CN100500827C

CN100500827C - 用人胚肺二倍体细胞培养繁殖脊髓灰质炎病毒的方法

Info

Publication number: CN100500827C
Application number: CNB2004100795842A
Authority: CN
Inventors: 胡云章; 胡凝珠; 刘国栋; 瞿素; 王荣福
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2004-11-26
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2009-06-17
Anticipated expiration: 2024-11-26
Also published as: CN1637140A

Abstract

本发明提供一种用人胚肺二倍体细胞KMB17培养脊髓灰质炎病毒的方法，其特征在于取人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17或者人二倍体成纤维细胞2BS的第10～40代，并将单层细胞分散并悬浮于培养液中，静置培养至长成致密单层，用含血清的培养基将细胞收集，加入脊髓灰质炎病毒毒种进行悬浮吸附，补加含血清的营养液，静置培养，换成无血清培养液，细胞出现病变时，收获细胞，经冻存、化冻、合并、检测感染性滴度后，得生产疫苗用的脊髓灰质炎病毒液。本发明可使病毒与细胞受体充分接触，有利于病毒进入细胞，同时使细胞处于分裂状态，有利于病毒繁殖，不仅提高了产量，而且显著提高了脊髓灰质炎病毒的滴度，与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度相比无显著差异(P＞0.05)。

Description

用人胚肺二倍体细胞培养繁殖脊髓灰质炎病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种病毒的培养方法，尤其是一种用人胚肺二倍体成纤维细胞或者人二倍体成纤维细胞2BS培养脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)的方法，以便生产脊髓灰质炎减毒活疫苗。

背景技述

利用恒河猴肾细胞生产口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)已有多年的历史，它具有细胞敏感、滴度高、繁殖周期短等特点。但为有效保护资源，人们试图使用人胚肺二倍体细胞生产OPV。但采用现有技术在人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17或人二倍体成纤维细胞2BS中培养生产OPV，与用恒河猴肾细胞培养OPV相比较，其滴度相对较低。而影响滴度的主要因素是细胞病变慢、病变时间长、至90小时病变不充分等等。这些又是现有技术所不能克服的困难。因此，有必要研究新的技术方案，以提高KMB17细胞和2BS细胞培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒滴度。

发明内容

本发明的目的正是为解决现有技术存在的上述不足而提出了一种用人胚肺二倍体细胞或者人二倍体成纤维细胞2BS培养脊髓灰质炎病毒的方法，以便用培养出来的脊髓灰质炎病毒生产减毒活疫苗。

本发明的技术方案是：一种用人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17培养脊髓灰质炎病毒的方法，包括细胞培养、悬浮吸附培养，病毒培养，其特征在于经过下列具体工艺步骤：

A、取人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17或者人二倍体成纤维细胞2BS的10～40代，用0.03～0.05％胰蛋白酶+0.02～0.04％乙二胺四乙酸EDTA将单层细胞分散并悬浮于培养液中，接种于容器中，35～37℃静置培养至长成致密单层；

B、将长成致密单层的KMB17细胞或者2BS细胞弃营养液，消化后，用含2～5％血清的培养基MEM将细胞收集于另一容器内，记数，按0.03～0.05MOI的量加入脊髓灰质炎病毒毒种，在33±0.5℃下，放入转速为20-120转/分钟的搅拌器上搅拌，进行悬浮吸附0.5～2.0小时；

C、将悬浮吸附好的悬液分装于培养瓶内，补加含5％～10％血清浓度的营养液至每个培养瓶并使终体积为100～200ml，于33±0.5℃静置培养20～24小时，换成无血清培养液，培养至90h，细胞出现病变时，即收获细胞并于-20～-30℃冻存，24小时以后化冻，合并样品、检测感染性滴度后，即得生产疫苗用的脊髓灰质炎病毒液。

所述人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17还可用人二倍体成纤维细胞2BS代替，同样也能实现本发明的目的。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：1)在高密度悬浮条件下使病毒与细胞受体充分接触，有利于病毒进入细胞；2)在培养过程中添加血清，使细胞处于分裂状态，有利于病毒繁殖，最终达到提高产量的目的。

本发明解决了下列技术难点：由于脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)与柯萨奇病毒(Coxsackievirus)相似，属小核糖核酸病毒科肠道病毒属，体内外研究证实，Coxsackievirus感染细胞后引起细胞裂解，呈现典型的细胞病变特征。根据Ralph等的研究发现：Coxsackievirus B3体外感染处于静止期的Hela-rw细胞，病毒繁殖量较低，相反，用Coxsackievirus B3感染处于分裂期的Hela-rw细胞，病毒产量显著提高，这一结果说明产生CPE的病毒在细胞培养过程中病毒产量与细胞状态密切相关，处于分裂期的细胞有利于病毒繁殖。以此类推，我们认为Poliovirus在KMB17细胞/2BS细胞上繁殖滴度相对较低可能与我所传统生产工艺中病毒感染细胞后换为无血清培养，导致细胞处于静止期有关。因此，本专利的发明人经过多年来的潜心研究与试验，并付出了创造性的劳动，获得上述技术方案，即采用悬浮吸附及添加5～10％血清的方法，用KMB17细胞/2BS细胞培养脊髓灰质炎病毒，均显著提高了脊髓灰质炎病毒(Sabin I、II、III、中III₂型疫苗株)的滴度。在最佳培养条件下，用KMB17细胞培养，Sabin I滴度可达8.125LgCCID₅₀，Sabin II滴度可达7.5LgCCID₅₀，Sabin III滴度可达7.575LgCCID₅₀，中III₂滴度可达7.583LgCCID₅₀；用2BS细胞培养，SabinI滴度可达8.073LgCCID₅₀，Sabin II滴度可达7.475LgCCID₅₀，Sabin III滴度可达7.5LgCCID₅₀，中III₂滴度可达7.542LgCCID₅₀。与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度比较，均无显著差异(P>0.05)，说明KMB17细胞/2BS细胞可以用于脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。我们筛选出的最佳条件是10％血清不换液，而24h换液后病毒产量略低于不换液的病毒产量，但无显著差异(P>0.05)。从安全性的角度考虑，换液培养对疫苗的安全性可能具有更重要的意义。其结果如下：

1、不同血清浓度、换液条件对Sabin I型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响见表1。

表1不同血清浓度、换液条件对Sabin I型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响

注：细胞分种比例，1：1指消化1个T225培养瓶细胞消化后分种入1个T225培养瓶中，2：1是指2个T225培养瓶细胞消化后分种入1个T225培养瓶中。

从表1可看出，用2：1分种率及10％血清，KMB17培养的病毒平均滴度为8.125LgCCID₅₀；2BS培养的病毒平均滴度为8.073LgCCID₅₀，均显著高于常规对照组(P<0.05)。但是，在2：1分种率及10％血清培养24h后换液条件下，病毒平均滴度分别也可达8.083LgCCID₅₀、7.875LgCCID₅₀，与前者相比，无显著差异(P>0.5)。

2、不同血清浓度、换液条件对Sabin II型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响见表2。

表2不同血清浓度、换液条件对Sabin II型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响

从表2可看出，10％血清培养滴度最高，KMB17培养的平均滴度达7.5LgCCID₅₀，2BS培养的平均滴度为7.475LgCCID₅₀，均显著高于常规对照组(P<0.05)。但是，在10％血清、2：1分种率，10％血清、2：1分种率、接种24h后换液培养以及在5％血清、2：1分种率培养条件下，KMB17培养的病毒滴度均可达到7.458LgCCID₅₀，与10％血清培养的病毒滴度无显著差异(P>0.05)。

3、不同血清浓度、换液条件对Sabin III型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响见表3。

表3不同血清浓度、换液条件对Sabin III型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响

从表3可看出，在10％血清、24h换液、2：1分种率培养条件下，病毒滴度均达最高，KMB17平均滴度为7.575LgCCID₅₀，2BS平均滴度为7.5LgCCID₅₀，均显著高于常规对照组(P<0.05)。但是，在5％血清、2：1分种率培养条件下，KMB17的平均滴度达到7.512LgCCID₅₀，2BS平均滴度为7.475LgCCID₅₀，与前者无显著差异(P>0.05)。

4、不同血清浓度、换液条件对中III₂型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响见表4。

表4不同血清浓度、换液条件对中III₂型在KMB17细胞或2BS细胞上繁殖的影响

从表4可看出，在10％血清、24h换液、2：1分种率培养条件下，病毒平均滴度均达最高，KMB17为7.583LgCCID₅₀，2BS为7.542LgCCID₅₀，均显著高于常规对照组(P<0.05)。但是，在5％血清、2：1分种率培养条件下，KMB17培养的病毒平均滴度达到7.542LgCCID₅₀，2BS培养的平均滴度也达到7.512LgCCID₅₀，与前者无显著差异(P>0.05)。

5、KMB17细胞及2BS细胞与原代猴肾细胞培养OPV的病毒滴度比较见表5。

与传统恒河猴原代肾细胞培养的病毒滴度相比较，用悬浮吸附法加10％血清培养可显著提高病毒滴度，I型略高于猴肾细胞培养的滴度，III型略低于猴肾细胞培养的滴度，但无显著差异(P>0.05)。这一结果说明，我们摸索的条件在KMB17细胞及2BS细胞上均可达到猴肾细胞培养的滴度。

表5KMB17细胞及2BS细胞与原代猴肾细胞培养OPV的病毒滴度比较

5、滴度检测

按传统微量法滴定。Hep-2细胞制成1×10⁵/ml，接种于96孔微量板，0.1ml/孔，同时接种10倍稀释的病毒样品，0.1ml/孔，每个稀释度接种8孔。测定板置于33℃CO₂孵箱中培养，于第3、7d观察、记录Hep-2细胞病变孔数，并按Reed-Munch法计算LgCCID₅₀/ml。

具体实施方式

下面结合实施对本发明做进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。

实施例1

A、取人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17的第35代，用0.03％胰蛋白酶+0.04％乙二胺四乙酸EDTA将单层细胞分散并悬浮于培养液中，接种于容器中，35℃静置培养至长成致密单层；

B、将长成致密单层的KMB17细胞弃营养液，消化后，用含2％血清的培养基MEM将细胞收集于另一容器内，记数，按0.03MOI的量加入脊髓灰质炎病毒毒种，在33±0.5℃下，放入转速为20转/分钟的磁力搅拌器上搅拌，进行悬浮吸附2.0小时；

C、将悬浮吸附好的悬液分装于培养瓶内，补加含10％血清浓度的营养液至每个培养瓶并使终体积为100ml，于33±0.5℃静置培养20～24小时，换成无血清培养液，培养至90h，细胞出现病变时(++++)，即收获细胞并于-20～-30℃冻存，24小时以后化冻，合并样品、检测感染性滴度后，即得生产疫苗用的脊髓灰质炎病毒液。

实施例2

A、取人二倍体成纤维细胞2BS的第25代，用0.05％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸EDTA将单层细胞分散并悬浮于培养液中，接种于容器中，37℃静置培养至长成致密单层；

B、将长成致密单层的2BS细胞弃营养液，消化后，用含5％血清的培养基MEM将细胞收集于另一容器内，记数，按0.05MOI的量加入脊髓灰质炎病毒毒种，在33±0.5℃下，放入转速为120转/分钟的磁力搅拌器上搅拌，进行悬浮吸附0.5小时；

C、将悬浮吸附好的悬液分装于培养瓶内，补加含5％血清浓度的营养液至每个培养瓶并使终体积为200ml，于33±0.5℃静置培养20～24小时，换成无血清培养液，培养至90h，细胞出现病变时(++++)，即收获细胞并于-20～-30℃冻存，24小时以后化冻，合并样品、检测感染性滴度后，即得生产疫苗用的脊髓灰质炎病毒液。

Claims

1、一种用人胚肺二倍体细胞KMB17或者人二倍体成纤维细胞2BS培养脊髓灰质炎病毒的方法，包括细胞培养、悬浮吸附培养，病毒培养，其特征在于经过下列具体工艺步骤：

A、取人胚肺二倍体细胞KMB17或者人二倍体成纤维细胞2BS的第10～40代，用0.03～0.05％胰蛋白酶+0.02～0.04％乙二胺四乙酸EDTA将单层细胞分散并悬浮于培养液中，接种于容器中，35～37℃静置培养至长成致密单层；

B、将长成致密单层的KMB17细胞或者2BS细胞弃营养液，消化后，用含2～5％血清的培养基MEM将细胞收集于另一容器内，记数，按0.03～0.05感染复数的量加入脊髓灰质炎病毒毒种，在33±0.5℃下，放入转速为20-120转/分钟的搅拌器上搅拌，进行悬浮吸附0.5～2.0小时；

C、将悬浮吸附好的悬液分装于培养瓶内，补加含5％～10％血清浓度的营养液至每个培养瓶并使终体积为100～200ml，于33±0.5℃静置培养20～24小时，换成无血清培养液，培养至90小时，细胞出现病变时，即收获细胞并于-20～-30℃冻存，24小时以后化冻，合并样品、检测感染性滴度后，即得生产疫苗用的脊髓灰质炎病毒液。