CN102485903A - 利用鹿胎盘制备生物活性蛋白寡肽粉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用鹿肉的生物活性蛋白寡肽粉及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：将鹿肉进行预处理、蛋白酶水解及分离纯化，即得到所述生物活性蛋白寡肽粉；所得到的利用鹿肉的生物活性蛋白寡肽粉的总氨基酸含量在75％以上，分子量在500-2000之间。由于本发明以生物活性丰富的鹿胎盘作为原料，具有补肾益精、延缓衰老的功效；同时，由于寡肽富有的各种生物活性，本发明的生物活性的蛋白寡肽同时还具有ACE抑制的补肾益精活性和基于清除自由基的抗衰老活性，故本发明将该生物活性寡肽作为原料应用于医药、保健品、化妆品领域，为有效利用鹿肉资源，提供一种开发途径。

Description

利用鹿胎盘制备生物活性蛋白寡肽粉的方法

技术领域

本发明涉及制备一种生物活性蛋白寡肽粉的方法，特别涉及一种利用鹿胎盘制备生物活性蛋白寡肽粉的方法。

背景技术

目前已有人以鳕鱼肉、鲢鱼、大豆、动物皮等为原料，采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及胰蛋白酶等水解蛋白酶制备了生物活性寡肽。在动物原料中，水产生物较为多见，鹿源寡肽还未见报道，在寡肽的生物活性方面也多集中在清除自由基活性，ACE抑制活性寡肽还未见报道。

鹿胎盘有补肾益精、延缓衰老的作用。但由于鹿胎盘温补作用显著，主要适合于气血不足，肾气亏虚的人食用，而大部分健康人群都不能过多食用，因此，限制了鹿胎盘的开发利用。同时，在一些鹿业公司鹿胎盘用酶活性为资源也未能被充分利用，而造成资源浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用鹿肉制备的生物活性蛋白寡肽及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种利用鹿肉制备生物活性蛋白寡肽粉。

本发明还提供了一种利用鹿肉制备生物活性蛋白寡肽粉及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

a.鹿胎盘预处理：将鹿胎盘煮至所述鹿胎盘的蛋白变性；

b.蛋白酶水解：向变性的鹿胎盘中添加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，进行酶解反应；

c.分离纯化：将所述酶解液除盐、冷冻干燥所得到的淡黄色粉针状细末即为所述生物活性蛋白寡肽粉。

本发明还提供了所述生物活性寡肽作为原料在医药、保健品、化妆品的应用。

由于本发明以生物活性丰富以鹿肉或鹿胎盘作为原料，具有补肾益精、延缓衰老的功效；同时，由于寡肽富有的各种生物活性，本发明的生物活性的蛋白寡肽同时还具有ACE抑制的补肾益精活性和基于清除自由基指标的抗衰老活性，将该生物活性寡肽作为原料应用于医药、保健品、化妆品领域，为有效利用鹿肉资源，提供一种开发途径。

附图说明

图1为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽四个批次的TLC图谱。

图2为用相似度评价软件自动生成的本发明的鹿胎盘寡肽对照图谱。

图3为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽的分子量分布。

图4为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽在分子量为500-2000的展开图；

图5为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽浓度与ACE抑制活性关系曲线。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

本发明是按以下技术方案实现的，其制备及质量检测方法是：

a.鹿肉预处理：将鹿肉或者鹿胎盘中肉质部分，去除筋膜和血管，洗净，反复冻融，绞碎。优选地，原料选自鹿胎盘；优选地，冻融三次以上；优选地，用95℃以上水煮15-30分钟。

b.蛋白酶水解：将变性的鹿肉与的水均匀混合，添加的碱性蛋白酶和的木瓜蛋白酶，进行酶解反应，灭酶活，冷却至常温。优选地，碱性蛋白酶占鹿胎原料的0.8％-2％；木瓜蛋白酶占鹿胎原料的0.8％-2％，优选地，在55±5℃，pH7.5±0.5的条件下酶解反应3-5小时；优选地，95℃以上灭酶活15分钟，冷却至常温；优选地，变性的鹿肉与1∶1的水的混合比例为1∶1，按重量计。

c.分离纯化：离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释，分离，收集分子量≤5k的部分，将收集到的料液除盐，收集除盐后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。优选地，采用8000rpm高速离心；优选地，将酶解液稀释10倍以上，优选地，采用超滤膜分离，优选地，利用纳滤除盐。

d.薄层色谱检测产品：薄层色谱条件为展开剂配方为正丁醇∶乙醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1∶2，显色剂配方为0.2％的茚三酮乙醇溶液，得到该工艺产品的5个主要特征点，为合格。

e.高效液相色谱检测产品：高效液相条件为：Agilent 1100型高效液相色谱仪，

T3色谱柱(4.6×10mm，3μm)，流动相为100％的超纯水，流速0.6ml/min，选样量10μl，检测波长紫外215nm。用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件制定出对照图谱，与对照图谱相似度大于90％的鹿胎盘寡肽为合格。

实施例1

以鹿胎盘为原料，去除其鹿胎盘肉质子叶，去除其血管和筋膜，将其洗净。将所属肉质子叶反复冻融三次，绞碎，95℃以上水煮15-30分钟。将变性的鹿肉与1∶1的水均匀混合，添加鹿胎原料的0.8％的碱性蛋白酶(酶活力2.4AU/g，丹麦诺维信)和2％的木瓜蛋白酶(800000u/g，南宁东恒华道)，在55±5℃，pH7.5±0.5的条件下，酶解反应3-5小时，95℃以上灭酶活15分钟，冷却至常温。采用8000rpm高速离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释10倍以上，采用超滤膜分离，收集分子量≤5k的部分，将收集到的料液利用纳滤除盐，收集纳滤后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。

实施例2

以鹿胎盘为原料，去鹿胎盘肉质子叶，去除血管和筋膜，洗净。将肉质子叶反复冻融三次，绞碎，95℃以上水煮15-30分钟。将变性的鹿肉与1∶1的水均匀混合，添加鹿胎原料的2％的碱性蛋白酶和0.8％的木瓜蛋白酶，在55±5℃，pH7.5±0.5的条件下，酶解反应3-5小时，95℃以上灭酶活15分钟，冷却至常温。采用8000rpm高速离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释10倍以上，采用超滤膜分离，收集分子量≤5k的部分，将收集到的料液利用纳滤除盐，收集纳滤后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。

实施例3

选料：去鹿胎盘肉质子叶，去除血管和筋膜，洗净。将肉质子叶反复冻融三次，绞碎，95℃以上水煮15-30分钟。将变性的鹿肉与1∶1的水均匀混合，添加鹿胎原料的1.5％的碱性蛋白酶和1.5％的木瓜蛋白酶，在55±5℃，pH7.5±0.5的条件下，酶解反应3-5小时，95℃以上灭酶活15分钟，冷却至常温。采用8000rpm高速离心去除不溶杂质后，将酶解液稀释10倍以上，采用超滤膜分离，收集分子量≤5k的部分，将收集到的料液利用纳滤除盐，收集纳滤后的浓缩液，旋转蒸发除去大部分水后，冷冻干燥即获得淡黄色粉针状细末。

实施例4

图1为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽四个批次的TLC图谱。将上述实施例1的鹿胎盘寡肽的淡黄色粉末制备成四个批次，分别将四个批次的样品溶解并制成1mg/ml的溶液在展开缸中进行展开，采用TLC法检测四个批次生产的鹿胎盘寡肽产品，展开剂配方为正丁醇∶乙醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1∶2，显色剂配方为0.2％的茚三酮乙醇溶液。对四个不同批次生产的鹿胎盘寡肽产品的薄层色谱结果进行分析，如图1所示，每个样品中，共含有5个可见圆点，从上到下1-5这5个点的比移值分别为0.8375，0.65，0.5375，0.475，0.2875。当得到的产品为如图1所示从上到下的5个主要特征点时，为合格产品。

实施例5

高效液相色谱检测条件为：高效液相色谱检测产品条件为：Agilent 1100型高效液相色谱仪，

T3色谱柱(4.6×10mm，3μm)，流动相为100％的超纯水，流速0.6ml/min，进样量10μl，检测波长紫外215nm。图2为相似度评价软件自动生成的鹿胎盘寡肽对照图谱。该图谱用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件制定出，且该对照图谱积分数据如表1。与对照图谱相似度大于90％的鹿胎盘寡肽为合格产品。

表1对照用指纹图谱积分数据

实施例6

分子量分布研究

图3为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽的分子量分布。采用MALDI-T0F-MS质谱法检测。由北京大学医学部分析测试中心合作完成。MALDI-TOF-MS质谱法检测，该产品分子量范围主要集中在500-2000之间，通过MALDI-TOF-MS质谱法检测，确定了鹿胎盘寡肽的分子量分布大部分处于2000Da以下。图4为本发明实施例1在分子量为500-2000的展开图，主峰有530Da、580Da、757Da、1113Da、1253Da、1367Da、1593Da、1987Da。

实施例7

表2为本发明实施例1的鹿胎盘寡肽中游离氨基酸组成和含量。由北京艾米诺医学研究有限公司合作完成。液质联用内标法检测其氨基酸组成和含量可测得实施例1的总氨基酸含量高达79.14％。该鹿胎盘寡肽产品中，20种常见的氨基酸除天门冬酰胺外，含有其余的十九种。还含有γ-氨基丁酸、α-氨基正丁酸这类具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压功能的强神经抑制性氨基酸；瓜氨酸、鸟氨酸这样参与尿素循环的氨基酸；主要存在于肌肉组织中的甲基组氨酸；能改善风味的羟基脯氨酸；由谷氨酸脱水得到的焦谷氨酸以及可以快速增加肌肉力量，加速疲劳恢复的肌酸。经过分析，鹿胎盘寡肽产品中氨基酸的含量占总样的79.14％，共含有28种氨基酸。

表2鹿胎盘寡肽中游离氨基酸组成和含量

实施例8

ACE抑制活性检测

1溶液配制：硼酸盐缓冲液：硼酸钠50mM，NaCl 300mM，用蒸馏水配制，然后用6mol/ml的NaoH调整pH值到8.3。0.3％(w/v)的HHL溶液：称取0.0215g的HHL，溶于硼酸盐缓冲液中，定容为10ml，分装后存于-20℃备用。ACE：所用的ACE购自Sigma公司，为来源于兔肺的具有ACE活性的粉状物，使用时0.25U的ACE用2.5ml的蒸馏水溶解，配成0.1U/ml，然后分装后-20℃保藏备用。抑制剂：用硼酸盐缓冲液(pH8.3)溶解鹿胎盘寡肽样品，然后用于测定。

2操作方法：

表3ACE抑制活性体外检测方法

单位：μl

a：对照组，即未加抑制剂，b：样品组，即加入抑制剂，c：空白组如表3，按照药品的先后顺序，将各种试剂加入2ml的EP管中，在37℃水浴中反应一小时后，加入1mol/l的HCl终止反应(空白组提前加入)。然后在各个EP管中加入1.5ml的乙酸乙酯溶液，混匀后静置萃取5min，以4000rpm离心10min，取上清液0.5ml，沸水浴20min除去乙酸乙酯，冷却后加入1.5ml蒸馏水，涡旋混合半分钟后于倒入比色杯中，用紫外分光光度计于紫外228nm下检测吸光度[61，62]。计算公式如下：

3半抑制浓度的测定：取实施例1的样品，配成一系列浓度的溶液，浓度梯度分别为：2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml。

表4鹿胎盘寡肽的浓度与ACE抑制活性的关系

按照ACE抑制活性体外检测方法测定其ACE抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制活性为纵坐标绘制光滑曲线，表4是鹿胎盘寡肽的浓度与ACE抑制活性的关系，图5是鹿胎盘寡肽浓度与ACE抑制活性关系曲线。从所述曲线中计算IC50值。根据图5进行一元二次回归分析，得到回归方程：y＝-0.3409x2+6.9992x+25.851，其中R2＝0.992，线性关系良好。通过回归方程计算可得，本发明实施例1所得到的鹿胎盘寡肽的半抑制浓度(IC50)为4.39mg/ml。

实施例9

清除DPPH·的活性检测

1.溶液配制

0.1mmol/l的DPPH·溶液：4mg DPPH·粉末，溶于95％的乙醇溶液中，定容至100ml，装于棕色瓶中，低温避光保存。

2操作方法：

表5清除DPPH·的活性检测方法

单位：ml

如表5，各试剂按照该配方分别加入到96孔酶标板中，每份重复三次。待样品和95％乙醇全部加完后，再用排枪加入DPPH·溶液，室温下避光反应20min，经多功能酶标仪517nm处测定其吸光度。分别以2mg/ml抗坏血酸和2mg/ml TBHQ作为参照[66，67，68]。计算公式如下：

$\mathrm{\η}=[1-\frac{\mathrm{As}-\mathrm{Ao}}{\mathrm{Ac}}]\×100\%$

η：DPPH·清除率，As：样品组，Ac：对照组，Ao：空白组

将实施例1的鹿胎盘寡肽分别配成浓度为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml及10mg/ml的溶液，其清除DPPH·自由基的活性如表6.

表6不同鹿胎盘寡肽浓度对清除DPPH·的活性的影响

由表6可见，DPPH·的清除率随鹿胎盘寡肽的浓度增大而增加。

实施例10

清除·OH的活性检测

1溶液配制：pH7.4的PBS溶液：取一片PBS药片用蒸馏水溶解，并定容至100ml。EDTA溶液：0.02mol/l，高温灭菌后可常温保存。TCA溶液：称取2.8g三氯乙酸溶于蒸馏水中，装于棕色广口瓶中，定容至100ml，4℃避光保存。TBA溶液：称取1g硫代巴比妥酸，先用少量氢氧化钠溶液至粉末完全溶解后，用蒸馏水定容至100ml，装于棕色广口瓶中，4℃避光保存。10mmol/l的FeSO₄-EDTA混合液：0.02mol/l的FeSO₄和0.02mol/l的EDTA等体积混合。该溶液现用现配。α-脱氧核糖溶液：10mmol/l，现用现配。H₂O₂溶液：10mmol/l，现用现配。

2操作方法：取0.1ml的FeSO₄-EDTA混合液于2mlEP管中，加入0.25ml的α-脱氧核糖溶液，再加入0.1ml的样品溶液，用pH为7.4的PBS溶液0.45ml定容至0.9ml。再加入0.1ml的H₂O₂溶液混匀后于37℃恒温水浴1小时，然后加入2.8％的TCA溶液0.5ml和1％的TBA溶液0.5ml，沸水浴反应15min，冷却后取200μl于96孔酶标板中，用酶标仪在紫外532nm处检测吸光度。

$\mathrm{SA}(\%)=\frac{(\mathrm{Ao}-A)}{\mathrm{Ao}}\×100\%$

空白对照采用0.1ml的PBS溶液代替0.1ml的样品。计算公式如下：

清除·OH能力：

A：样品的吸光度，Ao：空白对照组的吸光度

将实施例1的鹿胎盘寡肽分别配成浓度为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml及10mg/ml的溶液，其清除·OH的活性如表7。

表7不同鹿胎盘寡肽浓度对清除·OH的活性的影响

由表7可见，·OH的清除率随鹿胎盘寡肽的浓度增大而增加。

实施例11

清除O₂·的活性检测

1溶液配制：50mmol/l的pH为8.2的Tris-HCl缓冲液：称取0.6057gTris，溶于50ml蒸馏水中，用HCl调pH至8.2，定容至100ml。邻苯三酚溶液：60mmol/l，现用现配。

2操作方法：用Marklund法进行改进，12μl的样品加入到96孔酶标板中，加完后再用排枪加入pH8.2的Tris-HCl缓冲液160μl，于25℃保温10min。然后加入25℃预温的邻苯三酚28μl。用多功能酶标仪在紫外420nm处，每隔一分钟检测一次吸光度。空白组用12μl的蒸馏水代替样品溶液。操作过程中，控制邻苯三酚自氧化速率为0.05-0.065 OD/min。分别以2mg/ml的抗坏血酸和2mg/ml的TBHQ为参照[64，67，70]。计算公式如下：

清除O₂·的能力 $R=\frac{\frac{{\mathrm{\ΔA}}^{\′}420}{\mathrm{\ΔT}}-\frac{\mathrm{\ΔA}420}{\mathrm{\ΔT}}}{\frac{{\mathrm{\Δ}}^{\′}420}{\mathrm{\ΔT}}}\×100\%$

：邻苯三酚自氧化速率，OD/min

：添加样品溶液后的邻苯三酚氧化速率，OD/min

将实施例1的鹿胎盘寡肽分别配成浓度为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml及10mg/ml的溶液，其清除O₂·的活性如表8。

表8不同鹿胎盘寡肽浓度对清除O₂·的活性的影响

由表5-6可见，对O₂·的清除率随鹿胎盘寡肽的浓度增大而增加。

在实施例8-11中，通过本发明实施例1的生物活性寡肽的活性研究，可以看出，鹿胎盘寡肽具有一定的ACE抑制活性和清除自由基活性(·OH、DPPH·和O₂·)，可以作为化妆品或保健品的优良添加剂进一步加工。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种利用鹿胎盘制备生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.鹿胎盘预处理：将鹿胎盘煮至所述鹿胎盘的蛋白变性；

b.蛋白酶水解：向变性的鹿胎盘中添加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，进行酶解反应；

c.分离纯化：将所述酶解液除盐、冷冻干燥所得到的淡黄色粉针状细末即为所述生物活性蛋白寡肽粉。

2.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a包括：将鹿胎盘去除筋膜和血管后，反复冻融，再将融化的鹿胎盘绞碎，在水中煮已搅碎的鹿胎盘，直至所述鹿胎盘的蛋白变性；

步骤b包括：将变性的鹿胎盘与水混合，向混合物中添加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，进行酶解反应，然后灭酶活性，将所得酶解液冷却至常温；

步骤c包括：将所述酶解液离心去除杂质后，稀释，并分离、收集酶解液中分子量≤5k的部分，然后除盐，再将除盐后的浓缩液除去水后，冷冻干燥；所得到得淡黄色粉针状细末即为所述生物活性蛋白寡肽粉。

3.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，所述鹿胎盘包括马鹿的胎盘或梅花鹿的胎盘。

4.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，碱性蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的0.8％-2％，木瓜蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的0.8％-2％，酶解反应的pH为7.5±0.5，酶解反应温度为55±5℃。

5.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述变性的鹿胎盘和水的重量比例为1∶1，所述酶解反应进行3-5小时。

6.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述碱性蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的0.8％，所述木瓜蛋白酶的用量是鹿胎盘原料重量的2％，所述酶解反应为3小时。

7.一种如权利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，将酶解后的产物离心，并将所得上清液进一步纯化。

8.一种如权利要求1至7中任一项所述的方法制得的生物活性蛋白寡肽粉。

9.一种如权利要求8所述的一种生物活性蛋白寡肽粉，其特征在于，所述生物活性蛋白寡肽粉的总氨基酸含量占所述寡肽粉的79％以上。

10.一种如权利要求8所述的一种生物活性蛋白寡肽粉，其特征在于，所述生物活性蛋白寡肽粉的分子量在500-2000之间。

11.根据权利要求8所述的鹿胎盘生物活性寡肽作为原料在医药、保健品及化妆品中的应用。

Images