CN109627282B - 鹿胎盘活性蛋白及其提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹿胎盘活性蛋白及其提取方法和应用，所述方法包括以下步骤：取鹿胎盘进行预处理；将预处理后的鹿胎盘冷冻后切碎，加入含蛋白酶抑制剂的生理盐水，制成匀浆；将匀浆完全冻结后再迅速溶化，重复1‑3次；将处理后的匀浆进行超声破碎细胞，然后离心分离收取上清液；将上清液冷却后加入丙酮，过滤收集沉淀，将沉淀干燥后得到粉末；将粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入饱和硫酸铵至饱和度为0.25，离心去除沉淀，然后取上清液调节pH值，加饱和硫酸铵至饱和度为0.50，得到盐析物；将盐析物溶于Tris‑Hcl缓冲液中，超滤得到超滤液；将超滤液脱盐后，干燥得到鹿胎盘活性蛋白。本发明的鹿胎盘活性蛋白能够促进干细胞增殖。

Description

鹿胎盘活性蛋白及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及保健食品技术领域，特别涉及一种鹿胎盘活性蛋白及其提取方法和应用。

背景技术

鹿胎为梅花鹿或马鹿的完整子宫、胎儿、胎盘和羊水的统称，包括出生后未食乳的仔鹿。主要来源有妊娠母鹿剖腹产而得；机械原因流产的胎儿；母鹿少乳、缺乳、拒哺、弃仔等原因而死亡的仔鹿。鹿胎盘是传统名贵的鹿类中药材，鹿胎盘及其制剂作为一种特殊的中药，具有良好的滋补作用，在我国的应用已长达几百年。

国内现有鹿胎盘产品主要是初级原材料或直接应用简单加工，大部分产品采用传统的产品加工工艺，没有同现代制药工艺进行有机结合，导致产品的生物利用度不高。产品层次低，精深加工产品少，技术含量较低，致使产品附加值低。鹿胎膏的传统工艺是高温熬制，这样会使一部分生物活性蛋白失活，影响效果。此外，采用食品工艺的方法从鹿胎盘中提取鹿胎盘粉，提取的是鹿胎盘中所有的结构蛋白质和功能蛋白质及多糖的混合物，具有免疫原性，药用价值低，生物活性差。这些方法都大大浪费了宝贵的鹿胎盘资源。

间充质干细胞，通常是指来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，并能在特定条件下分化为软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。在成体干细胞中，间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓、脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞。由于间充质干细胞具有强大的增殖能力、较强的多向分化潜能陈、以及其低免疫原性比和免疫调节功能，成为组织工程中的理想种子细胞闭，因而在细胞替代治疗和组织工程方面显示出巨大价值而备受关注。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种鹿胎盘活性蛋白及其提取方法和应用。所述技术方案如下：

一方面，一种鹿胎盘活性蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)取鹿胎盘进行预处理；

(2)将步骤(1)预处理后的鹿胎盘于-30℃冷冻后切碎，加入含蛋白酶抑制剂的生理盐水，然后制成匀浆；

(3)将所述匀浆完全冻结后再迅速溶化，重复1-3次；

(4)将步骤(3)处理后的所述匀浆进行超声破碎细胞，然后离心分离，收取上清液；

(5)将所述上清液冷却后加入丙酮，过滤收集沉淀，将所述沉淀干燥后得到粉末；

(6)将所述粉末溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入饱和硫酸铵至饱和度为0.25，离心去除沉淀，然后取上清液调节pH值至4.0，加饱和硫酸铵至饱和度为0.50，得到盐析物；

(7)将所述盐析物溶于Tris-Hcl缓冲液中，超滤得到超滤液；

(8)将所述超滤液用Sephadex G-25脱盐后干燥，得到鹿胎盘活性蛋白。

进一步的，所述步骤(1)取鹿胎盘进行预处理，具体方法为：

将鹿胎盘去除胎膜，大血管及脂肪和结缔组织。

进一步的，所述步骤(2)中，鹿胎盘与含蛋白酶抑制剂的生理盐水的质量体积比为＝1:6。

进一步的，所述步骤(2)中，蛋白酶抑制剂为苯甲基硫氟化物。

进一步的，所述步骤(3)中，将所述匀浆置于-25～70℃完全冻结，然后再在25～37℃的水中迅速溶化。

进一步的，所述步骤(4)中14000g离心分离。

进一步的，所述步骤(5)将所述上清液冷却至4℃，加入所述上清液5倍体积的-10℃的丙酮。

进一步的，所述步骤(7)中Tris-Hcl缓冲液为pH8.0的10mmol/L Tris-Hcl缓冲液。

另一方面，一种鹿胎盘活性蛋白，采用上述方法提取得到。

再一方面，上述提取方法提取的鹿胎盘活性蛋白在制备促进间充质干细胞增殖药物中的应用。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的鹿胎盘活性蛋白及其提取方法和应用，方法简便易行，提取得到的鹿胎盘活性蛋白有助于干细胞干性维持，能够促进干细胞增殖和干性基因表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1：是本发明实施例2鹿胎盘活性蛋白促进人干细胞(间充质干细胞)增殖图；

图2：是本发明实施例2鹿胎盘活性蛋白对人干细胞(间充质干细胞)的生长曲线图；

图3：是本发明实施例3鹿胎盘活性蛋白对人干细胞(间充质干细胞)的碱性磷酸酶染色图；

图4：是本发明实施例4鹿胎盘活性蛋白对人干细胞(间充质干细胞)的免疫荧光染色图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1鹿胎盘活性蛋白的提取方法

本发明以梅花鹿胎盘为原材料，具体工艺过程如下：

(1)鹿胎盘的预处理

将鹿胎盘去除胎膜，大血管及脂肪和结缔组织。

(2)提取

在-30℃的低温下将预处理后的鹿胎盘冷冻后切碎，加入含苯甲基硫氟化物的生理盐水(质量:体积＝1:6)，用高速组织匀浆器制成匀浆。

(3)裂解细胞

a.多次反复冻融

将匀浆置于-25～70℃的低温下完全冻结后再在25～37℃水中迅速溶化，重复1-3次。

b.超声波破碎细胞

将上步鹿胎盘匀浆液在超声仪上进行超声裂解细胞，然后14000g离心分离，收取上清液。

(4)沉淀

将上清液冷却至4℃，然后加入5倍体积的-10℃的丙酮，过滤收集沉淀，将沉淀干燥后得到粉末。

(5)分段盐析

将得到的粉末溶于pH7.0磷酸盐缓冲溶液中，加入硫酸铵至饱和度为0.25，离心去除沉淀，上清液调pH至4.0，加硫酸铵至饱和度为0.50，得到盐析物。

饱和度：硫酸铵在溶液中的最终浓度。

计算公式：

Va：加入饱和硫酸铵的体积；V0：蛋白质溶液的体积。

(6)超滤

将盐析物溶于pH8.0的10mmol/L Tris-Hcl缓冲液中，超滤得到超滤液。

(7)脱盐、干燥

将超滤液用Sephadex G-25脱盐后，干燥得到鹿胎盘活性蛋白。

实施例2-4中所用到的药品及溶液配制说明：

1、鹿胎盘活性蛋白溶液配制：0.1g鹿胎盘活性蛋白(实施例1制备得到)溶于2ml超纯水中，0.22um滤膜过滤，-30℃保存。

2、磷酸盐缓冲液(PBS)配制：8g氯化钠，0.2g氯化钾，2.581g十二水合磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，溶于超纯水并定容至1L。上述药品均购自北京化工厂。

3、细胞培养基配制：在500ml DMEM F12(购自Invitrogen公司)细胞培养基加入50ml胎牛血清(天津康源生物有限公司)和5ml青/链霉素双抗生素混合液(青霉素，10U/ml；链霉素，10ug/ml)。青/链霉素双抗生素购自美国Gibco生物公司。

4、磷酸盐缓冲液(PBS)配制：8g氯化钠，0.2g氯化钾，3.581g十二水合磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，溶于超纯水并定容至。上述药品均购自北京化工厂。

5、磷酸盐洗涤液(PBST)：1L PBS中加入1ml吐温-20，搅拌使其混合均匀。吐温-20购自北京鼎国生物技术有限公司。

6、4％多聚甲醛：1.2g多聚甲醛粉末加入约25ml PBS中，最终体积30ml，再加入2MNaOH 3ml，55℃加热助溶，PH调至7.2-7.5之间，定容至30ml，并储存于4℃。

实施例2鹿胎盘活性蛋白促进人干细胞(间充质干细胞)的增殖

实验一：

(1)准备细胞：在6孔板(美国Corning)内接种(个/孔)Huc-MSC细胞(人源脐带间充质干细胞，吉林大学表观遗传实验室)，6孔板每孔加入2ml细胞培养基，在细胞培养箱(日本三洋)中培养至细胞覆盖率达到30％。

(2)鹿胎盘活性蛋白处理细胞：Huc-MSC细胞培养至细胞覆盖率达到30％后选取4个孔，每孔更换新的2ml预混不同浓度鹿胎盘活性蛋白的细胞培养基，使各孔内的鹿胎盘活性蛋白终浓度分别为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml和300ng/ml。细胞在加入鹿胎盘活性蛋白后继续培养72小时，拍照观察细胞生长情况，实验结果见图1，结果显示浓度为100ng/ml、200ng/ml及300ng/ml的处理组细胞数量明显多于0ng/ml(对照组)细胞数量。

实验二：生长曲线实验

在6孔板中接种Huc-MSC细胞，接种细胞数为(2×10⁴个/孔)共14个孔。细胞覆盖率达到30％后选取7个孔，每孔加入2ml DMEM-F12细胞培养基(对照组)，其他7个孔加入2ml含鹿胎盘活性蛋白浓度为200ng/ml的DMEM-F12细胞培养基(实验组)，每三天更换一次培养基。每天分别取对照组和实验组一个孔进行计数，共计数7天，实验结果见图2，图2中对照组和实验组细胞均成指对数生长，并且200ng/ml鹿胎盘活性蛋白实验组细胞增殖速度明显高于0ng/ml对照组的细胞。

通过显微镜观察和细胞生长曲线实验发现鹿胎盘活性蛋白处理脐带间充质干细胞Huc-MSCs时明显促进了干细胞的增殖，说明了鹿胎盘活性蛋白对干细胞增殖具有促进作用。

实施例3鹿胎盘活性蛋白益于人干细胞(间充质干细胞)干性维持

(1)细胞准备：在6孔板中接种Huc-MSC细胞(2×10⁴个/孔)，共四个孔。细胞覆盖率达到30％时选2个孔加入2ml DMEM-F12培养基(对照组)，另外2个孔加入2ml含鹿胎盘活性蛋白浓度为200ng/ml的DMEM-F12细胞培养基(实验组)，培养72小时后进行碱性磷酸酶染色。

(2)AP染色：吸弃6孔板中的培养基后，PBS洗两遍。4％的多聚甲醛固定3min，500ulPBS清洗两遍。将75ul 50mg/ml四唑淡蓝(NBT)与37.6ul 50mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(BCIP)加入到10ml AP底物buffer，每孔加入2ml，避光染色过夜。PBS清洗两遍，显微镜下观察拍照，结果见图3，图3中对照组及实验组细胞均能染上颜色，200ng/ml鹿胎盘活性蛋白(实验组)染色数量明显多于对照组细胞。

通过碱性磷酸酶(AP)染色实验发现鹿胎盘活性蛋白处理脐带间充质干细胞Huc-MSCs时，染色情况明显多于对照组细胞，说明了鹿胎盘活性蛋白对干细胞干性维持具有促进作用。

实施例4鹿胎盘活性蛋白促进人干细胞(间充质干细胞)干性标志物的表达

(1)细胞准备：在3.5cm培养皿中接种Huc-MSC细胞(2×10⁴个/孔)，共个2孔。细胞覆盖率达到30％时选1个孔加入2ml DMEM-F12培养基(对照组)，另外1个孔加入2ml含鹿胎盘活性蛋白浓度为200ng/ml的DMEM-F12细胞培养基(实验组)，培养72小时后进行免疫荧光染色。

(2)种爬片铺细胞：75％的乙醇浸泡爬片10-15min，100％乙醇浸泡爬片5min，在24孔板的盖上将爬片晾干然后种到孔中。将对照组和实验组细胞分别铺到4个孔中，培养24小时。

(3)固定细胞：300-500ul的4％多聚甲醛在室温下固定细胞15min。

(4)PBS清洗细胞：1xPBS清洗细胞，将24孔板放在摇床上清洗细胞一次，100rpm，5min。

(5)破膜：500ul的0.3％Trition-100破膜，室温放置5min。

(6)PBS清洗细胞：1×PBS清洗细胞，将24孔板放在摇床上清洗细胞一次，100rpm，5min。

(7)BSA封闭：150ul 1％的BSA封闭爬片，24孔板放在湿盒中，置于37℃培养箱中封闭1h。

(8)清洗细胞：500ul 1×PBST清洗细胞，将24孔板放在摇床上清洗细胞一次，100rpm，5min。

(9)一抗孵育：爬片从24孔板中抠出来，侧立用无尘纸吸干PBST，置于50ul的抗体中。置于湿盒中，37℃孵育1h。一抗种类及溶液配制：Sox2、Nanog、KIF4和Oct4以1:100体积比例用PBST稀释使用。

(10)二抗孵育：弃掉一抗溶液，加适量PBST清洗4次。在24孔进行二抗孵育，在37℃下避光孵育1h。(二抗1:300稀释)

(11)清洗细胞：1×PBST清洗细胞4次，100rpm，5min。二抗清洗细胞换液需要在暗室进行，始终用锡纸包着。

(12)封片：将50ul含DAPI的封片液滴到载玻片上，侧立吸干爬片上的PBST，置于封片液上，用枪滴3-4滴指甲油固定爬片，爬片置于4℃保存。荧光显微镜下观察Nanog、Sox2、Oct4和KIF4的水平变化，结果见图4。

通过免疫荧光染色实验发现鹿胎盘活性蛋白处理脐带间充质干细胞Huc-MSCs时，Oct4、Nanog、KIF4及Sox2荧光亮度明显高于对照组细胞，说明了鹿胎盘活性蛋白促进干细胞干性基因的表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.鹿胎盘活性蛋白在制备促进间充质干细胞干性维持的药物中的应用，其特征在于，所述鹿胎盘活性蛋白的提取方法包括以下步骤：

(1)取鹿胎盘进行预处理；

(2)将步骤(1)预处理后的鹿胎盘于-30℃冷冻后切碎，加入含蛋白酶抑制剂的生理盐水，其中，鹿胎盘与含蛋白酶抑制剂的生理盐水的质量体积比为1:6，蛋白酶抑制剂为苯甲基硫氟化物，然后制成匀浆；

(3)将所述匀浆置于-25～70℃完全冻结，然后再在25～37℃的水中迅速溶化，重复1-3次；

(4)将步骤(3)处理后的所述匀浆进行超声破碎细胞，然后14000g离心分离，收取上清液；

(5)将所述上清液冷却至4℃，加入所述上清液5倍体积的-10℃的丙酮，过滤收集沉淀，将所述沉淀干燥后得到粉末；

(6)将所述粉末溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入饱和硫酸铵至饱和度为0.25，离心去除沉淀，然后取上清液调节pH值至4.0，加饱和硫酸铵至饱和度为0.50，得到盐析物；

(7)将所述盐析物溶于pH8.0的10mmol/L Tris-Hcl缓冲液中，超滤得到超滤液；

(8)将所述超滤液用SephadexG-25脱盐后，干燥得到鹿胎盘活性蛋白。

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