CN103285385B

CN103285385B - 一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法

Info

Publication number: CN103285385B
Application number: CN201210578150.1A
Authority: CN
Inventors: 梁武; 吕蔚; 徐倩倩; 刘涛; 郑朝朝; 郁宏伟; 杨保收; 李亚杰; 柳珊; 赵玉龙; 朱秀同; 李建丽; 邱贞娜
Original assignee: RUIPU (BAODING) BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: RUIPU (BAODING) BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: CN103285385A

Abstract

一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：a.制苗用细胞的培养；b.病毒接种与培养；c.病毒液收获；d.病毒液灭活；e.疫苗制备。本发明对制苗细胞进行了筛选，加强了细胞与病毒的匹配性；采用激流灌注式生物反应器培养体系提高了病毒的增殖滴度及收获量；对于乳化工艺的改进提升了免疫效果；而且整个生产工艺不涉及其他生物安全和公共卫生问题，适合于大规模生产。

Description

一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，PCV2还与增生性坏死性肺炎、母猪繁殖障碍、猪皮炎与肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征有关，给养猪业造成了巨大的经济损失。

目前，国内猪圆环病毒2型灭活疫苗生产主要采用细胞转瓶培养方法实现，传统工艺生产半成品抗原效价低，操作繁琐，生产劳动强度大，效率低。近几年，随着兽用疫苗行业的发展，生物反应器被广泛关注，利用生物反应器替代传统的转瓶生产工艺已成为行业发展的趋势。生物反应器作为一种新型工具，能有效提高细胞产量，稳定疫苗批间差异，已被应用于规模化生产猪圆环病毒2型灭活疫苗。

从行业整体发展来看，应用生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗比转瓶工艺有很大的进步，但在生产工艺优化与成本控制等方面均有很大的发展空间。应用激流灌注式生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用激流灌注式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反应器为培养系统，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、第二蠕动泵，第一硅胶管、第二硅胶管、激流罐、灌注袋、有孔硅胶管和聚酯纤维纸片载体；所述灌注袋为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋，两个灌注袋结构与功能完全相同，以相同的方式与激流罐连接，通过外源泵实现物质交换；

灭活疫苗的制备按以下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养

将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上。接种密度为：每克载体接种0.8～1.2×10⁷个细胞，设定设备参数：温度T1：37.5～38℃、T2：43～46℃、T3：35.5～37℃，pH：7.2～7.6，DO：40%～70%、振荡速度30～45rpm，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

b.病毒接种与培养

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将猪圆环病毒2型种毒接种至制苗用细胞，设定设备参数：温度T1：37～38℃、T2：41～44℃、T3：34～36℃，pH：7.3～7.6，DO：40%～70%，振荡速度35~45r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养猪圆环病毒2型；

c.病毒液收获

病毒培养40～42h后，收获激流罐（5）与灌注袋（6）内的病毒液，将灌注袋（6）反复冻融2～3次后收获上清液，混合后-20℃保存备用；检测病毒液效价；

d.病毒液灭活

按V:V 1:2000向收获的病毒液中加入β-丙内酯灭活剂，灭活病毒；

e.疫苗制备

灭活的病毒液加入佐剂，乳化制备成猪圆环病毒2型灭活疫苗。

上述制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，步骤a中，种子细胞为猪肾细胞PK15，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞，应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过TCID₅₀筛选猪圆环病毒2型疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。

上述制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，步骤a中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于2g/L时，流加补充细胞生长液，流加量以培养液含糖量不低于1g/L为准，当培养液体积达到有效培养体积时，进行换液。

上述制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，步骤a中，逐日增大空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

上述制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，步骤b中，病毒接种前将种毒混于细胞维持液中，种毒与细胞维持液按V/V为1%～3%混合，病毒接种时将混有病毒液的细胞维持液泵入反应器系统中，无需吸附，直接启动病毒培养程序扩增培养病毒。

上述制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，步骤b中，病毒培养12h时开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培养液残糖量不低于1g/L为准；所述n等于2～5。

上述制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述n倍浓缩DMEM液配制方法为：1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述n等于2～5。

上述制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，步骤e中，在灭活的病毒液中按水相与油相佐剂V/V 3:1缓慢加入ISA 28 VG或MF59剂，乳化制备成水包油型猪圆环病毒2型灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.在本发明中，制苗用细胞经过纯化筛选，提高了细胞对病毒的敏感性，保证了种子细胞的状态均一，减小批次间差异，确保生产工艺参数和产品质量的稳定。

2.在本发明中，与常规激流灌注式生物反应器培养系统相比，增加了一个灌注袋，有效增大了细胞贴壁面积，细胞数量增加近一倍，大幅提高病毒液产量。

3.本发明随细胞数增长，逐渐增加空气流量，可以加快系统内气体循环，有利于培养液内CO₂的溢出，减少NaHCO₃的使用量。

4.本发明中，猪圆环病毒2型接种时采用同步接种法，无需吸附，简化操作，节省人力。

5.本发明在接毒后补充订制的浓缩营养液和葡萄糖，可以倍增各种氨基酸含量，为病毒繁殖提供了充足的营养，有利于提高病毒产量。

6. 本发明中采用进口水包油型佐剂，具有单位疫苗抗原含量高，产生免疫反应快，免疫后2周左右就能较好对抗强毒攻击，适用于紧急免疫预防接种。

附图说明

图1 是激流灌注式生物反应器的液体循环系统组成示意图；

图2 是本发明的工艺路线图；

附图或文字中各标号（或符号）清单为：1.第一蠕动泵（灌注出液泵），2.第二蠕动泵（灌注进液泵），3.第一硅胶管、4. 第二硅胶管，5.激流罐，6.灌注袋，7.有孔硅胶管，8.聚酯纤维纸片载体；

T1为激流罐内液体温度，T2为激流罐加热膜的温度，T3为灌注袋外环境温度，pH为激流罐内液体pH值，DO为激流罐内液体溶氧率，振荡速度为激流罐的振荡速度，空气流量为激流罐内空气流通量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，其中各实施例仅用于说明本发明而并非限定本发明的专利保护范围。

实施例1 有限稀释法克隆纯化筛选制苗用细胞

猪肾细胞PK15购自中国兽医药品监察所。

猪圆环病毒疫苗株为猪圆环病毒2型ZJ/C株，于2012年11月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，培养物名称：猪圆环病毒2型ZJ/C株（Porcine cirocovirus，PCV），保藏号为CCTCC NO：V201251，保藏地址为：中国武汉大学：所述病毒较常见，其特征描述省略。

细胞生长液的配方为体积百分含量90%高糖DMEM液，10%新生牛血清，调整PH值为7.4；

细胞维持液为体积百分含量96%高糖DMEM液，4%新生牛血清，调整PH值为7.5；

A. 单克隆细胞株制备

a. 细胞悬液的制备

细胞瓶中培养猪肾细胞PK15，待细胞长满为致密的单层、轮廓清晰时，用0.025%胰酶进行消化，制成悬液。

b. 细胞的有限稀释

对所制备的猪肾细胞PK15悬液进行细胞计数，加入无血清的DMEM培养液稀释细胞悬液，使得细胞密度约为1.0×10⁵个/ml；用无血清DMEM培养液将稀释后的猪肾细胞PK15悬液10倍梯度稀释至10³个/ml，再用细胞生长液10倍梯度稀释到10¹个/ml，即每0.1ml 1个细胞。

c. 细胞的克隆培养

将上述稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板中，0.1ml/孔，显微镜下观察，弃去非单一细胞并且细胞状态不佳的细胞孔，37℃ 5% CO₂培养，每天观察细胞生长状态并及时换液，待细胞增殖为克隆群落，选取生长状态良好的细胞孔，用0.025%胰酶进行消化，制成悬液，重复上述克隆方法1~2次，直至筛选出单克隆生长孔。

d. 单克隆化细胞株的扩大培养

选取单克隆生长孔，用0.025%胰酶消化，以小牛血清中和，以细胞生长液重悬，转移至24孔细胞培养板进行扩大培养，当细胞增殖到汇合度约为80%时，用0.025%胰酶消化，加入细胞生长液，接种于细胞培养瓶中扩大培养，培养6~10瓶，进行单克隆细胞的冻存及细胞库的建立。

B. 猪圆环病毒2型高适应性细胞株的筛选

a. PK15单克隆细胞株的消化铺板

将长满单层的PK15单克隆细胞株用0.025胰酶消化并计数，每株单克隆细胞铺24 孔细胞培养板，设复孔，30000个细胞/孔。置于37℃，5% CO₂下培养24h。

b. PK15单克隆细胞株接种猪圆环病毒2型

弃去24孔细胞培养板中的细胞生长液，加入0.1M PBS，0.8ml/孔，吹洗2~3遍后，按V:V 1%接种量接种猪圆环病毒2型疫苗株，1.0ml/孔，置于37℃，5% CO₂培养，72h后-20℃反复3次冻融，并收获病毒液。

c.猪圆环病毒2型疫苗株感染PK15单克隆细胞株的TCID₅₀检测

将病毒用无血清的DMEM培养液作10倍系列稀释，分别加入到每孔含有100μl PK15单克隆细胞悬液（细胞浓度约为2×10⁵/ml）的96孔细胞培养板，100μl/孔，同时设空白对照和阳性对照。接种后置37℃，5% CO₂培养72h。弃培养液，培养的细胞用冷甲醇/丙酮液固定后，首先与PCV2免疫血清反应，然后与FITC标记的羊抗猪lgG反应，最后用倒置显微镜观察每个稀释度的PCV2-ZJ/C阳性细胞。根据每个稀释度的阳性细胞孔数，按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。

C 结果

a. PK15单克隆细胞株的培养

通过有限稀释法扩大培养获得PK15单克隆细胞株47株。液氮冷冻保存，每株单克隆细胞冻存5支，每支1.5 ml，密度约为5×10⁶/ml。

b.猪圆环病毒2型疫苗株高适应性PK15单克隆细胞株的筛选

通过猪圆环病毒2型疫苗株感染PK15单克隆细胞株72h后的TCID₅₀测定，筛选出2株效价最高的PK15单克隆细胞株：第10株和第27株。其TCID₅₀分别为10^7.6TCID₅₀/ml和10^7.7TCID₅₀/ml。分别标号为P10和P27。与猪圆环病毒2型疫苗株感染普通猪肾细胞PK15的TCID₅₀（10^7.0～10^7.3TCID₅₀/ml）相比，提高约2～5倍。由此可见，筛选获得的PK15单克隆细胞株感染猪圆环病毒2型疫苗株的TCID₅₀ 滴度有明显提高。

P27号猪肾细胞PK15于2012年11月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2012179，保藏地址为：中国武汉大学；所述细胞较常见，其特征描述省略。

实施例2 AP20C型激流灌注式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗

本实施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反应器，灌注袋6体积为8L（两个灌注袋的体积均为4L），激流罐5体积为13L，灌注袋6内含有300g聚酯纤维纸片载体8（两灌注袋各含150g载体）；理论有效培养体积为21L。

细胞同实施例1中菌种保藏的猪肾细胞PK15；

种毒同实施例1中猪圆环病毒2型ZJ/C株，某一批次种毒效价为10^7.5TCID₅₀/ml。

细胞生长液的配方为体积百分含量92%高糖DMEM液，8%新生牛血清，调整PH值为7.4；

细胞维持液为体积百分含量98%高糖DMEM液，2%新生牛血清，调整PH值为7.5；

无Na-DMEM干粉培养基为不含有NaCl和酚红的高糖DMEM培养基，由Invitrogen Corporation生产销售。

A、准备工作：

检验系统气密性，校准电极，PBS处理纸片载体8，连接灌注袋6与激流罐5，用细胞生长液浸泡纸片载体8，平衡系统。

B、制备工作，具体步骤如下：

a.制苗用细胞的复苏与前期培养

从液氮罐中取出冻存的猪肾细胞PK15复苏后，用细胞生长液于37℃培养，长成良好单层后消化转至10L转瓶中培养、备用。

b.制苗用细胞在生物反应器中的接种、培养

取8个长满单层细胞的转瓶，用0.025%胰酶消化细胞，制备细胞悬液10L（含细胞和细胞生长液），细胞总数约2.9×10⁹个。

细胞接种采用两步接种法，第一步：两灌注袋中各从下部打入细胞悬液4.0L，静止吸附1h；第二步：将两灌注袋中的液体各打出1L，再从两灌注袋上部深层管各打入1L剩余细胞悬液，静置吸附0.5h；同时在激流罐5内补充5L细胞生长液预热；细胞接种密度为：每克载体接种0.97×10⁷个细胞。

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1:37.5℃，T2:43℃，T3:36℃，PH:7.4，DO:40～70%，震荡速度45r/min，循环速度400ml/min，空气流量100ml/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。

每日取样2次测残糖量，计算单日耗糖量。接种细胞后24h开始增大空气流量，每24h增加100ml/min。细胞生长液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管3、硅胶管4内液体颜色保持基本一致。

细胞培养48h培养液残糖量低于2g/L，开始流加补充细胞生长液，流加速度为9ml/min。

细胞培养60h时，泵出培养液12L，补入细胞生长液3L后流加补充细胞生长液，流加速度改为11ml/min。

细胞培养72h时培养液体积接近有效体积21L，将培养液全部打出，换入20L新鲜细胞生长液继续培养。

c.猪圆环病毒2型接种制苗用细胞，继续培养

细胞接种后第4日（96h）单日耗糖量达到2.7g/L/24h，且趋于平稳，确定细胞密度达到了接毒要求。排空反应器内液体，将含细胞维持液14L和病毒液420ml的种毒悬液打入系统中，设置设备参数如下：T1：37℃，T2：41℃，T3：36℃，pH：7.5，DO：40～70%，振荡速度45r/min，循环速度500ml/min，空气流量400ml/min，启动病毒培养程序开始培养。

病毒接种12h后开始流加补充200g/L葡萄糖、3倍浓缩DMEM液（1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解而成），3倍浓缩DMEM液流加速度为3.2ml/min，葡萄糖流加速度为0.1ml/min。

d.收获病毒液，灭活病毒

病毒培养40h后，收获激流罐5和灌注袋6内的病毒液，灌注袋6冻融3次后收获上清液，将收获的全部病毒液混匀，共得20.8L病毒液，备用。

收获的病毒液测定效价，每1ml含病毒10^8.4TCID₅₀。

收获的20.8L病毒液内加入10.5mLβ-丙内酯灭活剂，4℃灭活48h，然后置37℃水浴2h终止。灭活完成后取样进行灭活检验，置于4℃保存备用。

e.疫苗制备

将检验合格的灭活病毒液置于乳化容器中，按水相与油佐剂V/V3:1的比例缓慢加入ISA 28 VG油佐剂6.9L，边加边搅拌，然后以800r/min搅拌30min，制成水包油型猪圆环病毒2型灭活疫苗。

f.安全检验

14～21日龄PCV2 ELISA 抗体阴性、PCV2 抗原阴性、PRRSV ELISA抗体阴性的健康易感仔猪5头，各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，连续观察14日，免疫后5头仔猪精神、食欲均无明显变化，无异常临床反应，仔猪安检合格。

g.疫苗效力检验

用14～21日龄PCV2 ELISA抗体阴性、PCV2 抗原阴性、PRRSV ELISA抗体阴性的健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头，一组各颈部肌肉注射疫苗2.0ml/头，另一组用相同剂量的无病毒细胞液乳化剂接种作为阴性对照，14日后，对所有免疫猪及对照猪攻击PCV2-ZJ/C株。攻毒后14日扑杀，免疫组攻毒保护率100%，对照组全部未保护。

与转瓶工艺比较：转瓶培养工艺每瓶收获体积1L，病毒效价一般为10^7.3 TCID₅₀/ml左右；本次实验病毒总产量与200个10L转瓶产量持平。

实施例3 AP200型激流灌注式生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗

本实施例中所用的激流灌注式生物反应器包括AP20C型和AP200型两种。

AP20C型激流灌注式生物反应器同实施例2。

AP200型灌注袋6体积为80L（两个灌注袋的体积均为40L），激流罐5体积为130L，灌注袋6内含有3000g聚酯纤维纸片载体8（两灌注袋各含1500g载体）；理论有效培养体积为210L。

制苗用细胞、种毒均同实施例2。

A、准备工作：

选用AP20C型和AP200型两种激流灌注式生物反应器，做培养细胞前准备工作。

B、制备工作，具体步骤如下：

a.制苗用细胞的培养

按照实施例2方法，在AP20C型生物反应器内培养制苗用细胞96h，至细胞耗糖量增至2.6g/L/24h且趋于平稳时，用0.025%胰酶消化一个灌注袋6内细胞，制得细胞悬液100L，内含猪肾细胞PK15约2.7.×10¹⁰个。将制得的细胞悬液分两步接种于AP200型生物反应器灌注袋6内：第一步：两灌注袋中各从下部打入细胞悬液40L，静止吸附1h；第二步：将两灌注袋中的液体各打出10L，再从两灌注袋上部深层管各打入10L剩余细胞悬液，静置吸附0.5h；同时在激流罐5内补充50L细胞生长液预热；细胞接种密度为：每克载体接种0.9×10⁷个细胞。

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1:37.5℃，T2:43℃，T3:36.5℃，PH:7.3，DO:50～70%，震荡速度43r/min，循环速度4000ml/min，空气流量1000ml/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。

每日取样2次测残糖量，计算单日耗糖量。接种细胞后24h开始增大空气流量，每24h增加1000ml/min。细胞生长液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管3、硅胶管4内液体颜色保持基本一致。

细胞培养48h培养液残糖量低于2g/L，开始流加补充细胞生长液，流加速度为100ml/min。

细胞培养60h时，泵出培养液120L，补入细胞生长液20L后流加补充细胞生长液，流加速度改为为110ml/min。

细胞培养72h时培养液体积接近有效体积210L，将培养液全部打出，换入200L新鲜细胞生长液继续培养。

b.猪圆环病毒2型接种制苗用细胞，继续培养

细胞接种后第4日（96h）单日耗糖量达到2.6g/L/24h，且趋于平稳，确定细胞密度达到了接毒要求。排空反应器内液体，将含细胞维持液135L和病毒液4L的种毒悬液打入系统中，设置设备参数如下：T1：37℃，T2：41℃，T3：36℃，pH：7.5，DO：40～70%，振荡速度45r/min，循环速度5000ml/min，空气流量4000ml/min，启动病毒培养程序开始培养。

病毒接种12h后开始流加补充200g/L葡萄糖、3倍浓缩DMEM液（1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解而成），3倍浓缩DMEM液流加速度为32ml/min，葡萄糖流加速度为1ml/min。

c.收获病毒液，灭活病毒

病毒培养42h后，收获激流罐5和灌注袋6内的病毒液，灌注袋6冻融3次后收获上清液，将收获的全部病毒液混匀，共得207L病毒液，备用。

收获的病毒液测定效价，每1ml含病毒10^8.3TCID₅₀，

收获的207L病毒液内加入103.5mLβ-丙内酯灭活剂，4℃灭活48h，然后置37℃水浴2h终止。灭活完成后取样进行灭活检验，置于4℃保存备用。

d.疫苗制备

将检验合格的灭活病毒液置于乳化容器中，按水相与油佐剂3:1的比例缓慢加入ISA 28 VG油佐剂69L，边加边搅拌，然后以800r/min搅拌30min，制成水包油型猪圆环病毒2型灭活疫苗。

e.安全检验。

免疫后观察14天，5头免疫仔猪精神、食欲无明显变化，无异常临床反应，仔猪安全检合格。

f.疫苗效力检验。

免疫后14日，免疫组攻毒保护率100%，对照组全部未保护，效力检验合格。

与转瓶工艺比较：转瓶培养工艺每瓶收获体积1L，病毒效价一般为10^7.3 TCID₅₀/ml左右；本次实验病毒总产量与2000个10L转瓶产量持平。

Claims

1.一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于：它利用激流灌注式生物反应器为培养系统，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵（1）、第二蠕动泵（2），第一硅胶管（3）、第二硅胶管（4）、激流罐（5）、灌注袋（6）、有孔硅胶管（7）和聚酯纤维纸片载体（8）；所述灌注袋（6）为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋，两个灌注袋结构与功能完全相同，以相同的方式与激流罐（5）连接，通过外源泵实现物质交换；

灭活疫苗的制备按以下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养

将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上;

接种密度为：每克载体接种0.8～1.2×10⁷个细胞，设定设备参数：温度T1：37.5～38℃、T2：43～46℃、T3：35.5～37℃，pH：7.2～7.6，DO：40%～70%、振荡速度30～45rpm，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

b.病毒接种与培养

c.病毒液收获

d.病毒液灭活

e.疫苗制备

灭活的病毒液加入佐剂，乳化制备成猪圆环病毒2型灭活疫苗；

步骤a中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于2g/L时，流加补充细胞生长液，流加量以培养液含糖量不低于1g/L为准，当培养液体积达到有效培养体积时，进行换液；

步骤a中，逐日增大空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

2.根据权利要求1所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤a中，种子细胞为猪肾细胞PK15，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞，应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过TCID₅₀筛选猪圆环病毒2型疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。

3.根据权利要求2所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤b中，病毒接种前将种毒混于细胞维持液中，种毒与细胞维持液按V/V为1%～3%混合，病毒接种时将混有病毒液的细胞维持液泵入反应器系统中，无需吸附，直接启动病毒培养程序扩增培养病毒。

4.根据权利要求3所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤b中，病毒培养12h时开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培养液残糖量不低于1g/L为准；所述n等于2～5。

5.根据权利要求4所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于，所述n倍浓缩DMEM液配制方法为：1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述n等于2～5。

6.根据权利要求5所述的制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤e中，在灭活的病毒液中按水相与油相佐剂V/V 3:1缓慢加入ISA 28 VG或MF59剂，乳化制备成水包油型猪圆环病毒2型灭活疫苗。