
A中活细胞密度不低于2.5×106细胞/mL，按细胞培养液体积的1％比例接入新城疫病毒，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和二氧化碳，转速200r/min，温度37℃，pH 7.4，溶氧40％，于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×106细胞/mL后，收获病毒液即为抗原，效价HA滴度可以达到10-12(log2/100μL)。
5.疫苗制备(以Lasota株为例)
(1)将收获的病毒液用PBS调整为相同的病毒滴度(108.5EID50/0.1mL)。
(2)终浓度为0.1％的甲醛灭活抗原(37℃灭活时间16h。灭活检验鸡胚盲传3代无血凝活性)。
(3)胶体磨开机，冷却水打开；
(4)胶体磨开机后将间隙调到最大，倒入油相(提前加入白油和司本混匀后过夜，成为均一液体)；
(5)加水相(抗原和吐温提前混匀后过夜)抗原(3min内加，混匀后将间隙调至最小持续3～5min)；
(6)开大胶体磨间隙，出疫苗，停机。
6.疫苗检验
各批次新城疫灭活疫苗(以Lasota株为例)经过前期预试验证实：均可以在免疫后14天，诱导SPF鸡体产生9log2的抗体效价，对YT攻毒保护率可达100％：不发病且无排毒，同时油苗吸收良好。
附图说明
图1为贴壁培养的CHOK1细胞；
图2为悬浮培养的CHOK1细胞；
图3为CHOK1悬浮接毒病变细胞；
图4为抗体效价比较。
具体实施方式
本说明书中公开得任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或者类似特征中的一个例子而已。所述仅仅是为了帮助理解本发明，不应该视为对本发明的具体限制。
下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
全悬浮培养CHOK1细胞的驯化
1.材料
1.1细胞株:适合新城疫病毒培养用CHOK1细胞，购自美国ATCC公司。
1.2培养基:CD-CHOK1，深圳壹生科公司产品
1.3牛血清:武汉三利公司产品。
1.4仪器设备：悬浮细胞培养瓶(125mL，500mL)，corning产品；赛多利斯生物反应器
Figure BDA0001778393360000061
A，德国赛多利斯公司。
2.方法
(1)全悬浮CHOK1细胞的放大和种子批建立：
1)利用含2-8％血清的培养基在37℃，5％CO2单层贴壁培养适合新城疫病毒培养用CHOK1细胞，收集培养上清中贴壁能力弱或不贴壁的散在细胞(图1为原始CHOK1贴壁细胞形态)。
2)在37℃5％CO2条件下悬浮培养收集的细胞，悬浮培养的CHOK1细胞经1000r/min离心15min，弃上清，重悬细胞沉淀。
3)细胞沉淀重悬后经培养基适当稀释，利用微量细胞板对收集的CHOK1细胞进行连续单克隆化培养，筛选出不贴壁生长的单克隆CHOK1细胞。
(2)全悬浮CHOK1细胞的放大和种子批建立：
1)利用低血清或无血清培养基将CHOK1细胞克隆株用摇瓶悬浮培养放大，得到适应低血清或无血清全悬浮培养的CHOK1细胞(图2为CHOK1悬浮细胞形态)。
2)将全悬浮细胞经1000rpm离心15min，弃上清，取细胞沉淀，用细胞冻存液重悬为50万细胞/mL，分装后置液氮保存，建立细胞基础种子批(新城疫病毒/全悬浮CHOK1-DC005细胞株)。
本发明的新城疫病毒/全悬浮CHOK1-DC005细胞株已于2018年8月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为16211。
实施例2
悬浮培养CHOK1细胞生产新城疫病毒的方法
1.材料
1.1细胞株：适合新城疫病毒培养用CHOK1细胞，购自美国ATCC公司。
1.2培养基：CD-CHOK1，深圳壹生科公司产品。
1.3仪器设备：悬浮细胞培养瓶(125mL，500mL)，corning产品；赛多利斯生物反应器
Figure BDA0001778393360000071
A，德国赛多利斯公司。
1.4种毒：病毒株的选择为新城疫病毒为Ⅰ系、Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(Lasota株)、克隆-30、基因Ⅶ型等疫苗株。
2.方法
(1)全悬浮CHOK1细胞的种子培养与扩增：
1)复苏新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株在CD-CHOK1培养基中培养，培养容器为125mL摇瓶，培养条件为37℃，5％CO2，转速120rpm。
2)逐级扩增到5L赛多利斯生物反应器
Figure BDA0001778393360000072
A中，待细胞生长稳定后备用。
3)当赛多利斯
Figure BDA0001778393360000073
A中活细胞密度不低于2.5×106细胞/mL，按细胞培养液体积的1％比例接入新城疫病毒，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和二氧化碳，转速200r/min，温度37℃，pH 7.4，溶氧40％，于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×106细胞/mL后，收获病毒液即为抗原(图3为CHOK1悬浮接毒病变细胞)，效价HA滴度可以达到10-12(log2/100L)。
实施例3
基于悬浮培养CHOK1细胞生产的新城疫疫苗的免疫效果与传统鸡胚疫苗免疫效果的比较
1.实验材料
1.1疫苗
1.1.1悬浮培养CHOK1细胞生产的新城疫疫苗采用实施例2中的生产工艺制备(以Lasota毒株为例)，将收获的病毒液用PBS调整为相同的病毒滴度(108.5EID50/0.1mL)。终浓度为0.1％的甲醛灭活抗原(37℃灭活时间16h。灭活检验鸡胚盲传3代无血凝活性)。胶体磨开机，冷却水打开；胶体磨开机后将间隙调到最大，倒入油相(提前加入白油和司本混匀后过夜，成为均一液体)；加水相(抗原和吐温提前混匀后过夜)抗原(3min内加，混匀后将间隙调至最小持续3～5min)；开大胶体磨间隙，出疫苗，停机。悬浮培养CHOK1细胞生产的新城疫疫苗(简称细胞苗，批号：20180504)。
1.1.2传统鸡胚工艺生产的疫苗(简称鸡胚苗，批号：20180506)
1.2实验动物
表1实验动物信息
品种 鸡
品系 SPF
来源 北京梅里亚维通实验动物中心
年龄 4周龄
数量(只) 30
编号方式 随机分组
2.实验方法
2.1用4周龄健康易感鸡分为A、B、C共3组，各组的数量如下表1，测定HI抗体≤2log2。
表2免疫及攻毒毒株
分组 A B C
疫苗种类 细胞苗 鸡胚苗 灭菌PBS
攻毒毒株 F48E8 F48E8 F48E8
数量(只) 5 5 5
2.2称重后，A组各颈部皮下注射细胞苗20μL(0.5mL以下的注射器注射)；
2.3称重后，B组各颈部皮下注射鸡胚苗20μL(0.5mL以下的注射器注射)
2.4称重后，C组注射生理盐水。
2.5免疫后7天、14天、21天称重、采血测定抗体HI效价。
2.6并在免疫21天采血后，A、B、C组攻标准强毒F48E8，每只鸡各肌肉注射105ELD50强毒1mL。
3.实验结果
3.1抗体效价比较
从图中可看出含等量病毒滴度的新城疫细胞苗和鸡胚苗免疫鸡群后，在接种后的7天、14天和21天采集血清，用Lasota株抗原分别测定HI抗体效价。细胞苗和鸡胚苗免疫21天的抗体都达到新城疫抗体能够保护的水平3log2以上(图4为抗体效价比较)。
3.2免疫攻毒实验
从表3中可看出，攻标准强毒F48E8后，免疫PBS并攻击强毒的对照组全部死亡的前提下，细胞苗和鸡胚苗都能够提供100％的保护。
表3攻毒保护数据
编号 A B C
疫苗种类 细胞苗 鸡胚苗 PBS
SPF鸡死亡数量 0 0 5
攻毒毒株 F48E8 F48E8 F48E8
本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。
本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种新城疫病毒抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1）复苏新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，并采用悬浮细胞培养瓶逐级放大，将细胞扩增，待细胞生长至浓度为不低于6×106cells/mL后，全部转移至生物反应器中，培养并采样进行细胞计数和活力检测；
2）接毒和收毒
当生物反应器中活细胞密度不低于2.5×106 细胞 /mL，按细胞培养液体积的1%-5%比例接入新城疫病毒，于接毒后24h起，每隔一时间段采样进行细胞计数，当活细胞密度低于0.5×106后，收获病毒液即为新城疫病毒抗原，效价HA滴度达10-12 log2/100µL；
所述新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株为CHOK1-DC005细胞株，保藏号为CGMCC No.16211。
2.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒抗原的制备方法，其特征在于，所述新城疫病毒的病毒株为新城疫病毒Ⅰ系疫苗株、新城疫病毒Ⅱ系疫苗株、新城疫病毒Ⅲ系疫苗株、新城疫病毒Ⅳ系疫苗株、新城疫病毒克隆-30疫苗株或新城疫病毒基因Ⅶ型疫苗株。
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Hybrid- and complex-type N-glycans are not essential for Newcastle disease virus infection and fusion of host cells;Qing Sun等;《Glycobiology》;20110928;第22卷(第3期);第374页左栏第3段，第375页右栏第2-3段，第376页右栏最后一段，图8 *
Qing Sun等.Hybrid- and complex-type N-glycans are not essential for Newcastle disease virus infection and fusion of host cells.《Glycobiology》.2011,第22卷(第3期),第369-378页. *

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